CN116003404A

CN116003404A - 一种利培酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116003404A
Application number: CN202211605955.0A
Authority: CN
Inventors: 王镇; 王凌志; 饶颖
Original assignee: Hangzhou Tongzhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Tongzhou Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-14
Filing date: 2022-12-14
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明公开了一种新型的利培酮人工半抗原和人工抗原及其制备方法。利培酮人工半抗原的分子结构式如式Ⅰ，利培酮人工抗原的分子结构式如式Ⅱ。本发明还公开了利培酮人工抗原在制备抗利培酮抗体中的应用。本发明的利培酮人工半抗原最大程度地保留了利培酮的特征结构，且经过化学修饰具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可获得利培酮人工抗原；进一步制备获得的利培酮人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强、效价高的抗利培酮抗体；该抗原抗体可用于免疫层析技术，具有灵敏度高、特异性强、易于操作、经济快速等优点，可用于利培酮的定量或半定量检测。

Description

一种利培酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种利培酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。

背景技术

利培酮(Risperidone)，为苯并异恶唑衍生物，是新一代的抗精神病药，因其治疗窗宽且可以与其他药物合并用药，受到市场的广泛认可，成为治疗精神分裂症的常规药物之一。但是随着该药的推广，它的毒副作用也引起了人们的关注。常见不良反应有：失眠、焦虑、头痛、头晕、口干。较少见的不良反应有：嗜睡、疲劳、注意力下降、便秘、消化不良、恶心、呕吐、腹痛、视物模糊、阴茎异常勃起、勃起困难、射精无力、性淡漠、尿失禁、鼻炎、皮疹以及其它过敏反应。

从该药上市以来，随着该药的推广，对于利培酮所致不良反应的报导也层出不穷，因此对该药的检测也越来越多。所以开发一种快速、简便、经济的检测方法也显得尤为重要。

目前，对利培酮的检测主要依靠气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱四级杆飞行时间质谱仪(Q-TOFLC/MS)、核磁共振氢谱(HNMR)、核磁共振碳谱(13CNMR)、核磁共振氟谱(19FNMR)、红外光谱(IR)等方法，但都存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作的缺点，不能达到现代检测对快速、准确的要求。

采用免疫层析试纸快速检测技术则可以弥补以上所有缺点，该技术具有特异性强、灵敏度高、简便、经济等特点。它不需要专业技能和昂贵复杂的仪器设备即可实现对抗原、半抗原、抗体等各种分析物的定性和半定量检测。它广泛应用于激素、肿瘤标记物、兽药、农药、毒品等物质的检测。

现有技术中的利培酮人工半抗原一般在9位或者N、O、F原子位置进行衍生，影响利培酮的活性位点，专一性较差。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种利培酮人工半抗原和利培酮-牛血清白蛋白人工抗原的制备方法，所制备的利培酮-牛血清白蛋白人工抗原可进行动物免疫，取得相应的利培酮抗体，可用于各种利培酮类免疫分析法的研究，为利培酮的检测提供更加方便、快速、准确的途径。

为实现上述技术目的，本发明通过以下技术方案实现：

本发明的第一个目的是提供一种利培酮人工半抗原，其分子结构式如式Ⅰ所示：

本发明提供的利培酮人工半抗原在7位羟基处进行衍生，最大程度的保留了利培酮的特征结构，且经过化学修饰产生了与载体蛋白偶联的活性基团。

本发明第二个目的在于提供所述利培酮人工半抗原的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)7-羟基利培酮和碳酸钾、对溴甲基苯甲酸甲酯进行取代反应，制得式A所示化合物；

(2)式A所示化合物和碱溶液进行水解反应，再调节pH值至酸性，制得式I所示的利培酮半抗原；

所述方法的反应式如下所示：

所述步骤(1)中，7-羟基利培酮、碳酸钾、对溴甲基苯甲酸甲酯的物质的量之比为1:2～3:2～2.5；

反应温度为60～70℃，反应时间为15～20小时；

所述步骤(2)中，碱溶液优选NaOH水溶液，

进一步，优选所述方法包括以下步骤：

(1)7-羟基利培酮溶于丙酮中，再加入碳酸钾和对溴甲基苯甲酸甲酯，65～70℃回流搅拌反应15～20小时；反应结束，反应液后处理得到式A所示的化合物；

所述丙酮的体积用量一般以7-羟基利培酮的物质的量计为30～60mL/mmol；

一般用TLC检测原料反应完全，代表反应结束；

所述反应液后处理的方法为：反应液冷却至室温，过滤，收集滤液，滤液蒸除溶剂，所得黄色粘稠物经过薄层色谱分离得淡黄色油状物，为式A所示的化合物；

薄层色谱的层析液为乙酸乙酯、乙醇体积比10：2的混合液，产物Rf＝0.8；

(2)将式A所示的化合物溶于四氢呋喃和甲醇中，再加入1N的氢氧化钠水溶液，室温搅拌反应5～6小时；反应结束后调节pH＝3，然后进行纯化处理制得式I所示的利培酮半抗原；

所述四氢呋喃的体积用量优选以式A所示的化合物的物质的量计为10～30mL/g；

所述甲醇的体积用量优选以式A所示的化合物的物质的量计为10～30mL/g；

所述1N的氢氧化钠水溶液的体积用量一般以式A所示的化合物的质量计为40～70mL/g；

一般用1N的盐酸调反应液的pH＝3；

所述纯化处理的方法为：反应液调节pH＝3后，用乙酸乙酯萃取，收集有机相，有机相分别用纯化水和饱和的食盐水洗涤，取有机相，干燥后在40℃的水浴中减压浓缩，再经薄层色谱分离得到淡黄色油状物，制得式I所示的利培酮半抗原；

所述薄层色谱的层析液为二氯甲烷、95vol％乙醇、1，4-二氧六环、氨水的体积比为10：8：1：1的混合液，产物Rf＝0.3。

通过上述方法，在利培酮的7位羟基上引入连接臂，该修饰位点不占用利培酮任何活性位点，最大限度的保留了利培酮的特征结构，又提供了可以与载体蛋白偶联的活性位点，为利培酮抗体的免疫打好了基础。

本方法采用苯环结构的连接臂，可以增加该半抗原对应的人工抗原在动物体内的免疫原性，使对应的克隆抗体更加容易制得。

本发明的第三个目的在于提供一种利培酮人工抗原，其分子结构如II所示：

式II中，BSA为牛血清白蛋白。

本发明的第四个目的在于提供所述利培酮人工抗原的制备方法，所述方法为：将式I所示的利培酮人工半抗原与牛血清白蛋白通过活泼酯法结合，制得式II所示的利培酮人工抗原。

进一步，采用活泼酯法制备式II所示的利培酮人工抗原时，所述方法包括以下步骤：

(a)将式I所示的利培酮人工半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺按物质的量之比为1∶(1.2～1.5)∶(1.2～1.5)溶解于N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，室温搅拌反应18～20小时，反应结束后离心取上清液；

所述N,N-二甲基甲酰胺的体积用量一般以式I所示的利培酮人工半抗原的物质的量计为20～40mL/mmol。

(b)将步骤(a)的上清液滴加到牛血清白蛋白溶液中，混匀后将所得混合液置于4℃下静置过夜(通常静置15～24小时)，经透析、离心取上清液，制得所述式II所示的利培酮人工抗原。

本发明中牛血清白蛋白溶液是将牛血清白蛋白溶于0.01M、pH＝7.2-7.4的PBS缓冲液中制成的。

所述步骤(b)中，所述牛血清白蛋白溶液的浓度为10mg/mL，步骤(a)的上清液与牛血清白蛋白溶液的体积比为1∶10。

本发明选用的牛血清白蛋白(BSA)作为大分子载体，与其他载体蛋白相比，具有以下优点：①BSA具有583个氨基酸残基，较容易与利培酮半抗原发生偶联，可制得不同偶联比的利培酮人工抗原，且具有较高的免疫原性；②BSA经济实惠，有助于降低成本；③BSA的化学性质稳定，在酸性和弱碱性的环境下也有很好的溶解度和稳定性，适合长期储存；④BSA也可做为稳定剂用，多余的BSA是抗原的稳定剂，可以减轻抗原的变性、分解和非特异性吸附。

本发明的第五个目的在于提供所述利培酮人工半抗原或利培酮人工抗原在制备抗利培酮抗体中的应用。

本发明的第六个目的在于提供一种抗利培酮抗体，是由所述利培酮人工抗原经动物免疫得到的、可与利培酮发生特异性免疫反应的球蛋白。

本发明的第七个目的在于提供所述抗利培酮抗体在检测利培酮中的应用。

本发明的第八个目的在于可提供一种用于检测利培酮的试剂，所述试剂包括所述抗利培酮抗体。

本发明的第九个目的在于提供一种用于检测利培酮的试剂盒，所述试剂盒包括所述抗利培酮抗体。

试验发现，将所述利培酮人工抗原免疫新西兰白兔，获得的多克隆抗体的效价高达1：90000。表明本发明的利培酮人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗利培酮多克隆抗体，该抗利培酮多克隆抗体可用于利培酮的免疫检测和分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的利培酮人工半抗原最大程度地保留了利培酮的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇。进一步制备获得的利培酮人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强、效价高的抗利培酮多克隆抗体，该抗原抗体可用于免疫层析技术，具有灵敏度高、特异性强、易于操作、经济快速等优点，可用于对利培酮进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

附图说明

图1为实施例中制备人工抗原Ⅱ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ的反应式。

因为牛血清白蛋白(BSA)和牛丙种球蛋白(BGG)都属于球形蛋白，故用球形来代替，其大小并非其真实大小。蛋白表面的氨基并不代表其真实的数量，由于其表面的氨基数量很多，这里只用一个表示。其中

表示牛血清白蛋白，

表示牛丙种球蛋白，DMF表示N,N-二甲基甲酰胺，THF表示四氢呋喃，MeOH表示甲醇，NHS表示N-羟基琥珀酰亚胺，DCC表示二环己基碳二亚胺，下同。

图2为实施例1制备的利培酮人工半抗原Ⅰ的液相色谱图。

其中，mAU表示毫吸光度单位，min表示分钟。

图3为实施例1制备的利培酮半抗原Ⅰ的ESI-MS分析谱图。

其中，Intens.表示信号强度。m/z表示质荷比。

图4为牛血清白蛋白(BSA)、利培酮人工半抗原Ⅰ、利培酮人工抗原Ⅱ的紫外扫描图。图4中，曲线a为利培酮人工抗原的紫外扫描图，曲线b为利培酮人工半抗原的紫外扫描图，曲线c为牛血清白蛋白的紫外扫描图。

其中，Abs表示紫外-可见吸收光谱，WL表示波长。

图5为利培酮人工抗原Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ的制备流程图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

制备利培酮人工抗原II，反应式如图1所示，包括以下步骤：

(1)人工半抗原Ⅰ的制备：

①称取7-羟基利培酮200mg(0.47mmol)于50mL单口圆底烧瓶中，加入20mL丙酮溶解，再加入碳酸钾粉末162mg(1.17mmol)，室温搅拌0.5小时，此时溶液为白色悬浊液，再加入对溴甲基苯甲酸甲酯215mg(0.94mmol)置于65℃油浴中回流搅拌反应15小时，此时溶液为黄色悬浊液；

②TLC(层析液为乙酸乙酯：乙醇＝10：2)检测原料点基本消失表明反应基本完全，结束反应，将反应液冷却至室温，过滤、减压蒸干溶剂得黄色粘稠物，该黄色粘稠物经过薄层色谱(溶剂和洗脱剂为无水乙醇，层析液为乙酸乙酯：乙醇＝10：2，Rf＝0.8)分离得淡黄色油状物A154mg(0.27mmol)；

③将上步淡黄色油状物A154mg(0.27mmol)置于50mL单口圆底烧瓶中，加入4.6mL四氢呋喃和4.6mL甲醇，此时为淡黄色澄清溶液，再加入15.4mL1N的氢氧化钠溶液，过程中有白色沉淀产生，但是随着反应的进行沉淀逐渐消失，接着室温搅拌反应5小时，此时为黄色透明溶液；TLC检测反应基本完全，结束反应，用1N的盐酸调溶液的pH＝3，此时有大量的白色沉淀产生，用20mL×3的乙酸乙酯萃取，收集有机相为淡黄色透明溶液，分别用30mL纯化水和30mL饱和的食盐水洗涤有机相，有机相用无水硫酸钠干燥15分钟，在40℃的水浴中减压浓缩得到淡黄色油状物，该油状物经薄层色谱(溶剂和洗脱机为无水乙醇，层析液为二氯甲烷：95％乙醇：1，4-二氧六环：氨水＝10：8：1：1(v/v)，产物Rf＝0.3)分离得淡黄色油状物104mg(0.19mmol)，即利培酮人工半抗原Ⅰ。

利培酮人工半抗原Ⅰ的液相色谱图见图2(紫外检测器波长240nm)。

从图2可以得出经过纯化得到的利培酮人工半抗原的纯度达到99％以上。

利培酮半抗原Ⅰ的ESI-MS分析谱图见图3。从图3可以看出本实施例1得到的利培酮人工半抗原Ⅰ的分子离子峰的质荷比(m/z)为560，与其理论分子量吻合，可以确定步骤③得到的最终化合物就是本发明所设计的利培酮人工半抗原Ⅰ。

(2)利培酮人工抗原Ⅱ的制备：

④将104mg(0.19mmol)利培酮人工半抗原Ⅰ置于20mL单口圆底烧瓶中，加入5.2mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，再加入29mg(0.25mmol)N-羟基琥珀酰亚胺和52mg(0.25mmol)二环己基碳二亚胺，25℃搅拌反应18小时，有大量的白色沉淀产生，TLC(层析液为二氯甲烷：95％乙醇：1，4-二氧六环：氨水＝10：8：1：1(v/v)，产物Rf＝0.1)检测基本完全反应，以8000rpmin、4℃离心5分钟，取上清液，备用。

⑤称取14.5g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(0.75mol)氯化钠，1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液，。

⑥称取520mg牛血清白蛋白溶于52mL步骤⑤的PBS缓冲液中，缓慢搅拌至完全溶解，得到浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液。

⑦在快速搅拌下，将步骤④的上清液缓慢逐滴滴加到⑥的牛血清白蛋白溶液中，上清液与牛血清白蛋白溶液的体积比为1∶10，继续室温搅拌反应0.5小时，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。

⑧将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑤的PBS缓冲液透析7次，每天三次，每两次间隔不小于两小时，透析结束后，取出混合液，以8000rpmin、4℃离心10分钟，取上清液即得到人工抗原Ⅱ：利培酮-牛血清白蛋白偶联物。

利培酮人工抗原Ⅱ制备前后的紫外扫描图见图4。其中，曲线a为利培酮人工抗原的紫外扫描图，曲线b为利培酮人工半抗原的紫外扫描图，曲线c为牛血清白蛋白的紫外扫描图。与利培酮人工半抗原、牛血清白蛋白相比，利培酮人工抗原的最大吸收波长和吸光度都出现明显变化，说明利培酮半抗原与牛血清白蛋白偶联成功。

对比例1

制备利培酮人工抗原Ⅳ，反应式如图5所示，包括以下步骤：

(1)人工半抗原Ⅲ的制备：

①称取利培酮150mg(0.37mmol)置于50mL单口圆底烧瓶中，加入5mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，加入碳酸钾粉末303mg(2.20mmol)，25℃下搅拌0.5小时，接着加入巯基丙酸96μL(1.10mmol)，转入100℃的油浴中搅拌回流反应18小时，此时为黄色悬浊液；

TLC(层析液为二氯甲烷：95％乙醇：1，4-二氧六环：氨水＝10：8：1：1(v/v)，产物Rf＝0.1)检测大部分原料反应完，结束反应，将反应液自然冷却至室温，过滤，收集滤液，将滤液在60℃下减压蒸干得到黄色固体。向该黄色固体残渣中加入15mL纯化水，用10％的盐酸调节溶液的pH＝3，此时有大量黄色沉淀产生，用30mL×3的乙酸乙酯萃取，合并有机相，分别用20mL5％的碳酸氢钠溶液和20mL饱和的食盐水洗涤有机相，收集有机相，用无水硫酸镁干燥5分钟、过滤、减压蒸干得到黄色固体。

②该黄色固体通过薄层色谱(层析液为二氯甲烷：95％乙醇：1，4-二氧六环：氨水＝10：8：1：1(v/v)，溶剂和洗脱剂为无水乙醇，产物Rf＝0.1，该点在254nm下显色明显，碘熏不显色。)分离得到微黄色固体127mg(0.26mmol)，即利培酮人工半抗原Ⅲ；

(2)利培酮人工抗原的制备：

③将127mg(0.26mmol)利培酮人工半抗原Ⅲ置于25mL圆底烧瓶中，加入6.35mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，再加入40mg(0.35mmol)N-羟基琥珀酰亚胺和72mg(0.35mmol)二环己基碳二亚胺，25℃搅拌反应18小时，反应结束后以8000rpmin、4℃离心5分钟，取上清液，备用。

④称取14.5g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(0.75mol)氯化钠，1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用纯化水溶解定容至5.0L，得到0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液。

⑤称取640mg牛血清白蛋白溶于64mL步骤④的PBS缓冲液中，缓慢搅拌至完全溶解得到浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液。

⑥在快速搅拌下，将步骤③的上清液缓慢滴加到步骤⑤牛血清白蛋白溶液中，上清液与牛血清白蛋白溶液的体积比为1∶10，25℃下搅拌反应0.5小时，得到的混合液在4℃冰箱中静置保存过夜，得到人工抗原混合液。

⑦将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤④的PBS缓冲液透析7次，每天三次，每两次间隔不少于两小时，透析结束后，取出混合液以8000rpmin、4℃离心10分钟，取上清液即得到人工抗原Ⅳ：利培酮-牛血清白蛋白偶联物。

对比例2

制备利培酮人工抗原V，反应式如图5所示，包括以下步骤：

(1)利培酮人工半抗原Ⅲ的制备：

①～②分别与对比例1相同。

(2)利培酮人工抗原Ⅴ的制备：

采用牛丙种球蛋白作为载体，与利培酮人工半抗原Ⅲ进行偶联，偶联步骤与对比例1③～⑦相同，得到利培酮人工抗原Ⅴ。

对比例3

制备利培酮人工抗原VI，反应式如图5所示，包括以下步骤：

(1)利培酮人工半抗原Ⅲ的制备：

①～②分别与对比例1相同。

(2)利培酮人工抗原Ⅵ的制备：

③④分别与对比例1相同。

⑤称取320mg牛血清白蛋白溶于32mL步骤④的PBS缓冲液中，缓慢搅拌至完全溶解得到浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液。

⑥在快速搅拌下，将步骤③的上清液缓慢滴加到步骤⑤牛血清白蛋白溶液中，上清液与牛血清白蛋白溶液的体积比为1∶5，25℃下搅拌反应0.5小时，得到的混合液在4℃冰箱中静置保存过夜，得到人工抗原混合液。

⑦与对比例1相同，得到利培酮人工抗原Ⅵ。

对比例4

制备利培酮人工抗原VII，反应式如图5所示，包括以下步骤：

(1)利培酮人工半抗原Ⅲ的制备：

①～②分别与对比例1相同。

(2)利培酮人工抗原Ⅶ的制备：

采用牛丙种球蛋白作载体，与利培酮人工半抗原Ⅲ进行偶联，偶联步骤与对比例3③～⑦相同，得到利培酮人工抗原Ⅶ。

对比例5

制备利培酮人工抗原VIII，反应式如图1所示，包括以下步骤：

(1)利培酮人工半抗原Ⅰ的制备：

①～③分别与实施例1相同。

(2)利培酮人工抗原Ⅷ的制备：

采用牛丙种球蛋白作载体，与利培酮人工半抗原Ⅰ进行偶联，偶联步骤与实施例1④～⑧相同，得到利培酮人工抗原Ⅷ。

对比例6

制备利培酮人工抗原IX，反应式如图1所示，包括以下步骤：

(1)利培酮人工半抗原Ⅰ的制备：

①～③分别与实施例1相同。

(2)利培酮人工抗原Ⅸ的制备：

④⑤分别与实施例1相同。

⑥称取260mg牛血清白蛋白溶于26mL步骤⑤的PBS缓冲液中，缓慢搅拌至完全溶解，得到浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液。

⑦在快速搅拌下，将步骤④的上清液缓慢逐滴滴加到⑥的牛血清白蛋白溶液中，上清液与牛血清白蛋白溶液的体积比为1∶5，继续室温搅拌反应0.5小时，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。

⑧与实施例1相同，得到利培酮人工抗原Ⅸ。

对比例7

制备利培酮人工抗原X，反应式如图1所示，包括以下步骤：

(1)利培酮人工半抗原Ⅰ的制备：

①～③分别与实施例1相同。

(2)利培酮人工抗原Ⅹ的制备：

采用牛丙种球蛋白作载体，与利培酮人工半抗原Ⅰ进行偶联，偶联步骤与对比例6④～⑧相同，得到利培酮人工抗原Ⅹ。

实施例2利培酮人工抗原的性能测定

(1)利培酮人工抗原的鉴定：

摩尔吸收系数ε：用PBS缓冲液配制浓度为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL的利培酮人工半抗原Ⅰ和Ⅲ的溶液，通过紫外扫描图可知利培酮半抗原Ⅰ和Ⅲ的最大吸收波长，在最大吸收波长处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数(即摩尔吸收系数)的计算公式为：ε＝吸光值/摩尔浓度。

偶联物蛋白浓度的测定：用PBS缓冲液配制浓度为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、160μg/mL、200μg/mL的牛血清白蛋白溶液各1mL，加入3mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将人工抗原溶液(用PBS缓冲液配制)按一定比例稀释，在655nm处测得人工抗原的吸光值，从曲线上读取人工抗原溶液的相应蛋白浓度值。

偶联比测定：配制100μg/mL的牛血清白蛋白PBS溶液，将偶联物(即利培酮人工抗原)用PBS稀释到100μg/mL，在277nm处测得吸光值A₁，以PBS为空白测得吸光值A₂，则偶联比率γ为：γ＝[(A₁－A₂)/ε]/(100×10^-3/66430)。

其中ε为摩尔吸光系数(L/mol)，66430为牛血清白蛋白的分子量，100×10^-3为牛丙种球蛋白浓度(g/L)。

采用牛丙种球蛋白作为载体时，偶联比的计算式为：γ＝[(A₁－A₂)/ε]/(100×10^-3/150000)，其中，150000为牛丙种球蛋白的分子量，100×10^-3为牛丙种球蛋白浓度(g/L)。

表1各利培酮人工抗原的偶联比和摩尔吸收系数

编号	人工抗原	偶联比	偶联物蛋白浓度	摩尔吸收系数
					实施例1	Ⅱ	25	3.47mg/mL	5135.27
对比例1	Ⅳ	28	3.78mg/mL	4615.64
					对比例2	Ⅴ	20	2.97mg/mL	4615.64
对比例3	Ⅵ	16	2.62mg/mL	4615.64
					对比例4	Ⅶ	14	2.04mg/mL	4615.64
对比例5	Ⅷ	21	2.35mg/mL	5135.27
					对比例6	Ⅸ	14	2.64mg/mL	5135.27
对比例7	Ⅹ	9	1.55mg/mL	5135.27

由表1可见，人工半抗原的结构，人工半抗原和载体蛋白的加料比以及载体蛋白的种类对人工半抗原与载体蛋白的偶联比都是有影响的。

(2)动物免疫

将制备的各利培酮人工抗原免疫新西兰白兔，得到的免疫血清经ELISA方法检测其效价，检测结果见表2。

表2各免疫血清的效价检测结果

编号	利培酮人工抗原	免疫血清效价
			实施例1	Ⅱ	1∶90000
对比例1	Ⅳ	1∶70000
			对比例2	Ⅴ	1∶40000
对比例3	Ⅵ	1∶30000
			对比例4	Ⅶ	1∶60000
对比例5	Ⅷ	1∶35000
			对比例6	Ⅸ	1∶50000
对比例7	Ⅹ	1∶30000

由表2可见，与实施例1相比，利用各对比例利培酮人工抗原进行动物免疫获得的免疫血清，其效价均偏低。而利用利培酮人工抗原Ⅱ进行动物免疫获得的免疫血清，其效价达1:90000，因此相对而言利用利培酮人工抗原Ⅱ可以获得更高效价的多克隆抗体，更加适合用于免疫分析，能为利培酮的检测提供更加方便、快速、准确的途径。