CN111285786B - 硝呋烯腙半抗原和人工抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了硝呋烯腙半抗原和人工抗原及其制备方法与应用，该硝呋烯腙半抗原的结构式为
Figure DDA0002404880510000011
或
Figure DDA0002404880510000012
该硝呋烯腙人工抗原由上述硝呋烯腙半抗原与载体蛋白偶联后得到。利用该硝呋烯腙人工抗原免疫动物，可得到效价高、灵敏度高的特异性抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的硝呋烯腙检测方法提供了新手段；利用本发明提供的半抗原与载体蛋白的偶联物制备硝呋烯腙抗体制备过程简单、经济，抗体的检测灵敏度高、实用价值高，在兽药残留检测中具有良好的应用前景。

Description

硝呋烯腙半抗原和人工抗原及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及硝呋烯腙半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术
硝呋烯腙(Nitrovin，NTV)是一种呋喃类化学合成药物，是20世纪70年代中期发现的一种新型抗生素，随后在世界各地广泛应用，具有促进动物生长、提高饲料利用率、改善饲料报酬、防治畜禽腹泻和促进色素沉积等作用，而且能持续维护高效能，在畜牧生产中，主要用作畜禽的促生长饲料添加药物。
然而，由于硝基呋喃类药物的热和化学不稳定性，常以检测其代谢产物作为残留标示物，这些代谢物可以在弱酸性条件下(如胃液的酸性)从蛋白质中释放出来，因此，当人类吃了含有硝基呋喃类抗生素残留的食品，这些代谢物就可以在人类胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来被人体吸收而对人类健康造成危害。NTV的化学构造不同于其他硝基呋喃类药物，其他硝基呋喃环与侧链之间以C＝N键连接，C＝N键断裂导致其代谢产物的生成；而NTV在该位置上出现C＝C键，C＝C键键能大，稳定性好，因此其代谢产物较少，需要灵敏度高的检测方法。
随着国民对食品与环境质量要求的不断提高及对抗生素认识的不断深入，动物源食品中的兽药残留已逐渐成为大家关注的焦点。目前，硝呋烯腙的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)等，但其均存在价格昂贵、携带不便等问题，难以实现快速、简便的现场检测要求，严重制约了对该药物的有效检测。
以抗原抗体特异性可逆结合为基础的免疫分析，具有灵敏、快速、特异、简便等优点，可以用于大量样本的快速筛选，能节省检测成本，具有广阔的推广应用前景。因此，设计免疫半抗原分子，开发一种简单、快捷、用于检测硝呋烯腙代谢物的抗体显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供硝呋烯腙半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明一方面提供了硝呋烯腙半抗原，其结构式为如下式(I)或式(II)所示：
Figure BDA0002404880490000021
本发明另一方面提供了上述硝呋烯腙半抗原的制备方法。
当所述硝呋烯腙半抗原为式(I)所示化合物时，其制备方法具体包括如下步骤：
S1、以乙腈作溶剂，加入1eq 5-羟基-2硝基苯甲醛、1eq 2-溴乙酸乙酯和2eq碳酸钾，以KI为催化剂，回流反应过夜后进行后处理，先浓缩去除乙腈，随后倒入水中，加乙酸乙酯提取3次，将乙酸乙酯合并后，水洗后干燥并旋干；
S2、1eq步骤S1的产物加入甲醇中，加入3eq 1mol/L的氢氧化钠水溶液，30℃反应2h后倒入水中，加盐酸调节至酸性，析出固体后抽滤并干燥；
S3、以无水乙醇作溶剂，加入1eq步骤S2的产物、1eq氨基盐酸胍盐酸盐和1eq醋酸钠，回流反应3h，冷却后抽滤，将滤饼真空干燥得到所述硝呋烯腙半抗原。
当所述硝呋烯腙半抗原为式(II)所示化合物时，其制备方法具体包括如下步骤：
S1、以乙腈作溶剂，加入1eq 5-羟基-2硝基苯甲醛、1eq 4-溴丁酸乙酯和2eq碳酸钾，以KI为催化剂，回流反应过夜后进行后处理，先浓缩去除乙腈，随后倒入水中，加乙酸乙酯提取3次，将乙酸乙酯合并后，水洗后干燥并旋干；
S2、1eq步骤S1的产物加入甲醇中，加入3eq 1mol/L的氢氧化钠水溶液，30℃反应2h后倒入水中，加盐酸调节至酸性，析出固体后抽滤并干燥；
S3、以无水乙醇作溶剂，加入1eq步骤S2的产物和1eq氨基盐酸胍盐酸盐和1eq醋酸钠，回流反应3h，随后倒入水中，抽滤后真空干燥得到所述硝呋烯腙半抗原。
第三方面，本发明提供了硝呋烯腙人工抗原，是由所述硝呋烯腙半抗原与载体蛋白偶联后得到。所述硝呋烯腙人工抗原可以作为免疫原也可以作为包被原。
具体地，在上述技术方案中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白；优选为牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
第四方面，本发明提供了所述硝呋烯腙人工抗原的制备方法，采用活化酯法将载体蛋白偶联于所述硝呋烯腙半抗原的羧基碳上制得硝呋烯腙人工抗原。
具体地，在上述技术方案中，式(I)所示硝呋烯腙半抗原与载体蛋白的偶联摩尔比为5.7：1。
具体地，在上述技术方案中，式(II)所示硝呋烯腙半抗原与载体蛋白的偶联摩尔比为11.8：1。
第五方面，本发明提供了由所述硝呋烯腙人工抗原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体，优选为多克隆抗体。
第六方面，本发明提供了所述硝呋烯腙半抗原或所述硝呋烯腙人工抗原的以下任一应用：
①在制备抗硝呋烯腙代谢物特异性抗体中的应用；
②在检测抗硝呋烯腙代谢物特异性抗体中的应用。
第七方面，本发明提供了抗硝呋烯腙多克隆抗体，由所述硝呋烯腙人工抗原免疫实验动物获得。
优选地，在上述技术方案中，所述硝呋烯腙人工抗原由所述硝呋烯腙半抗原与钥孔血蓝蛋白偶联得到。
第八方面，本发明提供了所述特异性抗体或所述多克隆抗体制备的硝呋烯腙检测试剂或试剂盒。
第九方面，本发明提供了所述特异性抗体或所述多克隆抗体的以下任一应用：
(1)在检测硝呋烯腙中的应用；
(2)在制备硝呋烯腙的免疫层析试纸条中的应用；
(3)在制备硝呋烯腙的胶体金检测试纸条中的应用。
此外，本发明还提供了基于所述多克隆抗体和包被原建立的快速、灵敏、广谱的硝呋烯腙的酶联免疫分析方法。
优选地，在上述技术方案中，所述包被原由所述硝呋烯腙半抗原与牛血清白蛋白偶联得到。
本发明具有下列优点及有益效果：
(1)本发明首次公开了两种新的硝呋烯腙半抗原、人工抗原及其制备方法，用所述硝呋烯腙人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的特异性抗体，本发明所提供的硝呋烯腙半抗原及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的硝呋烯腙检测方法提供了新手段；
(2)利用本发明提供的半抗原与载体蛋白的偶联物制备硝呋烯腙抗体(多抗)，制备过程简单、经济，抗体的检测灵敏度高、实用价值高，在兽药残留检测中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中式(I)所示硝呋烯腙半抗原制备的流程图；
图2为本发明实施例1中式(II)所示硝呋烯腙半抗原制备的流程图；
图3为本发明实施例1中式(I)所示硝呋烯腙半抗原的质谱图；
图4为本发明实施例1中式(II)所示硝呋烯腙半抗原的质谱图；
图5为本发明实施例1中式(I)所示硝呋烯腙半抗原的1H NMR核磁谱图；
图6为本发明实施例1中式(II)所示硝呋烯腙半抗原的1H NMR核磁谱图；
图7为本发明实施例2中BSA的MALDI-TOF-MS图；
图8为本发明实施例2中AGD①-BSA的MALDI-TOF-MS图；
图9为本发明实施例2中AGD②-BSA的MALDI-TOF-MS图；
图10为本发明实施例4中利用多克隆抗体检测硝呋烯腙代谢物AGD的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
若未特别指明，本发明实施例中所用的实验试剂和材料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；本发明实施例中所用的PBS缓冲液均为pH 7.4、0.01M的PBS缓冲液；本发明实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH 9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液。
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写；DCC为二环己基碳二亚胺的缩写；DMF为N，N-二甲基甲酰胺的缩写；NHS、DCC、牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)、钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)以及弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司。
柱层析所用固定相均为200-300目的硅胶。
实施例1硝呋烯腙半抗原的制备和表征
一、硝呋烯腙半抗原的制备
1、式(I)所示硝呋烯腙半抗原的制备
如图1所示，具体包括以下步骤：
S1、乙腈作溶剂，依次加入1eq 5-羟基-2硝基苯甲醛、1eq 2-溴乙酸乙酯和2eq碳酸钾，加入少量KI做催化剂，回流反应过夜，后处理先浓缩除去大部分乙腈，然后倒入水中，加乙酸乙酯提取3次，乙酸乙酯合并后，水洗，干燥，旋干，收率约60％，无须纯化，直接下投；
S2、1eq步骤S1的产物加入甲醇中，然后加入3eq 1mol/L的氢氧化钠水溶液，30℃反应2h，后处理倒入水中，加盐酸调节至酸性，析出固体，抽滤，干燥，收率约80％；
S3、无水乙醇作溶剂，加入1eq步骤S2的产物、1eq氨基盐酸胍盐酸盐和1eq醋酸钠，回流反应3h，冷却，抽滤，滤饼真空干燥，收率95％。
2、式(II)所示硝呋烯腙半抗原的制备
如图2所示，具体包括以下步骤：
S1、乙腈作溶剂，依次加入1eq 5-羟基-2硝基苯甲醛、1eq 4-溴丁酸乙酯和2eq碳酸钾，加入少量KI做催化剂，回流反应过夜，后处理先浓缩除去大部分乙腈，然后倒入水中，加乙酸乙酯提取3次，乙酸乙酯合并后，水洗，干燥，旋干，收率约60％，无须纯化，直接下投；
S2、1eq步骤S1的产物加入甲醇中，然后加入3eq 1mol/L的氢氧化钠水溶液，30℃反应2h，后处理倒入水中，加盐酸调节至酸性，析出固体，抽滤，干燥，收率约80％；
S3、以无水乙醇作溶剂，加入1eq步骤S2的产物、1eq氨基盐酸胍盐酸盐和1eq醋酸钠，回流反应3h，后处理倒入水中，抽滤，真空干燥，收率90％。
二、硝呋烯腙半抗原的表征
1、质谱鉴定
上述式(I)所示硝呋烯腙半抗原的质谱检测结果如图3所示，结果分析如下，MS m/z[M+H]+理论值为281.2，实测值为282.1，与目标产物的分子量相吻合。
上述式(II)所示硝呋烯腙半抗原的质谱检测结果如图4所示，结果分析如下，MSm/z[M+H]+理论值为309.3，实测值为310.1，与目标产物的分子量相吻合。
2、核磁共振鉴定
上述式(I)所示硝呋烯腙半抗原的核磁共振检测结果如图5所示，结果分析如下，1H NMR(400MHz，dmso)δ8.23(m，4H，NH)，7.98(s，1H，ArH)，7.52(s，1H，ArH)，7.03(s，1H，ArH)，4.58(s，2H，CH2)；分析上述数据结果表明，所合成的产物即为目标产物。
上述式(II)所示硝呋烯腙半抗原的核磁共振检测结果如图6所示，结果分析如下，1H NMR(400MHz，dmso)δ8.37(s，1H，CHO)，7.93(d，J＝8.7Hz，1H，ArH)，7.73(s，1H，ArH)，6.97(dd，J＝9.1，2.4Hz，1H，ArH)，6.48(m，4H，NH2)，4.15(t，J＝6.5Hz，2H，CH2)，2.29(t，J＝6.9Hz，2H，CH2)，2.00-1.88(m，2H，CH2)；分析上述数据结果表明，所合成的产物即为目标产物。
实施例2硝呋烯腙人工抗原的制备和表征
所述免疫原与包被原的制备方法中，其区别在于载体蛋白的使用类型，所述免疫原载体蛋白主要采用KLH，所述包被原载体蛋白主要采用BSA，所用偶联方法为活化酯法。
一、硝呋烯腙包被原的合成和鉴定
1、硝呋烯腙包被原的制备
S1、将20mg实施例1制备得到的式(I)所示化合物溶于2mL DMF中，加入10mg NHS和10mg DCC，室温下搅拌过夜，得到溶液I；
S2、将7mg BSA加入7mL PBS缓冲液中，充分溶解，即为溶液II；
S3、将溶液I缓慢滴加至溶液II中，缓慢4℃搅拌24h后装入透析袋，在生理盐水中4℃透析72h(中间换水6次)，得到硝呋烯腙包被原溶液，-20℃保存。
以上式(I)所示化合物合成的硝呋烯腙包被原简称AGD①-BSA。
类似地，采用上述方法制备式(II)所示化合物合成的硝呋烯腙包被原，简称AGD②-BSA。
2、硝呋烯腙包被原的鉴定
用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)法分别测定AGD①-BSA溶液和AGD②-BSA溶液中BSA与半抗原的结合比。
结合比＝[M(偶联物)-M(蛋白质)]/M(半抗原)。
式(I)中半抗原的分子量为281.2，载体BSA的MALDI-TOF-MS(结果如图7所示)分子量为64771.297，偶联物AGD①-BSA的MALDI-TOF-MS(结果如图8所示)分子量为66369.524，偶联物的分子量高于载体蛋白BSA的分子量，说明AGD①-BSA合成成功。
经计算得出，BSA与半抗原的结合比为5.7，即AGD①-BSA中一个BSA分子上平均偶联5.7个半抗原。
式(II)半抗原的分子量为309.3，载体BSA的MALDI-TOF-MS(结果如图7所示)分子量为64771.297，偶联物AGD②-BSA的MALDI-TOF-MS(结果如图9所示)分子量为68417.44，偶联物的分子量高于载体蛋白BSA的分子量，说明AGD②-BSA合成成功。
经计算得出，BSA与半抗原的结合比为11.8，即AGD②-BSA中一个BSA分子上平均偶联11.8个半抗原。
二、硝呋烯腙免疫原的合成
1、硝呋烯腙免疫原的制备
制备方法与上述硝呋烯腙包被原的制备方法类似，区别在于，用KLH代替BSA。
式(I)和式(II)所示化合物合成硝呋烯腙免疫原分别简称AGD①-KLH、AGD②-KLH。
实施例3硝呋烯腙抗血清的制备
将实施例2制备的AGD①-KLH、AGD②-KLH溶液分别免疫2组3-4月龄，体重1.5-2.0kg的雌性新西兰大白兔，每组2只。
将各免疫原用生理盐水稀释至1mg/mL，与等量弗氏佐剂乳化。
首免采用弗氏完全佐剂，颈背部皮内多点注射，免疫剂量为1mg/只；4周后进行加强免疫，每隔4周加免1次，共加免3次，佐剂改为弗氏不完全佐剂，免疫剂量不变，改为颈背部皮下多点注射；第4次免疫1周后，用心脏采血的方法大量采血。
取血后，将血液37℃静置2h，然后4℃静置过夜，然后3000rpm离心20min，收集上清液，即为抗血清，-20℃分装保存。
实施例4硝呋烯腙抗血清的测定
一、采用间接ELISA方法检测抗血清效价
具体操作步骤如下：
S1、包被，将实施例2中的抗原用0.05M、pH 9.6碳酸盐缓冲液从10μg/mL开始进行倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
S2、洗涤，将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
S3、封闭，拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h，洗涤后烘干备用；
S4、加样，将抗血清从1：100开始进行倍比稀释，并加入到各种稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h，充分洗涤后，加入1：3000稀释的HRP-羊抗兔Ig G，100μL/孔，37℃反应1h；
S5、显色，将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
S6、终止和测定，每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值；
S7、结果判读，以OD450值≥阴性对照孔的2.1倍(即P/N≥2.1)所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。
二、半数抑制以及特异性的检测
具体操作步骤如下：
S1、用上述的间接ELISA方法确定以AGD②-BSA作为包被原，以AGD①-KLH免疫兔子获得的血清作为抗体，以OD450值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度；
S2、包被，将包被原用包被缓冲液稀释1000倍，100μL/孔，37℃反应2h；
S3、洗涤和封闭，方法操作同上述间接ELISA法；
S4、配硝呋烯腙代谢物AGD标准溶液，将AGD标准品用0.01mol/L、pH 7.4的PBS溶液配制成5mg/mL的母液，然后，在加样前，再用0.01mol/L、pH 7.4的PBS溶液倍比稀释成需要浓度(AGD的浓度分别为0.1ng/mL、0.3ng/mL、1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL)；
S5、加样，每孔加入50μL倍比稀释的AGD各浓度标准品，然后再加入50μL/孔最适稀释倍数的抗血清，37℃反应1h，充分洗涤后，加入1：3000稀释的HRP-羊抗兔Ig G，100μL/孔，37℃反应1h；
S6、显色反应，将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
S7、终止和测定，每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值；
S8、数据处理，以AGD各浓度的对数为横坐标，以AGD各浓度对应的OD值为纵坐标，使用Origin 8.5软件，按照四参数对数拟合绘制标准曲线，如图10所示，通过计算IC50值(半数抑制浓度)判定抗血清对AGD是否具有特异性。
结果显示，四免后，兔子抗血清效价可达3200，IC50值为4.2ng/mL。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (14)

1.硝呋烯腙半抗原，其特征在于，其结构式为如下式(I)或式(II)所示：
Figure FDA0002944366210000011
2.权利要求1所述硝呋烯腙半抗原的制备方法，其特征在于，当所述硝呋烯腙半抗原为式(I)所示化合物时，具体包括如下步骤：
S1、以乙腈作溶剂，加入1eq 5-羟基-2硝基苯甲醛、1eq 2-溴乙酸乙酯和2eq碳酸钾，以KI为催化剂，回流反应过夜后进行后处理，先浓缩去除乙腈，随后倒入水中，加乙酸乙酯提取3次，将乙酸乙酯合并后，水洗后干燥并旋干；
S2、1eq步骤S1的产物加入甲醇中，加入3eq 1mol/L的氢氧化钠水溶液，30℃反应2h后倒入水中，加盐酸调节至酸性，析出固体后抽滤并干燥；
S3、以无水乙醇作溶剂，加入1eq步骤S2的产物、1eq氨基胍盐酸盐和1eq醋酸钠，回流反应3h，冷却后抽滤，将滤饼真空干燥得到所述硝呋烯腙半抗原。
3.权利要求1所述硝呋烯腙半抗原的制备方法，其特征在于，当所述硝呋烯腙半抗原为式(II)所示化合物时，具体包括如下步骤：
S1、以乙腈作溶剂，加入1eq 5-羟基-2硝基苯甲醛、1eq 4-溴丁酸乙酯和2eq碳酸钾，以KI为催化剂，回流反应过夜后进行后处理，先浓缩去除乙腈，随后倒入水中，加乙酸乙酯提取3次，将乙酸乙酯合并后，水洗后干燥并旋干；
S2、1eq步骤S1的产物加入甲醇中，加入3eq 1mol/L的氢氧化钠水溶液，30℃反应2h后倒入水中，加盐酸调节至酸性，析出固体后抽滤并干燥；
S3、以无水乙醇作溶剂，加入1eq步骤S2的产物、1eq氨基胍盐酸盐和1eq醋酸钠，回流反应3h，随后倒入水中，抽滤后真空干燥得到所述硝呋烯腙半抗原。
4.硝呋烯腙人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述硝呋烯腙半抗原与载体蛋白偶联后得到；
其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。
5.根据权利要求4所述的硝呋烯腙人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
6.权利要求4或5所述硝呋烯腙人工抗原的制备方法，其特征在于，采用活化酯法将载体蛋白偶联于权利要求1所述硝呋烯腙半抗原的羧基碳上。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，式(I)所示硝呋烯腙半抗原与载体蛋白的偶联摩尔比为5.7：1，式(II)所示硝呋烯腙半抗原与载体蛋白的偶联摩尔比为11.8：1。
8.由权利要求4或5所述硝呋烯腙人工抗原制备的特异性抗体，其特征在于，所述特异性抗体选自多克隆抗体和单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的特异性抗体，其特征在于，所述特异性抗体为多克隆抗体。
10.权利要求1所述硝呋烯腙半抗原或权利要求4或5所述硝呋烯腙人工抗原的以下任一应用：
①在制备抗硝呋烯腙代谢物特异性抗体中的应用；
②在非诊断治疗目的检测抗硝呋烯腙代谢物特异性抗体中的应用。
11.抗硝呋烯腙多克隆抗体，其特征在于，由权利要求4或5所述硝呋烯腙人工抗原免疫实验动物获得。
12.根据权利要求11所述的抗硝呋烯腙多克隆抗体，其特征在于，所述硝呋烯腙人工抗原由所述硝呋烯腙半抗原与钥孔血蓝蛋白偶联得到。
13.由权利要求8或9所述特异性抗体或权利要求11或12所述多克隆抗体制备的硝呋烯腙检测试剂或试剂盒。
14.权利要求8或9所述特异性抗体或权利要求11或12所述多克隆抗体的以下任一应用：
(1)在非诊断治疗目的检测硝呋烯腙中的应用；
(2)在制备硝呋烯腙的免疫层析试纸条中的应用；
(3)在制备硝呋烯腙的胶体金检测试纸条中的应用。
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