NO173557B

NO173557B - Monoklonalt antistoff, immunogent konjugat, cyklosporin, fremgangsmaate for fremstilling av det monoklonale antistoff samt immunotestsett

Info

Publication number: NO173557B
Application number: NO86862177A
Authority: NO
Inventors: Joachim Rosenthaler; Roland Wenger; Phillip E Ball; Max H Schreier; Valerie Quesniaux
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1984-10-04
Filing date: 1986-06-02
Publication date: 1993-09-20
Also published as: DE3587342T2; JPS62500383A; WO1986002080A1; JPH074269B2; EP0290762B1; CY1915A; EP0290762A1; AU3914389A; NO862177D0; HK124696A; NO173557C; DE3587505T2; CA1309671C; DK172037B1; EP0314862A1; FI862370A0; FI93965C; ES547495A0; AU3914189A; NO862177L

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et monoklonalt antistoff for bruk i et blodovervåkningstestsystem, og det særegne ved det monoklonale antistoff i henhold til oppfinnelsen er at det er reaktivt med et cyklosporin og fremviser lav kryssreaktivitet med minst en metabolitt derav i mennesker.

Oppfinnelsen vedrører også et immunogent konjugat for utvikling av det ovennevnte monoklonale antistoff, og det særegne ved det immunogene konjugat i henhold til oppfinnelsen er at det omfatter et bærerprotein koblet til et cyklosporin ved omsetning av proteinet med et cyklosporin med en a-aminosyrerest i 2- eller 8-stillingen som bærer en aktivert koblingsgruppe, idet den aktiverte koblingsgruppe er en gruppe som er i stand til direkte reaksjon med bærerproteinet til å gi et kovalent sammenknyttet konjugat.

Oppfinnelsen omfatter også et cyklosporin for fremstilling av det ovennevnte konjugat, og det særegne ved cyklosporinet i henhold til oppfinnelsen er at det har en a-aminosyrerest som bærer en aktivert koblingsgruppe som angitt i det foregående.

Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for fremstilling av det ovennevnte monoklonale antistoff, omfattende trinnene med at a) et cyklosporin med en a-aminosyrerest kobles et bærer-protein for å danne et immunogent konjugat, b) det nevnte immunogene konjugat tilføres i en passende dyrespecies for å bevirke immunogen immunisering og antistoffproduserende celler som er sensitivert overfor det nevnte konjugat utvinnes,

c) de antistoffproduserende celler immortaliseres, og

d) monoklonalt antistoff utvinnes fra en selektert således

etablert immortalisert. cellelinje,

og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at det anvendes et cyklosporin med en a-aminosyrerest i 2-eller 8-stillingen som bærer en aktivert koblingsgruppe som angitt i krav 3.

Endelig omfatter oppfinnelsen også et immunotestsett eller system for overvåking av blodnivåer av cyklosporin, og det særegne ved immunotestsettet i henhold til oppfinnelsen er at det omfatter (1) et monoklonalt antistoff som angitt i krav 1 eller 2, og (2) et merket derivat av et cyklosporin hvor resten i 8-stillingen er -(D)Lys-, samt (3) en cyklosporin-standardoppløsning omfattende en kjent mengde av det cyklosporin som skal mengdebestemmes.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravene.

Foreliggende oppfinnelse vedrører således monoklonale antistoffer som er i stand til å skjelne mellom cyklosporiner og metabolitter derav og er egnet for bruk i diagnostiske overvåkings-testsett. Ved oppfinnelsen anvendes nye hybidrom-cellelinjer ved fremstillingen av de nevnte monoklonale antistoffer. De nye cyklosporiner og immunogene konjugater som omfatter dem anvendes således for generering av monoklonale antistoffer som nevnt i det foregående og som også er nyttige for generering av regulære polyklonale antisera egnet for bruk i diagnose/overvåkings-testsett.

Cyklosporinene omfatter en klasse av strukturelt distinkte, cykliske poly-N-metylerte undekapeptider som i alminnelighet har farmakologisk, spesielt immunosuppressiv, anti-inflamma-torisk og anti-parasitisk aktivitet. Det første av cyklosporinene som ble isolert var den naturlig forekommende fungale metabolitt "Cyclosporine" også benevnt som cyklosporin A, med formel A

hvori -MeBmt- representerer N-metyl-(4R)-4-but-2E-en-l-yl-4-metyl-(L)treonyl-resten med formel B

hvori -x-y- er -CH=CH- (trans).

Etter den opprinnelige oppdagelse av Cyclosporine er en lang rekke naturlig forekommende cyklosporiner isolert og identifisert og mange ytterligere ikke-naturlige cyklosporiner er blitt fremstilt ved total- eller halv-syntetiske midler eller ved anvendelse av modifiserte dyrkingsteknikker. Den klasse som omfattes av cyklosporinene er således nå meget stor og inkluderer f.eks. de naturlig forekommende cyklosporiner A til Z (jfr. Kobel et al, European Journal of applied Microbiology and Biotechnology 14, 237-240 (1982)og arbeidet fremlagt av Traber et al, 24. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, 8. - 10. oktober

(1984)), såvel som forskjellige ikke-naturlige eller kunstige cyklosporiner, inklusive dihydro-cyklosporiner (hvori gruppen -x-y- i -MeBmt-resten (se formel B i det foregående) er mettet, dvs. som omhandlet i US patentskrift nr- 4-108-985, 4.210.581 og 4.220.641, cyklosporiner hvori

-MeBmt-resten er tilstede i isomer eller N-desmetyl-form

(jfr. europetisk patent nr. 0.034.567 og "Cyclosporin A", Proe. Internat. Conference on Cyclosporin A, Cambridge (U.K.) september 1981, utgitt av D.J.G. White, Elsevier Press (1982) - som begge beskriver den total-syntetiske metode for fremstilling av cyklosporiner utviklet av R. Wenger) og cyklosporiner hvori innlemmelse av variant-aminosyrer i spesifikke posisjoner i peptid-sekvensen er gjennomført. Eksempler på slike cyklosporiner som omhandlet i henvisningene til den ovennevnte teknikk inkluderer f.eks. [Thr]<2->, [Val]<2->, [Nva]<2-> og [Nva]2-[Nva ] <5->Cyclosporine (også kjent som henhv. cyklosporiner C. D,

G og M) og dihydro [Val] -Cyclosporine (også kjent som dihydrocyklosporin D) .

[I samsvar med den nå konvensjonelle nomenklatur for cyklosporinene defineres disse i den foreliggende beskrivelse og krav med henvisning til strukturen av Cyclosporine (dvs. cyklosporin A). Dette gjøres ved først

å indikere de rester i molekylet som er forskjellig fra dem som er tilstede i Cyclosporine og deretter anvende betegnelsen "Cyclosporine" for karakterisering av de resterende rester som er identiske med dem som er tilstede i Cyclosporine. Samtidig anvendes prefikset "dihydro" for å betegne cyklosporiner hvori -MeBmt-resten er hydrogenert (-dihydro-MeBmt-), dvs. hvori -x-y- i formel B er -CH2-CH2. Således er [Thr] 2-Cyclosporine det cyklosporin som har sekvensen vist i formel A, men hvori -ocAbu- ved 2-stillingen er erstattet med -Thr- og dihydro-[Val] 2-Cyclosporine er det cyklosporin som har sekvensen vist i formel A, men hvori -MeBmt- i 1-stillingen er hydrogenert og -aAbu- i 2-stillingen er erstattet med -Val-.

I tillegg skal amino-syre-restene som er referert som forkortelser, f.eks. -Ala-, -MeVal- etc, i samsvar med konvensjonell praksis forståes som at de har (L) - konfigurasjon med mindre annet er angitt. Rest-forkortelser som foregåes av "Me" som i tilfellet med -MeLeu-, representerer N-metylerte rester. De individuelle rester i

cyklosporin-molekylet er nummerert, som vanlig på området,

i retning med urviserne og starter med resten -MeBmt-

(eller -dihydro-MeBmt-) i 1-stillingen. Den samme nummer-sekvens anvendes i hele den foreliggende beskrivelse og krav.]

På grunn av deres enestående immunosuppressive aktivitet,

har cyklosporinene tiltrukket særlig stor oppmerksomhet ikke bare innen medisinske og akademiske sirkler, men også

i den vanlige presse. Cyclosporine i seg selv er nå kommersielt tilgjengelig og vanlig anvendt for å forhindre avstøtning etter transplantasjon av allogent organ, f.eks. ved hjerte, hjerte-lunge, nyre og benmarg-transplantasjon,

såvel som mer nylig ved behandling" av forskjellige auto-immune og beslektede sykdommer og tilstander. Både dihydro-[Val] 2 -Cyclosporine og [Nva] 2-Cyclosporine er under intens klinisk undersøkelse som mulige etterfølgere av Cyclosporine (eller cyklosporin A).

Dosering av cyklosporiner, f. eks. Cyclosporine, frembyr imidlertid spesielle vanskeligheter. Da metaboliske omdannelses-hastigheter synes å være pasientspesifikke og det terapeutiske område snevert, er effektiv dosering sterkt individ-spesifikk og krever etablering av riktige individuelle serum-nivåer. Regelmessig overvåking av cyklosporin-plasma-konsentrasjoner er således en vesentlig forutsetning for effektiv behandling. For dette formål er det blitt- utviklet et antall systemer med høytrykks-væskekr.omatografering (HPLC) , radioimmunoanalyser

(RIA) og fluorimmunoanalyser (FIA)-systerner.

HPLC-metoder, selv om de er meget spesifikke er imidlertid vanskelige og omstendelige å anvende i praksis og det for tiden kommersielt tilgjengelige RIA-system basert på ovintpolyklonalt anti-serum er møtt med kritikk på grunn av dets mangel på spesifisitet. Utvikling av cyklosporin, f.eks. Cyclosporine, spesifikke monoklonale antistoffer som er i stand til å skjelne mellom terapeutisk tilførte cyklosporiner og deres metabolitter i mennesker har følgelig i lang tid vært et presserende praktisk såvel som et rent vitenskapelig mål, ettersom disse ville ha den fordel at de kunne tilby den samme potensielle spesifisitet som HPLC-metodologien, mens fordelene med lett anvendelse tilveiebragt ved konvensjonelle immunoanalysesystemer ville bli bibeholdt. I tillegg ville tilveiebringelsen av slike cyklosporin-spesifikke monoklonale antistoffer tilveiebringe et vitalt nytt forskningsverktøy som tillater f.eks. komparativ undersøkelse av cyklosporin-konformasjon og definisjon av cyklosporin-reseptorkrav etc.

Siden den opprinnelige oppdagelse av Cyclosporine er det gjort tallrike forsøk på å fremstille monoklonale antistoffer som er reaktive til cyklosporiner. Siden cyklosporiner, f.eks. Cyclosporine, i seg selv har liten immunogen aktivitet har et vanlig forsøk vært å gå frem under anvendelse av et immunogent, f.eks. hapten-protein, konjugat, f.eks. utviklet ved kobling av immunoglobuliner via hydroksy-gruppen tilgjengelig ved -Thr 2- i [Thr] 2-Cyclosporine under anvendelse av konvensjonelle koblingsmetoder, f.eks. med EDCI [N-etvl-N'-(3-dimetvl-aminopropyl)karbodiimid.2HC1] eller MCDI [N-cykloheksyl-N' -[3-(N-metyl-morfolino)etyl]-karbodiimid.p.toluen-sulfonat] som koblingsmiddel. Forsøk på denne måte har imidlertid slått feil oq hvor monoklonale antistoffer er blitt oppnådd er disse funnet å ha forholdsvis lav spesifisitet for Cyclosporine, eller å være spesifikke med hensyn ti 1 bærerproteinet eller koblingsreagenset som ble anvendt snarere enn for Cyclosporine, eller å være sterkt kryssreaktive med koblingsmidlet. Ikke i noen tilfeller har det vist seg mulig å frembringe monoklonale antistoffer som kan identifiseres ved at de skjelner mellom f.eks. Cyclosporine og metabolitter derav, f.eks. metabolittene cyklosporin 17 og cyklosporin 18 som er spesifikt beskrevet i det følgende. I tillegg har slike forsøk ført til fremstilling av monoklonale antistoffer til Cyclosporine bare av typen IgM og følgelig under enhver omstendighet hovedsakelig ubrukelige for anvendelse i noen form av vanlige, f.eks. kliniske, immunoanalyse-sett. Fremstillingen av monoklonale antistoffer med spesifikk reaktivitet med cyklosporiner og som kan skjelne mellom individuelle cyklosporiner og deres metabolitter, f.eks. mellom Cyclosporine og dets metabolitter i mennesker og egnet for bruk ved et immunoanalyse-system har således stadig vært et vesentlig mål.

I samsvar med den foreliggende oppfinnelse er det nå overraskende funnet at monoklonale antistoffer reaktive til cyklosporiner og som tilfredsstiller de forskjellige formål som er drøftet i det foregående, og som spesielt er i stand til å skjelne mellom Cyclosporine og metabolitter derav, kan fremstilles via hovedsakelig konvensjonelle immuniserings/fusjcnerings/kloning"smetoder under anvendelse av immunogene konjugater omfattende et cyklosporin som hapten ved det initiale immuniseringstrinn, hvis konjugatet fremstilles ved kobling av bærerproteinet til cyklosporinet ved hjelp av en aktivert koblingsgruppe,

ved at konjugat-syntesen gjennomføres under anvendelse av et cyklosporin med en aktivert koblings-gruppe som utgangsmaterial. Spesielt er det ved anvendelse av slike immunogene konjugater mulig å oppnå monoklonale antistoffer som er i stand til nøyaktig skjelning mellom cyklosporiner og metabolitter derav som endog bærer enkle variant-grupper på individuelle rester, f.eks. i tilfellet av Cyclosporine, som er reaktive med Cyclosporine mens de fremviser lav kryssreaktivitet med f.eks. dets metabolitter cyklosporine 17 og/eller cyklosporine 18.

I tillegg til endelig å ha tilveiebragt midlene for utvikling av passende monoklonale immunoanalyse-

systemer, f.eks. for klinisk bruk, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse således midler for den videre rensing av cyklosporin-metabolitter og det forventes da at monoklonale antistoffer vil kunne oppnås ved anvendelse av de generelle metoder i samsvar med oppfinnelsen, som kan simulere reseptor-steder, og ved karakterisering av potensielle endogene cyklosporinlignende molekyler.

Betydningen av den foreligger.de oppfinnelse fra både et praktisk og rent vitenskapelig synspunkt vil således lett sees.

Som indikert i det foregående kan immunogene

konjugater i oppfinnelsens sammenheng fremstilles ved direkte kobling av en bærer, f.eks. proteinmolekyl, med et cyklosporin ved innvirkning av en aktivert koblingsgruppe. Dette kunne gjennomføres enten ved omsetning mellom en bærer som bærer en aktivert koblingsgruppe og et cyklosporin som bærer en passende ko-reaktiv substituent, f.eks. hydroksy- eller amino-gruppe, f.eks. som i tilfellet med [Thr] 2 -Cyclosporine eller [(D)Lys] <8->Cyclosporin beskrevet i det følgende, eller ved omsetning av en bærer med et cyklosporin med en aktivert koblingsgruppe, idet en av aminosyre-restene tilstede i

cyklosporinmolekylet har en sidekjede ved a-karbonatomet som omfatter eller bærer en aktivert koblingsgruppe. De nevnte konjugater omfatter således en cyklosporin haptendel direkte knyttet til en bærerdel, i stedet for via en mellomliggende koblingsmiddel-rest, som i tilfellet med immunogene konjugater omfattende et cyklosporin som hapten som tidligere anvendt på området, f.eks. for fremstilling av vanlige polyklonale antisera.

Med betegnelsen "aktivert koblingsgruppe" som anvendt heri og i de etterfølgende patentkrav skal det forståes en hvilken spm helst gruppe som er i stand til direkte reaksjon med en passende, ko-reaktiv gruppe, f.eks. amino-gruppe, hydroksygruppe, tio-gruppe eller lignende, til å tilveiebringe en ko-valent binding, uten noe krav om bruk av et koblingsmiddel for å muliggjøre, bevirke eller fremme reaksjon. I tilfellet av cyklosporiner som bærer en "aktivert koblingsgruppe" vil dette således være en hvilken som helst gruppe som er i stand til direkte reaksjon med et bærermolekyl, f.eks. proteinmolekyl, til å gi et ko-valent bundet konjugat med bærermolekylet, uten krav om anvendelse av et koblingsmiddel for å muliggjøre, bevirke eller fremme kobling eller reaksjon med det nevnte

bærermolekyl.

Grupper som er egnet som aktiverte koblingsgrupper er vel kjent på området og inkluderer f.eks. i) aktiverte ester-eller aktiverte karboksy-grupper, dvs. med formel -CO-OZ hvori Z er en karboksy-aktiverende gruppe som o- eller p-nitrofenyl, 1-benztriazol, pentafluorfenyl eller N-succinimido, ii) aktiverte ditio-grupper, dvs. med formel -S-S-X hvori X er en ditio-aktiverende gruppe som f.eks. 2-pyridyl, og iii) epoksy-grupper.

Egnede immunogene konjugatbærer-molekyler, som bærer en aktivert koblings-gruppe, f.eks. epoksy-grupper; som nevnt i det foregående, kan fremstilles "i samsvar ned metoder kjent på området, f.eks. som beskrevet av Laurnen et al., Tetrahedron Letters, 26 (4), 407-410 (1985). I samsvar med den spesielle metode ved den foreliggende oppfinnelse skal imidlertid den aktiverte koblings-gruppe tilveiebringes på cyklosporinet som skal kobles med bæreren snarere enn vice versa.

I prinsippet kan den aktiverte koblings-gruppe være tilstede ved en hvilken som helst stilling rundt cyklosporinmolekylet. I og med at transformasjoner ved 1-stillingen er av særlig betydning ved cyklcsporin-metabolisme, eller i og med at vesentlige cyklosporin-metabolitter, f.eks. i tilfellet av Cyclosporine, cyklosporine 17 og cyklosporine 18, fremviser strukturell variasjon ved 1-stillingen som beskrevet i det følgende, foretrekkes det at den aktiverte koblingsgruppe er tilstede ved den ene eller den annen av stillingene 2 til 11 slik at resten ved 1-stillingen etterlates intakt, foretrukket 'umaskert"

av bæreren, i det immunogene konjugat som deretter oppnås, og følgelig fritt til å fremvise spesifikk antistoff-respons. Generelt er det passende hvis den aktiverte koblings-gruppe er ved 2-stillingen eller hvilke som helst av stillingene 3, 5 til 8 eller 10, spesielt 5 til 8, hvorved 2- og 8-stillingene er aktuelle ved den spesielle utførelsesform av konjugatet i henhold til oppfinnelsen.

I tilfellet av Cyclosporine er de vesentlige metc.boliske omdannelser som skjer i mennesker følgende: I Terminal hydroksylering av -MeLeu g- til å gi resten med formel E i

II Terminal hydroksylering av -MeBmt^- til å gi resten

med formel F

III Des-N-metylering av -MeLeu 4- til a gi -Leu-

IV Terminal hydroksylering av -MeLeu 4- til a gi

resten med formel E ovenfor,

V Terminal hydroksylering av -MeLeu^- til å gi

resten med formel E ovenfor,

VI Terminal hydroksylering og ringslutning i -MeBmt<1->

til å gi resten med formel G

Kjente metabolitter av Cyclosporine (identifisert som cyklosporine 1, cyklosporin 8 etc) fremviser således følqende metaboliske variasjoner.

Cyklosporin 1: I. Cyklosporin 8: I + II. Cyklosporin .9:1+ III + V. Cyklosporin. 10: I + IV. Cyklosporin 16: I + V. Cyklosporin' 17: II.

Cyklosporin 18: VI. Cyklosporin- 21: III.

(Se G. Maurer et al., "Drug Metab. Disposit" 12,

120 - 126 (1984)).

For fremstilling av monoklonale antistoffer som er i stand til å skielne mellom C<y>closporine og metabolitter derav i mennesker vil det derfor være riktig at den aktiverte koblingsgruppe i det cyklosporin som anvendes for imrnuno-gen konjugatdannelse befinner seg i en annen stilling enn 1-, 4-, 6- eller 9-stiIlingen, og i den utstrekningcyklo-sporin 17 og 18 representerer hoved-metabolitter, i det minste i en annen stilling enn 1-stillingen, og for det spesielle tilfelle av Cyclosporine er 2- og 8-stillingen spesielt fordelaktig.

Cyklosporiner med en aktivert koblingsgruppe som beskrevet i det foregående kan fremstilles f.eks. enten: i) ved aktivering av en passende forhåndseksisterende forløpergruppe (dvs. koblin<g>sgruppe i ikke-aktivert form), f.eks. omdannelse av karboksygruppen i et cyklosporin med en karboksy-substituert a-aminosyre-rest (dvs. a-aminosyre-rest med en sidekjede ved a-karbonatomet omfattende eller bærende en karboksy-gruppe), således i 2- eller 8-stillingen, til en aktivert karboksy-gruppe, ved reaksjon med et karboksy-aktiverende middel, eller

ii) ved acylering eller foretring av et cyklosporin med en amino- eller hydroksy-substituert a-aminosyre-rest (dvs. a-aminosyre-rest med en sidekjede ved a-karbonatomet omfattende eller bærende en hydroksy- eller amino-gruppe) f.eks. hydroksy-substituert a-aminosyre-rest ved 2-stillingen eller amino- eller hydroksy-substituert a-aminosyre-rest ved 8-stillingen, med et acylerende eller alkylerende middel som bærer en aktivert koblingsgruppe.

Prosess-trinn i) ovenfor kan gjennomføres i samsvar med standard metoder kjent på området, f.eks. for aktivering

av karboksy-grupper ved omsetning med et vanlig karboksy-aktiverende middel som f.eks. o- eller p-nitrofenyl,

1-hydroksy-benzitriazol, pentafluorfenol eller N-hydroksy-succinimid. Reaksjone gjennomføres på passende måte i nærvær av et kondenserende middel som f.eks. EDCI.

Prosesstrinn ii) kan også gjennomføres i samsvar med hovedsakelig konvensjonelle metoder. Således kan amino-eller hydroksy-grupper passende acyleres ved omsetning med et derivat av en karboksylsyre hvori karboksy-gruppen er aktivert og som ytterligere bærer en aktivert koblings-gruppe som er ikke-reaktiv med amino eller hydroksy i det enkelte tilfelle, f.eks. N-[(2-pyridyl)ditio-propion-1-yl]-succinimid, [(2-pyridyl)-ditio-delen tilveiebringer den aktiverte koblingsgruppe (ikke reaktiv i dette tilfelle, med både amino- og hydroksy-grupper) og -C00-succinimid-delen tilveiebringer den aktiverte karboksy-gruppe for gjennomføring av acylering]. Reaksjonen gjennomføres på passende måte i et inert løsningsmiddel eller fortynningsmiddel som diklormetan ved f.eks. vanlig temperatur. Alternativt kan hydroksygrupper foretres, f.eks. for å innføre en epoksybærende del med formel

[epoksydelen tilveiebringer den aktiverte

koblingsgruppe] under anvendelse av hvilke som helst av de forskjellige midler som er kjent på området for dette formål, som episk klorhydrin eller epibromhydrin, f.eks.

i samsvar med de generelle metoder som er beskrevet av Laumen et al., Loe. eit..

Cyklosporin-utgangsmaterialer for prosess-trinn i) ovenfor kan fremstilles analogt med prosess-trinn ii), f.eks. for fremstilling av et cyklosporin med et karboksy-substituert a-amino-syre-rest, f.eks. ved 2- eller 8-stillingen.

iii) ved reaksjon mellom et cyklosporin med en amino-eller hydroksy-substituert a-amino-syre-rest, f.eks. hydroksy-substituert a-amino-syre-rest ved 2-stillingen eller amino- eller hydroksy-substituert a-amino-syre-rest ved 8-stillingen, enten a) med en dikarboksylsyre hvori en av de tilstedeværende karboksy-grupper er i beskyttet form, eller b) med et dikarboksylsyre-anhydrid, f.eks. ravsyre-anhydrid, idet reaksjonen i tilfelle a) etterfølges av avbeskyttelse av karboksy-^gruppen i produkt-cyklosporinet.

Reaksjons-trinn iii) kan også gjennomføres ved å anvende hovedsakelig konvensjonelle prosedyrer, f.eks. i nærvær av et syre-bindende middel som f.eks. 4-dimetylaminopyridin,

i et inert organisk løsningsmiddel eller fortynningsmiddel, ved vanlig eller litt forhøyet temperatur. Når karboksy-beskyttende grupper anvendes som i variant a) kan disse være fullstendig konvensjonelle og fjernes ved fullstendig konvensjonell teknikk.

Cyklosporin-utgangsrnaterialer for prosess-trinn ii) og iii) med en hydroksy-substituert a-amino-syre-rest inkluderer de kjente cyklosporiner: [Thr] 2-Cyclosporine og [(D)Ser] g-Cyclosporine, idet det sistnevnte er omhandlet i f.eks. europeisk patentskrift nr. 0.056.782, sammen med prosesser for dets fremstilling i samsvar med de generelle metoder i total-syntese-metoden for fremstilling av cyklosporiner som det tidligere er vist til, eller ved gjæringsteknikk. Andre cyklosporiner med en hydroksy-substituert a-amino-syre-rest, f.eks. i 8-stillingen, kan fremstilles eller oppnås på analog måte og forskjellige ytterligere slike cyklosporiner inklusive [(D)Thr] g-Cyclosporine, [Nva] 2 -[(D)Ser] 9-Cyclosporine og [ Thr ] ? -[ (D)Ser] 8-Cyclosporine vil være kjent for den fagkyndige.

Foretrukne cyklosporiner med en amino-substituert a-amino-syre-rest er dem hvori den nevnte amino-syre-rest er ved 8-stillingen, idet cyklosporiner hvori resten ved 8-stillingen er -(D)Lvs- er spesielt foretrukket. Slike cyklosporiner kan også fremstilles i samsvar med de generelle metoder ved den total-syntetiske metode for fremstilling av cyklosporiner utviklet av f.eks. R. Wenger.

iv) ved avbeskyttelse av et cyklosporin med en amino-substituert a-amino-syre-rest ved 8-stillingen idet cyklosporinet er i beskyttet form, f.eks. ved avbeskyttelse av et cyklosporin hvori resten ved 8-stillingen er -(D)Lys- i N-e-beskyttet form, eller

v) ved ringslutning av et rettkjedet uncekapeptid med sekvensen til produkt-cyklosporinet, idet undekapeptidet er i fri eller beskyttet form, f.eks. undekapeptidet omfattende en -(D)Lys-rest i fri eller N-e-beskyttet form ved stillingen tilsvarende 8-stillingen av produkt-cyklosporinet, og om nødvendig gjennomføring av prosess-trinn iv).

Prosess-trinnene iv) og v) kan spesielt gjennomføres i samsvar med den generelle prosedyre illustrert i det følgende i eksempel 1,

Som det vil sees fra beskrivelsen av prosess-trinnene i), ii) og iii) ovenfor, vil produktene fra trinn i) eller ii) generelt omfatte cyklosporiner med en ecylamino-, acyloksy- eller alkoksy-substituert a-amino-syre-rest (dvs. a-amino-syre-rest med en sidekjede ved a-karbonatomet omfattende eller bærende en acylamino-, acyloksy- eller alkoksy-gruppe), f.eks. cyklosporin med en acyloksy-eller alkoksy-substituert a-amino-syre-rest ved 2-stillingen eller acylamino-, acyloksy, eller alkoksy-substituert a-amino-syre-rest ved 8-stillingen, hvori den aktiverte koblings-gruppe er tilstede på acyl/alkyl-delen.

Dette kan lettere innsees ved henvisning til de etter-følgende réaksjonsskjemaer som illustrerer fremstilling av spesielle grupper av cyklosporiner i samsvar med de generelle metoder i prosess-trinnene i) til v) ovenfor:

I de følgende formler Ia til Id, Ila til Ild og III,

C representerer sekvensen -Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala, og

3 4 5 6 7

E representerer sekvensen '-MeLeu-MeLeu-MeVal-.

9 10 11

Reaksionstrinn i)

hvori

A<1> = -MeBmt-,

B 3.. = -(O-acyl)-Thr- hvori acyl-delen bærer en koblings-gruppe i ikke-aktivert form, f.eks. en fri karboksy-gruppe, f.eks. -(O-hydroksy-succinyl)-Thr-, og

D<1> = - (D)Ala-:

Aktivering, f.eks. ved omsetning med et karboksy-aktiverende middel passende i nærvær av et koblingsmiddel som f.eks. EDCI:

hvori

A"*" og D^" har de betydninger som er gitt i det

foregående, og

B^ = -(O-acvl)-Thr- hvori acyl-delen bærer en aktivert koblincs-aruppe, f.eks. en aktivert karboksy-gruppe, f.eks.

-(O-acyl)-Thr- hvori acyl-delen har formel ZO-CO-(CH2)2_co hvori Z er en karboksy-beskyttende gruppe.

hvori

2 2

A = -MeBmt- og B = -aAbu- eller -Nva-, eller

2 2

A = -dihydro-MeBmt-, oa B = -Val- oa

D a.<2>= en ac<y>lamino-substituert (D)a-amino-syre-rest, f.eks. - (N-c-acy1)-(D)Lys-, hvori acyl-delen bærer en koblings-gruppe i ikke-aktivert form, f.eks. en fri karboksy-gruppe, f.eks. - fN-c-hydroksy-succinyl)-(D)Lys-:

Aktivering, f.eks. ved omsetning med et karboksy-aktiverende middel, f.eks. N-hydroksy-succinimid, passende i nærvær av et koblingsmiddel som f.eks. ECDI:

hvori

2 2

A og B har de ovenfor angitte betydning og

<2> = en acylamino-substituert (D)a-amino-syre-rest, -(N-e-acyl)-(D)Lys-, hvori acyl-delen bærer en aktivert koblings-gruppe, f.eks. en aktivert karboksy-qruppe, f.eks. -(N-e-acyl)-(D)Lys-hvori acyl-delen har formel ZO-CO-(CH2)2-CO_ hvori Z har den ovenfor angitte betydning.

Reaksionstrinn ii)

hvori

A^" og D^" har de betydninger som er gitt i det

foregående, og

B=<3> = -Thr-:

Q-alkylering for innføring av en alkyl-del som bærer en aktivert koblings-gruppe, f.eks. \y epoksy-gruppe, f.eks. ved reaksjon med en epiklorhydrin eller epibrom-hydrin:

hvori

A^ og D har de ovenfor angitte betydning, og B^<3> = -(O-alkyl)-Thr- hvori alkyl-delen bærer en aktivert koblings-gruppe, f.eks. en epoksy-gruppe, f.eks. -(O-epoksymetyl)-Thr.

hvori

A<2> og B<2> har de ovenfor angitte betydning og

D ^ = en amino-substituert (D)a-amino-syre-rest,

og f.eks. -(D)Lys-:

N-e-acylering under anvendelse av et acyleringsmiddel som bærer en aktiverende koblings-gruppe som er ikke-reaktiv med -NP^, f.eks. et acyleringsmiddel med formel ZO-CO-(CH2)2_Y hvori Z har den ovenfor angitte betydning og Y er en aktivert koblings-gruppe som er ikke-reaktiv med -NF^, f.eks. en 2-pyridyl-ditio-gruppe : 2 2 hvori A og B har de ovenfor angitte betydninger, og Dtø^ = en acylamino-substituert (D)a-amino-syre-rest. f.eks. - (N-e-acyl) - (D) Lys-. hvori acyl-delen bærer en aktivert koblings-rest. f.eks. -[N-e-(3-(2-Dyridy1)ditio-propion-l-yl) ]-(D)-Lys-.

Reak sions- trinn iii)

a) Et cyklosporin med formel Ic som definert i det foregående: J Acylering, f.eks. ved reaksjon med ravsyre-^ anhydrid: Et cyklosporin med formel Ia som definert i det foregående. b) Et cyklosporin med formel Id som definert i det foregående: I Acylering, f.eks. ved reaksjon med ravsyre-* anhydrid: Et cyklosporin med formel Ib som definert i det foregående.

Reaksions- trinn iv)

hvori

2 2

A og B har de ovenfor angitte betydninger og

D a<4>= en amino-substituert (D)a-amino-syre-rest,

f.eks. -(D)Lys-, i beskyttet form:

^ Avbeskyttelse:

Et cyklosporin med formel Id som definert i det foregående.

Reaksions- trinn v)

hvori

2 2

A og B har de ovenfor angitte betydninger og

D a ^ = en amino-substituert (D)a-amino-sy 1re-rest f.eks. (D)Lys-, i fri eller

-N-£-beskyttet form:

I Ringslutning i samsvar med metoden til

R. Wenger:

Et cyklosporin med formel Id eller en le som definert i det foregående.

Det kan på dette punkt bemerkes at hydroksy-gruppen ved 3'-stiIlingen i -MeBmt- og -dihydro-MeBmt- har forholdsvis lav reaktivitet. Hvor således prosesser beskrevet i det foregående innbefatter reaksjon av cyklosporiner med en hydroksy-substituert a-amino-syre-rest ved hvilke som helst av stillingene 2 til 11, f.eks. -Thr- i 2-stillingen vil reaksjonen med hydroksy-gruppen i resten foretrukket være reaksjon med hydroksy-gruppen i -MeBmt- eller dihydro-MeBmt-, slik at uønsket side-reaksjon med den sistnevnte lett kan unngås.

I formler Ib, Ilb, Id, Ild, le og III ovenfor representerer

2 2

A og B , foretrukket henhv. -MeBmt- og -aAbu-,

I hele den foregående beskrivelse, når cyklosporiner omtales med en spesifikk rest vec 8-stillingen, mer. hvor konfigurasjonen av resten ikke er angitt, foretrekkes (D/-konfigurasj onen.

Cyklosporiner med en aktivert koblings-gruppe beskrevet

i det foregående såvel som cyklosporiner med er. amino-substituert a-amino-syre-rest ved 8-stillingen hvori amino-substituenten er i fri eller beskyttet form, eller er derivatdannet på annen måte, f.eks. acylert, er nye forbindelser og kan omfatte: 1.1 Et cyklosporin med en a-amino-syre-rest som. bærer

en aktivert koblings-gruppe.

1.2 Et cyklosporin i henhold til 1.1 hvori den nevnte a-amino-syre-rest er tilstede ved en av stillingene 2 til 11.

1.3 Et cyklosporin i henhold til 1.2 hvori a-amino-syre-resten omfatter en acylamino-, acyloksy- eller alkoksy-substituert a-amino-syre-rest hvori den aktiverte koblings-gruppe er tilstede på acylamino-, acyloksy- eller alkoksy-substituenten.

1.4 Et cyklosporin i samsvar med hvilken som helst av 1.1 til 1.3 hvori den aktiverte koblings-gruppe er en aktivert ester-gruppe, aktivert ditio-gruppe ell^r epoksy-gruppe.

1.5 Et cyklosporin i samsvar med 1.3 hvori den nevnte a-amino-syre-rest omfatter: en acylamino-substituert a-amino-syre-rest, hvori acylamino-substituenten er substituert i sin acyldel med en aktivert karboksy-gruppe eller aktivert ditio-gruppe; en acyloksy-substituert -amino-syre-rest, hvori acyloksy-substituenten er substituert i acyldelen derav med en aktivert karboksy-gruppe; eller en alkoksy-substituert a-amino-syre-rest, hvori alkoksy-substituenten er substituert med en epoksy-gruppe.

1.6 Et cyklosporin i samsvar med hvilke som helst av

1.3 til 1.5 hvori den nevnte a-amino-syre-rest er en (O-acyl)-treonyl-rest ved 2-stillingen.

1.7 Et cyklosporin i samsvar med 1.6 hvori acyldelen

har formel ZO-CO-CH2-CH2-CO- hvori Z er en karboksy-aktiverende gruppe.

1.8 Et cyklosporin i samsvar med 1.2 hvori den nevnte a-amino-syre-rest er tilstede ved 5-, 6-, 7- eller 8-stillingen.

1.9 Et cyklosporin i samsvar med 1.8 hvori den nevnte a-amino-syre-rest er en (D) of-amino-syre-res t i 8-stillingen.

1.10 Et cyklosporin i samsvar med 1.9 hvori den nevnte a-amino-syre-rest er en acylamino-substituert (D) a-amino-syre-rest hvori den aktiverte koblings-gruppe er tilstede på acylamino-substituenten.

1.11 Et cyklosporin i samsvar med 1.10 hvori den aktiverte koblings-gruppe er en aktivert karboksy-gruppe eller aktivert ditio-gruppe.

1.12 Et cyklosporin med en amino-substituert (D)a-amino-syre-rest ved 8-stillingen, idet amino-substituenten er i fri eller beskyttet form.

1.13 Et cyklosporin med en acylamino-substituert (D)a-amino-syre-rest ved 8-stillingen, hvori acylamino-substituenten er substituert i acyldelen derav med en fri karboksy-gruppe.

1.14 Et cyklosporin i samsvar med 1.10 til 1.13 med

formel

hvori X er hydrogen, en amino-beskyttende gruppe eller en en acyl-gruppe substituert med en fri karboksy-gruppe eller en aktivert koblingsgruppe, f.eks. en aktivert karboksy-gruppe eller ditio-gruppe, f.eks. en acyl-gruppe med formel

hvori Y er karboksy, en aktivert karboksy-gruppe eller

en aktivert ditio-gruppe.

1.15 Et cyklosporin med formel Ila, Ib, Ilb, lic, Id,

Ild eller le som definert i det foregående.

Som drøftet i det foregående er det i sammenheng med oppfinnelsen nå overraskende funnet at

immunogene konjugater omfattende en bærer og et cyklosporin koblet ved hjelp av en aktivert koblings-gruppe, og oppnådd ved anvendelse av cyklosporiner med en aktivert koblings-gruppe som beskrevet ovenfor, f.eks. som

definert under 1.1 til 1.11, 1.14 eller 1.15, for første gang muliggjort fremstilling av monoklonale antistoffer som er i stand til å skjelne mellom cyklosporiner og metabolitter derav. Immunogene konjugater omfattende reaksjonsprodukter av slike cyklosporiner som nevnt som hapten-komponent er således i stand til å utløse en antistoff-respons i dyr som tilføres, f.eks. inokkuleres dermed, slik at antistoff-produserende celler, f.eks. miltceller eller lymfeknuteceller, som deretter kan

fjernes derfra kan anvendes for fremstilling av hybridom-linjer som tilveiebringer monoklonale antistoffer som er i stand til å skjelne mellom terapeutisk tilførte cyklosporiner, f.eks. Cyclosporine, og metabolitter derav, spesielt metaboli-tter derav i mennesker, f. eks. cyklosporin 17 og cyklosporin 18. Disse antigene konjugater er hittil ukjent og omfatter:

2.1 Et immunogent konjugat omfattende en bærer koblet

til et cyklosporin ved hjelp av en aktivert koblings-gruppe, f.eks. omfattende en bærer koblet til et cyklosporin med en a-amino-syre-rest som bærer en aktivert koblings-gruppe, f.eks. som beskrevet i det foregående, spesielt et cyklosporin som tidligere definert under hvilke som helst av punktene 1.1 til 1.11, 1.14 eller 1.15 (formler Ila, Ilb, Ile eller Ild) ovenfor.

2.2 Et immunogent konjugat oppnådd eller som kan oppnås ved kobling av et cyklosporin med en a-amino-syre-rest som bærer en aktivert koblings-gruppe, f.eks. som beskrevet i det foregående, spesielt et cyklosporin som tidligere definert under hvilke som helst av punktene 1.1 til 1.11, 1.14 eller 1.15 (formler (Ila, Ilb, lic eller Ild) ovenfor.

2.3 Et immunogent konjugat, f.eks. som definert under 2.1

e'ller 2.2, som kan anvendes ved fremstilling av et monoklonalt antistoff som kan skjelne mellom et cyklosporin og en metabolitt derav, f.eks. et monoklonalt antistoff som beskrevet i det følgende, og spesielt som definert i det følgende under hvilke som helst av punktene 3.1 til 3.10 i det følgende.

Egnede bærere for de immunogene konjugater som er nevnt "i det foregående inkluderer hvilke som helst av de bærere

som er kjent og vanlig anvendt på området, spesielt

polypeptider med høy molekylvekt, spesielt proteiner som serumalbuminer, f.eks. bovint serumulbumin og hønse-ovalbumin, immunoglobuliner, spesielt av klassen IgG som f.eks. hønse- eller marsvin-IgG og syntetiske polymerer som f.eks. polyglutaminsyre.

En fremgangsmåte for fremstilling av et immunogent konjugat som definert i det foregående vil kunne omfatte: vi) Kobling av en bærer, f.eks. som beskrevet i det foregående, som bærer en aktivert koblings-gruppe med et cyklosporin med en a-amino-syre-rest som bærer en passende ko-reaktiv, f.eks. hydroksy-

eller amino-gruppe, f.eks. med [Thr] 2-Cyclosporine eller [(D)Lys] g-Cyclosporine, eller kobling av en bærer, f.eks. som beskrevet i det foregående, med et cyklosporin med en a-amino-syre-rest som bærer en aktivert koblings-gruppe, f.eks. som beskrevet i det foregående, spesielt et cyklosporin som definert i det foregående under hvilke som helst av punktene 1.1 til 1.11, 1.14 eller 1.15 (formler Ila, Hb,

lic eller Ild) ovenfor.

Det ovennevnte prosess-trinn gjennomføres ved direkte omsetning mellom cyklosporin-komponenten, dvs. uten bruk av et koblingsmiddel. Reaksjonen gjennomføres passende ved tilsetning av cyklosporin-komponenten oppløst i et passende inert fortynningsmiddel eller bærer som f.eks. dimetylformamid til et bufret preparat av bæreren, f.eks. bærer-protein, f.eks. en oppløsning eller suspensjon i bikarbonat-buffer, ved vanlig temperatur. Det oppnådde immunogene konjugat renses passende ved dialyse, f.eks. mot fosfat-bufret saltløsning.

De ovenfor beskrevne immunogene konjugater, f.eks. som definert under 2.1 til 2.3, kan anvendes for fremstilling av monoklonale antistoffer ved hovedsakelig standard metoder, f.eks. via en trinnvis prosedyre omfattende: a) tilførsel av et immunogent konjugat, f.eks. som definert under hvilke som helst av 2.1 til 2.3 ovenfor,

til en passende dyrespecies; b) utvinning av antistoff-produserende, f.eks. miltcel-ler eller lymf eknuteceller sensibilisert til det immunogene konjugat; c) immortalisering av isolerte celler, f.eks. ved fusjon med en passende myelon-cellelinjer for fremstilling av hybridom-cellelinjer; og d) selektering av en immortalisert celle, f.eks. hybridom-linje, som frembringer de ønskede monoklonale antistoffer.

Trinn a) gjennomføres på passende måte under anvendelse av rotter eller mus, f. eks. (j) Balb/c mus som recipient, og tilførsel av det immunogene konjugat ved s.c. eller i.p. injeksjon i en mengde på fra ca. 50 til 200, f.eks. ca.

100 pg etterfulgt av booster-injeksjoner, i.p., s.c.

eller i.m., 14 til 21 døgn senere. Mus som viser høy-titrerte antisera med passende isotype-fordeling, f.eks. som bestemt ved regulær RIA og/eller ELISA teknikk, gis ytterligere booster-injeksjoner, f.eks. i samsvar med de spesifikke prosedyrer beskrevet i det følgende i eksempel 9, og antistoff-produserende, celler, f.eks. miltceller samles (trinn b). Trinn c) kan gjennomføres i samsvar med hvilke som helst av de metoder som praktiseres på området, f.eks. under anvendelse av metoden beskrevet av S. Fazekas et al., "J. Immunol. Methods" 35, 1-32 (1980), idet en foretrukket myelon-linje er en muselinje (Balb/C). I trinn d) blir voksende myelon-linjer underkastet screening for ant.istoff-produksjon mot et cyklosporin, f.eks. i et regulært RIA-system under anvendelse av et radiomerket derivat derav eller i et regulært ELISA-system, f.eks.

som beskrevet i det følgende i eksempel 9.

Ved anvendelse av de ovennevnte prosedyrer under anvendelse av de spesielle immunogene konjugater som omhandlet i det foregående, er ået mulig å oppnå monoklonale antistoffer som fremviser en grad av spesifisitet slik at de er i stand til å skjelne mellom individuelle cyklosporiner som er forskjellig fra hverandre med bare små strukturelle elementer, f.eks. nærvær av en enkel hydroksy-gruppe i stedet for et hydrogenatom. Mer viktig muliggjør den foreliggende oppfinnelse for første gang at det kan oppnås monoklonale antistoffer som er i stand til å skjelne mellom cyklosporiner, f.eks. Cyclosporine og metabolitter derav, i spesielle metabolitter derav i mennesker. Monoklonale antistoffer som kan oppnås i samsvar med fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er således funnet å være reaktive med cyklosporiner, f.eks. Cyclosporine, mens de fremviser forholdsvis liten kryss-reaktivitet med metabolitter derav. Videre muliggjør den foreliggende oppfinnelse ved anvendelsen av immunogene konjugater i samsvar med oppfinnelsen, som f.eks. definert under 2.1 til 2.3 ovenfor, hvori cyklosporin-hapten-komponenten tilsvarer et selektert "mål" -cyklosporin, oppnåelse av monoklonale antistoffer som er i stand til å skjelne mellom "mål" -cyklosporin og strukturelt nær beslektede metabolitter derav, f.eks. humane metabolitter. Ved således å gå ut fra immunogene konjugater oppnådd ved kobling av en bærer med et cyklosporin med en aktivert koblings-gruppe ved 2-stillingen, f.eks. som definert under 1.6 ovenfor, og hvori a-amino-syre-restene ved de resterende stillinger 1 og 3 til 11 er de samme som i Cyclosporine, er det mulig å fremstille monoklonale antistoffer reaktive med Cyclosporine som "mål"-cyklosporin foretrukket fremfor metabolitter derav i mennesker, f.eks. cyklosporiner 1, 8, 9, 10, 16, 17, 18 og/eller <x>21, spesielt 17 og/eller 18 og spesielt 17. Tilsvarende, ved å gå ut fra immunogene konjugater oppnådd ved kobling av en bærer med et cyklosporin med en aktivert koblings-gruppe ved 5-, 6-, 7- eller 8-stillingen, f.eks. som definert under 1.8 i det foregående, spesielt i 8-stillingen, f.eks. som definert under hvilke som helst av 1.9, 1.11, 1.14 eller 1.15 (formler Ilb eller Ild) ovenfor, og hvori restene i de resterende stillinger, f.eks. 1 til 7 og 9 til 11, tilsvarer restene i Cyclosporine, dihydro-[Val] 2 -Cyclosporine eller [Nva] 2-Cyclosporine,

kan monoklonale antistoffer fremstilles og som er reaktive med Cyclosporine, dihydro-[Val] 2-Cyclosporine eller

[Mva] 2 -Cyclosporine som "måo<l>" -cyclosporin, foretrukket fremfor metabolitter derav, f.eks. metabolitter derav i mennesker, slik som dem som er angitt umiddelbart i foregående i tilfellet med Cyclosporine.

Monoklonale antistoffer som kan oppnås i sammenheng den foreliggende oppfinnelse er spesielt

i stand til å skjelne mellom "mål" -cyklosporiner og metabolitter derav som fremviser strukturell transformasjon ved a-amino-syre-resten ved 1-stillingen, f.eks. metabolitter som er forskjellig fra det ikke-metaboliserte cyklosporin hvorfra de er avledet ved substitusjonen eller annen kjemisk modifisering av -MeBmt- eller dihydro-MeBmt-resten ved 1-stillingen, og som spesielt fremviser strukturell transformasjon ved en terminal posisjon i resten ved 1-stillingen, f.eks. omfattende hydroksylering av den terminale (C 9)-MeBmt-metyl-gruppe, som i tilfellet med monoklonale antistoffer beskrevet i det medfølgende eksempel 9, som er reaktive med cyklosporin, mens de har forholdsvis lav kryss-reaktivitet med dets metabolitt cyklosporin' 17. I og med at slik metabolisk transformasjon av Cyclosporine er av spesiell betydning, f.eks. som karakteristisk for hoved-metabolitter i mennesker, som i tilfellet med cyklosporiner 17 og 18, er evnen til monoklonale antistoffer som kan oppnås i samsvar med fremgangsmåtene i henhold til oppfinnelsen til å skjelne mellom cyklosporiner og metabolitter derav og som undergår slik transformasjon spesielt bemerkelsesverdig.

Kryss-reaktivitet med metabolitter, f.eks. som beskrevet i det foregående, er foretrukket ca. 5% eller mindre, mer foretrukket ca. 3% eller mindre, mer foretrukket ca. 2% eller mindre, av reaktiviteten med det ikke-metaboliserte cyklosporin, f.eks. som målt ved RIA eller ELISA, f.eks. teknikken med konkurrerende ELISA, under passende anvendelse av en buffer, f.eks. med ca. pH 6 til 8, spesielt 7 til 8, og som passende også inneholder en mindre mengde f.eks. 0,01 til 0,1%, f.eks. 0,01 til 0,05% av et ikke-ionisk overflate-aktivt middel eller tensid som f.eks.

"Tween", f.eks. fosfat-bufret saltløsning med pH 7,5 og inneholdende 0,03% overflateaktivt middel, f.eks.

"Tween 20". F.eks. fremviser monoklonale antistoffer som kan oppnås i samsvar med fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen og som er reaktive med cyklosporin en distinksjon i IC^Q-forhold for cyklosporin 17 i sammenligning med Cyclosporine, målt ved hjelp av konkurrerende ELISA-teknikk under betingelser angitt i det foregående av størrelsesorden 35 ganger eller mer.

Monoklonale antistoffer som kan oppnås i sammenheng

med den foreliggende oppfinnelse er også

karakterisert ved høy affinitet for "mål" -cyklosporiner, f.eks. Cyclosporine. Foretrukne monoklonale antistoffer i samsvar med oppfinnelsen vil således fremvise en affinitets-konstant (likevekts-dissosiasjons-konstant)

i forhold til "mål" -cyklosporinet, f.eks. Cyclosporine,

_9

av størrelsesorden 10 mol/L eller mindre, foretrukket

-10 10 mol/L eller mindre, f.eks. ved normale RIA-temperaturer (ca. 4 til 37°C) som bestemt ved standard metoder, f.eks. i samsvar med metoden beskrevet av Muller et al., Methods in Enzymology, 92, 589-601 (1983).

Den foreliggende oppfinnelse tillater videre lett oppnåelse av monoklonale antistoffer av klasse IgG, f.eks. av underklassen IgG^. I og med at slike antistoffer er spesielt egnet for bruk i diagnose/immunoanalyse-

sett, f.eks. som beskrevet i det følgende, er disse foretrukket.

Monoklonale antistoffer som beskrevet i det foregående, såvel som hybridom-cellelinjer som fremstiller dem er helt nye og vil som det vil sees fra den foregående beskrivelse av deres generelle og spesifikke egenskaper, være vel egnet for bruk i diagnose/immunoanalyse-sett systemer, f.eks. for overvåkning av cyklosporin-medisin-plasma-blodnivåer i pasienter som får cyklosporin-terapi. Den foreliggende oppfinnelse kan således sies å vedrøre følgende aspekter: 3.1 Et monoklonalt antistoff som er i stand til å skjelne mellom et cyklosporin, f.eks. et forut bestemt cyklosporin, og en metabolitt derav, spesielt i det minste en metabolitt derav i mennesker, spesielt i det minste en hoved-metabolitt derav i mennesker.

3.2 Et monoklonalt antistoff i henhold til 3.1 som er reaktivt med et cyklosporin, f.eks. et forut bestemt cyklosporin, og som fremviser forholdsvis lav kryss-reaktivitet med en metabolitt derav, spesielt i det minste en metabolitt derav i mennesker, spesielt i det minste en hoved-metabolitt derav i mennesker.

3.3 Et monoklonalt antistoff i henhold til 3.1 eller

3.2 hvori cyklosporinet er Cyclosporine, dihydro-[Val] 2 -Cyclosporine eller [Nva] 2-Cyclosporine, spesielt Cyclosporine.

3.4 Et monoklonalt antistoff i henhold til hvilke som helst av 3.1 til 3.3 hvori metabolitten er en metabolitt som fremviser strukturell transformasjon av a-amino-syre-resten ved 1-stillingen, spesielt ved en terminal posisjon på resten ved 1-stillingen, f.eks. som fremviser terminal hydroksylering ved a-amino-syre-resten -MeBmt- ved 1-stillingen.

3.5 Et monoklonalt antistoff i henhold til 3.4 hvori cyklosporinet er Cyclosporine og metabolitten er cyklosporin 1, 8, 9, 10, 16, 17, 18, eller 21, spesielt cyklosporin 17 eller 18, mest spesielt cyklosporin 17.

3.6 Et monoklonalt antistoff i henhold til hvilke som helst av 3.2 til 3.5 hvori kryss-reaktiviteten med metabolitten er av størrelsesorden ca. 5% eller mindre, foretrukket 3% eller mindre, mer foretrukket 2% eller mindre, f.eks. som målt ved hjelp av RIA eller ELISA-teknikk, f.eks. under betingelser som tidligere angitt.

3.7 Et monoklonalt antistoff i henhold til hvilke som helst av 3.1 til 3.6 hvori affinitets-konstanten overfor (forut bestemt) cyklosporin, f.eks.

_9 Cyclosporine, er av størrelsesorden 10 mol/liter eller mindre, foretrukket IO<-*0> mol/liter eller

mindre, f.eks. som målt under betingelser som tidligere angitt.

3.8 Et monoklonalt antistoff i henhold til hvilke som

helst av 3.1 til 3.7 av klassen IgG.

3.9 Et monoklonalt antistoff, f.eks. i henhold til hvilke som helst av 3.1 til 3.8 oppnådd eller som kan oppnås ved: a) kobling av et cyklosporin med en a-amino-syre-rest som bærer en aktivert koblings-gruppe,

f.eks. som beskrevet i det foregående, spesielt som definert i det foregående under hvilke som helst av 1.1 til I. 11, 1.14 eller 1.15 (formler Ila, Ilb, lic eller Ild) ovenfor, til en bærer for å oppnå et immunogent konjugat;

b) tilførsel av det nevnte immunogene konjugat til en passende dyre-species for å bevirke immunogen

utfordring, og utvinning av antistoff-produserende celler som er sensitivert overfor det nevnte konj ugat ;

c) immortalisering av de nevnte antistoff-produserende celler, f.eks. ved fusjonering med en passende

myelom-cellelinje, og

d) utvinning av monoklonalt antistoff fra en selektert immortalisert cellelinje, f.eks. hydridom-cellelinje, etablert på denne måte. 3.10 Et monoklonalt antistoff, f.eks. i samsvar med hvilke som helst av 3.1 til ?.. 8 oppnådd eller som kan oppnås ved: a) utvinning av antistoff-produserende celler sensitivert til et immunogent konjugat i henhold

til hvilke som helst av 2.1 til 2.3 ovenfor;

b) immortalisering av de nevnte antistoff-produserende celler, f.eks. ved fusjonering med en passende

myelom-cellelinje, og

c) utvinning av det ønskede monoklonale antistoff fra en selektert immortalisert cellelinje, f.eks.

hybridom-cellelinje etablert på denne måte.

4.1 En hybridom-ce1lelinje som frembringer et monoklonalt antistoff i henhold til hvilke som helst av 3.1 til 3.8 ovenfor.

4.2 En hybridom-cellelinje oppnådd eller som kan oppnås

i samsvar med trinnene a) til c) av 3.9 ovenfor eller trinnene a) og b) i 3.10 ovenfor.

Som det vil sees kan monoklonale antistoffer i samsvar med oppfinnelsen skjelne mellom et hvilket som helst gitt cyklosporin, f.eks. Cyclosporine, og et flertall av dets metabolitter, f.eks. fremvise lav kryss-reaktivitet i forhold' til fler enn en av dets metabolitter.

I tillegg til det foregående vedrører den

foreliggende oppfinnelse også:

vii) En fremgangsmåte for fremstilling av et monoklonalt antistoff som tidligere angitt 3.1 til 3.8 ovenfor, idet metoden omfatter dyrking av en hybridom-cellelinje som frembringer et slikt antistoff og utvinning av det således produserte antistoff, og mer perifert kan det i

oppfinnelsens sammenheng menes m.

viii) Fremgangsmåte for fremstilling av en hybridom-cellelinje som produserer et monoklonalt antistoff som angitt under hvilke som helst av 3.1 til 3.8 ovenfor, idet fremgangsmåten omfatter immortalisering av en antistoff-produserende celle, f.eks. miltcelle eller lymfeknutecelle som frembringer dette antistoff, f.eks. ved fusjonering med en passende myelom-cellelinj e.

De ovennevnte prosess-trinn kan gjennomføres i samsvar med nå standard - metoder, f.eks. som beskrevet i det foregående, eller som beskrevet i de medfølgende eksempler, idet foretrukne myelom-cellelinjer for anvendelse i prosess viii) er en muse (Balb/C) myelom-cellelinje.

I samsvar med enda en aspekt ved den foreliggende oppfinnelse er det overraskende funnet at cyklosporiner med en - (D)Lys-rest ved 8-stillingen, dvs. som definert under 1.14 eller 1.15 (formel Id) i det foregående, såvel som derivater hvori N-e-atomet derav er ytterligere derivatisert, fremviser f.eks. celle-bindings-egenskaper som er parallelle med dem av det tilsvarende "opphavs"-cyklosporin (f.eks. det tilsvarende cyklosporin med -(D)Ala- ved 8-stillingen) i en overraskende og bemerkelsesverdig grad. Dette funn er av spesiell betydning ettersom N-e-nitrogen-atomet i -(D)Lys-tilveiebringer en ideell posisjon hvor merking kan gjennom-føres, f.eks. hvor merkings- eller sporings-grupper kan innføres. Slike merkede cyklosporiner tilveiebringer et ytterligere nøkkelverktøy for studium av mekanismen av virkningen av "opphavs"-cyklosporiner (f.eks. i tilfellet av [(D)LysJ 8-Cyclosporine av Cyclosporine) og/eller for identifisering av bindingssteder av "opphavs"-cyklosporin, f.eks. i in vitro vevsdyrkings-preparater. Således er radioaktivt merkede derivater, f. eks. 125^. merkede derivater, nyttige for hurtig autoradiografering av vev, f.eks. i nyre-mikroautoradiografering.

I tillegg tilveiebringer merkede, f.eks. radioaktivt

eller fluorescerende merkede derivater som kan oppnås fra cyklosporiner med en -(D)Lys-rest ved 8-stillingen ideelle komponenter for bruk f.eks.- i RIA og FIA-diagnostiserings-sett. [(D)Lys] -cyklosporiner tilveiebringer således et middel for lett oppnåelse av merkede analoger av "opphavs "-cyklosporiner med ekvivalente bindingsegenskaper, f.eks. i forhold til monoklonale antistoffer til "opphavs"-cyklosporinet, f.eks. som oppnådd som definert i det foregående, og følgelig eminent nyttige som komponent eller ko-komponent i diagnostiser/immunoanalyse-sett.

Følgelig kan det i oppfinnelsens sammeheng tilveiebringes:

5.1 Et merket derivat av et cyklosporin hvori resten

ved 8-stillingen er -(D)Lys-, spesielt

5.2 Et merket derivat av et cyklosporin med formel Id

som definert i det foregående.

Med betegnelsen "merket derivat" som anvendt heri menes et derivat med et spor- eller markør-atom eller gruppe,

f.eks. som muliggjør eller letter kvantitativ immunoanalyse • eller lokalisering av det nevnte derivat.

Slike derivater inkluderer derivater, f.eks. hvori et

eller flere atomer i -(D)Lys-resten funksjonerer som et spor-eller markør-atom, f.eks. radioaktivt atom, såvel som derivater hvori en spor- eller markør-gruppe er knyttet til N-e-atomet i -(D)Lys-resten enten ved direkte binding av

spor- eller markør-gruppen til det nevnte N-e-atom eller ved binding av spor- eller markør-gruppen til det nevnte N-e- atom via en mellomliggende bindings-del. Eksempler på merkede derivater inkluderer radioaktivt merkede derivater, fluorescerende og kjemiluminescerende derivater og derivater egnet for foto-affinitetsmerking, dvs. forsynt med en substituent som vil reagere med et protein hvortil cyklosporinet bindes ved belysning. Radioaktivt merkede derivater som nevnt i det foregående inkluderer derivater

hvori N-e-atomet i -(D)Lys-resten ved 8-stillingen knytter seg til f.eks. en 125^ merket p-OH-fenyl-propionyl-rest. Fluorescerende og kjemi 1 uminescerende derivater som nevnt inkluderer derivater hvori N- -atomet i -(D)Lys-resten ved 8-stillingen knytter seg til en fluorescerende gruppe, som f.eks. en dansyl eller rhodamin-gruppe, eller en kjemiluminescerende gruppe som f.eks. en akridinium ester-gruppe, f.eks. som beskrevet i Clin. Chem. 29, 8

sidene 1474-1479 (1983). En spesiell gruppe av cyklosporiner som definert under 5.1 og 5.2 ovenfor er følgelig

5.3 dem hvori resten ved 8-stillingen er en rest med formel

hvori Q er eller omfatter en spor- eller markør-gruppe, spesielt en radioaktivt merket, fluorescerende eller kjemiluminescerende gruppe, f.eks. som spesifikt beskrevet i det foregående.

Merkede derivater som nevnt i det foregående kan fremstilles analogt med prosess-trinnene iv) og v)

ovenfor, f.eks. ved å anvende utgangsmaterialer hvori

-(D)Lys-resten ved 8-stillingen er forhåndsmerket. Alternativt kan de fremstilles ved innføring av en

passende merkings-substituent, f.eks. ved N-e-atomet i

-(D)Lys-resten ved 8-stillingen. Således kan fluorescerende

merkede derivater fremstilles ved kobling av en fluorescerende del til N-e-atomet, f.eks. ved N-e-dansylering. Lignende radioaktivt merkede derivater kan fremstilles ved kobling av en radioaktivt merket substituent, f.eks.

125 merket p-OH-fenyl-propionyl, til N-e-atomet. I det siste tilfelle kan substituenten være enten i merket form før innføringen eller kan merkes etter innføringen. F.eks. kan N-e-atomet i lysin-resten i 8-stillingen enten omsettes direkte med 125 merket p-OH-fenyl-propionsyre eller med umerket p-OH-fenyl-propionsyre og det oppnådde N-e-amid kan deretter merkes i p-OH-fenyl-delen med 125^. Kobling kan gjennomføres i samsvar med standard metoder kjent på området, f.eks. ved omsetning med p-OH-fenyl-propionsyre (merket eller umerket) i form av sin N-hydroksy-succinimid-ester.

125^ merket p-OH-fenyl-propionsyre kan i seg selv fremstilles ved hjelp av kloramin T-metoden (Hunter og Greenwood, Nature. 194, 495 (1962)). Når merking gjennom-føres etter koblingen kan denne gjennomføres ved å anvende kloramin T-metoden eller jodogen-metoden (Good, J.Clin.-Chem.Clin.Biochem., 19, 1051 (1981)). Derivater av cyklosporinene i samsvar■med oppfinnelsen som kan underkastes merking, f.eks. som beskrevet i det foregående, f.eks. derivater hvori N-e-atomet i -(D)Lys- ved 8-stillingen er substituert med en gruppe, som f.eks.

p-OH-fenyl-propionyl, som kan underkastes 125. , , er

* jodermg umiddelbare forløpere for de merkede derivater i samsvar med oppfinnelsen og skal også ansees å være innenfor rammen for den foreliggende oppfinnelse.

I samsvar med det foregående kan det i oppfinnelsens sammenheng også tilveiebringes: ix) En fremgangsmåte for fremstilling av et merket derivat som definert under hvilke som helst av 5.1 til 5.3 i det foregående, i fri eller beskyttet form, idet fremgangsmåten omfatter merking av det tilsvarende umerkede fri eller beskyttede cyklosporin. f.eks. ved innføring av en merkings-substituent, f.eks. som beskrevet i det foregående, ved N-e-atomet i (D)Lys-resten av 8-stillingen derav, og om nødvendig gjennomføre prosess-trinnet iv) i det foregående.

I samsvar med enda en ytterligere aspekt

er det funnet at immunogene konjugater hvori bærermolekylet er koblet til et cyklosporin som hapten via resten ved 5-, 6-, 7- eller 8-stillingen, spesielt i 8-stillingen, inklusive slike konjugater som definert under 2.1 til 2.3 i det foregående, såvel som konjugater oppnådd ved kobling av et cyklosporin som bærer en amino-syre med en annen reaktiv grvppe ved hvilken som helst av disse posisjoner enn en aktivert koblings-gruppe til en bærer ved hjelp av et koblingsmiddel, er i stand til å utvikle regulære polyklonale antisera med høyere spesifisitet enn hittil oppnåelig, f.eks. ved å anvende konjugater oppnådd ved kobling av en bærer til - (Thr) 2- i (Thr) 2-«Cyclosporine.

(Med betegnelsen "reaktiv gruppe" som anvendt i det foregående skal det forstås en hvilken som helst gruppe som tillater eller muliggjør kobling med en bærer, f.eks. polypeptid eller annet passende makromolekyl. Betegnelsen omfatter således generisk aktiverte koblingsgrupper som tidligere definert såvel som andre grupper som er i stand til reaksjon, f.eks. fri amino-, karboksy- eller hydroksy-grupper) .

Immunogene konjugater omfattende et cyklosporin som hapten, knyttet til en bærer via a-amino-syre-resten ved 5-, 6-,

7- eller 8-stillingen er nye i seg selv. Foretrukne cyklosporiner som tilveiebringer haptendelen av disse konjugater er spesielt dem som har en aktivert koblings-gruppe som definert under 1.8 til 1.11, 1.14 og 1.15 (formel Ilb og Ild) ovenfor.

I oppfinnelsens sammenheng kan det videre også tilveiebringes:

2.4 Et immunogent konjugat omfattende en bærer koblet

til et cyklosporin via a-amino-syre-resten ved 5-,

6-, 7- eller 8-stillingen av cyklosporinet.

2.5 Et immunogent konjugat omfattende en bærer koblet

med et cyklosporin med en aktivert koblings-gruppe som definert under hvilke som helst av 1.8 til 1.11, 1.14 eller 1.15 ovenfor (formler Ilb og Ild).

2.6 Et immunogent konjugat omfattende en bærer koblet

med et cyklosporin med en fr-i amino- eller karboksy-gruppe som definert under hvilke som helst av 1.12

til 1.14 og 1.15 ovenfor (formler Ib og Id), spesielt et cyklosporin som definert under 1.14 ovenfor eller formel Id som definert i det foregående.

3.11 Et monoklonalt antistoff i samsvar med 3.9 i det foregående, karakterisert ved at cyklosporinet anvendt ved trinn a) er et cyklosporin som definert under 2.5 ovenfor.

6.1 Et antistoff reaktivt med et cyklosporin (inklusive polyklonalt antiserum inneholdende antistoffer reaktive med et cyklosporin) utviklet som respons til et immunogent konjugat som definert under hvilke som helst av 2.4 til 2.6 i det foregående.

6.2 Antistoff i henhold til 6.1 reaktivt med Cyclosporine,

dihydro-[Val] 2 -Cyclosporine eller [Nva] 2-Cyclosporine, spesielt Cyclosporine.

Immunogene konjugater som definert under 2.5 kan fremstilles i samsvar med metodene i prosess-trinn vi) i det foregående. Immunogene konjugater som definert f.eks. under 2.6 kan fremstilles ved hjelp av metoder som beskrevet i det foregående eller ved hjelp av en prosess omfattende: x) Kobling av en bærer til et cyklosporin med en a-amino-syre-rest som bærer en reaktiv gruppe (dvs. a-amino-syre-rest med en sidekjede ved a-karbonatomet omfattende eller som bærer en reaktiv gruppe), f.eks. et cyklosporin med en fri amino- eller karboksy-gruppe som definert under hvilke som helst av 1.12 til 1.14 og 1.15 ovenfor (formler Ib og Id).

Det ovennevnte prosess-trinn kan gjennomføres i samsvar med metoder kjent på området, f.eks. ved binding av bæreren til cyklosporinet ved mellomkomst av et koblingsreagens. I tilfellet av cyklosporiner med en -(D)Lys-rest ved 8-stillingen, kan således konjugater oppnådd ved sammenknytning av bæreren, f.eks. polypeptidet, f.eks. immunoglobulin til -(D)Lys-N-e-atomet, under anvendelse av karbodiimid-metoden [Kellie et al., "Steroid Immunology", utgitt av Cameron-et al., Alpha. Omega, Cardiff 1975] eller ved Mannich-reaksjonen under anvendelse av formaldehyd som koblingsreagens.

Egnede bærere inkluderer dem av den type som allerede er omtalt i forbindelse med fremstillingen av konjugater for fremstillingen av monoklonale antistoffer, spesielt polypeptider med høy molekylvekt, spesielt proteiner som serumalbuminer, immunoglobuliner og syntetiske polymerer som f.eks. polyclutamin-syre.

Regulær polyklonale antisera som definert under 6.1, selv

om de mangler den fine spesifisitet av monoklonale antistoffer som beskrevet og definert i det foregående,

er også nyttige, f.eks. som komponenter i diagnostiser/ immunoanalyse-sett, spesielt med hensyn til deres forbedrede spesifisitet med hensyn til cyklosporiner i sammenligning med slike antisera som er kjent på området.

De kan fremstilles under anvendelse av hovedsakelig konvensjonelle metoder, f.eks. ved hjelp av en prosess omfattende:

xi) Utløsning av en immun-respons i en passende dyre-

species ved tilførsel av et immunogent konjugat som definert under hvilke som helst av 2.4 til 2.6 ovenfor og utvinning av de således utviklede anti-

sera .

Prosess-trinnet xi) som definert i det foregående kan gjennomføres f.eks. ved tilførsel av det immunogene konjugat til f.eks. en mus, en sau eller kylling, f.eks.

ved injeksjon. Etter en passende inkubasjonsperiode utvinnes antiserumet og blir passende frysetørket, f.eks.

for senere bruk i sett, f.eks. som beskrevet i det følgende. Inkubasjonsperioden velges passende til å gi et antiseruminnhold på mer enn 1:2.000, f.eks. i området fra omtrent 1:7.000 til omtrent 1:10.000, i f.eks. regulær RIA.

Som tidligere indikert er de angjeldende monoklonale antistoffer og polyklonale antisera, såvel som de angjeldende merkede cyklosporiner samtlige av spesiell nytte som komponenter i diagnostiser/immunoanalyse-sett-systerner.

Slike analysesett kan anordnes som:

7. Et immuno- analysesett eller system,

f.eks. et RIA eller FIA sett eller system, for

cyklosporin-analyse, f.eks. av Cyclosporine, i personer som mottar cyklosporin-terapi, f.eks. Cyclosporine-terapi, idet settet eller systemet kan omfatte: A) Antistoff eller antiserum som angitt under hvilke som helst av 3.1 til 3.11 eller 6.1 til 6.2 i det foregående, spesielt et monoklonalt antistoff som definert under hvilke som helst av 3.1 til 3.11 i det foregående, og/eller B) et merket derivat av et cyklosporin definert

under hvilke som helst av 5.1 til 5.3 ovenfor,

som komponent i det nevnte sett eller system.

Sett som definert under 7 er nyttige for diagnoseformål, f.eks. for bestemmelse av mengder av cyklosporin tilstede i blod, blodplasma eller urin, f.eks. som et middel for å etablere et passende doseringsområde for pasienter som mottar cyklosporin-terapi. Slike sett tilveiebringer et analyse-middel for cyklosporiner, f.eks.

Cyclosporine, med hittil ikke oppnådd sensitivitet.

Sett, f.eks. RIA og FIA sett, i samsvar med oppfinnelsen kan være av fullstendig konvensjonell type for anvendelse i samsvar méd den konvensjonelle RIA og FIA

analyse-metode. Således vil RIA-sett passende i tillegg til antiserum eller antistoff, f.eks. A) i det foregående, omfatte et passende merket cyklosporin-derivat, f.eks. B) i det foregående, og C) cyklosporin-standard. Det merkede cyklosporin-derivat vil være komplementært til det cyklosporin som skal analyseres. Passende vil det være et merket derivat som definert under B) i det foregående, f.eks. hvor Cyclosporine skal analyseres vil det passende være et merket derivat av [(D)Lys] - Cyclosporine. Det kan imidlertid også være.et hvilket som helst annet merket komplementært cyklosporin, f.eks. hvor

Cyclosporine skal analyseres, tritiumholdig

Cyclosporine. Cyklosporin standard C) vil gene.relt være

en oppløsning eller lignende omfattende en kjent mengde av det cyklosporin som skal analyseres.

I bruk oppløses f.eks. frysetørket antiserum/antistoff

og inkuberes sammen med f.eks. komponent B) og med enten prøven som skal assay-bestemmes eller komponent C). Inkubasjon gjennomføres foretrukket med avkjøling, f.eks. ved 4°C. pH i den inkuberende blanding holdes foretrukket i området omtrent 5 til 8, f.eks. omtrent pH 7 eller 8, foretrukket ved hjelp av et buffermiddel som f.eks. en citrat- eller tris-buffer.

Inkubasjonen varer passende i minst 2 timer, f.eks. fra omtrent 6 til omtrent 12 timer. Etter inkubasjon separeres den fraksjon av f.eks. komponent B) som er bundet til antistoffet fra den ubundne fraksjon, f.eks. ved bruk av trekull som f.eks. dekstran-belagt trekull. Den ubundne fraksjon absorberer på trekullet og kan deretter separeres ved filtrering eller ved sentrifugering. Mengden av radioaktivitet i en fraksjon måles så ved hjelp av standard metoder, f.eks. ved væske-scintillasjons-telling etter tilsetning av en sekundær solute. Mengdeandelen av komponent B) som er bundet til antistoffet er omvendt proporsjonal med mengden av cyklosporin i den ukjente plasmaprøve. For kvantitativ analyse er det vanlig å fremstille en standard kalibreringskurve ved å analysere oppløsninger av cyklosporinet med kjent konsentrasjon.

FIA-sett i samsvar med oppfinnelsen kan f.eks. være av den type hvori antistoffer er bundet til en lysspreder og som avhenger av konkurranse mellom et fluorescerende cyklosporin (f.eks. et fluorescerende merket derivat) og antistoffet.

Alternativt kan analyse-sett/systemer som

definert under 7 ovenfor være basert på hvilke som helst

av de konvensjonelle ELISA-systeiner som er kjent på området.

De følgende eksempler illustrerer den foreliggende oppfinnelse:

EKSEMPEL 1: Fremstilling av [( D) Lys] p<->C<y>clospo<r>ine

a) En oppløsning av 6,4 g H-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBzl-maleinat i CH2C12 (200 ml) og H20 (100 ml) innstilles

til pK 8 under anvendelse av fast K2CO^. Etter to gangers ekstraksjon, hver gang med CH2C12 (200 ml) tørkes den organiske fase over Na2SO^, filtreres og inndampes til tørrhet til å gi fritt H-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBZl som en krystallinsk rest.

b) (N-e-BOC)-FMOC-(C) Lys (6,25 g) oppløses i CHCl3 (100 ml) og N-metylmorfolin (2,95 g) tilsettes under

omrøring. Etter avkjøling av oppløsningen til -20°C tilsettes dråpevis pivaloylklorid (1,75 g) og reaksjonsblandingen omrøres i 6 timer ved -20°C.

En oppløsning av H-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBzl (6,34 g) i CHCl^ (20 ml) tilsettes dråpevis til anhycrid-oppløsningen og omrøres i 17 timer ved -20°C for fullstendig reaksjon. Etter fortynning av CHCI3-oppløsningen med ytterligere CHCl^ (200 ml) rystes blandingen med mettet NaHCO^-oppløsnincen (100 ml). Den organiske fase tørkes over Na2S04, filtreres og losningsmidlet avdampes til tørrhet.

Den oppnådde oljeaktige rest renses kromatografisk under anvendelse av 25 ganger så stor mengde silikagel (partikkelstørrelse 0,063 - 0,20 mm) og metylenklorid med' ytterligere 3% metanol som eluerincsmicdel-.

[a] 20 = -114,2° (c = 1,0 i CHC13).

c) (N-e-BOC)-FMOC-(C)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBZl (8,8 g) oppløst i abs. etanol (400 ml) hydrogeneres med 10%

palladium/C-katalysator (0,6 g) i en Gastar-

hydrogenator inntil den teoretiske mengde K2 er opptatt (214 ml). Etter avdamping av løsningsmidlet renses resten kromatografisk under anvendelse av 50 ganger så stor mengde silikagel (0,063 - 0,20 mm) og metylen-klorid pluss 1% metanol som elueringsmiddel: [<a>]<20> = -129,1° (c = 1,0 i CHC13).

d) (N- C-BOC) -FMOC- (C) Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-OH (7,1 g) og H-MeBmt- Abu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBZl (7,4 g)

oppløses i metylenklorid (100 ml) og N-metyl-morfolin

(1,72 g) og Castro-reagens (Bt-OP(NMe0)3PF~) (5,6 g) tilsettes ved romtemperatur (25°C). Reaksjonsblandingen omrøres i 3 døgn ved romtemperatur og deretter fortynnes oppløsningen med metylen-klorid

(200 ml) og rystes med mettet NaHCO^-oppløsning (100 ml) . Den organiske fase tørkes over Na2S04, filtreres og inndampes til tørrhet. Den oppnådde oljeaktige rest renses kromatografisk på silikagel (500 g)

(0,06-0,20) under anvendelse av metylenklorid + 3% metanol som elueringsmiddel:tQJD = -143,8°

(c = 1,0 i CHC13).

e) (N-e-B0C) -FMOC- (C) Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt- Abu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl (5,54 g) omrøres i

tilsammen 4 timer ved romtemperatur i en oppløsning av metylenklorid (50 ml) og piperidin (10 ml) . Løsningsmidlet avdampes og den oppnådde olje kromatograf eres på 'Sephadex" LH20 (300 g) under anvendelse av metylenklorid + 3% metanol som elueringsmiddel: fa] <20>= -165,2° (c = 1,0 i CHC13).

f) 0,2N NaOH (24 ml) tilsettes til (N- -BOC)-K-(D)Lys-MeLéu-MeLeu-MeVal- MeBMt-OAbu-Sar-MeLeu-Vai-MeLeu-Ala-OBzl (6,48 g) oppløst i etanol (75 ml). Etter

7 timer innstilles oppløsningen til pH 4 ved dråpevis

tilsetning av 2N HCl under avkjøling. Etter avdamping av løsningsmidlet rystes den oppnådde rest i CH2C12 (200 ml) og mettet NaHC03 (200 ml)

oppløsning. Etter 2 gangers ekstraksjon av den vandige fase, hver gang under anvendelse av metylen-klorid (200 ml) tørkes den organiske fase over Na2S04' filtreres °9 inndampes. Produktet renses kromatografisk på silikagel (300 g) (0,06-0,20 mm) under anvendelse av metylenklorid pluss 20% metanol som elueringsmiddel:[a]^ = -169,9°

(c = 1,0 i CHC13).

g) [ Prosess- trinn v)]

Dimetylaminopyridin (147 mg) tilsettes under omrøring

til (N-e-BOC)-K-(C)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-aAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OH (413 mg) oppløst i metylenklorid (2000 ml). Propan-fosfonsyre-anhydrid

[(0,19 g) 50% oppløsning i CH2C12] tilsettes og reeksjonsblandingen omrøres i 24 timer ved 25°C. Den oppnådde oppløsning vaskes med mettet NaHCH^-oppløsning (200 ml), den organiske fase tørkes over Na2SO^, filtreres og inndampes og renses kromatografisk på silikagel (300 g) (0,062-0,20) under anvendelse av metylenklorid pluss 5% metanol som elueringsmiddel:[tf]^ = -198,3°

(c = 1,0 i CHC13) .

h) [ Prosess- trinn iv)]

[(N-e-BOC)-(D)Lys] Q-Cyclosporine (842 mg) avkjøles

til -20°C med trifluoreddiksyre (25 ml) og røres sammen i 4 timer ved -20°C. Reaksjonsoppløsningen blandes med is, mettet K^CO^ (10 ml) og ekstraheres tre ganger med metylenklorid (200 ml). Den organiske fase tørkes over Na2SQ4, filtreres og løsningsmidlet avdampes. Det oppnådde råprodukt kromatograferes på "Sephadex" LH20 (200 g) under anvendelse av metylen-klorid pluss 1% metanol som elueringsmiddel til å gi den i overskriften nevnte forbindelse [(D)Lys] g-Cyclosporine: [al^<0> = -204,3° (c = 1,0 i CHCl3)

Produkt-forbindelsen kan også omdannes til saltform

i samsvar med standard metode. Typiske salter inkluderer [(D)Lys] Q-Cyclosporine-hydroklorid: [a] <20> = -203° (c = 1,0 i CHCl3), og [(D)Lys]<8->

Cyclosporine-trifluoracetat:[a]^ = -203°

(c - 1,0 i CHCl3).

EKSEMPEL 2: Fremstilling av [( N- e- hydroksysuccinyl)-( D) Lys] g- Cyclosporine: Prosess- trinn iii) 3

255 mg [ (D)Lys] g-Cyclosporine fremstilt i samsvar med eksempel 1 oppløses i 20 ml pyridin og 36 mg ravsyre-anhydrid tilsettes. Den oppnådde oppløsning omrøres i ca. 14 timer ved romtemperatur og pyridinet avdampes fullstendig under vakuum ved maksimalt 40°C. Den oppnådde oljeaktige rest kromatograferes på 55 g "Sephadex" LH 20 under anvendelse av metylenklorid + 2% metanol og oppsamles i 10 ml fraksjoner. Den rene i overskriften nevnte forbindelse oppnås fra fraksjoner 15 til 23.

NMR spektroskopi viser succinyl-protoner ved 2,50 og 2,70 ppm (brede signaler) og et signal for -C^-NH-COCr^CP^COOH ved 3,2 5 ppm.

EKSEMPEL 3: Fremstilling av [ ( O- hydroksysuccinyl)- ThrJ 2-Cyclosporine:[ Prosesstrinn iii)]

6,05 g [Thr] 2-Cyclosporine oppløses i 20 ml pyridin og 3,66 g 4-dimetylamino-pyridin og 1,5 g ravsyre-anhydrid tilsettes ved 75°C. Reaksjonsblandingen omrøres i 4 timer ved 75°C og fortynnes så med 500 ml CH^Cl^ vaskes 5 ganger med hver gang 50 ml 2N HC1 og en gang med 150 ml H^ 0. Den organiske fase ekstraheres, tørkes over Na2SO^ og inndampes og renses kromatografisk under anvendelse av 250 g silikagel (0,040 - 0,062 mm) med eddiksyre som elueringsmiddel .

EKSEMPEL 4: Fremstilling av [ ( N- f.- succinimidooksy-succinyl)-( D) Lys] g- Cyclosporine:

[ Prosess- trinn i)]

50 mg av [(N-e-hydroksysuccinyl)-(D)Lys] g-Cyclosporine fremstilt i samsvar med eksempel 2, 14 mg N-etyl-N'-(dimetylamino-propyl)-karbodidimid HC1, 23,8 mg N-hydroksy-succinimid og 24,6 mg trietylamin omrøres i 2 timer ved romtemperatur i 2 ml metylenklorid til å gi en klar fargeløs oppløsning. Den oppnådde oppløsning fortynnes med 50 ml metylenklorid og 10 ml PL^O og IN HCl tilsettes dråpevis inntil pH 6. En tofase-blanding dannes og denne ristes grundig mellom hver tilsetning av HCl. Den organiske fase rystes til slutt med 10 ml fortynnet NaHCO^-oppløsning og tørkes over Na2SO^, filtreres og løsningsmidlet avdampes til å gi den i overskriften nevnte forbindelse.

NMR-spektrumet fremviser succinyl-protoner ved 2,50 og

2,75 ppm (J = 5 eps) og N-succinimido-protoner ved 2,18 og 2,19 ppm (2S) . Resten ved 8-stillingen har følgende struktur:

EKSEMPEL 5: Fremstilling av [( O- succinimidooksysuccinyl-Thr] 2- Cyclosporine: [ Prosess- trinn i)]

54 mg trietylamin, 98 mg N-hydroksysuccinimid og 102 mg N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid tilsettes

til en oppløsning av 200 mg [(O-hydroksysucciny1)-Thr] 2-Cyclosporine fremstilt i samsvar med eksempel 3 i 10 ml

metylenklorid, idet tilsetningen gjennomføres ved 20°C

r.ied grundig utelukkelse av fuktighet. Reaksjonsblandingen omrøres i 6 timer ved romtemperatur, fortynnes med 200 ml metylenklorid og rystes med 50 ml 1^0. Den vandige fase innstilles til pH 5 til 6 ved dråpevis tilsetning av IN HCl og rystes. Den vandige ekstraheres med 10 ml metylen-klorid og de organiske faser vaskes med 0,1N NaHCO^, tørkes over Na2SO^, filtreres og inndampes. Resten renses kromatografisk under anvendelse av 110 g silikagel med etylacetat som elueringsmiddel til å gi den i overskriften nevnte forbindelse:[a]20 = 178° (c = 1,0 i CHCl3). <1>HNMR i CDCl^ viser succinimidoprotoner ved 2,80 som en singlett og succinylprotoner ved 2,60 ppm som en multiplett. Resten ved 2-stillingen har følgende struktur:

EKSEMPEL 6: Fremstilling av [ ( N-( 3- ( 2- pyridyl) ditio-propion- 1- yl)-( D) Lys 3 g- Cyclosporine:

[ Prosess- trinn i i) 3

35 mg succinyl-3-[(2-pyridyl)ditio3propionat tilsettes til en oppløsning av 126 mg [(D)Lys] g-Cyclosporine i 10 ml metylenklorid ved 20°C og med grundig utelatelse av fuktighet. Reaksjonsblandingen omrøres i 6 timer ved romtemperatur, fortynnes med 200 ml metylenklorid og ristes med 50 ml mettet NaHCO^. Den vandige fase ekstraheres med 150 ml metylenklorid, de organiske faser vaskes med H20, tørkes over Na2S0^, filtreres og inndampes. Den amorfe rest renses kromatografisk under anvendelse av 100 g silikagel med metylenklorid/metanol (95:5) som elueringsmiddel for å gi den rene i overskriften nevnte forbindelsé:[a] 2 0 =-165 o(c=l,0 i CHCl^)-

Resten ved 8-stillingen har formel

EKSEMPEL 7: Fremstilling av immunogene cyklosporin-bærer- konjugater av den type som er definert under 2. 1 i det foregående:

[ Prosess- trinn vi) 3

7. 1 Konjugat med kylling T- Globulin

10 mg [(N-e-succinimidooksysucciny1)-(D)Lys] 8-Cyclosporine fremstilt i samsvar med metoden i eksempel 4 i 0,2 ml dimetylformamid tilsettes til 100 mg kylling Y-globulin i 4 ml NaHC03 (1,5* vekt/volum, pH 8,1). Reaksjonsblandingen omrøres i ca. 2 timer ved romtemperatur og det oppnådde konjugat renses ved dialyse mot fosfat-bufret saltløsning.

7. 2 Konjugat med kyllinq- Ovalbumin

10,7 mg [(O-succinimidooksysuccinyl)-Thr] 2-Cyclosporine fremstilt i samsvar med eksempel 5 og ytterligere inneholdende 10% ditritiumholdig material (1-2 uCi/mg - oppnådd analogt med eksempel 5, men under anvendelse av tritriumholdig [Thr] 2-Cyclosporine som utgangsmaterial) i 100 pl dimetylformamid tilsettes under kraftig omrøring til 30,45 mg kylling ovalbumin i 2 ml, 1,5% NaHCO^ buffer (molart overskudd cyklosporin/ovalbumin = 10,68). Reaksjonsblandingen omrøres i 2 timer ved vanlig temperatur og det oppnådde konjugat renses ved dialyse tre ganger mot fosfat-bufret saltløsning i 18 timer ved 4°C. For konjugat-produktet finnes 55,7% av tilført radioaktivitet å være bundet til ovalbumin, som indikerer et bindirtgs-forhold på 5,95 cyklosporin/ovalbumin.

Kovalent binding av cyklosporin til ovalbumin ble bedømt ved aceton-utfelling av 3 konjugat-prøver. 39,5% radioaktivitet tilsvarende ikke-kovalent bundet cyklosporin bestemmes i aceton-supernatanten og gir et endelig kovalent koblingsforhold på 3,6 cyklosporin/ovalbumin.

Det oppnådde konjugat ble tatt ut som prøve og holdt ved -20°C.

Lignende konjugater kan fremstilles analogt med eksempler 7.1 og 7.2 i det foregående, men under anvendelse av produktet i eksempel 6 som cyklosporin-utgangsmaterial.

EKSEMPEL 8: Fremstilling av immunogene cyklosporin-beerer- kon j ugater av " typen definert under 2. 4/ 2. 6 ovenfor:

[ Prosess- trinn ( x)]

8. 1 Konjugat med marsvin IqG

Marsvin IgG (30 mg) oppløses i 0,IM bikarbcnat-buffer

(pK 9, 0,5 ml) og tilsettes til en oppløsning av [(D)Lys] g-Cyclosporine (1 mg) fremstilt i samsvar med eksempel 1, i den samme buffer (0,5 ml) og et fåtall dråper 1% eddiksyre tilsettes. Koblingen gjennomføres ved etterfølgende tilsetning av to porsjoner N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid-hydroklorid (hver porsjon = 100 mg) . Reaksjonsproduktet fremstilles for injeksjon 24 timer senere ved multippeldialyse mot vann etterfulgt av frysetørking.

8. 2 Konjugat med kanin IqG

[(D)Lys] g-Cyclosporine (10 mg), fremstilt i samsvar med metoden i eksempel 1, oppløses i 0,1 ml av en etanolisk oppløsning av 6,9 pg (=0,1 mCi) tritiumholcig [(D)Lysj g-Cyclosporine. 0,1 ml pyridin og 0,1 ml 35% formaldehyd tilsettes og hele blandingen holdes i 30 min. ved romtemperatur. 20 mg kanin IgG i 0,02M fosfat-bufret saltløsning (1 ml) og 0,3 ml pyridin tilsettes så og

blandingen får stå i omtrent 14 timar ved romtemperatur.

Det oppnådde konjugat dialyseres mot 30% pyridin, 10% pyridin og, til slutt mot 0,005M fosfat-bufret saltløsning. Koblingsfaktoren for konjugatet er 1:11,4.

EKSEMPEL 9: Fremstilling av hybridom- celle- linjer som fremstiller monoklonale antistoffer reaktive med Cyclosporine:

[ Prosess- trinn viii)]

9. 1 Anvendelse av konjugatet i eksempel 7. 1

a) Immuniserinq

Kun-Balb/c mus (20-25 g) mottar hver 100 (ug av det

immunogene konjugat-produkt i eksempel 7.1 i 0,2 ml komplett Freund adjuvant, tilført ved i.p. injeksjon. Etter to uker tilføres en annen booster-injeksjon omfattende 50 ug av produktet i eksempel 7.1 emulgert i 0,2 ml komplett Freund adjuvant på nytt ved i.p. injeksjon. Nærværet av antistoffer reaktive til Cyclosporine i serumet av behandlet mus bekreftes ved regulær RIA-assay-bestemmelse under anvendelse av tritium-merket Cyclosporine som spor-komponent.

b) Hybridom- genererinq

Mus oppnådd i trinn a) som fremviser maksimum Cyclosporine

reaktive antistoff-innhold mottar en booster-injeksjon omfattende 20 jig av produktet i eksempel 3.2 i salt-løsning (0,84% vekt/volum) tilført i.v. Musene avlives på den fjerde dag og milt-celler isoleres og fusjoneres med muse (Balb/C) myelom-celler i samsvar med de metoder som er beskrevet av S. Faz-ekas et al., J. Immunol. Methods, 35, 1-21 (1980).

Voksende hybridomer screen-selekteres for fremstilling av antistoff reaktivt til Cyclosporine ved regulær RIA-analyse^teknikk under anvendelse av tritium-merket Cyclosporine som spor-element og som frenwiser lav kryss-reaktivitet med cyklosporin 17, idet pi nytt regulær RIA-

analyse -teknikk med tritium-merket Cyclosporine som spor-komponent anvendes og cyklosporin 17 som konkurrerende ligand.

En selektert hybridom-linje finnes å fremstille et monoklonalt antistoff reaktivt med Cyclosporine og som har lav kryss-reaktivitet med cyklosporin 17. Antistoffet karakteriseres som hørende til klassen IgG, underklasse IgG^. Den oppnådde IC^q verdi for reaktivitet med Cyclosporine i RIA er 6,7 ng/ml, sammenlignet med 280 ng/ml for cyklosporin 17. Kryss-reaktivitet med cyk losporin 17 er således av størrelsesorden bare' 2%. Bestemt affinitet-konstant overfor Cyclosporine er av størrelsesorden 10 mol/liter.

Det innsees at ved anvendelse av metodene i samsvar med det foregående og som generelt omhandlet heri,

spesielt anvendelsen av cyklosporiner med en aktivert koblingsgruppe, f.eks. som tidligere definert under hvilke som helst av 1.1 til 1.11, 1.14 eller 1.15 (formler Ila, Ilb, lic eller Ild) for fremstilling av immunogene konjugater, og ved å gå frem f.eks. analogt med de generelle metoder i dette eksempel, kan hybridom-linjer/ monoklonale antistoffer lett fremstilles og som selv om de ikke er identiske med den spesifikke produkt-hybridom-linje/monoklonale antistoff i dette eksempel, vil tilfredsstille de samme essensielle kriterier, f.eks. fremvise ekvivalente eller endog forbedrede egenskaper i forhold til dem som er beskrevet i det foregående. Dette vil fremgå fra resultater påvist i det etterfølgende eksempel.

9. 2 Anvendelse av konjugatet i eksempel 7. 2

a) Immunisering

Mus (Balb/c) mottok hver 100 pg av det immunogene konjugat-produkt i eksempel 7.2 i 200 pl fosfat-bufret saltløsning/ Freund adjuvent (1:1). Den første tilførsel (komplett Freund adjuvent) gjennomføres s.c. i bakf ot-poten, neer halen og nær nakken. Etter 3 uker fulgte andre og tredje tilførsler (ufullstendig Freund adjuvant) gjennomført s.c. på henhv- ryggen og i.m. i bakbenene. Blodprøver samles 1 uke etter både annen og tredje tilførsel.

Mus selekteres, for ytterligere bru"k på basis av de følgende målte antisera-kriterier:

1. Titer i flytende fase RIA og i ELISA.

2. Tilsynelatende isotype-fordeling (IgG^ bare eller IgGl+2a+2b 1 ELISA)-

3. Relativ reaksjonsevne i ELISA.

4. Evne til å skjelne mellom Cyclosporine og cyklosporin 17 og cyklosporin- 18 i konkurrerende

ELISA.

Utvalgte mus gis booster-injeksjoner på tredje, andre og første døgn før fusjonering under anvendelse av 100 pg av det immunogene konjugat-produkt i eksempel 7.2 i 200 pl, 9% NaCl, ved i.p. (50%) og i.v. (50%) injeksjon på den tredje foregående dag og i.p. (100%) på andre og første foregående dag.

b) Hybridom- qenererinq

-7 -7

2,5 x 10 eller 5 x 10 milt-celler fra hver mus fusjoneres med 5 x 10 mus (Balb/c) myelom-celler under anvendelse av PEG 4000 og fordelt inn i 24 x 24 fordypninger.

Dyrkings-supernatanter screenes i ELISA for nærvær av antistoffer som gjenkjenner [Thr] 2-Cyclosporine koblet til bovint serum-albumin (fremstilt analogt med eksempel 7.2) og/eller [(D)Lys] -Cyclosporine koblet til bovint serum-albumin (fremstilt analogt med eksempel 7.1) foretrukket i forhold til fritt bovint serum-albumin som negativ kontroll. Selekterte IgG-produserende hybridom-linjer klones for å garantere monoklonalitet.

Evnen til monoklonale antistoffer fremstilt fra oppnådde hybridom-linjer, til å skjelne/diskriminere mellom (a) Cyclosporine og (b) cyklosporin 17 og cyklosporin 18 testes ved en konkurranse-type av indirekte ELISA

som beskrevet av Quesniaux et al., Immunolccy Letters, 9, 99-104, (1985) i en rekke forskjellige buffer-systemer inkluderende fosfat-bufret saltløsning med pK 7,5, med og uten 0,03% "Tween 20", og tris ved pH 7,5, med 0,03%

"Tween" og uten NaCl. Optimale betingelser for diskriminering iakttas generelt i fosfat-bufret saltløsning ved pH 7,5 med 140mM NaCl og 0,03% "Tween 20". Av 9 undersøkte klon-linjer frembringer 7 monoklonale antistoffer som diskriminerer mellom (a) Cyclosporine og (b) cyklosporin 17 og 18. For 6 er IC^q forholdet mellom cyklosporin 17 sammenlignet med Cyclosporine omtrent 35 ganger så stort eller mer.

EKSEMPEL 10: Fremstilling av regulære polyklonale

anti- sera reaktive med Cyclosporine

[ Prosess- trinn xi)]

Sauer immuniseres ved bakfot-intramuskulære injeksjoner

10 ganger med mellomrom omtrent 14 døgn. Injeksjonene omfatter et frysetørket preparat av det immunogene protein-konjugat-produkt i eksempel 8.1 (3 mg),"Alugel"S (0,2 ml) og Freund adjuvant (0,6 ml). Den endelige titer oppnådd mot tritiumholdig Cyclosporine er 1/100.000 som målt ved

RIA.

Polyklonale antisera som utvinnes finnes å fremvise forbedret diskriminering mellom Cyclosporine og dets metabolitt cyklosporin' 17 i sammenligning med polyklonale antisera oppnådd under anvendelse av [Thr] 2-Cyclosporine-IgG konjugater kjent på området, f.eks. som anvendt i hittil anvendte Cyclosporine RIA analyse-sett.

For antisera oppnådd i samsvar med det foreliggende eksempel, er således kryss-reaktiviteten med cyklosporin . 17 av størrelsesorden ca. 18% i sammenligning med ca. 42,0% for kjente polyklonale antisera.

EKSEiMPEL 11: Fremstilling av merkede derivater av cyklosporiner som definert under 5. 1 ovenfor:

[ Prosess- trinn ix)]

11. 1: Fremstilling av [ N- c- TRITC-( D) Lys] g- Cyclosporine

[(D)Lys] g-Cyclosporine (15 mg) fremstilt i samsvar med eksempel 1 oppløses i metylenklorid (2 ml). Rhodamin-isotiocyanat (TRITC) (5,3 mg) tilsettes og reaksjonsblandingen får stå ved -7°C i 17 timer. Den intenst rød-fargede oppløsning kromatograferes direkte på "Sephadex" LH20 (20 g) med metylenklorid og 0,5% metanol. Fraksjoner samles i 10 ml porsjoner.

Den i overskriften nevnte forbindelse utvinnes som en

olje fra fraksjoner 5 til 7 og 10 til 14: UV absorpsjon:

300nm/fluorescens-emisjon: 540 nm. Resten i 8-stillingen har strukturen

11. 2: Fremstilli ng a v [ N- e- Dansyl-( D) Lysj g- Cyclosporine

[(D)Lys] g-Cyclosporine (232 mg) fremstilt i samsvar med eksempel 1 oppløses i kloroform (15 ml). Etyl-diisopropyl-amin (7,3 mg) og dansyl-klorid (99,5 mg) tilsettes og reaksjonsblandingen omrøres i 2 timer. Produktet kromatograferes direkte på "Sephadex"LH20 (100 g) med metylenklorid og 0,5% metanol. Fraksjoner samles i 10 ml porsj oner.

De samlede fraksjoner inndampes og det resulterende produkt kromatograferes på nytt under anvendelse av silikagel (0,06 - 0,20 mm) (100 g) med metylen-klorid og 5% metanol. Fraksjoner samles i 15 ml porsjoner.

Fraksjonene 28-44 gir rent produkt:[a]20 = -183,8°,

c = 1,08 i CHC13.

11. 3: Fremstilling av 12^- joc;er^ derivat av [ (D) Lys ] g-Cyclosporine

Den i overskriften nevnte forbindelse fremstilles analogt med metodene beskrevet av Bolton og Hunter Biochem. J. 133, 529 (1973) ved tilknytning av en p-OH-fenylpropionyl-rest til N-e-atomet i resten ved 8-stillingen av [ (D)Lys] g-Cyclosporine fremstilt i samsvar med eksempel 1. 125^ merkingen bæres i fenyl-ringen av p-OH-fenyl-propionyl-resten

Rensing gjennomføres ved hjelp av KPLC på en 4 x 250 kolonne av RP18 med en lineær gradient og under anvendelse av 10 -30% n-propanol/0,2% trifluoreddiksyre i 5% eddiksyre/0,2% trifluoreddiksyre som flytende fase.

Claims

1. Et monoklonalt antistoff egnet for bruk i et blodover-våkingstestsystem, karakterisert ved at det er reaktivt med et cyklosporin og fremviser lav kryssreaktivitet med minst en metabolitt derav i mennesker.

2. Monoklonalt antistoff som angitt i krav 1, karakterisert ved at cyklosporinet er cyklosporin A og metabolitten derav er cyclosporin 1, 8, 10, 16, 17, 18 eller 21.

3. Et immunogent konjugat for utvikling av det monoklonale antistoff angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at det omfatter et bærerprotein koblet til et cyklosporin ved omsetning av proteinet med et cyklosporin med en a-aminosyrerest i 2-eller 8-stillingen som bærer en aktivert koblingsgruppe, idet den aktiverte koblingsgruppe er en gruppe som er i stand til direkte reaksjon med bærerproteinet til å gi et kovalent sammenknyttet konjugat.

4. Cyklosporin for fremstilling av det immunogene konjugat som angitt i krav 3, karakterisert ved at det har en a-aminosyre-rest som bærer en aktivert koblingsgruppe som angitt i krav 3 .

5. Fremgangsmåte for fremstilling av et monoklonalt antistoff som angitt i krav 1 eller 2, omfattende trinnene med at a) et cyklosporin med en a-aminosyrerest kobles et bærer-protein for a danne et immunogent konjugat, b) det nevnte immunogene konjugat tilfores i en passende dyrespecies for å bevirke immunogen immunisering og antistoffproduserende celler som er sensitivert overfor det nevnte konjugat utvinnes, c) de antistoffproduserende celler immortaliseres, og d) monoklonalt antistoff utvinnes fra en selektert således etablert immortalisert cellelinje, karakterisert ved at det anvendes et cyklosporin med en a-aminosyrerest i 2- eller 8-stillingen som bærer en aktivert koblingsgruppe som angitt i krav 3.

6. Immunotestsett eller system for overvåking av blodnivåer av cyklosporin, karakterisert ved at det omfatter (1) et monoklonalt antistoff som angitt i krav 1 eller 2, og (2) et merket derivat av et cyklosporin hvor resten i 8-stillingen er -(D)Lys-, samt (3) en cyklosporinstandardoppløsning omfattende en kjent mengde av det cyklosporin som skal mengdebestemmes.