CN114790203A - 一种东莨菪碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种东莨菪碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。东莨菪碱人工半抗原的分子结构如式（Ⅰ），东莨菪碱人工抗原的分子结构如式（Ⅱ）。本发明的东莨菪碱人工半抗原最大程度的保留了东莨菪碱的特征结构，且在远离这些主要特征结构的端位上引入了能与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的东莨菪碱人工抗原可进行小鼠免疫获得高亲和力、高灵敏度、强特异性的抗东莨菪碱单克隆抗体，可用于对东莨菪碱进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种东莨菪碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
背景技术
东莨菪碱（Scopolamine）是一种莨菪烷型生物碱，主要存在于茄科植物颠茄类和曼陀罗类中，是洋金花、赛莨菪和天仙子中主要的生物碱。临床上，东莨菪碱主要用于镇痛、麻醉、抗晕动症、帕金森症、改善微循环、戒毒脱瘾、农药中毒等，市场需求巨大。
自上世纪50年代末被用于治疗某些危重症获得成功后，该药被广泛的关注，尤其是近年来在临床医疗上应用范围日趋广泛，取得了令人注目的疗效。比如在治疗呼吸系统疾病、感染性休克、心血管疾病、消化系统疾病、神经系统疾病等疾病中都有重要用途。它的不良反应一般有口干、分泌物变稠、面色潮红、躁动不安、激动、幻觉、谵妄、尿潴留、视物模糊、腹胀、体温升高等；偶见有心律失常及惊厥、昏迷等情况。本药小剂量表现为镇静作用，大剂量产生催眠作用。因此很有必要建立一种快速、灵敏、准确的检测东莨菪碱的方法，这有助于确定东莨菪碱的滥用。
目前，对东莨菪碱的检测主要依靠气相色谱-质谱联用法（GC-MS)、液相色谱四级杆飞行时间质谱仪（Q-TOF LC/MS）、核磁共振氢谱（H NMR）、核磁共振碳谱（13C NMR）、核磁共振氟谱（19F NMR）、红外光谱（IR）等方法，但都存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员操作等缺点，因此不能达到现代检测对简便、快速、准确的要求。
而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合的原理检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法，该方法的关键就是要制备出该小分子化合物对应的完全抗原和对该抗原具有高特异性、高亲和力的抗体。由于大多数小分子化合物（分子量小于1000），缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，因此不具有免疫原性，故小分子物质属于半抗原。而小分子物质通过适当的化学修饰，在半抗原分子结构的某个位点上连接上端部为活性基团的连接臂，再与大分子载体结合，就可制成半抗原-载体偶联物即完全抗原或人工抗原，人工抗原则可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体从而制备出该特异性抗体。
因此有必要提供一种有效的东莨菪碱人工抗原的制备方法，制备的东莨菪碱人工抗原可用于动物免疫制备具有特异性的抗东莨菪碱抗体，进一步用于检测。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中对东莨菪碱的检测方法都存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员操作等缺点，提供了一种东莨菪碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用以克服上述缺陷。
为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种东莨菪碱人工半抗原，其特征在于，
其分子结构如（Ⅰ）所示：
其中，n的范围为1~3。
本发明中的东莨菪碱人工半抗原，其通过对东莨菪碱进行修饰，在远离其主要活性基团的端位上引入了新的活性基团，这样既可以最大限度的保留其特征结构，又提供了可以与载体蛋白偶联的活性位点。
与采用环状的连接臂相比，本发明所采用的连接臂为链状，可以尽可能的降低免疫时T细胞对连接臂的识别度，这样免疫得到的抗体对东莨菪碱的特异性和亲合力更强。
作为优选，所述东莨菪碱人工半抗原，其分子结构如（Ⅰ-Ⅰ）所示：
本发明中的优选的东莨菪碱人工半抗原中采用具有丁二酸结构的连接臂，经过筛选之后发现，这种丁二酸结构的连接臂其具有更好的反应活性，同时在与蛋白载体偶联制备成人工抗原后，其效价更强，对于东莨菪碱的检测更为灵敏。
如上所述的东莨菪碱人工半抗原的制备方法，
包括以下步骤：以氢溴酸三水东莨菪碱以及二酸酐为原料，进行反应，得到东莨菪碱人工半抗原。
本发明中的所涉及到的东莨菪碱人工半抗原的制备方法的关键因素在于在东莨菪碱分子结构的羟基基团上引入具有羧基的活性手臂。本发明在经过多种合成方案筛选后，选择采用二酸酐作为原料，通过酸酐基团与羟基之间的缩合反应制备得到，本发明中的这种制备方法具有工艺简单有效，无需高温高压的制备条件。
作为优选，具体包括以下步骤：
（1）将氢溴酸三水东莨菪碱溶于纯化水中，用氨水调节溶液的pH，经过萃取、干燥、过滤、减压蒸干得微白色油状物A；
（2）将微白色油状物A溶于吡啶中，再加入二酸酐和4-二甲氨基吡啶，回流搅拌反应，自然冷却至室温，减压蒸干溶剂，经萃取、纯化水洗涤、干燥、过滤、减压蒸干得东莨菪碱人工半抗原。
作为优选，所述步骤（1）中用氨水调节溶液的pH为8~10；
所述步骤（2）中回流搅拌反应温度为90~110℃，反应时间15~24h。
作为优选，所述二酸酐为丁二酸酐。
一种东莨菪碱人工抗原，其分子结构如（Ⅱ）所示：
其中，n的范围为1~3。
进一步优选，东莨菪碱人工抗原，其分子结构如（Ⅱ-Ⅰ）所示：
如权利要求1所述的东莨菪碱人工抗原的制备方法，其特征在于，
所述东莨菪碱人工抗原通过活泼酯法使东莨菪碱人工半抗原与牛血清蛋白结合获得。
本发明选用的牛血清蛋白（BSA）作为大分子载体，与其他载体蛋白相比，具有以下优点：①BSA具有583个氨基酸残基，较容易与东莨菪碱半抗原发生偶联，可制得不同偶联比的东莨菪碱人工抗原，且具有较高的免疫原性；②BSA经济实惠，成本低；③BSA的化学性质比较稳定，在酸性和弱碱性的环境下也有很好的溶解度和稳定性，适合长期储存。
作为优选，具体包括以下步骤：
（a）将东莨菪碱人工半抗原（Ⅰ）、N-羟基琥珀酰亚胺以及二环己基碳二亚胺溶于有机溶剂中，发生反应，取上清液得到含有活化的东莨菪碱人工半抗原的反应液；
（b）将含有活化的东莨菪碱人工半抗原的反应液滴加到牛血清蛋白溶液中，发生偶联反应，得到东莨菪碱人工抗原。
作为优选，所述步骤（a）中：东莨菪碱人工半抗原（Ⅰ）、N-羟基琥珀酰亚胺以及二环己基碳二亚胺三者的摩尔比为1∶(1.2~1.5)∶(1.2~1.5)，室温搅拌反应12~24h；
所述步骤（b）中：反应温度为3~6℃，反应时间10~18h。
作为优选，所述步骤（b）中：牛血清蛋白溶液的浓度为2~8 mg/ml；
含有活化的东莨菪碱人工半抗原的反应液与牛血清蛋白溶液的体积比为1：（8~15）。
本发明还提供了所述东莨菪碱人工半抗原或者东莨菪碱人工抗原在制备抗东莨菪碱抗体中的应用。
本发明还提供了一种抗东莨菪碱抗体，是由所述的东莨菪碱人工抗原经动物免疫得到的，可与东莨菪碱发生特异性免疫反应的球蛋白。
实验发现，将所述东莨菪碱人工抗原免疫Balb/c小鼠，得到含单克隆抗体的腹水的效价是1：90000。表明本发明的东莨菪碱人工抗原可免疫获得高亲和力、高灵敏度、强特异性的抗东莨菪碱抗体，该抗东莨菪碱抗体可用于东莨菪碱的免疫检测和分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的东莨菪碱人工抗原最大程度地保留了东莨菪碱的特征结构，且在远离主要特征结构的端位上引入了可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的东莨菪碱人工抗原可免疫获得高亲和力、高灵敏度、强特异性的抗东莨菪碱抗体，经免疫Balb/c小鼠获得的腹水效价高达1：90000，可用于对东莨菪碱进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
附图说明
图1为本发明实施例1东莨菪碱人工抗原Ⅱ-Ⅰ的制备流程图；
其中：BSA表示牛血清蛋白、Py表示吡啶、DMAP表示4-二甲胺基吡啶、DCC表示二环己基碳二亚胺、DMF表示N,N-二甲基甲酰胺，下同。
图2为本发明东莨菪碱人工半抗原Ⅰ-Ⅰ的液相色谱图；
其中：mAU表示毫吸光度单位，min表示分钟。
图3为本发明东莨菪碱半抗原Ⅰ-Ⅰ的ESI-MS高分辨谱图；
其中：Intens.表示信号强度；m/z表示质荷比。
图4为牛血清蛋白（BSA）、东莨菪碱人工抗原Ⅱ-Ⅰ偶联的SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）鉴定图。
图5为本发明实施例2东莨菪碱人工抗原Ⅱ-Ⅱ的制备流程图。
图6为本发明实施例3东莨菪碱人工抗原Ⅱ-Ⅲ的制备流程图。
图7为对比例1东莨菪碱人工抗原Ⅳ的制备流程图；
其中：TFA表示三氟乙酸、DCM表示二氯甲烷，NHS表示N-羟基琥珀酰亚胺，下同。
图8为对比例2东莨菪碱人工抗原Ⅴ的制备流程图；
其中：BGG表示牛丙种球蛋白，下同。
图9为对比例3东莨菪碱人工抗原Ⅵ的制备流程图；
其中：EDCI表示1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，下同。
图10为对比例4东莨菪碱人工抗原Ⅶ的制备流程图。
图11为对比例5东莨菪碱人工抗原Ⅷ的制备流程图。
图12为对比例6东莨菪碱人工抗原Ⅸ的制备流程图。
图13为对比例7东莨菪碱人工抗原Ⅹ的制备流程图。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施一种东莨菪碱人工抗原的制备方法（反应历程如图1），包括以下步骤：
（1）东莨菪碱人工半抗原Ⅰ-Ⅰ的制备：
①称取氢溴酸三水东莨菪碱200mg（0.457mmol）溶于10ml纯化水中，用浓氨水调节溶液的pH=9，再用3*20ml二氯甲烷萃取，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩得微白色油状物A132mg（0.436mmol）；
对该微白色油状物A进行TLC检测，层析液为二氯甲烷：95%乙醇：1,4-二氧六环：氨水=10:8:1:1（v/v），产物Rf=0.9；
②将微白色油状物A132mg（0.436mmol）溶于10ml吡啶中，再加入丁二酸酐87mg（0.87mmol）和4-二甲氨基吡啶13mg（原料质量的10%），在100℃的油浴中回流搅拌反应18小时；反应结束后，自然冷却至室温，减压蒸干溶剂得棕黑色油状物，加入20ml二氯甲烷溶解残渣，用2*20ml纯化水洗涤有机相，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干得棕黑色油状残渣。该残渣经薄层色谱（TLC）（溶剂和洗脱剂为无水乙醇，展开剂为二氯甲烷：95%乙醇：1,4-二氧六环：氨水=10:8:1:1（v/v），产物的Rf=0.3）分离得淡黄色油状物Ⅰ-Ⅰ63mg（0.156mmol），即所述的东莨菪碱人工半抗原Ⅰ-Ⅰ。
对该东莨菪碱人工半抗原Ⅰ进行TLC检测，层析液为二氯甲烷：95%乙醇：1,4-二氧六环：氨水=10:8:1:1（v/v），产物Rf=0.3；
东莨菪碱人工半抗原Ⅰ-Ⅰ的液相色谱图见图2（紫外检测器，波长215nm），东莨菪碱半抗原Ⅰ-Ⅰ的ESI-MS高分辨谱图见图3。
从图2可以看出经过纯化得到的东莨菪碱人工半抗原Ⅰ-Ⅰ的纯度达99.9%以上，从图3可以看出本实施例1得到的东莨菪碱人工半抗原Ⅰ-Ⅰ的分子离子峰的质荷比（m/z）为403，与其理论分子量吻合，可以确定步骤⑦得到的最终化合物就是本发明所设计的东莨菪碱人工半抗原。
(2)东莨菪碱人工抗原Ⅱ-Ⅰ的制备：
③取东莨菪碱半抗原Ⅰ-Ⅰ63mg（0.156mmol）与N-羟基琥珀酰亚胺24mg（0.211mmol）、环己基碳酰二亚胺43mg（0.211mmol）置于25ml的单口圆底烧瓶中，加入3.15mlN,N-二甲基甲酰胺溶解，室温下搅拌反应18小时，有大量的白色沉淀产生，反应结束后以8000r/min离心10分钟，弃沉淀，取上清液，备用；
④称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用纯化水溶解定容至5.0L，得到0.01M的PBS缓冲液，pH为7.4；
⑤称取160mg牛血清蛋白溶于32mlPBS缓冲液中，搅拌均匀，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液；
⑥室温下，将③的上清液缓慢滴加到快速搅拌的⑤的溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1:10，滴加完毕继续搅拌反应0.5小时，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
⑦将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤④的PBS缓冲液透析7次，透析结束后以10000r/min离心10分钟，弃沉淀，取上清液即得到人工抗原：东莨菪碱-牛血清蛋白偶联物（如式Ⅱ-Ⅰ）。图4是东莨菪碱人工抗原Ⅱ-Ⅰ的SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）鉴定图。
从图4中可以看出，牛血清蛋白（BSA）的泳动速度明显大于东莨菪碱人工抗原Ⅱ-Ⅰ的泳动速度，说明东莨菪碱人工抗原Ⅱ-Ⅰ的相对分子质量大于牛血清蛋白（BSA），证明东莨菪碱半抗原Ⅰ-Ⅰ与牛血清蛋白（BSA）已成功偶联。
实施例2
本实施一种东莨菪碱人工抗原的制备方法（反应历程如图5），包括以下步骤：
①与实施例1相同。
②将微白色油状物A128mg（0.422mmol）溶于10ml吡啶中，再加入戊二酸酐96mg（0.84mmol）和4-二甲氨基吡啶13mg（原料质量的10%），在110℃的油浴中回流搅拌反应18小时；反应结束后，自然冷却至室温，减压蒸干溶剂得棕黑色油状物，加入20ml二氯甲烷溶解残渣，用2*20ml纯化水洗涤有机相，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干得棕黑色油状残渣。该残渣经薄层色谱（TLC）（溶剂和洗脱剂为无水乙醇，展开剂为二氯甲烷：95%乙醇：1,4-二氧六环：氨水=10:8:1:1（v/v），产物的Rf=0.3）分离得淡黄色油状物Ⅰ-Ⅱ71mg，即所述的东莨菪碱人工半抗原Ⅰ-Ⅱ。
(2)东莨菪碱人工抗原Ⅱ-Ⅱ的制备：
③取东莨菪碱半抗原Ⅰ-Ⅱ71mg（0.170mmol）与N-羟基琥珀酰亚胺23mg（0.204mmol）、环己基碳酰二亚胺42mg（0.204mmol）置于25ml的单口圆底烧瓶中，加入3.55mlN,N-二甲基甲酰胺溶解，室温下搅拌反应24小时，有大量的白色沉淀产生，反应结束后以8000r/min离心10分钟，弃沉淀，取上清液，备用；
④~⑦与实施例1相同，最终制备得到人工抗原Ⅱ-Ⅱ。
实施例3
本实施一种东莨菪碱人工抗原的制备方法（反应历程如图6），包括以下步骤：
①与实施例1相同。
②将微白色油状物A122mg（0.403mmol）溶于10ml吡啶中，再加入己二酸酐104mg（0.81mmol）和4-二甲氨基吡啶12mg（原料质量的10%），在90℃的油浴中回流搅拌反应24小时；反应结束后，自然冷却至室温，减压蒸干溶剂得棕黑色油状物，加入20ml二氯甲烷溶解残渣，用2*20ml纯化水洗涤有机相，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干得棕黑色油状残渣。该残渣经薄层色谱（TLC）（溶剂和洗脱剂为无水乙醇，展开剂为二氯甲烷：95%乙醇：1,4-二氧六环：氨水=10:8:1:1（v/v），产物的Rf=0.3）分离得淡黄色油状物Ⅰ-Ⅲ67mg，即所述的东莨菪碱人工半抗原Ⅰ-Ⅲ。
(2)东莨菪碱人工抗原Ⅱ-Ⅲ的制备：
③取东莨菪碱半抗原Ⅰ-Ⅲ67mg（0.156mmol）与N-羟基琥珀酰亚胺27mg（0.234mmol）、环己基碳酰二亚胺41mg（0.234mmol）置于25ml的单口圆底烧瓶中，加入3.35mlN,N-二甲基甲酰胺溶解，室温下搅拌反应18小时，有大量的白色沉淀产生，反应结束后以8000r/min离心10分钟，弃沉淀，取上清液，备用；
④~⑦与实施例1相同，最终制备得到人工抗原Ⅱ-Ⅲ。
对比例1
本实施一种东莨菪碱人工抗原的制备方法（反应历程如图7），包括以下步骤：
(1)东莨菪碱人工半抗原Ⅲ的制备：
①称取氢溴酸三水东莨菪碱200mg（0.457mmol）溶于10ml纯化水中，用浓氨水调节溶液的pH=9，再用3*20ml二氯甲烷萃取，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩得微白色油状物A124mg（0.409mmol）；
对该微白色油状物A进行TLC检测，层析液为二氯甲烷：95%乙醇：1,4-二氧六环：氨水=10:8:1:1（v/v），产物Rf=0.9；
②将微白色油状物A124mg（0.409mmol）溶于5ml乙腈中置于50ml单口圆底烧瓶中，在0℃冰水浴中搅拌，缓慢加入N,N-二异丙基乙胺213μL（1.227mmol）再加入溴乙酸叔丁酯179μL（1.227mmol），慢慢升温至室温，继续搅拌反应15小时；结束反应，减压蒸干溶剂得到黄色油状物，加入20ml氯仿溶解残渣，分别用20ml纯化水和20ml饱和的食盐水洗涤有机相，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干溶剂得324mg黄色油状物。该黄色油状物经过薄层色谱（溶剂和洗脱机为无水乙醇，展开剂为乙酸乙酯，Rf=0.8）分离后得到158mg（0.379mmol）黄色油状物B。
对该黄色油状物B进行TLC检测，层析液为层析液为乙酸乙酯，产物Rf =0.8；
③将上步黄色油状物B158mg（0.379mmol）溶于5ml二氯甲烷和5ml三氟乙酸，此时溶液为橙红色，室温搅拌反应6小时；结束反应，减压蒸干溶剂得到橙红色油状残渣，加入10ml甲苯再蒸干，如此重复两次，该残渣用20ml二氯甲烷溶解，分别用20ml纯化水和20ml饱和的食盐水洗涤有机相，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干溶剂得橙红色油状残渣。该橙红色油状残渣经过薄层色谱（溶剂和洗脱机为无水乙醇，展开剂为二氯甲烷：95%乙醇：1，4-二氧六环：浓氨水=10:8:1:1（v/v），Rf=0.4）分离后得到103mg（0.285mmol）黄色油状物，即东莨菪碱人工半抗原Ⅲ；
(2) 东莨菪碱人工抗原Ⅳ的制备：
④取东莨菪碱半抗原Ⅲ103mg（0.285mmol）与N-羟基琥珀酰亚胺44mg（0.385mmol）、环己基碳酰二亚胺79mg（0.385mmol）置于25ml的单口圆底烧瓶中，加入5.15mlN,N-二甲基甲酰胺溶解，室温下搅拌反应18小时，有大量白色沉淀产生，此时为黄色浊液，反应结束后以8000r/min离心10分钟，弃沉淀，取上清液，备用；
⑤称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用纯化水溶解定容至5.0L，得到0.01M 、pH为7.4的PBS缓冲液；
⑥称取260mg牛血清蛋白溶于52mlPBS缓冲液中，搅拌均匀，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液；
⑦室温下，将④的上清液缓慢滴加到快速搅拌的⑥的溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1:10，滴加完毕后继续搅拌反应0.5小时，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
⑧将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑤的PBS缓冲液透析7次，透析结束后以10000r/min离心10分钟，弃沉淀，取上清液即得到东莨菪碱人工抗原Ⅳ。
对比例2
本实施一种东莨菪碱人工抗原的制备方法（反应历程如图8），包括以下步骤：
（1）东莨菪碱人工半抗原Ⅲ的制备：
①～③与对比例1相同。
（2）东莨菪碱人工抗原Ⅴ的制备：
④～⑧与对比例1相似，只是将牛血清蛋白替换为牛丙种球蛋白作为载体，与东莨菪碱人工半抗原Ⅲ进行偶联，得到东莨菪碱人工抗原Ⅴ。
对比例3
本实施一种东莨菪碱人工抗原的制备方法（反应历程如图9），包括以下步骤：
（1）东莨菪碱人工半抗原Ⅲ的制备：
①～③分别与对比例1相同。
（2）东莨菪碱人工抗原Ⅵ的制备：
④取东莨菪碱半抗原Ⅲ100mg（0.277mmol）置于25ml单口圆底烧瓶中，加入4ml四氢呋喃中溶解为黄色透明溶液，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐159mg（0.831mmol）、N-羟基琥珀酰亚胺64mg（0.554mmol），避光条件下室温搅拌反应24小时，反应结束后以10000r/min离心15min，弃沉淀取上清液，向上清液中加入1mlDMSO混匀后得到活化的东莨菪碱半抗原反应液；
⑤称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用纯化水溶解定容至5.0L，得到0.01M的PBS缓冲液，pH为7.4；
⑥称取250mg牛血清蛋白溶于50mlPBS缓冲液中，搅拌均匀，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液；
⑦室温下，将④的反应液缓慢滴加到快速搅拌的⑥的溶液中，反应液与牛血清蛋白溶液的体积比为1:10，滴加完毕后继续搅拌反应0.5小时，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
⑧将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑤的PBS缓冲液透析7次，透析结束后以10000r/min离心10分钟，弃沉淀，取上清液即得到东莨菪碱人工抗原Ⅵ。
对比例4
本实施一种东莨菪碱人工抗原的制备方法（反应历程如图10），包括以下步骤：
（1）东莨菪碱人工半抗原Ⅲ的制备：
①～③分别与对比例1相同。
（2）东莨菪碱人工抗原Ⅶ的制备：
④～⑧与对比例3相似，只是将牛血清蛋白替换为牛丙种球蛋白作为载体，与东莨菪碱人工半抗原Ⅲ进行偶联，得到东莨菪碱人工抗原Ⅶ。
对比例5
本实施一种东莨菪碱人工抗原的制备方法（反应历程如图11），包括以下步骤：
（1）东莨菪碱人工半抗原Ⅰ的制备：
①②分别与实施例1相同。
（2）东莨菪碱人工抗原Ⅷ的制备：
③～⑦与实施例1相似，只是将牛血清蛋白替换为牛丙种球蛋白作为载体，与东莨菪碱人工半抗原Ⅰ进行偶联，得到东莨菪碱人工抗原Ⅷ。
对比例6
本实施一种东莨菪碱人工抗原的制备方法（反应历程如图12），包括以下步骤：
（1）东莨菪碱人工半抗原Ⅰ的制备：
①②分别与实施例1相同。
（2）东莨菪碱人工抗原Ⅸ的制备：
③取东莨菪碱半抗原Ⅰ100mg（0.248mmol）与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐142mg（0.744mmol）、N-羟基琥珀酰亚胺57mg（0.496mmol）置于25ml的单口圆底烧瓶中，加入4ml四氢呋喃溶解，避光条件下室温搅拌反应24小时，反应结束后离心取上清液，反应结束后以10000r/min离心15min，弃沉淀取上清液，向上清液中加入1mlDMSO混匀后得到活化的东莨菪碱半抗原反应液；
④称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用纯化水溶解定容至5.0L，得到0.01M的PBS缓冲液，pH为7.4；
⑤称取250mg牛血清蛋白溶于50mlPBS缓冲液中，搅拌均匀，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液；
⑥在室温下，将③的反应液缓慢滴加到快速搅拌的⑤的溶液液中，反应液与牛血清蛋白溶液的体积比为1:10，滴加完毕继续搅拌反应0.5小时，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
⑦将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤④的PBS缓冲液透析7次，透析结束后以10000r/min离心10分钟，弃沉淀取上清液即得到东莨菪碱人工抗原Ⅸ。
对比例7
本实施一种东莨菪碱人工抗原的制备方法（反应历程如图13），包括以下步骤：
（1）东莨菪碱人工半抗原Ⅰ的制备：
①②分别与实施例1相同。
（2）东莨菪碱人工抗原Ⅹ的制备：
③～⑦与对比例6相似，只是将牛血清蛋白替换为牛丙种球蛋白作为载体，与东莨菪碱人工半抗原Ⅰ进行偶联，得到东莨菪碱人工抗原Ⅹ。
【检测例-东莨菪碱人工抗原的性能测试】
（1）东莨菪碱人工抗原的鉴定
偶联物蛋白浓度的测定：分别配制浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml的牛血清蛋白的PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655nm处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。
偶联比测定：SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是对蛋白进行量化和比较及特性鉴定的一种经济、快速且可重复的方法。它是分离蛋白质、研究蛋白质的亚基构成及亚基相对分子质量的重要工具。
对由小分子半抗原和载体蛋白偶联制备的人工抗原的鉴定，则可以根据电泳结果中偶联物和载体蛋白的迁移速率来确定偶联是否成功，并根据相对分子质量的测算结果结合以下公式计算出分子结合比：
本发明选择浓缩胶浓度为5%，浓缩胶电压为120V，分离胶浓度为12%，分离胶电压为60V，用考马斯亮蓝染色，用紫外凝胶成像系统分析软件估算牛血清蛋白和东莨菪碱半抗原的分子结合比。其中东莨菪碱人工抗原Ⅱ偶联的SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）鉴定图见图4，用紫外凝胶成像系统分析软件分析得出，BSA的相对分子质量为66400，SCO-BSA(Ⅱ)的相对分子质量为72900，因此可以计算出BSA和东莨菪碱半抗原（Ⅰ）的分子结合比约为16.1。
表1 各东莨菪碱人工抗原的偶联比和浓度
由表1可见，人工半抗原的结构，人工半抗原的活化方法以及载体蛋白的结构对人工半抗原与载体蛋白交联时的分子结合比都有影响。
（2）动物免疫
将制备的各东莨菪碱人工抗原免疫Balb/c小鼠，得到含单克隆抗体的免疫腹水经ELISA方法检测其效价，检测结果见表2。
表2 各免疫腹水的效价检测结果
由表2可见，与实施例1相比，利用各对比例东莨菪碱人工抗原进行动物免疫获得的免疫腹水，其效价均没有实施例1高，不能用于免疫分析中。而利用东莨菪碱人工抗原Ⅱ进行动物免疫获得的单克隆抗体，完全可用于免疫分析中，能为东莨菪碱的检测提供更加方便快速准确的途径。
Claims (10)
1.一种东莨菪碱人工半抗原，其特征在于，
其分子结构如（Ⅰ）所示：
其中，n的范围为1~3。
2.如权利要求1所述的东莨菪碱人工半抗原的制备方法，其特征在于，
包括以下步骤：以氢溴酸三水东莨菪碱以及丁二酸酐为原料，进行反应，得到东莨菪碱人工半抗原。
3.根据权利要求2所述的东莨菪碱人工半抗原的制备方法，其特征在于，
具体包括以下步骤：
（1）将氢溴酸三水东莨菪碱溶于纯化水中，用氨水调节溶液的pH，经过萃取、干燥、过滤、减压蒸干得微白色油状物A；
（2）将微白色油状物A溶于吡啶中，再加入二酸酐和4-二甲氨基吡啶，回流搅拌反应，自然冷却至室温，减压蒸干溶剂，经萃取、纯化水洗涤、干燥、过滤、减压蒸干得东莨菪碱人工半抗原。
4.根据权利要求3所述的东莨菪碱人工半抗原的制备方法，其特征在于，
所述步骤（2）中回流搅拌反应温度为90~110℃，反应时间15~24h。
5.一种东莨菪碱人工抗原，其特征在于，其分子结构如（Ⅱ）所示：
其中，n的范围为1~3。
6.如权利要求5所述的东莨菪碱人工抗原的制备方法，其特征在于，
所述东莨菪碱人工抗原通过活泼酯法使权利要求1中的东莨菪碱人工半抗原与牛血清蛋白结合获得。
7.权利要求6所述的东莨菪碱人工抗原的制备方法，其特征在于，
具体包括以下步骤：
（a）将东莨菪碱人工半抗原（Ⅰ）、N-羟基琥珀酰亚胺以及二环己基碳二亚胺溶于有机溶剂中，发生反应，取上清液得到含有活化的东莨菪碱人工半抗原的反应液；
（b）将含有活化的东莨菪碱人工半抗原的反应液滴加到牛血清蛋白溶液中，发生偶联反应，得到东莨菪碱人工抗原。
8.权利要求7所述的东莨菪碱人工抗原的制备方法，其特征在于，
所述步骤（a）中：东莨菪碱人工半抗原（Ⅰ）、N-羟基琥珀酰亚胺以及二环己基碳二亚胺三者的摩尔比为1∶(1.2~1.5)∶(1.2~1.5)；室温搅拌反应12~24h；
所述步骤（b）中：反应温度为3~6℃，反应时间10~18h。
9.如权利要求1所述东莨菪碱人工半抗原或者如权利要求5所述的东莨菪碱人工抗原在制备抗东莨菪碱抗体中的应用。
10.一种抗东莨菪碱抗体，其为由权利要求5所述的东莨菪碱人工抗原经动物免疫得到的、可与东莨菪碱发生特异性免疫反应的球蛋白。
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