JPH04253999A - シクロスポリンの定量のためのイムノアッセイ試薬および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料中のシクロスポリ
ンの存在または量を決定するための試薬に関する。さら
に詳しくは、試料中のシクロスポリンおよびシクロスポ
リンの代謝産物の存在または量を検出するためのイムノ
アッセイ、とりわけ蛍光偏光イムノアッセイに使用する
検出可能なトレーサー化合物に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】シク
ロスポリンは真菌由来の環状ウンデカペプチドであり［
米国特許第４，１１７，１１８号；リューガー（Ｒｕｅ
ｇｇｅｒ）ら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ　ＣｈｉｍｉｃａＡ
ｃｔａ、Ｖｏｌ．５９（４）、１０７５〜１０９２頁（
１９７６）；米国特許第４，２８９，８５１号；および
トレーバー（Ｔｒａｂｅｒ）ら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ　
Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ、Ｖｏｌ．６０（４）、１２
４７〜１２５５頁（１９７７）およびＶｏｌ．６５（５
）、１６５５〜１６７７（１９８２）］、ヒトにおける
腎臓、心臓、骨髄および肝臓などの移植臓器の拒絶を防
ぐための強力な免疫抑制剤として一般に用いられている
。シクロスポリンの有効性はまた、乾せん、結膜炎、関
節炎、腎炎および自己免疫疾患などの病的状態の治療に
おいても探求されている［ドネリー（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ
）ら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇ　Ｍｏｎｉｔ
ｏｒｉｎｇ、Ｖｏｌ．１１（６）、６９６〜７００頁（
１９８９）］。

【０００３】移植臓器の拒絶を防ぐため、あるレベルの
シクロスポリンを血流中に維持する必要があるが、該薬
物の高血中レベルまたは長期の使用により腎毒性、肝細
胞毒性その他の副作用が生じる。さらに、シクロスポリ
ンの分布および代謝は個々の個体間で大きく異なるばか
りでなく、同一個体においても治療経過で異なる。従っ
て、適切な患者管理のため、全血、血漿および血清など
の生物学的試料中のシクロスポリンの濃度またはレベル
をモニターする必要がある［バーチャート（Ｂｕｒｃｈ
ａｒｔ）ら、Ｄｒｕｇ　Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ　ａ
ｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｖｏｌ．
２０、６４９〜６５２頁（１９８６）およびショー（Ｓ
ｈａｗ）ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
Ｖｏｌ．３３（７）、１２６９〜１２８８頁（１９８７
）］。

【０００４】しかしながら、血液、血漿および血清中の
シクロスポリンの測定はシクロスポリンの代謝産物が存
在するために複雑であり［モーラー（Ｍａｕｒｅｒ）ら
、Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｄｉｓｐ
ｏｓｉｔｉｏｎ、Ｖｏｌ．１２（１０）、１２０〜１２
６頁（１９８４）］、これら代謝産物の毒性、免疫抑制
作用、および相乗作用が研究されている［ディンザンス
（Ｄｉｎｄｚａｎｓ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉ
ｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、Ｖｏｌ．１９（４）、
３４９０〜３４９３頁（１９８７）；イー（Ｙｅｅ）ら
、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．，Ｖｏｌ．１８、
７７４〜７７６頁（１９８６）；およびライフェル（Ｒ
ｙｆｆｅｌ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．，
Ｖｏｌ．２０（補遺２）、５７５〜５８４頁（１９８８
）］。シクロスポリンをその代謝産物とは独立に測定す
ることが望ましいが、親薬物とともにその代謝産物をも
測定するアッセイに対する必要性も存在する［ドネリー
ら、上記文献］。環がなお完全であることが同定された
シクロスポリンの代謝産物は、該親化合物の水酸化およ
びメチル化の結果得られたものである［モーラーら、Ｄ
ｒｕｇ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｄｉｐｏｓｉ
ｔｉｏｎ、１２（１）、１２０〜１２６頁（１９８４）
］。シクロスポリンおよびその幾つかの主要な代謝産物
の構造は下記式：

【化２４】 で示される。

【０００５】シクロスポリンの構造はまた下記式：

【化
２５】 （式中、「ＭｅＢｍｔ」はＮ−メチル−（４Ｒ）−４−
ブト−２Ｅ−エン−１−イル４−メチル−（Ｌ）−トレ
オニン残基、「ＭｅＶａｌ」は（Ｎ）−メチル−（Ｌ）
−バリン残基、「ＭｅＬｅｕ」は（Ｎ）−メチル−（Ｌ
）−ロイシン残基、「Ｄ−Ａｌａ」はＤ−アラニン残基
、「Ａｌａ」はＬ−アラニン残基、「Ｖａｌ」はＬ−バ
リン残基、「Ａｂｕ」はＬ−（α）−アミノ酪酸残基、
「Ｓａｒ」はサルコシン（Ｎ−メチルグリシンとしても
知られる）残基である）によっても表される。本明細書
において「残基」なる語はペプチド中に認められるアミ
ノ酸の縮合形を意味し、α−アミノ酸の立体配置は特に
Ｄ−配置であると断らない限りＬ−配置である。本明細
書においても、シクロスポリン（すなわち、シクロスポ
リンＡ）の構造を言及することによるシクロスポリン類
似体の通常の命名法が定められる。すなわち、まずシク
ロスポリン中に存在する残基とは異なる残基を指摘し、
ついでシクロスポリン中に存在する残基と同一である残
りの残基を特徴付けるため「シクロスポリン」の語を適
用する。それゆえ、［Ｔｈｒ］２シクロスポリンといっ
た場合、これはシクロスポリンの２位のアミノ酸残基が
トレオニンであるシクロスポリン、すなわちシクロスポ
リンＣを意味する。

【０００６】全血、血漿および血清中のシクロスポリン
レベルは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）［
レンズマイヤー（Ｌｅｎｓｍｅｙｅｒ）ら、Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．３１（２）、１
９６〜２０１頁（１９８５）］、３Ｈ［ドナッチ（Ｄｏ
ｎａｔｓｃｈ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２（１）、１９〜３２頁（１９８１
）］または１２５Ｉ［米国特許第４，７２７，０３５号
およびマホニー（Ｍａｈｏｎｅｙ）ら、Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．３１（３）４５９〜
４６２頁（１９８５）］を利用したラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（米国特許第４，７
２７，０３５号）、および蛍光偏光イムノアッセイ（Ｆ
ＰＩＡ）［マーティー（Ｍａｒｔｙ）ら、Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、Ｖｏｌ．２２（１３＆１４
）、２７１７〜２７３６頁（１９８９）およびヨーロッ
パ特許出願公開第２８３，８０１号］により測定されて
いる。

【０００７】シクロスポリンの代謝産物は上記ＨＰＬＣ
法によりシクロスポリン自体から区別することができる
が、ＨＰＬＣ法は時間と労力がかかり、大量の試料調製
物が必要であり、アッセイを行うのに少なくとも３０分
の時間がかかる。同様に、ＲＩＡ法も放射性物質を使用
することにより特別の貯蔵、取り扱いおよび廃棄が必要
であるという欠点を有し、アッセイを行うには最小限２
時間が必要とされる。

【０００８】蛍光偏光イムノアッセイ法は、特に使用が
容易であるという点で上記方法よりも優れているが、市
販のポリクローナル抗体イムノアッセイ法は代謝産物と
対したときにシクロスポリンに対する特異性を欠いてい
る。この点でイムノアッセイ法の特異性は、使用した抗
体の種類、および該抗体のシクロスポリン、シクロスポ
リンの代謝産物および標識シクロスポリンに対する相対
的な親和性に依存する。最近になって、代謝産物と対し
てもシクロスポリンに特異的なモノクローナル抗体が記
載されており［ケスニオー（Ｑｕｅｓｎｉａｕｘ）ら、
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、Ｖｏｌ．３３
（１）、３２〜３７頁（１９８７）、およびＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２４（１１
）、１１５９〜１１６８頁（１９８７）］、これら抗体
を用いたＲＩＡアッセイ法はＨＰＬＣ法と良好な相関を
有することがわかった。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、シクロスポリ
ンまたはシクロスポリンとその代謝産物を検出するため
のイムノアッセイ法、特に蛍光偏光イムノアッセイ法に
特に有用な試薬を提供することにより、上記ＨＰＬＣ法
およびＲＩＡ法の欠点を克服するものである。さらに、
本発明は、試料中のシクロスポリンまたはシクロスポリ
ンとその代謝産物を検出するために、特異的抗体または
非特異的抗体のいずれかを用いた、イムノアッセイ法、
特に蛍光偏光イムノアッセイ法に使用する新規トレーサ
ー化合物を提供することにより、これまでに記載された
シクロスポリンのためのイムノアッセイ法に対して進歩
をもたらすものである。

【００１０】本発明は、試料中のシクロスポリンまたは
シクロスポリンとその代謝産物の存在または量を決定す
るためのイムノアッセイにおいてトレーサー化合物とし
て使用するための、シクロスポリンまたはシクロスポリ
ン類似体を検出可能な残基で標識してなる新規シクロス
ポリン誘導体に関する。該検出可能な残基はフルオレセ
インまたはフルオレセイン誘導体であるのが好ましく、
かくして得られる蛍光トレーサー化合物は蛍光偏光イム
ノアッセイを行うのに特に有用である。

【００１１】本発明のシクロスポリン誘導体は、シクロ
スポリンの第一位に認められるアミノ酸残基（Ｎ−メチ
ル−（４Ｒ）−４−ブト−２Ｅ−エン−１−イル−メチ
ル−Ｌ−トレオニン残基）、シクロスポリンの第二位に
認められるアミノ酸残基（Ｌ−α−アミノ酪酸残基）、
シクロスポリンの第三位に認められるアミノ酸残基（Ｎ
−メチルグリシン残基）、シクロスポリンの第八位に認
められるアミノ酸残基（Ｄ−アラニン残基）またはシク
ロスポリンの第十位に認められるアミノ酸残基（Ｎ−メ
チル−Ｌ−ロイシン残基）において検出可能な残基がシ
クロスポリンまたはシクロスポリン誘導体にカップリン
グしたものである。

【００１２】本発明のシクロスポリン誘導体は、式：

【
化２６】 （式中、Ｒ１は式：

【化２７】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ２は式：

【化２８】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ３は式：

【化２９】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ４は式：

【化３０】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ５は式：

【化３１】 で示されるアミノ酸残基；Ｚは検出可能なシグナルを生
成し得る検出可能な残基；

【００１３】ただし、Ｒ１が「化２７」である場合、Ｘ
１は水素以外の原子数が１〜２０の連結基であり、Ｒ２
は（Ｌ）−α−アミノ酪酸残基または（Ｌ）−トレオニ
ン残基、または（Ｌ）−トレオニン残基において水酸基
が炭素数１〜１０のアシル基もしくはフルオレセイニル
基でアシル化されているものであり、Ｒ３はサルコシン
残基、または（Ｄ）−セリン残基であり、Ｒ４は（Ｄ）
−アラニン残基であり、Ｒ５はＮ−メチル−（Ｌ）−ロ
イシン残基であり、Ｒ２が「化２８」である場合、Ｘ２
は水素以外の原子数が１〜３０の連結基であり、Ｒ１は
ＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、ＭｅＢｍｔの環化
誘導体、または水酸基が炭素数１〜１０のアシル基また
はフルオレセイニル残基でアシル化されたＭｅＢｍｔの
誘導体であり、Ｒ３はサルコシン残基、（Ｄ）−セリン
残基、または（Ｄ）−セリン残基において水酸基が炭素
数１〜１０のアシル基でアシル化されたものであり、Ｒ
４は（Ｄ）−アラニン残基であり、Ｒ５は（Ｎ）−メチ
ル−（Ｌ）−ロイシン残基であり、

【００１４】Ｒ３が「化２９」である場合は、Ｘ１は水
素以外の原子数が１〜２０の連結基であり、Ｒ１はＭｅ
Ｂｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、ＭｅＢｍｔの環化誘導
体、または水酸基が炭素数１〜２０のアシル基でアシル
化されたＭｅＢｍｔの誘導体であり、Ｒ４は（Ｄ）−ア
ラニン残基であり、Ｒ５は（Ｎ）−メチル−（Ｌ）−ロ
イシン残基であり、Ｒ４が「化３０」である場合は、Ｘ
１は水素以外の原子数が１〜２０の連結基であり、Ｒ１
はＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、ＭｅＢｍｔの環
化誘導体、または水酸基が炭素数１〜１０のアシル基で
アシル化されたＭｅＢｍｔの誘導体であり、Ｒ２は（Ｌ
）−α−アミノ酪酸残基または（Ｌ）−トレオニン残基
、または（Ｌ）−トレオニン残基において水酸基が炭素
数１〜１０のアシル基でアシル化されたものであり、Ｒ
５は（Ｎ）−メチル−（Ｌ）−ロイシン残基であり、

【００１５】Ｒ５が「化３１」である場合は、Ｘ１は水
素以外の原子数が１〜２０の連結基であり、Ｒ１はＭｅ
Ｂｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、ＭｅＢｍｔの環化誘導
体、または水酸基が炭素数１〜１０のアシル基でアシル
化されたものであり、Ｒ２は（Ｌ）−α−アミノ酪酸残
基または（Ｌ）−トレオニン残基、または（Ｌ）−トレ
オニン残基において水酸基が炭素数１〜１０のアシル基
でアシル化されたものであり、Ｒ４は（Ｄ）−アラニン
残基である）で示される化合物またはその塩である。

【００１６】本発明の好ましいシクロスポリン誘導体は
、式：

【化３２】 （式中、Ｆｌは蛍光残基、Ｘ１は水素以外の原子数が１
〜１５の連結基、Ｒ１は水素、ＯＨまたはＯＣＯＲ６（
式中、Ｒ６は炭素数１〜６のアルキル基またはＸ１−Ｆ
ｌである）で示される基である）で示される化合物；お
よび式：

【化３３】 （式中、Ｒ７は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｒ
８は水素またはＣＨ２ＯＲ７（式中、Ｒ７は前記と同じ
）、Ｘ２は水素以外の原子数が１〜３０の連結基、Ｆｌ
は蛍光残基である）で示される化合物；および式：

【０
０１７】

【化３４】 （式中、Ｒ７は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｒ
９は水素またはＯＲ７、Ｘ１は水素以外の原子数が１〜
１５の連結基、Ｆｌは蛍光残基である）で示される化合
物；および式：

【化３５】 （式中、Ｒ７は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｘ
１は水素以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｆｌは蛍光
残基である）で示される化合物；および式：

【化３６】 （式中、Ｒ７は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｘ
１は水素以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｆｌは蛍光
残基である）で示される化合物である。本発明はまた、
上記シクロスポリントレーサー化合物を用いたアッセイ
法および試験キットをも提供する。

【００１８】本発明のシクロスポリントレーサー化合物
は、下記反応式：

【化３７】 （式中、Ｒはシクロスポリン残基、Ｘは水素以外の原子
数が１〜６の連結基、ＹはＣｌまたはＯＣＨ３、Ｚは検
出可能な残基、Ｒ’およびＲ”はアルキル基またはカル
ボジイミド中に一般に認められる官能化アルキル基であ
る）に従って調製する。

【００１９】たとえば、上記反応式（ｉ）によれば、遊
離の水酸基を有するシクロスポリンまたはその誘導体を
ベンゼンまたはトルエン中のホスゲン溶液で処理して中
間体のクロロホルメートを生成させる。別法として、同
様の中間体はカルボニルジイミダゾールを用いても生成
させることができる。ついで、このクロロホルメートを
、たとえばアミノ基で置換したフルオレセイン残基と反
応させてカルバメート結合を生成させる（下記実施例３
、４、５、１３、１４、１６、１７、１８および１９に
詳細に記載）。

【００２０】反応式（ｉｉ）によれば、遊離の水酸基を
有するシクロスポリンまたはその誘導体をオキサリルク
ロリドで処理して中間体のクロロオキサリルエステルを
生成させる。ついで、この中間体を、たとえばアミノ基
で置換したフルオレセイン残基で処理してアミド結合を
生成させる（下記実施例１および２に詳細に記載）。

【００２１】反応式（ｉｉｉ）によれば、遊離の水酸基
または遊離のアミノ基を有するシクロスポリンまたはそ
の誘導体を無水コハク酸で処理して中間体として酸の半
エステルまたは酸の半アミドを生成させる。かくして生
成した遊離のカルボン酸をカルボジイミドを用いて活性
化し、ついで、たとえばアミノ基で置換したフルオレセ
イン残基で処理してアミド結合を生成させるが、別法と
してＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルなどの
活性エステルの媒体を経て反応を進行させてもよい（下
記実施例１１、２０、２１、２２、２４、２５、２８、
２９、３３、３４、３６、３８、４０および４３に詳細
に記載）。

【００２２】反応式（ｉｖ）によれば、遊離のアミノ基
を有するシクロスポリンまたはその誘導体を塩基の存在
下、カルボキシフルオレセイン活性エステルで処理する
。このシクロスポリン誘導体とフルオレセイン残基とは
アミド結合で連結される（下記実施例１１、１２、２６
および３２に詳細に記載）。

【００２３】反応式（ｖ）によれば、アミノ基を有する
シクロスポリンまたはその誘導体をジクロロトリアジニ
ル基で置換したフルオレセイン残基で処理して窒素−炭
素結合を生成させる（下記実施例９、１０、２３および
２７に詳細に記載）。

【００２４】本発明のシクロスポリントレーサー化合物
の検出可能な残基成分は、当該技術分野で知られた種々
の検出可能な標識から選択され、たとえば化学発光分子
、発光分子、酵素などであってよいが、これらに限られ
るものではない。本発明では、フルオレセインおよびフ
ルオレセイン誘導体として知られている発光分子が好ま
しい。そのようなフルオレセイン誘導体としては、フル
オレセインアミン、カルボキシフルオレセイン、α−ヨ
ードアセトアミドフルオレセイン、４’−アミノメチル
フルオレセイン、４’−Ｎ−アルキルアミノメチルフル
オレセイン、５−アミノメチルフルオレセイン、６−ア
ミノメチルフルオレセイン、２，４−ジクロロ−１，３
，５−トリアジン−２−イル−アミノフルオレセイン（
ＤＴＡＦ）、４−クロロ−６−メトキシ−１，３，５−
トリアジン−２−イル−アミノフルオレセイン、および
フルオレセインイソチオシアネートなどが挙げられるが
、これらに限られるものではない。特に好ましいフルオ
レセイン誘導体は、アミノメチルフルオレセイン類、カ
ルボキシフルオレセイン類、およびフルオレセインアミ
ン類である。

【００２５】フルオレセインは、環境の酸濃度（ｐＨ）
に依存して２つの互変異体として存在する。開環形（酸
）ではフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体（ま
たは蛍光分子を含有するトレーサー）は、約４ナノ秒の
励起状態寿命の後、青色を吸収し緑色の蛍光を放射する
ことができる。開環形と閉環形とが共存するときは、開
環形分子と閉環形分子の相対濃度はｐＨレベルを調節す
ることにより容易に変えることができる。一般に、本発
明のシクロスポリントレーサー化合物は溶液中でナトリ
ウム、カリウム、アンモニウムなどの生物学的に許容し
得る塩として調製されるため、該化合物は蛍光形で存在
することができる。存在する特定の塩の種類は、ｐＨレ
ベルを調節するのに使用した緩衝液に依存する。たとえ
ば、リン酸ナトリウム緩衝液の存在下では本発明の化合
物は一般に開環形でナトリウム塩として存在する。従っ
て、本明細書において「フルオレセイン」なる語は、蛍
光の文脈で使用する場合は蛍光を生じるために開環形で
あることが必要であるから別として、特定の分子として
存在する場合は、個々の化合物としてかまたはトレーサ
ーの成分としてのいずれにおいても開環形と閉環形との
両方の互変異形を包含する。

【００２６】当業者には理解されるであろうように、蛍
光標識はそのサイズに従って選択するのが理想的である
、すなわち、分子が小さくなればなるほど一層速く回転
することができ、それゆえ蛍光偏光イムノアッセイトレ
ーサー化合物として一層有効になる。そのような化合物
は適当な波長の偏光で励起させたときに蛍光応答を生じ
、蛍光偏光測定を行うことができる。

【００２７】本発明のシクロスポリントレーサー化合物
は、当該技術分野で知られた通常のイムノアッセイ法を
用い、全血、血漿、脊髄液などの希釈または非希釈試料
中のシクロスポリンまたはシクロスポリンの代謝産物の
存在または量を決定するために使用することができる。 本発明の方法によれば、シクロスポリンまたはシクロス
ポリンとシクロスポリンの代謝産物を含有していると思
われる試料を本発明のシクロスポリントレーサー化合物
および、当該技術分野で知られた方法により調製した、
シクロスポリン、シクロスポリンの代謝産物およびシク
ロスポリン誘導体に対する適当な抗体と混合する。試料
中に存在するシクロスポリンとトレーサー化合物とは抗
体上の限られた数の結合部位に対して競合し、その結果
、シクロスポリン−抗体複合体およびトレーサー化合物
−抗体複合体が生成する。トレーサー化合物および抗体
の濃度を一定に保つことにより、トレーサー−抗体複合
体に対するシクロスポリン−抗体複合体の生成比は試料
中のシクロスポリンの量に正比例する。

【００２８】本発明のトレーサー化合物は、シクロスポ
リンを認識する抗体またはシクロスポリンとその代謝産
物を認識する抗体を用いたイムノアッセイ系において用
いることができる。シクロスポリンに対するモノクロー
ナル抗体およびポリクローナル抗体は記載されている［
ドナッチら、上記文献；ケスニオーら、上記文献および
ケスニオーら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．３１、１７３〜１８５
頁（１９８８）；ヨーロッパ特許出願公開第２８３，８
０１号；カカルノ（Ｃａｃａｌｎｏ）ら、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ、Ｖｏｌ．１１８（２）、２５７〜２６３頁（１９８
９）；および国際特許出願公開第ＷＯ　８６／０２０８
０号］。 従って、本明細書にいうシクロスポリンの決定は、試料
中に存在するかもしれないシクロスポリン代謝産物とは
独立のシクロスポリンの特異的な決定、またはシクロス
ポリンとその代謝産物の決定を包含し、これら決定はも
ちろんイムノアッセイ系に使用した特定の抗体に依存す
る。

【００２９】当業者には理解されるであろうように、抗
体の特異性は、一部は該抗体を産生させるのに使用した
免疫原の構造により決定される。分子量の小さい分析対
象物に対しては、当該技術分野で知られた方法に従い、
実験動物において適当な免疫応答を確実にするために該
分析対象物をタンパク質などの分子量の大きな担体に共
有結合によってカップリングすることにより免疫原を調
製する。担体に分析対象物を結合させる位置は、その部
位に対する抗体の認識が一般に低くなるようなものにす
る。

【００３０】本発明のトレーサー化合物を調製する場合
、誘導体化シクロスポリン分子に検出可能な残基を結合
させる位置およびそれらを結合させるリンカーの長さお
よび特性は、該トレーサー化合物と試料中に存在するシ
クロスポリンとの間で該抗体への結合に対して競合が起
こるように最適化すべきである。多くの場合、シクロス
ポリン分子上で抗体によってよく認識されない部位に検
出可能な残基を結合させることにより該抗体が該トレー
サー化合物に結合するようにすることが有利である。 一般に、免疫原を結合させる部位以外に抗体によってほ
とんど認識されない部位が存在するものである。従って
、リンカーアームの長さおよび特性を変えることにより
、トレーサー化合物への抗体の結合を最適化して所望の
結果を得ることができる。さらに、シクロスポリンのモ
ニターに有用であるために、分析対象物とトレーサー化
合物との間の競合は治療学的範囲レベルが互いに識別で
きるようなものでなければならない。

【００３１】トレーサー化合物の構造はイムノアッセイ
を行うのに重要であり、特定のアッセイに使用した抗体
とともに使用するため最適化すべきである。たとえば、
抗体がトレーサー化合物に対して高親和性で結合するな
らば、トレーサー化合物は分析対象物によって抗体から
置換されることがないか、またはトレーサー化合物は抗
体からすべての分析対象物を競合的に置換してしまい、
分析対象物を測定することはできない。逆に抗体がトレ
ーサー化合物を認識しない場合は、バックグラウンドシ
グナル以外はシグナルは検出されることはなく、分析対
象物を測定することはできない。同様に、トレーサー化
合物の構造はある程度、分析対象物の代謝産物または類
似体に対する抗体の交差反応性を決定する。なぜなら、
分析対象物、分析対象物類似体およびトレーサー化合物
との抗体の相対的な結合能が交差反応性を決定するから
である。

【００３２】本発明のシクロスポリントレーサー化合物
は蛍光偏光イムノアッセイ系に用いるのが好ましく、該
系において試料中のシクロスポリンの量の決定は、混合
物を偏光で励起させ、ついで遊離すなわち未結合のトレ
ーサー化合物かまたはトレーサー−抗体複合体のいずれ
かから放射される蛍光の偏光を測定することにより行う
。抗体と複合体を形成していないトレーサー化合物は、
吸収および蛍光の再放射に要する時間よりも短い時間で
自由に回転する。その結果、再放射される光は相対的に
ランダムな方向を向いており、それゆえ抗体と複合体を
形成していないトレーサー化合物の蛍光偏光は低く、０
に近付く。特異的抗体と複合体を形成すると、かくして
生成したトレーサー−抗体複合体は抗体分子の回転（ト
レーサー化合物分子のものよりも相対的に遅い）を担い
、その結果、観察される偏光は増加する。

【００３３】そのようにして決定を行う場合、シクロス
ポリンは抗体部位に対してトレーサー化合物と競合し、
観察されるトレーサー−抗体複合体の蛍光偏光は、遊離
のトレーサー化合物の値とトレーサー−抗体複合体の値
との間の値となる。それゆえ、試料中に高濃度のシクロ
スポリンまたはその代謝産物が含まれていると、観察さ
れる偏光値は遊離のトレーサー化合物の値に近付く、す
なわち低くなる。逆に、試料が低濃度のシクロスポリン
またはその代謝産物しか含んでいない場合は、偏光値は
トレーサー−抗体複合体の値に近付く、すなわち高くな
る。イムノアッセイの反応混合物を垂直偏光ついで水平
偏光で順に励起させ、放射光の垂直成分のみを分析する
ことにより、反応混合物の蛍光の偏光を正確に決定する
ことができる。偏光とシクロスポリン濃度との正確な相
関関係は、既知濃度のカリブレーターの偏光値を測定し
、かくして作成された標準曲線からシクロスポリンの濃
度を内挿することにより確立することができる。

【００３４】蛍光偏光法を用いる場合、得られる結果は
「ミリ偏光単位」、「スパン（ミリ偏光単位にて）」お
よび「相対強度」により定量することができる。ミリ偏
光単位の測定は、分析対象物が試料中で不在下に最大量
のトレーサー化合物が抗体に結合した場合の最大偏光を
示す。 正味のミリ偏光単位が高くなればなるほど、トレーサー
化合物の抗体への結合は良好となる。本発明の目的のた
めには、少なくとも約１３０の正味のミリ偏光単位が好
ましい。

【００３５】「スパン」とは、正味のミリ偏光と抗体に
最小量のトレーサー化合物が結合した際の偏光値の差異
を示す。スパンの値が大きくなればなるほどデータの数
値分析は良好となる。本発明の目的のためには、少なく
とも約１５ミリ偏光単位のスパンが好ましい。

【００３６】「相対強度」とは、バックグラウンド蛍光
を越える蛍光シグナルの強度の測定値である。それゆえ
、強度が高くなればなるほど、正確な測定値が得られる
。 この強度は、垂直偏光の強度に水平偏光の強度を２倍し
たものを加えた合計として決定される。強度は、トレー
サー化合物の濃度および他のアッセイ変数に依存して、
バックグラウンドノイズの約３倍から約３０倍のシグナ
ルの範囲である。本発明の目的のためには、バックグラ
ウンドノイズの約３倍から約２０倍の強度が好ましい。

【００３７】本発明のトレーサー化合物を用いてイムノ
アッセイ法を行う場合は、ｐＨは約４．０〜約９，０、
好ましくは約６．０〜約８．０、最も好ましくは約７．
０〜約７．５である。トレーサー化合物の検出可能な残
基がフルオレセイン残基である場合は、該トレーサー化
合物を使用するイムノアッセイ系のｐＨは、該トレーサ
ー化合物のフルオレセイン残基が開環形で存在するのに
充分なものでなければならない。イムノアッセイ法を行
う間にｐＨを達成し一定に保持しておくため種々の緩衝
液を用いることができ、その例として、ホウ酸塩、リン
酸塩、炭酸塩、トリスＴＭ，バルビタールなどを挙げる
ことができるが、これらに限られるものではない。蛍光
偏光イムノアッセイを行う場合にはトリスおよびリン酸
緩衝液が好ましい。

【００３８】本発明の方法は、適度の温度、好ましくは
一定温度で行う。温度は通常、約０℃〜約５０℃、好ま
しくは約１５℃〜約４０℃である。下記で詳細に記載す
るように、本発明のシクロスポリントレーサー化合物は
蛍光偏光イムノアッセイにおいて特に有用であり、試料
中の約１０−６Ｍ〜約１０−１０Ｍのシクロスポリンを
決定することができる。当業者には理解されるように、
高濃度のシクロスポリンは試料を希釈することによって
決定することができる。試料中のシクロスポリンの濃度
範囲によってトレーサー化合物や抗体などのアッセイ試
薬の濃度範囲は決定されるけれども、各試薬の濃度は、
当業者によって決定されるようにアッセイの感度を最適
にするように経験的に決定することができる。

【００３９】本発明の好ましい態様によれば、蛍光偏光
イムノアッセイを行うための試薬には、下記実施例４に
記載するように下記式：

【化３８】 （式中、Ｒ１は水素、Ｘ１は−ＣＨ２ＮＨＣＯ−残基、
Ｆｌは４’位でカップリングしたフルオレセインである
）で示される、シクロスポリンの第一位にあるＭｅＢｍ
ｔの水酸基に４−アミノメチルフルオレセインをカップ
リングした蛍光トレーサー化合物、および国際特許出願
公開ＷＯ　８６／０２０８０に記載されているようなシ
クロスポリンに対する抗体が含まれる。上記式で示され
る蛍光トレーサー化合物の使用は、上記モノクローナル
抗体とともに用いた場合に驚くほど有用であることがわ
かった。というのは、該抗体は、シクロスポリンの第二
位にあるアミノ酸によって担体タンパク質分子にカップ
リングした免疫原を用いて調製したものであり、シクロ
スポリン抗体の結合能は第一位の構造変化に他の点では
特に感受性であるからである。

【００４０】下記実施例で一層詳細に記載するように、
米国特許出願第５６７，８５３号（発明の名称：「タン
パク質沈殿試薬」、１９９０年８月１５日出願）に記載
されているようなメタノール、エチレングリコールおよ
び硫酸亜鉛からなるシクロスポリンモノクローナル全血
沈殿溶液、および米国特許出願第５６７，８４０号（発
明の名称：「生物学的試料のための可溶化試薬」、１９
９０年８月１５日出願）に記載されているようなサポニ
ンおよびタージトールＴＭ［アルキルオキシ（ポリエチ
レンオキシプロピレンオキシイソプロパノール）］など
の界面活性剤からなる可溶化試薬も用いられる。加えて
、希釈緩衝液、カリブレーターおよびコントロールも用
いるのが好ましい。

【００４１】本発明による好ましいイムノアッセイ法は
均一イムノアッセイ法であり、抗体−蛍光トレーサー化
合物複合体および遊離すなわち未結合の蛍光トレーサー
化合物を含有する溶液から蛍光偏光の読み取りを行うの
で、そのような化学種を分離する必要がない。そのよう
なイムノアッセイ法は、たとえば、読み取り前に結合放
射性トレーサーを未結合の放射性トレーサーから分離し
なければならないラジオイムノアッセイ法に比べて特に
有利である。

【００４２】本発明の好ましいアッセイ法によれば、シ
クロスポリンまたはシクロスポリンとその代謝産物とを
含有する試料を上記沈殿試薬と合わせ、混合し、遠心分
離にかけて変性タンパク質のペレットを得る。シクロス
ポリンおよびその代謝産物はタンパク質、とりわけリポ
タンパク質に対して高い結合親和性を有することを理解
する必要がある。従って、シクロスポリンおよびその代
謝産物をタンパク質から分離するため（さもないと、本
明細書に記載するようなシクロスポリンとその代謝産物
のイムノアッセイ決定を妨害するであろう）、沈殿試薬
を用いてそのような分離を行う。その際、試料中に存在
するタンパク質は沈殿するが、同時に試料中に存在する
シクロスポリンまたはその代謝産物の約９０％〜１１０
％が回収される。

【００４３】同様に、試料が種々の細胞成分を含有する
全血試料その他の生物学的試料などである場合は、シク
ロスポリンやその代謝産物が抗体への結合に利用できる
ように、そのような細胞成分からシクロスポリンまたは
その代謝産物を解離させるのが望ましい。従って、上記
可溶化試薬は、試料中の細胞成分からシクロスポリンや
その代謝産物を解離させるのに用いる。

【００４４】たとえば全血試料の場合に上記のようにし
て妨害タンパク質を沈殿させたら、試料をまず上記可溶
化試薬で処理し、ついでシクロスポリンまたはシクロス
ポリンとその代謝産物を含有する上澄み液を抗体と混合
する。トレーサー化合物および希釈緩衝液を加える前に
バックグラウンド蛍光を読み取り、約１０分〜約３０分
のインキュベート後、上記のようにして蛍光偏光の読み
取りを行う。

【００４５】本発明の試験キットは、本発明による所望
のイムノアッセイを行うのに必要な必須の試薬のすべて
を含んでいる。本発明の試験キットは、必要な試薬を入
れた１または２以上の容器の組み合わせとして、または
試薬の融和性の許す場合には組成物または混合物として
市販の包装形態で提供される。特に好ましいのは、本発
明の適当な蛍光トレーサー化合物、適当な抗体試薬、沈
殿試薬、および試料が全血試料である場合には上記可溶
化試薬からなる、シクロスポリンまたはシクロスポリン
とその代謝産物の蛍光偏光イムノアッセイ決定のための
試験キットである。本発明の試験キットには、もちろん
、緩衝液、希釈液、標準などの当該技術分野で知られ商
業上の使用者の観点から望ましい他の物質も含まれてい
てよいことを理解する必要がある。

【００４６】

【実施例】つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。 実施例１ ［Ｏ−（クロロオキサリル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポ
リン：シクロスポリン（３４．３ｍｇ、０．０２８５ミ
リモル）およびジメチルアミノピリジン（３０．２ｍｇ
、０．２４７ミリモル）をオキサリルクロリド（１．０
ｍｌ）中に０℃にて溶解した。フラスコには撹拌棒およ
び乾燥チューブが備えてあり、反応混合物を氷浴上で３
．５時間撹拌した。この反応物を真空下で濃縮乾固した
。この残渣を乾燥ジメチルホルムアミド（１．０ｍｌ）
中に取って０．０３Ｍ溶液とし、つぎの反応に用いた。

【００４７】実施例２ ［Ｏ−（フルオレセイン−５−イルアミノオキサリル）
ＭｅＢｍｔ］１シクロスポリン：実施例１に記載のＤＭ
Ｆ溶液（０．３３ｍｌ、９．５μモル）を、撹拌棒を備
えた栓付きフラスコ中でフルオレセインアミン異性体Ｉ
（５．２ｍｇ、１５μモル）と混合した。みかけのｐＨ
が約４〜５になるまで（湿ったｐＨ紙上に溶液をスポッ
トすることにより決定）ピリジンを加えた。この反応混
合物を室温で３日間撹拌した。溶媒を真空除去し、残渣
をメタノール（０．５ｍｌ）中に取り、０．５ｍｍシリ
カゲルプレート（２０ｃｍ×２０ｃｍ）に適用した。こ
のプレートを１５％メタノール／メチレンクロリド中で
展開した。Ｒｆ＝０．５の蛍光バンドをメタノールでシ
リカゲルから除き、０．５ｍｍシリカゲルプレート（２
０ｃｍ×２０ｃｍ）上で再精製し、５％メタノール／メ
チレンクロリドで２回溶出した。所望のバンド（Ｒｆ＝
０．３７）をメタノールでシリカゲルから除いた。

【００４８】実施例３ ［Ｏ−（クロロホルミル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポリ
ン（シクロスポリンクロロホルメート）：シクロスポリ
ン（２４．２ｍｇ、０．０２０ミリモル）を、栓および
撹拌棒を備えた１０ｍｌ容丸底フラスコ中でベンゼン（
２．０ｍｌ）中のホスゲンの２５％ｗ／ｗ溶液中に溶解
した。この反応混合物を５分間撹拌してシクロスポリン
を溶解し、ついで室温で２４時間静置した。反応物を真
空濃縮し、生成物を固体として０℃にて６カ月まで貯蔵
することができた。その後の反応のため、ＤＭＦ中の０
．０２Ｍ溶液を用いた。

【００４９】実施例４ ［Ｏ−（フルオレセイン−４’−イルメチルアミノホル
ミル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポリン：実施例３に記載
のＤＭＦ中の０．０２Ｍ溶液としてのシクロスポリンク
ロロホルメート（０．２ｍｌ、４μモル）を、撹拌棒を
備えた栓付きバイアル中で４’−アミノメチルフルオレ
セイン塩酸塩（２．０ｍｇ、５μモル）と混合した。み
かけのｐＨが約７となるまで（湿ったｐＨ紙による）ピ
リジンを加えた。この反応混合物を室温で２４時間撹拌
した。溶媒を真空除去し、残渣をメタノール中に取り、
１ｍｍシリカゲルプレート上に負荷した。このプレート
を１５％メタノール／メチレンクロリドで展開した。生
成物のバンド（Ｒｆ＝０．５５）をシリカゲルからメタ
ノールで溶出した。

【００５０】実施例５ ［Ｏ−（フルオレセイン−５−イルメチルアミノホルミ
ル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポリン：シクロスポリンク
ロロホルメート（実施例３に記載した固体５ｍｇ、４．
０μモル）を、撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で乾燥
ＤＭＦ（１５０μＬ）中に溶解した。５−アミノメチル
フルオレセイン塩酸塩（３．２ｍｇ、８μモル）および
トリエチルアミン（２．２μｌ、１６μモル）を加え、
この反応混合物を室温２．５日撹拌した。溶媒を真空除
去し、残渣をメタノール中に取り、１ｍｍシリカゲルプ
レートに適用し、１５％メタノール／メチレンクロリド
で溶出した。Ｒｆ＝０．６４の蛍光バンドを単離し、シ
リカゲルからメタノールで除いた。

【００５１】実施例６ ［Ｏ−（クロロアセチル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポリ
ン：撹拌棒および乾燥チューブを備えた丸底フラスコ中
でシクロスポリン（１．０１ｇ、０．８４０ミリモル）
をクロロアセチルクロリド（３．０ｍｌ）中に溶解した
。ジメチルアミノピリジン（１５２．４ｍｇ、１．２５
ミリモル）を加えた。この反応混合物を室温で２．５日
撹拌した。泡立ちが終わるまで固体ＮａＨＣＯ３を少し
ずつ加えながら、この反応溶液を冷（０℃）飽和ＮａＨ
ＣＯ３（１０ｍｌ）中に注ぎ、約２時間撹拌した。この
溶液をジエチルエーテル（３×２０ｍｌ）で抽出した。 コンバインしたエーテル抽出物を０．１Ｎ　ＨＣｌ（１
×１０ｍｌ）、水（３×１０ｍｌ）および飽和ＮａＣｌ
溶液（１×１０ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水ＭｇＳ
Ｏ４で乾燥し、濾過し、真空濃縮して黄色のガラス状残
渣（１．０２ｇ）を得た。 この物質を、５％メタノール／メチレンクロリドを溶離
液として用い、シリカゲル（７５ｇ）上のフラッシュク
ロマトグラフィーにかけた。生成物を含有するフラクシ
ョンをコンバインし、濃縮して標記化合物（０．５２ｇ
、収率４８％）を得た。高速原子衝撃質量分析により１
２７８に（Ｍ＋Ｈ）シグナルが示された。

【００５２】実施例７ ［Ｏ−（アジドアセチル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポリ
ン：撹拌棒および還流冷却器を備えた丸底フラスコ中で
、［Ｏ−（クロロアセチル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポ
リン（１０３．３ｍｇ、０．０８０８ミリモル）および
アジ化ナトリウム（６．５ｍｇ、０．１０ミリモル）を
混合した。ジメチルホルムアミド（１．０ｍｌ）および
水（１滴）を加えた（アジ化ナトリウムを溶解するため
）。この反応混合物を５０℃で一夜、ついで９０℃で１
．５時間撹拌した。この溶液をエーテル（２０ｍｌ）中
に取り、水（３×１ｍｌ）および飽和ＮａＣｌ溶液（１
×５ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、真
空濃縮してわずかに黄色の固体（９２．１ｍｇ、８８％
）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、５％メタノール／メチ
レンクロリド）により少量の不純物が示された。ＩＲは
２１００ｃｍ−１でアジドの吸収を示した。

【００５３】実施例８ ［Ｏ−（グリシル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポリン：１
００ｍｌ容のパール水素化容器中で［Ｏ−（アジドアセ
チル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポリン（４６．１ｍｇ、
０．０３５９ミリモル）を無水エタノール（５．０ｍｌ
）中に溶解した。５％パラジウム／炭酸カルシウム（鉛
で活性を減じたもの（ｐｏｉｓｏｎｅｄ））（３６．１
ｍｇ、７８％ｗ／ｗ）、およびトリエチルアミン（１０
０μｌ）を加え、この反応混合物をパール装置上、５０
ｐｓｉＨ２、室温にて振とうした。反応混合物を装置か
ら取り、セライトパッドで濾過した。セライトをさらに
エタノールで洗浄した。コンバインした濾液および洗浄
液を真空濃縮してＴＬＣ（シリカゲル、５％メタノール
／メチレンクロリド、Ｒｆ＝０．３および０．１８）に
より２つの成分からなる混合物（４２ｍｇ）を得た。こ
の混合物を、１ｍｍローターを用い５％メタノール／メ
チレンクロリドで溶出してクロマトトロン［ハリソン・
リサーチ（Ｈａｒｒｉｓｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、８
１０　モアナコート、パロアルト、ＣＡ］上で分離した
。 純粋な生成物を含有するフラクションをコンバインして
Ｏ−（グリシル）シクロスポリン（２３．４ｍｇ、５２
％収率）を得た。ＦＡＢ　ＭＳにより、所望の化合物に
対して（Ｍ＋Ｈ）＋　１２５９および（Ｍ＋Ｎａ）＋　
１２７１が示された。

【００５４】実施例９ ［Ｏ−（５−フルオレセイン−５−イルアミノ−３−ク
ロロトリアジニルグリシル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポ
リン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で［Ｏ−（グリ
シル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポリン（実施例８、５ｍ
ｇ、４μモル）をメタノール（８μｌ）中に溶解した。 ３，５−ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン異
性体Ｉ（ＤＴＡＦ−Ｉ、４．０ｍｇ、８μモル）を加え
、反応混合物を室温で３．５日撹拌した。この溶液を１
ｍｍシリカゲルプレート上に負荷し、２０％メタノール
／メチレンクロリドで展開した。Ｒｆ＝０．７５のバン
ドをメタノールでシリカゲルから溶出し、５％メタノー
ル／メチレンクロリドで展開して１ｍｍシリカゲルプレ
ート上で再精製した。Ｒｆ＝０．３のバンドをメタノー
ルでシリカゲルから溶出した。

【００５５】実施例１０ ［Ｏ−（５−フルオレセイン−６−イルアミノ−３−ク
ロロトリアジニルグリシル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポ
リン：ＤＴＡＦ−Ｉの代わりにジクロロトリアジニルア
ミノフルオレセイン異性体ＩＩ（ＤＴＡＦ−ＩＩ）を用
いる他は実施例９に記載の手順に従った。この反応混合
物を１日撹拌した。第一の精製は２０％メタノール／メ
チレンクロリド（Ｒｆ＝０．７０）で行い、第二の精製
は１０％メタノール／メチレンクロリド（Ｒｆ＝０．７
１）で行った。

【００５６】実施例１１ ［Ｏ−（フルオレセイン−５−カルボキシグリシル）Ｍ
ｅＢｍｔ］１シクロスポリン：撹拌棒を備えた栓付きバ
イアル中に、［Ｏ−（グリシル）ＭｅＢｍｔ］１シクロ
スポリン（実施例８、５ｍｇ、４μモル）および５−カ
ルボキシフルオレセインのＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（３．０ｍｇ、８μモル）をジメチルホルム
アミド（５０μｌ）、トリエチルアミン（３．３μｌ、
２４μモル）およびジメチルアミノピリジン（５μモル
）とともに入れた。この反応混合物を室温で一夜撹拌し
た。揮発成分を真空除去し、残渣をメタノール中に取り
、１ｍｍシリカゲルプレート上に負荷した。プレートを
２０％メタノール／メチレンクロリドで展開し、Ｒｆ＝
０．６４のバンドをメタノールでシリカゲルから除いた
。２×１０％メタノール／メチレンクロリドを用いた分
取薄層クロマトグラフィーにより再精製してＲｆ＝０．
４３の単一バンドを得た。

【００５７】実施例１２ ［Ｏ−（フルオレセイン−６−カルボキシグリシル）Ｍ
ｅＢｍｔ］１シクロスポリン：６−カルボキシフルオレ
セインのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用い
た他は実施例１１に記載の手順に従った。２０％メタノ
ール／メチレンクロリドで１回展開した後の所望のバン
ドのＲｆは０．６５であり、２×１０％メタノール／メ
チレンクロリドで第二の精製を行った後のＲｆは０．４
であった。

【００５８】実施例１３ ［Ｏ−（Ｎ−フルオレセイン−４’−イルメチルアセト
アミドアミノホルミル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポリン
：ＤＭＦ中の溶液としてのシクロスポリンクロロホルメ
ート（実施例３、４μモル）を、撹拌棒を備えた栓付き
バイアル中に４’−Ｎ−グリシルアミノメチルフルオレ
セイン塩酸塩（２．４ｍｇ、５．３μモル）とともに入
れた。みかけのｐＨが約８になるまでピリジン（約１０
滴）を加えた。この反応混合物を室温で１日撹拌した。 揮発成分を真空除去し、残渣をメタノール中に取り、１
ｍｍシリカゲルプレート上に負荷した。プレートを１５
％メタノール／メチレンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０
．５のバンドをメタノールでシリカゲルから溶出した。 ２０％メタノール／メチレンクロリドを用いて再精製し
てＲｆ＝０．６のバンドを得た。

【００５９】実施例１４ ［Ｏ−（フルオレセイン−５−イルアミノホルミル）Ｍ
ｅＢｍｔ］１シクロスポリン：ＤＭＦ中の溶液としての
シクロスポリンクロロホルメート（実施例３、４μモル
）を、撹拌棒を備えた栓付きバイアル中にフルオレセイ
ンアミン異性体Ｉ（６．２ｍｇ、１８μモル）とともに
入れた。 みかけのｐＨが約７になるまでピリジンを加えた。この
反応混合物を室温で１日撹拌した。揮発成分を真空除去
し、残渣をメタノール中に取り、１ｍｍシリカゲルプレ
ート上に負荷した。プレートを１５％メタノール／メチ
レンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０．５７のバンドをメ
タノールでシリカゲルから溶出した。１０％メタノール
／メチレンクロリドを用いて再精製を行い、Ｒｆ＝０．
５のバンドを得た。

【００６０】実施例１５ ［Ｏ−アセチルＴｈｒ］２シクロスポリン：［Ｔｈｒ］
２シクロスポリン（シクロスポリンＣ；サンドスＡＧ、
バーゼル、スイスより入手；０．３０ｇ、０．２５ミリ
モル）を、撹拌棒および乾燥チューブを備えた丸底フラ
スコ中で乾燥ピリジン（１．０ｍｌ）中に溶解した。こ
の溶液を氷浴上で０°Ｃに冷却した。無水酢酸（２８μ
ｌ、０．３０ミリモル）を加え、氷浴を除いた。室温で
３時間撹拌した後、さらに無水酢酸（２８μｌ、０．６
０ミリモル合計）を加えた。この反応混合物を室温で一
夜撹拌し、さらに無水酢酸（１０μｌ、合計０．７ミリ
モル）を加えた。室温でさらに６時間撹拌した後、反応
混合物をエーテル（２５ｍｌ）中に取り、１．２Ｎ　Ｈ
Ｃｌ（２５ｍｌ）、水（２５ｍｌ）および飽和ＮａＣｌ
溶液（２５ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水ＭｇＳＯ４
で乾燥し、濾過し、真空濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２
およびシクロヘキサン中に取って痕跡量の酢酸を除いた
。標記化合物を８２％の収率（２５９ｍｇ）で得た。生
成物の構造を２００ＭＨｚ　ＮＭＲで確認したところ、
デルタ４．１５で３重線がなく、デルタ５．６で二重線
およびデルタ１．９で一重項が出現した。

【００６１】実施例１６ ［Ｏ−クロロカルボニルＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−アセチル
Ｔｈｒ］２シクロスポリン：きつく締めた栓および撹拌
棒を備えた丸底フラスコ中で、［Ｏ−アセチルＴｈｒ］
２シクロスポリン（実施例１５、１７．３ｍｇ、１３．
７μモル）をベンゼン中のホスゲンの２５％ｗ／ｗ溶液
（１．０ｍｌ）中に溶解した。５分間撹拌してペプチド
を完全に溶解した後、反応液を室温で一夜静置した。揮
発成分を真空除去してホフホワイトの固体残渣を得た。

【００６２】実施例１７ ［Ｏ−（フルオレセイン−４’−イルメチルアミノホル
ミル）ＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−アセチルＴｈｒ］２シクロ
スポリン：乾燥ピリジン（０．３ｍｌ）中の［Ｏ−クロ
ロカルボニルＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−アセチルＴｈｒ］２
シクロスポリン（実施例１６、４．６μモル）を、撹拌
棒を備えた栓付きバイアル中に４’−アミノメチルフル
オレセイン塩酸塩（５．５ｍｇ、１３．８μモル）とと
もに入れた。この反応混合物を室温で３日間撹拌した。 溶媒を真空除去し、残渣をメタノール中に取り、１ｍｍ
シリカゲルプレート上に負荷した。プレートを１５％メ
タノール／メチレンクロリドで展開した。生成物のバン
ド（Ｒｆ＝０．９５）をメタノールでシリカゲルから溶
出した。２×５％メタノール／メチレンクロリドを用い
て再精製して生成物をＲｆ＝０．４の単一バンドとして
得た。このバンドをメタノールでシリカゲルから除いた
。

【００６３】実施例１８ ［Ｏ−（イミダゾール−１−イルカルボニル）Ｔｈｒ］
２シクロスポリン：撹拌棒および乾燥チューブを備えた
丸底フラスコ中に［Ｔｈｒ］２シクロスポリン（１４．
６ｍｇ、１２．０μモル）を入れた。カルボニルジイミ
ダゾール（１４．８μモル）、ジメチルアミノピリジン
（１４．５μモル）、ジメチルホルムアミド（４４μｌ
）およびメチレンクロリド（１２０μモル）を加えた。 この反応混合物を室温で２４時間撹拌した。揮発成分を
除き、残渣を直ちにつぎの反応に用いた。

【００６４】実施例１９ ［Ｏ−（フルオレセイン−４’−イルメチルアミノカル
ボニル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン：撹拌棒を備えた栓
付きバイアル中に、［Ｏ−（イミダゾール−１−イルカ
ルボニル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン（実施例１８、６
μモル）および４’−アミノメチルフルオレセイン塩酸
塩（５．２ｍｇ、１３μモル）を乾燥ジメチルホルムア
ミド（１００μＬ）とともに入れた。４−メチルモルホ
リン（３μｌ、２７μモル）を加え、反応混合物を室温
で一夜撹拌した。 揮発成分を除去し、残渣をメタノール中に取った。この
溶液を２つの０．５ｍｍシリカゲルプレート上で精製し
、これを１５％メタノール／メチレンクロリドで溶出し
た。Ｒｆ＝０．９のバンドをメタノールでシリカゲルか
ら溶出して標記化合物を単離した。

【００６５】実施例２０ ［Ｏ−（Ｎ−（Ｎ−（フルオレセイン−４’−イルメチ
ル）カルボキサミドメチル）カルボキサミドメチル）Ｔ
ｈｒ］２シクロスポリン： （ａ）［Ｏ−（スクシンイミド−Ｎ−イルオキシカルボ
ニルメチル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン：撹拌棒および
乾燥チューブを備えた丸底フラスコ中で、［Ｏ−（カル
ボキシメチル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン（サンドスＡ
Ｇ、バーゼル、スイスより入手；２０．３ｍｇ、１５．
９μモル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（７．
８ｍｇ、６７．８μモル）を乾燥ジメチルホルムアミド
（４００μｌ）中に溶解した。１−エチル−１’−［（
３’−ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド塩酸
塩（９．２ｍｇ、４８μモル）を加え、反応混合物を室
温で一夜撹拌した。この反応溶液を精製することなくつ
ぎの反応に用いた。

【００６６】（ｂ）［Ｏ−（Ｎ−（Ｎ−（フルオレセイ
ン−４’−イルメチル）カルボキサミドメチル）カルボ
キサミドメチル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン：撹拌棒を
備えた栓付きバイアル中に、［Ｏ−（スクシンイミド−
Ｎ−イルオキシカルボニルメチル）Ｔｈｒ］２シクロス
ポリン（反応溶液として、実施例２０工程（ａ）、４μ
モル）およびＮ−グリシル−４’−アミノメチルフルオ
レセイン塩酸塩（６．２μモル）を入れた。４−メチル
モルホリン（２．０μＬ、１８．２μモル）を加えた。 この反応混合物を室温で一夜撹拌した。揮発成分を高真
空下で除去した。残渣をメタノール中に取り、０．５ｍ
ｍシリカゲルプレートに適用し、１５％メタノール／メ
チレンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０．９のバンドをメ
タノールでシリカゲルから溶出し、５％メタノール／メ
チレンクロリドで溶出して再精製した。Ｒｆ＝０．４５
のバンドをメタノールでシリカゲルから除いた。

【００６７】実施例２１ ［Ｏ−（Ｎ−（フルオレセイン−４’−イルメチル）カ
ルボキサミドメチル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン：撹拌
棒を備えた栓付きバイアル中に、［Ｏ−（スクシンイミ
ド−Ｎ−イルオキシカルボニルメチル）Ｔｈｒ］２シク
ロスポリン（反応溶液として、実施例２０、４μモル）
および４’−アミノメチルフルオレセイン塩酸塩（３．
１ｍｇ、７．８μモル）を入れた。４−メチルモルホリ
ン（２．０μＬ、１８．２μモル）を加えた。この反応
混合物を室温で一夜撹拌した。揮発成分を高真空下で除
去した。残渣をメタノール中に取り、０．５ｍｍシリカ
ゲルプレートに適用し、１５％メタノール／メチレンク
ロリドで溶出した。 Ｒｆ＝０．８のバンドをメタノールでシリカゲルから溶
出し、同様にして５％メタノール／メチレンクロリドで
溶出して再精製した。Ｒｆ＝０．５５のバンドをメタノ
ールでシリカゲルから除いた。

【００６８】実施例２２ ［Ｏ−（Ｎ−メチル−Ｎ−（フルオレセイン−４−イル
メチル）カルボキサミドメチル）Ｔｈｒ］２シクロスポ
リン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル中に、［Ｏ−（ス
クシンイミド−Ｎ−イルオキシカルボニルメチル）Ｔｈ
ｒ］２シクロスポリン（反応溶液として、実施例２０、
４μモル）および４’−メチルアミノメチルフルオレセ
イン塩酸塩（２．８ｍｇ、６．８μモル）を入れた。４
−メチルモルホリン（２．０μＬ、１８．２μモル）を
加えた。この反応混合物を室温で一夜撹拌した。揮発成
分を高真空下で除去した。残渣をメタノール中に取り、
０．５ｍｍシリカゲルプレートに適用し、１５％メタノ
ール／メチレンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０．９２の
バンドをメタノールでシリカゲルから溶出し、同様にし
て２×５％メタノール／メチレンクロリドで溶出して再
精製した。Ｒｆ＝０．５０のバンドをメタノールでシリ
カゲルから除いた。

【００６９】実施例２３ ［Ｏ−（５−フルオレセイン−５−イルアミノ−３−ク
ロロトリアジニル−２−アミノエチル）Ｔｈｒ］２シク
ロスポリン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で、［Ｏ
−（２−アミノエチル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン（サ
ンドスＡＧ、バーゼル、スイスより入手；５ｍｇ、４μ
モル）およびＤＴＡＦ−Ｉ（４ｍｇ、８μモル）をメタ
ノール（６０μＬ）中に溶解し、室温で一夜撹拌した。 この溶液を０．５ｍｍシリカゲルプレートに適用し、２
０％メタノール／メチレンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝
０．４６のバンドをメタノールでシリカゲルから除き、
２×５％メタノール／メチレンクロリドを用いて同様に
して再精製した。Ｒｆ＝０．５のバンドをメタノールで
シリカゲルから除いた。

【００７０】実施例２４ ［Ｏ−（フルオレセイン−４’−イルメチルアミノスク
シニル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン：［Ｏ−（スクシン
イミド−Ｎ−イルオキシスクシニル）Ｔｈｒ］２シクロ
スポリン（サンドスＡＧ、バーゼル、スイスより入手；
５ｍｇ、３．５μモル）、４’−アミノメチルフルオレ
セイン塩酸塩（２．９ｍｇ、７μモル）、ジメチルアミ
ノピリジン（６．５μモル）およびトリエチルアミン（
１μＬ、７μモル）を乾燥ジメチルホルムアミド（６５
μＬ）中に入れた。この反応混合物を室温で２．５日撹
拌した。溶媒を真空除去し、残渣をメタノール中に取り
、１ｍｍシリカゲルプレートに適用した。プレートを１
０％メタノール／メチレンクロリドで溶出し、Ｒｆ＝０
．８のバンドをメタノールでシリカゲルから溶出した。 このバンドを、２×５％メタノール／メチレンクロリド
および１×１０％メタノール／メチレンクロリドを用い
てプレートを展開して同様にして再精製した。Ｒｆ＝０
．７のバンドをメタノールでシリカゲルから除いた。

【００７１】実施例２５ ［Ｏ−（Ｎ−（フルオレセイン−４’−イルメチル）カ
ルボキサミドメチルアミノスクシニル）Ｔｈｒ］２シク
ロスポリン：［Ｏ−（スクシンイミジルオキシスクシニ
ル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン（サンドスＡＧ、バーゼ
ル、スイスより入手；５ｍｇ、３．５μモル）、４’−
グリシルアミノメチルフルオレセイン塩酸塩（２．９ｍ
ｇ、７μモル）、ジメチルアミノピリジン（３．５μモ
ル）およびトリエチルアミン（１μＬ、７μモル）を乾
燥ジメチルホルムアミド（１００μＬ）中に入れた。こ
の反応混合物を室温で２．５日間撹拌した。溶媒を真空
除去し、残渣をメタノール中に取り、１ｍｍシリカゲル
プレートに適用した。プレートを２０％メタノール／メ
チレンクロリドで溶出し、Ｒｆ＝０．８５のバンドをメ
タノールでシリカゲルから溶出した。このバンドを、１
０％メタノール／メチレンクロリドおよび１×２０％メ
タノール／メチレンクロリドを用いてプレートを展開し
て同様にして再精製した。Ｒｆ＝０．７５のバンドをメ
タノールでシリカゲルから除いた。

【００７２】実施例２６ ［Ｏ−（Ｎ−（フルオレセイン−６−イルカルボニルア
ミノエチル）アミノスクシニル）Ｔｈｒ］２シクロスポ
リン：（ａ）［Ｏ−（Ｎ−（２−ＢＯＣ−アミノエチル
）アミノスクシニル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン：［Ｏ
−（スクシンイミジルオキシスクシニル）Ｔｈｒ］２シ
クロスポリン（１５ｍｇ、１０．７μモル）、モノ−Ｂ
ＯＣ−エチレンジアミン（４．６ｍｇ、２８．７μモル
）およびジメチルアミノピリジン（２μモル）を乾燥ジ
メチルホルムアミド（１５０μＬ）中に入れた。この反
応混合物を室温で一夜撹拌した。反応液をエーテル（２
５ｍｌ）中に取り、水（４×１０ｍｌ）および飽和Ｎａ
Ｃｌ溶液（１×１０ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫
酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。高真空下に
一夜置いた後、１ｍｍローターを用い５％〜１０％メタ
ノール／メチレンクロリドで溶出して残渣をクロマトト
ロン上で精製した。純粋なフラクションをコンバインし
、濃縮して標記化合物（１４．７ｍｇ、１０μモル、９
３％収率）を得た。ＦＡＢ　ＭＳは（Ｍ＋Ｈ）＋１４６
０を示した。

【００７３】（ｂ）［Ｏ−（Ｎ−（２−アミノエチル）
アミノスクシニル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン：［Ｏ−
（Ｎ−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）アミノスクシニル
）Ｔｈｒ］２シクロスポリン（実施例２６工程（ａ）；
１４．７ｍｇ、１０μモル）を０°Ｃにてトリフルオロ
酢酸（３００μｌ）中に溶解し、この温度にて一夜撹拌
した。この反応混合物をＮａＨＣＯ３（０．５ｇ）およ
び氷（１０ｇ）に注いだ。泡立ちが終わった後、溶液を
メチレンクロライド（３×２０ｍｌ）で抽出した。有機
抽出物をコンバインし、無水硫酸ナトリウムで乾燥した
。濾過し、濃縮して生成物（１０．５ｇ）を得た。

【００７４】（ｃ）［Ｏ−（Ｎ−（フルオレセイン−６
−イルカルボニルアミノエチル）アミノスクシニル）Ｔ
ｈｒ］２シクロスポリン：撹拌棒を備えた栓付きバイア
ル中で、［Ｏ−（Ｎ−（２−アミノエチル）アミノスク
シニル）Ｔｈｒ］２シクロスポリンおよび６−（スクシ
ンイミドオキシカルボニル）フルオレセイン［リサーチ
・オーガニックス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｏｒｇａｎｉｃ
ｓ）；２．３ｍｇ、４．９μモル］を乾燥ジメチルホル
ムアミド（１００μｌ）中に入れた。４−メチルモルホ
リン（１滴）を加えてみかけのｐＨを７〜８とした。こ
の反応混合物を室温で一夜撹拌した。揮発成分を真空除
去し、残渣をメタノール中に取り、２〜０．５ｍｍシリ
カゲルプレートに適用した。プレートを２×１５％メタ
ノール／メチレンクロリドで展開した。Ｒｆ＝０．８の
バンドをメタノールでシリカゲルから溶出して標記化合
物を得た。

【００７５】実施例２７ ［Ｏ−（２−（３−クロロ−５−（フルオレセイン−５
−イルアミノ）トリアジン−１−イル）アミノエチルア
ミノスクシニル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン：撹拌棒を
備えた栓付きバイアル中で、［Ｏ−（Ｎ−（２−アミノ
エチル）アミノスクシニル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン
（３．５ｍｇ、２μモル）およびジクロロトリアジニル
アミノフルオレセイン異性体Ｉ（ＤＴＡＦ−Ｉ；２．５
ｍｇ、５μモル）をメタノール（１００μＬ）中に入れ
た。この反応混合物を室温で一夜撹拌し、ついで０．５
ｍｍシリカゲルプレートに適用し、２×１５％メタノー
ル／メチレンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０．５のバン
ドをメタノールでシリカゲルから除いて標記化合物を得
た。

【００７６】実施例２８ ［Ｏ−（Ｎ−（フルオレセイン−４’−イルメチル）−
Ｎ−メチルアミノスクシニルポリ（オキシエチル）スク
シニル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン： （ａ）［Ｏ−（ポリ（オキシエチル）スクシニル）Ｔｈ
ｒ］２シクロスポリン：撹拌棒および乾燥チューブを備
えた丸底フラスコ中で、［Ｏ−（スクシニル）Ｔｈｒ］
２シクロスポリン（３５０ｍｇ、０．２６５ミリモル）
をポリエチレングリコール（平均分子量　２００ｇ／モ
ル、８２．２ｍｇ、約０．９１ミリモル）、Ｎ−エチル
−Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩
（９０．２ｍｇ、０．４７１ミリモル）およびジメチル
アミノピリジン（４６．７ｍｇ、０．３８２ミリモル）
とともに乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍｌ）中に溶解した
。この反応混合物を室温で一夜撹拌した。

【００７７】この溶液をエーテル（２０ｍｌ）中に取り
、０．１２Ｎ　ＨＣｌ（２×５ｍｌ）、水（２×１０ｍ
ｌ）、５％ＮａＨＣＯ３（２×５ｍｌ）、水（３×１０
ｍｌ）および飽和ＮａＣｌ溶液（１×５ｍｌ）で洗浄し
た。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮
して白色泡（２９９．４ｍｇ）を得た。この生成物を、
１ｍｍローターを用い３％メタノール／メチレンクロリ
ドで溶出してクロマトトロン上で精製した。純粋な生成
物を含有するフラクションをコンバインし、濃縮して所
望の生成物２４０．６ｍｇ（６０％収率）を得た。ＦＡ
Ｂ　ＭＳにより質量が４４ずつ異なる４つの親イオンが
得られた：（Ｍ＋Ｈ）＋１５３８、１４９４、１４５０
、１４０６。

【００７８】（ｂ）［Ｏ−（ヒドロキシスクシニルポリ
（オキシエチル）スクシニル）Ｔｈｒ］２シクロスポリ
ン：撹拌棒および乾燥チューブを備えた丸底フラスコ中
で、［Ｏ−（ポリ（オキシエチル）スクシニル）トレオ
ニル］２シクロスポリン（実施例２８工程（ａ）；８３
．８ｍｇ、５５．９μモル）、無水コハク酸（８．９ｍ
ｇ、８９μモル）およびジメチルアミノピリジン（８０
μモル）をＤＭＦ（１ｍｌ）中に溶解した。この反応混
合物を室温で一夜撹拌した。 この溶液をエーテル（２５ｍｌ）中に取り、０．１２Ｎ
　ＨＣｌ（５ｍｌ）、水（３×５ｍｌ）および飽和Ｎａ
Ｃｌ溶液（１０ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水ＭｇＳ
Ｏ４で乾燥し、濾過し、濃縮して標記化合物（６７．４
ｍｇ、８６％）を得た。

【００７９】（ｃ）［Ｏ−（Ｎ−（フルオレセイン−４
’−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノスクシニルポリ（
オキシエチル）スクシニル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン
：撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で、［Ｏ−（ヒドロ
キシスクシニルポリ（オキシエチル）スクシニル）Ｔｈ
ｒ］２シクロスポリン（実施例２８工程（ｂ）；５ｍｇ
、３．１μモル）、ジイソプロピルカルボジイミド（０
．５８μＬ、３．７μモル）、Ｎ−ヒドロキシベンゾト
リアゾール（１．１ｍｇ、７μモル）、トリエチルアミ
ン（１．４μＬ、１０μモル）および４’−メチルアミ
ノメチルフルオレセイン（１．４ｍｇ、３．７μモル）
をＤＭＦ（１５０μＬ）中に入れた。 この反応混合物を室温にて一夜撹拌した。揮発成分を真
空除去し、残渣をメタノール中に取り、０．５ｍｍシリ
カゲルプレートに適用した。プレートを２０％メタノー
ル／メチレンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０．８のバン
ドから所望の化合物をメタノールで除いた。

【００８０】実施例２９ ［ジヒドロＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−（フルオレセイン−４
−イルメチルアミノスクシニル）Ｔｈｒ］２シクロスポ
リン：（ａ）［ジヒドロＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−（スクシ
ニル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン：上記手順に従い、ジ
ヒドロシクロスポリンＣを無水コハク酸と反応させて標
記化合物を得た。

【００８１】（ｂ）［ジヒドロＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−（
Ｎ−フルオレセイン−４’−イルメチルアミノスクシニ
ル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン：撹拌棒を備えた栓付き
バイアル中で、［ジヒドロＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−（スク
シニル）Ｔｈｒ］２シクロスポリン（０．８ｍｇ、０．
６μモル）をジイソプロピルカルボジイミド（０．２１
μＬ、１．３μモル）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール（０．３４ｍｇ、２．２μモル）、４’−アミノメ
チルフルオレセイン塩酸塩（０．５４ｍｇ、１．３μモ
ル）およびトリエチルアミン（０．４５μＬ、３．３μ
モル）とともにＤＭＦ（５０μＬ）中に入れた。この反
応混合物を室温にて一夜撹拌した。揮発成分を真空除去
し、残渣をメタノール中に取り、０．５ｍｍシリカゲル
プレートに適用した。プレートを２０％メタノール／メ
チレンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０．６１のバンドを
回収し、メタノールでシリカゲルから化合物を除いた。 ２×１５％メタノール／メチレンクロリドを用い同様に
して再精製してＲｆ＝０．５の生成物バンドを得た。こ
の化合物をメタノールでシリカゲルから除いて標記化合
物を得た。

【００８２】実施例３０ ［Ｏ−（フルオレセイン−４’−イルメチルアミノカル
ボニル）−（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ］３シクロスポリン：撹
拌棒および乾燥チューブを備えた丸底フラスコ中で、［
（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ］３シクロスポリン（１３．３ｍｇ
、１０．８μモル）、１，１’−カルボニルジイミダゾ
ール（１３μモル）およびジメチルアミノピリジン（１
３μモル）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）中に入れた。この反
応混合物を室温で２４時間撹拌した。この反応混合物の
１／３に４’−アミノメチルフルオレセイン塩酸塩（３
．６ｍｇ、９μモル）および４−メチルモルホリン（２
．０μＬ、１８．２μモル）を加えた。湿ったｐＨ紙に
より、みかけのｐＨは８〜９であった。この反応混合物
を室温でさらに２４時間撹拌した。揮発成分を真空除去
し、残渣をメタノール中に取り、１ｍｍシリカゲルプレ
ートに適用した。プレートを１５％メタノール／メチレ
ンクロリドで溶出した。 Ｒｆ＝０．６のバンドを除き、プレートからメタノール
で化合物を溶出し、得られた生成物を２×１０％メタノ
ール／メチレンクロリドを用い同様にして再精製した。 Ｒｆ＝０．７２のバンドを回収し、メタノールでシリカ
ゲルから除去して標記化合物を単離した。

【００８３】実施例３１ ［Ｔｈｒ］２［Ｏ−（４’−フルオレセイン−４’−イ
ルメチルアミノカルボニル）−（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ］３
シクロスポリン：撹拌棒および乾燥チューブを備えた丸
底フラスコ中で、［Ｔｈｒ］２［（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ］
３シクロスポリン（２８．５ｍｇ、２２．８μモル）、
１，１’−カルボニルジイミダゾール（３．３ｍｇ、２
０μモル）およびジメチルアミノピリジン（１３μモル
）をＤＭＦ（１５０μＬ）中に入れた。この反応混合物
を室温で２４時間撹拌した。この反応混合物の１／５に
４’−アミノメチルフルオレセイン塩酸塩（４．９ｍｇ
、１２．３μモル）および４−メチルモルホリン（１滴
）を加えた。湿ったｐＨ紙により、みかけのｐＨは８〜
９であった。この反応混合物を室温でさらに２４時間撹
拌した。揮発成分を真空除去し、残渣をメタノール中に
取り、１ｍｍシリカゲルプレートに適用した。プレート
を１５％メタノール／メチレンクロリドで溶出した。Ｒ
ｆ＝０．５７のバンドを回収し、シリカゲルからメタノ
ールで除くことにより標記化合物を単離した。

【００８４】実施例３２ ［（フルオレセイン−５−イルカルボニル）アミノＡｌ
ａ］８シクロスポリン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル
中で、［アミノＡｌａ］８シクロスポリン（サンドスＡ
Ｇ、バーゼル、スイスより入手；３．０ｍｇ、２．５μ
モル）、５−（スクシンイミドオキシカルボニル）フル
オレセイン（リサーチ・オーガニックス；３．１ｍｇ、
６．５μモル）および４−メチルモルホリン（２．０μ
Ｌ、１８μモル）をＤＭＦ（１００μＬ）中に入れた。 この反応混合物を室温で２．５日撹拌した。揮発成分を
真空除去し、残渣をメタノール中に取り、０．５ｍｍシ
リカゲルプレートに適用した。プレートを１５％メタノ
ール／メチレンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０．４５の
バンドを回収し、メタノールでシリカゲルから除くこと
により標記化合物を単離した。

【００８５】実施例３３ ［ε−（Ｎ−（フルオレセイン−４’−イルメチル）カ
ルボキサミドメチルアミノスクシニル）−（Ｄ）−Ｌｙ
ｓ］８シクロスポリン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル
中で、［Ｎ−（スクシンイミドオキシスクシニル）−（
Ｄ）−Ｌｙｓ］８シクロスポリン（サンドスＡＧ、バー
ゼル、スイスより入手；３．０ｍｇ、２．１μモル）お
よび４’−グリシルアミノメチルフルオレセイン（１．
８ｍｇ、４．２μモル）をジメチルアミノピリジン（５
μモル）およびトリエチルアミン（８．４μモル）とと
もにＤＭＦ（５０μＬ）中に入れた。この反応混合物を
室温で一夜撹拌した。揮発成分を真空除去し、残渣をメ
タノール中に取り、０．５ｍｍシリカゲルプレートに適
用した。プレートを２０％メタノール／メチレンクロリ
ドで溶出した。Ｒｆ＝０．７０のバンドを回収し、メタ
ノールでシリカゲルから除くことにより標記化合物を単
離した。

【００８６】実施例３４ ［Ｏ−（Ｎ−（フルオレセイン−４’−イルメチル）−
Ｎ−プロピルアミノスクシニル）ＭｅＴｈｒ］１０シク
ロスポリン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で、［Ｍ
ｅＴｈｒ］１０シクロスポリン（サンドスＡＧ、バーゼ
ル、スイスより入手；２０ｍｇ、１７μモル）、無水コ
ハク酸（２７．３ｍｇ、０．２７３ミリモル）およびジ
メチルアミノピリジン（１１．１ｍｇ、０．０９１ミリ
モル）をピリジン（２５０μＬ）中に入れた。この反応
混合物を４５°Ｃで３日間撹拌した。反応物をエーテル
（１０ｍｌ）中に取り、１Ｎ　ＨＣｌ（１０ｍｌ）で洗
浄した。水性抽出物をエーテル（５ｍｌ）で逆抽出した
。有機抽出物をコンバインし、水（５ｍｌ）および飽和
ＮａＣｌ溶液（５ｍｌ）で洗浄し、ついで無水ＭｇＳＯ
４で乾燥し、濾過し、濃縮して、出発物質およびビス−
スクシニル誘導体がわずかに混じった［Ｏ−（スクシニ
ル）ＭｅＴｈｒ］１０シクロスポリン（１６ｍｇ）を得
た。

【００８７】撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で、［Ｏ
−（スクシニル）ＭｅＴｈｒ］１０シクロスポリン（４
ｍｇ、３．１μモル）をジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（６μモル）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（
６μモル）、４’−アミノメチルフルオレセイン塩酸塩
（１２μモル）およびトリエチルアミン（３．１μモル
）とともにＤＭＦ（１００μＬ）中に入れた。この反応
混合物を室温で一夜撹拌した。揮発成分を真空除去し、
残渣をメタノール中に取り、０．５ｍｍシリカゲルプレ
ートに適用した。プレートを１５％メタノール／メチレ
ンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０．５０のバンドを回収
し、２×１０％メタノール／メチレンクロリドを用いて
同様にして再精製した。Ｒｆ＝０．２のバンドを回収し
、メタノールでシリカゲルから除くことにより標記化合
物を単離した。

【００８８】実施例３５ ［Ｏ−アセチルＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−スクシニルＴｈｒ
］２シクロスポリン：栓および撹拌棒を備えた丸底フラ
スコ中で、［Ｏ−スクシニルＴｈｒ］２シクロスポリン
（２０．８ｍｇ、１５．８μモル）およびジメチルアミ
ノピリジン（３２．５ｍｇ、０．２６６ミリモル）を無
水酢酸（０．５ｍｌ、５．３ミリモル）中に入れた。こ
の反応混合物を室温で３日間撹拌した。この溶液を撹拌
しながら０°Ｃの５％ＮａＨＣＯ３中に注ぎ、溶液のｐ
Ｈが約５となるまで固体のＮａＨＣＯ３を少しずつ加え
た。この水性溶液を酢酸エチルで３回抽出した。コンバ
インした有機層を水および飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、
ついで無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。濾過し、濃縮して
残渣を得、これをＣＨ２Ｃｌ２およびシクロヘキサンか
ら再び濃縮して痕跡量の酢酸を除いた。この生成物を、
１ｍｍローターおよび５〜１０％メタノール／メチレン
クロリドを用いてクロマトトロン上で精製した。純粋な
生成物を含有するフラクションをコンバインし、濃縮し
て標記化合物（１２．６ｍｇ、９．３μモル、５８％収
率）を得た。

【００８９】実施例３６ ［Ｏ−アセチルＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−（フルオレセイン
−４−イルメチルアミノスクシニル）Ｔｈｒ］２シクロ
スポリン：［Ｏ−アセチルＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−スクシ
ニルトレオニル］２シクロスポリン（５ｍｇ、３．７μ
モル）を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩（１．４ｍｇ、７．３μモル
）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．０ｍｇ、
８．７μモル）とともにメチレンクロリド（３７μＬ）
中に入れ、室温で一夜撹拌した。この反応混合物をＣＨ
２Ｃｌ２（５ｍｌ）中に取り、水（５ｍｌ）で洗浄した
。ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）で水層を逆抽出し、コンバイ
ンした有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（５ｍｌ）で洗浄し、
無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空濃縮した。

【００９０】ＤＭＦ（８７μＬ）中のトリエチルアミン
（１．０μＬ、７．４μモル）、ジメチルアミノピリジ
ン（５μモル）およびアミノメチルフルオレセイン塩酸
塩（２．３ｍｇ、５．５μモル）を加え、反応混合物を
一夜撹拌した。揮発成分を真空除去し、残渣をメタノー
ル中に取り、０．５ｍｍシリカゲルプレートに適用した
。プレートを２０％メタノール／メチレンクロリドで溶
出した。Ｒｆ＝０．８３のバンドを回収し、メタノール
でシリカゲルから所望の化合物を除いた。１×１０％メ
タノール／メチレンクロリドを用い同様にして再精製し
てＲｆ＝０．７４の生成物バンドを得た。この化合物を
メタノールでシリカゲルから除いて標記化合物を得た。

【００９１】実施例３７ ［Ｏ−（クロロアセチル）ＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−スクシ
ニルＴｈｒ］２シクロスポリン：乾燥チューブおよび撹
拌棒を備えた丸底フラスコ中で、［Ｏ−スクシニルＴｈ
ｒ］２シクロスポリン（１００．７ｍｇ、７６．４μモ
ル）およびジメチルアミノピリジン（２３．１ｍｇ、０
．１９ミリモル）をクロロアセチルクロリド（１．０ｍ
ｌ）中に入れた。この反応混合物を４５°Ｃで一夜撹拌
した。この溶液を室温に冷却し、揮発成分を真空除去し
た。残渣をアセトン（１ｍｌ）中に取り、０°Ｃで１Ｍ
ＮａＯＡｃ溶液（１ｍｌ）で１時間処理して酸クロリド
を加水分解した。この溶液を酢酸エチル（２０ｍｌ）で
抽出した。有機層を水（２×５ｍｌ）および飽和ＮａＣ
ｌ溶液（５ｍｌ）で洗浄し、ついで無水ＭｇＳＯ４で乾
燥させた。濾過し、濃縮して１０５．４ｍｇを得た。こ
の生成物を、１ｍｍローターおよび４．５％メタノール
／０．５％酢酸／９５％メチレンクロリドを用いてクロ
マトトロン上で精製した。 純粋な生成物を含有するフラクションをコンバインし、
濃縮して標記化合物（５３．９ｍｇ、３８．６μモル、
５１％収率）を得た。

【００９２】実施例３８ ［Ｏ−（クロロアセチル）ＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−（フル
オレセイン−４’−イルメチルアミノスクシニル）Ｔｈ
ｒ］２シクロスポリン：撹拌棒および乾燥チューブを備
えた丸底フラスコ中で、［Ｏ−（クロロアセチル）Ｍｅ
Ｂｍｔ］１［Ｏ−スクシニルＴｈｒ］２シクロスポリン
（１１．３ｍｇ、８．１μモル）、１−エチル−３−（
３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（
３．４ｍｇ、１７．７μモル）、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（３．２ｍｇ、２７．８μモル）および４−メ
チルモルホリン（５μＬ、４５．５μモル）をＤＭＦ（
１．０ｍｌ）中に入れた。この反応混合物を室温で一夜
撹拌した。この溶液の１／３を４’−アミノメチルフル
オレセイン塩酸塩（２．２ｍｇ、５．３μモル）と混合
した。４−メチルモルホリンをさらに加えて、みかけの
ｐＨを８〜９とした。この反応混合物を室温で一夜撹拌
した。揮発成分を真空除去し、残渣をメタノール中に取
り、０．５ｍｍシリカゲルプレートに適用した。プレー
トを１５％メタノール／メチレンクロリドで溶出した。 Ｒｆ＝０．９のバンドを回収し、メタノールでシリカゲ
ルから所望の化合物を除くことにより標記化合物を得た
。

【００９３】実施例３９ ［Ｏ−（アジドアセチル）ＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−スクシ
ニルＴｈｒ］１シクロスポリン：［Ｏ−（クロロアセチ
ル）ＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−スクシニルＴｈｒ］２シクロ
スポリン（２７．０ｍｇ、１９．３μモル）、アジ化ナ
トリウム（１２．７ｍｇ、０．１９２ミリモル）および
ＤＭＦ（１．０ｍｌ）を用い、実施例７の手順を繰り返
した。収量は１９．４ｍｇ、１３．８μモル、７２％で
あった。

【００９４】実施例４０ ［Ｏ−（アジドアセチル）ＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−（フル
オレセイン−４’−イルメチルアミノスクシニル）Ｔｈ
ｒ］２シクロスポリン：［Ｏ−（アジドアセチル）Ｍｅ
Ｂｍｔ］１［Ｏ−スクシニルＴｈｒ］２シクロスポリン
（１５．２ｍｇ、１０．８μモル）、１−エチル−３−
（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩（５．８ｍｇ、３０．３μモル）、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミド（４．８ｍｇ、４２μモル）、４−メチル
モルホリン（４μＬ、３６．４μモル）および４’−ア
ミノメチルフルオレセイン塩酸塩（３．９ｍｇ、９．８
μモル）を用い、実施例３７の手順を繰り返した。Ｒｆ
＝０．８７のバンドを回収し、所望の化合物をメタノー
ルでシリカゲルから除いた。同様にして再精製してＲｆ
＝０．８５のバンドを得、これをメタノールで溶出して
標記化合物を得た。

【００９５】実施例４１ ［（３−（Ｒ）−メチル−５−アリル−２−テトラヒド
ロフラニル）サルコシル］１［Ｔｈｒ］２シクロスポリ
ン：Ｎ２導入口および撹拌棒を備えた丸底フラスコ中で
、［Ｔｈｒ］２シクロスポリン（５０ｍｇ、４１μモル
）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（０．７ｍｌ）中に溶解し、ドラ
イアイス／アセトン浴で−７８°Ｃに冷却した。フェニ
ルセレニルクロリド（７．９ｍｇ、４１μモル）をＣＨ
２Ｃｌ２（８０μｌ）中に溶解し、上記冷ペプチド溶液
に滴下した。この反応混合物を−７８°Ｃで２５分間撹
拌した。メタ−クロロ過安息香酸（８．１ｍｇ、４７μ
モル）をＣＨ２Ｃｌ２（８０μｌ）中に溶解し、上記反
応液に滴下した。反応液を撹拌しながらドライアイス／
アセトン浴を室温にもっていった。４時間後、反応液を
ＥｔＯＡｃ（１０ｍｌ）中に取り、５％ＮａＨＣＯ３（
１０ｍｌ）、水（２×５ｍｌ）および飽和ＮａＣｌ溶液
（５ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥
し、濾過し、濃縮した。得られた残渣をフラッシュ−グ
レードシリカゲル（２５ｇ）上で５％メタノール／メチ
レンクロリドを用いてカラムを溶出して精製した。純粋
な生成物を含有するフラクションをコンバインし、濃縮
して標記化合物（３６．７ｍｇ、７３．６％収率）を得
た。

【００９６】実施例４２ ［（３−（Ｒ）−メチル−５−アリル−２−テトラヒド
ロフラニル）サルコシル］１［（Ｏ−スクシニル）Ｔｈ
ｒ］２シクロスポリン：撹拌棒および乾燥チューブを備
えた丸底フラスコ中で、［（３−（Ｒ）−メチル−５−
アリル−２−テトラヒドロフラニル）サルコシル］１［
Ｔｈｒ］２シクロスポリン（３６．７ｍｇ、３０．２μ
モル）を無水コハク酸（３．３ｍｇ、３３μモル）およ
びピリジン（４．６μｌ、６０．４μモル）とともにＤ
ＭＦ（１００μｌ）中に入れた。この反応混合物を室温
で４日間撹拌した。揮発成分を真空除去し、残渣をＣＨ
２Ｃｌ２（１０ｍｌ）中に取り、水（５ｍｌ）で洗浄し
た。水性層をＣＨ２Ｃｌ２（２×５ｍｌ）で逆抽出した
。コンバインした有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾
過し、濃縮して標記化合物（２０．０ｍｇ）を得た。

【００９７】実施例４３ ［（３−（Ｒ）−メチル−５−アリル−２−テトラヒド
ロフラニル）サルコシル］１［Ｏ−（フルオレセイン−
４’−イルメチルアミノスクシニル）Ｔｈｒ］２シクロ
スポリン：撹拌棒および乾燥チューブを備えた丸底フラ
スコ中で、［（３−（Ｒ）−メチル−５−アリル−２−
テトラヒドロフラニル）サルコシル］１［Ｏ−スクシニ
ルＴｈｒ］２シクロスポリン（１０ｍｇ、７．６μモル
）、ジイソプロピルカルボジイミド（１．３μＬ、８．
４μモル）、アミノメチルフルオレセイン塩酸塩（３．
３ｍｇ、８．４μモル）、トリエチルアミン（４．０μ
ｌ、２８μモル）およびジメチルアミノピリジン（１０
μモル）をＤＭＦ（１００μｌ）中に入れた。この反応
混合物を室温で一夜撹拌した。揮発成分を真空除去し、
残渣をメタノール中に取り、０．５ｍｍシリカゲルプレ
ートに適用した。プレートを２０％メタノール／メチレ
ンクロリドで溶出した。Ｒｆ＝０．６４のバンドを回収
し、所望の化合物をメタノールでシリカゲルから除いて
標記化合物を得た。

【００９８】実施例４４ ［Ｏ−（フルオレセイン−４’−イルメチルアミノホル
ミル）ＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−ベンゾイルＳｅｒ］３シク
ロスポリン：撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で、［Ｓ
ｅｒ］２シクロスポリン（２０ｍｇ、１６μモル）をピ
リジン（２００μｌ）中に溶解した。ベンゾイルクロリ
ド（２．１μｌ、１８μモル）およびジメチルアミノピ
リジン（５ｍｇ、４１μモル）を加えた。この反応混合
物を４５°Ｃで２日間撹拌した。揮発成分を真空除去し
、得られた粗製の反応混合物を実施例３および４と同様
にして処理した。揮発成分を真空除去し、残渣をメタノ
ールに取り、１ｍｍシリカゲルプレートに適用し、１×
１５％メタノール／メチレンクロリドで展開した。Ｒｆ
＝０．６の蛍光バンドをメタノールでシリカゲルから除
き、プレートを２×１０％メタノール／メチレンクロリ
ドで展開して同様にして再精製した。Ｒｆ＝０．３のバ
ンドをメタノールでシリカゲルから除いて標記化合物を
得た。

【００９９】実施例４５ ［Ｏ−アセチルＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−（フルオレセイン
−４’−イルメチル）カルボキシメチルＴｈｒ］１シク
ロスポリン：［Ｏ−（カルボキシメチル）Ｔｈｒ］１シ
クロスポリン（サンドスＡＧ、バーゼル、スイスより入
手；１０ｍｇ、８μモル）を乾燥メチレンクロリド（２
００μｌ）中に溶解した。アセチルクロリド（１．７μ
ｌ、２４μモル）を加え、反応混合物を室温で２．５日
間撹拌した。反応液をメチレンクロリド（１ｍｌ）中に
取り、１ＮＨＣｌ（１ｍｌ）および飽和ＮａＣｌ溶液（
１ｍｌ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、
濃縮して［Ｏ−アセチルＭｅＢｍｔ］１［Ｏ−（カルボ
キシメチル）Ｔｈｒ］２シクロスポリンを得た。ついで
、これを実施例２０工程（ａ）および実施例２１と同様
にして処理した。揮発成分を真空除去し、残渣をメタノ
ール中に取り、１ｍｍシリカゲルプレートに適用し、１
×１５％メタノール／メチレンクロリドで展開した。Ｒ
ｆ＝０．６の蛍光バンドをメタノールでシリカゲルから
除いて標記化合物を得た。

【０１００】実施例４６ シクロスポリン血清および全血蛍光偏光イムノアッセイ
： 試薬 本発明の蛍光偏光イムノアッセイを行うための試薬を下
記のようにして調製した。 （ａ）シクロスポリントレーサー試薬：０．０１％（ｗ
／ｖ）ウシガンマグロブリン、０．１％（ｗ／ｖ）アジ
化ナトリウム、５．０％（ｗ／ｖ）エチレングリコール
および０．０５％（ｗ／ｖ）ツイーンＴＭ２０を含有す
る、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中
のシクロスポリントレーサー化合物（実施例４に記載の
方法に従って調製）からなる６０ナノモルシクロスポリ
ントレーサー試薬を調製した。

【０１０１】（ｂ）モノクローナル抗体調製物：シクロ
スポリンに対するマウス（腹水）モノクローナル抗体（
サンドスＡＧ、バーゼル、スイス）を、アジ化ナトリウ
ムを含有するクエン酸緩衝液中に希釈してモノクローナ
ル抗体試薬を調製した。 （ｃ）前処理試薬：０．１ＭトリスＴＭ緩衝液（ｐＨ７
．５）、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、０．５
％（ｗ／ｖ）硫酸銅および１０．０％（ｗ／ｖ）５−ス
ルホサリチル酸塩からなる前処理試薬を調製した。

【０１０２】（ｄ）希釈緩衝液：０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７．５）および０．１％（ｗ／ｖ）ウシガン
マグロブリンからなる希釈緩衝液を調製した。 （ｅ）血清沈澱試薬：７０％（ｗ／ｖ）エチレングリコ
ール、２５％（ｗ／ｖ）メタノールおよび５−スルホサ
リチル酸（０．５ｇ）を含有する水性希釈液中の１０ｍ
Ｍ硫酸亜鉛からなる血清沈澱試薬を調製した。 （ｆ）全血沈澱試薬：６０ｍＭ硫酸亜鉛、５０％（ｗ／
ｖ）メタノールおよび３０％（ｗ／ｖ）エチレングリコ
ールからなる全血沈澱試薬を調製した。

【０１０３】（ｇ）可溶化試薬：２．０％（ｗ／ｖ）タ
ージトールミンフォーム（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ　ｍｉｎ　
ｆｏａｍ）ＴＭ，２．０％（ｗ／ｖ）サポニンおよび０
．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムからなる可溶化試薬
を調製した。 （ｈ）カリブレーター： （１）シクロスポリンおよび人工ヒト全血マトリックス
からなるシクロスポリンモノクローナル全血カリブレー
ターを調製した。これらカリブレーターは、保存剤とし
てアジ化ナトリウムを用い、０．０、１００、２５０、
５００、１０００および１５００ｎｇ／ｍｌの濃度で調
製した。 （２）シクロスポリンおよび血清マトリックスからなる
シクロスポリンモノクローナル血清カリブレーターを調
製した。これらカリブレーターは、保存剤としてアジ化
ナトリウムを用い、０．０、３０、６０、１２０、２４
０および４００ｎｇ／ｍｌの濃度で調製した。

【０１０４】（ｉ）コントロール （１）シクロスポリンおよび人工ヒト全血マトリックス
からなるシクロスポリンモノクローナル全血コントロー
ルを調製した。これらコントロールは、保存剤としてア
ジ化ナトリウムを用い、１５０、４００および８００ｎ
ｇ／ｍｌの濃度で調製した。 （２）シクロスポリンおよび血清マトリックスからシク
ロスポリンモノクローナル血清コントロールを調製した
。 これらコントロールは、保存剤としてアジ化ナノを用い
、４５、９０および３２０ｎｇ／ｍｌの濃度で調製した
。

【０１０５】シクロスポリン血清ＦＰＩＡアッセイプロ
トコール アボットＴＤｘＲセラピューティックドラッグモニタリ
ングアナライザーを用い、血清試料中のシクロスポリン
を決定するための蛍光偏光イムノアッセイを以下のよう
にして行った。各５０μｌのシクロスポリン含有患者血
清試料、コントロールおよびカリブレーターを、ラベル
を付した遠心管にピペットで入れた。ピペットに空気泡
を除いた血清沈澱試薬を満たし、試薬を分配する間、各
遠心管の管壁にピペットの先端を接触させて各遠心管中
に１５０μｌを分配した。ついで、遠心管に蓋をし、回
転ミキサーで１０秒間混合し、遠心管が均等に分布し遠
心ヘッドが平衡を保つように遠心管を遠心ヘッド中に置
いた。透明な上澄み液および変性タンパク質の固くて密
なペレットが得られるまで９，５００×ｇで約３分間遠
心分離にかけた。遠心分離の完了後、各管の蓋を取り、
ＴＤｘサンプルカートリッジの対応試料ウエル中に上澄
み液をデカントした。好ましいＴＤｘアッセイ手順に従
ってアッセイを行うには１５０μｌの上澄み液が必要で
あるので、すべての上澄み液を回収するためサンプルカ
ートリッジの対応試料ウエルの縁で各試験管を軽くたた
いた。

【０１０６】各カリブレーター、コントロールおよび試
料の蛍光偏光値を決定し、アボットＴＤｘアナライザー
の出力テープにプリントした。非線形回帰分析を用いて
各カリブレーターの偏光（Ｐ）と各カリブレーターの濃
度をプロットすることにより標準曲線を装置中で作成し
た。その際、各コントロールおよび試料の濃度は用意し
てある検量曲線（図１）から読み取り、出力テープにプ
リントした。

【０１０７】本発明の好ましい蛍光偏光アッセイの感度
は、１５．０ｎｇ／ｍｌのシクロスポリンおよび代謝産
物である。６０の臨床試料を用いた現在利用できるラジ
オイムノアッセイと比較したとき、線形最小二乗回帰分
析から０．９４７の傾き、７．１５の切片および０．９
６９の相関係数が得られた。

【０１０８】本発明による試験キットをＴＤｘアナライ
ザーと組み合わせて用いる場合は、本発明による蛍光偏
光イムノアッセイを行うための試薬はＴＤｘ試薬パック
の別のバイアル中に入れてよく、その際、試薬パック中
の各バイアルの蓋は除き試薬パック内部の所定のウエル
に置く。従って、いったん試薬パックをＴＤｘアナライ
ザーの内部に入れたら、あとのアッセイ手順は完全に自
動化される。

【０１０９】手動アッセイを行う場合は、試料をまず上
記沈澱試薬で処理し、ついで希釈緩衝液と混合する。つ
いで、試料を入れた試験管に抗体試薬および前処理溶液
を入れ、バックグラウンド蛍光を読み取る。ついで、ト
レーサー化合物および希釈緩衝液を試料に加え、インキ
ュベート後、蛍光偏光を読み取る。

【０１１０】シクロスポリン全血ＦＰＩＡアッセイプロ
トコール アボットＴＤｘＲセラピューティックドラッグアナライ
ザーを用い、全血試料中のシクロスポリンを決定するた
めの蛍光偏光イムノアッセイを以下のようにして行った
。各１５０μｌのシクロスポリン含有患者全血試料、コ
ントロールおよびカリブレーターを、ラベルを付した遠
心管にピペットで入れ、各管に可溶化試薬（５０μｌ）
を加えた。ピペットに空気泡を除いた全血沈澱試薬を満
たし、各遠心管の管壁にピペットの先端を接触させて各
遠心管中に３００μｌを分配した。ついで、遠心管に蓋
をし、回転ミキサーで１０秒間混合し、遠心管が均等に
分布し遠心ヘッドが平衡を保つように遠心管を遠心ヘッ
ド中に置いた。透明な上澄み液および変性タンパク質の
固くて密なペレットが得られるまで９，５００×ｇで約
３分間遠心分離にかけた。遠心分離の完了後、各管の蓋
を取り、ＴＤｘサンプルカートリッジの対応試料ウエル
中に上澄み液をデカントし、各カリブレーター、コント
ロールおよび試料の蛍光偏光値を決定し、アボットＴＤ
ｘアナライザーの出力テープにプリントした（上記参照
）。非線形回帰分析を用いて各カリブレーターの偏光（
Ｐ）と各カリブレーターの濃度をプロットすることによ
り標準曲線を装置中で作成した。その際、各コントロー
ルおよび試料の濃度は用意してある検量曲線（図２）か
ら読み取り、出力テープにプリントした。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　本発明のシクロスポリントレーサー化合物
を用いた蛍光偏光イムノアッセイにおいて、血清試料中
のシクロスポリンの量を決定する際に用いる検量曲線で
ある。

【図２】　　本発明のシクロスポリントレーサー化合物
を用いた蛍光偏光イムノアッセイにおいて、全血試料中
のシクロスポリンの量を決定する際に用いる検量曲線で
ある。

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　式： 【化１】 （式中、Ｒ１は式： 【化２】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ２は式： 【化３】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ３は式： 【化４】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ４は式： 【化５】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ５は式： 【化６】 で示されるアミノ酸残基；Ｚは検出可能なシグナルを生
   成し得る検出可能な残基；ただし、Ｒ１が「化２」であ
   る場合、Ｘ１は水素以外の原子数が１〜２０の連結基で
   あり、Ｒ２は（Ｌ）−α−アミノ酪酸残基または（Ｌ）
   −トレオニン残基、または（Ｌ）−トレオニン残基にお
   いて水酸基が炭素数１〜１０のアシル基もしくはフルオ
   レセイニル基でアシル化されているものであり、Ｒ３は
   サルコシン残基、（Ｄ）−セリン残基、または（Ｄ）−
   アラニン残基であり、Ｒ５は（Ｎ）−メチル−（Ｌ）−
   ロイシン残基であり、Ｒ２が「化３」である場合、Ｘ２
   は水素以外の原子数が１〜３０の連結基であり、Ｒ１は
   ＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、ＭｅＢｍｔの環化
   誘導体、または水酸基が炭素数１〜１０のアシル基また
   はフルオレセイニル残基でアシル化されたＭｅＢｍｔの
   誘導体であり、Ｒ３はサルコシン残基、（Ｄ）−セリン
   残基、または（Ｄ）−セリン残基において水酸基が炭素
   数１〜１０のアシル基でアシル化されたものであり、Ｒ
   ４は（Ｄ）−アラニン残基であり、Ｒ５は（Ｎ）−メチ
   ル−（Ｌ）−ロイシン残基であり、Ｒ３が「化４」であ
   る場合は、Ｘ１は水素以外の原子数が１〜３０の連結基
   であり、Ｒ１はＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、Ｍ
   ｅＢｍｔの環化誘導体、または水酸基が炭素数１〜２０
   のアシル基でアシル化されたＭｅＢｍｔの誘導体であり
   、Ｒ４は（Ｄ）−アラニン残基であり、Ｒ５は（Ｎ）−
   メチル−（Ｌ）−ロイシン残基であり、Ｒ４が「化５」
   である場合は、Ｘ１は水素以外の原子数が１〜２０の連
   結基であり、Ｒ１はＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ
   、ＭｅＢｍｔの環化誘導体、または水酸基が炭素数１〜
   １０のアシル基でアシル化されたＭｅＢｍｔの誘導体で
   あり、Ｒ２は（Ｌ）−α−アミノ酪酸残基または（Ｌ）
   −トレオニン残基、または（Ｌ）−トレオニン残基にお
   いて水酸基が炭素数１〜１０のアシル基でアシル化され
   たものであり、Ｒ５は（Ｎ）−メチル−（Ｌ）−ロイシ
   ン残基であり、Ｒ５が「化６」である場合は、Ｘ１は水
   素以外の原子数が１〜２０の連結基であり、Ｒ１はＭｅ
   Ｂｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、ＭｅＢｍｔの環化誘導
   体、または水酸基が炭素数１〜１０のアシル基でアシル
   化されたものであり、Ｒ２は（Ｌ）−α−アミノ酪酸残
   基または（Ｌ）−トレオニン残基、または（Ｌ）−トレ
   オニン残基において水酸基が炭素数１〜１０のアシル基
   でアシル化されたものであり、Ｒ４は（Ｄ）−アラニン
   残基である）で示されるシクロスポリン誘導体またはそ
   の塩。
2. 【請求項２】　　式： 【化７】 （式中、Ｆｌは検出可能な残基、Ｘ１は水素以外の原子
   数が１〜１５の連結基、Ｒ１は水素、ＯＨまたはＯＣＯ
   Ｒ６（式中、Ｒ６は炭素数１〜６のアルキル基またはＸ
   １−Ｆｌである）で示される基である）で示される請求
   項１に記載のシクロスポリン誘導体またはその塩。
3. 【請求項３】　　式： 【化８】 （式中、Ｒ７は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｒ
   ８は水素またはＣＨ２ＯＲ７（式中、Ｒ７は前記と同じ
   ）、Ｘ２は水素以外の原子数が１〜３０の連結基、Ｆｌ
   は検出可能な残基である）で示される請求項１に記載の
   シクロスポリン誘導体またはその塩。
4. 【請求項４】　　式： 【化９】 （式中、Ｒ７は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｒ
   ９は水素またはＯＲ７、Ｘ１は水素以外の原子数が１〜
   １５の連結基、Ｆｌは検出可能な残基である）で示され
   る請求項１に記載のシクロスポリン誘導体またはその塩
   。
5. 【請求項５】　　式： 【化１０】 （式中、Ｒ７は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｘ
   １は水素以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｆｌは検出
   可能な残基である）で示される請求項１に記載のシクロ
   スポリン誘導体またはその塩。
6. 【請求項６】　　式： 【化１１】 （式中、Ｒ７は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｘ
   １は水素以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｆｌは検出
   可能な残基である）で示される請求項１に記載のシクロ
   スポリン誘導体またはその塩。
7. 【請求項７】　　該検出可能な残基が、化学発光分子、
   発光分子および酵素分子よりなる群から選ばれたもので
   ある、請求項１に記載のシクロスポリン誘導体またはそ
   の塩。
8. 【請求項８】　　該発光分子がフルオレセイン分子また
   はその誘導体である請求項７に記載のシクロスポリン誘
   導体またはその塩。
9. 【請求項９】　　該フルオレセイン分子またはその誘導
   体が、アミノフルオレセイン、カルボキシフルオレセイ
   ンおよびフルオレセインアミンよりなる群から選ばれた
   ものである、請求項８に記載のシクロスポリン誘導体ま
   たはその塩。
10. 【請求項１０】　　試料中のシクロスポリン、またはシ
    クロスポリンおよびシクロスポリンの代謝産物を決定す
    る方法であって、 （ａ）該試料を式： 【化１２】 （式中、Ｒ１は式： 【化１３】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ２は式： 【化１４】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ３は式： 【化１５】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ４は式： 【化１６】 で示されるアミノ酸残基；Ｒ５は式： 【化１７】 で示されるアミノ酸残基；Ｚは検出可能なシグナルを生
    成し得る蛍光残基またはその誘導体；ただし、Ｒ１が「
    化１３」である場合、Ｘ１は水素以外の原子数が１〜２
    ０の連結基であり、Ｒ２は（Ｌ）−α−アミノ酪酸残基
    または（Ｌ）−トレオニン残基、または（Ｌ）−トレオ
    ニン残基において水酸基が炭素数１〜１０のアシル基も
    しくはフルオレセイニル基でアシル化されているもので
    あり、Ｒ３はサルコシン残基、（Ｄ）−セリン残基、ま
    たは（Ｄ）−アラニン残基であり、Ｒ５は（Ｎ）−メチ
    ル−（Ｌ）−ロイシン残基であり、Ｒ２が「化１４」で
    ある場合、Ｘ２は水素以外の原子数が１〜３０の連結基
    であり、Ｒ１はＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、Ｍ
    ｅＢｍｔの環化誘導体、または水酸基が炭素数１〜１０
    のアシル基またはフルオレセイニル残基でアシル化され
    たＭｅＢｍｔの誘導体であり、Ｒ３はサルコシン残基、
    （Ｄ）−セリン残基、または（Ｄ）−セリン残基におい
    て水酸基が炭素数１〜１０のアシル基でアシル化された
    ものであり、Ｒ４は（Ｄ）−アラニン残基であり、Ｒ５
    は（Ｎ）−メチル−（Ｌ）−ロイシン残基であり、Ｒ３
    が「化１５」である場合は、Ｘ１は水素以外の原子数が
    １〜３０の連結基であり、Ｒ１はＭｅＢｍｔ、ジヒドロ
    −ＭｅＢｍｔ、ＭｅＢｍｔの環化誘導体、または水酸基
    が炭素数１〜２０のアシル基でアシル化されたＭｅＢｍ
    ｔの誘導体であり、Ｒ４は（Ｄ）−アラニン残基であり
    、Ｒ５は（Ｎ）−メチル−（Ｌ）−ロイシン残基であり
    、Ｒ４が「化１６」である場合は、Ｘ１は水素以外の原
    子数が１〜２０の連結基であり、Ｒ１はＭｅＢｍｔ、ジ
    ヒドロ−ＭｅＢｍｔ、ＭｅＢｍｔの環化誘導体、または
    水酸基が炭素数１〜１０のアシル基でアシル化されたＭ
    ｅＢｍｔの誘導体であり、Ｒ２は（Ｌ）−α−アミノ酪
    酸残基または（Ｌ）−トレオニン残基、または（Ｌ）−
    トレオニン残基において水酸基が炭素数１〜１０のアシ
    ル基でアシル化されたものであり、Ｒ５は（Ｎ）−メチ
    ル−（Ｌ）−ロイシン残基であり、Ｒ５が「化１７」で
    ある場合は、Ｘ１は水素以外の原子数が１〜２０の連結
    基であり、Ｒ１はＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、
    ＭｅＢｍｔの環化誘導体、または水酸基が炭素数１〜１
    ０のアシル基でアシル化されたものであり、Ｒ２は（Ｌ
    ）−α−アミノ酪酸残基または（Ｌ）−トレオニン残基
    、または（Ｌ）−トレオニン残基において水酸基が炭素
    数１〜１０のアシル基でアシル化されたものであり、Ｒ
    ４は（Ｄ）−アラニン残基である）で示されるシクロス
    ポリン誘導体またはその塩、および（ｉ）シクロスポリ
    ン、またはシクロスポリンおよびシクロスポリンの代謝
    産物、および（ｉｉ）該シクロスポリン誘導体、に結合
    して反応溶液を生成し得る抗体であって、該シクロスポ
    リン誘導体が該抗体の存在に対して検出可能な蛍光偏光
    応答を生成し得るもの、と接触させ、 （ｂ）該反応溶液に偏光平面を通して蛍光偏光応答を得
    、ついで （ｃ）該反応溶液に対する該蛍光偏光応答を、試料中に
    存在するシクロスポリンまたはシクロスポリンおよびシ
    クロスポリンの代謝産物の量の関数として検出すること
    を特徴とする方法。
11. 【請求項１１】　　該シクロスポリン誘導体が式：【化
    １８】 （式中、Ｆｌは蛍光残基またはその誘導体、Ｘ１は水素
    以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｒ１は水素、ＯＨま
    たはＯＣＯＲ６（式中、Ｒ６は炭素数１〜６のアルキル
    基またはＸ１−Ｆｌである）で示される基である）で示
    される化合物またはその塩である、請求項１０に記載の
    方法。
12. 【請求項１２】　　該シクロスポリン誘導体が式：【化
    １９】 （式中、Ｒ７は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｒ
    ８は水素またはＣＨ２ＯＲ７（式中、Ｒ７は前記と同じ
    ）、Ｘ２は水素以外の原子数が１〜３０の連結基、Ｆｌ
    は蛍光残基またはその誘導体である）で示される化合物
    またはその塩である、請求項１０に記載の方法。
13. 【請求項１３】　　該シクロスポリン誘導体が式：【化
    ２０】 （式中、Ｒ７は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｒ
    ９は水素またはＯＲ７、Ｘ１は水素以外の原子数が１〜
    １５の連結基、Ｆｌは蛍光残基またはその誘導体である
    ）で示される化合物またはその塩である、請求項１０に
    記載の方法。
14. 【請求項１４】　　該シクロスポリン誘導体が式：【化
    ２１】 （式中、Ｒ７は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｘ
    １は水素以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｆｌは蛍光
    残基またはその誘導体である）で示される化合物または
    その塩である、請求項１０に記載の方法。
15. 【請求項１５】　　該シクロスポリン誘導体が式：【化
    ２２】 （式中、Ｒ７は水素または炭素数１〜６のアシル基、Ｘ
    １は水素以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｆｌは蛍光
    残基またはその誘導体である）で示される化合物または
    その塩である、請求項１０に記載の方法。
16. 【請求項１６】　　該抗体がシクロスポリンおよび該シ
    クロスポリン誘導体に結合し得るものである、請求項１
    ０に記載の方法。
17. 【請求項１７】　　生物学的試料中のシクロスポリン、
    またはシクロスポリンおよびシクロスポリンの代謝産物
    の量を決定するための蛍光偏光イムノアッセイに使用す
    る試験キットであって、 （ａ）式： 【化２３】 （式中、Ｆｌは蛍光残基またはその誘導体、Ｘ１は水素
    以外の原子数が１〜１５の連結基、Ｒ１は水素、ＯＨま
    たはＯＣＯＲ６（式中、Ｒ６は炭素数１〜６のアルキル
    基またはＸ１−Ｆｌである）で示される基である）で示
    されるシクロスポリン誘導体、および （ｂ）（ｉ）シクロスポリン、またはシクロスポリンお
    よびシクロスポリンの代謝産物、および（ｉｉ）該シク
    ロスポリン誘導体、に結合して反応溶液を生成し得る抗
    体であって、該シクロスポリン誘導体が該抗体の存在に
    対して検出可能な蛍光偏光応答を生成し得るものからな
    ることを特徴とする試験キット。