CN116813512B - 一种氟苯尼考半抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种氟苯尼考半抗原及其制备方法和应用，所述氟苯尼考半抗原结构式如式（Ⅰ）所示。本发明对氟苯尼考结构进行了改造，得到氟苯尼考半抗原，并与载体蛋白偶联制备了抗原。使用所制备的抗原免疫新西兰大白兔可获得灵敏度高、特异性强的多克隆抗体。在此之前没有使用本研究中的半抗原、抗原制备抗体的相关信息。利用本发明提供的半抗原与载体蛋白的偶联物制备氟苯尼考抗体，开始免疫后抗体效价上升速度较快、然后慢慢趋向稳定，抗体的灵敏度逐渐提高、最终达到稳定。本发明提供的氟苯尼考半抗原和抗原的制备过程简单、经济、实用价值高，在兽药残留检测中具有良好的应用前景。

Description

一种氟苯尼考半抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及氟苯尼考检测领域，具体涉及一种氟苯尼考半抗原及其制备方法和应用。
背景技术
氟苯尼考（florfenicol，FF），又称氟甲砜霉素，是一种合成的广谱抗菌氯霉素衍生物。因其具杀菌力强、安全性高、耐药性低、吸收良好、体内分布广泛、无潜在致再生障碍性贫血的隐患及安全性较好的特点，在临床上被广泛使用。
在促进畜牧业发展的同时，氟苯尼考的滥用会导致在畜禽产品中产生有较高剂量的残留，人体长期摄入含有氟苯尼考的食物会导致过敏反应和体内菌群失调等症状，更为严重的是会造成细菌耐药性增加和对生态环境的破坏。2022 年，我国发布的 GB 31650.1-2022《食品安全国家标准 食品中41种兽药最大残留限量》规定了FF残留标志物为FF与FFA之和，且该标准明确规定禽蛋中FF限量为10 μg/kg 。
免疫分析法是目前最常用的氟苯尼考残留检测方法，其核心试剂抗体的性能很大程度上由半抗原和抗原的结构决定。因此，开发可以制备高灵敏度、高特异性多克隆抗体的氟苯尼考半抗原和抗原显得尤为重要。
CN114031528A公开了一种氟苯尼考半抗原，其结构如下：
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CN108558718A公开了一种氟苯尼考半抗原，其结构如下：
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CN108218747A公开了一种氟苯尼考半抗原，其结构如下：
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CN106905428A公开了一种氟苯尼考半抗原，其结构如下：
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发明人在前的专利CN114163365A公开了一种氟苯尼考半抗原，其结构式如下：
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上述专利公开了不同化学结构的氟苯尼考半抗原，但是使用以上半抗原制备的抗原在免疫动物后获得的抗体效价较低、特异性不足，导致后续建立的检测方法不能满足目前痕量检测的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种氟苯尼考半抗原、抗原及其应用。
本发明第一个目的是提供一种氟苯尼考半抗原，结构式如式（Ⅰ）所示；
式（Ⅰ）。
本发明第二个目的是提供制备式（Ⅰ）所示化合物的方法，合成路线如下：
。
进一步地，所述制备式（Ⅰ）所示化合物的方法，包括以下步骤：
(S1)氟苯尼考溶于无水乙醇中，加入浓盐酸，60-80℃反应6-10h，减压浓缩，浓缩液补加无水乙醇，旋转蒸干；
(S2)取步骤(S1)所得产物，用乙酸乙酯重结晶，过滤，干燥，得到氟苯尼考胺盐酸盐；
(S3)将氟苯尼考胺盐酸盐在溶剂和碱条件下，与4'-溴甲基联苯-2-羧酸甲酯在40-50℃反6-10小时，过滤，滤液减压浓缩；
(S4)步骤(S3)所得产物柱层析提纯，得到联苯-2-甲酸甲酯取代-氟苯尼考胺；
(S5)联苯-2-甲酸甲酯取代-氟苯尼考胺加入到甲醇中，加入氢氧化钠，回流条件下70-80℃反应3-5h，蒸除甲醇，调节pH为6-7，析出固体，干燥，得到式(I)化合物，即氟苯尼考半抗原。
进一步地，步骤(S1)中，氟苯尼考、无水乙醇、浓盐酸、补加的无水乙醇的比例为2-3g：40-60mL：20-30mL：20-30mL；浓盐酸质量浓度35-38wt%；步骤(S2)中，乙酸乙酯体积和步骤(S1)所得产物质量比为30-40mL：1g；步骤(S3)中，氟苯尼考胺盐酸盐和4'-溴甲基联苯-2-羧酸甲酯的摩尔比为1-1.1:1-1.1；步骤(S4)中，柱层析洗脱液是石油醚和乙酸乙酯按照体积比1-3:1-3的混合液；步骤(5)中，调节pH用盐酸。
本发明第三个目的是提供一种氟苯尼考人工抗原，是式（Ⅰ）所示化合物与载体蛋白BSA偶联得到的偶联物，结构如式（Ⅱ）所示。但是其他蛋白也能用于本发明，比如人血清蛋白，钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白，也在本发明实质性保护范围内。出于综合考虑抗原制备的成功率、免疫原性、稳定性和成本等因素，优选使用BSA。
式（Ⅱ）。
进一步地，所述偶联物中，一个载体蛋白分子上平均偶联6.5-7.1个式（Ⅰ）所示化合物。
本发明第四个目的是提供一种制备式（Ⅱ）所示所示偶联物的方法，包括如下步骤：采用碳二亚胺法将载体蛋白偶联于式（Ⅰ）所示化合物的羧基上。
具体地，式（Ⅱ）所示所示偶联物的制备方法包括以下步骤：
（1）式（Ⅰ）所示化合物溶解于DMF中，得到半抗原溶液；
（2）取半抗原溶液，加入羧基活化剂，反应；
（3）载体蛋白溶于含DMF的PBS缓冲液中，得到载体蛋白溶液；
（4）将完成步骤（2）的液相加入到步骤（3）制备的蛋白溶液中；
（5）将步骤（4）所得液相在截留分子量为7-10 KDa透析袋中，4-8℃的PBS缓冲液透析72-96h，每隔12-15h更换PBS缓冲液。
进一步地，步骤(1)中式（Ⅰ）所示化合物在DMF溶液中浓度为20-40mg/mL；步骤(2)中羧基活化剂选自EDC和NHS的组合(EDC和NHS的摩尔比为1-1.5:1-1.5)、 氯甲酸异丁酯和一正丁胺的组合、二环已基碳二亚胺和NHS的组合中的至少一种；羧基活化剂和式(I)化合物的摩尔比是1-1.1：1，步骤(2)中反应是在常温下，400-600rpm条件下搅拌2-4；步骤(3)中PBS缓冲液DMF体积含量为10-20%，载体蛋白和PBS缓冲液的质量体积比为50-80mg:3-5mL；步骤(4)中，步骤（2）的液相中的式(I)化合物质量和步骤（3）的蛋白溶液中BSA质量比为2-3：5-8。
本发明第五个目的是提供一种氟苯尼考抗体，所述氟苯尼考抗体是上述式(II)所示的氟苯尼考人工抗原经动物免疫得到。进一步地，所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。
本发明第六个目的是提供上述式(I)所示的氟苯尼考半抗原，和/或式(II)所示的氟苯尼考人工抗原，和或上述氟苯尼考抗体的以下任一用途：
(1)在制备氟苯尼考特异性抗体中的用途；
(2)在制备氟苯尼考检测试剂中的用途；
(3)在制备氟苯尼考免疫层析试纸中的用途；
(4)在检测氟苯尼考中的用途。
本发明对氟苯尼考结构进行了改造，得到一种未见现有技术报道的氟苯尼考半抗原，并与载体蛋白偶联制备了抗原。使用所制备的抗原免疫新西兰大白兔可获得灵敏度高、特异性强的多克隆抗体。在此之前没有使用本研究中的半抗原、抗原制备抗体的相关信息。利用本发明提供的半抗原与载体蛋白的偶联物制备氟苯尼考抗体，开始免疫后抗体效价上升速度较快、然后慢慢趋向稳定，抗体的灵敏度逐渐提高、最终达到稳定。本发明提供的氟苯尼考半抗原和抗原的制备过程简单、经济、实用价值高，在兽药残留检测中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为式(I)所示氟苯尼考半抗原质谱图；
图2为式(I)所示氟苯尼考半抗原核磁共振氢谱图；
图3为抗原基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图；
图4为氟苯尼考标准曲线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置五次重复实验，结果取平均值。
FF为氟苯尼考的缩写。NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的缩写。DMF为N,N-二甲基甲酰胺的缩写。氟苯尼考购自阿拉丁化学试剂公司，产品目录号为F111293。4'-溴甲基联苯-2-羧酸甲酯购自毕得医药科技公司，产品目录号为BD8268。N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐均购自sigma公司。无水碳酸钠、石油醚、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、氢氧化钠、盐酸、甲醇等购自国药集团。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自 Sigma 公司，产品目录号分别为 F-5881 和F-5506。羊抗兔IgG酶标抗体购自jacksonimmunoresearch，产品目录号为111-035-003。96孔酶标板购自costar公司，产品目录号为2592。
牛血清白蛋白（Albumin from bovine serum, BSA）购自sigma 公司，产品目录号为9048-46-18。
新西兰大白兔购自山东豪瑞牧业。
如无特殊说明，实施例中所用的PBS缓冲液均为pH 7.4、0.01 M的PBS缓冲液。
PBST 溶液：含有0.05%（体积百分含量）Tween-20的PBS缓冲液(pH7.2)。
实施例1、半抗原的合成和鉴定
一、半抗原的合成
1、取100 mL锥形瓶，依次加入氟苯尼考2 g、无水乙醇40 mL，搅拌均匀后加入浓盐酸20 mL，60 ℃搅拌反应6 h。反应完成后进行减压浓缩，浓缩液中加入无水乙醇20 mL，旋转蒸干。
2、取步骤1所得的产物 1 g，加入 40 mL乙酸乙酯进行结晶，过滤收集固体，40℃鼓风干燥，得到氟苯尼考胺盐酸盐（白色固体粉末）。
3、取100 mL的锥形瓶，加入步骤2得到的氟苯尼考胺盐酸盐283.5 mg、N,N-二甲基甲酰胺 10 mL，搅拌至溶解后加入无水碳酸钾552 mg，室温搅拌30 min后加入4'-溴甲基联苯-2-羧酸甲酯305.17 mg，40℃搅拌反应6小时，过滤除盐，滤液减压浓缩。
4、取步骤3得到的产物，加入1000 mg 100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱层析，石油醚：乙酸乙酯=1:1（V:V）洗脱，收集主产物,得联苯-2-甲酸甲酯取代-氟苯尼考胺（白色固体粉末）。
5、取步骤4得到的产物，加入甲醇10 ml，2M氢氧化钠水溶液556 ul，70℃回流搅拌反应3 h。反应完成后，减压蒸除甲醇，用2M盐酸将pH调至6，使产物析出。
6、取步骤5得到的固体，40℃鼓风干燥，所得固体粉末即为氟苯尼考半抗原（白色固体粉末）。
二、半抗原的鉴定
将所得产物氟苯尼考半抗原进行质谱和核磁共振鉴定。
质谱结果见图1，可以明显看到m/z 456.56的峰(M+H+)，与目标分子量（457.52）相符。核磁共振氢谱图见图2，表明氟苯尼考半抗原合成成功。
结果表明，所得氟苯尼考半抗原结构如下式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）。
实施例2、抗原的制备（碳二亚胺法）
将半抗原与BSA的偶联物命名为FF-BSA，作为抗原式（Ⅱ），
式（Ⅱ）。
一、免疫原的制备
1、称取氟苯尼考半抗原20 mg，溶解于1mL DMF中，得到半抗原溶液。
2、取步骤1制备的半抗原溶液，加入EDC 20 mg和NHS 20 mg，置于磁力搅拌器上，400 rpm室温反应2 h。
3、取 50 mg BSA，溶于3 mL 含10%（体积百分含量）DMF的PBS缓冲液中，得到蛋白溶液。
4、将完成步骤2的液相逐滴加入到步骤3制备的蛋白溶液中，然后转移到截留分子量为7 KDa的透析袋中，然后将透析袋置于PBS缓冲液中4℃透析72 h（每12小时换液一次）。
5、完成步骤4后，取所述透析袋，取出其中的液相，3000 rpm离心5 min，收集上清液，即为含有FF-BSA的溶液，将其命名为FF-BSA溶液。
6、用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted LaserDesorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-MS）法测定FF-BSA溶液中BSA与半抗原的结合比。结果见图3。
结合比={M（偶联物）－M（蛋白质）}/M（半抗原）
BSA的分子量为66430，半抗原的分子量为457.52。由质谱最高峰值分析偶联物的分子量为69671.734，经计算得出BSA与半抗原的结合比为7.1，即一个BSA分子上平均偶联7.1个式(I)的半抗原。
二、包被原的制备
用OVA代替BSA，得到FF-OVA溶液。包被原的制备方法和步骤与免疫原的制备相同，只是用OVA代替了制备免疫原时用的BSA，得到了FF-OVA溶液。
实施例3、多克隆抗体的制备
FF-BSA的加入量，以总蛋白量计，即bradford 法检测FF-BSA溶液的总蛋白浓度，总蛋白浓度乘以加入体积即为FF-BSA的加入量。
一、多克隆抗体的制备
首免制剂的制备方法：取实施例2制备的FF-BSA抗原溶液，用PBS缓冲液稀释，然后与等体积的弗氏完全佐剂混合并乳化。加强免制剂的制备方法：取实施例2制备的FF-BSA溶液，用PBS缓冲液稀释，然后与等体积的弗氏不完全佐剂混合并乳化。
取1只新西兰大白兔，对新西兰大白兔进行八次免疫，具体步骤如下（免疫方式为颈背部免疫4-8点）：
第一次免疫（首次免疫）：每只免疫1 ml首免制剂（每1 ml首免制剂含有1 mg FF-BSA）。
第二次至第八次免疫（加强免疫）：从首次免疫开始计天数，每21天进行一次加强免疫，共进行7次加强免疫；每次加强免疫每只免疫1ml加强免制剂（每1 ml加强免制剂含有1 mg FF-BSA）。
从第三次免疫开始，免疫1周后采血（耳缘静脉血采血，每只0.5 ml），离心收集血清。
二、多克隆抗体的效价的测定
待测多克隆抗体为步骤一得到的血清（分别为第三次免疫免疫1周后的血清、第四次免疫免疫1周后的血清、第五次免疫免疫1周后的血清、第六次免疫免疫1周后的血清、第七次免疫免疫1周后的血清和第八次免疫免疫1周后的血清）。
取96孔酶标板，依次进行如下步骤：
1、包被
每孔加入100μL包被液，37℃孵育2 h，然后用PBST溶液洗板3次。
包被液：用pH 9.6、0.05 M的碳酸盐缓冲液稀释实施例2制备的FF-OVA溶液，使FF-OVA的浓度为0.2μg/ml（以总蛋白浓度计）。
2、封闭
每孔加入150μL封闭液，37℃孵育1 h，然后用PBST溶液洗涤3次，拍干。
封闭液：0.4g/100ml脱脂牛奶水溶液。
3、加待测抗体
试验孔：每孔加入50μLPBS缓冲液和50μL待测多克隆抗体的稀释液；
对照孔：每孔加入50μLPBS缓冲液和50μL第一次免疫前的血清；
37 ℃孵育30 min，然后用PBST 溶液洗涤3次，拍干。
稀释液：从1:4000稀释度开始，以2为梯度，共8个稀释度；采用PBS缓冲液作为溶剂。
4、加酶标二抗
每孔加入100μL酶标二抗稀释液，37℃孵育30 min，然后用PBST 溶液洗涤3次，拍干。
酶标二抗稀释液：羊抗兔IgG酶标抗体稀释至5000倍体积。
5、显色
每孔加入100μL显色液，37℃孵育15 min。
显色液：将2% 3,3’,5,5’- 四甲基联苯胺溶液和30%过氧化氢等体积混合。
6、终止
每孔加入 50μL 2 mol/L浓硫酸。
7、读数
以 OD 450 nm波长测定各孔 OD 值。以阴性OD值不大于0.15，以最大OD值在1.5-1.8之间对应的抗体稀释度为抗体效价。
从第三次免疫至第八次免疫，氟苯尼考多克隆抗体效价呈现逐渐上升、然后趋向稳定或略有下降的趋势。第八次免疫后，血清效价为100000。
三、多克隆抗体的纯化（饱和硫酸铵沉淀法）
根据步骤二的结果，第八次免疫免疫1周后，用心脏采血的方法大量采血。取血后，将血液放置37℃静置2h，然后4℃静置过夜，然后3000 rpm离心20 min，收集上清液，即为待纯化的血清， -20℃分装保存。
1、饱和硫酸铵一次沉淀
取10 ml待纯化的血清，加入10 ml生理盐水，然后室温下边搅拌边缓慢滴加饱和硫酸铵水溶液20 ml，然后搅拌3-5分钟，然后4℃静置12小时。
2、饱和硫酸铵二次沉淀
完成步骤1后，收集液相，5000rpm离心15min，弃除上清液，加入12ml生理盐水，然后室温下缓慢滴加8ml饱和硫酸铵水溶液，充分混匀，然后4℃静置3h，然后5000rpm离心15min，弃除上清液，加入2ml-3ml PBS缓冲液，进行吹打使之完全溶解。
3、透析
将步骤2得到的溶液转移到截留分子量为7KDa的透析袋中，然后将透析袋置于PBS缓冲液中4℃透析（每2-3小时换液，换液3-4次）。
收集透析袋内的液体，即为纯化后的多克隆抗体，分装，-20℃保存备用。
四、纯化后的多克隆抗体的稀释
用步骤三制备的纯化后的多克隆抗体代替步骤二中的“待测多克隆抗体”，按照步骤二进行操作。得到最大OD值在1.5-1.8之间对应的抗体稀释度。
采用PBS缓冲液作为溶剂，按照上述得到的抗体稀释度稀释步骤三制备的纯化后的多克隆抗体，得到抗体稀释液。
五、多克隆抗体灵敏度的测定
1、包被
每孔加入100μL包被液，37℃孵育2h，然后用PBST溶液洗板3次。
2、封闭
每孔加入150μL封闭液，37℃孵育1h，然后用PBST溶液洗涤3次，拍干。
3、加标准品和抗体
每孔加入50μL氟苯尼考标准品溶液和50μL步骤四制备的抗体稀释液，37℃孵育30min，然后用PBST 溶液洗涤3次，拍干。
氟苯尼考标准品溶液的溶剂为PBS缓冲液，氟苯尼考标准品浓度分别为0、0.001、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16和0.32 ng/mL 的溶液，每个浓度三个平行。
4、加酶标二抗
每孔加入100μL酶标二抗稀释液，37℃孵育30 min，然后用PBST 溶液洗涤3次，拍干。
5、显色
每孔加入100μL显色液，37℃孵育15 min。
6、终止
每孔加入 50μL 2 mol/L浓硫酸。
7、读数
以 OD 450 nm波长测定各孔 OD 值。
以－log10（氟苯尼考浓度）值为横坐标，以 OD 值 ( 测定 OD 450 nm) 为纵坐标，利用 Origin 8.0 的四参数方程进行拟合，建立标准曲线获得IC50值，标准曲线见图4，纯化后的多克隆抗体的IC50值为0.05 ng/mL。
六、氟苯尼考多克隆抗体与甲砜霉素交叉反应率的测定
按步骤五的操作，测定所制备的氟苯尼考多克隆抗体对甲砜霉素的交叉反应率。
经测定，所制备的多克隆抗体与甲砜霉素的交叉反应率<1 %。

Claims (9)

1.一种氟苯尼考半抗原，其特征在于，结构式如式（Ⅰ）所示；
式（Ⅰ）。
2.一种权利要求1所述氟苯尼考半抗原化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(S1)氟苯尼考溶于无水乙醇中，加入浓盐酸，60-80℃反应6-10h，减压浓缩，浓缩液补加无水乙醇，旋转蒸干；
(S2)取步骤(S1)所得产物，用乙酸乙酯重结晶，过滤，干燥，得到氟苯尼考胺盐酸盐；
(S3)将氟苯尼考胺盐酸盐在溶剂和碱条件下，与4'-溴甲基联苯-2-羧酸甲酯在40-50℃反6-10小时，过滤，滤液减压浓缩；
(S4)步骤(S3)所得产物柱层析提纯，得到联苯-2-甲酸甲酯取代-氟苯尼考胺；
(S5)联苯-2-甲酸甲酯取代-氟苯尼考胺加入到甲醇中，加入氢氧化钠，回流条件下70-80℃反应3-5h，蒸除甲醇，调节pH为6-7，析出固体，干燥，得到式(I)化合物，即氟苯尼考半抗原。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(S1)中，氟苯尼考、无水乙醇、浓盐酸、补加的无水乙醇的比例为2-3g：40-60mL：20-30mL：20-30mL；浓盐酸质量浓度35-38wt%；步骤(S2)中，乙酸乙酯体积和步骤(S1)所得产物质量比为30-40mL：1g；步骤(S3)中，氟苯尼考胺盐酸盐和4'-溴甲基联苯-2-羧酸甲酯的摩尔比为1-1.1:1-1.1；步骤(S4)中，柱层析洗脱液是石油醚和乙酸乙酯按照体积比1-3:1-3的混合液；步骤(5)中，调节pH用盐酸。
4.一种氟苯尼考人工抗原，其特征在于，是权利要求1所述氟苯尼考半抗原化合物与载体蛋白BSA偶联得到的偶联物，结构如式（Ⅱ）所示：
式（Ⅱ）。
5.根据权利要求4所述的氟苯尼考人工抗原，其特征在于，所述偶联物中，一个载体蛋白分子上平均偶联6.5-7.1个式（Ⅰ）所示化合物。
6.一种制备权利要求4或5所述氟苯尼考人工抗原的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用碳二亚胺法将载体蛋白偶联于式（Ⅰ）所示化合物的羧基上。
7.一种氟苯尼考抗体，其特征在于，是权利要求4或5所述氟苯尼考人工抗原经动物免疫得到。
8.权利要求1所述氟苯尼考半抗原或权利要求4或5所述氟苯尼考人工抗原的以下任一用途：
(1)在制备氟苯尼考特异性抗体中的用途；
(2)在制备氟苯尼考检测试剂中的用途；
(3)在制备氟苯尼考免疫层析试纸中的用途；
(4)在检测氟苯尼考中的用途。
9.权利要求7所述氟苯尼考抗体的以下任一用途：
(1)在制备氟苯尼考检测试剂中的用途；
(2)在制备氟苯尼考免疫层析试纸中的用途；
(3)在检测氟苯尼考中的用途。
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