DE3587342T2

DE3587342T2 - Cyclosporine.

Info

Publication number: DE3587342T2
Application number: DE88104793T
Authority: DE
Inventors: Philipp E Ball; Valerie Quesniaux; Joachim Rosenthaler; Max H Schreier; Roland Wenger
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1984-10-04
Filing date: 1985-09-27
Publication date: 1993-12-02
Anticipated expiration: 2005-09-28
Also published as: FI862370A0; EP0198026B1; JPS62500383A; FI93965C; CA1309671C; DE3587505D1; NO173557C; FI93965B; EP0290762B1; NO862177D0; KR870700637A; JPH074269B2; FI862370A; EP0290762A1; AU589917B2; HK78696A; AU4967185A; DE3587505T2; EP0314862A1; KR910002691B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Cyclosporine zur Erzeugung von Antikörpern zur Verwendung in Diagnostik-/Testkits, die zur Unterscheidung zwischen Cyclosporinen und Metaboliten hiervon fähig sind. Die Cyclosporine umfassen eine Klasse strukturell unterschiedlicher, zyklischer, poly-N-methylierter Undecapeptide, die gemeinsam pharmazeutische, speziell immunsuppressive, antiinflammatorische und antiparasitäre Wirkung besitzen. Das erste isolierte Cyclosporin war der naturlich vorkommende Pilzmetabolit Cyclosporin, auch als Cyclosporin A bekannt, der Formel A
worin -MeBmt- für den N-Methyl-(4R)-4-but-2E-en-1-yl-4-methyl- (L)threonylrest der Formel B steht
worin -x-y- für -CH=CH- (trans) steht.
Seit dem ursprünglichen Auffinden von Cyclosporin wurden eine Vielzahl an natürlich vorkommenden Cyclosporinen isoliert und identifiziert und viele weitere nicht-natürliche Cyclosporine wurden durch total- oder halbsynthetische Methoden oder durch die Anwendung veränderter Kulturverfahren hergestellt. Die durch die Cyclosporine umschriebene Klasse ist inzwischen umfangreich und enthält beispielsweise die natürlich vorkommenden Cyclosporine A bis z [vergleiche Kobel et al. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 14, 237-240 (1982) und präsentierte Poster von Traber et al. 24. Interwissenschaftliche Konferenz über antimikrobielle Mittel und Chemotherapie, Washington, 8. -10. Oktober, (1984)], genauso wie die verschiedenen nicht-natürlichen oder künstlichen Cyclosporine, einschließlich der Dihydro- Cyclosporine ( bei denen die -x-y- Gruppe des -MeBmt- Rests (siehe obige Formel B) gesättigt ist, wie beispielsweise in US-A 4 108 985, 4 210 581 und 4 220 641 beschrieben), Cyclosporine, bei denen der -MeBmt- Rest in isomerer oder N-demethylierter Form vorhanden ist [vergleiche EP-B 0 034 567 und "Cyclosporin A", Proc. Internat. Conference on Cyclosporin A, Cambridge (Großbritannien) September 1981, Herausgeber D.J.G. White, Elsevier Press (1982), die beide das von R. Wenger entwickelte Totalsyntheseverfahren zur Herstellung von Cyclosporinen beschreiben] und Cyclosporine, in die ein Einbau verschiedener Aminosäuren an spezifische Positionen innerhalb der Peptidsequenz bewirkt wird. Beispiele solcher Cyclosporine, wie sie im obigen Stand der Technik beschrieben sind, beinhalten beispielsweise [Thr]²-, [Val]²-, [Nva]²- und [Nva]²-(Nva]&sup5;-Cyclosporin (ebenfalls als Cyclosporine C, D, G und M bekannt) und Dihydro-[Val]²- Cyclosporin (ebenfalls als Dihydrocyclosporin D bekannt).
[Gemäß der jetzt üblichen Nomenklatur für die Cyclosporine werden diese durch die vorliegende Beschreibung und die Patentansprüche mit Bezug auf die Struktur von Cyclosporin beschrieben (nämlich Cyclosporin A). Dies wird durchgeführt, indem man zuerst die Reste im Molekül nennt, die sich von denen im Cyclosporin vorhandenen unterscheiden und dann den Ausdruck "Cyclosporin" anhängt, um die verbleibenden Reste zu beschreiben, die mit denen im Cyclosporin vorhandenen identisch sind. Gleichzeitig wird die Vorsilbe "Dihydro" verwendet, um Cyclosporine zu bezeichnen, in denen der -MeBmt- Rest hydriert ist (-Dihydro- MeBmt-), worin -x-y- in Formel B für -CH&sub2;-CH&sub2;- steht. Daher ist [Thr]²-Cyclosporin das Cyclosporin mit der in Formel A gezeigten Sequenz, in der aber -aAbu- an Position 2 durch -Thr- ersetzt ist und Dihydro-[Val]²-Cyclosporin ist das Cyclosporin mit der in Formel A gezeigten Sequenz, in der aber -MeBmt- an Position 1 hydriert ist und -oAbu- an Position 2 durch -Val- ersetzt ist.
Ferner haben die durch Abkürzungen, wie beispielsweise - Ala-, -MeVal- etc . . . bezeichneten Aminosäurereste, der herkömmlichen Praxis entsprechend die (L)-Konfiguration, sofern nichts anderes angegeben ist. Abkürzungen von Resten, die mit "Me" beginnen, wie im Fall von -MeLeu-, stellen N-methylierte Reste dar. Die einzelnen Reste des Cyclosporinmoleküls sind fachüblich im Uhrzeigersinn nummeriert und beginnen mit dem Rest -MeBmt- (oder -Dihydro-MeBmt-) in Position 1. Die selbe Nummernfolge wird in der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet.
Wegen ihrer einzigartigen immunsuppressiven Wirkung haben die Cyclosporine nicht nur in medizinischen und akademischen Kreisen , sondern auch in der populärwissenschaftlichen Presse sehr große Aufmerksamkeit auf sich gelenkt. Cyclosporin selber ist nun im Handel erhältlich und wird im allgemeinen verwendet, um Abstoßung bei allogenen Organtransplantaten zu verhindern, beispielsweise Herz, Herz-Lunge, Niere und Knochenmark, und wird auch in letzter Zeit zur Behandlung von verschiedenen Autoimmunkrankheiten und verwandten Krankheiten und Zuständen verwendet. Sowohl Dihydro- [Val]²-Cyclosporin als auch [Nva]²-Cyclosporin befinden sich als potentielle Nachfolger von Cyclosporin unter extensiver klinischer Untersuchung.
Die Dosierung von Cyclosporinen, beispielsweise des Cyclosporins, bereitet jedoch bestimmte Schwierigkeiten. Da metabolische Umwandlungsraten dazu neigen, patientenspezifisch zu sein und die therapeutische Breite gering ist, ist die effektive Dosierung sehr subjektspezifisch und bedarf der Einstellung angemessener individueller Serumspiegel. Regelmäßiges Überwachen der Cyclosporin Plasmakonzentrationen ist daher eine notwendige Voraussetzung für eine wirksame Behandlung. Aus diesem Grund wurden einige Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie- (HPLC), Radioimmunoassay- (RIA) und Fluoreszenzimmunoassay-Systeme (FIA) entwickelt. Trotzdem sind HPLC Methoden, neben hoher Spezifität, schwierig und umständlich im praktischen Einsatz und das derzeitige im Handel erhältliche, auf polyklonales Antiserum vom Schaf aufgebaute RIA System wurde wegen seiner mangelnden Spezifität kritisiert. Die Entwicklung von Cyclosporinspezifischen Antikörpern, beispielsweise für das Cyclosporin, die zur Unterscheidung zwischen therapeutisch verabreichten Cyclosporinen und deren Metaboliten beim Menschen fähig sind, war daher lange Zeit ein vordringliches praktisches als auch rein wissenschaftliches Ziel, da diese Antikörper den Vorteil der hohen Spezifität der HPLC Technik hätten, während die einfache Verabreichbarkeit durch herkömmliche Immunoassaysyteme erhalten bliebe. Zusätzlich würde die Bereitstellung solcher Cyclosporinspezifischer monoklonaler Antikörper ein entscheidend neues Forschungswerkzeug liefern, das beispielsweise die vergleichende Untersuchung von Cyclosporinkonformation und Bestimmung der Cyclosporinrezeptor Charakteristiken etc . . erlauben würde.
Seit dem ursprünglichen Auffinden von Cyclosporin wurden viele Versuche gemacht, reaktive monoklonale Antikörper gegen Cyclosporine herzustellen. Da Cyclosporine, beispielsweise das Cyclosporin, ihrerseits geringe immunogene Wirkung aufweisen, bestand ein allgemeiner Ansatz in der Verwendung eines immunogenen Konjugats, beispielsweise eines Hapten-Proteins, das durch Kupplung von Immunglobulinen über die am -Thr²- in [Thr]²- Cyclosporin zugängliche Hydroxylgruppe unter Verwendung herkömmlicher Kupplungstechniken entstand, beispielsweise mit EDCI [N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid. 2 HCl] oder MCDI [N-Cyclohexyl-N'-[(3-[N-methylmorpholino)ethyl]-carbodiimid. p-Toluolsulfonat] als Kupplungsmittel. Versuche auf diese Weise schlugen trotzdem immer fehl und wo Antikörper erhalten wurden, fand man eine relativ niedrige Spezifität für das Cyclosporin, oder eine Spezifität in Bezug auf das verwendete Trägerprotein oder das verwendete Kupplungsreagenz, statt gegen das Cyclosporin, oder eine hohe Kreuzreaktivität mit dem Kupplungsreagenz. In keinem Fall war es möglich, monoklonale Antikörper herzustellen, die zur Unterscheidung fähig waren zwischen beispielsweise dem Cyclosporin und Metaboliten hiervon, wie beispielsweise den Metaboliten Cyclosporin 17 und Cyclosporin 18, die hierin später speziell beschrieben sind. Zusätzlich führten solche Versuche nur zur Bildung von monoklonalen Antikörpern vom IgM Typ gegen das Cyclosporin und waren daher immer zur Verwendung in regulären Testkits, beispielsweise klinischen Testkits gänzlich ungeeignet. Die Bildung von monoklonalen Antikörpern mit spezifischer Reaktivität mit Cyclosporinen, die zur Unterscheidung zwischen einzelnen Cyclosporinen und deren Metaboliten, beispielsweise zwischen dem Cyclosporin und seinen Metaboliten beim Menschen fähig sind, und zur Verwendung in einem Testsystem geeignet sind, ist daher ein Hauptziel geblieben.
Erfindungsgemäß hat man nun überraschenderweise gefunden, daß monoklonale Antikörper mit Reaktivität gegen Cyclosporine und mit den verschiedenen oben diskutierten Eigenschaften, speziell der Unterscheidungsfähigkeit zwischen Cyclosporinen und Metaboliten hiervon, über im wesentlichen herkömmliche Immunisierungs-/Fusions -/Klonierungstechniken unter Verwendung immunogener Konjugate hergestellt werden können, die ein Cyclosporin als Hapten beim ersten Immunisierungsschritt enthalten, wenn das Konjugat durch Kupplung des Trägers an das Cyclosporin durch die Wirkung einer aktivierten Kupplungsgruppe hergestellt wird, beispielsweise wenn die Konjugatsynthese unter Verwendung eines Cyclosporins mit aktivierter Kupplungsgruppe als Ausgangsmaterial bewirkt wird. Unter Verwendung solcher immunogener Konjugate ist es speziell möglich, monoklonale Antikörper zu erhalten, die zur genauen Unterscheidung zwischen Cyclosporinen und Metaboliten hiervon fähig sind, die nur einzelne unterschiedliche Gruppierungen auf einzelnen Resten aufweisen, beispielsweise im Fall von Cyclosporin sind sie mit dem Cyclosporin reaktiv, während sie zum Beispiel mit dessen Metaboliten Cyclosporin 17 und/oder Cyclosporin 18 geringe Kreuzreaktivität zeigen.
Zusätzlich zur Lieferung der Entwicklungstechniken für brauchbare monoklonale Testsysteme, beispielsweise für die Verwendung in der Klinik, liefert die Erfindung auch ein Mittel zur weiteren Reinigung von Cyclosporinmetaboliten und, da es angenommen werden kann, dar monoklonale Antikörper durch die Anwendung der allgemeinen erfindungsgemäßen Verfahren zugänglich werden, die die Rezeptorstellen nachahmen können, wird auch erfindungsgemäß ein Mittel zur Charakterisierung von potentiellen endogenen cyclosporinähnlichen Molekülen bereitgestellt. Die Bedeutung der vorliegenden Erfindung vom praktischen wie vom rein wissenschaftlichen Standpunkt wird daher leicht einsehbar.
Wie oben dargestellt, werden die für die Anwendung der Erfindung benötigten immunogenen Konjugate durch direkte Kupplung eines Trägers, beispielsweise eines Proteinmoleküls, mit dem Cyclosporin durch die Wirkung einer aktivierten Kupplungsgruppe hergestellt. Dies wird entweder durch die Reaktion eines eine aktivierte Kupplungsgruppe tragenden Trägers mit einem einen passenden mitreagierenden Substituenten tragenden Cyclosporin, beispielsweise eine Hydroxy- oder Aminogruppe tragend, wie im hier später beschriebenen Fall von [Thr]²-Cyclosporin oder [(D)Lys]&sup8;- Cyclosporin, oder durch Reaktion eines Trägers mit einem Cyclosporin mit aktivierter Kupplungsgruppe, beispielsweise einem Cyclosporin, in dem einer der im Cyclosporinmolekül vorhandenen Aminosäurereste eine Seitenkette am α-Kohlenstoffatom besitzt, die eine aktivierte Kupplungsgruppe enthält oder trägt, erreicht. Die genannten Konjugate enthalten daher ein Cyclosporin als Haptenteil, das direkt mit dem Trägerteil verbunden ist und nicht über einen dazwischenliegenden Kupplungsmittelrest, wie im Fall von Cyclosporin enthaltenden immunogenen Konjugaten, die bisher verwendet wurden, beispielsweise zur Erzeugung regulärer polyklonaler Antiseren.
Mit dem Ausdruck "aktivierte Kupplungsgruppe", der hierin und in den begleitenden Patentansprüchen verwendet wird, wird jede Gruppe verstanden, die in der Lage ist direkt mit einer geeigneten mitreagierenden Gruppe, beispielsweise Amino-, Hydroxy-, Thiogruppe oder dergleichen, unter Bildung einer kovalenten Bindung zu reagieren, ohne daß ein Kupplungsreagenz benötigt wird, das die Reaktion ermöglicht, bewirkt oder fördert. Daher wird dies im Fall von Cyclosporinen mit "aktivierter Kupplungsgruppe" jede Gruppe sein, die zur direkten Reaktion mit einem Trägermolekül, beispielsweise Proteinmolekül, in der rage ist unter Bildung einer kovalenten Bindung mit dem Trägermolekül zu reagieren, ohne daß ein Kupplungsreagenz benötigt wird, das die Kupplung oder Reaktion mit diesem Trägermolekül ermöglicht, bewirkt oder fördert.
Die Cyclosporine mit aktivierten Kupplungsgruppen sind von den Cyclosporinen mit verfügbaren mitreagierenden Gruppen, beispielsweise Amino-, Hydroxy-, Thiogruppen oder dergleichen zu unterscheiden, die im Fachgebiet bekannt sind, siehe EP-B 0 056 782, J. Immunoassay 2/1 (1981) 19-32, Drug. Metabol. Dispos. 12/1 (1984) 120. Anders als aktivierte Kupplungsgruppen, werden solche mitreagierenden Gruppen nicht unter Bildung einer kovalenten Bindung mit einem nicht-modifizierten Proteinträgermolekül reagieren, bis ein Kupplungsreagenz, beispielsweise Carbodiimid, verwendet wird.
Als aktivierte Kupplungsgruppen geeignete Gruppen sind im Fachgebiet gut bekannt und beinhalten beispielsweise i) aktivierte Ester oder aktivierte Carboxygruppen, das heißt der Formel -CO-OZ-, worin Z eine Carboxy-aktivierende Gruppe, wie eine o- oder p- Nitrophenyl-, 1-Benztriazol-, Pentafluorphenyl- oder N- Succinimidogruppe ist, ii) aktivierte Dithiogruppen, das heißt der Formel -S-S-X, worin X eine Dithio-aktivierende Gruppe ist wie 2- Pyridyl und iii) Epoxygruppen.
Geeignete Trägermoleküle in immunogenen Konjugaten, die eine aktivierte Kupplungsgruppe, wie eine Epoxygruppe der oben genannten Art tragen, können gemäß im Fachgebiet bekannter Techniken hergestellt werden, wie beispielsweise durch Laumen et al., Tetrahedron Letters, 26 (4), 407-410 (1985) beschrieben. Gemäß den allgemeinen erfindungsgemäßen Verfahren wird es trotzdem bevorzugt, daß die aktivierte Kupplungsgruppe vom zu kuppelnden Cyclosporin geliefert wird, als umgekehrt.
Im Prinzip kann die aktivierte Kupplungsgruppe an jeder Position um das Cyclosporinmolekül herum sitzen. Da Transformationen in der Position 1 im Cyclosporinmetabolismus von spezieller Bedeutung sind, oder da hauptsächlich auftretende Cyclosporinmetaboliten strukturelle Veränderungen in der Position 1, wie unten beschrieben zeigen, wie beispielsweise bei dem Cyclosporin, Cyclosporin 17 und Cyclosporin 18 ist es vorzuziehen, daß die aktivierte Kupplungsgruppe an einer der Positionen 2 bis einschließlich 11 vorkommt und so der Rest an der Position 1 in dem erhaltenen immunogenen Konjugat intakt und bevorzugt durch den Träger "unmaskiert" und somit frei zum Hervorrufen einer Antikörperantwort bleibt. Im allgemeinen ist es passend, wenn sich die aktivierte Kupplungsgruppe an der Position 2 oder an einer der Positionen 3, 5 bis 8 oder 10, speziell 5 bis einschließlich 8, befindet, wobei die Positionen 2 und 8 besonders bevorzugt sind.
Im Fall des Cyclosporins treten beim Menschen hauptsächlich folgende metabolische Umwandlungen auf:
I Terminale Hydroxylierung von -MeLeu&sup9; - unter Bildung des Rests der Formel E
II Terminale Hydroxylierung von -MeBmt¹ - unter Bildung des Rests der Formel F
III N-Demethylierung von -MeLeu&sup4; - unter Bildung von -Leu-,
IV Terminale Hydroxylierung von -MeLeu&sup4; - unter Bildung des Rests der obigen Formel E,
V Terminale Hydroxylierung von -MeLe&sup6;- unter Bildung des Rests der obigen Formel E,
VI Terminale Hydroxylierung und Ringschluß in -MeBmt¹- unter Bildung des Rests der Formel G
Daher zeigen die bekannten Metaboliten des Cyclosporins (identifiziert als Cyclosporin 1, Cyclosporin 8 etc . . . ) die folgenden metabolischen Variationen.
Cyclosporin 1: I, Cyclosporin 8 I + II,
Cyclosporin 9: I + III + V, Cyclosporin 10: I + IV,
Cyclosporin 16: I + V, Cyclosporin 17: II,
Cyclosporin 18: VI, Cyclosporin 21: III.
[siehe G. Maurer et al, "Drug Metab. Disposit" 11, 120-126 (1984)] Demnach wird es zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern , die zur Unterscheidung zwischen dem Cyclosporin und Metaboliten hiervon beim Menschen fähig sind, erforderlich sein, daß sich die zur Bildung des immunogenen Konjugats verwendete aktivierte Kupplungsgruppe im Cyclosporin an anderen Positionen als 1, 4, 6, oder 9 befindet, und insoweit, als Cyclosporin 17 und 18 Hauptmetaboliten darstellen, zumindest an einer anderen Position als der Position 1 befindet. Daher sind wiederum im Fall des Cyclosporins die Positionen 2 und 8 besonders bevorzugt.
Cyclosporine mit aktivierter Kupplungsgruppe, wie oben beschrieben, können beispielsweise hergestellt werden
i) durch Aktivierung einer bereits vorhandenen Vorläufergruppe (das heißt Kupplungsgruppe in nicht-aktivierter Form), beispielsweise Umwandlung der Carboxygruppe eines Cyclosporins mit einem carboxy-substituierten α-Aminosäurerest (das heißt einem α- Aminosäurerest mit einer Seitenkette am α-Kohlenstoffatom, der eine Carboxygruppe enthält oder trägt), beispielsweise an der Position 2 oder 8 in eine aktivierte Carboxygruppe durch Reaktion mit einem carboxy-aktivierenden Mittel oder
ii) durch Acylierung oder Veresterung eines Cyclosporins mit einem Amino- oder Hydroxy-substituierten α-Aminosäurerest (das heißt einem α-Aminosäurerest mit einer Seitenkette am α-Kohlenstoffatom, der eine Hydroxy- oder Aminogruppe enthält oder trägt), beispielsweise Hydroxy-substituierter α-Aminosäurerest an der Position 2 oder Amino- oder Hydroxy-substituierter α- Aminosäurerest an der Position 8, mit einem acylierenden oder alkylierenden Mittel mit aktivierter Kupplungsgruppe.
Der obige Verfahrensschritt i) kann gemäß im Fachgebiet bekannter Standardtechniken ausgeführt werden, beispielsweise zur Aktivierung von Carboxygruppen durch Reaktion mit ordnugsgemäßen carboxy-aktivierenden Mitteln, wie o- oder p-Nitrophenol, 1-Hydroxybenztriazol, Pentafluorphenol oder N-Hydroxysuccinimid. Die Reaktion wird geeigneterweise in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie EDCI ausgeführt.
Der Verfahrensschritt ii) kann ebenfalls mit im wesentlichen herkömmlichen Techniken ausgeführt werden. Daher können Amino- oder Hydroxylgruppen geeigneterweise durch Reaktion mit einem Derivat einer Carbonsäure acyliert werden, worin die Carboxylgruppe aktiviert ist und die zusätzlich eine aktivierte Kupplungsgruppe trägt, die nicht mit Amino- oder Hydroxygruppen reagiert, wie das beispielsweise bei N-[(2-Pyridyl)dithio-propion- 1-yl]-succinimid der Fall ist, [der (2-Pyridyl)-dithio Teil liefert die aktivierte Kupplungsgruppe (in diesem Fall nicht reaktiv mit Amino- und Hydroxygruppen) und der -COO-Succinimidoteil die aktivierte Carboxygruppe für eine Acylierung]. Die Reaktion wird geeigneterweise in einem inerten Lösemittel oder Verdünnungsmittel, wie Dichlormethan, beispielsweise bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Alternativ dazu können Hydroxygruppen verethert werden, beispielsweise um einen Epoxy-tragenden Teil der Formel
unter Verwendung jedes der verschiedenen Mittel, die im Fachgebiet für solche Zwecke bekannt sind, wie Epichlorhydrin oder Epibromhydrin, einzuführen [der Epoxyteil liefert die aktivierte Kupplungsgruppe], beispielsweise gemäß den bereits oben von Laumen et al., beschriebenen allgemeinen Verfahren.
Die Cyclosporin Ausgangsmaterialien für den obigen Verfahrensschritt i) können analog zum Verfahrensschritt ii) hergestellt werden, beispielsweise für die Herstellung eines Cyclosporins mit Carboxy-substituiertem α-Aminosäurerest, beispielsweise an der Position 2 oder 8.
iii) durch Reaktion eines Cyclosporins mit einem Amino- oder Hydroxy-substituierten α-Aminosäurerest, beispielsweise einem Hydroxy-substituierten α-Aminosäurerest an der Position 2 oder einem Amino- oder Hydroxy-substituierten α-Aminosäurerest an der Position 8, entweder a) mit einer Dicarbonsäure, bei der eine der Carboxygruppen in geschützter Form vorkommt, oder b) mit einem Dicarbonsäureanhydrid, beispielsweise Bernsteinsäureanhydrid, wobei sich an die Reaktion im Fall a) von eine Abspaltung von Schutzgruppen der Carboxygruppe im Cyclosporinprodukt anschließt.
Der Verfahrensschritt iii) kann ebenfalls unter Verwendung im wesentlichen herkömmlicher Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise in Gegenwart eines säurebindenden Mittels, wie 4-Dimethylaminopyridin in einem inerten organischen Lösemittel oder Verdünnungsmittel bei Umgebungs- oder etwas höherer Temperatur. Wo Carboxyschutzgruppen wie in Variante a) verwendet werden, können diese gänzlich herkömmlich sein und durch gänzlich herkömmliche Verfahren entfernt werden.
Die Cyclosporin Ausgangsmaterialien für die Verfahrensschritte ii) und iii) mit einem Hydroxy-substituiertem α-Aminosäurerest beinhalten die bekannten Cyclosporine: [Thr]²-Cyclosporin und [(D)Ser]&sup8;-Cyclosporin, wobei das letztere in EP-B 0 056 782 zusammen mit dem Verfahren zu dessen Herstellung gemäß den allgemeinen Techniken des oben beschriebenen Totalsyntheseverfahrens für die Herstellung der Cyclosporine oder durch Fermentationstechnik beschrieben und beansprucht ist. Andere Cyclosporine mit Hydroxysubstituiertem α-Aminosäurerest, beispielsweise in der Position 8, können analog hergestellt oder erhalten werden und verschiedene weitere Cyclosporine einschließlich [(D)Thr]&sup8;-Cyclosporin, [Nva]²- [(D)Ser]&sup8;-Cyclosporin und [Thr]²-[(D)Ser]&sup8;-Cyclosporin wurden beschrieben und beansprucht in US Patentanmeldung Nr. 713 259 (vom 19. März 1985) = DE-A 3 509 809 (vom 19. März 1985) = FR-A 8 404 172 (vom 19. März 1985) = AU-A 40 272/85 (vom 22. März 1985) = GB-A 8 507 270 (vom 20. März 1985) = NZ-A 211 526 (vom 21. März 1985) = ZA-A 85/2195 (vom 22. März 1985).
Bevorzugte Cyclosporine mit einem Amino-substituierten α- Aminosäurerest sind jene, bei denen sich der Aminosäurerest an der Position 8 befindet, wobei Cyclosporine, bei denen der Rest - (D)Lys- in Position 8 vorkommt, besonders bevorzugt sind. Solche Cyclosporine können auch gemäß den allgemeinen Techniken des Totalsyntheseverfahrens zur Herstellung von Cyclosporinen hergestellt werden, das von R. Wenger entwickelt wurde, beispielsweise
iv) durch Abspalten der Schutzgruppen bei einem Cyclosporin mit einem Amino-substituierten α-Aminosäurerest an der Position 8, wobei dieses Cyclosporin in geschützter Form vorliegt, beispielsweise durch Abspalten der Schutzgruppen bei einem Cyclosporin, worin der Rest an der Position 8 -(D)Lys- in N-&epsi;geschützter Form ist, oder
v) Cyclisieren eines geradkettigen Undecapeptids mit der Sequenz des Cyclosporinprodukts, wobei dieses Undecapeptid in freier oder geschützter Form vorliegt, beispielsweise eines Undecapeptids, das einen -(D)Lys- Rest in freier oder N-&epsi;geschützter Form an der der Position 8 entsprechenden Position des Cyclosporinprodukts enthält, und, falls erforderlich, Durchführung des Verfahrensschritts iv).
Die Verfahrensschritte iv) und v) können im einzelnen gemäß dem hierin später in Beispiel 1 beschriebenen allgemeinen Verfahren ausgeführt werden.
Wie sich aus der Beschreibung der obigen Verfahrensschritte i), ii) und iii) ergibt, handelt es sich bei den Produkten der Schritte i) und ii) im allgemeinen um Cyclosporine mit einem Acylamino-, Acyloxy- oder Alkoxy-substituierten α-Aminosäurerest (das heißt einem α-Aminosäurerest mit einer Seitenkette am α- Kohlenstoffatom, der eine Acylamino-, Acyloxy- oder Alkoxygruppe enthält oder trägt), beispielsweise um Cyclosporine mit einem Acyloxy- oder Alkoxy-substituierten α-Aminosäurerest an der Position 2 oder mit einen Acylamino-, Acyloxy- oder Alkoxysubstituierten α-Aminosäurerest an der Position 8, worin die aktivierte Kupplungsgruppe im Acyl/Alkylteil vorkommt.
Dies kann auch ohne weiteres den folgenden Reaktionsschemata entnommen werden, die die Herstellung von bestimmten Cyclosporingruppen gemäß den allgemeinen Methoden der obigen Verfahrensschritte i) bis v) verdeutlichen:
In den folgenden Formeln Ia bis Id, IIa bis IId und III, steht C für die Sequenz -Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala- und
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E für die Sequenz -MeLeu-MeLeu-MeVal-.
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Reaktionsschritt i)

a)
worin
A¹ für -MeBmt- steht,
Ba¹ für -(O-Acyl)-Thr- , worin der Acylteil eine Kupplungsgruppe in nicht-aktivierter Form trägt, beispielsweise eine freie Carboxygruppe, wie - (O-Hydroxysuccinyl ) -Thr-, steht und
D¹ für -(D)Ala- steht,
↓Aktivierung, beispielsweise durch Reaktion mit einem in Gegenwart eines Kupplungsmittels geeigneten carboxyaktivierenden Mittel, wie EDCI,
worin und D¹ die obigen Bedeutungen besitzen, und
Bb¹ für -(O-Acyl)-Thr-, worin der Acylteil eine aktivierte Kupplungsgruppe trägt, beispielsweise eine aktivierte Carboxygruppe, wie -(O-Acyl)-Thr-, worin der Acylteil die Formel ZO-CO-(CH&sub2;)&sub2;-CO- aufweist, in welchem Z die carboxyaktivierende Gruppe darstellt, steht.
b)
worin A² für -MeBmt- steht und B² für -αAbu- oder -Nva- steht, oder
A² für -Dihydro-MeBmt- steht und B² für -Val- steht und
Da² für einen Acylamino-substituierten (D)α-Aminosäurerest, beispielsweise -(N-&epsi;-Acyl)-(D)Lys-, in welchem der Acylteil eine Kupplungsgruppe in nicht aktivierter Form trägt, beispielsweise eine freie Carboxygruppe, wie -(N-&epsi;- Hydroxysuccinyl)-(D)Lys-, steht,
↓Aktivierung, beispielsweise durch Reaktion mit einem Carboxyaktivierenden Mittel, wie N-Hydroxysuccinimid zweckmäßigerweise in Gegenwart eines Kupplungsmittels, wie EDCI,
worin
A² und B² die obigen Bedeutungen besitzen und
Db² einen Acylamino-substituierten (D)α-Aminosäurerest, beispielsweise -(N-&epsi;-Acyl)-(D)Lys-, worin der Acylteil eine aktivierte Kupplungsgruppe trägt, beispielsweise eine aktivierte Carboxygruppe, wie -(N-&epsi;-Acyl)-(D)Lys-, worin der Acylteil die Formel ZO-CO-(CH&sub2;)&sub2;-CO- aufweist, wobei Z die obige Bedeutung besitzt.

Reaktionsschritt ii)

a)
worin
A¹ und D¹ die obigen Bedeutungen besitzen und
Ba³ für -Thr- steht,
↓O-Alkylierung, um einen Alkylteil mit aktivierter Kupplungsgruppe einzuführen, beispielsweise eine Epoxygruppe, wie bei einer Reaktion mit Epichlorhydrin oder Epibromhydrin,
worin
A¹ und D¹ obige Bedeutungen besitzen und
Bb³ für -(O-Alkyl)-Thr- steht, worin der Alkylteil eine aktivierte Kupplungsgruppe trägt, beispielsweise eine Epoxygruppe, wie - (O-Epoxymethyl)-Thr-.
b)
worin
A² und B² die obigen Bedeutungen besitzen und Da³ für einen Amino-substituierten (D)α-Aminosäurerest, beispielsweise -(D)Lys-, steht,
↓ N-&epsi;-Acylierung unter Verwendung eines acylierenden Mittels mit aktivierender Kupplungsgruppe, die nicht mit -NH&sub2; reagiert, beispielsweise ein acylierendes Mittel der Formel ZO-CO- -(CH&sub2;)&sub2;-Y worin z obige Bedeutung besitzt und Y eine mit -NH&sub2; nicht reagierende aktivierte Kupplungsgruppe darstellt, beispielsweise eine 2-Pyridyldithiogruppe,
worin
A² und B² die obigen Bedeutungen besitzen und Db³ für ein Acylamino-substituierter (D)α-Aminosäurerest, beispielsweise -(N-&epsi;-Acyl)-(D)Lys-, worin der Acylteil einen aktivierten Kupplungsrest trägt, wie - [N-&epsi;-(3-(2- Pyridyl)dithio-propion-1-yl)]-(D)Lys-.

Reaktionsschritt iii)

a) Ein Cyclosporin der wie oben definierten Formel Ic:
↓Acylierung, beispielsweise durch Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid,
Ein Cyclosporin der wie oben definierten Formel Ia.
b) Ein Cyclosporin der wie oben definierten Formel Id:
↓Acylierung, beispielsweise durch Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid,
Ein Cyclosporin der wie oben definierten Formel Ib. Reaktionsschritt iv)
worin
A² und B² die obigen Bedeutungen besitzen und
Da&sup4; für einen Amino-substituierten (D)α-Aminosäurerest, beispielsweise -(D)Lys- in geschützter Form, steht,
↓Abspalten von Schutzgruppen,
Ein Cyclosporin der wie oben definierten Formel Id.

Reaktionsschritt v)

H-Da&sup5;EA²-B²-C-OH (III)
worin A² und B² die obigen Bedeutungen besitzen und
Da&sup5; für einen Amino-substituierten (D)α-Aminosäurerest, beispielsweise -(D)Lys-, in freier oder -N-&epsi;-geschützter Form, steht
↓Zyklisierung gemäß dem Verfahren von R. Wenger,
Ein Cyclosporin der wie oben definierten Formel Id oder Ie.
Es soll an dieser Stelle erwähnt werden, daß die Hydroxygruppe in der Position 3' in -MeBmt-und -Dihydro-MeBmteine relativ geringe Reaktivität besitzt. Wenn daher die oben beschriebenen Verfahren eine Reaktion von Cyclosporinen mit einem Hydroxy-substituierten α-Aminosäurerest an einer der Positionen 2 bis 1-1 beinhalten, beispielsweise -Thr- in Position 2, dann ist die Reaktion mit der Hydroxygruppe dieses Restes bevorzugt gegenüber einer Reaktion mit der Hydroxygruppe in -MeBmt- oder - Dihydro-MeBmt-, wobei Nebenreaktionen mit dem letzteren somit leicht vermeidbar sind.
In den obigen Formeln Ib, IIb, Id, IId, Ie und III stehen A² und B² bevorzugt jeweils für -MeBmt- und -oAbu-.
Wenn während der ganzen vorangegangenen Beschreibung spezifische Reste an der Position 8 bei Cyclosporinen erwähnt werden, aber die Konformation dieser Reste nicht genannt ist, ist die (D) -Konfiguration bevorzugt.
Die oben beschriebenen Cyclosporine mit aktivierter Kupplungsgruppe, wie auch Cyclosporine mit Amino-substituiertem α-Aminosäurerest an der Position 8, in denen der Aminosubstituent in freier oder geschützter Form vorliegt, oder anderweitig derivatisiert ist, beispielsweise acyliert, sind neu und stellen einen Teil der vorliegenden Erfindung dar.
Demnach liefert die vorliegende Erfindung:
1.1 Ein Cyclosporin, das einen α-Aminosäurerest mit aktivierter Kupplungsgruppe aufweist.
1.2 Ein Cyclosporin nach 1.1, worin der α-Aminosäurerest mit einer aktivierten Kupplungsgruppe an einer der Positionen 2 bis einschließlich 11 vorkommt.
1.3 Ein Cyclosporin nach 1.2, worin der α-Aminosäurerest eine aktivierter Kupplungsgruppe trägt, die einen Acylamino-, Acyloxy- oder Alkoxy-substituierten α-Aminosäurerest enthält, in welchem die aktivierte Kupplungsgruppe in dem Acylamino-, Acyloxy- oder Alkoxysubstituenten vorkommt.
1.4 Ein Cyclosporin nach einem der Punkte 1.1 bis 1.3, worin die aktivierte Kupplungsgruppe ein aktivierter Ester, eine aktivierte Dithio- oder Epoxygruppe ist.
1.5 Ein Cyclosporin nach 1.3, worin der α-Aminosäurerest eine aktivierte Kupplungsgruppe trägt, die enthält, einen Acylaminosubstituierten α-Aminosäurerest, worin der Acylaminosubstituent im Acylteil hiervon durch eine aktivierte Carboxy- oder aktivierte Dithiogruppe substituiert ist, einen Acyloxysubstituierten α-Aminosäurerest, worin der Acyloxysubstituent im Acylteil hiervon durch eine aktivierte Carboxygruppe substituiert ist, oder einen Alkoxy-substituierten α- Aminosäurerest, worin der Alkoxysubstituent durch eine Epoxygruppe substituiert ist.
1.6 Ein Cyclosporin nach einem der Punkte 1.1 bis 1.5, worin der α-Aminosäurerest mit ein (O-Acyl)-threonylrest an Position 2 ist.
1.7 Ein Cyclosporin nach 1.6 worin der Acylteil die Formel ZO-CO- CH&sub2;-CH&sub2;-CO- aufweist, worin Z eine Carboxy-aktivierende Gruppe ist.
1.8 Ein Cyclosporin nach 1.2, worin der α-Aminosäurerest an der Position 5, 6, 7 oder 8 vorkommt.
1.9 Ein Cyclosporin nach 1.8, worin der α-Aminosäurerest ein (D)α- Aminosäurerest in Position 8 ist.
1.10 Ein Cyclosporin nach 1.9, worin der α-Aminosäurerest ein Acylamino-substituierter (D)α-Aminosäurerest ist, worin die aktivierte Kupplungsgruppe im Acylaminosubstituenten vorkommt.
1.11 Ein Cyclosporin nach 1.10, worin die aktivierte Kupplungsgruppe eine aktivierte Carboxy- oder aktivierte Dithiogruppe ist.
1.12. Ein Cyclosporin mit einem Amino-substituierten (D)α- Aminosäurerest an der Position 8 in freier oder geschützter Form.
1.13. Ein Cyclosporin mit einem Acylamino-substituierten (D)α- Aminosäurerest an der Position 8, worin der Acylaminosubstituent im Acylteil hiervon durch eine freie Carboxygruppe substituiert ist.
1.14 Ein Cyclosporin nach einem der Punkte 1.10 bis 1.13 der Formel
worin X für Wasserstoff, eine Aminoschutzgruppe oder eine durch eine freie Carboxygruppe substituierte Acylgruppe steht oder für eine aktivierte Kupplungsgruppe, beispielsweise eine aktivierte Carboxy- oder Dithiogruppe, wie eine Acylgruppe der Formel Y-CH&sub2;-CH&sub2;-COsteht, worin Y für Carboxy, eine aktivierte Carboxygruppe oder eine aktivierte Dithiogruppe steht.
1.15 Ein Cyclosporin der Formel IIa, Ib, IIb, IIc, Id, IId oder Ie, wie oben definiert.
Wie oben diskutiert, ist nun erfindungsgemäß überraschenderweise gefunden worden, daß immunogene Konjugate, die einen durch die Wirkung einer aktivierten Kupplungsgruppe gekuppelten Träger und ein Cyclosporin enthalten, die man speziell unter Verwendung von Cyclosporinen mit aktivierten Kupplungsgruppen wie oben unter 1.1 bis 1.11, 1.14 oder 1.15 beschrieben, erhält, zum ersten Mal die Herstellung von monoklonalen Antikörpern ermöglichen, die zur Unterscheidung zwischen Cyclosporinen und Metaboliten hiervon fähig sind. Daher sind immunogene Konjugate, die die Reaktionsprodukte solcher Cyclosporine als Haptenkomponente enthalten, fähig, eine Antikörperantwort in provozierten Tieren, beispielsweise hiermit beimpften Tieren, hervorzurufen, so daß Antikörper-produzierende Zellen, wie Milz- oder Lymphknotenzellen anschließend von diesen isoliert und zur Herstellung von Hybridomalinien verwendet werden können, die monoklonale Antikörper liefern, die zur Unterscheidung von therapeutisch verabreichten Cyclosporinen, beispielsweise dem Cyclosporin und Metaboliten hiervon, speziell Metaboliten hiervon beim Menschen, wie Cyclosporin 17 und Cyclosporin 18 fähig sind. Solche antigenen Konjugate waren bis dahin unbekannt und die Erfindung liefert weiterhin:
2.1 Ein immunogenes Konjugat, das einen an ein Cyclosporin durch die Wirkung einer aktivierten Kupplungsgruppe gekuppelten Träger enthält, das beispielsweise einen Träger enthält, der mit einem Cyclosporin mit einem eine aktivierte Kupplungsgruppe der oben beschriebenen Art tragenden α-Aminosäurerest gekuppelt ist, insbesondere mit einem Cyclosporin, wie es unter einem der obigen Punkte 1 1 bis 1.11, 1.14 oder 1.15 (Formeln IIa, IIb, IIc oder IId) definiert ist.
2.2 Ein immunogenes Konjugat, erhalten oder erhältlich durch Kupplung eines Cyclosporins mit einem eine aktivierte Kupplungsgruppe tragenden α-Aminosäurerest der oben beschriebenen Art, insbesondere eines Cyclosporins , wie es oben unter einem der obigen Punkte 1.1 bis 1 11, 1.14 oder 1.15 (Formeln IIa, IIb, IIc oder IId) definiert ist.
2.3 Ein immunogenes Konjugat, beispielsweise der oben unter 2.1 oder 2.2 definierten Art, das bei der Herstellung eines monoklonalen Antikörpers brauchbar ist, der zur Unterscheidung zwischen einem Cyclosporin und einem Metaboliten hiervon fähig ist, beispielsweise eines monoklonalen Antikörpers, wie er später beschrieben, insbesondere unter einem der Punkte 3.1 bis 3.10 definiert ist.
Geeignete Träger für die erfindungsgemäßen immunogenen Kojugate umfassen alle bekannten und allgemein im Fachgebiet verwendeten Träger, besonders Polypeptide mit hohem Molekulargewicht, speziell Proteine, wie Serumalbumine, beispielsweise Rinderserumalbumin und Hühnerserumalbumin, Immunglobuline, besonders der Klasse IgG, wie Hühner oder Meerschweinchen IgG und synthetische Polymere, wie Polyglutaminsäure.
Zusätzlich liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines oben definierten immunogenen Konjugats, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch:
vi) Kuppeln eines eine aktivierte Kupplungsgruppe tragenden Trägers, wie beispielsweise hierin oben beschrieben, mit einem Cyclosporin mit einem eine geeignete mitreagierende Gruppe, beispielsweise Hydroxy- oder Aminogruppe, tragenden α- Aminosäurerests wie mit [Thr]²-Cyclosporin oder [(D)Lys]&sup8;- Cyclosporin, oder Kuppeln eines Trägers, wie beispielsweise hierin oben beschrieben, mit einem Cyclosporin, das einen eine aktivierte Kupplungsgruppe tragenden α-Aminosäurerest aufweist, wie beispielsweise hierin vorher beschrieben, besonders einem unter einem der obigen Punkte 1.1 bis 1.11, 1.14 oder 1.15 (Formeln IIa, Ib, IIc oder IId) definierten Cyclosporin.
Der obige Verfahrensschritt wird durch direkte Reaktion der Cyclosporinkomponente, das heißt ohne Verwendung eines Kupplungsreagenzes ausgeführt. Die Reaktion wird geeigneterweise durch Zugabe der in einem geeigneten inerten Verdünnungsmittel oder Träger, wie Dimethylformamid gelösten Cyclosporinkomponente zu einer gepufferten Präparation des Trägers, beispielsweise Trägerproteins, wie einer Lösung oder Suspension in Bicarbonatpuffer bei Umgebungstemperatur bewirkt. Das erhaltene immunogene Konjugat wird geeigneterweise durch Dialyse, beispielsweise gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung gereinigt.
Die oben beschriebenen immunogenen Konjugate, wie beispielsweise unter 2.1 bis 2.3 beschrieben, können zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern mit im wesentlichen herkömmlichen Standardtechniken verwendet werden, beispielsweise durch ein schrittweises Verfahren, das gekennzeichnet ist durch: a) Verabreichung eines immunogenen Konjugats, wie beispielsweise oben unter 2.1 bis 2.3 definiert, an eine geeignete Tierart, b) Gewinnung von gegen das immunogene Konjugat sensibilisierten antikörperproduzierenden Zellen, beispielsweise Milz- oder Lymphknotenzellen, c) Immortalisierung der gewonnenen Zellen, beispielsweise durch Fusion mit einer geeigneten Myelomazellinie unter Bildung von Hybridomazellinien, und d) Selektion einer immortalisierten Zelle, beispielsweise Hybridomalinie, die den benötigten monoklonalen Antikörper bildet.
Der Schritt a) wird geeigneterweise unter Verwendung von Ratten oder Mäusen, beispielsweise weiblichen Balb/c Mäusen als Empfänger und Verabreichung des immunogenen Konjugats durch s. c oder i.p. Injektion in einer Menge von etwa 50 bis 200 ug, beispielsweise 100 ug gefolgt von Boosterinjektionen i.p., s.c. oder i.m. 14 bis 21 Tage später ausgeführt. Mäusen, die hochtitrige Antiseren mit geeigneter Isotypenverteilung zeigen, wie beispielsweise durch reguläre RIA und/oder ELISA Technik bestimmt, werden später weitere Boosterinjektionen gegeben, beispielsweise gemäß den speziellen hierin später in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren, und weiterhin werden antikörperbildende Zellen, beispielsweise Milzzellen gesammelt [Schritt b)]. Der Schritt c) wird gemäß einer der im Fachgebiet angewandten Techniken ausgeführt, beispielsweise unter Verwendung des von S. Fazekas et al., "J. Immunol. Methods" 35, 1-32 (1980) beschriebenen Verfahrens, wobei eine bevorzugte Myelomlinie eine Maus (Balb/C) Linie ist. In Schritt d) werden wachsende Myelomlinien auf die Bildung von Antikörpern gegen Cyclosporin gescreent, beispielsweise in einem regulären RIA System unter Verwendung radioaktiv markierter Derivate hiervon oder in einem regulären ELISA System, wie beispielsweise hierin später in Beispiel 9 beschrieben.
Durch die Anwendung der oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung der besonderen erfindungsgemäßen immunogenen Konjugate ist es möglich, monoklonale Antikörper zu erhalten, die einen Grad an Spezifität zeigen, so daß sie zur Unterscheidung zwischen einzelnen Cyclosporinen fähig sind, die sich untereinander-nur in untergeordneten Strukturelementen unterscheiden, beispielsweise durch das Vorkommen einer einzelnen Hydroxygruppe an Stelle eines Wasserstoffatoms. Ein noch wichtigerer Punkt ist, daß die vorliegende Erfindung es zum ersten Mal ermöglicht, monoklonale Antikörper zu erhalten, die zur Unterscheidung zwischen Cyclosporinen, beispielsweise dem Cyclosporin und Metaboliten hiervon, besonders Metaboliten hiervon beim Menschen fähig sind. Daher sind gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche monoklonale Antikörper mit Cyclosporinen reaktiv, beispielsweise dem Cyclosporin, während sie relativ geringe Kreuzreaktivität mit Metaboliten hiervon zeigen. Ferner ermöglicht die Erfindung unter Verwendung erfindungsgemäßer immunogener Konjugate, wie beispielsweise unter 2.1 bis 2.3 oben definiert, in denen die Cyclosporin Haptenkomponente einem ausgewählten "Ziel"-Cyclosporin entspricht, den Erhalt von monoklonalen Antikörpern, die zur Unterscheidung zwischen dem Ziel" -Cyclosporin und den strukturell nah verwandten Metaboliten fähig sind, beispielsweise Metaboliten hiervon beim Menschen. Daher ist es möglich, wenn man von immunogenen Konjugaten ausgeht, die durch Kupplung eines Trägers mit einem Cyclosporin mit aktivierter Kupplungsgruppe an der Position 2 erhalten werden, beispielsweise wie oben unter 1.6 definiert, und in denen die α-Aminosäurereste an den verbleibenden Positionen 1 und 3 bis 11 die gleichen sind, wie die im Cyclosporin, monoklonale Antikörper herzustellen, die mit dem Cyclosporin als " Ziel" -Cyclosporin bevorzugt gegenüber Metaboliten hiervon beim Menschen reagieren, wie beispielsweise den Cyclosporinen 1, 8, 9, 10, 16, 17, 18 und/oder 21, besonders 17 und/oder 18 und speziell 17. Ähnlich können ausgehend von immunogenen Konjugaten, die durch Kupplung eines Trägers mit einem Cyclosporin mit aktivierter Kupplungsgruppe an der Position 5, 6, 7 oder 8 erhalten werden, wie beispielsweise oben unter 1.8 definiert, besonders an der Position 8, wie beispielsweise unter einem der obigen Punkte 1.9, 1.11, 1.14 oder 1.15 (Formeln IIb oder IId) definiert, und in dem die Reste an den verbleibenden Positionen, beispielsweise an den Positionen 1 bis 7 und 9 bis 11' denen bei Cyclosporin , Dihydro-[Val]²-Cyclosporin oder [Nva]²-Cyclosporin entsprechen, monoklonale Antikörper hergestellt werden, die bevorzugt mit Cyclosporin, Dihydro- [Val]²-Cyclosporin oder [Nva]²-Cyclosporin als "Ziel"-Cyclosporin gegenüber Metaboliten hiervon reagieren, beispielsweise Metaboliten hiervon beim Menschen, wie den den unmittelbar vorher angeführten Metaboliten des Cyclosporins.
Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene monoklonale Antikörper sind besonders zur Unterscheidung zwischen "Ziel"-Cyclosporin und Metaboliten hiervon fähig, welche strukturelle Umwandlungen des α-Aminosäurerests an der Position 1 zeigen, beispielsweise Metaboliten, die sich von einem nicht-metabolisierten Cyclosporin unterscheiden, von dem sie durch austauschende oder chemische Modifikationen des -MeBmt- oder -Dihydro-MeBmt- Restes an der Position 1 stammen, und besonders eine strukturelle Umwandlung an einer endständigen Stelle im Rest an der Position 1 zeigen, beispielsweise eine Hydroxylierung der endständigen (C&sup9;)- MeBmt- Methylgruppe enthalten, wie im Fall der im Beispiel 9 beschriebenen monoklonalen Antikörper, die mit Cyclosporin reaktiv sind, während sie relativ niedrige Kreuzreaktivität mit dessen Metabolit Cyclosporin 17 aufweisen. Ist diese metabolische Umwandlung eines Cyclosporins von besonderer Bedeutung, beispielsweise als Merkmal von Hauptmetaboliten beim Menschen, wie im Fall der Cyclosporine 17 und 13, dann ist die Fähigkeit der durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen monoklonalen Antikörper zur Unterscheidung zwischen Cyclosporinen und Metaboliten hiervon, die diese Umwandlung zeigen, besonders zu erwähnen.
Die Kreuzreaktivität mit Metaboliten, wie beispielsweise oben beschrieben, beträgt vorzugsweise etwa 5% oder weniger, insbesondere etwa 3% oder weniger, und vor allem etwa 2% oder weniger der Reaktivität mit dem nicht-metabolisierten Cyclosporin, beispielsweise durch RIA- oder ELISA Techniken gemessen, wie kompetitive ELISA Techniken, und zwar zweckmäßigerweise unter Verwendung eines Puffers, beispielsweise mit einem pH von etwa 6 bis 8, insbesondere 7 bis 8, wobei dieser Puffer zweckmäßigerweise auch eine geringe Menge, beispielsweise 0,01 bis 0,1%, wie 0,01 bis 0,05%, eines nicht ionischen oberflächenaktiven Mittels oder Tensids, wie Tween, enthält, unter Verwendung einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung von pH 7,5 mit 0,03% eines oberflächenaktiven Mittels, wie Tween 20. Daher zeigen die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen und mit Cyclosporin reaktiven monoklonalen Antikörper einen Unterschied im IC&sub5;&sub0; Verhältnis für Cyclosporin 11 verglichen mit dem Cyclosporin, gemessen durch kompetitive ELISA Technik unter den oben dargestellten Bedingungen in der Größenordnung des 35fachen oder mehr.
Durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche monoklonale Antikörper sind ebenfalls durch eine hohe Affinität für das "Ziel" -Cyclosporin, beispielsweise das Cyclosporin, gekennzeichnet. Daher werden erfindungsgemäß bevorzugte monoklonale Antikörper eine Affinitätskonstante [Gleichgewichts-Dissoziationskonstante] bezüglich des "Ziel"-Cyclosporins, beispielsweise des Cyclosporins, in der Größenordnung von 10 9 mol/l oder weniger, vorzugsweise von 10&supmin;¹&sup0; mol/l oder weniger haben, die
beispielsweise bei normalen RIA Temperaturen (etwa 4 bis 37ºC) durch Standardverfahren bestimmt wird, wie durch das Verfahren von Müller et al., Methods in Enzymology, 92, 589-601 (1983).
Die vorliegende Erfindung erlaubt weiterhin die leichte Zugänglichkeit zu monoklonalen Antikörpern der Klasse IgG, beispielsweise der Unterklasse IgG&sub1;. Insofern als solche Antikörper besonders für den Einsatz in Diagnostik-/Testkits geeignet sind, wie beispielsweise unten beschrieben, werden diese bevorzugt.
Monoklonale Antikörper, wie unten beschrieben, genauso wie die sie bildenden Hybridomalinien sind gänzlich neu und wie man leicht aus den vorhergehenden Beschreibungen ihrer allgemeinen und speziellen Eigenschaften ersehen kann, gut für den Einsatz in Diagnostik-/Testkits zugeschnitten, beispielsweise für die Überwachung von Plasmablutspiegeln von Cyclosporin als Arzneimittel bei Patienten, die eine Cyclosporintherapie erhalten. Die vorliegende Erfindung liefert demnach auch:
3.1 Einen monoklonalen Antikörper, der zur Unterscheidung zwischen einem Cyclosporin, wie einem vorherbestimmten Cyclosporin und einem Metaboliten hiervon fähig ist, insbesondere zumindest einem Metaboliten hiervon beim Menschen, insbesondere zumindest einem Hauptmetaboliten hiervon beim Menschen.
3.2 Einen monoklonalen Antikörper gemäß 3.1, der mit einem Cyclosporin, beispielsweise einem vorherbestimmten Cyclosporin reagiert und eine relativ geringe Kreuzreaktivität mit einem Metaboliten hiervon zeigt, insbesondere zumindest einem Metaboliten hiervon beim Menschen, speziell zumindest einem Hauptmetaboliten hiervon beim Menschen.
3.3 Einen monoklonalen Antikörper gemäß 3.1 oder 3.2, worin das Cyclosporin Cyclosporin, Dihydro-[Val]²-Cyclosporin oder [Nva]²-Cyclosporin ist, insbesondere das Cyclosporin ist.
3.4 Einen monoklonalen Antikörper gemäß einem der Punkte 3.1 bis 3.3, worin der Metabolit ein Metabolit ist, der eine strukturelle Umwandlung des α-Aminosäurerests an der Position 1 zeigt, insbesondere an einer endständigen Stelle am Rest der Position 1, wobei der Metabolit beispielsweise eine endständige Hydroxylierung des α-Aminosäurerests -MeBmt- an der Position 1 hat.
3.5 Einen monoklonalen Antikörper gemäß 3.4, worin das Cyclosporin Cyclosporin ist und der Metabolit Cyclosporin 1, 8, 9, 10, 16, 17. 18 oder 21 ist, besonders Cyclosporin 17 oder Cyclosporin 18 und speziell Cyclosporin 17 ist.
3.6 Ein monoklonaler Antikörper gemäß einem der Punkte 3.2 bis
3.5, worin die Kreuzreaktivität mit dem Metaboliten in der Größenordnung von etwa 5% oder weniger, vorzugsweise 3% oder weniger, insbesondere 2% oder weniger aufweist, wie beispielsweise durch RIA- oder ELISA Techniken unter den oben beschriebenen Bedingungen gemessen.
3.7 Einen monoklonalen Antikörper gemäß einem der Punkte 3.1 bis 3.6, worin die Affinitätskonstante in Bezug auf das (vorherbestimmte) Cyclosporin, beispielsweise dem Cyclosporin, in der Größenordnung von 10&supmin;&sup9; mol/Liter oder weniger, vorzugsweise 10&supmin;¹&sup0; mol/Liter beträgt, wie beispielsweise unter den oben beschriebenen Bedingungen gemessen.
3.8 Einen monoklonalen Antikörper gemäß einem der Punkte 3.1 bis 3.7 der Klasse IgG.
3.9 Einen monoklonalen Antikörper, beispielsweise gemäß einem der Punkte 3.1 bis 3.8, erhalten oder erhältlich durch:
a) Kuppeln eines Cyclosporins mit einem eine aktivierte Kupplungsgruppe tragenden α-Aminosäurerest, wie beispielsweise oben beschrieben, insbesondere wie unter einem der obigen Punkte
1.1 bis 1.11, 1.14 oder 1.15 (Formeln IIa, IIb, IIc oder IId) beschrieben an einen Träger unter Bildung eines immunogenen Konjugats,
b) Verabreichung dieses immunogenen Konjugats an eine geeignete Tierart, um eine immunogene Provokation zu bewirken und Gewinnung der gegen dieses Konjugat sensibilisierten antikörperproduzierenden Zellen,
c) Immortalisierung dieser antikörperproduzierenden Zellen, beispielsweise durch Fusion mit einer geeigneten Myelomzellinie, und
d) Gewinnung monoklonaler Antikörper von einer ausgewählten immortalisierten Zelle, beispielsweise einer so erhaltenen Hybridomazellinie.
3.10 Einen monoklonalen Antikörper, beispielsweise gemäß einem der Punkte 3.1 bis 3.8, erhalten oder erhältlich durch:
a) Gewinnung von antikörperproduzierenden Zellen, die gegenüber einem immunogenen Konjugat gemäß einem der obigen Punkte 2.1 bis 2.3 sensibilisiert wurden,
b) Immortalisierung dieser Antikörperproduzierenden Zellen, beispielsweise durch Fusion mit einer geeigneten Myelomzellinie, und
c) Gewinnung der benötigten monoklonalen Antikörper von einer ausgewählten immortalisierten Zellinie, beispielsweise einer so erhaltenen Hybridomazellinie
4.1 Eine Hybridomazellinie, die einen monoklonalen Antikörper gemäß einem der obigen Punkte 3.1 bis 3.8 bildet.
4.2 Eine Hybridomazellinie, die gemäß der obigen Schritte a) bis
c) von 3.9 oder der obigen Schritte a) und b) von 3.10 erhalten wurde oder erhältlich ist.
Es ist ersichtlich, daß erfindungsgemäße monoklonale Antikörper zwischen einem gegebenen Cyclosporin, beispielsweise dem Cyclosporin und einer Vielzahl von dessen Metaboliten unterscheiden können und geringe Kreuzreaktivität in Bezug auf mehr als nur einem der Metaboliten zeigt.
Zusätzlich zum Vorangegangenen liefert die vorliegende Erfindung auch:
vii) Ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, wie nach einem der obigen Punkte 3.1 bis 3.8 definiert, wobei dieses Verfahren gekennzeichnet ist durch Kultivieren einer Hybridomazellinie, die diese Antikörper bildet und durch Gewinnung des so gebildeten Antikörpers, und
viii) Ein Verfahren zur Herstellung einer Hybridomazellinie, die einen nach einem der obigen Punkte 3.1 bis 3.8 definierten monoklonalen Antikörper bildet, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch Immortalisierung einer antikörperproduzierenden Zelle, wie einer einen solchen Antikörper bildenden Milz- oder Lymphknotenzellen beispielsweise durch Fusion mit einer geeigneten Myelomzellinie.
Die obigen Verfahrensschritte können gemäß jetzt üblichen Techniken ausgeführt werden, wie beispielsweise oben oder in den begleitenden Beispielen beschrieben, wobei bevorzugte Myelomzellinien zur Verwendung im Verfahren viii) Maus (Balb/C) Myelomzellinien sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, das Cyclosporine mit -(D)Lys- Rest an der Position 8, das heißt wie oben unter 1.14 oder 1.15 (Formel id) definiert, genauso, wie Derivate, in denen das N-&epsi;- Atom hiervon weiter derivatisiert ist, beispielsweise zellbindende Eigenschaften in einem überraschenden und bemerkenswerten Grad mit Parallelen zu den "Ausgangs"-Cyclosporinen zeigen (beispielsweise die entsprechenden Cyclosporine mit -(D)-Ala an der Position 8). Dieser Befund ist von besonderer Bedeutung, da das N-&epsi;- Stickstoffatom von -(D)-Lys- eine ideale Stelle zur Anbringung von Markierungen liefert, an der beispielsweise ein Marker oder eine signalgebende Gruppe eingeführt werden kann. Solche markierten Cyclosporine liefern ein weiteres Schlüsselwerkzeug zum Studieren des Wirkmechanismus der "Ausgangs" -Cyclosporine (beispielsweise im Fall von [(D)Lys]&sup8;-Cyclosporin von Cyclosporin) und/oder zur Identifizierung von Bindungsstellen der "Ausgangs"-Cyclosporine, beispielsweise durch in vitro Gewebekulturpräparationen. Daher sind radioaktiv markierte Derivate, beispielsweise ¹²&sup5;I markierte Derivate zur schnellen Autoradiographie von Geweben brauchbar, beispielsweise bei der Nieren-Miroautoradiographie.
Zusätzlich liefern markierte Derivate, beispielsweise radioaktiv- oder fluoreszenzmarkiert, die von Cyclosporinen mit - (D)Lys-Rest an der Position 8 erhältlich sind, ideale Komponenten für den Einsatz in beispielsweise RIA und FIA Diagnostikkits. [(D)Lys]&sup8;-Cyclosprorine machen daher markierte Analoga der "Ausgangs"-Cyclosporine mit gleichen Bindungseigenschaften leicht zugänglich, beispielsweise in Bezug auf monoklonale Antikörper gegen das "Ausgangs"-Cyclosporin, wie beispielsweise erfindungsgemäß erhalten oder wie hierin oben definiert, und sind daher äußerst brauchbar als Diagnostik-/Testkit Komponente oder Teilkomponente.
Demnach liefert die vorliegende Erfindung auch:
5.1 Ein markiertes Derivat eines Cyclosporins, worin der Rest an der Position 8 -(D)Lys- ist, insbesondere
5.2 Ein markiertes Derivat eines Cyclosporins der oben definierten Formel Id.
Mit dem hierin verwendeten Ausdruck "markiertes Derivat" ist ein Derivat gemeint, das signalgebende Atome oder Gruppen oder Markeratome oder Markergruppen trägt, die beispielsweise quantitative Tests oder die Lokalisierung des Derivats ermöglichen oder erleichtern. Solche Derivate beinhalten Derivate, worin beispielsweise ein oder mehrere Atome des -(D)-Lys- Rests als signalgebendes Atom oder Markeratom dienen, beispielsweise ein radioaktives Atom, genauso wie Derivate, in denen eine signalgebende Gruppe oder Markergruppe mit dem N-&epsi;-Atom des -(D)Lys-Rests entweder durch direkte Bindung der signalgebenden Gruppe oder Markergruppe an das N-&epsi;-Atom oder durch Bindung der signalgebenden Gruppe oder Markergruppe durch einen verbindenden Zwischenteil an das N-&epsi;-Atom angehängt ist. Beispiele von markierten Derivaten beinhalten radioaktiv markierte Derivate, Fluoreszenz und Chemilumineszenzderivate und Derivate, die zur Photoaffinitätsmarkierung geeignet sind, das heißt, die mit einem Substituenten ausgestattet sind, der mit einem Protein reagiert, an das Cyclosporin bei Belichtung gebunden wird. Die genannten radioaktiv markierten Derivate beinhalten Derivate, worin das N-&epsi;-Atom des - (D)Lys- Rests an der Position 8 beispielsweise an einen ¹²&sup5;I markierten p-OH-Phenylpropionylrest gehängt wird. Die genannten Fluoreszenz und Chemilumineszenzderivate beinhalten Derivate, worin das N-&epsi;-Atom des -(D)Lys- Rests an der Position 8 an eine fluoreszierende Gruppe, wie Dansyl- oder Rhodamingruppe oder chemilumineszierende Gruppe, wie eine Acriniumestergruppe gehängt wird, wie beispielsweise in Clin. Chem. 29, 8, Seiten 1474-1479 (1983) beschrieben. Eine besondere Gruppe der oben unter 5.1 und 5.2 definierten Cyclosporine sind demnach 5.3 jene, worin der Rest an der Position 8 ein Rest der Formel
ist, worin Q eine signalgebende Gruppe oder Markergruppe ist oder enthält, besonders eine radioaktiv markierte Gruppe, Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzgruppe, wie oben eingehend beschrieben.
Die genannten markierten Derivate können gemäß den obigen Verfahrensschritten iv) und v) hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung von Ausgangsmaterialien, in denen der -(D)Lys- Rest an der Position 8 vormarkiert ist. Alternativ dazu können sie durch Einführung eines geeigneten markierenden Substituenten hergestellt werden, beispielsweise am N-&epsi;-Atom des -(D)Lys- Rests an der Position 8. Daher können fluoreszenzmarkierte Derivate durch Kupplung eines Fluoreszenzteils an das N-&epsi;-Atom, beispielsweise durch N-&epsi;-Dansylierung hergestellt werden. Ähnlich können radioaktiv markierte Derivate durch Kupplung an das N-&epsi;-Atom eines radioaktiv markierten Substituenten hergestellt werden, beispielsweise durch 125I markiertes p-OH-Phenylpropionyl. Im letzteren Fall kann der Substituent entweder vor der Einführung in markierter Form sein oder anschließend an die Einführung markiert werden. Beispielsweise kann das N-&epsi;-Atom des Lysinrests in der Position 8 entweder direkt mit 1251 markierter p-OH-Phenylpropionsäure oder mit unmarkierter p-OH-Phenylpropionsäure reagieren und das erhaltene N-&epsi;-Amid anschließend im p-OH-Phenylteil mit 125I markiert werden. Die Kupplung kann gemäß im Fachgebiet bekannter Standardtechniken bewirkt werden, beispielsweise durch Reaktion mit p-OH- Phenylpropionsäure (markiert oder unmarkiert) in Form des N- Hydroxysuccinimidesters.
¹²&sup5;I markierte p-OH-Phenylpropionsäure kann ihrerseits durch das Chloramin T-Verfahren hergestellt werden [Hunter und Greenwood, Nature, 194, 495 (1962)]. Wenn die Markierung anschließend die Kupplung durchgeführt wird, kann dies unter Verwendung des Chloramin T-Verfahrens oder des Iodogen-Verfahrens ausgeführt werden [Good, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 19, 1051 (1981)]. Die erfindungsgemäßen Derivate der Cyclosporine, die wie oben beschrieben für eine Markierung zugänglich sind, worin beispielsweise das N-&epsi;-Atom von -(D)Lys- an der Position 8 durch eine Gruppe substituiert ist, wie durch die für eine ¹²&sup5;Iodierung zugängliche p-OH-Phenylpropionylgruppe, sind unmittelbare Vorläufer der markierten Derivate und werden auch als Teil des Wirkungsbereichs der vorliegenden Erfindung verstanden
Gemäß dem Vorangegangenen liefert die vorliegender Erfindung auch:
ix) Ein Verfahren zur Herstellung eines markierten Derivats, wie unter einem der obigen Punkte 5.1 bis 5.3 definiert, in freier oder geschützter Form, das gekennzeichnet ist durch Markierung des entsprechenden unmarkierten, freien oder geschützten Cyclosporins, beispielsweise durch Einführung eines markierten Substituenten, wie oben definiert, am N-&epsi;-Atom des -(D)Lys- Rests an der Position 8 hiervon und, falls erforderlich, unter Ausführung des obigen Verfahrensschritts iv).
An dieser Stelle soll noch erwähnt werden, das die Cyclosporine mit freier Aminogruppe, wie oben unter 1.12 definiert, beispielsweise die Verbindung [(D)Lys]&sup8;-Cyclosporin auch pharmazeutische, besonders immunsuppressive, antiinflammatorische und antiparasitäre Wirkung (beispielsweise anti-Malariawirkung und anti-coccidiomycotische Wirkung) besitzen, wie durch Standardtests in vivo und in vitro gezeigt werden kann, beispielsweise durch die verschiedenen in EP-B 0 056 782 beschriebenen Testverfahren.
Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wurde gefunden, daß die immunogenen Konjugate, in denen das Trägermolekül an ein Cyclosporin als Hapten über den Rest an der Position 5, 6, 7 oder 8, insbesondere an der Position 8 gekuppelt ist, einschließlich der oben unter 2.1 bis 2.3 definierten Konjugate, wie auch der durch Kupplung eines Cyclosporins erhaltenen, das eine Aminosäure mit reaktiver Gruppe an einer dieser Positionen trägt und nicht diejenigen, die durch eine aktivierte Kupplungsgruppe mit einem Träger unter Wirkung eines Kupplungsreagenzes erhalten werden, zur Bildung von regulären polyklonalen Antiseren mit höherer Spezifität als bis dahin erhältlich fähig sind, beispielsweise unter Verwendung von Konjugaten, die durch Kupplung eines Trägers an -(Thr)²- in (Thr)²-Cyclosporin erhalten wurden.
(Unter dem Ausdruck "reaktive Gruppe", wie er oben verwendet wird, ist jede Gruppe zu verstehen, die die Kupplung mit einem Träger, beispielsweise einem Polypeptid oder einem anderen geeigneten Makromolekül, erlaubt oder ermöglicht. Im allgemeinen umfaßt der Ausdruck aktivierte Kupplungsgruppen, wie oben definiert, wie auch andere zur Reaktion fähige Gruppen, beispielsweise freie Amino-, Carboxy- oder Hydroxygruppen).
Immunogene Konjugate, die ein Cyclosporin über den α-Aminosäurerest an der Position 5, 6, 7 oder 8 an einen Träger als Hapten gebunden enthalten, sind als solche neu. Bevorzugte Cyclosporine, die den Haptenteil solcher Konjugate liefern, sind besonders diejenigen, die eine aktivierte Kupplungsgruppe enthalten, wie oben unter 1.8 bis 1.11, 1.14 und 1.15 (Formeln IIb und IId) definiert.
Die vorliegende Erfindung liefert auch:
2.4 Ein immunogenes Konjugat, das einen an ein Cyclosporin über den α-Aminosäurerest an Position 5, 6, 7 oder 8 dieses Cyclosporins gekuppelten Träger enthält.
2.5 Ein immunogenes Konjugat, das einen Träger mit einem eine aktivierte Kupplungsgruppe tragenden Cyclosporin gekuppelt enthält, wie unter einem der obigen Punkte 1.8 bis 1.11, 1.14 oder 1.15 (Formeln IIb und IId) definiert.
2.6 Ein immunogenes Konjugat, das einen Träger mit einem eine freie Amino- oder Carboxygruppe tragenden Cyclosporin gekuppelt enthält, wie unter einem der obigen Punkte 1.12 bis
1.14 und 1.15 (Formeln Ib und Id) definiert, besonders ein Cyclosporin, wie oben unter 1.14 definiert oder der Formel Id wie oben definiert.
3.11 Einen monoklonalen Antikörper gemäß 3.9, dadurch gekennzeichnet, daß das in Schritt a) verwendete Cyclosporin ein oben unter 2.5 definiertes Cyclosporin ist.
6.1 Einen Antikörper, der mit einem Cyclosporin reagiert (einschließlich eines polyklonalen Antiserums, das reaktive Antikörper gegen ein Cyclosporin enthält), der als Antwort auf ein immunogenes Konjugat gebildet wird, wie unter einem der obigen Punkte 2.4 bis 2.6 definiert.
6.2 Einen Antikörper gemäß 6.1, der mit Cyclosporin, Dihydro- [Val]²-Cyclosporin oder [Nva]²-Cyclosporin, speziell Cyclosporin reagiert.
Die unter 2.5 definierten immunogenen Konjugate können gemäß den Verfahren des obigen Verfahrensschritts vi) hergestellt werden. Beispielsweise können die unter 2.6 definierten Konjugate durch oben beschriebene Verfahren oder durch ein Verfahren hergestellt werden, das gekennzeichnet ist durch:
x) Kuppeln eines Trägers an ein Cyclosporin mit einem eine reaktive Gruppe tragenden α-Aminosäurerest (das heißt α- Aminosäurerest mit Seitenkette am α-Kohlenstoffatom, die eine reaktive Gruppe enthält oder trägt), beispielsweise ein Cyclosporin mit freier Amino- oder Carboxygruppe, wie unter einem der Punkte 1.12 bis 1.14 und 1.15 oben definiert (Formeln Ib und Id).
Der obige Verfahrensschritt kann gemäß den im Fachgebiet bekannten Techniken durch Bindung des Trägers an das Cyclosporin über die Vermittlung einer Kupplungsgruppe bewirkt werden. Daher können im Fall von Cyclosporinen mit einem -(D)Lys- Rest an der Position 8 Konjugate durch Bindung des Trägers, beispielsweise eines Polypeptids, wie Immunglobulin, an das -(D)Lys- N-&epsi;-Atom unter Verwendung des Carbodiimidverfahrens [Kellie et al., "Steriod Immunology", Herausgeber Cameron et al., Alpha. Omega, Cardiff, 1975] oder durch die Mannich-Reaktion, die Formaldehyd als Kupplungsreagenz verwendet, erhalten werden.
Geeignete Träger beinhalten Träger vom schon in Zusammenhang mit der Herstellung von Konjugaten zur Bildung von monoklonalen Antikörper beschriebenen Typ, besonders Polypeptide mit hohem Molekulargewicht, speziell Proteine, wie Serumalbumine, Immunglobuline und synthetische Polymere, wie Polyglutaminsäure.
Reguläre polyklonale Antiseren, wie unter 6.1 definiert, sind auch brauchbar, obwohl ihnen die genaue Spezifität der monoklonalen Antikörper, wie hierin vorher beschrieben und definiert, fehlt, sind auch beispielsweise als Diagnostik-/Testkitkomponenten brauchbar, besonders in Anbetracht ihrer verbesserten Spezifität in Bezug auf Cyclosporine, verglichen mit den im Fachgebiet bekannten Antiseren. Sie können unter Verwendung von im wesentlichen herkömmlichen Techniken hergestellt werden, beispielsweise durch ein Verfahren, das gekennzeichnet ist durch:
xi) Hervorrufen einer Immunantwort in einer geeigneten Tierart durch Verabreichung eines immunogenen Konjugats, wie unter einem der obigen Punkte 2.4 bis 2.6 definiert, und Gewinnung der so erzeugten Antiseren.
Der oben definierte Verfahrensschritt xi) kann beispielsweise durch Verabreichung des immunogenen Konjugats an beispielsweise eine Maus, ein Schaf oder Huhn, beispielsweise durch Injektion ausgeführt werden. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode wird das Antiserum gewonnen und zweckmäßigerweise lyophilisiert, beispielsweise zum späteren Einsatz in Kits, wie hierin später beschrieben. Die Inkubationsperiode wird geeignet gewählt, um dem Antiserum einen Titer von mehr als 1 : 2 000, beispielsweise im Bereich von etwa 1 7 000 bis 1 : 10 000 im regulären RIA zu verleihen.
Wie vorher angemerkt sind die monoklonalen Antikörper und polyklonalen Antiseren, wie auch die erfindungsgemäßen markierten Cyclosporine, alle besonders nützlich als Komponenten von Diagnostik-/Testkitsystemen, beispielsweise Immunotestkits.
Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt:
7. Ein Immunotestkit oder Immunotestsystem für Cyclosporintests, beispielsweise RIA oder FIA Kit oder System, für den Test auf ein Cyclosporin, wie dem Cyclosporin, in Subjekten , die eine Cyclosporintherapie erhalten, beispielsweise mit Cyclosporin, wobei dieser Kit oder dieses System enthält:
A) Einen Antikörper oder ein Antiserum, wie unter einem der obigen Punkte 3.1 bis 3.11 oder 6. 1 bis 6. 2 definiert, besonders einen monoklonalen Antikörper, wie unter einem der obigen Punkte 3.1 bis 3.11 definiert, und/oder
B) ein markiertes Derivat eines Cyclosporins, wie unter einem der obigen Punkte 5.1 bis 5.3 definiert, als Komponente dieses Kits oder Systems.
Kits, wie unter 7 definiert, sind für diagnostische Zwecke brauchbar, beispielsweise zur Bestimmung der im Blut, Blutplasma oder Urin vorhandenen Cyclosporinmengen, beispielsweise zur Erstellung eines geeigneten Dosierungsplans für Patienten, die eine Cyclosporintherapie erhalten. Solche Kits liefern ein Testmittel für Cyclosporine, beispielsweise dem Cyclosporin, von bis dahin unerreichter Sensitivität.
Kits, beispielsweise RIA- oder FIA Kits, können erfindungsgemäß gänzlich herkömmlich zur Anwendung gemäß herkömmlicher RIA- oder FIA Testtechniken sein. Daher werden RIA Kits geeigneterweise zusätzlich zum Antikörper oder Antiserum, wie einem oben unter Punkt A), ein geeignet markiertes Cyclosporinderivat, wie einem oben unter Punkt B) und C) einen Cyclosporin Standard enthalten. Das markierte Cyclosporinderivat wird dem zu bestimmenden Cyclosporin entsprechen. Zweckmäßigerweise wird es ein markiertes Derivat sein, wie unter dem obigem Punkt B) definiert, wenn beispielsweise das Cyclosporin zu testen ist, wird es geeigneterweise ein markiertes Derivat von [(D)Lys ]&sup8;-Cyclosporin sein. Trotzdem kann es auch jedes andere markierte komplementäre Cyclosporin sein, beispielsweise wenn das Cyclosporin zu testen ist, tritiertes Cyclosporin. Der Cyclosporin Standard C) wird im allgemeinen eine Lösung oder dergleichen sein mit einer bekannten Menge an zu testendem Cyclosporin.
Bei der Anwendung wird das Antiserum/der Antikörper, falls lyophilisiert, gelöst und zusammen mit beispielsweise der Komponente B) und entweder mit der zu testenden Probe oder oder der Komponente C) inkubiert. Die Inkubation wird bevorzugt bei 4ºC ausgeführt. Der pH der Inkubationsmischung wird bevorzugt im Bereich von etwa 5 bis 8, wie bei etwa pH 7 oder 8, gehalten, vorzugsweise mit der Hilfe eines puffernden Mittels, wie Citrat- oder Trispuffer.
Die Inkubation dauert, um brauchbar zu sein, mindestens 2 Stunden, beispielsweise etwa 6 bis etwa 12 Stunden. Nach der Inkubation wird die an den Antikörper gebundene Fraktion, beispielsweise die Komponente B), von der ungebundenen Fraktion getrennt, beispielsweise unter Verwendung von Aktivkohle, wie dextranbeschichteter Aktivkohle. Die ungebundene Fraktion absorbiert an die Aktivkohle und kann dann durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt werden. Die Menge an Radioaktivität in einer Fraktion wird dann durch Standardtechniken gemessen, beispielsweise durch Flüssigscintillationszählung nach der Zugabe einer sekundären Lösung. Der Anteil der an den Antikörper gebundenen Komponente B) ist umgekehrt proportional zur Menge an Cyclosporin in der unbekannten Plasmaprobe. Zur quantitativen Analyse stellt man gewöhnlich eine Standardeichkurve durch Analyse von Cyclosporinlösungen mit bekannter Konzentration her.
Erfindungsgemäße FIA Kits können so aufgebaut sein, daß beispielsweise die Antikörper an einen Lichtfänger gebunden werden und so die Kits von der Kompetition zwischen einem fluoreszierenden Cyclosporin (beispielsweise einem erfindungsgemäß fluoreszenzmarkierten Derivat) und dem Antikörper abhängen.
Alternativ dazu können oben unter 7 definierte Testkits/Systeme auf jeden der im Fachgebiet bekannten herkömmlichen ELISA Systeme basieren.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung:

Beispiel I: Herstellung von [(D)Lys&sup8;]-Cyclosporin

a) Eine Lösung von 6,4 g H-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBzl Maleinat in CH&sub2;Cl&sub2; (200 ml) und H&sub2;O (100 ml) wird mit festem K&sub2;CO&sub3; auf pH 8 eingestellt. Nach zweimaligem Extrahieren, jeweils mit CH&sub2;Cl&sub2; (200 ml), wird die organische Phase über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und bis zur Trockne unter Bildung von freiem H-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBzl als kristallinen Rest verdampft.
b) (N-&epsi;-BOC)-FMOC-(D)Lys (6,25 g) wird in CHCl&sub3; (100 ml) gelöst und N-Methylmorpholin (2,95 g) wird unter Rühren zugegeben.
Nach Abkühlen der Lösung auf -20ºC wird Pivaloylchlorid (1,75 g) tropfenweise zugegeben und die Reaktionsmischung bei -20ºC für 6 Stunden gerührt. Eine Lösung von H-MeLeu-MeLeu-MeVal- OBzl (6,34 g) in CHCl&sub3; (20 ml) wird tropfenweise zur Anhydridlösung gegeben und für 17 Stunden bei -20ºC gerührt, um die Reaktion zu beenden. Nach dem Verdünnen der CHCl&sub3;
Lösung mit zusätzlichem CHCl&sub3; (200 ml), wird die Mischung mit gesättigter NaHCO&sub3; Lösung (100 ml) geschüttelt. Die organische Phase wird über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und das Lösemittel bis zur Trockne verdampft.
Der erhaltene, ölige Rest wird chromatographisch gereinigt unter Verwendung der 25fachen Menge an Silicagel (Teilchengröße 0,063-0,20 mm) und Methylenchlorid mit zugesetzten 3% Methanol als Eluent: [α]20/D = -114,2º (c = 1,0 in CHCl&sub3;).
c) (N-&epsi;-BOC)-FMOC-(D)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBzl (8,8 g), gelöst in absoluten Ethanol (400 ml), wird mit 10% Palladium/C Katalysator (0,6 g) in einem Gastar Hydrogenator hydriert bis die theoretische Menge an H2 aufgenommen ist (214 ml). Nach dem Abdampfen des Lösemittels wird der Rest chromatographisch unter Verwendung der Sofachen Menge an Silicagel (0,063-0,20 mm) und Methylenchlorid mit 7% Methanol als Eluent gereinigt: [α]20/D = -129,1º (c = 1,0 in CHCl&sub3;).
d) (N-&epsi;-BOC)-FMOC-(D)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-OH (7, 1 g) und H- MeBmt-αAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl (7,4 g) werden in Methylenchlorid (100 ml) gelöst und N-Methylmorpholin (1,72 g) und Castro-Reagenz (Bt-OP(NMe&sub2;)&sub3;&spplus;PF&sub6;&supmin;) (5,6 g) werden bei Raumtemperatur (25ºC) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird für drei Tage bei Raumtemperatur gerührt, dann wird die Lösung mit Methylenchlorid (200 ml) verdünnt und mit NaHCO&sub3; Lösung (100 ml) geschüttelt. Die organische Phase wird über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und bis zur Trockne eingedampft. Der erhaltene, ölige Rest wird chromatographisch auf Silicagel (500 g) (0,063-0,20 mm) unter Verwendung von Methylenchlorid mit zugesetzten 3% Methanol als Eluent gereinigt: [α]20/D = -143,8º (c = 1,0 in CHCl&sub3;).
e) (N-&epsi;-BOC) -FMOC- (D)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-αAbu-Sar-MeLeu- Val-MeLeu-Ala-OBzl (5,54 g) wird insgesamt für 4 Stunden bei Raumtemperatur in einer Lösung von Methylenchlorid (50 ml) und Piperidin (10 ml) gerührt. Das Lösemittel wird verdampft und das erhaltene Öl auf Sephadex LH20 (300 g) chromatographiert unter Verwendung von Methylenchlorid mit 3% Methanol als Eluent: [α]20/D = -165,2º (c = 1,0 in CHCl&sub3;).
f) 0,2 N NaOH (24 ml) wird zu in Ethanol (75 ml) gelöstem (N-&epsi;- BOC)-H-(D)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-αAbu-Sar-MeLeu-Val- MeLeu-Ala-OBzl (6,48 g) gegeben. Nach 7 Stunden wird die Lösung auf pH 4 durch tropfenweise Zugabe von 2 N HCl unter Kühlung eingestellt. Nach dem Verdampfen des Lösemittels wird der erhaltene Rest in CH&sub2;Cl&sub2; (200 ml) und gesättigter NaHCO&sub3; Lösung (200 ml) geschüttelt. Nach zweimaligem Extrahieren der wäßrigen Phase jeweils mit Methylenchlorid (200 ml), wird die organische Phase über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, abfiltriert und eingedampft. Das Produkt wird chromatographisch auf Silicagel (300 g) (0,06 - 0,20 mm) unter Verwendung von Methylenchlorid mit 20% Methanol als Eluent gereinigt: [α]20/D = -169,9º (c = 1,0 in CHCl&sub3;).

g) [Verfahrensschritt v)]

Dimethylaminopyridin (147 mg) wird unter Rühren zu in Methylenchlorid (2000 ml) gelöstem (N-&epsi;-BOC)-H-(D)Lys-MeLeu-MeLeu- MeVal-MeBmt-αAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OH (413 mg) gegeben. Propanphosphonsäureanhydrid [(0,19 g) 50%ige Lösung in CH&sub2;Cl&sub2;] wird zugegeben und die Reaktionsmischung wird für 24 Stunden bei 25ºC gerührt. Die erhaltene Lösung wird mit gesättigter NaHCO&sub3; Lösung (200 ml) gewaschen, die organische Phase wird über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, abfiltriert und eingedampft und chromatographisch auf Silicagel (300 g) (0,062-0,20 mm) unter Verwendung von Methylenchlorid mit 5% Methanol als Eluent gereinigt: 20 - -198,3º (c = 1,0 in CHCl&sub3;)

h) [Verfahrensschritt iv)]

[(N-&epsi;-BOC)-(D)Lys]&sup8;-Cyclosporin (842 mg) wird mit Trifluoressigsäure (25 ml) auf -20ºC gekühlt und zusammen für 4 Stunden bei -20ºC gerührt. Die Reaktionslösung wird mit Eis und gesättigter K&sub2;CO&sub3; Lösung (10 ml) gemischt und 3 Mal mit Methylenchlorid (200 ml) extrahiert. Die organische Phase wird über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und das Lösemittel verdampft. Das erhaltene Rohprodukt wird auf Sephadex LH20 (200 g) chromatographiert unter Verwendung von Methylenchlorid mit 1% Methanol als Eluent unter Bildung der Titelverbindung [(D)Lys]&sup8;- Cyclosporin: [α]20/D = -204,3º (c = 1,0 in CHCl&sub3;).
Das Verbindungsprodukt kann auch in Salzform gemäß Standardtechniken umgewandelt werden. Zu typischen Salzen gehören [(D)Lys]&sup8;-Cyclosporinhydrochlorid: [a]20/D = -203º (c = 1,0 in CHCl&sub3;) und [(D)Lys]&sup8;-Cyclosporintrifluoracetat: [α]20/D 0 -203º (c = 1,0 in CHCl&sub3;).

Beispiel 2: Herstellung von [(N-&epsi;-Hydroxysuccinyl)-(D)Lys]&sup8;-Cyclosporin: [Verfahrensschritt iii)]

255 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten [(D)Lys]&sup8;- Cyclosporins werden in 20 ml Pyridin gelöst und 36 mg Bernsteinsäureanhydrid werden zugegeben. Die erhaltene Lösung wird für etwa 14 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und das Pyridin bei maximal 40ºC unter Vakuum verdampft. Der erhaltene ölige Rest wird auf 55 g Sephadex LH 20 unter Verwendung von Methylenchlorid mit 2 % Methanol chromatographiert und in 10 ml Fraktionen gesammelt. Die reine Titelverbindung wird aus den Fraktionen 15 bis 23 erhalten.
Eine NMR Spektroskopie zeigt Bernsteinsäureprotonen bei 2,50 und 2,70 ppm (breite Signale) und ein Signal für -CH&sub2;-NH- COCH&sub2;CH&sub2;-COOH bei 3,25 ppm.

Beispiel 3: Herstellung von [(O-Hydroxysuccinyl)-Thr]-²-Cyclosporin: [Verfahrensschritt iii)]

6,05 g [Thr]²-Cyclosporin werden in 20 ml Pyridin gelöst und 3,66 g 4-Dimethylaminopyridin und 1,5 g Bernsteinsäureanhydrid werden bei 75ºC zugegeben. Die Reaktionsmischung wird für 4 Stunden bei 75ºC gerührt und dann mit 500 ml CH&sub2;Cl&sub2;, 5 Mal jeweils mit 50 ml 2N HCl und einmal mit 150 ml H&sub2;O gewaschen. Die organische Phase wird extrahiert, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, eingedampft und chromatographisch unter Verwendung von 250 g Silicagel (0,040-0,062 mm) mit Essigsäure als Eluent gereinigt.

Beispiel 4: Herstellung von [(N-&epsi;-Succinimidooxysuccinyl)- (D)Lys]&sup8;-Cyclosporin: [Verfahrensschritt i)]

50 mg des gemäß Beispiel 2 hergestellten [(N-&epsi;-Hydroxysuccinyl)-(D)Lys]&sup8;-Cyclosporins, 14 mg N-Ethyl-N'-(Dimethylaminopropyl)-carbodiimid HCl, 23,8 mg N-Hydroxysuccinimid und 24,6 mg Triethylamin werden für 2 Stunden bei Raumtemperatur in 2 ml Methylenchlorid unter Bildung einer klaren, farblosen Lösung gerührt. Die erhaltene Lösung wird mit 50 ml Methylenchlorid und 10 ml H&sub2;O verdünnt und IN HCl wird tropfenweise bis pH 6 zugegeben. Es entwickelt sich ein Zweiphasengemisch und dieses wird sorgfältig zwischen jeder HCl Zugabe geschüttelt. Die organische Phase wird schließlich mit 10 ml verdünnter NaHCO&sub3; Lösung geschüttelt, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und das Lösemittel wird unter Bildung der Titelverbindung verdampft.
Das NMR Spektrum zeigt Bernsteinsäureprotonen bei 2, 50 und 2,75 ppm (J = 5 cps) und N-Succinimidoprotonen bei 2,18 und 2,19 ppm (2S). Der Rest an der Position 8 hat die folgende Struktur:

Beispiel 5: Herstellung von [(O-Succinimidooxysuccinyl)-Thr]-²-Cyclosporin: [Verfahrensschritt i)]

54 mg Triethylamin, 98 mg N-Hydroxysuccinimid und 102 mg N- Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid werden zu einer Lösung von 200 mg gemäß Beispiel 3 hergestelltem [(O-Hydroxysuccinyl)-Thr]²-Cyclosporin in 10 ml Methylenchlorid gegeben, wobei die Zugabe bei 20ºC unter striktem Feuchtigkeitsausschluß erfolgt. Die Reaktionsmischung wird für 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, mit 200 ml Methylenchlorid verdünnt und mit 50 ml H&sub2;O geschüttelt. Die wäßrige Phase wird auf pH 5-6 durch tropfenweise Zugabe von IN HCl unter Schütteln eingestellt. Die wäßrige Phase wird mit 100 ml Methylenchlorid extrahiert, und die organischen Phasen werden mit 0, 1 N NaHCO&sub3; gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und eingedampft. Der Rest wird chromatographisch unter Verwendung von 110 g Silicagel mit Ethylacetat als Eluent unter Bildung der Titelverbindung gereinigt: [α]20/D = -178º (c = 1,0 in CHCl&sub3;). ¹H-NMR in CDCl&sub3; zeigt Succinimidoprotonen bei 2, 80 als Singlet und Bernsteinsäureprotonen bei 2, 60 ppm als Multiplett. Der Rest an der Position 2 hat die folgende Struktur:

Beispiel 6: Herstellung von [(N-(3-(2-Pyridyl)dithio)propion-1- yl)-(D)Lys]&sup8;-Cyclosporin: [Verfahrensschritt ii)]

35 mg Succinyl-3-[(2-Pyridyl)dithio]propionat werden zu einer Lösung von 126 mg [(D)Lys]&sup8;-Cyclosporin in 10 ml Methylenchlorid bei 20ºC unter striktem Feuchtigkeitsausschluß gegeben. Die Reaktionsmischung wird für 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, mit 200 ml Methylenchlorid verdünnt und mit 50 ml gesättigter NaHCO&sub3; Lösung geschüttelt. Die wäßrige Phase wird mit 150 ml Methylenchlorid extrahiert, die organischen Phasen werden mit H&sub2;O gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und eingedampft. Der amorphe Rest wird chromatographisch unter Verwendung von 100 g Silicagel mit Methylenchlorid/Methanol (95 5) als Eluent unter Bildung der reinen Titelverbindung gereinigt: [α]20/D = -165º (c = 1,0 in CHCl&sub3;).
Der Rest an der Position 8 hat die Formel

Beispiel 7: Herstellung von immunogenen Cyclosporin-Trägerkonjugaten des oben unter 2.1 definierten Typs [Verfahrensschritt vi)]

7.1 Konjugat mit Hühner gamma-Globulin

10 mg des nach dem Verfahren von Beispiel 4 hergestellten [N-&epsi;-Succinimidooxysuccinyl)-(D)Lys]&sup8;-Cyclosporins in 0,2 ml Dimethylformamid werden zu 100 mg Hühner gamma-Globulin in 4 ml NaHCO&sub3; (1,5% w/v, pH 8,1) gegeben. Die Reaktionsmischung wird für etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und das erhaltene Konjugat wird durch Dialyse gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung gereinigt.

7.2 Konjugat mit Hühner Ovalbumin

10,7 mg in 100 ul Dimethylformamid des gemäß Beispiel 5 hergestellten [O-Succinimidooxysuccinyl)-Thr]²-Cyclosporins, das zusätzlich 10% zweifach tritiertes Material enthält (1-2 uCi/mg
- analog zu Beispiel 5 erhalten, aber unter Verwendung von tritiertem [Thr]²-Cyclosporin als Ausgangsmaterial) werden unter ernergischem Rühren zu 30,45 mg Hühner Ovalbumin in 2 ml 1,5% NaHCO&sub3; Puffer gegeben (molarer Überschuß Cyclosporin/Ovalbumin = 10,68). Die Reaktionsmischung wird für 2 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt und das erhaltene Konjugat wird durch dreimalige Dialyse gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung für 18 Stunden bei 4ºC gereinigt. Bei dem Konjugatgebilde werden 55,7% der Anfangsradioaktivität ans Ovalbumin gebunden festgestellt, was eine Bindungsrate von 5,95 Cyclosporin/Ovalbumin anzeigt.
Die kovalente Bindung von Cyclosporin an das Ovalbumin wird durch Acetonfällung von 3 Konjugataliquots ermittelt. 39, 5% der Radioaktivität, die dem nicht-kovalent gebundenem Cyclosporin entsprechen, werden im Acetonüberstand gefunden, was schließlich eine kovalente Kupplungsrate von 3, 6 Cyclosporin/Ovalbumin ergibt. Das erhaltene Konjugat wird aliquotiert und bei -20ºC aufgehoben.
Ähnliche Konjugate können analog zu den obigen Beispielen 7.1 und 7.2 hergestellt werden, aber unter Verwendung des Cyclosporin Ausgangsmaterials von Beispiel 6.

Beispiel 8: Herstellung von immunogenen Cyclosporin-Trägerkonjugaten des oben unter 2.4/2.6 definierten Typs: [Verfahrensschritt (x)]

8. 1 Konjugat mit Meerschweinchen IgG

Meerschweinchen IgG (30 mg) wird in 0,1 M Bicarbonatpuffer (pH 9, 0,5 ml) gelöst und zu einer Lösung des gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellten [(D)Lys]&sup8;-Cyclosporins (1 mg) im selben Puffer (0,5 ml) gegeben und einige Tropfen 1%iger Essigsäure werden zugegeben. Die Kupplung wird durch anschließende Zugabe von zwei Teilen N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (jeder Teil = 100 mg) bewirkt. Das Reaktionsprodukt wird zur 24 Stunden späteren Injektion durch mehrere Dialysen gegen Wasser, gefolgt von einer Lyophilisierung, vorbereitet.

8.2 Konjugat mit Hasen IgG

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 hergestelltes [(D)Lys]&sup8;- Cyclosporin (10 mg) wird in 0, 1 ml ethanolischer Lösung von 6, 9 ug (= 0,1 mCi) tritiertem [(D)Lys]&sup8;-Cyclosporin gelöst. 0,1 ml Pyridin und 0, 1 ml 35%iges Formaldehyd werden zugegeben und das Ganze wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. 20 mg Hasen IgG in 0,02 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1 ml) und 0,3 ml Pyridin werden dann zugegeben und die Reaktion wird für etwa 14 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das erhaltene Konjugat wird gegen 30% Pyridin, 10% Pyridin und schließlich 0,005 M phosphatgeputferte Kochsalzlösung dialysiert. Die Kupplungsrate des Konjugats beträgt 1 : 11, 4.

Beispiel 9: Herstellung von Hybridomazellinien die mit Cyclosporin reagierende Antikörper bilden: [Verfahrensschritt viii)]

9.1 Verwendung des Konjugats von Beispiel 7.1

a) Immunisierung

Weibliche Balb/c Mäuse (20-25 g) erhalten, durch i.p. Injektion verabreicht, jeweils 100 ug des immunogenen Konjugatgebildes von Beispiel 7.1 in 0, 2 ml kompletten Freundschen Adjuvans. Nach 2 Wochen wird eine zweite Boosterinjektion mit 50 ug des Produkts von Beispiel 7.1 in 0, 2 ml kompletten Freundschen Adjuvans emulgiert, erneut durch i.p. Injektion verabreicht. Das Vorkommen von gegen Cyclosporin reaktiven Antikörpern im Serum der behandelten Mäuse wird durch reguläre RIA Tests unter Verwendung von Tritium-markiertem Cyclosporin als Signalgeber überprüft.

b) Hybridoma Erzeugung

Die in Schritt a) erhaltenen Mäuse mit maximalen Cyclosporin-reaktiven Antikörpertitern erhalten eine i.v. verabreichte Boosterinjektion , die 20 ug des Produkts von Beispiel 3.2 in Kochsalzlösung (0,85% w/v) enthält. Die Mäuse werden am vierten Tag getötet und die Milzzellen werden gemäß den von S. Fazekas et al., J. Immunol. Methods, 35, 1 (1980) beschriebenen Verfahren isoliert und mit Maus (Balb/C) Myelomzellen fusioniert.
Die wachsenden Hybridomazellen werden auf die Bildung von gegen Cyclosporin reaktiven Antikörpern durch reguläre RIA Testverfahren unter Verwendung von tritiummarkiertem Cyclosporin als Signalgeber und auf geringe Kreuzreaktivität mit Cyclosporin 17 gescreent, wieder unter Verwendung von regulären RIA Testverfahren mit tritiummarkiertem Cyclosporin als Signalgeber und Cyclosporin 17 als kompetitiven Ligand.
Eine ausgewählte Hybridomalinie J19. 2 bildet einen gegen Cyclosporin reaktiven monoklonalen Antikörper mit geringer Kreuzreaktivität gegenüber Cyclosporin 17. Der Antikörper wird zur IgG Klasse, Unterklasse IgG1 gehörend charakterisiert. Der erhaltene IC&sub5;&sub0; Wert für die Reaktivität mit Cyclosporin im RIA ist 6,7 ng/ml, veralichen mit 280 g/ml für Cyclosporin 17. Die Kreuzreaktivität mit Cyclosporin 17 ist daher in der Größenordnung von nur 2%. die bestimmte Affinitätskonstante in Bezug auf Cyclosporin ist in der Größenordnung von 10&supmin;&sup9; mol/Liter.
Diese Hybridomalinie wurde in der National Collection of Animal Cell Cultures, PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, SP4 OJG. Großbritannien unter der Hinterlegungsnummer 85 06 14 01 hinterlegt (Hinterlegungsdatum 13. Juni 1985).
Es ist ersichtlich, daß durch die Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, wie es hierin allgemein gezeigt wird, besonders durch die Verwendung von Cyclosporinen mit aktivierten Kupplungsgruppen, wie beispielsweise unter einem der obigen Punkte 1.1 bis 1.11, 1.14 oder 1.15 (Formeln IIa, IIb, IIc oder IId) definiert, zur Herstellung von immunogenen Konjugaten durch analoges Vorgehen nach den allgemeinen Verfahren dieses Beispiels, Hybridomalinien/monoklonale Antikörper damit leicht hergestellt werden können, wenn auch nicht identisch zu den speziell hergestellten Hybridomalinien/monoklonalen Antikörpern dieses Beispiels, so werden sie doch mit den selben wesentlichen oben beschriebenen Kriterien konfrontiert werden, beispielsweise gleichwertige oder sogar verbesserte Merkmale gegenüber den oben beschriebenen zu zeigen. Dies wird aus den im folgenden Beispiel gezeigten Ergebnissen deutlich.

9.2 Verwendung des Konjugats von Beispiel 7.2

a) Immunisierung

Die Mäuse (Balb/C) erhalten jeweils 100 ug des immunogenen Konjugatgebildes von Beispiel 7. 2 in 200 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung/Freundsches Adjuvans (1 : 1). Die erste Verabreichung (komplettes Freundsches Adjuvans) wird s.c. in der hinteren Fußsohle, nahe dem Schwanz und nahe dem Hals ausgeführt. Nach drei Wochen folgen zweite und dritte Verabreichungen (inkomplettes Freundsches Adjuvans), die s.c. am Rücken und i.m. jeweils in den hinteren Beinen ausgeführt werden. Blutproben werden 1 Woche jeweils nach der zweiten und dritten Verabreichung entnommen.
Die Mäuse werden zur weiteren Verwendung auf der Grundlage der folgenden gemessenen Kriterien ausgewählt:
1. Titer im Flüssigphasen RIA und im ELISA
2. Erkennbare Isotypenverteilung (nur IgG&sub1; oder IgG1+2a+2b im ELISA)
3. Relative Avidität im ELISA
4. Vermögen, zwischen Cyclosporin und Cyclosporin 17 und Cyclosporin 18 im kompetitiven ELISA zu unterscheiden
Den ausgewählten Mäusen werden Boosterinjektionen an den Tagen -3, -2 und -1 vor der Fusion unter Verwendung von 100 ug des immunogenen Konjugatgebildes von Beispiel 7.2 in 200 ul 9% NaCl durch i.p. (50%) und i.v. (50%) Injektionen am Tag -3 und i.p. Injektionen (100%) an den Tagen -2 und -1 verabreicht.

b) Hybridomaerzeugung

2,5·10&supmin;&sup7; oder 5·10&supmin; Milzzellen von jeder Maus werden mit 5·10&supmin;&sup7; Maus (Balb/C) Myelomzellen unter Verwendung von PEG 4000 fusioniert und in 24·24 Probenlöcher verteilt.
Die Kulturüberstände werden im ELISA auf das Vorkommen von Antikörpern gescreent, die an Rinderserumalbumin gekuppeltes [Thr]²-Cyclosporin (gemäß Beispiel 7.2 hergestellt) und/oder an Rinderserumalbumin gekuppeltes [(D)Lys]&sup8;-Cyclosporin bevorzugt gegenüber freiem Rinderserumalbumin als Negativkontrolle erkennen. Die ausgewählten IgG bildenden Hybridomalinien werden bis zur garantierten Monoklonalität kloniert.
Die Fähigkeit von durch Hybridomazellinien gebildete monoklonalen Antikörpern, zwischen (a) Cyclosporin und (b) den Cyclosporinen 17 und 18 zu unterscheiden/diskriminieren wird durch eine Kompetitionsmethode in einem indirekten ELISA, wie von Quesniaux et al., Immunology Letters, 9, 99-104, (1985) beschrieben, in einer Vielzahl an Puffersystemen getestet, die beinhalten: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung bei pH 7, 5 mit und ohne 0, 03% Tween 20 und Tris bei pH 7,5 mit 0,03% Tween und ohne NaCl. Optimale Bedingungen für die Enterscheidung werden allgemein in der phosphatgepufferten Kochsalzlösung bei pH 7, 5 mit 140 mM NaCl und 0,03% Tween 20 beobachtet. Von 9 untersuchten Klonlinien bilden 7 monoklonale Antikörper, die zwischen (a) Cyclosporin und (b) Cyclosporin 17 und Cyclosporin 18 unterscheiden. Für 6 Klonlinien ist das IC&sub5;&sub0; Verhältnis von Cyclosporin 17 verglichen mit Cyclosporin etwa 35fach oder größer.

Beispiel 10: Herstellung von regulären mit Cyclosporin reagierenden polyklonalen Antiseren [Verfahrensschritt xi)]

Schafe werden durch zehnmalige intramuskuläre Injektionen in die Hinterbeine in Intervallen von ungefähr 14 Tagen immunisiert. Die Injektionen enthalten ein Lyophilisat des immunogenen Proteinkonjugatgebildes von Beispiel 8.1 (3 mg), Alugel S (0,2 ml) und Freundsches Adjuvans (0,6 ml). Der erhaltene gegen Cyclosporin titrierte Endtiter ist durch RIA bestimmt 1/100 000.
Die gewonnenen polyklonalen Antikörperseren zeigen verbesserte Unterscheidungsfähigkeit zwischen Cyclosporin und dessen Metabolit Cyclosporin 17, verglichen mit polyklonalen Antiseren, die unter Verwendung der im Fachgebiet bekannten [Thr]²-Cyclosporin- IgG Konjugate erhalten werden, wie sie beispielsweise in derzeitigen Cyclosporin RIA Testkits verwendet werden. Daher ist die Kreuzreaktivität mit Cyclosporin 17 für gemäß dem vorliegenden Beispiel erhaltene Antiseren in der Größenordnung von etwa 18% verglichen mit etwa 42,0% für bekannte polyklonale Antiseren.

Beispiel 11: Herstellung von markierten Cyclosporinderivaten. wie oben unter 5. 1 definiert: [Verfahrensschritt ix)]

11.1 Herstellung von [N-&epsi;-TRITC-(D)Lysi]&sup8;-Cyclosporin

Gemäß Beispiel 1 hergestelltes [(D)Lys]&sup8;-Cyclosporin (15 mg) wird in Methylenchlorid (2 ml) gelöst. Rhodaminisothiocyanat (TRITC) (5,3 mg) wird zugegeben und die Reaktionsmischung bei -7ºC für 17 Stunden stehengelassen. Die intensiv rot gefärbte Lösung wird direkt auf Sephadex LH 20 (20 g) mit Methylenchlorid und 0,5 % Methanol chromatographiert. Die Fraktionen werden in 10 ml Portionen gesammelt.
Die Titelverbindung wird als ein Öl aus den Fraktionen 5 bis 7 und 10 bis 14 gewonnen: UV Absorbtion 300 nm/Fluoreszenzemission: 540 nm. Der Rest an der Position 8 hat die Struktur:

11.2 Herstellung von [N-&epsi;-Dansyl-(D)Lys]&sup8;-Cyclosporin

Gemäß Beispiel 1 hergestelltes [(D)Lys]&sup8;-Cyclosporin (232 mg) wird in Chloroform (15 ml) gelöst. Ethyldiisopropylamin (7,3 mg) und Dansylchlorid (99,5 mg) werden zugegeben und die Reaktionsmischung wird für 2 Stunden gerührt. Das Produkt wird direkt auf Sephadex LH 20 (100 g) mit Methylenchlorid und 0,5% Methanol chromatographiert. Die Fraktionen werden in 10 ml Portionen gesammelt.
Die gesammelten Fraktionen werden eingedampft und das entstehende Produkt erneut unter Verwendung von Silicagel (0,06 - 0,20 mm) (100 g) mit Methylenchlorid und 5% Methanol chromatographiert. Die Fraktionen werden in 15 ml Portionen gesammelt. Die Fraktionen 28 - 44 ergeben das reine Produkt: [α]20/D = -183,8º (c = 1,08 in CHCl&sub3;).

11.3 Herstellung eines ¹²&sup5;iodierten Derivats von [D)Lys]&sup8;- Cyclposporin

Die Titelverbindung wird analog zu den von Bolton und Hunter [Biochem. J. 133, 529 (1973)] beschriebenen Verfahren durch Anhängen eines p-OH-Phenylpropionylrestes an das N-&epsi;-Atom des Rests an der Position 8 von gemäß Beispiel 1 hergestelltem [(D)- Lys-Cyclosporin hergestellt. Die 125 I Markierung Markierung wird im Phenylring des p-OH-Phenylpropionylrestes getragen.
Die Reinigung wird durch HPLC auf einer 4·250 RP18-Säule mit einem linearen Gradienten und Verwendung von 10-30% n-Propanol/0,2% Trifluoressigsäure in 5% Essigsäure/0,2% Trifluoressigsäure als flüssige Phase ausgeführt.

Claims

1. Cyclosporin, das einen α-Aminosäurerest mit aktivierter Kupplungsgruppe aufweist, die zur direkten Reaktion mit einem Trägermolekül unter Bildung eines kovalent gebundenen Konjugats mit diesem Trägermolekül fähig ist, ohne daß ein Kupplungsreagenz benötigt wird, das die Kupplung oder Reaktion mit diesem Trägermolekül ermöglicht, bewirkt oder fördert.

2. Cyclosporin nach Anspruch 1, worin der α-Aminosäurerest mit einer aktivierten Kupplungsgruppe an einer der Positionen 2 bis einschließlich 11 vorkommt.

3. Cyclosporin nach Anspruch 2, worin der α-Aminosäurerest eine aktivierte Kupplungsgruppe trägt, die einen Acylamino-, Acyloxy- oder Alkoxy-substituierten α-Aminosäurerest enthält, in welchem die aktivierte Kupplungsgruppe in dem Acylamino-, Acyloxy- oder Alkoxysubstituenten vorkommt.

4. Cyclosporin nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die aktivierte Kupplungsgruppe ein aktivierter Ester, eine aktivierte Dithio- oder Epoxygruppe ist.

5. Cyclosporin nach Anspruch 3, worin der α-Amionosäurerest eine aktivierte Kupplungsgruppe trägt, die enthält, einen Acylamino-substituierten α-Aminosäurerest, worin der Acylaminosubstituent im Acylteil hiervon durch eine aktivierte Carboxy- oder aktivierte Dithiogruppe substituiert ist, einen Acyloxy-substituierten α-Aminosäurerest, worin der Acyloxysubstituent im Acylteil hiervon durch eine aktivierte Carboxygruppe substituiert ist, oder einen Alkoxysubstituierten α-Aminosäurerest, worin der Alkoxysubstituent durch eine Epoxygruppe substituiert ist.

6. Cyclosporin nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der α-Aminosäurerest, der eine aktivierte Kupplungsgruppe trägt, ein (O-Acyl)-threonylrest an der Position 2 ist.

7. Cyclosporin nach Anspruch 6, worin der (O-Acyl)teil die Formel ZO-CO-CH&sub2;-CH&sub2;-CO- aufweist, worin Z eine Carboxy-aktivierende Gruppe ist.

8. Cyclosporin nach Anspruch 2, worin der α-Aminosäurerest mit aktivierter Kupplungsgruppe an der Position 5, 6, 7 oder 8 vorkommt.

9. Cyclosporin nach Anspruch 8, worin der α-Aminosäurerest mit aktivierter Kupplungsgruppe ein (D)α-Aminosäurerest in Position 8 ist.

10. Cyclosporin nach Anspruch 9, worin der α-Aminosäurerest mit aktivierter Kupplungsgruppe ein Acylamino-substituierter (D)α- Aminosäurerest ist, worin die aktivierte Kupplungsgruppe im Acylaminosubstituenten vorkommt.

11. Cyclosporin nach Anspruch 10, worin die aktivierte Kupplungsgruppe eine aktivierte Carboxy- oder aktivierte Dithiogruppe ist.

12. Cyclosporin nach Anspruch 10 oder 11, worin der (D)α-Aminosäurerest in der Position 8 die Formel aufweist

worin X für eine durch eine aktivierte Kupplungsgruppe substituierte Acylgruppe steht.

13. Cyclosporin nach Anspruch 12, worin X eine Gruppe der Formel

Y-CH&sub2; -CH&sub2;-COist, worin Y für eine aktivierte Carboxy- oder aktivierte Dithiogruppe steht.

14. Cyclosporin nach Anspruch 5 der Formel IIa, IIb, IIc oder IId

worin A¹ für -MeBmt- steht,

Bb¹ für -(O-Acyl)-Thr- steht, worin der Acylteil eine aktivierte Kupplungsgruppe aufweist,

C für Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala- steht,

D¹- für -(D)Ala- steht, und

E für -MeLeu-MeLeu-MeVal- steht,

worin A² für -MeBmt- steht und B² für -αAbu- oder -Nvasteht, oder

A² für -Dihydro-MeBmt- steht und B² für -Val- steht, C und E die oben angegebenen Bedeutungen haben, und

Db² für einen Acylamino-substituierten (D)α-Aminosäurerest steht, worin der Acylteil eine aktivierte Kupplungsgruppe aufweist,

worin A¹, C, D¹ und E die oben angegebenen Bedeutungen haben, und

Bb³ für -(O-Alkyl)-Thr- steht, worin der Alkylteil eine aktivierte Kupplungsgruppe aufweist, und

worin A², B², C und E die oben angegebenen Bedeutungen haben, und

Db für einen Acylamino-substituierten (D) a-Aminoäurerest steht, worin der Acylteil eine aktivierte Kupplungsgruppe aufweist.

15. Cyclosporin nach Anspruch 14, worin in der Formel IIa, IIb, IIc oder IId

a) Bb¹ für -(-O-Acyl)-Thr- steht, worin der Acylteil die Formel ZO-CO-(CH&sub2;)&sub2;-CO- aufweist, worin Z eine Carboxy-aktivierende Gruppe ist, oder

b) Db² für -(N-&epsi;-Acyl)-(D)Lys- steht, worin der Acylteil die Formel ZO-CO-(CH&sub2;)&sub2;-CO- aufweist, worin Z die oben angegebene Bedeutung hat, oder

Db³ für -[N-&epsi;-(3-(2-Pyridyl)dithio-propion-1-yl)]-(D)Lyssteht.

16. Cyclosporin nach Anspruch 15, das ein [(N-&epsi;-Succinimidooxysuccinyl)-(D)Lys ]&sup8;-Cyclosporin ist.

17. Cyclosporin nach Anspruch 15, das ein [(O-Succinimidooxysuccinyl)-Thr]²-Cyclosporin ist.

18. Cyclosporin nach Anspruch 15, das ein [(N-(3-(2-Pyridyl)dithio)propion-1-yl)-(D)Lys]&sup8;-Cyclosporin ist.

19. Cyclosporin, das einen Amino-substituierten (D)α-Aminosäurerest an Position 8 aufweist, worin der Aminosubstituent in freier oder geschützter Form vorliegt.

20. Cyclosporin, das einen Acylamino-substituierten (D)α-Aminosäurerest in der Position 8 aufweist, worin der Acylaminosubstituent im Acylteil hiervon durch eine freie Carboxygruppe substituiert ist.

21. Cyclosporin nach Anspruch 19 oder 20, worin der (D)α-Aminosäurerest in der Position 8 die in Anspruch 12 dargestellte Formel aufweist, worin X für Wasserstoff, eine Aminoschutzgruppe oder eine durch eine Carboxygruppe substituierte Acylgruppe steht.

22. Cyclosporin nach Anspruch 19, das [(D)Lys]&sup8;-Cyclosporin ist.

23. Cyclosporin nach Anspruch 19, das [(N-&epsi;-BOC)-(D)Lys]&sup8;-Cyclosporin ist.

24. Cyclosporin nach Anspruch 22, das [(N-&epsi;-Hydroxysuccinyl)- (D)Lys]&sup8;-Cyclosporin ist.