ES2275542T3

ES2275542T3 - Compuestos sinteticos que portan dos epitopes para inmunodosificaciones.

Info

Publication number: ES2275542T3
Application number: ES00958689T
Authority: ES
Inventors: Isabelle Nathalie Garric; Isabelle Karine Giuliani; Catherine Christiane Marie Larue; Francois Yves Rieunier; Sylvie Marie-France Trinquier
Original assignee: Bio Rad Pasteur SA
Current assignee: Bio Rad Innovations SAS
Priority date: 1999-08-16
Filing date: 2000-08-14
Publication date: 2007-06-16
Anticipated expiration: 2020-08-14
Also published as: JP4447811B2; ATE346295T1; DE60031990T2; EP1204865A1; FR2797689A1; EP1204865B1; CA2382035C; FR2797689B1; WO2001013114A1; DE60031990D1; CA2382035A1; JP2003507711A; US8013115B1

Abstract

Un compuesto sintético, que comprende: - una molécula portadora que posee una cadena hidrocarbonada peptídica, formada por a) encadenamientos de 7 a 50 aminoácidos que forman una cadena hidrocarbonada, abierta, la cual comprende, por lo menos, un encadenamiento que introduce una rigidez en la molécula, de tal forma que, los encadenamientos formados por los átomos de la cadena hidrocarbonada, no se encuentren ya más, todos ellos, en libre rotación; o b) encadenamientos de 8 a 50 aminoácidos que forman un ciclo; comprendiendo, la citada cadena hidrocarbonada, por lo menos dos residuos seleccionados de entre el grupo constituido por aminoácidos de cadenas laterales básicas, aminoácidos de cadenas laterales cargadas negativamente, aminoácidos de cadenas laterales hidroxiladas, y aminoácidos de cadenas laterales que contienen azufre, que permiten el injerto de brazos laterales sobre la citada cadena hidrocarbonada; y - por lo menos dos epítopes diferentes, portados por los citados brazos laterales injertados sobre la citada molécula portadora.

Description

Compuestos sintéticos que portan dos epítopes para inmunodosificaciones.

La presente invención, se refiere a compuestos sintéticos susceptibles de poderse utilizar como patrones o testigos en los inmunoensayos, especialmente, para la dosificación de troponina, a su procedimiento de preparación, a maletines que contienen tales tipos de compuestos, así como a los procedimientos de inmunodosificación que aplican tales tipos de compuestos.

Se sabe que, la troponina, es un complejo protéico miofibrillar, constituido por tres proteínas, las troponinas I, T y C. Este complejo proteínico, permite el contribuir a la regulación de la contracción del músculo, mediante el ión Ca^{2+}, interaccionando con la miosina y la actina. De una forma más precisa, se sabe que, cuando un influjo nervioso llega al nivel de la placa motriz de un músculo, existe generación de un potencial de acción que se transmite al retículo sarcoplásmico. El Ca^{2*}, se libera, entonces, en el citosol, y se fija sobre la troponina C, lo cual conlleva un refuerzo de la interacción entre la troponina I y la troponina C y, por consiguiente, un cambio de la conformación del complejo troponina I, T, C. Existe, entonces, una liberación de los sitios de interacción actina-mosina, lo cual permite el movimiento de contracción del músculo.

Cuando el músculo se daña, bien ya sea el músculo cardíaco, en el momento de una necrosis miocardíaca consecutiva a un infarto de miocardio, o bien ya sea el músculo esquelético, en el momento de esfuerzos físicos prolongados, las troponinas entonces liberadas, aparecen más o menos rápidamente, en la circulación sanguínea.

Así, de este modo, recientemente, se ha preconizado la dosificación de la troponina, para el diagnóstico precoz del infarto de miocardio, bien ya sea el de la troponina T, en Circulation (1991), 83 páginas 902-912, o bien ya sea el de la troponina I, en Am. Hart J. (1987), 110, páginas 1333-1334, y Molecular Immunology (1992), 29 (2), páginas 271-278. Además, se ha preconizado la dosificación de la troponina T cardíaca, para medir el éxito de la terapia trombolítica, consecutiva a un infarto de miocardio, en Br. Heart J., (1994), 71, páginas 242-248, así como la dosificación de la troponina I esquelética, para la medición del daño de los músculos esqueléticos (resumen nº 35 de la American Association for Clinical Chemistry, 46th National Meeting, -Asociación Americana para la Química Clínica, 46º Encuentro Nacional, New Orleans, 17-21 de Julio de 1994). Se tomará debida nota en cuanto al hecho de que, la dosificación de las diferentes troponinas cardíacas y esqueléticas, es hoy en día un medio muy útil para el diagnóstico de las patologías humanas y animales.

Es bien conocido el hecho de que, los inmunoensayos practicados en los laboratorios de análisis biológicos, necesitan el suministro, por parte del fabricante, junto a los reactivos necesarios para la dosificación (es decir, anticuerpos, marcados o no, agentes de revelación, y soluciones de dilución), también de un patrón del compuesto a determinar, el cual, al aplicarse en las condiciones análogas a las de la muestra a estudiar, servirá de referencia para el cálculo de los resultados y/o del testigo positivo.

Para obtener la muestra y/o el testigo del compuesto a determinar, se puede citar el citado compuesto purificado, en forma liofilizada (acompañado de un disolvente, en el cual, el compuesto se disolverá por parte del usuario, antes de su empleo) o listo para su empleo.

Debido al hecho de que, los reactivos biológicos, son inestables, las soluciones patrón o testigos preparados, a partir del liofilizado, se congelan en dosis unitarias, conservadas a una temperatura de -80ºC. Se ha constatado el hecho de que, además, estas soluciones, no eran estables más que durante un transcurso de tiempo de algunas horas, a una temperatura de +4ºC, incluso si se añadían inhibidores de proteasas o agentes antibacterianos. Esto obliga, por lo tanto, a los usuarios, a preparar extemporalmente sus soluciones patrón.

La solicitud de patente francesa publicado con el número FR-A-2 701 954, divulga una composición estabilizada de troponina I ó T, para inmunoensayos, caracterizada por el hecho de que, ésta, se encuentra constituida por una solución acuosa que contiene troponina I ó troponina T, en mezcla con troponina C y, especialmente, en las proporciones de 1 a 10 equivalentes molares de troponina C, por equivalente de troponina I ó T, y cloruro de calcio. Esta técnica, permite la conservación durante varios días, a una temperatura de +4ºC, de soluciones patrón, más o menos diluidas, de troponina I ó T.

La solicitud de patente francesa publicada con el número FR 2 734 267, describe soluciones patrón de la troponina, compuestas por un complejo ternario, formado por la troponina I, la troponina T y la troponina C.

Las materias primas utilizadas para obtener estos patrones, son de origen humano o animal y, los patrones o testigos de esta forma obtenidos, son estables, durante un transcurso de tiempo de un mes, a una temperatura de +4ºC.

El documento de solicitud de patente internacional WO 94/15 217, describe ciertos péptidos sintéticos, útiles como inmunógenos, para la preparación de anticuerpos que reconocen el péptido N-terminal de la troponina I. Algunos de estos péptidos, pueden utilizarse como patrones, en las inmunodosificaciones de la troponina I, aplicando los anticuerpos objeto de la presente invención, amparada por el documento de solicitud de patente internacional WO 94/15 217.

Adicionalmente, el documento de solicitud de patente internacional WO 94/27 156, se refiere a un procedimiento de dosificación de la troponina I cardíaca, que aplica anticuerpos específicos de la troponina I cardíaca. Estos anticuerpos, pueden prepararse a partir de fragmentos peptídicos que tienen una secuencia ausente de la troponina I del músculo esquelético y, por lo tanto, específica de la troponina I cardíaca. No obstante, esta solicitud de patente, no divulga, ni sugiere, la posibilidad de utilizar ciertos fragmentos peptídicos, como patrones, en los inmunoensayos de la troponina I.

Se conocen, igualmente, a raíz del documento de solicitud de patente internacional WO 96/27 661, soluciones acuosas para estabilizar proteínas y péptidos. Estas soluciones, encuentran principalmente su aplicación, en los tests de ensayo de diagnósticos de proteínas o péptidos.

Según el documento de solicitud de patente internacional WO 96/27 661, tales tipos de soluciones, permiten incluso aumentar la estabilidad de los fragmentos de la troponina I, que se conocen por ser menos estables que la troponina I entera.

La solicitud de patente europea EP-A-752 426, publicada en fecha 8 de enero de 1967, describe también patrones de la troponina I, compuestos por uno o por varios péptidos, fijados sobre una molécula portadora, tales como proteínas de alto peso molecular (>100 KD) o polímeros.

La solicitud de patente europea EP-A-650 053, describe patrones sintéticos, los cuales contienen sitios activos, para uno o para varios receptores, unidos entre ellos mediante una estructura arborescente. Esta solicitud de patente, describe, de una forma más especial, patrones específicos de la troponina T, los cuales no son estables en solución, más que durante un transcurso de tiempo de 3 semanas.

El documento de solicitud de patente internacional WO 98/24 816, describe compuestos sintéticos biepitópicos, susceptibles de poderse utilizar como patrones, en las dosificaciones biológicas de la troponina I.

Estos compuestos, se encuentran constituidas por estructuras lineales que comprenden dos secuencias peptídicas epitópicas, diferentes de la troponina I, unidas entre ellas, mediante un grupo de enlace ("linker"), formado por un esqueleto hidrocarbonado y/o por un esqueleto peptídico, en el cual, los dos epítopes, pueden, además, encontrarse unidos mediante sus extremos N- y C-terminales, a secuencias peptídicas adicionales.

Los compuestos sintéticos epitópicos de esta forma obtenidos, presentan una excelente estabilidad en solución, pero una insuficiente linealidad de dilución.

Por "linealidad de dilución", se entenderá la función que representa la señal obtenida, en función del factor de dilución del compuesto de referencia, función ésta, la cual, de una forma ideal, debe estar representada por una recta.

Se conocen, además, a raíz del documento de solicitud de patente internacional WO 95/04 543, estructuras sintéticas peptídicas, constituidas por una matriz de naturaleza peptídica, que comprende ramificaciones formadas por péptidos ramificados sobre grupos laterales del péptido matriz, por intermediación de un enlace dendrítico.

Estas estructuras dendríticas ramificadas, son de utilidad para la concepción de proteínas que presentan una topología helicoidal determinada.

Los trabajos de los inventores que han permito llegar a la presente invención, han permitido descubrir el hecho de que, las estructuras ramificadas del tipo que se describe en el documento de solicitud de patente internacional WO 95/04 543, que comprenden brazos laterales ramificados que portan por lo menos dos secuencias epitópicas diferentes de la troponina I, proporcionan patrones o testigos para inmunoensayos, en vistas a la dosificación de la troponina I, que presentan, a la vez, una estabilidad elevada, en solución, a una temperatura de 4ºC, y una excelente linealidad de dilución.

La invención, tiene por objeto la utilización de por lo menos un compuesto sintético, que comprende:

- una molécula portadora que posee una cadena hidrocarbonada peptídica, formada por

a): encadenamientos de 7 a 50 aminoácidos que forman una cadena hidrocarbonada, abierta, la cual comprende, por lo menos, un encadenamiento que introduce una rigidez en la molécula, de tal forma que, los encadenamientos formados por los átomos de la cadena hidrocarbonada, no se encuentren ya más, todos ellos, en libre rotación; o

b): encadenamientos de 8 a 50 aminoácidos que forman un ciclo;

comprendiendo, la citada cadena hidrocarbonada, por lo menos dos residuos seleccionados de entre el grupo constituido por aminoácidos de cadenas laterales básicas, aminoácidos de cadenas laterales cargadas negativamente, aminoácidos de cadenas laterales hidroxiladas, y aminoácidos de cadenas laterales que contienen azufre, que permiten el injerto de brazos laterales sobre la citada cadena hidrocarbonada; y

- por lo menos dos epítopes diferentes, portados por los citados brazos laterales injertados sobre la citada molécula portadora,

como patrón o testigo para inmuno-dosificaciones de moléculas biológicas, especialmente, de polipéptidos o proteínas.

Es deseable el tener un espaciamiento mínimo de las funciones reactivas, o susceptibles de poder reaccionar, sobre las cuales se encuentran injertados los brazos laterales que portan epítopes.

A dicho efecto, se prefiere que, los epítopes, se encuentren espaciados sobre los brazos laterales, por lo menos de 40 \ring{A}, lo cual corresponde a un espaciamiento de por lo menos tres aminoácidos.

Se prefiere, además, el hecho de que, los brazos laterales que portan los epítopes, se encuentren dispuestos sobre la molécula portadora, de tal forma que no exista un impedimento estérico ni interacción entre los citados brazos, de una forma particular, en el momento de la reacción inmunológica de uno o de varios de estos epítopes, con anticuerpos.

De una forma ventajosa, los brazos laterales, se encuentran dispuestos de tal modo que éstos formen, entre ellos, un ángulo, pudiéndose éste obtenerse, mediante la introducción de una torsión o rigidez en la cadena hidrocarbonada, de tal forma que, los brazos laterales, se encuentren dispuestos en orientaciones no paralelas y, de una forma preferible, opuestas.

La cadena hidrocarbonada es, de una forma ventajosa, un oligopéptido o polipéptido formado por aminoácidos naturales, tales como los que se encuentran en las proteínas procariotas o eucariotas, o incluso aminoácidos no naturales.

Se prefiere, en este caso, el hecho de que, dos brazos consecutivos laterales, estén portados por dos aminoácidos tales como los que se han definido anteriormente, arriba, espaciados el uno con respecto al otro, por un número 2n+1 de aminoácidos, de una forma preferente, no comportando ninguna cadena lateral reactiva, o comportando una cadena lateral reactiva inactivada, en donde, n, representa un número entero, y éste, se encuentra ventajosamente comprendido entre 1 y 6. De una forma preferente, n = 2, proporcionando, no obstante, los valores n = 3, n = 4 y n = 5, buenos resultados.

Según una primera forma de realización de la invención, la cadena hidrocarbonada, es abierta, y ésta comprende por lo menos un encadenamiento que introduce una rigidez en la molécula, de tal modo que, los encadenamientos formados por los átomos de la cadena hidrocarbonada, no se encuentren ya más, todos ellos, en libre rotación.

Puede por ejemplo tratarse de un átomo de carbono sp^{2}, por ejemplo, cuando la cadena hidrocarbonada no es de naturaleza peptídica, o no es exclusivamente de naturaleza peptídica, o de un átomo de carbono de un ciclo.

Cuando la cadena hidrocarbonada es de naturaleza peptídica, el distanciamiento entre dos brazos laterales consecutivos que permiten evitar las interacciones entre los átomos de un lateral con los átomos del otro brazo lateral, se obtiene previendo un desplazamiento de 2n + 1 aminoácidos, entre los aminoácidos que portan los brazos laterales, siendo n, tal y como se define anteriormente, arriba, o introduciendo, en la cadena peptídica, un aminoácido cíclico que genera una rigidez, en esta cadena, o incluso previendo, simultáneamente, una u otra de estas alternativas.

La rigidez de la molécula portadora, puede conferirse, por ejemplo, mediante un residuo de prolina.

Según una segunda forma de realización de la presente invención, la cadena hidrocarbonada, especialmente, oligopeptídica o polipeptídica, es cerrada, de modo que forme un ciclo.

Una secuencia peptídica que permite satisfacer de la mejor forma, las condiciones mencionadas anteriormente, arriba, para obtener el distanciamiento deseado, responde a la fórmula:

X_{1}-A_{1}-A_{2}-A_{3}-A_{4}-A_{5}-X_{2}-A_{6}

en la cual,

X_{1} y X_{2}, idénticas o diferentes, son los aminoácidos que portan los brazos laterales, y se eligen entre un aminoácido de cadena lateral básica, un aminoácido de cadena lateral cargada negativamente, un aminoácido de cadena lateral hidroxilada, y un aminoácido de cadena lateral azufrada, representando, X_{1} y X_{2}, de una forma preferente, la lisina,

A_{1} y A_{2}, representan un aminoácido elegido entre la prolina, la fenilalanina, la glicina, la alanina, la valina, la leucina y la isoleucina;

con la reserva de que, una de las A_{1} y A_{2}, se elijan entre la prolina y la fenilalanina,

A_{3}, representa un aminoácido elegido entre la glicina, la alanina, la valina, la leucina y la isoleucina, de una forma preferente, la glicina,

A_{4}, representa un aminoácido elegido entre la arginina y la histidina, de una forma preferente, la arginina,

A_{5}, representa un aminoácido elegido entre la glicina, la alanina, la valina, la leucina y la isoleucina, de una forma preferente, la alanina,

A_{6}, representa un aminoácido elegido entre la glicina, la alanina, la valina, la leucina y la isoleucina, de una forma preferente, la glicina.

Así, de este modo, secuencias peptídicas mínimas particularmente preferidas, son las siguientes

KGPGRAKG: (SEQ. ID. Nº 1)

KGFGRAKG: (SEQ. ID. Nº 2)

KPGGRAKG: (SEQ. ID. Nº 3)

KFPGRAKG: (SEQ. ID. Nº 1)

Se prefiere el hecho de que, la molécula portadora, comprenda por lo menos dos residuos elegidos entre los aminoácidos de cadenas laterales básicas, especialmente, la lisina, los aminoácidos de cadenas laterales cargadas negativamente, especialmente, el ácido glutámico o el ácido aspártico, los aminoácidos de cadenas laterales hidroxiladas, especialmente, la serina y la treonina, y los aminoácidos de cadenas laterales que contienen azufre, especialmente, la cisteína, prefiriéndose la lisina. De una forma general, la molécula portadora según la invención, tiene una masa molecular que no sobrepasa de aproximadamente 8 kilodaltons. Las moléculas portadoras preferidas según la invención, tienen una masa molecular inferior a aproximadamente 5 kilodaltons. La masa molecular media requerida es, de una forma general, de aproximadamente 1 más o menos 0,2 kilodalton.

Los epítopes, pueden consistir en epítopes cualesquiera de la molécula biológica a dosificar, para los cuales existen anticuerpos, de una forma preferente, anticuerpos específicos.

Se pueden citar, para la troponina I, anticuerpos descritos por parte de Larue et al (Molec. Immunnology, (1992), volumen 20 nº 29, páginas 271-278). Bodor et al. (Clin. Chem. (1992), volumen 38 nº 11, páginas 2203-2214). Granier et al (Protein Science (1997), volumen 6 suplemento 1, página 61) y en el documento de solicitud de patente internacional WO 94/15 217. La mayoría de estos anticuerpos, se encuentran comercialmente disponibles en el mercado (Hytest LTD-Turku, Finlandia). Se prefieren, especialmente, los anticuerpos 11E12 y 8E1.

Los epítopes, se denominan, en la parte que sigue de este documento, como E1 y E2, siendo, E1, diferente de E2.

Los epítopes E1 y E2, pueden encontrarse presentes en un solo ejemplar, cada uno, sobre la molécula portadora, o en varios, especialmente, en dos o tres ejemplares.

En ese último caso, los dos ejemplares del mismo epítope, pueden encontrase presentes sobre el mismo brazo lateral, o sobre dos de los brazos laterales.

De una forma ventajosa, la síntesis de los compuestos en concordancia con la presente invención, pueden controlarse rigurosamente: para asegurar el número de epítopes E1 ó E2, que se han enlazado sobre la molécula portadora, se podrá utilizar la obra siguiente: Synthetic Peptides, A user's guide, -Péptidos sintéticos, Una guía para el usuario-, editado por parte de Gregory A. Grant, (UWBC Biotechnological Resource Series, Richard R. Burgess series editor), 1992, en el capítulo 4: Evaluation of the finished product, -Evaluación del producto acabado-. Véase posteriormente, a continuación.

Se prefiere, no obstante, el hecho de que, un mismo brazo lateral, no comporte ya más que dos epítopes idénticos o diferentes.

En el caso en donde, los epítopes, se encuentren presentes en más de dos ejemplares, se prefiere que, éstos dos, sean portados por otros tantos brazos laterales suplementarios.

Cuando éstos se encuentran presentes en dos ejemplares, sobre el mismo brazo lateral, los epítopes E_{1} y E_{2}, se encuentran separados, de una forma preferente, los unos con respecto a los otros, mediante un grupo de enlace ("linker"), que puede ser de naturaleza peptídica o de naturaleza no peptídica.

También, el grupo de enlace Z, puede presentar:

- una secuencia peptídica de 1 a 40 aminoácidos, de una forma preferente, de 3 a 20 aminoácidos, con la condición, no obstante, de que, el encadenamiento formado por los epítopes y el grupo de enlace Z, no formen, conjuntamente, una parte de la secuencia de la molécula biológica a dosificar, especialmente, la troponina I;

- una cadena aminoalquil-(C_{1}-C_{10})carbonilo, lineal o ramificada;

- una construcción mixta, constituida por lo menos por una secuencia peptídica de 1 a 10 aminoácidos, y por lo menos una cadena aminoalquil-(C_{1}-C_{10})carbonilo, lineal o ramificada.

Se considera que -E_{1}-Z-E_{2} -, no es una parte de la secuencia de la molécula biológica a dosificar, especialmente, la troponina I, cuando -E_{1}-Z-E_{2} -, difiere de una fragmento dado de la secuencia de la molécula a dosificar, por ejemplo, la troponina I, mediante sustitución, deleción o inserción no conservadora de por lo menos un aminoácido, de una forma preferente, de 2 aminoácidos, de una forma más particular, de 5 aminoácidos.

Z, puede representar

\bullet una cadena de la fórmula:

-NH-(CH_{2})_{m}-CO-

en la cual, m represente un número entero de 1 a 10,

\bullet o una construcción mixta de las fórmulas:

\quad: -[pep_{1}-NH-(CH_{2})_{m}CO-]_{p}-

\quad: -[pep_{1}-NH-(CH_{2})_{m}CO-pep_{2}]_{p}-

\quad: -[NH-(CH_{2})_{m}CO-pep_{2}]_{p}-

en las cuales,

- m, representa un número entero de 1 a 10,

- p, representa un número entero de 1 a 5, y

- pep_{1} y pep_{2}, idénticas o diferentes, representan una cadena peptídica, la cual comporta de 2 a 10 aminoácidos.

Los brazos laterales que portan los epítopes que comprenden, de una forma preferente, en los extremos N- y C-terminales de los epítopes, o del encadenamiento formado por -E_{1}-Z-E_{2} -, grupos suplementarios, respectivamente, Z_{1} y Z_{2}.

De una forma ventajosa, Z_{1}, representa:

\bullet un átomo de hidrógeno, un grupo acetilo, una secuencia peptídica de 1 a 10 aminoácidos, una secuencia peptídica de 1 a 10 aminoácidos N-terminales \alpha-acetilada, un grupo cisteinilo, biotinilo o bioctinilo, una secuencia peptídica de 1 a 10 aminoácidos, que porta un resto cisteinilo, amino, hidroxilo, halógeno, carboxilo, biotinilo o bioctinilo,

\bullet una cadena aminoalquil-(C_{1}-C_{10})carbonilo, lineal o ramificada,

\bullet una cadena aminoalquil-(C_{1}-C_{10})carbonilo, lineal o ramificada N-\alpha-acetilada, ó

\bullet una construcción mixta, constituida por lo menos por una secuencia peptídica de 1 a 10 aminoácidos y por lo menos una cadena aminoalquil-(C_{1}-C_{10})carbonilo, lineal o ramificada, o

\bullet una construcción mixta, constituida por lo menos por una secuencia peptídica de 1 a 10 aminoácidos y por lo menos una cadena aminoalquil-(C_{1}-C_{10})carbonilo, lineal o ramificada, que porta un resto amino, halógeno, hidroxilo, carboxilo, biotinilo, bioctinilo o cisteinilo.

De una forma ventajosa, Z_{2}, representa:

\bullet un radical hidroxilo, un radial amino, una secuencia peptídica de 1 a 10 aminoácidos, una secuencia peptídica de 1 a 10 aminoácidos que porta un grupo terminal hidroxilo, carboxilo, halógeno, biotinilo o bioctinilo,

\bullet una cadena aminoalquil-(C_{1}-C_{10})carbonilo, lineal o ramificada,

\bullet una cadena aminoalquil-(C_{1}-C_{10})carbonilo, lineal o ramificada, que porta un radical hidroxilo ó un radical amino,

\bullet una construcción mixta, constituida por lo menos por una secuencia peptídica de 1 a 10 aminoácidos y por lo menos una cadena aminoalquil-(C_{1}-C_{10})carbonilo, lineal o ramificada,

\bullet una construcción mixta, constituida por lo menos por una secuencia peptídica de 1 a 10 aminoácidos y por lo menos una cadena aminoalquil-(C_{1}-C_{10})carbonilo, lineal o ramificada, que porta un radical hidroxilo o un radical amino.

Los brazos laterales, se encuentran ligados a la molécula portadora, bien ya sea por la intermediación de un espaciador ("spacer"), que puede ser un grupo bifuncional, que comprende, en sus extremidades, dos funciones reactivas elegidas para reaccionar con los grupos reactivos portados respectivamente por la molécula portadora y Z_{1} y Z_{2}.

Se prefiere el hecho de que, los brazos laterales comprendan epítopes formados, por cómo mucho 10 aminoácidos, de una forma ventajosa, por cómo mucho 6 aminoácidos y que, los grupos Z y Z_{1} y Z_{2}, se encuentren formados por aminoácidos naturales y/o no naturales.

Los compuestos sintéticos de la invención, pueden obtenerse mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes:

- Etapa A: proporcionar una molécula portadora, que posea una cadena hidrocarbonada, peptídica, comprenda por lo menos dos grupos reactivos que permitan el injerto de brazos laterales.

- Etapa B: eventualmente, la ciclización de la molécula portadora.

- Etapa C: proporcionar moléculas que formen los brazos laterales, que comprendan, por lo menos, una función reactiva con el grupo reactivo de la molécula portadora,

- Etapa D: acoplamiento de los brazos laterales y de la molécula portadora, en las condiciones apropiadas.

Cuando los espaciadores ("spacers"), son de naturaleza peptídica, las etapas anteriormente descritas, arriba, de una forma ventajosa, pueden constituir en:

- Etapa A: proporcionar un oligopéptido o polipéptido, que comprenda por lo menos dos residuos de aminoácidos, que comporten, por lo menos, dos grupos laterales funcionales (por ejemplo: amino), idénticos o diferentes.

- En el caso de un péptido ciclizado, los grupos funcionales, se eligen de tal forma que no haya interferencia en el momento de la ciclización, o entonces, éstos se protegen de una forma temporal, con la ayuda de un grupo protector usual.

Etapa B: ciclización eventual del péptido, bien ya sea directamente, o bien ya sea por la intermediación de un agente de acoplamiento.

Por ejemplo, en el caso de la formación de un enlace amida, el acoplamiento, puede realizarse mediante la intermediación de la pareja hexafluorofosfato de benzotriazolil-oxi-tris-(dimetilamino)fosfonio/1-hidroxi-benzotriazol (BOP/HOBt), en presencia de una base.

Etapa C: proporcionar péptidos de brazos laterales no protegidos, portando, cada uno de ello, un grupo funcional susceptible de poder reaccionar directamente o mediante la intermediación de un agente de acoplamiento; y a continuación,

Etapa D: acoplamiento del citado oligopéptido o polipéptido, con los péptidos que forman los brazos laterales, de tal forma que se obtenga el compuesto sintético según la invención.

En una forma de realización preferida, las funciones reactivas de la molécula portadora, son funciones amino, activadas mediante la intermediación de un grupo bifuncional _{s}SMCC.

En la etapa D, el enlace entre el brazo lateral y la molécula portadora, se realiza mediante una reacción de sustitución nucleófila, entre un residuo -SH del péptido denominado brazo lateral, sobre un grupo maleimida de la molécula portadora.

La molécula portadora y los brazos laterales, se obtienen mediante los procedimientos clásicos de la síntesis orgánica y/o de la química de los péptidos, eventualmente y dado el caso.

Los péptidos de la molécula portadora y de los brazos laterales que portan los epítopes, pueden obtenerse mediante síntesis en fase sólida, según los procedimientos clásicos descritos por parte de R.B. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. (1963), 85, páginas 2149-2154; R.C. Sheppard, en "Peptides 1971", Nesvadba H (ed.) Norht Holland, Ámsterdam, páginas 111; E. Atherton y R.L. Sheppard, en "Solid phase peptide synthesis, a practical approach", -Síntesis de péptidos en fase sólida, un estudio práctico-, IRL PRESS, (1989), Oxford University Press, páginas 25-34.

Como sintetizador automático, se puede utilizar el sintetizador "9050 Plus Pep Synthesizer" de Millipore, "Pioneer" de Perspective, o el sintetizador "433A" de ABI.

Los péptidos, pueden igualmente obtenerse, mediante síntesis en fase homogénea.

El soporte sólido utilizado para las síntesis, debe ser compatible con la técnica de la química utilizada. Así, por ejemplo, para una síntesis sobre el sintetizador "9050 Plus pep. Synthesizer", es recomendable el utilizar una resina adaptada a la técnica denominada "en flujo continuo"; las resinas PEG PS, responden a estos criterios. Estos soportes, se encuentran constituidos por UN brazo espaciador ("spacer"), a base de polietilenglicol (PEG), situado entre el grupo funcional del poliestireno de las bolitas, y el punto de enlace del primer aminoácido. La naturaleza de este punto de enlace, puede variar según la función C-terminal elegida. Así, por ejemplo, para un péptido en forma de amida, se podrá tomar una resina del tipo PAL PEG PS.

Las resinas de Novabiochem, responden también a los criterios necesarios para la síntesis en fase sólida, de flujo continuo. Éstas presentan, además, la ventaja de poder liberar el péptido, después de las síntesis, en las condiciones ácidas denominadas dulces, lo cual permite obtener fragmentos peptídicos, cuyas cadenas laterales de aminoácidos, se encuentran aún protegidas por grupos químicos.

La resina de partida de los aminoácidos utilizados como primera materia, son productos disponibles en el mercado (PerSeptive-Biosystem, Perkin-Elmer; Novabiochem.

Los grupos protectores de cadenas laterales que pueden utilizarse, se encuentran representados en la tabla I:

TABLA I Grupos protectores

1

La protección temporal de la función amina primaria en \alpha de los aminoácidos, puede efectuarse con ya ayuda del grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La desprotección, puede efectuarse mediante una solución de piperidina a un 20%, en dimetilformamida.

Para el acoplamiento, se utiliza, de una forma preferente, un exceso de diisopropilcarbodiimida (DIPCDI) y 1-hidroxi-benzotriazol (HOBt).

Para los péptidos cíclicos que constituyen la molécula portadora, se utiliza, de una forma preferente, la resina Fmoc Ala Nova Syn.

Después de la síntesis, la resina, se lava con disolventes orgánicos (dimetilformamida y, a continuación, diclorometano), se seca sobre la acción de vacío y, a continuación, se trata con una solución base de ácido.

Los péptidos de esta forma aislados, se precipitan, a continuación, y se lavan con éter.

Para las moléculas portadoras formadas de péptidos cíclicos, se puede por ejemplo realizar una ciclización denominada "cabeza y cola". Para esta etapa, el péptido, se disuelve en DMF, siendo, el agente de acoplamiento, la pareja BOP/HOBt, en presencia de una base como la diisopropilenamina (DIEA), o la N-metilmorfolina (MMM). Después de la extracción, el péptido ciclizado, se precipita y, a continuación, se lava mediante una solución a base de éter.

El péptido de esta forma obtenido, se trata, a continuación, mediante una solución de ácido trifluoroacético y, a continuación, se precipita y se lava con éter, otra vez.

Para las moléculas portadoras de naturaleza peptídica, no cíclicas, se utiliza una resina PALPEG PS. Después de la síntesis, la resina, se lava sobre disolventes orgánicos, (dimetilformamida, diclorometano), se seca sobre la acción del vacío y, a continuación, se trata mediante una solución a base de ácido trifluoroacético, enfriado a una temperatura de 0ºC, y que contiene sus secuestrantes ("scavangers") apropiados. Se puede utilizar, por ejemplo, el reactivo K, que contiene un 82% de ácido trifluoroacético, un 5% de fenol, un 5% de agua, un 5% de tioanisol y un 3% de etanoditiol.

Los péptidos que forman los brazos laterales, pueden obtenerse, de una forma particular, tal y como se describe en la el documento de patente internacional WO 98/24 816.

Los péptidos sintéticos de esta forma aislados, se precipitan, a continuación, con éter.

Los compuestos sintéticos cíclicos o lineales, se purifican, a continuación, mediante cromatografía líquida en fase inversa y, su pureza, se determina mediante espectrometría de masas. Como fase, se puede utilizar, por ejemplo, la fase Bondapak C-18. Los péptidos, se eluyen por mediación de un gradiente lineal, entre dos soluciones tampón, la primera, esencialmente acuosa (por ejemplo agua-TFA 0,1%) y, la segunda, más bien orgánica (por ejemplo, una mezcla de que contiene acetonitrilo 60%, agua 40% y TFA 0,08%). Las fracciones puras recogidas, se reúnen, se concentran bajo la acción del vacío, y se liofilizan y, su pureza, se controla mediante espectrometría de masa, tal y como se indica en la obra siguiente: Synthetic Peptides, A user's guide, -Péptidos sintéticos, Una guía para usuarios-, editada por Gregory A. Grant (UWBC Biotechnological Resource Series, Richard R. Burgess Series editor), 1992, en el capítulo 4: Evaluation of the finished product, -Evaluación del producto acabado.

Las funciones de las cadenas laterales de ciertos aminoácidos (por ejemplo, lisina, arginina, cisteína, etc.) constitutivas del oligopéptido o del polipéptido portador, se activan, a continuación, mediante un grupo bifuncional que permite el enlace de una forma específica, o no, de uno o de varios péptidos (que forman los brazos laterales). Como ejemplo de cadena lateral arriba pretendida, que pueden utilizarse, en este tipo de enlace, se pueden citar las cadenas que portan grupos amino (primario/secundario), carboxilo, tiol, hidróxido, aldehído, etc...

Como ejemplo de compuestos que comprenden grupos bifuncionales, se pueden utilizar los compuestos siguientes:

-: BS_{3}: bis(sulfosuccinimidil)suberato;

-: _{s}SMCC: (sulfosuccinimidil-4-N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato.

-: BMH: bis-maleidohexano

-: 5MBS: éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxi-sulfosuccimida

-: MPBH: Hidróxido del ácido 4-(4-N-maleimidofenil)-butírico

-: EDC: 1-etil-3-(3-diemetilaminopropilato)carbodiimida

Utilizando la técnica de espectrometría de masa, anteriormente citada, arriba, en los compuestos sintéticos finales en concordancia con la presente invención, la persona experta en el arte especializado de la técnica, puede verificar el grado de pureza de un compuesto de este tipo. Además, se puede controlar, de una forma clara y no ambigua, el hecho de que, la masa molecular del citado compuesto, medida de una forma efectiva mediante espectrometría, corresponde bien a la masa molecular esperada, en vista de las masas moleculares de las moléculas de partida (molécula portadora, epítopes,...). La presente invención, permite por lo tanto, a la persona experta en el arte especializado de la técnica, el controlar de una forma precisa, las síntesis que éste realiza, y saber exactamente lo que éste hace.

La invención, tiene igualmente por objeto, compuestos que comprenden dos epítopes diferentes de la tropotina I, tal y como éstos se han definido anteriormente, arriba.

Como epítopes de la troponina I, se pueden citar, especialmente, las secuencias peptídicas TPH (SEQ. ID. Nº 5), ALLGAR (SEQ. ID. Nº 6) y FAEL (SEQ. ID. Nº 7), o las secuencias que comprenden éstas últimas.

La invención, tiene igualmente por objeto, composiciones que contienen los compuestos de la invención, que comprenden, por lo menos, dos epítopes de la troponina I.

Se trata, de una forma preferente, de soluciones acuosas o de composiciones constituidas por compuestos sintéticos biepitópicos, tales como los que se han descrito anteriormente, arriba, en una solución tampón. Como solución tampón, se puede utilizar, por ejemplo, una solución tampón fosfato (KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} pH = 6,5-7,5) que contiene Kathon® y albúmina sérica bovina (BSA), o Kathon®, Régilait® y EDTA, o Kathon®, Plasmion® y eventualmente EDTA, o Kathon®, caseína y EDTA.

Se puede utilizar, igualmente, una solución tampón succinato (pH = 5-6) ó Tris HCl (pH = 7,5-8,5), que contenga o Kathon® y albúmina sérica bovina, o Kathon®, Régilait y EDTA, o Kathon®, Plasmion® y eventualmente EDTA, o Kathon®, caseína y EDTA.

Las soluciones tampón que contienen glicina, Kathon®, Réagilait y EDTA, pueden igualmente utilizarse.

Se prefiere utilizar una solución tampón succinato o fosfato, que contenga Kathon®, Réagilait y EDTA.

El Kathon®, agente antibacteriano comercializado por la Societé Rohm et Hass, está constituida por la 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona y la 2-metil-4-isotiazolin-3-ona (1,5%).

El Régilait, es una leche en polvo, descremada, comercializada por la sociedad Régilait (Francia).

El Plasmion®, se comercializa por el laboratorio Laboratoires Bellon (Francia), y está constituido por gelatina fluida modificada (30 g/l), NaCl (5,383 g/l), MgCl (143 mg/l), KCl (373 mg/l) lactato de sodio (3,360 g/l), en agua.

Las soluciones tampón siguientes, son las que se prefieren de una forma particular:

- solución tampón succinato 0,1 m(pH = 6), que contiene Kathon® (a un 0,2%), Réagilait® (0,05-2%) y EDTA 2 mM,

- solución tampón succinato 0,1 m(pH = 6), que contiene Kathon® (a un 0,2%), caseína (0,01-0,5%) y EDTA 2 mM,

- solución tampón succinato 0,1 m(pH = 6), que contiene Kathon® (a un 0,2%) y BSA a un 1%,

- solución tampón fosfato KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} 0,1 M (pH = 7,5), que contiene Kathon® (a un 0,2%), Réagilait® (0,05-2%) y EDTA 2 mM,

- solución tampón fosfato KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} 0,1 M (pH = 7,5), que contiene Kathon® (a un 0,2%), caseína (0,01-0,1%) y EDTA 2 mM,

- solución tampón fosfato KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} 0,1 M (pH = 7,5), que contiene Kathon® (a un 0,2%) y BSA a un 1%.

Las composiciones que contienen plasma, suero y un compuesto de la invención definidas anteriormente, arriba, hacen también parte de la presente invención.

Los procedimientos de inmunodosificaciones que utilizan como patrones o testigos, los compuestos tal y como se han definido anteriormente, arriba, hacen igualmente parte de la presente invención.

La invención, prevé también, maletines de aplicación de inmunoensayos que incluyen por lo menos un compuesto biepitópico definido anteriormente, arriba, o por lo menos una composición que contiene un péptido biepitópico definido anteriormente, arriba.

Los ejemplos que se facilitan a continuación, ilustran la invención, y se proporcionan a título no limitativo.

Ejemplo 1 Preparación de compuesto biepitópicos sintéticos según la invención A. Preparación de la molécula portadora

Se procede a preparar un péptido cíclico de la fórmula:

2

siendo, el código, de una letra.

Este péptido, se sintetiza en fase sólida, mediante la técnica puesta a punto en el año 1963, por parte de Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, páginas 2149-2154), tal y como se ha descrito anteriormente, arriba.

Para la síntesis del compuesto anterior, de arriba, se han utilizado, como sintetizador, el sintetizador 9050 Plus Synthesizer y, como resina, la resina Fmoc Ala Nova Syn. Las diferentes etapas de la síntesis, se encuentran resumidas en la tabla II siguiente:

TABLA II Etapas de la síntesis

3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{145mm} Dc* significa doble acoplamiento.
Un doble acoplamiento, puede efectuarse para aumentar la pureza del
péptido.\end{minipage} \cr}

La final de la síntesis, la resina, se lava con dimetilformamida y, a continuación, con diclorometano, y se seca al vacío.

A continuación, la resina, se trata con una solución que contiene ácido acético, metanol y diclorometano (5/1/4 V/V/V).

La resina, se aísla del péptido en solución, mediante filtración. El filtrado, se concentra y, el péptido, se aísla mediante precipitación con éter enfriado. Se obtienen, de este modo, 0,145 g del compuesto.

El péptido, se cicliza a continuación, de la forma siguiente:

Se procede a disolver 100 mg del compuesto, en 18 ml de dimetilformamida, a los cuales se les añade, de una forma sucesiva, 2 equivalentes de BOP, 2 equivalentes de HOBt y 5 equivalentes de DIEA.

Después de dos horas de reacción, el péptido, ciclizado, se extrae en un ampolla de decantación.

La fase orgánica, se seca, a continuación, sobre Na_{2}SO_{4} y, a continuación, se concentra en el Rotavapor®, con la ayuda de todo otro evaporador rotativo apropiado. El péptido ciclizado, se precipita, a continuación, en una mezcla de éter, de acetato de etilo y de hexano (6/3/1) V/V/V), durante un transcurso de tiempo de 15 horas, a una temperatura de 0ºC. Se obtienen 70 mg del péptido ciclizado, es decir, 70 mg de molécula portadora.

B. Preparación de compuestos sintéticos biepitópicos según la invención

Se procede activar 8 mg de molécula portadora (es decir, del péptido ciclizado precedente, de arriba), disueltos en una mezcla DMF/tampón (1/3 / 2/3), mediante 6 equivalentes de _{s}SMCC, añadidos gota a gota. La reacción, se mantiene bajo régimen de agitación, durante un transcurso de tiempo de aproximadamente 45 minutos, a una temperatura de 18-25ºC. La molécula portadora activada, se separa del exceso de _{s}SMCC, mediante HPLC. Las fracciones puras, se reúnen y se liofilizan. Se obtienen 4,5 mg de molécula portadora activada (rendimiento \approx 45%).

Se disuelven 2 mg de molécula portadora activada, en un tampón PBS pH 6,5. A esta solución, se le añaden 2 equivalentes (es decir, 8 mg) del péptido TRP 1116 Ac siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

Ac-GSSNYRAYA-(TPH)-AKK-Hx-PLELAGLG-(FAEL)-QDLCRQ-NH_{2}

(SEQ. ID. Nº 9).

\vskip1.000000\baselineskip

Las secuencias peptídicas entre paréntesis, representan epítopes de la troponina I.

La reacción, se mantiene en régimen de agitación, durante un transcurso de tiempo de cuatro horas, a una temperatura de 18-25ºC.

El compuesto según la invención de esta forma obtenido, se desala, a continuación (HPLC/diálisis).

La masa molecular, se evalúa mediante espectrometría de masa (según el protocolo indicado en la obra Synthetic Peptides, A user's guide, -Péptidos sintéticos, Una guía para usuarios-, editada por A. Grant (UWBC Biotechnological Resource Series, Richard R. Burgess series editor), 1992, en el capítulo 4: Evaluation of the finished product, -Evaluación del producto acabado.

Del mismo modo, se han preparado los compuestos según la invención PEP 5, PEP 9 y PEP 10, de las fórmulas siguientes:

- compuesto PEP 5:

4

- compuesto PEP 9:

5

- compuesto PEP 10:

6

en dos lotes PEP 10 P1 y PEP 10 P2

Los resultados de estabilidad y de linealidad de dilución de los compuestos según la invención, se proporcionan abajo, a continuación.

Ejemplo 2 Estabilidad de los compuestos según la presente invención

Se procedió a evaluar la estabilidad de los compuestos PEP5, PEP9 y PEP10, en ensayo ELISA, de lectura en quimioluminiscencia (señal expresada en Unidades Relativas de Luminiscencia o URL), con la ayuda de un autómata de la sociedad Beckman, distribuido por Bio-Rad (Marnes la Coquette, Francia) y, a continuación, ésta se comparó con la de un compuesto biopeptídico de referencia, no ciclizado, correspondiente al arte de la técnica anterior (TR 116 Ac), analizado de la misma forma.

Los resultados, se presentan en la tabla III que se facilita a continuación.

TABLA III

7

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 *  \hskip0.2cm   \begin{minipage}[t]{140mm} Número de
aceptación de las diluciones: El factor de relación señal
experimental/señal teórica, a una dilución dada, debe ser igual a
1,00  \pm  0,2, para que el compuesto sea diluíble. Las diluciones
que proporcionan señales inferiores a 100 000 unidades URL, no deben
tenerse en cuenta.\end{minipage} \cr  **  \hskip0.1cm 
 \begin{minipage}[t]{140mm} Norma de aceptación de las
estabilidades: para que la estabilidad a un día X, después de JO,
sea aceptable, debe obtenerse un factor de relación de señal a JO +
X/señal JO, que sea igual a 1,00  \pm  0,2.\end{minipage} \cr 
***  \begin{minipage}[t]{140mm} Tampón succinato 0,1 M, pH 6,0,
que contiene Kathon a un 0,2%, Régilait a un 0,2% y EDTA 2 mM (o
bien tampón succinato 0,1 M, pH 6,0, que contiene Kathon a un 0,2% y
BSA a un 1%.\end{minipage} \cr  ND = no
determinado\cr}

El compuesto correspondiente al arte anterior de la técnica TRP 1116 Ac, no es estable a JO + 24 horas, y más allá, a +4ºC.

Los compuestos según la invención PEP5, PEP9 y PEP10, son todos estables a una temperatura de +4ºC, después de 3 meses, o incluso 6 meses, para PEP 9, y 12 meses para PEP 5.

Ejemplo 3 Resultados lineales de las curvas de dilución

Los resultados, se presentan en la tabla 5 que se facilita a continuación.

Norma de aceptación de las diluciones: el factor de relación señal experimental/señal teórica, a una dilución dada, debe ser igual a 1,00 \pm 0,2, para que el compuesto sea diluíble. Las diluciones que proporcionan señales inferiores a 100 000 unidades URL, no deben tenerse en cuenta.

Resultados expresados en unidades de señal (URL) TABLA 5

8

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

Las curvas de dilución de los compuestos según la invención, PEP 5, PEP 9 y PEP 10, presentan todavía una buena linealidad, incluso a fuertes diluciones, contrariamente al péptido TRP 1116 Ac.

Como consecuencia de ello, pueden obtenerse unos resultados fiables, con los compuestos según la invención : no únicamente puesto que éstos demuestran ser de una estabilidad mayor que los compuestos correspondientes al arte de la técnica anterior, sino que, además, incluso, éstos permiten obtener una curva de dilución lineal. En otros términos, éstos resuelven el problema planteado.

<110> Bio-Rad Pasteur

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Compuestos sintéticos que portan dos epítopes para inmunodosifcaciones

\vskip0.400000\baselineskip

<130> BET 01/1239

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP 00958689.2-1223

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 200-08-14

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> molécula portadora

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gly Pro Gly Arg Ala Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> molécula portadora

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gly Phe Gly Arg Ala Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> molécula portadora

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Pro Gly Gly Arg Ala Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> molécula portadora

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Phe Gly Gly Arg Ala Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> troponina I epítope

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Glu Pro His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> troponina I epítope

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Leu Leu Gly Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> troponina I epítope

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ala Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> molécula portadora

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido cíclico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gly Pro Gly Arg Ala Lys Gly Pro Gly Ser Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido TRP 1116 Ac

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ACETILACIÓN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Hx

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala}

\sac{Lys Lys Xaa Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu}

\sac{Leu Gln Asp Leu Cys Arg Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto biepitópico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido cíclico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> posición del brazo del sitio 1116 Ac

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> posición del brazo del sitio 1116 Ac

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gly Pro Gly Arg Ala Lys Gly Pro Gly Ser Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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<220>

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<223> compuesto biepitópico

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ACETILACIÓN

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<220>

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<221> SITIO

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<222> (1)..(1)

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<223> posición del brazo del sitio 1116 Ac

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<220>

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<221> SITIO

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<222> (7)..(7)

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<223> posición del brazo del sitio 1116 Ac

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (12)..(12)

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<223> AMIDACIÓN

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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\sa{Lys Gly Pro Gly Arg Ala Lys Gly Pro Gly Ser Ala}

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<210> 12

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> compuesto biepitópico

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ACETILACIÓN

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<220>

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<221> SITIO

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<222> (1)..(1)

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<223> posición del brazo del sitio 1116 Ac

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<220>

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<221> SITIO

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<222> (7)..(7)

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<223> posición del brazo del sitio 1116 Ac

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (12)..(12)

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<223> AMIDACIÓN

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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\sa{Lys Gly Phe Gly Arg Ala Lys Gly Ser Gly Ser Ala}

Claims

1. Un compuesto sintético, que comprende:

b): encadenamientos de 8 a 50 aminoácidos que forman un ciclo;

- por lo menos dos epítopes diferentes, portados por los citados brazos laterales injertados sobre la citada molécula portadora.

2. Compuesto sintético, según la reivindicación 1, en el cual, los citados dos residuos que permiten el injerto de brazo lateral sobre la citada cadena hidrocarbonada, son lisinas.

3. Compuesto sintético, según la reivindicación 1, ó 2, en el cual, la citada cadena hidrocarbonada, comprende un residuo prolina.

4. Compuesto sintético, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual, cada uno de los citados brazos laterales, porta por lo menos dos epítopes de troponina I diferentes.

5. Compuesto sintético, según la reivindicación 4, en el cual, cada uno de los citados brazos laterales, porta dos epítopes de troponina I diferentes.

6. Compuesto sintético, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual, dos brazos laterales consecutivos que portan los epítopes, se portan mediante aminoácidos espaciados el uno con respecto al otro, por un número 2n + 1 de aminoácidos, en donde, n, representa un número entero y éste es entre 1 y 6.

7. Compuesto sintético, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual, la cadena hidrocarbonada de naturaleza sintética, comprende la secuencia:

X_{1}-A_{1}-A_{2}-A_{3}-A_{4}-A_{5}-X_{2}-A_{6}

en la cual,

X_{1} y X_{2}, idénticas o diferentes, portan los brazos laterales, y se eligen entre un aminoácido de cadena lateral básica, un aminoácido de cadena lateral cargada negativamente, un aminoácido de cadena lateral hidroxilada, y un aminoácido de cadena lateral azufrada, representando, X_{1} y X_{2}, de una forma preferente, la lisina,

A_{1} y A_{2}, representan un aminoácido elegido entre la prolina, la fenilalanina, la glicina, la alanina, la valina, la leucina y la isoleucina; con la reserva de que, una de las A_{1} y A_{2}, se elijan entre la prolina y la fenilalanina,

A_{5}, representa un aminoácido elegido entre la glicina, la alanina, la valina, la leucina y la isoleucina, de una forma preferente, la alanina, y

8. Compuesto sintético, según la reivindicación 7, en el cual, la cadena hidrocarbonada de naturaleza peptídica, comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias:

\newpage

: -KGPGRAKG-

: -KGFGRAKG-

: -KPGGRAKG- y

: -KFPGRAKG-.

9. Compuesto sintético, según una cualquiera de la reivindicaciones precedentes, en el cual, cada epítope, comprende por lo menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias:

: -TEPH;

: -ALLGAR: y

: -FAEL.

10. Compuesto sintético, según una cualquiera de la reivindicaciones precedentes, en el cual, la molécula portadora, se selecciona de entre el grupo constituido por:

13

11. Utilización de un compuesto, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, como patrón o testigo, para inmunoensayos de troponina I.

12. Composición que contiene por lo menos un compuesto sintético, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en solución en agua, en plasma o una solución tampón.

13. Composición, según la reivindicación 12, caracterizada por el hecho de que, la solución tampón, se elige entre las soluciones tampón fosfato, succinato y Tris HCl.

14. Composición, según la reivindicación 13, en la cual, la solución tampón, se selecciona entre el grupo constituido por las soluciones siguientes:

- solución tampón succinato (pH = 5,6) que contiene Kathon®, Régilait y EDTA,

- solución tampón succinato (pH = 5,6) que contiene Kathon®, caseína y EDTA,

- solución tampón succinato (pH = 5,6) que contiene Kathon® y BSA,

- solución tampón fosfato (KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} pH = 6,5-7,5) que contiene Kathon®, Régilait y EDTA,

- solución tampón fosfato (KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} 0,1 M, pH = 6,5-7,5) que contiene Kathon®, caseína y EDTA,

- solución tampón fosfato (KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} 0,1 M, pH = 6,5-7,5) que contiene Kathon® y BSA.

15. Procedimiento de inmunodosificación que utiliza, como patrón o testigo, por lo menos un compuesto sintético según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

16. Procedimiento, según la reivindicación 15, en el cual, la inmunodosificación, es del tipo sandwich.

17. Maletín de inmunodosificación, el cual comprende:

-: por lo menos un compuesto sintético, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, ó una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14;

-: por lo menos un reactivo usual, de aplicación de una inmunodosificación.