JPH05194384A - チオール反応性マレイミドに基づく放射性標識試薬 - Google Patents

チオール反応性マレイミドに基づく放射性標識試薬

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JPH05194384A
JPH05194384A JP4155111A JP15511192A JPH05194384A JP H05194384 A JPH05194384 A JP H05194384A JP 4155111 A JP4155111 A JP 4155111A JP 15511192 A JP15511192 A JP 15511192A JP H05194384 A JPH05194384 A JP H05194384A
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pthrp
minutes
protein
acetonitrile
tfa
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JP4155111A
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Michael Chorev
ショロヴ マイケル
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Merck and Co Inc
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 システインを含むペプチドを間接的に放射線
標識化するのに使用できる化合物の提供。 【構成】 図示の構造式で表わされるチオール反応性マ
レイミドベース化合物、ならびに本発明マレイミドベー
ス化合物を蛋白質と組合せて生体に投与することによる
生体内での該蛋白質受容体の検出・定量法及び画像診断
方法。 （Ｒは 等、Ｒ２水素又は１２２Ｉ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、７５
Ｂｒ、７７Ｂｒ、８２Ｂｒまたは２１１Ａｔから選ばれ
た放射性核種；ｍ，ｎは０〜２；ｘは０〜２である） 【効果】 結合及び受容体研究及び評価分析に、診断画
像剤及び放射線治療薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】生体分子の分子標識は、生化学、分子生物
学、免疫学、医薬のような多くの分野で使われる必要不
可欠な道具である。放射性ヨウ素化生体配位子および生
体高分子は分子標識の最も豊富な例である。高い比放射
能、かなり長い半減期、比較的簡単な製造操作のため、
放射性ヨウ素化はとりわけ最もしばしば使われる標識法
である。125 Ｉの高い比放射能とかなり長い半減期はこ
の同位体をごく少量の生体分子の標識と追跡とに特に適
したものにしている。
【０００２】放射性ヨウ素化調剤に多く依存する幾つか
の主要研究分野は、受容体研究、親和性標識、免疫化学
を含む。放射性ヨウ素化に現在利用できる方法は放射性
ヨウ素化を受ける化合物の存在で種々の酸化剤により
125 Ｉの反応系内酸化を行う直接法および対照の化合物
中のＮ−修飾アミノ官能基に予め放射性ヨウ素化した試
薬を使う間接法を含む。
【０００３】直接放射性ヨウ素化の幾つかの方法は、ク
ロラミンＴ（Ｎ−クロロ−４−メチルベンゼンスルホン
アミドナトリウム塩）〔Greenwood,F.C.ら、Biochem.
J.、８９（１９６３）参照〕、ヨード−ビーズ（重合体
クロラミンＴ）〔Markwell,M.A.K. 、Anal.Biochem. １
２５（１９８３）参照〕、ヨード−ゲン(Iodo-Gen)
（１，３，４，６−テトラクロロ−３ａ，６ａ−ジフェ
ニルグリコルリル）〔Franker,P.J.ら、Biochem.Biophy
s.Res.Commun. 、８０（１９８７）参照〕、ラクトペル
オキシダーゼ〔Thorell,J.I.ら、Biochem.Biophys.Act
a、２５（１９７１）参照〕、電気化学的酸化〔Teare,
F.W.ら、Intl.J.Appl.Rad.Isot. 、２９（１９７８）〕
を含む。これらの放射性ヨウ素化は求電子置換に対し十
分に活性であるフェノール、イミダゾリル、インドリル
のような芳香族残基上で起る。一般に、これらの酸化法
は、放射性成分を含む複雑な反応混合物を生じる〔Kosh
land,M.E.ら、J.Biol.Chem.、２３８（１９６３）参
照〕。
【０００４】ポリヨウ素化、酸化、還元（過剰の酸化剤
を分解するためメタ重亜硫酸ナトリウムのような還元剤
を使う場合）及び放射性ヨウ素化剤の十分な選択性の欠
如に伴なう単一生体分子における複数の反応性残基の存
在は冗長な精製を必要とする不均一調製物を生じる。
【０００５】間接放射性ヨウ素化は予め標識した試薬を
使い、そこで直接ヨウ素化で生じる損傷を避ける〔Bolt
on,A.E. ら、Biochem.J.、１３３（１９７３）、Wood,
F.T.ら、Anal.Biochem. 、６９（１９７５）参照〕。今
日まで、温和なアシル化剤３−（４−ヒドロキシ−５−
〔125 Ｉ〕ヨードフェニル）プロピオン酸Ｎ−スクシン
イミジル（Bolton-Hunter 試薬として知られている）の
みが、非酸化的間接放射性ヨウ素化の達成に使われる
〔Bolton,A.E. ら、Biochem.J.、１３３（１９７３）参
照〕。Bolton-Hunter 試薬はリシン残基の一級ε−アミ
ノ官能基を主にアシル化し、Ｎ−末端α−アミノ官能基
を一層少ない程度でアシル化する。Bolton-Hunter 試薬
によるＮ−アシル化が起る温和な条件にもかかわらず、
ペプチドおよび蛋白質における複数のリシン残基の高い
存在によって、放射性ヨウ素化生成物の不均一性が生
じ、それがヘテロ−モノおよびヘテロ−ポリ放射性ヨウ
素化トレーサーとなる〔Bolander,Jr.F.F.ら、Bioche
m.、１４頁（１９７５）参照〕。さらに、Bolton-Hunte
r 試薬におけるＮ−スクシンイミジルエステルの加水分
解に対する敏感性は、その貯蔵寿命を限定し、効率よい
合体を達成するためには大過剰モルの基質の導入を必要
とする。標識用基質が得難いときはこれは明らかに不利
である。過剰のBolton-Hunter 試薬を使う強制条件で
は、ヒスチジンおよびチロシン残基のアシル化も起り得
る〔Knight,L.C.,Biochem.Biophys.Acta、５３４（１９
７８）参照〕。
【０００６】そこで、本発明の目的はスルフヒドリル基
に対するマレイミド残基の高特異性の利点を組合せて、
マレイミド残基の活性化二重結合をはさんでチオールの
効率よい定量的付加により安定なチオエーテルを生成す
る間接的温和な高選択的放射性標識法を開発するにあ
る。多くの蛋白質および生物活性ペプチド中のシステイ
ン残基の低い存在および合成ペプチド類似体中へのシス
テイン残基またはチオール含有残基の導入の容易さの両
者と組合わさったこの反応の特異性は選択的特異的ヨウ
素化を許容する。ペプチドにおけるシステインの低い存
在とマレイミド残基に対するスルフヒドリル官能基の特
異性と高い反応性に基づき、本発明の目的は本発明のマ
レイミドに基づく試薬を使い、スルフヒドリル基含有ペ
プチドの間接放射性標識の新規解決法を開発するにあ
る。
【０００７】本発明は結合および受容体研究に有用な新
規なチオール反応性マレイミドに基づく放射性標識試薬
（thiol reactive maleimido-base radiolabeling reag
ent）に関する。さらに、本発明は、本発明のスルフヒ
ドリル−マレイミド化学に基づき、生理活性ペプチドの
新規間接放射性ヨウ素化の開発に関する。
【０００８】本発明のチオール反応性マレイミドに基づ
く化合物は式Ｉの化合物である。
【化６】
【０００９】式中、Ｒは
【化７】 であり、Ｒ1 は中性、＋／−荷電、疎水性、または親水
性であり、Ｒ2 はＨまたは122Ｉ、123Ｉ、125Ｉ、
131Ｉ、75Ｂｒ、77Ｂｒ、82Ｂｒ、または211Ａｔから選
ばれた放射性核種であり、ｎは０〜２であり、ｍは０〜
２であり、ｘは０〜２である。
【００１０】放射性ヨウ素標識試薬として使うのに好ま
しい本発明の化合物は
【化８】 を含む。
【００１１】上記一般式のチオール反応性マレイミドに
基づく化合物は、システイン含有ペプチドの間接放射性
標識に有用である。間接的非酸化的マレイミドに基づく
チオール特異性放射性ヨウ素化操作に使用できるペプチ
ドはシステインを含むかまたはその構造中にシステイン
残基またはスルフヒドリルをもつ残基を含むように修飾
できるものである。上記システイン含有ペプチドの例
は、タチキニン類（サブスタンスＰ、ノイロキニンＡ及
びノイロキニンＢ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副
甲状腺ホルモン関連蛋白質（ＰＴＨｒＰ）、ボンベシ
ン、メチオニンエンケファリンを含むが、これらに限定
されない。システイン含有ペプチドの放射性標識の有効
性は副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモン関
連蛋白質（ＰＴＨｒＰ）のシステイン含有類似体で示さ
れてきた。
【００１２】本発明の放射性ヨウ素標識化合物は、画像
診断剤として、放射性治療薬として、検定の開発、オー
トラジオグラフィーにおいて、結合および受容体研究に
使用できる。適当な放射性核種は122 Ｉ、123 Ｉ、125
Ｉ、131 Ｉ、75Ｂｒ、77Ｂｒ、83Ｂｒ、211 Ａｔを含
む。
【００１３】上記一般式の化合物は下記の反応スキーム
に従って製造できる。
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【００１４】３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシン
イミジルと２−（４−ヒドロキシフェニル）エチルアミ
ンとの反応および３−（４−ヒドロキシフェニル）プロ
ピオン酸Ｎ−スクシンイミジルと２−マレイミドエチル
アミンとの反応は、ヨード−ゲンを媒介とする放射性ヨ
ウ素化にかけられアミド結合の方向が異なる放射性ヨウ
素標識試薬ＡとＢを生成する生成物を与える。
【００１５】ＡおよびＢを得るための125 Ｉの導入は高
効率で実施されて混合物を生成し、その混合物は著しく
速く容易なＲＰ−ＨＰＬＣ精製にかけられる。無標識及
び放射性標識マレイミド含有試薬がＰＴＨおよびＰＴＨ
ｒＰのシステイン置換類似体の修飾に使われた。たとえ
ば、次の類似体が無標識及び放射性標識マレイミドに基
づく試薬により修飾された：ＰＴＨアゴニスト〔Ｎｌｅ
8,18，Ｌｙｓ13（ε−ビオチニル），Ｔｙｒ34，Ｃｙｓ
35〕ｂ−ＰＴＨ（１−３５）アミド（３）、ＰＴＨｒＰ
アゴニスト（〔Ｃｙｓ35〕ＰＴＨｒＰ（１−３５）アミ
ド（１）、ＰＴＨｒＰアンタゴニストＡｃ〔Ｃｙｓ8 ，
Ｌｅｕ11，Ｄ−Ｔｒｐ12〕−ＰＴＨｒＰ（８−３４）ア
ミド（２）。無標識Ｃｙｓ−変性類似体を、物理化学的
キャラクタリゼーションに使い、in vitro バイオアッ
セイで試験しその生物学的活性を確立した。全ての場
合、生物活性のすぐれた維持が、アデニル酸シクラーゼ
または受容体結合検定で示された。ＡおよびＢ放射性ヨ
ウ素標識試薬によるこれら類似体の効率よい高収率の放
射性ヨウ素化は、０℃で中性pHで一夜実施され、迅速な
ＲＰ−ＨＰＬＣ精製できる簡単な反応混合物を与えた。
放射性標識類似体の同定は、相当するコールドヨウ素標
識類似体による共溶出により確立された。精製した放射
性標識トレーサーは−７０℃の貯蔵で安定であった。こ
のトレーサーは、非協力的可逆的飽和的方式で、著しく
高い親和力（Ｋｄ＝１〜３nM）でもって、ヒト骨肉腫Ｂ
−１０細胞の一つの結合部位に結合する。
【００１６】この研究に含まれたＰＴＨおよびＰＴＨｒ
Ｐ類似体は、われわれの実験室で行われた最近の構造−
活性関係の研究に基づき設計された〔Mc Kee,R.L.,Endo
crinol. 、１２２、３００８−３０１０（１９８８）、
Nutt,R.F. ら、Endocrinol.、１２７、４９１−４９３
（１９９０）、Horiuchi,N. ら、Science,２３８、１５
６６−１５６８（１９８７）参照〕。システイン残基
は、ＰＴＨアゴニストまたはアゴニスト様活性に影響を
与えない方式で、ペプチドの位置に置換した。ＰＴＨお
よびＰＴＨｒＰアゴニスト関連類似体（１）および
（３）においては、夫々、３５位でシステイン残基によ
り１−３４配列をのばすように選んだ。Ａｃ−Ｃｙｓに
よるＬｅｕ8 の置換は、ＰＴＨｒＰアンタゴニスト関連
類似体（２）において選択した修飾であった。
【００１７】３’−マレイミドプロピオニル−３−ヨー
ドチルアミド（IV）の合成は、３−ヨードチラミン（I
I）〔Fisher,A.G. ら、J.Biol.Chem.、２４０、４３３
８−４３４３（１９６５）参照〕を商業的に入手できる
３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル(II
I) でWunschと共同研究者が記載の条件でアシル化する
ことにより遂行した〔Wunsch,E. ら、Biol.Chem.Hoppe-
Seyler、３６６、５３−６１（１９８５）参照〕。放射
性標識試薬３’−マレイミドプロピオン−３−〔12 5
Ｉ〕ヨードチラミン(IV* ) は、２工程操作（スキームII
方法Ａ参照）または１工程法（スキームII方法Ｂ参照）
でつくった。チラミン（Ｉ）のヨード−ゲン媒介放射性
ヨウ素化は、方法Ａの第１工程である。方法Ｂで示した
ように、同一化学を３−マレイミドプロピオンチルアミ
ド（Ｖ）の直接放射性標識に使った。一層長い一層便利
でない方法Ａにもかかわらず、両合成経路は放射性標識
アルキル化剤(IV* ) を与えた。
【００１８】平行して、スキームIII に総括した別の解
決法を開発した。Ｎ−保護カルバメート（VI）のＴＦＡ
媒介酸分解によるＮ−マレオイルエチレンジアミントリ
フルオロアセタート(VII) の製造は、Keller,Rudinger
が記載の手順と類似手順で合成された〔Keller,O. ら、
Helv.Chim.Acta、５８、５３１−５４０（１９７５）参
照〕（スキームIII 経路Ａ参照）。このアミン(VII) と
４−ヒドロキシフェニル−、４−ヒドロキシ−３−ヨ−
ドフェニル−、および４−ヒドロキシ−３−〔125 Ｉ〕
ヨードフェニルプロピオン酸から誘導されるスクシンイ
ミジルエステル〔Bolton,A.E. ら、Biochem.J.、１３３
（１９７３）、Rudinger,J. ら、Biochem.J.、１３３、
５３８−５３９（１９７３）、Michelot,R. ら、Bioche
m.Biophys.Res.Commun. 、９５、４９１−４９８（１９
８０）参照〕との反応は、夫々試薬VIII、IX、IX* を与
える。（スキームIII の経路Ｂ−Ｄ参照）。
【００１９】単離した３−ヨードチルアミド誘導体IVま
たはＲＰ−ＨＰＬＣ精製３−〔125Ｉ〕ヨードチルアミ
ドIV* によるアルキル化反応において、精製ペプチド類
似体１〜３を基質として使い、夫々付加物１Ａ〜３Ａお
よび１Ａ * 〜３Ａ * を得た。非放射性付加物１Ａ〜３Ａ
は分取ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、放射性標識付加物１Ａ
* 〜３Ａ * は分析ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。同様にし
て、４−ヒドロキシフェニルプロピオン酸から得られる
マレイミド試薬IX、IX* を、Ｃｙｓ8 −置換ＰＴＨｒＰ
アンタゴニスト２の修飾に使って、夫々非放射性または
放射性ヨウ素化付加物Ｒ２Ａ、Ｒ２Ａ* を得た。夫々２
Ａおよび２Ａ* とその相当する異性体Ｒ２ＡとＲ２Ａ *
の間の唯一の差は、３−Ｓ−スクシンイミジル残基と４
−ヒドロキシ−３−ヨードフェニル残基をつなぐスペー
サーにおけるアミド結合の逆なことである（Ｒ２Ａおよ
びＲ２Ａ * のＲはアミド結合方向の逆を意味する）。
【００２０】放射性標識試薬IV* およびIX* および放射
性標識付加物１Ａ* 〜３Ａ* およびＲ２Ａ* の同定は、
新しく調製したトレーサーと非放射性付加物試料を一緒
に注入後、放射能ピークと２１４nmのＵＶ吸光度ピーク
を共溶出することにより確立した。
【００２１】
【実施例】ここに示された実施例は本発明の理解を助け
るためである。使った特定の物質、化学種、条件は本発
明をさらに例示する意図のもので、本発明の範囲を制限
するものではない。 物質：超純度等級〔Ｎｌｅ8,18，Ｔｙｒ34ｂＰＴＨ−
（１−３４）ＮＨ2 ，Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（β−ｃ
Ｈｅｘ）−ＯＨ，Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（ε−Ｎ−Ｆ
ｍｏｃ）−ＯＨ，Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎハ゜イ−Ｂｏｍ−Ｌ−Ｈ
ｉｓ−ＯＨはBachemInc. （Torrence、ＣＡ）から得
た。Ｎ−Ｂｏｃ保護アミノ酸誘導体の残り、ｐ−メチル
ベンズヒドリルアミン樹脂塩酸塩（１％橋かけ、０．６
４mmol窒素／ｇ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド（ＤＣＣ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ピペ
リジン、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はApplied Biosys
tems Inc.(Foster City,ＣＡ) から買った。ジクロロメ
タン（ＤＣＭ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）（共にＢ＆Ｊブランド）はBaxter Health care Co.
(Muskegon,ＭＩ) から買った。フッ化水素はMatheson(S
ecaucus,ＮＪ) から買った。ｐ−クレゾールはAldrich
Chemical Inc.(Milwaukee,ＷＩ) から買った。ビオチ
ン、メトキシカルボニルマレイミド、３−マレイミドプ
ロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルはFluka ChemieＡＧ
（Buchs 、スイス）から買った。３−（４−ヒドロキシ
フェニル）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルはPierce
(Rockford,ＩＬ）から買った。ウシ血清アルブミン、ト
リス−ＨＣｌ、ホスホクレアチン、クレアチンホスホキ
ナーゼ、ＧＴＰ、イソブチルメチルキサンチン、Ｍｇ−
ＡＴＰはSigma(St.Louis, ＭＯ) から得た。ウシ腎臓は
Baums Meat Packing Inc.(Hatfield, ＰＡ) の寄付であ
る。
【００２２】バイオアッセイ ＳａＯＳ−２／Ｂ１０細胞培養物。培養におけるこの細
胞種の保持の詳細は以前に報告された。〔Chorev,M.
ら、Intl.J.Peptide & Protein Res. 、３６、４６５−
４７０（１９９０）参照〕。ＰＴＨ受容体結合およびア
デニル酸シクラーゼ検定。腎臓に基づく検定は前記手順
に従って、ウシの腎皮質膜で行った〔Goldman,M.E.ら、
Endocrinal. 、１２３、１４６８−１４７５（１９８
８）参照〕。骨に基づく検定はヒトＳａＯＳ−２／Ｂ１
０細胞培養物で行った。サイクリックＡＭＰは前に報告
の変形〔Chorev,M. ら、Intl.J.Peptide & Protein Re
s. 、３６、４６５−４７０（１９９０）参照〕を含
め、報告の操作〔Rodan,S.B.ら、J.Clin.Invest.、７
２、１５１１−１５１５（１９８３）参照〕を使い、測
定した。ＰＴＨｒＰ類似体に対する受容体結合親和力
は、１％ＢＳＡ、２０mMＨＥＰＥＳ（pH７．５）、０．
１％アジドを補充したＲＰＭＩ １６４０培地で、２４
−ウエル皿に塗布した細胞を使って得た。最終容量０．
２５ml中、種々の量の類似体の存在または不在で、〔Ｎ
ｌｅ8,18，モノ−125 Ｉ−Ｊｙｒ4 〕ｂＰＴＨ（１−３
４）ＮＨ2 （５０，０００cpm ／ウエル）を融合単層に
加えた。培養物を室温で４時間培養した。培養物を氷上
に置き、氷冷リン酸塩緩衝食塩水で４回洗うことによっ
て、結合反応を停止した。細胞を１Ｎ−ＮａＯＨ １ml
に溶かすことにより、細胞と結合した放射能を回収し
た。
【００２３】データ分析。結合阻害定数（Ｋｂ）および
アデニル酸シクラーゼ阻害定数（Ｋ1 ）は次の刊公物の
方法により計算した〔Cheng,Y.C.ら、Bio chem.Pharmac
ol.、２２、３０９９−３１０８（１９７３）参照〕。
【００２４】ペプチドおよび標識試薬の合成。ペプチド
〔Ｃｙｓ35〕ＰＴＨｒＰ（１−３５）ＮＨ2 （１）、Ａ
ｃ〔Ｃｙｓ8 ，Ｌｅｕ11，Ｄ−Ｔｒｐ12〕ＰＴＨｒＰ
（８−３４）ＮＨ2 （２）、〔Ｎｌｅ8,18，Ｌｙｓ
13（ε−ビオチニル），Ｔｙｒ34，Ｃｙｓ35〕ｂＰＴＭ
（１−３５）ＮＨ2 （３）はソフトウエアバージョン
１．２を使い、Merrifield固相操作の変形〔Merrifiel
d,R.B.,Adv.Enzymal.、３２、２２１−２９６（１９６
９）参照〕を使い、Applied Biosystems４３０Ａ自動ペ
プチド合成器で合成した。合成は、次の変形を含めて、
報告の手順に従った〔Chorev,M. ら、Intl.J.Peptide &
Protein Res. 、３６、４６５−４７０（１９９０）参
照〕。ＰＴＨｒＰ誘導配列（類似体１および２）におい
て、３個のアルギニン（残基１８−２１）およびヒスチ
ジン（残基２５と２６）の各々の再結合後、Ｎα−Ｂｏ
ｃ保護基の除去前に、ＤＣＣ媒介酢酸（１１４μl 、２
mmol）カップリングを使って、残存遊離α−アミノ基の
アセチル化を実施した。Ｎ−ε−ビオチニル化によるＬ
ｙｓ13の修飾を行った。ＨＦ開裂後に得られた粗製物質
を、５０％酢酸の移動相を使ってＧ−５０セファデック
スカラムで分画した。粗製ペプチドは、Vydac 蛋白質Ｃ
−１８カラム（１５μ）を使い、Watersδ−PrepＨＰＬ
Ｃ系で精製した。使用溶剤系は、Ａ：水／アセトニトリ
ル（１９：１）中０．１％ＴＦＡ、Ｂ：（類似体１に対
しては）Ｂ １５〜４０％の勾配を使いアセトニトリル
中０．１％ＴＦＡ、（類似体２、３に対しては）Ｂ １
０〜５０％の勾配を使いアセトニトリル中０．１％ＴＦ
Ａで、２１４nmで監視し１００ml／分の流量であった。
合成で得られた精製物質の収量は、夫々類似体１〜３に
対し１５３mg、１００mg、１２３mgであった。
【００２５】実施例１ ３’−マレイミドプロピオン−３−ヨード−チルアミド
（IV）： ＤＭＦ（１．５ml）中の３−ヨードチラミン〔IIの製造
は文献に従う、Fischer,A.G.ら、J.Biol.Chem.、２４
０、４３３８−４３４３（１９６５）参照〕（１３１．
５mg、０．５mmol）の氷冷溶液に、３−マレイミドプロ
ピオン酸Ｎ−スクシンイミジル(III) （１３３．１mg、
０．５mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（８７μl
、０．５mmol）、ピリジン（３９μl 、０．５mmol）
を加えた。０℃で１時間後、反応混合物を室温で一夜か
きまぜた。減圧下溶剤の除去後得られた残留物を酢酸エ
チルに溶かし、２％ＫＨＳＯ4 溶液、食塩水、５％Ｎａ
ＨＣＯ3 溶液、食塩水で連続して抽出した。有機相をＮ
ａ2 ＳＯ4 で乾燥し、減圧で溶剤を除去した。残留物を
δPrep Vydac蛋白質Ｃ−１８カラムで精製した；２１４
nm；流量１００ml／分で１２０分で勾配０〜５０％Ｂ；
１０ml／画分。生成物は約１８〜１９％Ｂでカラムから
出た。プールしたピークを減圧で乾燥し、残留物を水に
溶かし、凍結乾燥し４８mg（２３．２％収率）を得た。 ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔ４．５分、ｋ’＝１３．２０；Vyda
c 蛋白質Ｃ−１８（０．２１×１５cm）５μ：２１４n
m；Ａ：水／アセトニトリル（１９：１）中０．１％Ｔ
ＦＡ、Ｂ：３０分で０〜１０％Ｂの勾配、流量１．５ml
／分を使いアセトニトリル中０．１％ＴＦＡ。
【００２６】実施例２ ３−マレイミドプロピオンチルアミド（Ｖ）： ＤＭＦ（２ml）中のチラミン（２７４．４mg、２mmo
l）、３−マレイミドプロピオン酸（６７６．６mg、４m
mol）の氷冷混合物に、１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌ（ＥＤＣ）
（３８３．４mg、２mmol）を加えた。反応混合物を室温
で一夜かきまぜた。減圧下ＤＭＦの除去後得られた残留
物を、酢酸エチルに溶かし、１Ｎ・ＨＣｌ、食塩水、Ｎ
ａＨＣＯ3 ５％溶液、食塩水で連続して抽出した。有機
相をＮａ2 ＳＯ4 で乾燥し、減圧で溶剤を除去し、粗製
生成物２２０mgを得た。この粗製生成物をδ−Prep Vyd
ac蛋白質Ｃ−１８カラムで精製した；２１４nm；流量１
００ml／分で２００分で勾配１０〜５０％Ｂ；１０ml／
画分。生成物は約１８〜１９％Ｂでカラムから溶出し
た。プールしたピークを減圧で乾燥し、残留物を水に溶
かし、凍結乾燥し１３０mg（２２．５％収率）を得た。
ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔr ＝１３．７、ｋ’＝９．５３；Vy
dac 蛋白質Ｃ−１８（０．２１×１５cm）５μ；２１４
nm；Ａ：水／アセトニトリル（１９：１）中０．１％Ｔ
ＦＡ、Ｂ：流量１．５ml／分、３０分で勾配０〜５０％
Ｂを使い、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ。 ＦＡＢ−ＭＳ：分子量Ｃ15Ｈ16Ｎ2 Ｏ4 に対し 計算値２８７．２９、測定値２８９。 元素分析： 計算値（％）Ｃ ６２．７０、Ｈ ５．６１、Ｎ ９．
７５ 実測値（％）Ｃ ５６．２２、Ｈ ４．９５、Ｎ ８．
５１
【００２７】実施例３ Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎ’−マレオ
イルエチレンジアミン（VI) の合成 Ｎ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（５．８ｇ、３６．２５
mmol）をＮａＨＣＯ3飽和溶液（１５０ml）に溶かし、
０℃に冷した。このかくはん溶液に、Ｎ−メトキシカル
ボニルマレイミド（５．６２ｇ、３６．２mmol）を加え
た。１０分後、反応混合物を水（３００ml）で希釈し、
３０分かきまぜ、Ｎ−メトキシカルボニルマレイミドの
第２部分（１．４ｇ、９mmol）を加え、混合物を１時間
かきまぜた。白色沈殿を濾過し、氷冷水（１００ml）で
洗った。生成物を減圧で乾燥し、７．２１ｇ（８２．５
％収率）を得た。 元素分析：Ｃ11Ｈ16Ｎ2 Ｏ4 に対し 計算値（％）Ｃ ５４．９９、Ｈ ６．７１、Ｎ １
１．６６ 測定値（％）Ｃ ５４．２８、Ｈ ６．４８、Ｎ １
１．３７。 融点１２５−１２７℃；Ｒｆ＝０．５７（ＣＨＣｌ3 ／
ＣＨ3 ＯＨ９：１）；ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔr ＝２０．４
分、ｋ’＝１２．３、Vydac 蛋白質Ｃ−１８（０．２１
×１５cm）５μ；２１４nm；Ａ：水／アセトニトリル中
１．０％ＴＦＡ、Ｂ：３０分で５〜２０％Ｂの勾配、流
量１．５ml／分を使い、アセトニトリル中０．１％ＴＦ
Ａ。1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）、δppm ：１．３４（一重
線、９Ｈ、（ＣＨ 3 ）3Ｃ）、３．２２（四重線、２
Ｈ、ＣＨ 2 −ＣＨ）、３．５８（四重線、２Ｈ、ＣＨ 2
−Ｎ）、６．７９（一重線、２Ｈ、ＣＨ＝ＣＨ）。
【００２８】実施例４ Ｎ−マレオイルエチレンジアミントリフルオロアセテー
ト(VII) Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎ’−マレオ
イルエチレンジアミン（VI）（２ｇ、８．２３mmol）を
ジクロロメタン（４０ml）に溶かし、ついでＴＦＡ（２
０ml）を加えた。反応混合物をＣａＣｌ2 で保護して室
温に３０分留めた。溶剤の蒸発後得られた残留物を、乾
燥エーテルで処理し、生成沈殿を濾過で集めた。白色固
体を減圧で乾燥し、２．０４ｇ（１００％収率）を得
た。
【００２９】実施例５ Ｎ−マレオイル−Ｎ’−３−（４−ヒドロキシフェニ
ル）プロパノイルエチレンジアミド(VIII) Ｎ−マレオイルエチレンジアミントリフルオロアセテー
ト(VII) （０．４５７ｇ、１．８mmol）、３−（４−ヒ
ドロキシフェニル）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル
（０．４７４ｇ、１．８mmol）の混合物をＤＭＦ中２％
ピリジン溶液（０．５ml）に溶かした。ジイソプロピル
エチルアミン（約０．３１ml、１．８mmol）を加えてpH
を８．５に調節し、混合物を室温で２４時間かきまぜ
た。減圧で溶剤の除去後、得られた残留物を酢酸エチル
（３０ml）に溶かし、ＮａＨＣＯ3、ＫＨＳＯ4 、食塩
水で連続して抽出した。有機相をＭｇＳＯ4 で乾燥し、
濾過し、減圧で溶剤を除去し、粗製油（０．３ｇ）を得
た。この粗製物質をＨＰＬＣで精製した：Delta Prep P
ack ５００Vydac 蛋白質Ｃ−１８（１５μ）、１５０分
で０〜２０％の勾配、流量１００ml／分；Ａ：水／アセ
トニトリル（１９：１）中０．１％ＴＦＡ、Ｂ：アセト
ニトリル中０．１％ＴＦＡ。収量２２５mg（４３％収
率）。ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔr ＝１４．３、ｋ’＝９．
２；Vydac 蛋白質Ｃ−１８（０．２１×１５cm）５μ；
２１４nm；Ａ：水／アセトニトリル（１９：１）中０．
１％ＴＦＡ、Ｂ：３０分で０〜５０％Ｂの勾配、流量
１．５ml／分を使い、アセトニトリル中０．１％ＴＦ
Ａ。 ＦＡＢ−ＭＳ：分子量Ｃ15Ｈ16Ｎ2 Ｏ4 に対し、 計算値２８８、測定値２８９。 元素分析：Ｃ15Ｈ16Ｎ2 Ｏ4 ・０．５Ｈ2 Ｏに対し、 計算値（％）；Ｃ ６０．１６、Ｈ ５．１７、Ｎ
９．１７ 測定値（％）；Ｃ ６０．６０、Ｈ ５．７２、Ｎ
９．４２。1 Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）、δppm ：２．２０
（三重線、２Ｈ、ＣＨ 2 −ＣＯ）、２．６２（三重線、
２Ｈ、ＣＨ 2 −Ａｒ）、３．１８（四重線、２Ｈ、ＣＨ
2 −ＮＨ）、３．４３（三重線、２Ｈ、ＣＨ 2 −Ｎ）、
６．６４（二重線、２Ｈ、芳香族）、６．９４（二重
線、２Ｈ、芳香族）、７．１０（一重線、２Ｈ、ＣＨ＝
ＣＨ）、７．９１（三重線、１Ｈ、ＮＨ）、９．１２
（一重線、１Ｈ、ＯＨ）。
【００３０】実施例６ Ｎ−マレオイル−Ｎ’−３−（４−ヒドロキシ−３−ヨ
ードフェニル）プロパノイルエチレンジアミン（XI） Ｎ−マレオイルエチレンジアミントリフルオロアセテー
ト(VII) （０．３０５ｇ、１．２mmol）、３−（４−ヒ
ドロキシ−３−ヨードフェニル）プロピオン酸Ｎ−スク
シンイミジル（０．４２５ｇ、１．２mmol）の混合物を
ＤＭＦ中の２％ピリジン溶液（０．５ml）に溶かした。
ジイソプロピルエチルアミン（約０．２１ml、１．２mm
ol）を加えて、pHを８．５に調節し、混合物を室温で２
４時間かきまぜた。反応混合物を水（３０ml）で希釈
し、凍結乾燥し、粗製油（０．４ｇ）を得た。この粗製
物質をＨＰＬＣで精製した：Delta Prep Pack ５００Vy
dac蛋白質Ｃ−１８（５μ）；１５０分で０〜２０％の
勾配、流量１００ml／分；Ａ：水／アセトニトリル（１
９：１）中０．１％ＴＦＡ、Ｂ：アセトニトリル中０．
１％ＴＦＡ。収量２０７mg（４５％収率）。ＲＰ−ＨＰ
ＬＣ：ｔr ＝１９．２、ｋ’＝１２．７；Vydac 蛋白質
Ｃ−１８（０．２１×１５cm）５μ；２１４nm；Ａ：水
／アセトニトリル（１９：１）中０．１％ＴＦＡ、Ｂ：
３０分で０〜５０％Ｂの勾配、流量１．５ml／分を使い
アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ。 ＦＡＢ−ＭＳ：分子量Ｃ15Ｈ15Ｎ2 Ｏ4 Ｉに対し、 計算値４１４、測定値４１５。 元素分析：Ｃ15Ｈ15Ｎ2 Ｏ4 Ｉ・０．５Ｈ2 Ｏに対し、 計算値（％）Ｃ ４２．５５、Ｈ ３．７８、Ｎ ６．
６２ 測定値（％）Ｃ ４２．３８、Ｈ ３．１９、Ｎ ６．
５０。1 Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）、δppm ：２．２１
（三重線、２Ｈ、ＣＨ 2 −ＣＯ）、２．６２（三重線、
２Ｈ、ＣＨ 2 −Ａｒ）、３．１７（四重線、２Ｈ、ＣＨ
2 −ＮＨ）、３．４２（三重線、２Ｈ、ＣＨ 2 −Ｎ）、
６．７７（二重線、Ｈ、芳香族）、６．９８（多重線、
１Ｈ、芳香族）、７．００（一重線、２Ｈ、ＣＨ＝Ｃ
Ｈ）、７．４６（多重線、１Ｈ、芳香族）、７．９１
（三重線、１Ｈ、ＮＨ）、１０．０３（一重線、１Ｈ、
ＯＨ）。
【００３１】実施例７ 〔Ｃｙｓ35（Ｓ−２’−（Ｎ−スクシニル−β−アラニ
ル−３−ヨードチルアミド）〕ＰＴＨｒＰ（１−３５）
ＮＨ2 （類似体１Ａ） 〔Ｃｙｓ35〕ＰＴＨｒＰ（１−３５）ＮＨ2 （類似体
１）（２０．８mg、５μmol ）、３’−マレイミドプロ
ピオン−３−ヨードチルアミド（IV）（１１．８３mg、
２８．６μmol ）の混合物をＤＭＦ（１ml）に溶かし
た。これを室温で４８時間かきまぜ、ついで減圧で溶剤
を除去した。得られた残留物をＨＰＬＣで精製した：Vy
dac 蛋白質Ｃ−１８（１５μ、２．２×２５cm）；２１
４nm；１００分で０〜５０％Ｂの勾配、流量３５ml／
分；Ａ：水／アセトニトリル（１９：１）中０．１％Ｔ
ＦＡ、Ｂ：アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ。収量１５
mg（６６％収率）。
【００３２】実施例８ Ａｃ〔Ｃｙｓ8 （Ｓ−２’−（Ｎ−スクシニル−β−ア
ラニル−３−ヨードチルアミド），Ｌｅｕ11，Ｄ−Ｔｒ
ｐ12〕ＰＴＨｒＰ（８−３４）ＮＨ2 （類似体２Ａ） Ａｃ〔Ｃｙｓ8 ，Ｌｅｕ11，Ｄ−Ｔｒｐ12〕ＰＴＨｒＰ
（８−３４）ＮＨ2 （類似体２）（１７mg、５μmol
）、３’−マレイミドプロピオン−３−ヨードチルア
ミド（IV）（１０．３６mg、２５μmol ）の混合物をＤ
ＭＦ（２００μl ）に溶かした。類似体１Ａで上記した
手順に従い、得られた収量は１４．３mg（７６％収率）
であった。
【００３３】実施例９ Ａｃ〔Ｃｙｓ8 （Ｓ−２’−Ｎ−スクシニル−Ｎ’−３
−（４−ヒドロキシ−３−ヨードフェニル）プロパノイ
ルエチレンジアミン），Ｌｅｕ11，Ｄ−Ｔｒｐ12〕ＰＴ
ＨｒＰ（８−３４）ＮＨ2 （類似体Ｒ２Ａ） Ａｃ〔Ｃｙｓ8 ，Ｌｅｕ11，Ｄ−Ｔｒｐ12〕ＰＴＨｒＰ
（８−３４）ＮＨ2 （類似体２）（１７mg、５μmol
）、Ｎ−マレオイル−Ｎ’−３−（４−ヒドロキシ−
３−ヨードフェニル）プロパノイルエチレンジアミン(V
III)（１０．３６mg、２５μmol ）の混合物をＤＭＦ
（２００μl ）に溶かし、室温で一夜かきまぜた。類似
体１Ａの上記手順に従い、得られた収量は１０．８mg
（５７％収率）であった。
【００３４】実施例１０ 〔Ｎｌｅ8,18，Ｌｙｓ13（ε−ビオチニル），Ｔｙ
ｒ34，Ｃｙｓ35（Ｓ−２’−（Ｎ−スクシニル−β−ア
ラニル−３−ヨードチルアミド）〕ｂＰＴＨ（１−３
５）ＮＨ2 （類似体３Ａ） 〔Ｎｌｅ8,18，Ｌｙｓ13（ε−ビオチニル），Ｔｙ
ｒ34，Ｃｙｓ35〕−ｂＰＴＨ（１−３５）ＮＨ2 （３）
（２３．６mg、５．３μmol ）、３’−マレイミドプロ
ピオン−３−ヨードチルアミド（IV）（４．１９mg、１
０．１μmol ）の混合物をＤＭＦ（４００μl ）に溶か
し、室温に一夜放置した。類似体１Ａの上記手順に従
い、得られた収量は１２．３mg（４８％収率）であっ
た。
【００３５】実施例１１ チオール含有ペプチドの放射性ヨウ素化 Ａ：チラミンの放射性ヨウ素化 １００mMリン酸緩衝液（pH７．４、５０μl ）に溶かし
たチラミン（１０μg、０．７３μmol ）をヨード−ゲ
ン（１０μg 、０．２３μmol 、１２×７５mmホウケイ
酸塩チューブに固定化した）に加え、Ｎａ125 Ｉ（２．
０mCi 、２０μl 、Amershamから購入、比放射能２２０
０Ci／mmol）を加えた。室温で１０分反応を行った。つ
いで、反応混合物をアセトニトリル（１００μl ）を含
む第２のホウケイ酸塩チューブ（１２×７５mm）に移
し、室温に１０分放置した。
【００３６】Ｂ：３’−マレイミドプロピオン−３−〔
125 Ｉ〕ヨードチルアミド(IV *) の製造： Ｉ．３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル
(III) による３−〔12 5 Ｉ〕ヨードチラミン(II *) のア
シル化による方法：アセトニトリル（１００μl ）に溶
かした３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジ
ル(III) （５００μg 、１．９μmol ）の溶液を、Ａに
記載の反応混合物を加え、室温に６０分放置した。溶液
を０．１％ＴＦＡ（６００μl ）で希釈し、混合物をと
り出し、ＨＰＬＣに注入した。ＨＰＬＣの条件は次の通
りである。Vydac 蛋白質Ｃ−１８（５μ、０．２１×１
５cm）カラム；溶液Ａ ０．１％ＴＦＡ；溶液Ｂアセト
ニトリル中０．１％ＴＦＡ；流量１ml／分。吸光度は２
１４nmで監視し、放射能はガンマ検出器（Beckman モデ
ル１７０放射性同位体検出器）を通る流れにより監視し
た。使用勾配は０〜１０分、１０％Ｂ、１０〜４０分、
１０〜６０％Ｂであった。予期生成物に相当する主放射
性ヨウ素化ピーク（ｔr ＝２８分、ｋ’＝１９）を、ホ
ウケイ酸塩チューブ（１２×７５mm）にプールした
（０．５分画分）。 II．３−マレイミドプロピオンチルアミド（Ｖ）の直接
放射性ヨウ素化による方法：１００mMリン酸ナトリウム
緩衝液（１００μl 、pH６．５）中の３−マレイミドプ
ロピオンチルアミド（Ｖ）（５０μg 、２μmol ）の溶
液を、ヨード−ゲン（１０μg 、０．２３μmol 、１２
×７５mmホウケイ酸塩チューブに固定化した）に加え、
ついでＮａ125 Ｉ（２．０mCi 、２０μl ）を加え、室
温で１０分温置した。反応混合物を０．１％ＴＦＡ（６
００μl ）で希釈し、Ｂ−Ｉに記載のように精製した。
【００３７】Ｃ：IV * によるペプチドの放射性標識：
〔Ｃｙｓ35〕ＰＴＨｒＰ（１−３５）ＮＨ2 （類似体
１）、またはＡｃ〔Ｃｙｓ8 ，Ｌｅｕ11，Ｄ−Ｔｒ
ｐ12〕ＰＴＨｒＰ（８−３４）ＮＨ2 （類似体２）、ま
たは〔Ｎｌｅ8,18，Ｌｙｓ13（ε−ビオチニル），Ｔｙ
ｒ34，Ｃｙｓ35〕ｂＰＴＨ（１−３５）ＮＨ2 （類似体
３）（少なくとも５０μg ）を２倍容量の水に溶かし
た。この溶液試料（２０μl ）を、プールしＨＰＬＣ精
製した放射性標識試薬IV * （上記Ｂに記載）に加え、チ
ューブを針貫通キャップでふたをした。ついで、反応混
合物をSpeed Vac(Savant) で６０分濃縮した。濃縮溶液
を１Ｍ Hepes （pH７．５）の少量（１０μl ）を加え
てUniversal pH紙でpHを試験し、pHを６．５にした。pH
６．５に達した後、ペプチド溶液の残り（６０μg ま
で）を反応管に加え、４℃で一夜かきまぜた。反応混合
物を、３０分にわたり３０〜３５％Ｂの勾配、流量１ml
／分を使い、Vydac 蛋白質Ｃ−１８カラム（０．２１×
１５cm）（上記のような緩衝液ＡとＢ）で分離した（夫
々、放射性標識した類似体１Ａ* 〜３Ａ* に対し、ｔr
＝１１．９分、ｋ’＝４．１；ｔr ＝２３．８分、ｋ’
＝８．５；ｔr ＝２０．４分、ｋ’＝７．７）。ピーク
放射性画分（０．５分画分）をプールし、５０mM Hepes
（pH７．５）中の２％ＢＳＡの等容量で希釈し、Eppend
orf 小瓶に分け、−７０℃で貯蔵した。
【００３８】Ｄ：予め標識した３−（４−ヒドロキシ−
３−〔125 Ｉ〕ヨードフェニル）プロピオン酸Ｎ−スク
シンイミジルによるＮ−マレオイル−Ｎ’−３−（４−
ヒドロキシフェニル）プロパノイルエチレンジアミン(I
X *) の製造：３−（４−ヒドロキシ−３−〔125 Ｉ〕−
ヨードフェニル）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルを
１００mMＮａ3 ＰＯ4 （pH７．４、８０μl ）に溶かし
た。アセトニトリル（１００μl ）に溶かしたＮ−マレ
オイルエチレンジアミントリフルオロアセテート(VII)
（５００μg ）を加え、室温で６０分温置した。０．１
％ＴＦＡ（５００μl ）を加えて、反応を停止し、Vyda
c 蛋白質Ｃ−１８カラム（０．２１×１５cm）（上記の
ような緩衝液ＡとＢ）を使い、３０分にわたり１０〜５
０％Ｂの勾配、流量１ml／分を使い、ＨＰＬＣで混合物
を分離した（ｔr ＝２５分、ｋ’＝８．８）。画分
（０．５分）を集め、カウンターし、最高放射性画分を
プールし、Savant Speed Vacで２時間濃縮した。濃縮
後、１Ｍ Hepes （pH７．５、７５μl ）を加えて、溶
液を約６．５のpHにした。
【００３９】Ｅ：IX * によるＰＴＨｒＰアンタゴニスト
２Ａの放射性標識：水（１００ml）中のペプチド２Ａ
（１００mg）を、放射性配位子IX * （前記Ｄ参照）の溶
液に加え、反応混合物をかきまぜて４℃で一夜温置し
た。温置後、３０分にわたり３１〜３９％Ｂの勾配を使
い、上記のようにＨＰＬＣで混合物を分離した（ｔr ＝
２３．３分、ｋ’＝８）。ピーク放射性画分（０．５分
画分）をプールし、５０mM Hepes（pH７．５）中の２％
ＢＳＡの等容量で希釈し、Eppendorf 小瓶に分け、−７
０℃で貯蔵した。
【００４０】表１はウシ腎皮質膜およびＢ１０細胞とＰ
ＴＨおよびＰＴＨｒＰ配列から誘導されたアゴニスト付
加物およびアンタゴニスト付加物の結合およびシクラー
ゼ活性を示す。
【００４１】
【化１５】

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式Ｉ 【化１】 （式中、Ｒは 【化２】 又は 【化３】 であり；Ｒ1 は中性、＋／−荷電、親水性又は疎水性で
    あり；Ｒ2 は水素又は122 Ｉ、123 Ｉ、125 Ｉ、131
    Ｉ、75Ｂｒ、77Ｂｒ、82Ｂｒまたは211 Ａｔから選ばれ
    た放射性核種であり；ｎは０乃至２であり；ｍは０乃至
    ２であり；そしてｘは０乃至２である）の化合物。
  2. 【請求項２】 化合物が 【化４】 である請求項１の化合物。
  3. 【請求項３】 化合物が 【化５】 である請求項１の化合物。
  4. 【請求項４】 哺乳類の組織中の蛋白質受容体の検出及
    び定量化の方法に於て、その様な定量化を望まれる哺乳
    類に蛋白質と組合わせて請求項１の化合物の有効量を投
    与することを特徴とする方法。
  5. 【請求項５】 哺乳類がヒトである請求項４記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 蛋白質受容体がＰＴＨ又はＰＴＨｒＰで
    ある請求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】 哺乳類種中で蛋白質受容体を保持してい
    る組織の画像診断方法に於て、その様な画像診断の必要
    な哺乳類種に蛋白質と組合わせて請求項１の化合物の有
    効量を投与することを特徴とする方法。
  8. 【請求項８】 哺乳類がヒトである請求項７記載の方
    法。
  9. 【請求項９】 蛋白質受容体がＰＴＨ又はＰＴＨｒＰで
    ある請求項７記載の方法。
JP4155111A 1991-06-14 1992-06-15 チオール反応性マレイミドに基づく放射性標識試薬 Pending JPH05194384A (ja)

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