JP3171460B2 - シクロスポリンの定量のためのイムノアッセイ試薬および方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料中のシクロスポリ
ンの存在または量を決定するための試薬に関する。さら
に詳しくは、試料中のシクロスポリンおよびシクロスポ
リンの代謝産物の存在または量を検出するためのイムノ
アッセイ、とりわけ蛍光偏光イムノアッセイに使用する
検出可能なトレーサー化合物に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】シク
ロスポリンは真菌由来の環状ウンデカペプチドであり
[米国特許第４,１１７,１１８号；リューガー(Ruegger)
ら、Helvetica ChimicaActa、Vol.５９(４)、１０７５
〜１０９２頁(１９７６)；米国特許第４,２８９,８５１
号；およびトレーバー(Traber)ら、Helvetica Chimica
Acta、Vol.６０(４)、１２４７〜１２５５頁(１９７７)
およびVol.６５(５)、１６５５〜１６７７(１９８
２)]、ヒトにおける腎臓、心臓、骨髄および肝臓などの
移植臓器の拒絶を防ぐための強力な免疫抑制剤として一
般に用いられている。シクロスポリンの有効性はまた、
乾せん、結膜炎、関節炎、腎炎および自己免疫疾患など
の病的状態の治療においても探求されている[ドネリー
(Donnelly)ら、Therapeutic Drug Monitoring、Vol.１
１(６)、６９６〜７００頁(１９８９)]。

【０００３】移植臓器の拒絶を防ぐため、あるレベルの
シクロスポリンを血流中に維持する必要があるが、該薬
物の高血中レベルまたは長期の使用により腎毒性、肝細
胞毒性その他の副作用が生じる。さらに、シクロスポリ
ンの分布および代謝は個々の個体間で大きく異なるばか
りでなく、同一個体においても治療経過で異なる。従っ
て、適切な患者管理のため、全血、血漿および血清など
の生物学的試料中のシクロスポリンの濃度またはレベル
をモニターする必要がある[バーチャート(Burchart)
ら、Drug Intelligence and Clinical Pharmacy、Vol.
２０、６４９〜６５２頁(１９８６)およびショー(Shaw)
ら、Clinical Chemistry、Vol.３３(７)、１２６９〜１
２８８頁(１９８７)]。

【０００４】しかしながら、血液、血漿および血清中の
シクロスポリンの測定はシクロスポリンの代謝産物が存
在するために複雑であり[モーラー(Maurer)ら、Drug Me
tabolism and Disposition、Vol.１２(１０)、１２０〜
１２６頁(１９８４)]、これら代謝産物の毒性、免疫抑
制作用、および相乗作用が研究されている[ディンザン
ス(Dindzans)ら、Transplantation Proceedings、Vol.
１９(４)、３４９０〜３４９３頁(１９８７)；イー(Ye
e)ら、Transplant.Proc.,Vol.１８、７７４〜７７６頁
(１９８６)；およびライフェル(Ryffel)ら、Transplan
t.Proc.,Vol.２０(補遺２)、５７５〜５８４頁(１９８
８)]。シクロスポリンをその代謝産物とは独立に測定す
ることが望ましいが、親薬物とともにその代謝産物をも
測定するアッセイに対する必要性も存在する[ドネリー
ら、上記文献]。環がなお完全であることが同定された
シクロスポリンの代謝産物は、該親化合物の水酸化およ
びメチル化の結果得られたものである[モーラーら、Dru
g Metabolism and Diposition、１２(１)、１２０〜１
２６頁(１９８４)]。シクロスポリンおよびその幾つか
の主要な代謝産物の構造は下記式：

【化２４】 で示される。

【０００５】シクロスポリンの構造はまた下記式：

【化２５】 (式中、「ＭｅＢｍｔ」はＮ−メチル−(４Ｒ)−４−ブト
−２Ｅ−エン−１−イル４−メチル−(Ｌ)−トレオニン
残基、「ＭｅＶａｌ」は(Ｎ)−メチル−(Ｌ)−バリン残
基、「ＭｅＬｅｕ」は(Ｎ)−メチル−(Ｌ)−ロイシン残
基、「Ｄ−Ａｌａ」はＤ−アラニン残基、「Ａｌａ」はＬ−
アラニン残基、「Ｖａｌ」はＬ−バリン残基、「Ａｂｕ」
はＬ−(α)−アミノ酪酸残基、「Ｓａｒ」はサルコシン
(Ｎ−メチルグリシンとしても知られる)残基である)に
よっても表される。本明細書において「残基」なる語はペ
プチド中に認められるアミノ酸の縮合形を意味し、α−
アミノ酸の立体配置は特にＤ−配置であると断らない限
りＬ−配置である。本明細書においても、シクロスポリ
ン(すなわち、シクロスポリンＡ)の構造を言及すること
によるシクロスポリン類似体の通常の命名法が定められ
る。すなわち、まずシクロスポリン中に存在する残基と
は異なる残基を指摘し、ついでシクロスポリン中に存在
する残基と同一である残りの残基を特徴付けるため「シ
クロスポリン」の語を適用する。それゆえ、[Ｔｈｒ]²シ
クロスポリンといった場合、これはシクロスポリンの２
位のアミノ酸残基がトレオニンであるシクロスポリン、
すなわちシクロスポリンＣを意味する。

【０００６】全血、血漿および血清中のシクロスポリン
レベルは、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)[レ
ンズマイヤー(Lensmeyer)ら、Clinical Chemistry、Vo
l.３１(２)、１９６〜２０１頁(１９８５)]、³Ｈ[ドナ
ッチ(Donatsch)ら、Journal ofImmunology、Vol.２
(１)、１９〜３２頁(１９８１)]または¹²⁵Ｉ[米国特許
第４,７２７,０３５号およびマホニー(Mahoney)ら、Cli
nical Chemistry、Vol.３１(３)４５９〜４６２頁(１９
８５)]を利用したラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、蛍光
イムノアッセイ(米国特許第４,７２７,０３５号)、およ
び蛍光偏光イムノアッセイ(ＦＰＩＡ)[マーティー(Mart
y)ら、Analytical Letters、Vol.２２(１３＆１４)、２
７１７〜２７３６頁(１９８９)およびヨーロッパ特許出
願公開第２８３,８０１号]により測定されている。

【０００７】シクロスポリンの代謝産物は上記ＨＰＬＣ
法によりシクロスポリン自体から区別することができる
が、ＨＰＬＣ法は時間と労力がかかり、大量の試料調製
物が必要であり、アッセイを行うのに少なくとも３０分
の時間がかかる。同様に、ＲＩＡ法も放射性物質を使用
することにより特別の貯蔵、取り扱いおよび廃棄が必要
であるという欠点を有し、アッセイを行うには最小限２
時間が必要とされる。

【０００８】蛍光偏光イムノアッセイ法は、特に使用が
容易であるという点で上記方法よりも優れているが、市
販のポリクローナル抗体イムノアッセイ法は代謝産物と
対したときにシクロスポリンに対する特異性を欠いてい
る。この点でイムノアッセイ法の特異性は、使用した抗
体の種類、および該抗体のシクロスポリン、シクロスポ
リンの代謝産物および標識シクロスポリンに対する相対
的な親和性に依存する。最近になって、代謝産物と対し
てもシクロスポリンに特異的なモノクローナル抗体が記
載されており[ケスニオー(Quesniaux)ら、Immunology L
etters、Vol.３３(１)、３２〜３７頁(１９８７)、およ
びMolecular Immunology、Vol.２４(１１)、１１５９〜
１１６８頁(１９８７)]、これら抗体を用いたＲＩＡア
ッセイ法はＨＰＬＣ法と良好な相関を有することがわか
った。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、シクロスポリ
ンまたはシクロスポリンとその代謝産物を検出するため
のイムノアッセイ法、特に蛍光偏光イムノアッセイ法に
特に有用な試薬を提供することにより、上記ＨＰＬＣ法
およびＲＩＡ法の欠点を克服するものである。さらに、
本発明は、試料中のシクロスポリンまたはシクロスポリ
ンとその代謝産物を検出するために、特異的抗体または
非特異的抗体のいずれかを用いた、イムノアッセイ法、
特に蛍光偏光イムノアッセイ法に使用する新規トレーサ
ー化合物を提供することにより、これまでに記載された
シクロスポリンのためのイムノアッセイ法に対して進歩
をもたらすものである。

【００１０】本発明は、試料中のシクロスポリンまたは
シクロスポリンとその代謝産物の存在または量を決定す
るためのイムノアッセイにおいてトレーサー化合物とし
て使用するための、シクロスポリンまたはシクロスポリ
ン類似体を検出可能な残基で標識してなる新規シクロス
ポリン誘導体に関する。該検出可能な残基はフルオレセ
インまたはフルオレセイン誘導体であるのが好ましく、
かくして得られる蛍光トレーサー化合物は蛍光偏光イム
ノアッセイを行うのに特に有用である。

【００１１】本発明のシクロスポリン誘導体は、シクロ
スポリンの第一位に認められるアミノ酸残基(Ｎ−メチ
ル−(４Ｒ)−４−ブト−２Ｅ−エン−１−イル−メチル
−Ｌ−トレオニン残基)、シクロスポリンの第二位に認
められるアミノ酸残基(Ｌ−α−アミノ酪酸残基)、シク
ロスポリンの第三位に認められるアミノ酸残基(Ｎ−メ
チルグリシン残基)、シクロスポリンの第八位に認めら
れるアミノ酸残基(Ｄ−アラニン残基)またはシクロスポ
リンの第十位に認められるアミノ酸残基(Ｎ−メチル−
Ｌ−ロイシン残基)において検出可能な残基がシクロス
ポリンまたはシクロスポリン誘導体にカップリングした
ものである。

【００１２】本発明のシクロスポリン誘導体は、式：

【化２６】 (式中、Ｒ₁は式：

【化２７】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ₂は式：

【化２８】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ₃は式：

【化２９】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ₄は式：

【化３０】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ₅は式：

【化３１】 で示されるアミノ酸残基；Ｚは検出可能なシグナルを生
成し得る検出可能な残基；

【００１３】ただし、Ｒ₁が「化２７」である場合、Ｘ₁は
水素以外の原子数が１〜２０の連結基であり、Ｒ₂は
(Ｌ)−α−アミノ酪酸残基または(Ｌ)−トレオニン残
基、または(Ｌ)−トレオニン残基において水酸基が炭素
数１〜１０のアシル基もしくはフルオレセイニル基でア
シル化されているものであり、Ｒ₃はサルコシン残基、
または(Ｄ)−セリン残基であり、Ｒ₄は(Ｄ)−アラニン
残基であり、Ｒ₅はＮ−メチル−(Ｌ)−ロイシン残基で
あり、Ｒ₂が「化２８」である場合、Ｘ₂は水素以外の原子
数が１〜３０の連結基であり、Ｒ₁はＭｅＢｍｔ、ジヒ
ドロ−ＭｅＢｍｔ、ＭｅＢｍｔの環化誘導体、または水
酸基が炭素数１〜１０のアシル基またはフルオレセイニ
ル残基でアシル化されたＭｅＢｍｔの誘導体であり、Ｒ
₃はサルコシン残基、(Ｄ)−セリン残基、または(Ｄ)−
セリン残基において水酸基が炭素数１〜１０のアシル基
でアシル化されたものであり、Ｒ₄は(Ｄ)−アラニン残
基であり、Ｒ₅は(Ｎ)−メチル−(Ｌ)−ロイシン残基で
あり、

【００１４】Ｒ₃が「化２９」である場合は、Ｘ₁は水素以
外の原子数が１〜２０の連結基であり、Ｒ₁はＭｅＢｍ
ｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、ＭｅＢｍｔの環化誘導体、
または水酸基が炭素数１〜２０のアシル基でアシル化さ
れたＭｅＢｍｔの誘導体であり、Ｒ₄は(Ｄ)−アラニン
残基であり、Ｒ₅は(Ｎ)−メチル−(Ｌ)−ロイシン残基
であり、Ｒ₄が「化３０」である場合は、Ｘ₁は水素以外の
原子数が１〜２０の連結基であり、Ｒ₁はＭｅＢｍｔ、
ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、ＭｅＢｍｔの環化誘導体、また
は水酸基が炭素数１〜１０のアシル基でアシル化された
ＭｅＢｍｔの誘導体であり、Ｒ₂は(Ｌ)−α−アミノ酪
酸残基または(Ｌ)−トレオニン残基、または(Ｌ)−トレ
オニン残基において水酸基が炭素数１〜１０のアシル基
でアシル化されたものであり、Ｒ₅は(Ｎ)−メチル−
(Ｌ)−ロイシン残基であり、

【００１５】Ｒ₅が「化３１」である場合は、Ｘ₁は水素以
外の原子数が１〜２０の連結基であり、Ｒ₁はＭｅＢｍ
ｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、ＭｅＢｍｔの環化誘導体、
または水酸基が炭素数１〜１０のアシル基でアシル化さ
れたものであり、Ｒ₂は(Ｌ)−α−アミノ酪酸残基また
は(Ｌ)−トレオニン残基、または(Ｌ)−トレオニン残基
において水酸基が炭素数１〜１０のアシル基でアシル化
されたものであり、Ｒ₄は(Ｄ)−アラニン残基である)で
示される化合物またはその塩である。

【００１６】本発明の好ましいシクロスポリン誘導体
は、式：

【化３２】 (式中、Ｆｌは蛍光残基、Ｘ₁は水素以外の原子数が１〜
１５の連結基、Ｒ¹は水素、ＯＨまたはＯＣＯＲ₆(式
中、Ｒ₆は炭素数１〜６のアルキル基またはＸ₁−Ｆｌで
ある)で示される基である)で示される化合物；および
式：

【化３３】 (式中、Ｒ₇は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｒ₈
は水素またはＣＨ₂ＯＲ₇(式中、Ｒ₇は前記と同じ)、Ｘ₂
は水素以外の原子数が１〜３０の連結基、Ｆｌは蛍光残
基である)で示される化合物；および式：

【００１７】

【化３４】 (式中、Ｒ₇は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｒ₉
は水素またはＯＲ₇、Ｘ₁は水素以外の原子数が１〜１５
の連結基、Ｆｌは蛍光残基である)で示される化合物；
および式：

【化３５】 (式中、Ｒ₇は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｘ₁
は水素以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｆｌは蛍光残
基である)で示される化合物；および式：

【化３６】 (式中、Ｒ₇は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｘ₁
は水素以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｆｌは蛍光残
基である)で示される化合物である。本発明はまた、上
記シクロスポリントレーサー化合物を用いたアッセイ法
および試験キットをも提供する。

【００１８】本発明のシクロスポリントレーサー化合物
は、下記反応式：

【化３７】 (式中、Ｒはシクロスポリン残基、Ｘは水素以外の原子
数が１〜６の連結基、ＹはＣｌまたはＯＣＨ₃、Ｚは検
出可能な残基、Ｒ'およびＲ"はアルキル基またはカルボ
ジイミド中に一般に認められる官能化アルキル基であ
る)に従って調製する。

【００１９】たとえば、上記反応式(i)によれば、遊離
の水酸基を有するシクロスポリンまたはその誘導体をベ
ンゼンまたはトルエン中のホスゲン溶液で処理して中間
体のクロロホルメートを生成させる。別法として、同様
の中間体はカルボニルジイミダゾールを用いても生成さ
せることができる。ついで、このクロロホルメートを、
たとえばアミノ基で置換したフルオレセイン残基と反応
させてカルバメート結合を生成させる(下記実施例３、
４、５、１３、１４、１６、１７、１８および１９に詳
細に記載)。

【００２０】反応式(ii)によれば、遊離の水酸基を有す
るシクロスポリンまたはその誘導体をオキサリルクロリ
ドで処理して中間体のクロロオキサリルエステルを生成
させる。ついで、この中間体を、たとえばアミノ基で置
換したフルオレセイン残基で処理してアミド結合を生成
させる(下記実施例１および２に詳細に記載)。

【００２１】反応式(iii)によれば、遊離の水酸基また
は遊離のアミノ基を有するシクロスポリンまたはその誘
導体を無水コハク酸で処理して中間体として酸の半エス
テルまたは酸の半アミドを生成させる。かくして生成し
た遊離のカルボン酸をカルボジイミドを用いて活性化
し、ついで、たとえばアミノ基で置換したフルオレセイ
ン残基で処理してアミド結合を生成させるが、別法とし
てＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルなどの活
性エステルの媒体を経て反応を進行させてもよい(下記
実施例１１、２０、２１、２２、２４、２５、２８、２
９、３３、３４、３６、３８、４０および４３に詳細に
記載)。

【００２２】反応式(iv)によれば、遊離のアミノ基を有
するシクロスポリンまたはその誘導体を塩基の存在下、
カルボキシフルオレセイン活性エステルで処理する。こ
のシクロスポリン誘導体とフルオレセイン残基とはアミ
ド結合で連結される(下記実施例１１、１２、２６およ
び３２に詳細に記載)。

【００２３】反応式(v)によれば、アミノ基を有するシ
クロスポリンまたはその誘導体をジクロロトリアジニル
基で置換したフルオレセイン残基で処理して窒素−炭素
結合を生成させる(下記実施例９、１０、２３および２
７に詳細に記載)。

【００２４】本発明のシクロスポリントレーサー化合物
の検出可能な残基成分は、当該技術分野で知られた種々
の検出可能な標識から選択され、たとえば化学発光分
子、発光分子、酵素などであってよいが、これらに限ら
れるものではない。本発明では、フルオレセインおよび
フルオレセイン誘導体として知られている発光分子が好
ましい。そのようなフルオレセイン誘導体としては、フ
ルオレセインアミン、カルボキシフルオレセイン、α−
ヨードアセトアミドフルオレセイン、４'−アミノメチ
ルフルオレセイン、４'−Ｎ−アルキルアミノメチルフ
ルオレセイン、５−アミノメチルフルオレセイン、６−
アミノメチルフルオレセイン、２,４−ジクロロ−１,
３,５−トリアジン−２−イル−アミノフルオレセイン
(ＤＴＡＦ)、４−クロロ−６−メトキシ−１,３,５−ト
リアジン−２−イル−アミノフルオレセイン、およびフ
ルオレセインイソチオシアネートなどが挙げられるが、
これらに限られるものではない。特に好ましいフルオレ
セイン誘導体は、アミノメチルフルオレセイン類、カル
ボキシフルオレセイン類、およびフルオレセインアミン
類である。

【００２５】フルオレセインは、環境の酸濃度(ｐＨ)に
依存して２つの互変異体として存在する。開環形(酸)で
はフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体(または
蛍光分子を含有するトレーサー)は、約４ナノ秒の励起
状態寿命の後、青色を吸収し緑色の蛍光を放射すること
ができる。開環形と閉環形とが共存するときは、開環形
分子と閉環形分子の相対濃度はｐＨレベルを調節するこ
とにより容易に変えることができる。一般に、本発明の
シクロスポリントレーサー化合物は溶液中でナトリウ
ム、カリウム、アンモニウムなどの生物学的に許容し得
る塩として調製されるため、該化合物は蛍光形で存在す
ることができる。存在する特定の塩の種類は、ｐＨレベ
ルを調節するのに使用した緩衝液に依存する。たとえ
ば、リン酸ナトリウム緩衝液の存在下では本発明の化合
物は一般に開環形でナトリウム塩として存在する。従っ
て、本明細書において「フルオレセイン」なる語は、蛍光
の文脈で使用する場合は蛍光を生じるために開環形であ
ることが必要であるから別として、特定の分子として存
在する場合は、個々の化合物としてかまたはトレーサー
の成分としてのいずれにおいても開環形と閉環形との両
方の互変異形を包含する。

【００２６】当業者には理解されるであろうように、蛍
光標識はそのサイズに従って選択するのが理想的であ
る、すなわち、分子が小さくなればなるほど一層速く回
転することができ、それゆえ蛍光偏光イムノアッセイト
レーサー化合物として一層有効になる。そのような化合
物は適当な波長の偏光で励起させたときに蛍光応答を生
じ、蛍光偏光測定を行うことができる。

【００２７】本発明のシクロスポリントレーサー化合物
は、当該技術分野で知られた通常のイムノアッセイ法を
用い、全血、血漿、脊髄液などの希釈または非希釈試料
中のシクロスポリンまたはシクロスポリンの代謝産物の
存在または量を決定するために使用することができる。
本発明の方法によれば、シクロスポリンまたはシクロス
ポリンとシクロスポリンの代謝産物を含有していると思
われる試料を本発明のシクロスポリントレーサー化合物
および、当該技術分野で知られた方法により調製した、
シクロスポリン、シクロスポリンの代謝産物およびシク
ロスポリン誘導体に対する適当な抗体と混合する。試料
中に存在するシクロスポリンとトレーサー化合物とは抗
体上の限られた数の結合部位に対して競合し、その結
果、シクロスポリン−抗体複合体およびトレーサー化合
物−抗体複合体が生成する。トレーサー化合物および抗
体の濃度を一定に保つことにより、トレーサー−抗体複
合体に対するシクロスポリン−抗体複合体の生成比は試
料中のシクロスポリンの量に正比例する。

【００２８】本発明のトレーサー化合物は、シクロスポ
リンを認識する抗体またはシクロスポリンとその代謝産
物を認識する抗体を用いたイムノアッセイ系において用
いることができる。シクロスポリンに対するモノクロー
ナル抗体およびポリクローナル抗体は記載されている
[ドナッチら、上記文献；ケスニオーら、上記文献およ
びケスニオーら、International Journal of Peptide a
nd Protein Research、Vol.３１、１７３〜１８５頁(１
９８８)；ヨーロッパ特許出願公開第２８３,８０１号；
カカルノ(Cacalno)ら、Journal of Immunological Meth
ods、Vol.１１８(２)、２５７〜２６３頁(１９８９)；
および国際特許出願公開第ＷＯ ８６／０２０８０号]。
従って、本明細書にいうシクロスポリンの決定は、試料
中に存在するかもしれないシクロスポリン代謝産物とは
独立のシクロスポリンの特異的な決定、またはシクロス
ポリンとその代謝産物の決定を包含し、これら決定はも
ちろんイムノアッセイ系に使用した特定の抗体に依存す
る。

【００２９】当業者には理解されるであろうように、抗
体の特異性は、一部は該抗体を産生させるのに使用した
免疫原の構造により決定される。分子量の小さい分析対
象物に対しては、当該技術分野で知られた方法に従い、
実験動物において適当な免疫応答を確実にするために該
分析対象物をタンパク質などの分子量の大きな担体に共
有結合によってカップリングすることにより免疫原を調
製する。担体に分析対象物を結合させる位置は、その部
位に対する抗体の認識が一般に低くなるようなものにす
る。

【００３０】本発明のトレーサー化合物を調製する場
合、誘導体化シクロスポリン分子に検出可能な残基を結
合させる位置およびそれらを結合させるリンカーの長さ
および特性は、該トレーサー化合物と試料中に存在する
シクロスポリンとの間で該抗体への結合に対して競合が
起こるように最適化すべきである。多くの場合、シクロ
スポリン分子上で抗体によってよく認識されない部位に
検出可能な残基を結合させることにより該抗体が該トレ
ーサー化合物に結合するようにすることが有利である。
一般に、免疫原を結合させる部位以外に抗体によってほ
とんど認識されない部位が存在するものである。従っ
て、リンカーアームの長さおよび特性を変えることによ
り、トレーサー化合物への抗体の結合を最適化して所望
の結果を得ることができる。さらに、シクロスポリンの
モニターに有用であるために、分析対象物とトレーサー
化合物との間の競合は治療学的範囲レベルが互いに識別
できるようなものでなければならない。

【００３１】トレーサー化合物の構造はイムノアッセイ
を行うのに重要であり、特定のアッセイに使用した抗体
とともに使用するため最適化すべきである。たとえば、
抗体がトレーサー化合物に対して高親和性で結合するな
らば、トレーサー化合物は分析対象物によって抗体から
置換されることがないか、またはトレーサー化合物は抗
体からすべての分析対象物を競合的に置換してしまい、
分析対象物を測定することはできない。逆に抗体がトレ
ーサー化合物を認識しない場合は、バックグラウンドシ
グナル以外はシグナルは検出されることはなく、分析対
象物を測定することはできない。同様に、トレーサー化
合物の構造はある程度、分析対象物の代謝産物または類
似体に対する抗体の交差反応性を決定する。なぜなら、
分析対象物、分析対象物類似体およびトレーサー化合物
との抗体の相対的な結合能が交差反応性を決定するから
である。

【００３２】本発明のシクロスポリントレーサー化合物
は蛍光偏光イムノアッセイ系に用いるのが好ましく、該
系において試料中のシクロスポリンの量の決定は、混合
物を偏光で励起させ、ついで遊離すなわち未結合のトレ
ーサー化合物かまたはトレーサー−抗体複合体のいずれ
かから放射される蛍光の偏光を測定することにより行
う。抗体と複合体を形成していないトレーサー化合物
は、吸収および蛍光の再放射に要する時間よりも短い時
間で自由に回転する。その結果、再放射される光は相対
的にランダムな方向を向いており、それゆえ抗体と複合
体を形成していないトレーサー化合物の蛍光偏光は低
く、０に近付く。特異的抗体と複合体を形成すると、か
くして生成したトレーサー−抗体複合体は抗体分子の回
転(トレーサー化合物分子のものよりも相対的に遅い)を
担い、その結果、観察される偏光は増加する。

【００３３】そのようにして決定を行う場合、シクロス
ポリンは抗体部位に対してトレーサー化合物と競合し、
観察されるトレーサー−抗体複合体の蛍光偏光は、遊離
のトレーサー化合物の値とトレーサー−抗体複合体の値
との間の値となる。それゆえ、試料中に高濃度のシクロ
スポリンまたはその代謝産物が含まれていると、観察さ
れる偏光値は遊離のトレーサー化合物の値に近付く、す
なわち低くなる。逆に、試料が低濃度のシクロスポリン
またはその代謝産物しか含んでいない場合は、偏光値は
トレーサー−抗体複合体の値に近付く、すなわち高くな
る。イムノアッセイの反応混合物を垂直偏光ついで水平
偏光で順に励起させ、放射光の垂直成分のみを分析する
ことにより、反応混合物の蛍光の偏光を正確に決定する
ことができる。偏光とシクロスポリン濃度との正確な相
関関係は、既知濃度のカリブレーターの偏光値を測定
し、かくして作成された標準曲線からシクロスポリンの
濃度を内挿することにより確立することができる。

【００３４】蛍光偏光法を用いる場合、得られる結果は
「ミリ偏光単位」、「スパン(ミリ偏光単位にて)」および
「相対強度」により定量することができる。ミリ偏光単位
の測定は、分析対象物が試料中で不在下に最大量のトレ
ーサー化合物が抗体に結合した場合の最大偏光を示す。
正味のミリ偏光単位が高くなればなるほど、トレーサー
化合物の抗体への結合は良好となる。本発明の目的のた
めには、少なくとも約１３０の正味のミリ偏光単位が好
ましい。

【００３５】「スパン」とは、正味のミリ偏光と抗体に最
小量のトレーサー化合物が結合した際の偏光値の差異を
示す。スパンの値が大きくなればなるほどデータの数値
分析は良好となる。本発明の目的のためには、少なくと
も約１５ミリ偏光単位のスパンが好ましい。

【００３６】「相対強度」とは、バックグラウンド蛍光を
越える蛍光シグナルの強度の測定値である。それゆえ、
強度が高くなればなるほど、正確な測定値が得られる。
この強度は、垂直偏光の強度に水平偏光の強度を２倍し
たものを加えた合計として決定される。強度は、トレー
サー化合物の濃度および他のアッセイ変数に依存して、
バックグラウンドノイズの約３倍から約３０倍のシグナ
ルの範囲である。本発明の目的のためには、バックグラ
ウンドノイズの約３倍から約２０倍の強度が好ましい。

【００３７】本発明のトレーサー化合物を用いてイムノ
アッセイ法を行う場合は、ｐＨは約４.０〜約９,０、好
ましくは約６.０〜約８.０、最も好ましくは約７.０〜
約７.５である。トレーサー化合物の検出可能な残基が
フルオレセイン残基である場合は、該トレーサー化合物
を使用するイムノアッセイ系のｐＨは、該トレーサー化
合物のフルオレセイン残基が開環形で存在するのに充分
なものでなければならない。イムノアッセイ法を行う間
にｐＨを達成し一定に保持しておくため種々の緩衝液を
用いることができ、その例として、ホウ酸塩、リン酸
塩、炭酸塩、トリス^TM，バルビタールなどを挙げること
ができるが、これらに限られるものではない。蛍光偏光
イムノアッセイを行う場合にはトリスおよびリン酸緩衝
液が好ましい。

【００３８】本発明の方法は、適度の温度、好ましくは
一定温度で行う。温度は通常、約０℃〜約５０℃、好ま
しくは約１５℃〜約４０℃である。下記で詳細に記載す
るように、本発明のシクロスポリントレーサー化合物は
蛍光偏光イムノアッセイにおいて特に有用であり、試料
中の約１０^-6Ｍ〜約１０^-10Ｍのシクロスポリンを決定
することができる。当業者には理解されるように、高濃
度のシクロスポリンは試料を希釈することによって決定
することができる。試料中のシクロスポリンの濃度範囲
によってトレーサー化合物や抗体などのアッセイ試薬の
濃度範囲は決定されるけれども、各試薬の濃度は、当業
者によって決定されるようにアッセイの感度を最適にす
るように経験的に決定することができる。

【００３９】本発明の好ましい態様によれば、蛍光偏光
イムノアッセイを行うための試薬には、下記実施例４に
記載するように下記式：

【化３８】 (式中、Ｒ₁は水素、Ｘ₁は−ＣＨ₂ＮＨＣＯ−残基、Ｆｌ
は４'位でカップリングしたフルオレセインである)で示
される、シクロスポリンの第一位にあるＭｅＢｍｔの水
酸基に４−アミノメチルフルオレセインをカップリング
した蛍光トレーサー化合物、および国際特許出願公開Ｗ
Ｏ ８６／０２０８０に記載されているようなシクロス
ポリンに対する抗体が含まれる。上記式で示される蛍光
トレーサー化合物の使用は、上記モノクローナル抗体と
ともに用いた場合に驚くほど有用であることがわかっ
た。というのは、該抗体は、シクロスポリンの第二位に
あるアミノ酸によって担体タンパク質分子にカップリン
グした免疫原を用いて調製したものであり、シクロスポ
リン抗体の結合能は第一位の構造変化に他の点では特に
感受性であるからである。

【００４０】下記実施例で一層詳細に記載するように、
米国特許出願第５６７,８５３号(発明の名称：「タンパ
ク質沈殿試薬」、１９９０年８月１５日出願)に記載され
ているようなメタノール、エチレングリコールおよび硫
酸亜鉛からなるシクロスポリンモノクローナル全血沈殿
溶液、および米国特許出願第５６７,８４０号(発明の名
称：「生物学的試料のための可溶化試薬」、１９９０年８
月１５日出願)に記載されているようなサポニンおよび
タージトール^TM[アルキルオキシ(ポリエチレンオキシプ
ロピレンオキシイソプロパノール)]などの界面活性剤か
らなる可溶化試薬も用いられる。加えて、希釈緩衝液、
カリブレーターおよびコントロールも用いるのが好まし
い。

【００４１】本発明による好ましいイムノアッセイ法は
均一イムノアッセイ法であり、抗体−蛍光トレーサー化
合物複合体および遊離すなわち未結合の蛍光トレーサー
化合物を含有する溶液から蛍光偏光の読み取りを行うの
で、そのような化学種を分離する必要がない。そのよう
なイムノアッセイ法は、たとえば、読み取り前に結合放
射性トレーサーを未結合の放射性トレーサーから分離し
なければならないラジオイムノアッセイ法に比べて特に
有利である。

【００４２】本発明の好ましいアッセイ法によれば、シ
クロスポリンまたはシクロスポリンとその代謝産物とを
含有する試料を上記沈殿試薬と合わせ、混合し、遠心分
離にかけて変性タンパク質のペレットを得る。シクロス
ポリンおよびその代謝産物はタンパク質、とりわけリポ
タンパク質に対して高い結合親和性を有することを理解
する必要がある。従って、シクロスポリンおよびその代
謝産物をタンパク質から分離するため(さもないと、本
明細書に記載するようなシクロスポリンとその代謝産物
のイムノアッセイ決定を妨害するであろう)、沈殿試薬
を用いてそのような分離を行う。その際、試料中に存在
するタンパク質は沈殿するが、同時に試料中に存在する
シクロスポリンまたはその代謝産物の約９０％〜１１０
％が回収される。

【００４３】同様に、試料が種々の細胞成分を含有する
全血試料その他の生物学的試料などである場合は、シク
ロスポリンやその代謝産物が抗体への結合に利用できる
ように、そのような細胞成分からシクロスポリンまたは
その代謝産物を解離させるのが望ましい。従って、上記
可溶化試薬は、試料中の細胞成分からシクロスポリンや
その代謝産物を解離させるのに用いる。

【００４４】たとえば全血試料の場合に上記のようにし
て妨害タンパク質を沈殿させたら、試料をまず上記可溶
化試薬で処理し、ついでシクロスポリンまたはシクロス
ポリンとその代謝産物を含有する上澄み液を抗体と混合
する。トレーサー化合物および希釈緩衝液を加える前に
バックグラウンド蛍光を読み取り、約１０分〜約３０分
のインキュベート後、上記のようにして蛍光偏光の読み
取りを行う。

【００４５】本発明の試験キットは、本発明による所望
のイムノアッセイを行うのに必要な必須の試薬のすべて
を含んでいる。本発明の試験キットは、必要な試薬を入
れた１または２以上の容器の組み合わせとして、または
試薬の融和性の許す場合には組成物または混合物として
市販の包装形態で提供される。特に好ましいのは、本発
明の適当な蛍光トレーサー化合物、適当な抗体試薬、沈
殿試薬、および試料が全血試料である場合には上記可溶
化試薬からなる、シクロスポリンまたはシクロスポリン
とその代謝産物の蛍光偏光イムノアッセイ決定のための
試験キットである。本発明の試験キットには、もちろ
ん、緩衝液、希釈液、標準などの当該技術分野で知られ
商業上の使用者の観点から望ましい他の物質も含まれて
いてよいことを理解する必要がある。

【００４６】

【実施例】つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。実施例１ [Ｏ−(クロロオキサリル)ＭｅＢｍｔ]¹シクロスポリ
ン：シクロスポリン(３４.３ｍｇ、０.０２８５ミリモ
ル)およびジメチルアミノピリジン(３０.２ｍｇ、０.２
４７ミリモル)をオキサリルクロリド(１.０ｍｌ)中に０
℃にて溶解した。フラスコには撹拌棒および乾燥チュー
ブが備えてあり、反応混合物を氷浴上で３.５時間撹拌
した。この反応物を真空下で濃縮乾固した。この残渣を
乾燥ジメチルホルムアミド(１.０ｍｌ)中に取って０.０
３Ｍ溶液とし、つぎの反応に用いた。

【００４７】実施例２ [Ｏ−(フルオレセイン−５−イルアミノオキサリル)Ｍ
ｅＢｍｔ]¹シクロスポリン：実施例１に記載のＤＭＦ溶
液(０.３３ｍｌ、９.５μモル)を、撹拌棒を備えた栓付
きフラスコ中でフルオレセインアミン異性体Ｉ(５.２ｍ
ｇ、１５μモル)と混合した。みかけのｐＨが約４〜５
になるまで(湿ったｐＨ紙上に溶液をスポットすること
により決定)ピリジンを加えた。この反応混合物を室温
で３日間撹拌した。溶媒を真空除去し、残渣をメタノー
ル(０.５ｍｌ)中に取り、０.５ｍｍシリカゲルプレート
(２０ｃｍ×２０ｃｍ)に適用した。このプレートを１５
％メタノール／メチレンクロリド中で展開した。Ｒｆ＝
０.５の蛍光バンドをメタノールでシリカゲルから除
き、０.５ｍｍシリカゲルプレート(２０ｃｍ×２０ｃ
ｍ)上で再精製し、５％メタノール／メチレンクロリド
で２回溶出した。所望のバンド(Ｒｆ＝０.３７)をメタ
ノールでシリカゲルから除いた。

【００４８】実施例３ [Ｏ−(クロロホルミル)ＭｅＢｍｔ]¹シクロスポリン(シ
クロスポリンクロロホルメート)：シクロスポリン(２
４.２ｍｇ、０.０２０ミリモル)を、栓および撹拌棒を
備えた１０ｍｌ容丸底フラスコ中でベンゼン(２.０ｍ
ｌ)中のホスゲンの２５％ｗ／ｗ溶液中に溶解した。こ
の反応混合物を５分間撹拌してシクロスポリンを溶解
し、ついで室温で２４時間静置した。反応物を真空濃縮
し、生成物を固体として０℃にて６カ月まで貯蔵するこ
とができた。その後の反応のため、ＤＭＦ中の０.０２
Ｍ溶液を用いた。

【００４９】実施例４ [Ｏ−(フルオレセイン−４'−イルメチルアミノホルミ
ル)ＭｅＢｍｔ]¹シクロスポリン：実施例３に記載のＤ
ＭＦ中の０.０２Ｍ溶液としてのシクロスポリンクロロ
ホルメート(０.２ｍｌ、４μモル)を、撹拌棒を備えた
栓付きバイアル中で４'−アミノメチルフルオレセイン
塩酸塩(２.０ｍｇ、５μモル)と混合した。みかけのｐ
Ｈが約７となるまで(湿ったｐＨ紙による)ピリジンを加
えた。この反応混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒
を真空除去し、残渣をメタノール中に取り、１ｍｍシリ
カゲルプレート上に負荷した。このプレートを１５％メ
タノール／メチレンクロリドで展開した。生成物のバン
ド(Ｒｆ＝０.５５)をシリカゲルからメタノールで溶出
した。

【００５０】実施例５ [Ｏ−(フルオレセイン−５−イルメチルアミノホルミ
ル)ＭｅＢｍｔ]¹シクロスポリン：シクロスポリンクロ
ロホルメート(実施例３に記載した固体５ｍｇ、４.０μ
モル)を、撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で乾燥ＤＭ
Ｆ(１５０μＬ)中に溶解した。５−アミノメチルフルオ
レセイン塩酸塩(３.２ｍｇ、８μモル)およびトリエチ
ルアミン(２.２μｌ、１６μモル)を加え、この反応混
合物を室温２.５日撹拌した。溶媒を真空除去し、残渣
をメタノール中に取り、１ｍｍシリカゲルプレートに適
用し、１５％メタノール／メチレンクロリドで溶出し
た。Ｒｆ＝０.６４の蛍光バンドを単離し、シリカゲル
からメタノールで除いた。

【００５１】実施例６ [Ｏ−(クロロアセチル)ＭｅＢｍｔ]¹シクロスポリン：
撹拌棒および乾燥チューブを備えた丸底フラスコ中でシ
クロスポリン(１.０１ｇ、０.８４０ミリモル)をクロロ
アセチルクロリド(３.０ｍｌ)中に溶解した。ジメチル
アミノピリジン(１５２.４ｍｇ、１.２５ミリモル)を加
えた。この反応混合物を室温で２.５日撹拌した。泡立
ちが終わるまで固体ＮａＨＣＯ₃を少しずつ加えなが
ら、この反応溶液を冷(０℃)飽和ＮａＨＣＯ₃(１０ｍ
ｌ)中に注ぎ、約２時間撹拌した。この溶液をジエチル
エーテル(３×２０ｍｌ)で抽出した。コンバインしたエ
ーテル抽出物を０.１Ｎ ＨＣｌ(１×１０ｍｌ)、水(３
×１０ｍｌ)および飽和ＮａＣｌ溶液(１×１０ｍｌ)で
洗浄した。有機層を無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濾過し、
真空濃縮して黄色のガラス状残渣(１.０２ｇ)を得た。
この物質を、５％メタノール／メチレンクロリドを溶離
液として用い、シリカゲル(７５ｇ)上のフラッシュクロ
マトグラフィーにかけた。生成物を含有するフラクショ
ンをコンバインし、濃縮して標記化合物(０.５２ｇ、収
率４８％)を得た。高速原子衝撃質量分析により１２７
８に(Ｍ＋Ｈ)シグナルが示された。

【００５２】実施例７ [Ｏ−(アジドアセチル)ＭｅＢｍｔ]¹シクロスポリン：
撹拌棒および還流冷却器を備えた丸底フラスコ中で、
[Ｏ−(クロロアセチル)ＭｅＢｍｔ]¹シクロスポリン(１
０３.３ｍｇ、０.０８０８ミリモル)およびアジ化ナト
リウム(６.５ｍｇ、０.１０ミリモル)を混合した。ジメ
チルホルムアミド(１.０ｍｌ)および水(１滴)を加えた
(アジ化ナトリウムを溶解するため)。この反応混合物を
５０℃で一夜、ついで９０℃で１.５時間撹拌した。こ
の溶液をエーテル(２０ｍｌ)中に取り、水(３×１ｍｌ)
および飽和ＮａＣｌ溶液(１×５ｍｌ)で洗浄し、ＭｇＳ
Ｏ₄で乾燥し、濾過し、真空濃縮してわずかに黄色の固
体(９２.１ｍｇ、８８％)を得た。ＴＬＣ(シリカゲル、
５％メタノール／メチレンクロリド)により少量の不純
物が示された。ＩＲは２１００ｃｍ^-1でアジドの吸収を
示した。

【００５３】実施例８ [Ｏ−(グリシル)ＭｅＢｍｔ]¹シクロスポリン：１００
ｍｌ容のパール水素化容器中で[Ｏ−(アジドアセチル)
ＭｅＢｍｔ]¹シクロスポリン(４６.１ｍｇ、０.０３５
９ミリモル)を無水エタノール(５.０ｍｌ)中に溶解し
た。５％パラジウム／炭酸カルシウム(鉛で活性を減じ
たもの(poisoned))(３６.１ｍｇ、７８％ｗ／ｗ)、およ
びトリエチルアミン(１００μｌ)を加え、この反応混合
物をパール装置上、５０ｐｓｉＨ₂、室温にて振とうし
た。反応混合物を装置から取り、セライトパッドで濾過
した。セライトをさらにエタノールで洗浄した。コンバ
インした濾液および洗浄液を真空濃縮してＴＬＣ(シリ
カゲル、５％メタノール／メチレンクロリド、Ｒｆ＝
０.３および０.１８)により２つの成分からなる混合物
(４２ｍｇ)を得た。この混合物を、１ｍｍローターを用
い５％メタノール／メチレンクロリドで溶出してクロマ
トトロン[ハリソン・リサーチ(Harrison Research)、８
１０ モアナコート、パロアルト、ＣＡ]上で分離した。
純粋な生成物を含有するフラクションをコンバインして
Ｏ−(グリシル)シクロスポリン(２３.４ｍｇ、５２％収
率)を得た。ＦＡＢ ＭＳにより、所望の化合物に対して
(Ｍ＋Ｈ)⁺ １２５９および(Ｍ＋Ｎａ)⁺ １２７１が示さ
れた。

【００５４】実施例９ [Ｏ−(５−フルオレセイン−５−イルアミノ−３−クロ
ロトリアジニルグリシル)ＭｅＢｍｔ]¹シクロスポリ
ン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で[Ｏ−(グリシ
ル)ＭｅＢｍｔ]¹シクロスポリン(実施例８、５ｍｇ、４
μモル)をメタノール(８μｌ)中に溶解した。３,５−ジ
クロロトリアジニルアミノフルオレセイン異性体Ｉ(Ｄ
ＴＡＦ−Ｉ、４.０ｍｇ、８μモル)を加え、反応混合物
を室温で３.５日撹拌した。この溶液を１ｍｍシリカゲ
ルプレート上に負荷し、２０％メタノール／メチレンク
ロリドで展開した。Ｒｆ＝０.７５のバンドをメタノー
ルでシリカゲルから溶出し、５％メタノール／メチレン
クロリドで展開して１ｍｍシリカゲルプレート上で再精
製した。Ｒｆ＝０.３のバンドをメタノールでシリカゲ
ルから溶出した。

【００５５】実施例１０ [Ｏ−(５−フルオレセイン−６−イルアミノ−３−クロ
ロトリアジニルグリシル)ＭｅＢｍｔ]¹シクロスポリ
ン：ＤＴＡＦ−Ｉの代わりにジクロロトリアジニルアミ
ノフルオレセイン異性体ＩＩ(ＤＴＡＦ−ＩＩ)を用いる
他は実施例９に記載の手順に従った。この反応混合物を
１日撹拌した。第一の精製は２０％メタノール／メチレ
ンクロリド(Ｒｆ＝０.７０)で行い、第二の精製は１０
％メタノール／メチレンクロリド(Ｒｆ＝０.７１)で行
った。

【００５６】実施例１１ [Ｏ−(フルオレセイン−５−カルボキシグリシル)Ｍｅ
Ｂｍｔ]¹シクロスポリン：撹拌棒を備えた栓付きバイア
ル中に、[Ｏ−(グリシル)ＭｅＢｍｔ]¹シクロスポリン
(実施例８、５ｍｇ、４μモル)および５−カルボキシフ
ルオレセインのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
(３.０ｍｇ、８μモル)をジメチルホルムアミド(５０μ
ｌ)、トリエチルアミン(３.３μｌ、２４μモル)および
ジメチルアミノピリジン(５μモル)とともに入れた。こ
の反応混合物を室温で一夜撹拌した。揮発成分を真空除
去し、残渣をメタノール中に取り、１ｍｍシリカゲルプ
レート上に負荷した。プレートを２０％メタノール／メ
チレンクロリドで展開し、Ｒｆ＝０.６４のバンドをメ
タノールでシリカゲルから除いた。２×１０％メタノー
ル／メチレンクロリドを用いた分取薄層クロマトグラフ
ィーにより再精製してＲｆ＝０.４３の単一バンドを得
た。

【００５７】実施例１２ [Ｏ−(フルオレセイン−６−カルボキシグリシル)Ｍｅ
Ｂｍｔ]¹シクロスポリン：６−カルボキシフルオレセイ
ンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いた他
は実施例１１に記載の手順に従った。２０％メタノール
／メチレンクロリドで１回展開した後の所望のバンドの
Ｒｆは０.６５であり、２×１０％メタノール／メチレ
ンクロリドで第二の精製を行った後のＲｆは０.４であ
った。

【００５８】実施例１３ [Ｏ−(Ｎ−フルオレセイン−４'−イルメチルアセトア
ミドアミノホルミル)ＭｅＢｍｔ]¹シクロスポリン：Ｄ
ＭＦ中の溶液としてのシクロスポリンクロロホルメート
(実施例３、４μモル)を、撹拌棒を備えた栓付きバイア
ル中に４'−Ｎ−グリシルアミノメチルフルオレセイン
塩酸塩(２.４ｍｇ、５.３μモル)とともに入れた。みか
けのｐＨが約８になるまでピリジン(約１０滴)を加え
た。この反応混合物を室温で１日撹拌した。揮発成分を
真空除去し、残渣をメタノール中に取り、１ｍｍシリカ
ゲルプレート上に負荷した。プレートを１５％メタノー
ル／メチレンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０.５のバン
ドをメタノールでシリカゲルから溶出した。２０％メタ
ノール／メチレンクロリドを用いて再精製してＲｆ＝
０.６のバンドを得た。

【００５９】実施例１４ [Ｏ−(フルオレセイン−５−イルアミノホルミル)Ｍｅ
Ｂｍｔ]¹シクロスポリン：ＤＭＦ中の溶液としてのシク
ロスポリンクロロホルメート(実施例３、４μモル)を、
撹拌棒を備えた栓付きバイアル中にフルオレセインアミ
ン異性体Ｉ(６.２ｍｇ、１８μモル)とともに入れた。
みかけのｐＨが約７になるまでピリジンを加えた。この
反応混合物を室温で１日撹拌した。揮発成分を真空除去
し、残渣をメタノール中に取り、１ｍｍシリカゲルプレ
ート上に負荷した。プレートを１５％メタノール／メチ
レンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０.５７のバンドをメ
タノールでシリカゲルから溶出した。１０％メタノール
／メチレンクロリドを用いて再精製を行い、Ｒｆ＝０.
５のバンドを得た。

【００６０】実施例１５ [Ｏ−アセチルＴｈｒ]²シクロスポリン：[Ｔｈｒ]²シク
ロスポリン(シクロスポリンＣ；サンドスＡＧ、バーゼ
ル、スイスより入手；０.３０ｇ、０.２５ミリモル)
を、撹拌棒および乾燥チューブを備えた丸底フラスコ中
で乾燥ピリジン(１.０ｍｌ)中に溶解した。この溶液を
氷浴上で０°Ｃに冷却した。無水酢酸(２８μｌ、０.３
０ミリモル)を加え、氷浴を除いた。室温で３時間撹拌
した後、さらに無水酢酸(２８μｌ、０.６０ミリモル合
計)を加えた。この反応混合物を室温で一夜撹拌し、さ
らに無水酢酸(１０μｌ、合計０.７ミリモル)を加え
た。室温でさらに６時間撹拌した後、反応混合物をエー
テル(２５ｍｌ)中に取り、１.２Ｎ ＨＣｌ(２５ｍｌ)、
水(２５ｍｌ)および飽和ＮａＣｌ溶液(２５ｍｌ)で洗浄
した。有機層を無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濾過し、真空
濃縮した。残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂およびシクロヘキサン中に
取って痕跡量の酢酸を除いた。標記化合物を８２％の収
率(２５９ｍｇ)で得た。生成物の構造を２００ＭＨｚ
ＮＭＲで確認したところ、デルタ４.１５で３重線がな
く、デルタ５.６で二重線およびデルタ１.９で一重項が
出現した。

【００６１】実施例１６ [Ｏ−クロロカルボニルＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−アセチルＴｈ
ｒ]²シクロスポリン：きつく締めた栓および撹拌棒を備
えた丸底フラスコ中で、[Ｏ−アセチルＴｈｒ]²シクロ
スポリン(実施例１５、１７.３ｍｇ、１３.７μモル)を
ベンゼン中のホスゲンの２５％ｗ／ｗ溶液(１.０ｍｌ)
中に溶解した。５分間撹拌してペプチドを完全に溶解し
た後、反応液を室温で一夜静置した。揮発成分を真空除
去してホフホワイトの固体残渣を得た。

【００６２】実施例１７ [Ｏ−(フルオレセイン−４'−イルメチルアミノホルミ
ル)ＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−アセチルＴｈｒ]²シクロスポリ
ン：乾燥ピリジン(０.３ｍｌ)中の[Ｏ−クロロカルボニ
ルＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−アセチルＴｈｒ]²シクロスポリン
(実施例１６、４.６μモル)を、撹拌棒を備えた栓付き
バイアル中に４'−アミノメチルフルオレセイン塩酸塩
(５.５ｍｇ、１３.８μモル)とともに入れた。この反応
混合物を室温で３日間撹拌した。溶媒を真空除去し、残
渣をメタノール中に取り、１ｍｍシリカゲルプレート上
に負荷した。プレートを１５％メタノール／メチレンク
ロリドで展開した。生成物のバンド(Ｒｆ＝０.９５)を
メタノールでシリカゲルから溶出した。２×５％メタノ
ール／メチレンクロリドを用いて再精製して生成物をＲ
ｆ＝０.４の単一バンドとして得た。このバンドをメタ
ノールでシリカゲルから除いた。

【００６３】実施例１８ [Ｏ−(イミダゾール−１−イルカルボニル)Ｔｈｒ]²シ
クロスポリン：撹拌棒および乾燥チューブを備えた丸底
フラスコ中に[Ｔｈｒ]²シクロスポリン(１４.６ｍｇ、
１２.０μモル)を入れた。カルボニルジイミダゾール
(１４.８μモル)、ジメチルアミノピリジン(１４.５μ
モル)、ジメチルホルムアミド(４４μｌ)およびメチレ
ンクロリド(１２０μモル)を加えた。この反応混合物を
室温で２４時間撹拌した。揮発成分を除き、残渣を直ち
につぎの反応に用いた。

【００６４】実施例１９ [Ｏ−(フルオレセイン−４'−イルメチルアミノカルボ
ニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン：撹拌棒を備えた栓付き
バイアル中に、[Ｏ−(イミダゾール−１−イルカルボニ
ル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン(実施例１８、６μモル)お
よび４'−アミノメチルフルオレセイン塩酸塩(５.２ｍ
ｇ、１３μモル)を乾燥ジメチルホルムアミド(１００μ
Ｌ)とともに入れた。４−メチルモルホリン(３μｌ、２
７μモル)を加え、反応混合物を室温で一夜撹拌した。
揮発成分を除去し、残渣をメタノール中に取った。この
溶液を２つの０.５ｍｍシリカゲルプレート上で精製
し、これを１５％メタノール／メチレンクロリドで溶出
した。Ｒｆ＝０.９のバンドをメタノールでシリカゲル
から溶出して標記化合物を単離した。

【００６５】実施例２０ [Ｏ−(Ｎ−(Ｎ−(フルオレセイン−４'−イルメチル)カ
ルボキサミドメチル)カルボキサミドメチル)Ｔｈｒ]²シ
クロスポリン： (ａ)[Ｏ−(スクシンイミド−Ｎ−イルオキシカルボニル
メチル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン：撹拌棒および乾燥チ
ューブを備えた丸底フラスコ中で、[Ｏ−(カルボキシメ
チル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン(サンドスＡＧ、バーゼ
ル、スイスより入手；２０.３ｍｇ、１５.９μモル)お
よびＮ−ヒドロキシスクシンイミド(７.８ｍｇ、６７.
８μモル)を乾燥ジメチルホルムアミド(４００μｌ)中
に溶解した。１−エチル−１'−[(３'−ジメチルアミ
ノ)プロピル]カルボジイミド塩酸塩(９.２ｍｇ、４８μ
モル)を加え、反応混合物を室温で一夜撹拌した。この
反応溶液を精製することなくつぎの反応に用いた。

【００６６】(ｂ)[Ｏ−(Ｎ−(Ｎ−(フルオレセイン−
４'−イルメチル)カルボキサミドメチル)カルボキサミ
ドメチル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン：撹拌棒を備えた栓
付きバイアル中に、[Ｏ−(スクシンイミド−Ｎ−イルオ
キシカルボニルメチル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン(反応溶
液として、実施例２０工程(ａ)、４μモル)およびＮ−
グリシル−４'−アミノメチルフルオレセイン塩酸塩
(６.２μモル)を入れた。４−メチルモルホリン(２.０
μＬ、１８.２μモル)を加えた。この反応混合物を室温
で一夜撹拌した。揮発成分を高真空下で除去した。残渣
をメタノール中に取り、０.５ｍｍシリカゲルプレート
に適用し、１５％メタノール／メチレンクロリドで溶出
した。Ｒｆ＝０.９のバンドをメタノールでシリカゲル
から溶出し、５％メタノール／メチレンクロリドで溶出
して再精製した。Ｒｆ＝０.４５のバンドをメタノール
でシリカゲルから除いた。

【００６７】実施例２１ [Ｏ−(Ｎ−(フルオレセイン−４'−イルメチル)カルボ
キサミドメチル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン：撹拌棒を備
えた栓付きバイアル中に、[Ｏ−(スクシンイミド−Ｎ−
イルオキシカルボニルメチル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン
(反応溶液として、実施例２０、４μモル)および４'−
アミノメチルフルオレセイン塩酸塩(３.１ｍｇ、７.８
μモル)を入れた。４−メチルモルホリン(２.０μＬ、
１８.２μモル)を加えた。この反応混合物を室温で一夜
撹拌した。揮発成分を高真空下で除去した。残渣をメタ
ノール中に取り、０.５ｍｍシリカゲルプレートに適用
し、１５％メタノール／メチレンクロリドで溶出した。
Ｒｆ＝０.８のバンドをメタノールでシリカゲルから溶
出し、同様にして５％メタノール／メチレンクロリドで
溶出して再精製した。Ｒｆ＝０.５５のバンドをメタノ
ールでシリカゲルから除いた。

【００６８】実施例２２ [Ｏ−(Ｎ−メチル−Ｎ−(フルオレセイン−４−イルメ
チル)カルボキサミドメチル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン：
撹拌棒を備えた栓付きバイアル中に、[Ｏ−(スクシンイ
ミド−Ｎ−イルオキシカルボニルメチル)Ｔｈｒ]²シク
ロスポリン(反応溶液として、実施例２０、４μモル)お
よび４'−メチルアミノメチルフルオレセイン塩酸塩
(２.８ｍｇ、６.８μモル)を入れた。４−メチルモルホ
リン(２.０μＬ、１８.２μモル)を加えた。この反応混
合物を室温で一夜撹拌した。揮発成分を高真空下で除去
した。残渣をメタノール中に取り、０.５ｍｍシリカゲ
ルプレートに適用し、１５％メタノール／メチレンクロ
リドで溶出した。Ｒｆ＝０.９２のバンドをメタノール
でシリカゲルから溶出し、同様にして２×５％メタノー
ル／メチレンクロリドで溶出して再精製した。Ｒｆ＝
０.５０のバンドをメタノールでシリカゲルから除い
た。

【００６９】実施例２３ [Ｏ−(５−フルオレセイン−５−イルアミノ−３−クロ
ロトリアジニル−２−アミノエチル)Ｔｈｒ]²シクロス
ポリン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で、[Ｏ−(２
−アミノエチル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン(サンドスＡ
Ｇ、バーゼル、スイスより入手；５ｍｇ、４μモル)お
よびＤＴＡＦ−Ｉ(４ｍｇ、８μモル)をメタノール(６
０μＬ)中に溶解し、室温で一夜撹拌した。この溶液を
０.５ｍｍシリカゲルプレートに適用し、２０％メタノ
ール／メチレンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０.４６の
バンドをメタノールでシリカゲルから除き、２×５％メ
タノール／メチレンクロリドを用いて同様にして再精製
した。Ｒｆ＝０.５のバンドをメタノールでシリカゲル
から除いた。

【００７０】実施例２４ [Ｏ−(フルオレセイン−４'−イルメチルアミノスクシ
ニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン：[Ｏ−(スクシンイミド
−Ｎ−イルオキシスクシニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン
(サンドスＡＧ、バーゼル、スイスより入手；５ｍｇ、
３.５μモル)、４'−アミノメチルフルオレセイン塩酸
塩(２.９ｍｇ、７μモル)、ジメチルアミノピリジン
(６.５μモル)およびトリエチルアミン(１μＬ、７μモ
ル)を乾燥ジメチルホルムアミド(６５μＬ)中に入れ
た。この反応混合物を室温で２.５日撹拌した。溶媒を
真空除去し、残渣をメタノール中に取り、１ｍｍシリカ
ゲルプレートに適用した。プレートを１０％メタノール
／メチレンクロリドで溶出し、Ｒｆ＝０.８のバンドを
メタノールでシリカゲルから溶出した。このバンドを、
２×５％メタノール／メチレンクロリドおよび１×１０
％メタノール／メチレンクロリドを用いてプレートを展
開して同様にして再精製した。Ｒｆ＝０.７のバンドを
メタノールでシリカゲルから除いた。

【００７１】実施例２５ [Ｏ−(Ｎ−(フルオレセイン−４'−イルメチル)カルボ
キサミドメチルアミノスクシニル)Ｔｈｒ]²シクロスポ
リン：[Ｏ−(スクシンイミジルオキシスクシニル)Ｔｈ
ｒ]²シクロスポリン(サンドスＡＧ、バーゼル、スイス
より入手；５ｍｇ、３.５μモル)、４'−グリシルアミ
ノメチルフルオレセイン塩酸塩(２.９ｍｇ、７μモ
ル)、ジメチルアミノピリジン(３.５μモル)およびトリ
エチルアミン(１μＬ、７μモル)を乾燥ジメチルホルム
アミド(１００μＬ)中に入れた。この反応混合物を室温
で２.５日間撹拌した。溶媒を真空除去し、残渣をメタ
ノール中に取り、１ｍｍシリカゲルプレートに適用し
た。プレートを２０％メタノール／メチレンクロリドで
溶出し、Ｒｆ＝０.８５のバンドをメタノールでシリカ
ゲルから溶出した。このバンドを、１０％メタノール／
メチレンクロリドおよび１×２０％メタノール／メチレ
ンクロリドを用いてプレートを展開して同様にして再精
製した。Ｒｆ＝０.７５のバンドをメタノールでシリカ
ゲルから除いた。

【００７２】実施例２６ [Ｏ−(Ｎ−(フルオレセイン−６−イルカルボニルアミ
ノエチル)アミノスクシニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン： (ａ)[Ｏ−(Ｎ−(２−ＢＯＣ−アミノエチル)アミノスク
シニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン：[Ｏ−(スクシンイミ
ジルオキシスクシニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン(１５ｍ
ｇ、１０.７μモル)、モノ−ＢＯＣ−エチレンジアミン
(４.６ｍｇ、２８.７μモル)およびジメチルアミノピリ
ジン(２μモル)を乾燥ジメチルホルムアミド(１５０μ
Ｌ)中に入れた。この反応混合物を室温で一夜撹拌し
た。反応液をエーテル(２５ｍｌ)中に取り、水(４×１
０ｍｌ)および飽和ＮａＣｌ溶液(１×１０ｍｌ）で洗浄
した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、
濃縮した。高真空下に一夜置いた後、１ｍｍローターを
用い５％〜１０％メタノール／メチレンクロリドで溶出
して残渣をクロマトトロン上で精製した。純粋なフラク
ションをコンバインし、濃縮して標記化合物（１４.７
ｍｇ、１０μモル、９３％収率)を得た。ＦＡＢ ＭＳは
(Ｍ＋Ｈ)⁺１４６０を示した。

【００７３】(ｂ)[Ｏ−(Ｎ−(２−アミノエチル)アミノ
スクシニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン：[Ｏ−(Ｎ−(２−
ＢＯＣ−アミノエチル)アミノスクシニル)Ｔｈｒ]²シク
ロスポリン(実施例２６工程(ａ)；１４.７ｍｇ、１０μ
モル)を０°Ｃにてトリフルオロ酢酸(３００μｌ)中に
溶解し、この温度にて一夜撹拌した。この反応混合物を
ＮａＨＣＯ₃(０.５ｇ)および氷(１０ｇ)に注いだ。泡立
ちが終わった後、溶液をメチレンクロライド(３×２０
ｍｌ)で抽出した。有機抽出物をコンバインし、無水硫
酸ナトリウムで乾燥した。濾過し、濃縮して生成物(１
０.５ｇ)を得た。

【００７４】(ｃ)[Ｏ−(Ｎ−(フルオレセイン−６−イ
ルカルボニルアミノエチル)アミノスクシニル)Ｔｈｒ]²
シクロスポリン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で、
[Ｏ−(Ｎ−(２−アミノエチル)アミノスクシニル)Ｔｈ
ｒ]²シクロスポリンおよび６−(スクシンイミドオキシ
カルボニル)フルオレセイン[リサーチ・オーガニックス
(Research Organics)；２.３ｍｇ、４.９μモル]を乾燥
ジメチルホルムアミド(１００μｌ)中に入れた。４−メ
チルモルホリン(１滴)を加えてみかけのｐＨを７〜８と
した。この反応混合物を室温で一夜撹拌した。揮発成分
を真空除去し、残渣をメタノール中に取り、２〜０.５
ｍｍシリカゲルプレートに適用した。プレートを２×１
５％メタノール／メチレンクロリドで展開した。Ｒｆ＝
０.８のバンドをメタノールでシリカゲルから溶出して
標記化合物を得た。

【００７５】実施例２７ [Ｏ−(２−(３−クロロ−５−(フルオレセイン−５−イ
ルアミノ)トリアジン−１−イル)アミノエチルアミノス
クシニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン：撹拌棒を備えた栓
付きバイアル中で、[Ｏ−(Ｎ−(２−アミノエチル)アミ
ノスクシニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン(３.５ｍｇ、２
μモル)およびジクロロトリアジニルアミノフルオレセ
イン異性体Ｉ(ＤＴＡＦ−Ｉ；２.５ｍｇ、５μモル)を
メタノール(１００μＬ)中に入れた。この反応混合物を
室温で一夜撹拌し、ついで０.５ｍｍシリカゲルプレー
トに適用し、２×１５％メタノール／メチレンクロリド
で溶出した。Ｒｆ＝０.５のバンドをメタノールでシリ
カゲルから除いて標記化合物を得た。

【００７６】実施例２８ [Ｏ−(Ｎ−(フルオレセイン−４'−イルメチル)−Ｎ−
メチルアミノスクシニルポリ(オキシエチル)スクシニ
ル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン： (ａ)[Ｏ−(ポリ(オキシエチル)スクシニル)Ｔｈｒ]²シ
クロスポリン：撹拌棒および乾燥チューブを備えた丸底
フラスコ中で、[Ｏ−(スクシニル)Ｔｈｒ]²シクロスポ
リン(３５０ｍｇ、０.２６５ミリモル)をポリエチレン
グリコール(平均分子量 ２００ｇ／モル、８２.２ｍ
ｇ、約０.９１ミリモル)、Ｎ−エチル−Ｎ'−ジメチル
アミノプロピルカルボジイミド塩酸塩(９０.２ｍｇ、
０.４７１ミリモル)およびジメチルアミノピリジン(４
６.７ｍｇ、０.３８２ミリモル)とともに乾燥ＣＨ₂Ｃｌ
₂(０.５ｍｌ)中に溶解した。この反応混合物を室温で一
夜撹拌した。

【００７７】この溶液をエーテル(２０ｍｌ)中に取り、
０.１２Ｎ ＨＣｌ(２×５ｍｌ)、水(２×１０ｍｌ)、５
％ＮａＨＣＯ₃(２×５ｍｌ)、水(３×１０ｍｌ)および
飽和ＮａＣｌ溶液(１×５ｍｌ)で洗浄した。有機層を無
水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、濃縮して白色泡(２９
９.４ｍｇ)を得た。この生成物を、１ｍｍローターを用
い３％メタノール／メチレンクロリドで溶出してクロマ
トトロン上で精製した。純粋な生成物を含有するフラク
ションをコンバインし、濃縮して所望の生成物２４０.
６ｍｇ(６０％収率)を得た。ＦＡＢ ＭＳにより質量が
４４ずつ異なる４つの親イオンが得られた：(Ｍ＋Ｈ)⁺
１５３８、１４９４、１４５０、１４０６。

【００７８】(ｂ)[Ｏ−(ヒドロキシスクシニルポリ(オ
キシエチル)スクシニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン：撹拌
棒および乾燥チューブを備えた丸底フラスコ中で、[Ｏ
−(ポリ(オキシエチル)スクシニル)トレオニル]²シクロ
スポリン(実施例２８工程(ａ)；８３.８ｍｇ、５５.９
μモル)、無水コハク酸(８.９ｍｇ、８９μモル)および
ジメチルアミノピリジン(８０μモル)をＤＭＦ(１ｍｌ)
中に溶解した。この反応混合物を室温で一夜撹拌した。
この溶液をエーテル(２５ｍｌ)中に取り、０.１２Ｎ Ｈ
Ｃｌ(５ｍｌ)、水(３×５ｍｌ)および飽和ＮａＣｌ溶液
(１０ｍｌ)で洗浄した。有機層を無水ＭｇＳＯ₄で乾燥
し、濾過し、濃縮して標記化合物(６７.４ｍｇ、８６
％)を得た。

【００７９】(ｃ)[Ｏ−(Ｎ−(フルオレセイン−４'−イ
ルメチル)−Ｎ−メチルアミノスクシニルポリ(オキシエ
チル)スクシニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン：撹拌棒を備
えた栓付きバイアル中で、[Ｏ−(ヒドロキシスクシニル
ポリ(オキシエチル)スクシニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリ
ン(実施例２８工程(ｂ)；５ｍｇ、３.１μモル)、ジイ
ソプロピルカルボジイミド(０.５８μＬ、３.７μモ
ル)、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール(１.１ｍｇ、
７μモル)、トリエチルアミン(１.４μＬ、１０μモル)
および４'−メチルアミノメチルフルオレセイン(１.４
ｍｇ、３.７μモル)をＤＭＦ(１５０μＬ)中に入れた。
この反応混合物を室温にて一夜撹拌した。揮発成分を真
空除去し、残渣をメタノール中に取り、０.５ｍｍシリ
カゲルプレートに適用した。プレートを２０％メタノー
ル／メチレンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０.８のバン
ドから所望の化合物をメタノールで除いた。

【００８０】実施例２９ [ジヒドロＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−(フルオレセイン−４−イ
ルメチルアミノスクシニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン： (ａ)[ジヒドロＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−(スクシニル)Ｔｈｒ]²
シクロスポリン：上記手順に従い、ジヒドロシクロスポ
リンＣを無水コハク酸と反応させて標記化合物を得た。

【００８１】(ｂ)[ジヒドロＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−(Ｎ−フ
ルオレセイン−４'−イルメチルアミノスクシニル)Ｔｈ
ｒ]²シクロスポリン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル中
で、[ジヒドロＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−(スクシニル)Ｔｈｒ]²
シクロスポリン(０.８ｍｇ、０.６μモル)をジイソプロ
ピルカルボジイミド(０.２１μＬ、１.３μモル)、Ｎ−
ヒドロキシベンゾトリアゾール(０.３４ｍｇ、２.２μ
モル)、４'−アミノメチルフルオレセイン塩酸塩(０.５
４ｍｇ、１.３μモル)およびトリエチルアミン(０.４５
μＬ、３.３μモル)とともにＤＭＦ(５０μＬ)中に入れ
た。この反応混合物を室温にて一夜撹拌した。揮発成分
を真空除去し、残渣をメタノール中に取り、０.５ｍｍ
シリカゲルプレートに適用した。プレートを２０％メタ
ノール／メチレンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０.６１
のバンドを回収し、メタノールでシリカゲルから化合物
を除いた。２×１５％メタノール／メチレンクロリドを
用い同様にして再精製してＲｆ＝０.５の生成物バンド
を得た。この化合物をメタノールでシリカゲルから除い
て標記化合物を得た。

【００８２】実施例３０ [Ｏ−(フルオレセイン−４'−イルメチルアミノカルボ
ニル)−(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ]³シクロスポリン：撹拌棒お
よび乾燥チューブを備えた丸底フラスコ中で、[(Ｄ)−
ＭｅＳｅｒ]³シクロスポリン(１３.３ｍｇ、１０.８μ
モル)、１,１'−カルボニルジイミダゾール(１３μモ
ル)およびジメチルアミノピリジン(１３μモル)をＤＭ
Ｆ(０.５ｍｌ)中に入れた。この反応混合物を室温で２
４時間撹拌した。この反応混合物の１／３に４'−アミ
ノメチルフルオレセイン塩酸塩(３.６ｍｇ、９μモル)
および４−メチルモルホリン(２.０μＬ、１８.２μモ
ル)を加えた。湿ったｐＨ紙により、みかけのｐＨは８
〜９であった。この反応混合物を室温でさらに２４時間
撹拌した。揮発成分を真空除去し、残渣をメタノール中
に取り、１ｍｍシリカゲルプレートに適用した。プレー
トを１５％メタノール／メチレンクロリドで溶出した。
Ｒｆ＝０.６のバンドを除き、プレートからメタノール
で化合物を溶出し、得られた生成物を２×１０％メタノ
ール／メチレンクロリドを用い同様にして再精製した。
Ｒｆ＝０.７２のバンドを回収し、メタノールでシリカ
ゲルから除去して標記化合物を単離した。

【００８３】実施例３１ [Ｔｈｒ]²[Ｏ−(４'−フルオレセイン−４'−イルメチ
ルアミノカルボニル)−(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ]³シクロスポ
リン：撹拌棒および乾燥チューブを備えた丸底フラスコ
中で、[Ｔｈｒ]²[(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ]³シクロスポリン
(２８.５ｍｇ、２２.８μモル)、１,１'−カルボニルジ
イミダゾール(３.３ｍｇ、２０μモル)およびジメチル
アミノピリジン(１３μモル)をＤＭＦ(１５０μＬ)中に
入れた。この反応混合物を室温で２４時間撹拌した。こ
の反応混合物の１／５に４'−アミノメチルフルオレセ
イン塩酸塩(４.９ｍｇ、１２.３μモル)および４−メチ
ルモルホリン(１滴)を加えた。湿ったｐＨ紙により、み
かけのｐＨは８〜９であった。この反応混合物を室温で
さらに２４時間撹拌した。揮発成分を真空除去し、残渣
をメタノール中に取り、１ｍｍシリカゲルプレートに適
用した。プレートを１５％メタノール／メチレンクロリ
ドで溶出した。Ｒｆ＝０.５７のバンドを回収し、シリ
カゲルからメタノールで除くことにより標記化合物を単
離した。

【００８４】実施例３２ [(フルオレセイン−５−イルカルボニル)アミノＡｌａ]
⁸シクロスポリン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル中
で、[アミノＡｌａ]⁸シクロスポリン(サンドスＡＧ、バ
ーゼル、スイスより入手；３.０ｍｇ、２.５μモル)、
５−(スクシンイミドオキシカルボニル)フルオレセイン
(リサーチ・オーガニックス；３.１ｍｇ、６.５μモル)
および４−メチルモルホリン(２.０μＬ、１８μモル)
をＤＭＦ(１００μＬ)中に入れた。この反応混合物を室
温で２.５日撹拌した。揮発成分を真空除去し、残渣を
メタノール中に取り、０.５ｍｍシリカゲルプレートに
適用した。プレートを１５％メタノール／メチレンクロ
リドで溶出した。Ｒｆ＝０.４５のバンドを回収し、メ
タノールでシリカゲルから除くことにより標記化合物を
単離した。

【００８５】実施例３３ [ε−(Ｎ−(フルオレセイン−４'−イルメチル)カルボ
キサミドメチルアミノスクシニル)−(Ｄ)−Ｌｙｓ]⁸シ
クロスポリン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で、
[Ｎ−(スクシンイミドオキシスクシニル)−(Ｄ)−Ｌｙ
ｓ]⁸シクロスポリン(サンドスＡＧ、バーゼル、スイス
より入手；３.０ｍｇ、２.１μモル)および４'−グリシ
ルアミノメチルフルオレセイン(１.８ｍｇ、４.２μモ
ル)をジメチルアミノピリジン(５μモル)およびトリエ
チルアミン(８.４μモル)とともにＤＭＦ(５０μＬ)中
に入れた。この反応混合物を室温で一夜撹拌した。揮発
成分を真空除去し、残渣をメタノール中に取り、０.５
ｍｍシリカゲルプレートに適用した。プレートを２０％
メタノール／メチレンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０.
７０のバンドを回収し、メタノールでシリカゲルから除
くことにより標記化合物を単離した。

【００８６】実施例３４ [Ｏ−(Ｎ−(フルオレセイン−４'−イルメチル)−Ｎ−
プロピルアミノスクシニル)ＭｅＴｈｒ]¹⁰シクロスポリ
ン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で、[ＭｅＴｈｒ]
¹⁰シクロスポリン(サンドスＡＧ、バーゼル、スイスよ
り入手；２０ｍｇ、１７μモル)、無水コハク酸(２７.
３ｍｇ、０.２７３ミリモル)およびジメチルアミノピリ
ジン(１１.１ｍｇ、０.０９１ミリモル)をピリジン(２
５０μＬ)中に入れた。この反応混合物を４５°Ｃで３
日間撹拌した。反応物をエーテル(１０ｍｌ)中に取り、
１Ｎ ＨＣｌ(１０ｍｌ)で洗浄した。水性抽出物をエー
テル(５ｍｌ)で逆抽出した。有機抽出物をコンバイン
し、水(５ｍｌ)および飽和ＮａＣｌ溶液(５ｍｌ)で洗浄
し、ついで無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濾過し、濃縮し
て、出発物質およびビス−スクシニル誘導体がわずかに
混じった[Ｏ−(スクシニル)ＭｅＴｈｒ]¹⁰シクロスポリ
ン(１６ｍｇ)を得た。

【００８７】撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で、[Ｏ
−(スクシニル)ＭｅＴｈｒ]¹⁰シクロスポリン(４ｍｇ、
３.１μモル)をジシクロヘキシルカルボジイミド(６μ
モル)、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール(６μモ
ル)、４'−アミノメチルフルオレセイン塩酸塩(１２μ
モル)およびトリエチルアミン(３.１μモル)とともにＤ
ＭＦ(１００μＬ)中に入れた。この反応混合物を室温で
一夜撹拌した。揮発成分を真空除去し、残渣をメタノー
ル中に取り、０.５ｍｍシリカゲルプレートに適用し
た。プレートを１５％メタノール／メチレンクロリドで
溶出した。Ｒｆ＝０.５０のバンドを回収し、２×１０
％メタノール／メチレンクロリドを用いて同様にして再
精製した。Ｒｆ＝０.２のバンドを回収し、メタノール
でシリカゲルから除くことにより標記化合物を単離し
た。

【００８８】実施例３５ [Ｏ−アセチルＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−スクシニルＴｈｒ]²シ
クロスポリン：栓および撹拌棒を備えた丸底フラスコ中
で、[Ｏ−スクシニルＴｈｒ]²シクロスポリン(２０.８
ｍｇ、１５.８μモル)およびジメチルアミノピリジン
(３２.５ｍｇ、０.２６６ミリモル)を無水酢酸(０.５ｍ
ｌ、５.３ミリモル)中に入れた。この反応混合物を室温
で３日間撹拌した。この溶液を撹拌しながら０°Ｃの５
％ＮａＨＣＯ₃中に注ぎ、溶液のｐＨが約５となるまで
固体のＮａＨＣＯ₃を少しずつ加えた。この水性溶液を
酢酸エチルで３回抽出した。コンバインした有機層を水
および飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ついで無水ＭｇＳＯ
₄で乾燥させた。濾過し、濃縮して残渣を得、これをＣ
Ｈ₂Ｃｌ₂およびシクロヘキサンから再び濃縮して痕跡量
の酢酸を除いた。この生成物を、１ｍｍローターおよび
５〜１０％メタノール／メチレンクロリドを用いてクロ
マトトロン上で精製した。純粋な生成物を含有するフラ
クションをコンバインし、濃縮して標記化合物(１２.６
ｍｇ、９.３μモル、５８％収率)を得た。

【００８９】実施例３６ [Ｏ−アセチルＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−(フルオレセイン−４
−イルメチルアミノスクシニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリ
ン：[Ｏ−アセチルＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−スクシニルトレオ
ニル]²シクロスポリン(５ｍｇ、３.７μモル)を１−エ
チル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミ
ド塩酸塩(１.４ｍｇ、７.３μモル)およびＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド(１.０ｍｇ、８.７μモル)とともにメ
チレンクロリド(３７μＬ)中に入れ、室温で一夜撹拌し
た。この反応混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂(５ｍｌ)中に取り、水
(５ｍｌ)で洗浄した。ＣＨ₂Ｃｌ₂(５ｍｌ)で水層を逆抽
出し、コンバインした有機層を飽和ＮａＣｌ溶液(５ｍ
ｌ)で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濾過し、真空濃
縮した。

【００９０】ＤＭＦ(８７μＬ)中のトリエチルアミン
(１.０μＬ、７.４μモル)、ジメチルアミノピリジン
(５μモル)およびアミノメチルフルオレセイン塩酸塩
(２.３ｍｇ、５.５μモル)を加え、反応混合物を一夜撹
拌した。揮発成分を真空除去し、残渣をメタノール中に
取り、０.５ｍｍシリカゲルプレートに適用した。プレ
ートを２０％メタノール／メチレンクロリドで溶出し
た。Ｒｆ＝０.８３のバンドを回収し、メタノールでシ
リカゲルから所望の化合物を除いた。１×１０％メタノ
ール／メチレンクロリドを用い同様にして再精製してＲ
ｆ＝０.７４の生成物バンドを得た。この化合物をメタ
ノールでシリカゲルから除いて標記化合物を得た。

【００９１】実施例３７ [Ｏ−(クロロアセチル)ＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−スクシニルＴ
ｈｒ]²シクロスポリン：乾燥チューブおよび撹拌棒を備
えた丸底フラスコ中で、[Ｏ−スクシニルＴｈｒ]²シク
ロスポリン(１００.７ｍｇ、７６.４μモル)およびジメ
チルアミノピリジン(２３.１ｍｇ、０.１９ミリモル)を
クロロアセチルクロリド(１.０ｍｌ)中に入れた。この
反応混合物を４５°Ｃで一夜撹拌した。この溶液を室温
に冷却し、揮発成分を真空除去した。残渣をアセトン
(１ｍｌ)中に取り、０°Ｃで１ＭＮａＯＡｃ溶液(１ｍ
ｌ)で１時間処理して酸クロリドを加水分解した。この
溶液を酢酸エチル(２０ｍｌ)で抽出した。有機層を水
(２×５ｍｌ)および飽和ＮａＣｌ溶液(５ｍｌ)で洗浄
し、ついで無水ＭｇＳＯ₄で乾燥させた。濾過し、濃縮
して１０５.４ｍｇを得た。この生成物を、１ｍｍロー
ターおよび４.５％メタノール／０.５％酢酸／９５％メ
チレンクロリドを用いてクロマトトロン上で精製した。
純粋な生成物を含有するフラクションをコンバインし、
濃縮して標記化合物(５３.９ｍｇ、３８.６μモル、５
１％収率)を得た。

【００９２】実施例３８ [Ｏ−(クロロアセチル)ＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−(フルオレセ
イン−４'−イルメチルアミノスクシニル)Ｔｈｒ]²シク
ロスポリン：撹拌棒および乾燥チューブを備えた丸底フ
ラスコ中で、[Ｏ−(クロロアセチル)ＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−
スクシニルＴｈｒ]²シクロスポリン(１１.３ｍｇ、８.
１μモル)、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロ
ピル)カルボジイミド塩酸塩(３.４ｍｇ、１７.７μモ
ル)、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(３.２ｍｇ、２７.
８μモル)および４−メチルモルホリン(５μＬ、４５.
５μモル)をＤＭＦ(１.０ｍｌ)中に入れた。この反応混
合物を室温で一夜撹拌した。この溶液の１／３を４'−
アミノメチルフルオレセイン塩酸塩(２.２ｍｇ、５.３
μモル)と混合した。４−メチルモルホリンをさらに加
えて、みかけのｐＨを８〜９とした。この反応混合物を
室温で一夜撹拌した。揮発成分を真空除去し、残渣をメ
タノール中に取り、０.５ｍｍシリカゲルプレートに適
用した。プレートを１５％メタノール／メチレンクロリ
ドで溶出した。Ｒｆ＝０.９のバンドを回収し、メタノ
ールでシリカゲルから所望の化合物を除くことにより標
記化合物を得た。

【００９３】実施例３９ [Ｏ−(アジドアセチル)ＭｅＢｍｔ]^１[Ｏ−スクシニル
Ｔｈｒ]^２シクロスポリン： [Ｏ−(クロロアセチル)ＭｅＢｍｔ]^１[Ｏ−スクシニル
Ｔｈｒ]^２シクロスポリン(２７.０ｍｇ、１９.３μモ
ル)、アジ化ナトリウム(１２.７ｍｇ、０.１９２ミリモ
ル)およびＤＭＦ(１.０ｍｌ)を用い、実施例７の手順を
繰り返した。収量は１９.４ｍｇ、１３.８μモル、７２
％であった。

【００９４】実施例４０ [Ｏ−(アジドアセチル)ＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−(フルオレセ
イン−４'−イルメチルアミノスクシニル)Ｔｈｒ]²シク
ロスポリン：[Ｏ−(アジドアセチル)ＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−
スクシニルＴｈｒ]²シクロスポリン(１５.２ｍｇ、１
０.８μモル)、１−エチル−３−(３'−ジメチルアミノ
プロピル)カルボジイミド塩酸塩(５.８ｍｇ、３０.３μ
モル)、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(４.８ｍｇ、４
２μモル)、４−メチルモルホリン(４μＬ、３６.４μ
モル)および４'−アミノメチルフルオレセイン塩酸塩
(３.９ｍｇ、９.８μモル)を用い、実施例３７の手順を
繰り返した。Ｒｆ＝０.８７のバンドを回収し、所望の
化合物をメタノールでシリカゲルから除いた。同様にし
て再精製してＲｆ＝０.８５のバンドを得、これをメタ
ノールで溶出して標記化合物を得た。

【００９５】実施例４１ [(３−(Ｒ)−メチル−５−アリル−２−テトラヒドロフ
ラニル)サルコシル]¹[Ｔｈｒ]²シクロスポリン：Ｎ₂導
入口および撹拌棒を備えた丸底フラスコ中で、[Ｔｈｒ]
²シクロスポリン(５０ｍｇ、４１μモル)を乾燥ＣＨ₂Ｃ
ｌ₂(０.７ｍｌ)中に溶解し、ドライアイス／アセトン浴
で−７８°Ｃに冷却した。フェニルセレニルクロリド
(７.９ｍｇ、４１μモル)をＣＨ₂Ｃｌ₂(８０μｌ)中に
溶解し、上記冷ペプチド溶液に滴下した。この反応混合
物を−７８°Ｃで２５分間撹拌した。メタ−クロロ過安
息香酸(８.１ｍｇ、４７μモル)をＣＨ₂Ｃｌ₂(８０μ
ｌ)中に溶解し、上記反応液に滴下した。反応液を撹拌
しながらドライアイス／アセトン浴を室温にもっていっ
た。４時間後、反応液をＥｔＯＡｃ(１０ｍｌ)中に取
り、５％ＮａＨＣＯ₃(１０ｍｌ)、水(２×５ｍｌ)およ
び飽和ＮａＣｌ溶液(５ｍｌ)で洗浄した。有機層を無水
ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濾過し、濃縮した。得られた残渣
をフラッシュ−グレードシリカゲル(２５ｇ)上で５％メ
タノール／メチレンクロリドを用いてカラムを溶出して
精製した。純粋な生成物を含有するフラクションをコン
バインし、濃縮して標記化合物(３６.７ｍｇ、７３.６
％収率)を得た。

【００９６】実施例４２ [(３−(Ｒ)−メチル−５−アリル−２−テトラヒドロフ
ラニル)サルコシル]¹[(Ｏ−スクシニル)Ｔｈｒ]²シクロ
スポリン：撹拌棒および乾燥チューブを備えた丸底フラ
スコ中で、[(３−(Ｒ)−メチル−５−アリル−２−テト
ラヒドロフラニル)サルコシル]¹[Ｔｈｒ]²シクロスポリ
ン(３６.７ｍｇ、３０.２μモル)を無水コハク酸(３.３
ｍｇ、３３μモル)およびピリジン(４.６μｌ、６０.４
μモル)とともにＤＭＦ(１００μｌ)中に入れた。この
反応混合物を室温で４日間撹拌した。揮発成分を真空除
去し、残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂(１０ｍｌ)中に取り、水(５ｍ
ｌ)で洗浄した。水性層をＣＨ₂Ｃｌ₂(２×５ｍｌ)で逆
抽出した。コンバインした有機層を無水ＭｇＳＯ₄で乾
燥し、濾過し、濃縮して標記化合物(２０.０ｍｇ)を得
た。

【００９７】実施例４３ [(３−(Ｒ)−メチル−５−アリル−２−テトラヒドロフ
ラニル)サルコシル]¹[Ｏ−(フルオレセイン−４'−イル
メチルアミノスクシニル)Ｔｈｒ]²シクロスポリン：撹
拌棒および乾燥チューブを備えた丸底フラスコ中で、
[(３−(Ｒ)−メチル−５−アリル−２−テトラヒドロフ
ラニル)サルコシル]¹[Ｏ−スクシニルＴｈｒ]²シクロス
ポリン(１０ｍｇ、７.６μモル)、ジイソプロピルカル
ボジイミド(１.３μＬ、８.４μモル)、アミノメチルフ
ルオレセイン塩酸塩(３.３ｍｇ、８.４μモル)、トリエ
チルアミン(４.０μｌ、２８μモル)およびジメチルア
ミノピリジン(１０μモル)をＤＭＦ(１００μｌ)中に入
れた。この反応混合物を室温で一夜撹拌した。揮発成分
を真空除去し、残渣をメタノール中に取り、０.５ｍｍ
シリカゲルプレートに適用した。プレートを２０％メタ
ノール／メチレンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０.６４
のバンドを回収し、所望の化合物をメタノールでシリカ
ゲルから除いて標記化合物を得た。

【００９８】実施例４４ [Ｏ−(フルオレセイン−４'−イルメチルアミノホルミ
ル)ＭｅＢｍｔ]¹[Ｏ−ベンゾイルＳｅｒ]³シクロスポリ
ン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で、[Ｓｅｒ]²シ
クロスポリン(２０ｍｇ、１６μモル)をピリジン(２０
０μｌ)中に溶解した。ベンゾイルクロリド(２.１μ
ｌ、１８μモル)およびジメチルアミノピリジン(５ｍ
ｇ、４１μモル)を加えた。この反応混合物を４５°Ｃ
で２日間撹拌した。揮発成分を真空除去し、得られた粗
製の反応混合物を実施例３および４と同様にして処理し
た。揮発成分を真空除去し、残渣をメタノールに取り、
１ｍｍシリカゲルプレートに適用し、１×１５％メタノ
ール／メチレンクロリドで展開した。Ｒｆ＝０.６の蛍
光バンドをメタノールでシリカゲルから除き、プレート
を２×１０％メタノール／メチレンクロリドで展開して
同様にして再精製した。Ｒｆ＝０.３のバンドをメタノ
ールでシリカゲルから除いて標記化合物を得た。

【００９９】実施例４５ [Ｏ−アセチルＭｅＢｍｔ]^１[Ｏ−(フルオレセイン−
４'−イルメチル)カルボキシメチルＴｈｒ]^２シクロス
ポリン： [Ｏ−(カルボキシメチル)Ｔｈｒ]^１シクロスポリン(サ
ンドスＡＧ、バーゼル、スイスより入手；１０ｍｇ、８
μモル)を乾燥メチレンクロリド(２００μｌ)中に溶解
した。アセチルクロリド(１.７μｌ、２４μモル)を加
え、反応混合物を室温で２.５日間撹拌した。反応液を
メチレンクロリド(１ｍｌ)中に取り、１Ｎ ＨＣｌ(１ｍ
ｌ)および飽和ＮａＣｌ溶液(１ｍｌ)で洗浄し、無水Ｍ
ｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、濃縮して[Ｏ−アセチルＭ
ｅＢｍｔ]^１[Ｏ−(カルボキシメチル)Ｔｈｒ]^２シクロ
スポリンを得た。ついで、これを実施例２０工程(ａ)お
よび実施例２１と同様にして処理した。揮発成分を真空
除去し、残渣をメタノール中に取り、１ｍｍシリカゲル
プレートに適用し、１×１５％メタノール／メチレンク
ロリドで展開した。Ｒｆ＝０.６の蛍光バンドをメタノ
ールでシリカゲルから除いて標記化合物を得た。

【０１００】実施例４６ シクロスポリン血清および全血蛍光偏光イムノアッセ
イ：試薬 本発明の蛍光偏光イムノアッセイを行うための試薬を下
記のようにして調製した。 (ａ)シクロスポリントレーサー試薬：０.０１％(ｗ／
ｖ)ウシガンマグロブリン、０.１％(ｗ／ｖ)アジ化ナト
リウム、５.０％(ｗ／ｖ)エチレングリコールおよび０.
０５％(ｗ／ｖ)ツイーン^TM２０を含有する、０.１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.５)中のシクロスポリン
トレーサー化合物(実施例４に記載の方法に従って調製)
からなる６０ナノモルシクロスポリントレーサー試薬を
調製した。

【０１０１】(ｂ)モノクローナル抗体調製物：シクロス
ポリンに対するマウス(腹水)モノクローナル抗体(サン
ドスＡＧ、バーゼル、スイス)を、アジ化ナトリウムを
含有するクエン酸緩衝液中に希釈してモノクローナル抗
体試薬を調製した。 (ｃ)前処理試薬：０.１Ｍトリス^TM緩衝液(ｐＨ７.５)、
０.１％(ｗ／ｖ)アジ化ナトリウム、０.５％(ｗ／ｖ)硫
酸銅および１０.０％(ｗ／ｖ)５−スルホサリチル酸塩
からなる前処理試薬を調製した。

【０１０２】(ｄ)希釈緩衝液：０.１Ｍリン酸ナトリウ
ム(ｐＨ７.５)および０.１％(ｗ／ｖ)ウシガンマグロブ
リンからなる希釈緩衝液を調製した。 (ｅ)血清沈澱試薬：７０％(ｗ／ｖ)エチレングリコー
ル、２５％(ｗ／ｖ)メタノールおよび５−スルホサリチ
ル酸(０.５ｇ)を含有する水性希釈液中の１０ｍＭ硫酸
亜鉛からなる血清沈澱試薬を調製した。 (ｆ)全血沈澱試薬：６０ｍＭ硫酸亜鉛、５０％(ｗ／ｖ)
メタノールおよび３０％(ｗ／ｖ)エチレングリコールか
らなる全血沈澱試薬を調製した。

【０１０３】(ｇ)可溶化試薬：２.０％(ｗ／ｖ)タージ
トールミンフォーム(Tergitol min foam)^TM，２.０％
(ｗ／ｖ)サポニンおよび０.１％(ｗ／ｖ)アジ化ナトリ
ウムからなる可溶化試薬を調製した。 (ｈ)カリブレーター： (１)シクロスポリンおよび人工ヒト全血マトリックスか
らなるシクロスポリンモノクローナル全血カリブレータ
ーを調製した。これらカリブレーターは、保存剤として
アジ化ナトリウムを用い、０.０、１００、２５０、５
００、１０００および１５００ｎｇ／ｍｌの濃度で調製
した。 (２)シクロスポリンおよび血清マトリックスからなるシ
クロスポリンモノクローナル血清カリブレーターを調製
した。これらカリブレーターは、保存剤としてアジ化ナ
トリウムを用い、０.０、３０、６０、１２０、２４０
および４００ｎｇ／ｍｌの濃度で調製した。

【０１０４】(i)コントロール (１)シクロスポリンおよび人工ヒト全血マトリックスか
らなるシクロスポリンモノクローナル全血コントロール
を調製した。これらコントロールは、保存剤としてアジ
化ナトリウムを用い、１５０、４００および８００ｎｇ
／ｍｌの濃度で調製した。 (２)シクロスポリンおよび血清マトリックスからシクロ
スポリンモノクローナル血清コントロールを調製した。
これらコントロールは、保存剤としてアジ化ナノを用
い、４５、９０および３２０ｎｇ／ｍｌの濃度で調製し
た。

【０１０５】シクロスポリン血清ＦＰＩＡアッセイプロ
トコール アボットＴＤｘ^Rセラピューティックドラッグモニタリ
ングアナライザーを用い、血清試料中のシクロスポリン
を決定するための蛍光偏光イムノアッセイを以下のよう
にして行った。各５０μｌのシクロスポリン含有患者血
清試料、コントロールおよびカリブレーターを、ラベル
を付した遠心管にピペットで入れた。ピペットに空気泡
を除いた血清沈澱試薬を満たし、試薬を分配する間、各
遠心管の管壁にピペットの先端を接触させて各遠心管中
に１５０μｌを分配した。ついで、遠心管に蓋をし、回
転ミキサーで１０秒間混合し、遠心管が均等に分布し遠
心ヘッドが平衡を保つように遠心管を遠心ヘッド中に置
いた。透明な上澄み液および変性タンパク質の固くて密
なペレットが得られるまで９,５００×ｇで約３分間遠
心分離にかけた。遠心分離の完了後、各管の蓋を取り、
ＴＤｘサンプルカートリッジの対応試料ウエル中に上澄
み液をデカントした。好ましいＴＤｘアッセイ手順に従
ってアッセイを行うには１５０μｌの上澄み液が必要で
あるので、すべての上澄み液を回収するためサンプルカ
ートリッジの対応試料ウエルの縁で各試験管を軽くたた
いた。

【０１０６】各カリブレーター、コントロールおよび試
料の蛍光偏光値を決定し、アボットＴＤｘアナライザー
の出力テープにプリントした。非線形回帰分析を用いて
各カリブレーターの偏光(Ｐ)と各カリブレーターの濃度
をプロットすることにより標準曲線を装置中で作成し
た。その際、各コントロールおよび試料の濃度は用意し
てある検量曲線(図１)から読み取り、出力テープにプリ
ントした。

【０１０７】本発明の好ましい蛍光偏光アッセイの感度
は、１５.０ｎｇ／ｍｌのシクロスポリンおよび代謝産
物である。６０の臨床試料を用いた現在利用できるラジ
オイムノアッセイと比較したとき、線形最小二乗回帰分
析から０.９４７の傾き、７.１５の切片および０.９６
９の相関係数が得られた。

【０１０８】本発明による試験キットをＴＤｘアナライ
ザーと組み合わせて用いる場合は、本発明による蛍光偏
光イムノアッセイを行うための試薬はＴＤｘ試薬パック
の別のバイアル中に入れてよく、その際、試薬パック中
の各バイアルの蓋は除き試薬パック内部の所定のウエル
に置く。従って、いったん試薬パックをＴＤｘアナライ
ザーの内部に入れたら、あとのアッセイ手順は完全に自
動化される。

【０１０９】手動アッセイを行う場合は、試料をまず上
記沈澱試薬で処理し、ついで希釈緩衝液と混合する。つ
いで、試料を入れた試験管に抗体試薬および前処理溶液
を入れ、バックグラウンド蛍光を読み取る。ついで、ト
レーサー化合物および希釈緩衝液を試料に加え、インキ
ュベート後、蛍光偏光を読み取る。

【０１１０】シクロスポリン全血ＦＰＩＡアッセイプロ
トコール アボットＴＤｘ^Rセラピューティックドラッグアナライ
ザーを用い、全血試料中のシクロスポリンを決定するた
めの蛍光偏光イムノアッセイを以下のようにして行っ
た。各１５０μｌのシクロスポリン含有患者全血試料、
コントロールおよびカリブレーターを、ラベルを付した
遠心管にピペットで入れ、各管に可溶化試薬(５０μｌ)
を加えた。ピペットに空気泡を除いた全血沈澱試薬を満
たし、各遠心管の管壁にピペットの先端を接触させて各
遠心管中に３００μｌを分配した。ついで、遠心管に蓋
をし、回転ミキサーで１０秒間混合し、遠心管が均等に
分布し遠心ヘッドが平衡を保つように遠心管を遠心ヘッ
ド中に置いた。透明な上澄み液および変性タンパク質の
固くて密なペレットが得られるまで９,５００×ｇで約
３分間遠心分離にかけた。遠心分離の完了後、各管の蓋
を取り、ＴＤｘサンプルカートリッジの対応試料ウエル
中に上澄み液をデカントし、各カリブレーター、コント
ロールおよび試料の蛍光偏光値を決定し、アボットＴＤ
ｘアナライザーの出力テープにプリントした(上記参
照)。非線形回帰分析を用いて各カリブレーターの偏光
(Ｐ)と各カリブレーターの濃度をプロットすることによ
り標準曲線を装置中で作成した。その際、各コントロー
ルおよび試料の濃度は用意してある検量曲線(図２)から
読み取り、出力テープにプリントした。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のシクロスポリントレーサー化合物を
用いた蛍光偏光イムノアッセイにおいて、血清試料中の
シクロスポリンの量を決定する際に用いる検量曲線であ
る。

【図２】 本発明のシクロスポリントレーサー化合物を
用いた蛍光偏光イムノアッセイにおいて、全血試料中の
シクロスポリンの量を決定する際に用いる検量曲線であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スティーブン・イー・ルネッタ アメリカ合衆国60085イリノイ州ウォー クガン、ヒッコリー・ストリート1327番 (72)発明者 ビクトリア・ピー・ミューチ アメリカ合衆国イリノイ州シカゴ、ノー ス・ラセール1660番 アパートメント 311 (72)発明者 マリオラ・ビー・ザジャック アメリカ合衆国イリノイ州シカゴ、ノー ス・ハルステッド1660番 (72)発明者 エリザベス・エイ・シンプソン アメリカ合衆国イリノイ州スコーキー、 スコーキー・ブールバード9140番 (56)参考文献 特開 昭63−258491（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 7/64 G01N 33/53 - 33/542 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (15)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式： 【化７】 (式中、点線と実線が並列で表された結合は単結合また
   は二重結合、Ｆｌはカルボキシフルオレセインまたはフ
   ルオレセインアミンより選ばれた発光分子からの検出可
   能な残基、Ｘ_１は水素以外の原子数が１〜１５の連結
   基、Ｒ^１は水素、ＯＨまたはＯＣＯＲ_６(式中、Ｒ_６は
   炭素数１〜６のアルキル基またはＸ_１−Ｆｌである)で
   示される基である)で示されるシクロスポリン誘導体ま
   たはその塩。
2. 【請求項２】 式： 【化８】 (式中、点線と実線が並列で表された結合は単結合また
   は二重結合、Ｒ_７は水素または炭素数１〜６のアシル
   基、Ｒ_８は水素またはＣＨ_２ＯＲ_７(式中、Ｒ_７は前記
   と同じ)、Ｘ_２は水素以外の原子数が１〜３０の連結
   基、Ｆｌはカルボキシフルオレセインまたはフルオレセ
   インアミンより選ばれた発光分子からの検出可能な残基
   である)で示されるシクロスポリン誘導体またはその
   塩。
3. 【請求項３】 式： 【化９】 (式中、点線と実線が並列で表された結合は単結合また
   は二重結合、Ｒ_７は水素または炭素数１〜６のアシル
   基、Ｒ_９は水素またはＯＲ_７（式中、Ｒ_７は前記と同
   じ）、Ｘ_１は水素以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｆ
   ｌはカルボキシフルオレセインまたはフルオレセインア
   ミンより選ばれた発光分子からの検出可能な残基であ
   る)で示されるシクロスポリン誘導体またはその塩。
4. 【請求項４】 式： 【化１０】 (式中、点線と実線が並列で表された結合は単結合また
   は二重結合、Ｒ_７は水素または炭素数１〜６のアシル
   基、Ｘ_１は水素以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｆｌ
   はカルボキシフルオレセインまたはフルオレセインアミ
   ンより選ばれた発光分子からの検出可能な残基である)
   で示されるシクロスポリン誘導体またはその塩。
5. 【請求項５】 式： 【化１１】 (式中、点線と実線が並列で表された結合は単結合また
   は二重結合、Ｒ_７は水素または炭素数１〜６のアシル
   基、Ｘ_１は水素以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｆｌ
   はカルボキシフルオレセインまたはフルオレセインアミ
   ンより選ばれた発光分子からの検出可能な残基である)
   で示されるシクロスポリン誘導体またはその塩。
6. 【請求項６】 試料中のシクロスポリン、またはシクロ
   スポリンおよびシクロスポリンの代謝産物を決定する方
   法であって、 (ａ)該試料を式： 【化１８】 (式中、点線と実線が並列で表された結合は単結合また
   は二重結合、Ｆｌはカルボキシフルオレセインまたはフ
   ルオレセインアミンより選ばれた発光分子からの検出可
   能な残基、Ｘ_１は水素以外の原子数が１〜１５の連結
   基、Ｒ^１は水素、ＯＨまたはＯＣＯＲ_６(式中、Ｒ_６は
   炭素数１〜６のアルキル基またはＸ_１−Ｆｌである)で
   示される基である)で示されるシクロスポリン誘導体ま
   たはその塩、および (i)シクロスポリン、またはシクロスポリンおよびシク
   ロスポリンの代謝産物、および(ii)該シクロスポリン誘
   導体、に結合して反応溶液を生成し得る抗体であって、
   該シクロスポリン誘導体が該抗体の存在に対して検出可
   能な蛍光偏光応答を生成し得るもの、と接触させ、 (ｂ)該反応溶液に偏光平面を通して蛍光偏光応答を得、
   ついで (ｃ)該反応溶液に対する該蛍光偏光応答を、試料中に存
   在するシクロスポリンまたはシクロスポリンおよびシク
   ロスポリンの代謝産物の量の関数として検出することを
   特徴とする方法。
7. 【請求項７】 試料中のシクロスポリン、またはシクロ
   スポリンおよびシクロスポリンの代謝産物を決定する方
   法であって、 (ａ)該試料を式： 【化１９】 (式中、点線と実線が並列で表された結合は単結合また
   は二重結合、Ｒ_７は水素または炭素数１〜６のアシル
   基、Ｒ_８は水素またはＣＨ_２ＯＲ_７(式中、Ｒ_７は前記
   と同じ)、Ｘ_２は水素以外の原子数が１〜３０の連結
   基、Ｆｌはカルボキシフルオレセインまたはフルオレセ
   インアミンより選ばれた発光分子からの検出可能な残基
   である)で示されるシクロスポリン誘導体またはその
   塩、および (i)シクロスポリン、またはシクロスポリンおよびシク
   ロスポリンの代謝産物、および(ii)該シクロスポリン誘
   導体、に結合して反応溶液を生成し得る抗体であって、
   該シクロスポリン誘導体が該抗体の存在に対して検出可
   能な蛍光偏光応答を生成し得るもの、と接触させ、 (ｂ)該反応溶液に偏光平面を通して蛍光偏光応答を得、
   ついで (ｃ)該反応溶液に対する該蛍光偏光応答を、試料中に存
   在するシクロスポリンまたはシクロスポリンおよびシク
   ロスポリンの代謝産物の量の関数として検出することを
   特徴とする方法。
8. 【請求項８】 試料中のシクロスポリン、またはシクロ
   スポリンおよびシクロスポリンの代謝産物を決定する方
   法であって、 (ａ)該試料を式： 【化２０】 (式中、点線と実線が並列で表された結合は単結合また
   は二重結合、Ｒ_７は水素または炭素数１〜６のアシル
   基、Ｒ_９は水素またはＯＲ_７（式中、Ｒ_７は前記と同
   じ）、Ｘ_１は水素以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｆ
   ｌはカルボキシフルオレセインまたはフルオレセインア
   ミンより選ばれた発光分子からの検出可能な残基であ
   る)で示されるシクロスポリン誘導体またはその塩、お
   よび(i)シクロスポリン、またはシクロスポリンおよび
   シクロスポリンの代謝産物、および(ii)該シクロスポリ
   ン誘導体、に結合して反応溶液を生成し得る抗体であっ
   て、該シクロスポリン誘導体が該抗体の存在に対して検
   出可能な蛍光偏光応答を生成し得るもの、と接触させ、 (ｂ)該反応溶液に偏光平面を通して蛍光偏光応答を得、
   ついで (ｃ)該反応溶液に対する該蛍光偏光応答を、試料中に存
   在するシクロスポリンまたはシクロスポリンおよびシク
   ロスポリンの代謝産物の量の関数として検出することを
   特徴とする方法。
9. 【請求項９】 試料中のシクロスポリン、またはシクロ
   スポリンおよびシクロスポリンの代謝産物を決定する方
   法であって、 (ａ)該試料を式： 【化２１】 (式中、点線と実線が並列で表された結合は単結合また
   は二重結合、Ｒ_７は水素または炭素数１〜６のアシル
   基、Ｘ_１は水素以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｆｌ
   はカルボキシフルオレセインまたはフルオレセインアミ
   ンより選ばれた発光分子からの検出可能な残基である)
   で示されるシクロスポリン誘導体またはその塩、および (i)シクロスポリン、またはシクロスポリンおよびシク
   ロスポリンの代謝産物、および(ii)該シクロスポリン誘
   導体、に結合して反応溶液を生成し得る抗体であって、
   該シクロスポリン誘導体が該抗体の存在に対して検出可
   能な蛍光偏光応答を生成し得るもの、と接触させ、 (ｂ)該反応溶液に偏光平面を通して蛍光偏光応答を得、
   ついで (ｃ)該反応溶液に対する該蛍光偏光応答を、試料中に存
   在するシクロスポリンまたはシクロスポリンおよびシク
   ロスポリンの代謝産物の量の関数として検出することを
   特徴とする方法。
10. 【請求項１０】 試料中のシクロスポリン、またはシク
    ロスポリンおよびシクロスポリンの代謝産物を決定する
    方法であって、 (ａ)該試料を式： 【化２２】 (式中、点線と実線が並列で表された結合は単結合また
    は二重結合、Ｒ_７は水素または炭素数１〜６のアシル
    基、Ｘ_１は水素以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｆｌ
    はカルボキシフルオレセインまたはフルオレセインアミ
    ンより選ばれた発光分子からの検出可能な残基である)
    で示されるシクロスポリン誘導体またはその塩、および
    (i)シクロスポリン、またはシクロスポリンおよびシク
    ロスポリンの代謝産物、および(ii)該シクロスポリン誘
    導体、に結合して反応溶液を生成し得る抗体であって、
    該シクロスポリン誘導体が該抗体の存在に対して検出可
    能な蛍光偏光応答を生成し得るもの、と接触させ、 (ｂ)該反応溶液に偏光平面を通して蛍光偏光応答を得、
    ついで (ｃ)該反応溶液に対する該蛍光偏光応答を、試料中に存
    在するシクロスポリンまたはシクロスポリンおよびシク
    ロスポリンの代謝産物の量の関数として検出することを
    特徴とする方法。
11. 【請求項１１】 生物学的試料中のシクロスポリン、ま
    たはシクロスポリンおよびシクロスポリンの代謝産物の
    量を決定するための蛍光偏光イムノアッセイに使用する
    試験キットであって、 (ａ)式： 【化２３】 (式中、点線と実線が並列で表された結合は単結合また
    は二重結合、Ｆｌはカルボキシフルオレセインまたはフ
    ルオレセインアミンより選ばれた発光分子からの検出可
    能な残基、Ｘ_１は水素以外の原子数が１〜１５の連結
    基、Ｒ_１は水素、ＯＨまたはＯＣＯＲ_６(式中、Ｒ_６は
    炭素数１〜６のアルキル基またはＸ_１−Ｆｌである)で
    示される基である)で示されるシクロスポリン誘導体、
    および(ｂ)(i)シクロスポリン、またはシクロスポリン
    およびシクロスポリンの代謝産物、および(ii)該シクロ
    スポリン誘導体、に結合して反応溶液を生成し得る抗体
    であって、該シクロスポリン誘導体が該抗体の存在に対
    して検出可能な蛍光偏光応答を生成し得るものからなる
    ことを特徴とする試験キット。
12. 【請求項１２】 さらに沈殿試薬を含む、請求項１１に
    記載の試験キット。
13. 【請求項１３】 該沈殿試薬が、メタノール、エチレン
    グリコールおよび硫酸亜鉛を含む、請求項１２に記載の
    試験キット。
14. 【請求項１４】 さらに可溶化試薬を含む、請求項１１
    に記載の試験キット。
15. 【請求項１５】 該可溶化試薬が、アルキルオキシ(ポ
    リエチレンオキシプロピレンオキシ)イソプロパノール
    を含む、請求項１４に記載の試験キット。