ES2307421B1 - Polipeptido quimerico fibrina-filagrina citruinado capaz de detectar los anticuerpos generados en la artritis reumatoide. - Google Patents
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Abstract
Polipéptido quimérico
fibrina-filagrina citrulinado capaz de detectar los
anticuerpos generados en la artritis reumatoide.
La presente invención se refiere a un
polipéptido quimérico, capaz de detectar los anticuerpos generados
en la artritis reumatoide, que comprende al menos dos subunidades
peptídicas citrulinadas: (i) una procedente de la cadena \alpha o
\beta de la fibrina y (ii) una segunda procedente de la
filagrina. Además, la invención comprende una composición
antigénica, un método y un kit para el diagnóstico de la artritis
reumatoide, a partir de la detección de los
auto-anticuerpos generados durante el curso de
dicha enfermedad.
Description
Polipéptido quimérico
fibrina-filagrina citrulinado capaz de detectar los
anticuerpos generados en la artritis reumatoide.
La presente invención se refiere a un
polipéptido quimérico, capaz de detectar los anticuerpos generados
en la artritis reumatoide, que comprende al menos dos subunidades
peptídicas citrulinadas: (i) una procedente de la cadena \alpha o
\beta de la fibrina y (ii) una segunda procedente de la
filagrina. Además, la invención comprende una composición
antigénica, un método y un kit para el diagnóstico de la artritis
reumatoide, a partir de la detección de los
auto-anticuerpos generados durante el curso de
dicha enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
La artritis reumatoide (AR) es una de las
enfermedades autoimunes más comunes, con un origen desconocido y
que afecta 0.5-1% de la población, destruyendo
progresivamente las articulaciones, causándoles deformidad y
pérdida de función, además de producir complicaciones
sistémicas.
En esta enfermedad la terapia agresiva aplicada
en estadios iniciales ofrece resultados muy positivos, siendo
fundamental su diagnóstico prematuro. El criterio de clasificación
para la AR según el Colegio Americano de Reumatología (ACR)
(Arnelt FC, et al. Arthritis Rheum. 1988;
31:315-24) está basado en parámetros puramente
clínicos, aunque estos criterios no son útiles para el diagnóstico
temprano de la AR (Saraux A, et al. Arthritis
Rheum 2001; 44: 2485-91).
En la actualidad existen diferentes métodos
serológicos que permiten el diagnóstico de la AR y la distinguen de
otras patologías similares en fases tempranas de su evolución. En
este sentido, se conocen una serie de anticuerpos específicos para
la AR, tales como: el factor antiperinuclear (APF), anticuerpos
antifilagrina (AFA) y los anticuerpos antiqueratina (AKA). Los
epítopos reconocidos por estos anticuerpos
(auto-anticuerpos anti-proteínas
citrulinadas) son generados por modificaciones
post-traduccionales que consisten en la deiminación
de la arginina a citrulina por la enzima peptidilarginina deiminasa
(Vossenaar ER, et al. Bioessays 2003; 25:
1106-18).
Una de las herramientas más específicos en el
diagnóstico de RA consiste en la detección de los
auto-anticuerpos, generados frente a péptidos o
proteínas citrulinadas, constituyendo éstos uno de los marcadores
serológicos más eficaces de esta patología que se conocen
(Nijenhuis S, et al. Clin. Chim. Acta 2004; 350:
17-34). Incluso, los kits (ELISA) más efectivos
y comercialmente más extendidos para el diagnóstico de RA están
basados en péptidos citrulinados (CCP-1 y
CCP-2) derivados concretamente de la proteína
filagrina (Nijenhuis S, et al.
2004).
2004).
Otras proteínas del tejido sinovial que pueden
ser citrulinadas son las cadenas \alpha y \beta de la fibrina y
el antígeno Sa o vimentina citrulinada. Recientemente, Sebbag et
al (Sebbag et al Eur. J. Clin. Immunol. 2006,
36: 2250-2263) identificó 18 péptidos derivados
de la proteína fibrina, dos de los cuales, denominados como
[Cit^{60.72.74}] \beta-fibrina
(60-74) y [Cit^{38.42}]
\alpha-fibrina (36-50) y
localizados en el dominio globular de la proteína, eran capaces de
reaccionar frente a todos los sueros positivos para
auto-anticuerpos anti-proteínas
citrulinadas. Estos resultados han sido corroborados por recientes
estudios (Pérez, et al Chem. Biol. Drug Des. 2006,
68, 194-200; US 7,022,485), donde se ha
analizado la reactividad de péptidos derivados de la fibrina en el
diagnóstico de AR, confirmándose así su utilidad para el desarrollo
y mejora de la eficacia de los sistemas de diagnóstico
actuales.
\vskip1.000000\baselineskip
Existe un creciente interés por desarrollar
tests o pruebas específicas que mejoren el diagnóstico de AR así
como su diferenciación temprana respecto a otras enfermedades
reumáticas que afectan a las articulaciones y tejido conectivo,
sobre todo sucede en pacientes con una pronóstico más pobre o
aquéllos con un desarrollo más temprano de la enfermedad. La
incorporación de estos tests en la práctica clínica podría permitir
la identificación de aquellos pacientes que requieren terapias más
agresivas desde el mismo momento del diagnóstico de la enfermedad,
permitiendo así un mayor control de ésta y, consecuentemente,
conseguir menores daños articulares y una mejor prognosis de
la
enfermedad.
enfermedad.
Los autores de la presente invención en su afán
de mejorar los sistemas de diagnóstico de AR, que se emplean
actualmente, han descubierto sorprendentemente una serie de
péptidos citrulinados de las cadenas \alpha y \beta de la
fibrina con especial sensibilidad y especificidad frente a los
auto-anticuerpos anti-proteínas
citrulinadas, en adelante auto-anticuerpos, que se
generan durante el desarrollo de la AR. Además, uno de estos
péptidos citrulinados de la cadenas \alpha de la fibrina fue
unido covalentemente a un péptido cíclico de la filagrina
obteniéndose un polipéptido quimérico
(fibrina-filagrina) que fue capaz de complementar o
mejorar los resultados de sensibilidad y especificidad obtenidos
con péptidos CCP-1 y CCP-2
(Inmunoscan RA).
Así, un primer aspecto de la invención está
referido a un polipéptido quimérico, que comprende al menos dos
subunidades peptídicas citrulinadas y unidas covalentemente, capaz
de interaccionar con anticuerpos auto-inmunes
citrulinados generados durante la AR, donde:
- a.
- una subunidad (a) tiene al menos un 85% homología, preferentemente al menos un 90%, 93%, 95% o 98%, con un fragmento de al menos 7 aminoácidos de cualquiera de las cadenas \alpha y \beta de la fibrina, preferentemente entre 10-18 aminoácidos, y
- b.
- una segunda subunidad (b) ciclada que tiene al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, 93%, 95% o 98%, de homología con un fragmento de al menos 7 aminoácidos de la proteína filagrina, preferentemente entre 10-18 aminoácidos.
En una realización preferida de este aspecto de
la invención la subunidad b comprende al menos dos aminoácidos
cisteína entre los cuales se forma un puente disulfuro para ciclar
dicha subunidad. Preferentemente estás cisteínas provienen de una
sustitución serina-cisteína.
En una realización más preferida de este aspecto
de la invención el fragmento de la filagrina, a partir del cual se
obtiene la subunidad b, es el comprendido entre las posiciones
306-324 de dicha proteína. En una realización mas
preferida la secuencia comprendida entre las posiciones
306-324 de la \beta-fibrina es la
SEQ ID NO:7.
En una realización aun más preferida la
subunidad (b) tiene la secuencia SEQ ID NO:1 (cfc1cyc).
En una realización más preferida de este aspecto
de la invención el fragmento de la fibrina, a partir del cual se
obtiene la subunidad a, es el comprendido entre las posiciones
617-631 de la \alpha-fibrina ó las
posiciones 43-62 de la
\beta-fibrina. En una realización preferente la
secuencia comprendida entre las posiciones 617-631
de la \alpha-fibrina es la SEQ ID NO:8. En una
realización también preferente la secuencia comprendida entre las
posiciones 43-62 de la
\beta-fibrina es la SEQ ID NO:9.
En una realización todavía más preferida de este
aspecto de la invención la subunidad (a) del polipéptido quimérico
tiene la secuencia se seleccionada del grupo:
- a.
- SEQ ID NO:2 (p18),
- b.
- SEQ ID NO:3 (p19), ó
- c.
- SEQ ID NO:4 (p22),
En una realización todavía más preferida de este
aspecto de la invención la subunidad (a) del polipéptido quimérico
tiene la secuencia SEQ ID NO:5 (p38).
En otra realización preferida de la invención el
polipéptido quimérico tiene la SEQ ID NO:6
(p18-cfc1cyc).
En una realización también preferida de la
invención el polipéptido quimérico, según cualquiera de los
aspectos anteriores de la invención, están marcados o conjugados
con moléculas transportadoras.
En adelante estos polipéptidos quiméricos
citrulinados serán denominados como "polipéptido quimérico de
la invención". Dichos péptidos podrán ser obtenidos por
procedimientos sobradamente conocidos en el estado de la técnica,
tales como la síntesis química de péptidos en fase sólida (ver
material y métodos).
Un segundo aspecto de la invención se relaciona
con péptidos citrulinados de las cadenas \alpha y \beta de la
fibrina donde dichos péptidos tienen cualquiera de las secuencias
seleccionadas del grupo: p18, p19, p22 y p38 o secuencias análogas
(péptidos análogos), donde dichos péptidos citrulinados y péptidos
análogos son capaces de interaccionar con los auto anticuerpos
específicos de la AR. En una realización preferida de la este
aspecto de la invención los péptidos se encuentran ciclados y en una
realización la ciclación se lleva a cabo a partir de dos cisteínas,
Preferentemente provenientes de una sustitución
serina-cisteína. En adelante estos péptidos
citrulinados serán denominados como "péptidos de la
invención".
Un tercer aspecto de la invención se relaciona
con una composición antigénica para el diagnóstico de la AR que
comprende al menos uno de los péptidos de la invención, el
polipéptido quimérico de la invención o combinaciones de los
mismos. En adelante esta composición será denominada como
"composición antigénica de la invención".
Un cuarto aspecto de la invención se relaciona
con un método para la detección de auto-anticuerpos
específicos de la artritis reumatoide en una muestra biológica que
comprende:
- a.
- Poner en contacto una muestra biológica con al menos uno de los péptidos de la invención, el polipéptido quimérico de la invención ó la composición antigénica de la invención.
\newpage
- b.
- Detectar la interacción entre los auto-anticuerpos específicos y los péptidos de la invención, el polipéptido quimérico o composición antigénica del paso (a), donde dicha interacción puede ser llevada a cabo mediante metodologías sobradamente conocidas en el estado de la técnica, a través del marcado de los péptidos, medición de la densidad óptica de la muestra, etc.
Un quinto aspecto de la invención se relaciona
con un kit de diagnóstico para la detección de la AR que comprende
al menos uno de los péptidos de la invención, el polipéptido
quimérico de la invención ó la composición antigénica de la
invención (antígenos) y los reactivos y tampones necesarios para
permitir la formación del complejo
anticuerpo-antígeno
\vskip1.000000\baselineskip
El termino "péptido o polipéptido derivado"
hace referencia a lo largo de la descripción a péptidos que se
obtienen a partir de regiones o fragmentos de al menos 7 amino
ácidos de la proteína filagrina o de las cadenas \alpha y \beta
de la fibrina. Estos péptidos derivados han podido sufrir
modificaciones (ejemplo: ciclaciones, deiminaciones, etc), que
hayan reducido su homología con la secuencia inicial de la proteína
de la que derivan. Un ejemplo de estos péptidos son los grupos de
péptidos conocidos como CCP-1 y
CCP-2.
El término "péptidos CCP-1"
hace referencia a lo largo de la descripción a péptidos cíclicos
derivados de la filagrina.
El término "péptidos CCP-2"
hace referencia a lo largo de la descripción a péptidos con un
grado de sensibilidad y especificad para la detección de AR mayor
que el alcanzado con los péptidos CCP-1. A lo largo
de los ensayos, que se muestran en la descripción, los péptidos de
la invención son comparados con los péptidos CCP-2
obtenidos a partir del kit comercial de Immunoscan (Immunoscan RA;
Eurodiagnostica, distribuido por Diasorin, Madrid,
España).
España).
El término "péptidos o polipéptidos
análogos" está referido a péptidos donde al menos uno de sus
aminoácidos ha sido sustituido por otro de características
similares según se indica a continuación:
- -
- Neutros polares, hidrófilos o (polares): serina (Ser), treonina (Thr), cisteína (Cys), asparagina (Asn) y giutamina (Gln).
- -
- Neutros no polares, apolares o hidrófobos: glicina (Gly), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile), metionina (Met), prolina (Pro), fenilalanina (Phe) y triptófano (Trp).tirosina (Tyr).
- -
- Con carga negativa, o ácidos: ácido aspártico (Asp) y ácido glutámico (Glu).
- -
- Con carga positiva, o básicos: lisina (Lys), arginina (Arg) e histidina (His).
El término "péptidos unidos covalentemente"
hace referencia a péptidos entre los cuales media un enlace
covalente y donde la unión puede darse con o sin espaciadores.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Esta figura muestra un esquema de la
estrategia de síntesis en fase sólida del péptido cíclico
"cabeza-cola" (p38HT) procedente de la cadena
\beta de la fibrina (fragmento 43-62). Reactivos y
condiciones: (i) Fmoc-Asp-Odmab
DCM, DIPCDI, 20 min 0°C; (ii) DMAP
(4-Dimetilaminopiridina), DMF, 3 h; (iii) Síntesis
en fase sólida (SPPS); (iv) 20% piperidina/DMF; (v) 3%
hidrazina/DMF; 20% H_{2}O/DMF, 16 h; (vii) DMF, DCM, MeOH; (viii)
1% DIPEA/DMF; (x) PyBOP/DMF, DCM, 72 h; (xi) 1% DIEA/DMF; (xii)
DMF/MeOH; (xiii) TFA/EDT/TIS/H_{2}, 3 h. Los grupos W, X y Z son
grupos protectores empleados para dirigir la reacción de síntesis
química de los
péptidos.
péptidos.
Figura 2. Esta figura muestra un esquema de la
estrategia de síntesis en fase sólida del péptido cíclico con
puentes disulfuro (p38SS). Reactivos y condiciones: (i) SPPS; (ii)
20% piperidina/DMF; (iii) TFA/EDT/TIS/H_{2}O, 3 h; (iv)
I_{2}/MeOH, 60 min, I_{2}/MeOH 90 min; (v) DCM. Los grupos W, X,
y Z son grupos protectores empleados para dirigir la reacción de
síntesis de los péptidos.
Figura 3. Esta figura muestra un esquema de la
estrategia de síntesis en fase sólida del péptido
p18-cfc1cyc. Reactivos y condiciones: a) (i) 20%
piperidina/DMF; (ii) SPPS del péptido cyc; (iii) SPPS del péptido
p18; (iv) 20% piperidina/DMF; (v) TFA/EDT/TIS/H_{2}O; (vi)
I_{2}/MeOH, 60 min; b) Reactivos y condiciones: (i) 20%
piperidina/DMF; (ii) SPPS del péptido cfc1; (iii) I_{2}/MeOH, 60
min, H_{2}O, 90 min; (iv) DCM; (v) SPPS de p18 (vi) 20%
piperidina/DMF; (vii) TFAIEDT/TIS/H_{2}O. Los grupos W, X, Y y Z
son grupos protectores empleados para dirigir la reacción de
síntesis de los péptidos.
\newpage
Figura 4. Esta figura muestra gráficas de
reactividad, medida en densidades ópticas (DO_{492}), de péptidos
derivados las cadenas \alpha y \beta de la fibrina para una
muestra de 33 sueros AR.
Figura 5. Esta figura muestra gráficas de
reactividad, medida en densidades ópticas (DO_{492}), del péptido
derivado la cadena \beta de la fibrina p38 y los péptidos
cíclicos p38HT y p38SS para una muestra de 110 sueros AR.
Figura 6. Análisis de curva ROC (A) y de la
reactividad de los péptidos p22, p22sc y p22lc frente a
auto-anticuerpos (B, C y D) para una cohorte de
pacientes seropositivos para AR o PsA. A) La sensibilidad y la
especificidad fue calculada para todos los potenciales valores de
cut-off (línea de corte) y representada como
curva ROC (n=111 pacientes RA positivos, n=82 pacientes PsA
positivos). En las gráficas B, C y D se muestra la reactividad de
p22, p22sc y p22lc frente a los anticuerpos de pacientes de RA y
PsA (CONTROL), representada con los valores óptimos de
"cut-off" obtenidos del análisis con la
curvas ROC de cada ensayo.
Figuras 7. Análisis de curva ROC (A) y de
reactividad frente a anticuerpos (B, C, D y E) del péptido lineal
de la \beta-fibrina (p38), del péptido lineal de
la \alpha-fibrina (p22), del polipéptido
quimérico p38-GGG-p22) y de la
mezcla de p38 y p22 para una cohorte de pacientes seropositivos
para AR o PsA. A) La sensibilidad y la especificidad fue calculada
para todos los potenciales valores de
"cut-off" y representada como curva ROC
(n=111 pacientes RA positivos, n=82 pacientes PsA positivos). En
las gráficas B, C D y E se muestra la reactividad de p38, p22,
p38-GGG-p22 y p38+p22 frente a los
auto-anticuerpos de pacientes de RA y PsA (CONTROL),
representada con los valores óptimos de
"cut-off" obtenidos del análisis con la
curvas ROC de cada ensayo.
Figura 8. Análisis de curva ROC y de la
reactividad péptidos cíclicos derivados de la filagrina (cfc1cyc)
(Pérez, T. et al. J. Pept. Sci. (2006) 12 (4),
267-278.) y el polipéptido quimérico
(p18-cfc1cyc) en una cohorte de pacientes con AR o
PsA. A) La sensibilidad y la especificidad fue calculada para todos
los potenciales valores de "cut-off" y
representada como curva ROC (n=111 RA pacientes, n=82 PsA
pacientes). B) En las gráficas B, C se muestra la reactividad de
cfc1 y p18-cfc1cyc frente a los
auto-anticuerpos de pacientes de RA y PsA
(CONTROL), representada con los valores óptimos de
"cut-off" obtenidos del análisis con la
curvas ROC de cada ensayo.
Figura 9. Análisis de la correlación entre los
títulos de anticuerpos anti-péptido
p18-cfc1cyc y anti-CCP2.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se detallan los materiales y
métodos que fueron empleados para el desarrollo de la presente
invención, así como sus ejemplos de realización. Dichos ejemplos no
limitan la invención, sino que su finalidad es ilustrarla, poniendo
de manifiesto la sensibilidad y especificidad de los polipéptidos
quiméricos y péptidos de la
invención.
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de los péptidos pertenecientes a las
cadenas \alpha y \beta de la proteína fibrina, con distinto
grado de deiminación (Tabla 1 a-b), fueron
sintetizadas mediante un proceso de síntesis de péptidos en fase
sólida empleando una resina Tentagel RAM (Rapp Polymere GmbH,
Germany) (100 mg, 0.28 meq/g). La síntesis se realizó en un
sintetizador semiautomático de péptidos (SAM, Multisyntech,
Germany) y se obtuvieron las secuencias en forma de carboxamidas
C-terminales. Se siguió una estrategia Fmoc/tBut y
las reacciones de acoplamiento entre aminoácidos se realizaron por
duplicado, empleando como agentes de condensación
1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y
N,N'-diisipropilcarbodiimida (DIPCDI), y excesos de
tres veces de aminoácidos. La etapa de desprotección del grupo
protector Fmoc se realizó también por duplicado empleando
piperidina (20%) en dimetilformamida (DMF) durante 10
minutos.
minutos.
Los péptidos fueron desprotegidos y
simultáneamente desanclados de la resina en una única etapa
empleando una mezcla de ácido trifluoroacético
(TFA)/triisopropilsilano (TIS)/H_{2}O (95/2.5/2.5). Los péptidos
se precipitaron con éter dietílico frío, se centrifugaron y
liofilizaron en un 10% de ácido acético. Los péptidos así obtenidos
se analizaron por HPLC analítico a 215 nm. Su identidad se confirmó
por espectrometría de masas MALDI-TOF.
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener el péptido cíclico
"cabeza-cola" p38HT cuya secuencia aparece
indicada en la Tabla 2, se empleó una protección estándar de los
aminoácidos. p38HT se obtuvo por síntesis manual en una resina
Novasyn® TGA (Novabiochem Ltd., Switzerland) (0.25 mmol/g) en forma
de ácido C-terminal, siguiendo el procedimiento
indicado en la Figura 1. La resina se suministra comercialmente
funcionalizada con ácido hidroximetilfenoxiacético (HMPA). La
primera etapa consistió en la acilación de la resina con el
anhídrido simétrico del
Fmoc-Asp-ODmab vía su cadena
lateral. La síntesis del péptido se continuó empleando una
estrategia estándar Fmoc/tBut. Tras completar la síntesis del
péptido, se eliminó el grupo terminal Fmoc con un 20% de piperidina
en DMF. La eliminación del grupo Dmab se realizó por tratamiento
con un 3% de hidracina en DMF, seguido de tratamiento con un 20% de
agua en DMF.
La resina desprotegida se trató con un 1% de
DIPEA-DMF seguido de un 1% de
HOBt-DMF. La reacción de macrociclación se realizó
en la resina empleando 3 equivalentes de PyBOP a temperatura
ambiente durante 72 horas. Finalmente se liberó el péptido de la
resina por tratamiento ácido con una mezcla de
TFA/1,2-etanoditiol (EDT)/TIS/H_{2}O (95/2/1/2).
La construcción cíclica se aisló por precipitación con éter
dietílico frío, disolviéndose el residuo final en un 10% de ácido
acético y siendo éste finalmente liofilizado. El crudo peptídico se
purificó por HPLC en fase reversa y se identificó por espectrometría
de masas electrospray (ES-MS).
Para obtener los péptidos cíclicos en forma de
disulfuro, que se muestran en las Tablas 2 y 3 (p38SS,
p18-sc, p19-sc,
p22-sc, p18-lc,
p19-lc and p22-lc), fue necesario
sustituir dos residuos de serina de la secuencia peptídica original
por dos residuos de cisteína protegidos como Cys(Acm). Los
péptidos lineales correspondientes se sintetizaron en forma de
carboxamidas C-terminales tal y como se ha descrito
con anterioridad y finalmente se liberaron de la resina por
tratamiento con TFA/EDT/H_{2}O (95/2.5/2.5) y se precipitaron con
éter dietílico frío. Finalmente se disolvieron en un 10% de ácido
acético y se liofilizaron. La caracterización de los péptidos
resultantes se realizó por MALDI-TOF y HPLC
analítico. La ciclación se llevó a cabo disolviendo los péptidos en
ácido acético y adicionando una solución de yodo en metanol, para
obtener el enlace disulfuro. Tras 60 minutos de agitación, se
adicionó agua para acelerar la liberación del grupo protector Acm.
La solución resultante se agitó durante 90 minutos más y finalmente
el yodo fue extraído con diclorometano. La fase acuosa se diluyó
tres veces con agua y se liofilizó. Los crudos peptídicos se
caracterizaron por HPLC analítico y finalmente fueron purificados
por HPLC preparativo y caracterizados por ES-MS. En
la Figura 2 se ilustra el procedimiento sintético seguido para la
preparación de uno de los péptidos cíclicos con puentes disulfuro
(p38SS).
Para llevar a cabo la síntesis de los péptidos
quiméricos lineales que contienen tres residuos de glicina entre
los péptidos seleccionados de \alpha- y
\beta-fibrina (Tabla 4a), se siguió el
procedimiento general anteriormente descrito.
Para llevar a cabo la síntesis del quimérico
\alpha-fibrina-filagrina
(p18-cfc1cyc) cuya secuencia primaria se indica en
la Tabla 4b, se emplearon dos estrategias sintéticas diferentes. La
primera (Figura 3a) consistió en la síntesis de la secuencia
quimérica lineal en fase sólida y su posterior ciclación en
solución, mediante la formación de un puente disulfuro. En la
segunda estrategia (Figura 3b), la ciclación de la región
correspondiente al péptido de la filagrina se realizó en fase
sólida y posteriormente, sobre la peptidil resina con el péptido de
filagrina ya ciclado, se completó la síntesis de la secuencia
correspondiente a la \alpha-fibrina. El desanclaje
y desprotección final del polipéptido quimérico se realizó
preservando el enlace disulfuro ya formado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de suero analizadas procedieron de
pacientes del Servicio de Reumatología del Hospital Clínico de
Barcelona. Se trabajó con un total de 193 muestras de suero, de las
cuales 111 correspondían a pacientes diagnosticados con artritis
reumatoide (AR), según los criterios revisados de la Asociación
Americana de Reumatología en 1987 (ahora Colegio Americano de
Reumatología). Las muestras fueron previamente testadas por ELISA
con el kit con anticuerpos CCP-2 (Immunoscan RA;
Eurodiagnostica, distribuido por Diasorin, Madrid, Spain) para
conocer la presencia o ausencia de anticuerpos
anti-CCP2. Los 82 sueros restantes se obtuvieron de
pacientes de artritis psoriásica (PsA) no preseleccionados y se
emplearon como control negativo.
Las secuencias peptídicas se unieron
covalentemente a placas de titulación de ELISA (Costar Corp.,
DNA-bind N-oxysuccinimide surface,
Cambrigde, MA), como se ha descrito previamente (Pérez, T.; Gómez,
et al. Lett. Peptide Sci. 2002, 9,
291-300).
Brevemente, se diluyeron los péptidos a una
concentración de 10 mg/mL en tampón carbonato/bicarbonato (pH 9.6)
0.05 M. Se adicionaron 100 \muL de solución peptídica a cada
pocillo de la microplaca de titulación y se incubó toda la noche a
4°C. Cada placa contenía pocillos control que incluían todos los
reactivos excepto la muestra de suero, para estimar el ruido de
fondo y pocillos que incluían todos los reactivos excepto el
péptido, para evaluar así las reacciones no específicas del suero.
En los controles, los pocillos se bloquearon con 2 mg BSA/pocillo.
Tras la incubación, las placas se bloquearon con 2% de BSA en
tampón carbonato/bicarbonato (pH 9.6) 0.05 M durante 1 hora a
temperatura ambiente. Los sueros se diluyeron 200 veces en tampón
RIA (1% BSA, 350 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.6,
1% vol/vol Triton X-100, 0.5% wt/vol
Na-deoxicolato, 0.1% SDS) suplementado con suero
fetal bovino al 10%. Se adicionaron 100 \muL/pocillo y se
incubaron durante 1.5 horas a temperatura ambiente. Tras realizar
seis lavados con PBS/0.05% Tween-20, se adicionaron
100 \muL/pocillo de IgG anti-humana conjugada a
peroxidasa, diluida 1:1000 en tampón RIA. Tras 1 hora de incubación
a temperatura ambiente, se lavaron las placas seis veces con
PBS/0.05% Tween-20 y los anticuerpos unidos se
detectaron con dihicrocloruro de o-fenilenodiamina
(OPD, Sigma Chemical Company) y 0.8 mL/mL de 30% de peroxido de
hidrógeno. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante
30 minutos. La reacción se detuvo con 50 mL de H_{2}SO_{4} 2N y
los valores de absorbancia obtenidos fueron medidos a una longitud
de onda de 492 nm. Todos los sueros se testaron por duplicado.
También se incluyeron sueros control para monitorizar las
variaciones inter- e intra-ensayos.
Los ensayos de ELISA llevados a cabo con el
lipopéptido p66 o con las mezclas físicas de péptidos de fibrina,
se realizaron tras la adsorción pasiva de las secuencias a la
superficie sólida (Maxisorp, 96F Nunc, Roskilde, Denmark),
siguiendo la metodología ya descrita (Gomara, M. J. et al J
Immunol Methods 2000, 234 (1-2),
23-34.). El péptido p65 se analizó empleando placas
Covalink NH (Nunc, Roskilde, Denmark), que permiten la unión
covalente de los péptidos a través de su región
C-terminal. El procedimiento general fue el
siguiente:
Se preparó una solución de péptido de 10
\mug/mL en agua destilada que contenía
sulfo-N-hidroxisuccinimida
(sulfo-NHS) a concentración 8 mM. Se adicionaron
100 \muL de la solución de péptido/sulfo-NHS a
cada pocillo. Asimismo se preparó una solución de un 2% de
BSA/sulfo-NHS para adicionar al pocillo control. La
reacción covalente se inició tras la adición de 50 \muL de una
solución 16 mM de
1-etil-3(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida
(EDC), a cada pocillo. Se incubaron las placas durante la noche a
temperatura ambiente y se realizó el resto del ensayo de ELISA
siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para las placas
Costar.
Los análisis según las curvas ROC y de regresión
se realizaron empleando el programa MedCalc versión 7.6 (MedCalc
Software. Mariakerte, Belgium). Las reactividades de los péptidos
con los dos paneles de sueros (SE+ y SE-) fueron comparadas
empleando el test Chi-cuadrado de asociación para
una tabla de contingencia 2x2.
Los análisis de correlación se llevaron a cabo
empleando el test no-paramétrico de Spearman.
Ejemplo
1
Con el objeto de detectar aquéllos péptidos de
la proteína fibrina que fuesen más reactivos frente a sueros
positivos para AR (en adelante sueros AR), se procedió a analizar
la influencia del grado de deiminización mediante la síntesis de
péptidos derivados a la fibrina y con distinta correlación
arginina/citrulina. La identificación de las regiones de las
cadenas \alpha-fibrina y
\beta-fibrina que serían empleadas en los ensayos
fue llevada a cabo por predicciones de antigenicidad realizadas por
ordenador Se emplearon las escalas de hidrofilia de Hopp y Woods,
de accesibilidad de Janin y de antigenicidad de Welling. Además se
tuvo en cuenta que regiones presentaban una mayor probabilidad de
formar giros beta y que por tanto se deberían localizar en una zona
más externa de la proteína, teniendo con ello una mayor facilidad
para interaccionar con los anticuerpos. Los péptidos finalmente que
finalmente fueron sintetizados en fase sólida y caracterizados por
su secuencia, HPLC y espectrometría de masas
MALDI-Tof (ver material y métodos).
Estos péptidos fueron ensayados en inmunoensayo
(ELISA) para determinar su capacidad de reconocer
auto-anticuerpos presentes en sueros positivos para
AR. Para identificar qué péptidos eran el mejor sustrato para los
auto-anticuerpos todos los péptidos sintetizados
fueron inicialmente ensayados con 33 sueros positivos para AR y con
40 sueros control. Tal y como se muestra en la Figura 4 se observó
un considerable aumento de la sensibilidad para los péptidos p18,
p19 y p22 derivados de la cadena \alpha-fibrina,
donde la arginina había sido sustituida en la posición 630. Aunque
p24 también presenta una Cit en esta posición específica, se trata
de una versión totalmente citrulinada de la región
(617-631). De acuerdo con resultados nuestros
anteriores, una carga neta positiva podría ser un factor adicional
que contribuyera en la reactividad del péptido. Según nuestra
experiencia, mediante un adecuado balance de residuos Arg/Cit los
péptidos pueden adoptar una conformación con capacidad incrementada
de unión a los auto-anticuerpos, la cual ha
resultado favorable para su utilidad diagnóstica.
El resto de péptidos correspondientes a la
región 617-631 de la
\alpha-fibrina con una arginina sin modificar en
la misma posición mostraron una reactividad menor. Para los
péptidos derivados de la cadena de \beta-fibrina,
de aquellos obtenidos a partir de la región definida entre las
posiciones 43-62, el p38 fue el que ofreció unos
resultados de absorbancia mayores (DO_{492}).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
A partir de la región 43-62 de
la \beta-fibrina se procedió a la ciclación de
péptidos derivados dicha región para determinar si este tratamiento,
la ciclación, conseguía aumentar su afinidad por los
auto-anticuerpos. Así se prepararon dos versiones
de péptidos cíclicos a partir de la región 43-62 de
la \beta-fibrina (Tabla 2). La primera de estas
versiones, p38HT (del inglés "head to
tail"-cabeza-cola), se correspondía con el
péptido p38 ciclado, que fue obtenido en fase sólida mediante la
formación de un enlace amida entre el extremo
N-terminal del péptido y el grupo carboxilo de un
residuo Asp introducido en el extremo C-terminal de
la secuencia del péptido protegida por el grupo Odmab (del inglés -
4(N-[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxo-cyclohexylideno)-3-metylbutylamino)benzyloxy)
(Figura 1). La segunda versión de los péptidos preparada, p38SS,
fue obtenida mediante sustitución de dos residuos de serina por dos
cisteínas en la región 43-62 de la
\beta-fibrina y la ciclación fue llevada a cabo
por oxidación en solución de yodo/metanol (Figura 2).
Las dos versiones de péptidos clicados fue
testada en ELISA con 110 sueros positivos para AR y 80 sueros
control. Tal y como se muestra en la figura 5, la capacidad de los
péptidos lineales para detectar auto-anticuerpos fue
significativamente superada por los péptidos cíclicos (p<0.05),
aunque entre p38HT y p38SS las diferencias no fueron significativas
(p=162).
Al igual que con la
\beta-fibrina, se desarrollaron péptidos ciclados
derivados de la \alpha-fibrina, a partir de
aquéllos que habían ofrecido unos valores más elevados de
antigenicidad, p18, p19 y p22. De este modo, se prepararon dos
versiones cicladas de a cada uno de los péptidos, una larga y otra
según se indica en la Tabla 3, y se ensayaron con 110 sueros
positivos para AR y 70 positivos para PsA (artritis psoriásica).
Los análisis de curva ROC mostraron unos valores de área bajo la
curva (AUC) mayores para los péptidos cíclicos cortos
(respectivamente 0.829, 0.745 y 0.703 para p18-sc,
p19-sc y p22-sc) en comparación con
los largos (respectivamente 0.738, 0.703, 0.685 para los
p18-lc, p19-lc y
p22-lc). Como se muestra en la Figura 6 los valores
más elevados de AUC y sensibilidad (p=0.008) fueron obtenidos para
el péptido p22-sc, cuando el tamaño del anillo de
ciclación era más pequeño.
Por otro lado, cabe destacar que los péptidos de
fibrina empleados en los ensayos no dieron lugar a falsos positivos
con muestras positivas para PsA, a diferencia de lo que sucede con
otros métodos de detección de AR. Consecuentemente, y tal y como
describen diversos autores (21, 22), que afirman que los
auto-anticuerpos detectados en el test
anti-CCP son más frecuentes poblaciones afectadas
por la PsA, los péptidos ciclados de la
\alpha-fibrina descritos en este apartado pueden
ser de gran relevancia para mejorar los sistemas de detección de
AR.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
A partir de los datos de especificidad y
selectividad obtenidos para las diferentes regiones de los
polipéptidos derivados de la \alpha-fibrina y
\beta-fibrina se procedió al diseño y síntesis en
fase sólida de péptidos quiméricos (Tabla 4).
Los análisis ELISA mostraron que los
polipéptidos quiméricos \alpha-fibrina y
\beta-fibrina analizados por curvas ROC ofrecían
unos valores de AUC moderadamente más elevados que los
correspondientes a péptidos monoméricos (Fig. 7).
Sorprendentemente, cuando los mismos ensayos se realizaron con
polipéptidos quiméricos fibrina-filagrina, donde el
péptido de filagrina se encontraba ciclado, los resultados de
sensibilidad y especificidad fueron mejores.
Para la elaboración de este último ensayo se
elaboraron dos péptidos: cfc1cyc, perteneciente al grupo de los
péptidos conocidos como CCP-1 (15), y
p18-cfc1cyc, resultante de la unión covalente del
primero con p18. La relación entre la sensibilidad y especificidad
de los ambos péptidos se presenta en la Figura 8. La sensibilidad
del ELISA con p18-cfc1cyc fue del 82%, la cual fue
significativamente más elevada que la alcanzada por el ELISA con
cfc1cyc (65,8%; p=0.002). La especificidad fue muy elevada en ambos
casos (93%). Esta elevada sensibilidad sin perdida de especificidad
es bastante relevante teniendo en cuenta que el grupo empleado como
control consistía en pacientes afectados por PsA, una enfermedad
inflamatoria con un cuadro clínico que puede simular la AR. Por otro
lado, la frecuencia de auto-anticuerpos contra el
polipéptido p18-cfc1cyc (6%) en la población
control (PsA) es similar a la descrita por otros autores que
emplean el test comercial CCP2, habiéndose reportado una prevalencia
de un 5.6-7.8%
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Con el objetivo de mejorar los métodos de
detección de AR basados en péptidos derivados de la fibrina, se
prepararon diferentes mezclas de los mismos.
Se empleó un panel de 23 muestras de suero para
las que el test CCP-2 había ofrecido resultados
negativos y se estudió su reactividad frente a diversas mezclas de
péptidos escogidos de entre los que habían resultado
antigénicamente más relevantes (Tabla 5). Estas mezclas de péptidos
fueron únicamente capaces de detectar 4 de las 23 muestras AR
positivas.
Sin embargo, el polipéptido quimérico
p18-cfc1cyc fue capaz de detectar
auto-anticuerpos AR en 8 sueros, alcanzándose por lo
tanto una reactividad del 33% frente a unos máximos del 21% y 17%
obtenidos con el resto de métodos ensayados. Estos resultados
demuestran que los péptidos quiméricos
fibrina-filagrina son capaces de mejorar la
sensibilidad de los métodos de detección de AR.
Es importante mencionar que los polipéptidos
quiméricos fibrina-filagrina y, más concretamente,
el polipéptido p18-cfc1cyc, han sido capaces de
ofrecer resultados de sensibilidad superiores a los de cfc1cyc e
incluso detectar sueros positivos para RA allí donde el test
CCP-2 ofrecía falsos negativos. De hecho, más del
46% de los sueros negativos para el test CCP-2
reaccionó con p18-cfc1cyc y/o p38, indicando que los
péptidos de derivados fibrina y los polipéptidos quiméricos
fibrina-filagrina pueden permitir el desarrollar y
mejora de los test de detección de AR que en la actualidad se
conocen.
Durante la realización de estos ensayos se
incluso comprobó la existencia de una correlación entre
p18-cfc1cyc y CCP-2, tal y como se
muestra en la Figura 9 (r=0.86, p<0.001). Estos resultados
refuerzan la utilidad de los péptidos
fibrina-filagrina para robustecer los métodos de
detección de AR.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polipéptido quimérico
fibrina-filagrina citrulinado capaz de detectar los
anticuerpos generados en la artritis reumatoide
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ES1641.8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (cfc1cyc)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = Citrulina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial (p18)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = citrulina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial (p19)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = citrulina
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = citrulina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial (p22)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = citrulina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = citrulina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> secuencia artificial (p38)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = citrulina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
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<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = citrulina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
(p18-cfc1cyc)
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = citrulina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
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<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = citrulina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región 306-324 de la
proteína filagrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> homo sapiens
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<220>
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<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región 617-631 de la
alfa fibrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
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<211> 20
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región 43-62 de la
beta filagrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,9cm
Claims (13)
1. Polipéptido quimérico, que comprende al menos
dos subunidades peptídicas citrulinadas a y b, unidas
covalentemente, donde:
- a.
- la subunidad (a) tiene al menos un 85% de homología con un fragmento de al menos 7 amino ácidos la proteína \alpha-fibrina o \beta-fibrina.
- b.
- la segunda subunidad (b) está ciclada y tiene al menos un 85% de homología con un fragmento de al menos 7 amino ácidos proteína filagrina.
2. Polipéptido quimérico según la reivindicación
anterior, donde la subunidad b) comprende al menos dos aminoácidos
cisteína formando un puente disulfuro entre ellos.
3. Polipéptido quimérico, según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde el fragmento de la proteína
filagrina es el comprendido entre las posiciones 306 y 324.
4. Polipéptido quimérico, según la
reivindicación anterior, donde la subunidad (b) tiene la secuencia
SEQ ID NO:1 (cfc1cyc).
5. Polipéptido quimérico, según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde el fragmento de la proteína
\alpha-fibrina es el comprendido entre las
posiciones 617 y 631.
6. Polipéptido quimérico, según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, donde el fragmento de la proteína
\beta-fibrina es el comprendido entre las
posiciones 43-62.
7. Polipéptido quimérico, según la
reivindicación 5, donde la subunidad b tiene la secuencia se
seleccionada del grupo:
- a.
- SEQ ID NO:2 (p18),
- b.
- SEQ ID NO:3 (p19), ó
- c.
- SEQ ID NO:4 (p22).
8. Polipéptido quimérico, según la
reivindicación 6, donde la subunidad b tiene la secuencia SEQ ID
NO:5 (p38).
9. Polipéptido quimérico, según cualquiera de
las reivindicaciones 1-2, cuya secuencia es la SEQ
ID NO:6 (p18-cfc1cyc).
10. Polipéptido quimérico, según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores donde dichos polipéptidos se
encuentran marcados o conjugados con al menos una molécula
transportadora.
11. Composición antigénica que comprende
cualquiera un polipéptido quimérico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores o combinaciones de los mismos.
12. Método para la defección de
auto-anticuerpos específicos de la artritis
reumatoide en una muestra biológica que comprende:
- a.
- Poner en contacto la muestra biológica con al menos uno de los polipéptidos quiméricos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 ó la composición antigénica de la reivindicación 11.
- b.
- Detectar la interacción entre los auto-anticuerpos específicos y los polipéptidos quiméricos o composición antigénica del paso (a).
13. Kit de diagnóstico de la artritis reumatoide
que comprende al menos uno de los polipéptidos quiméricos según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, la composición
antigénica de la reivindicación 11 o una combinaciones de los
mismos (antígenos), y los reactivos y tampones necesarios para
permitir la formación del complejo
anticuerpo-antígeno.
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