CN113999188B - 赛拉嗪半抗原和人工抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种赛拉嗪半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。用本发明的赛拉嗪人工抗原免疫动物，可以得到效价高，灵敏度高的特异性抗体。本发明提供的赛拉嗪半抗原及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的赛拉嗪检测方法提供了新手段。利用本发明提供的半抗原与载体蛋白的偶联物制备赛拉嗪抗体，制备过程简单、经济，抗体对赛拉嗪的检测灵敏度可达0.25ng/mL，实用价值高，特别是在兽药残留检测中具有良好的应用前景。

Description

赛拉嗪半抗原和人工抗原及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体地说，涉及赛拉嗪半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术
赛拉嗪(Xylazine，XYL)为镇痛性化学保定药，其作用机理是通过与中枢神经系统突触前膜的受体结合,并激动突触前膜的抑制性自身受体,抑制去甲肾上腺素的释放,从而起到镇静、镇痛和中枢性肌松作用。目前，该药主要用于马、牛、羊等动物的镇静与镇痛。已有研究表明，赛拉嗪在动物源性食品中的残留会对消费者的健康带来极大危害，长期食用含有赛拉嗪残留的动物源食品可能会出现恶心、呕吐、头晕，无力等症状，严重的还会出现精神失常。因此，开发可用于动物源性食品中的赛拉嗪残留检测方法，对有效控制动物源性食品中赛拉嗪的残留，保障人民的健康具有重大意义。
目前，已有的赛拉嗪检测方法主要包括高效液相色谱(HPLC)，液相色谱/串联质谱(LC-MS)和气相色谱/串联质谱(GC-MS/MS)等。然而，这些方法所需的大型仪器价格昂贵、操作复杂、便携性差，难以实现生产一线的检测，并且这些方法的前处理过程较为复杂、费时，不适用于大量样品的快速检测。因此，有必要建立一种针对赛拉嗪的简单、快速、可靠的检测方法。基于抗原-抗体特异性反应的免疫分析技术，具有检测速度快，检测成本低的优点。然而，免疫分析技术的核心是获得对赛拉嗪具有高特异性和高灵敏度的抗体，因此，合理设计赛拉嗪半抗原，开发一种简单、快捷、用于检测赛拉嗪的抗体显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供赛拉嗪半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种赛拉嗪半抗原，其结构如式(I)或式(II)所示：
第二方面，本发明提供所述赛拉嗪半抗原的制备方法。
式(I)所示赛拉嗪半抗原的制备方法，包括如下步骤：
S1：将241.86mg 6-溴己酸加入到20mL二氯甲烷中，再加入5mL二氯亚砜，95-110℃回流反应1-3h(优选1h)，直接旋转蒸发至干，滴加到10mL含有5％碳酸氢钠的叔丁醇溶液中，室温反应过夜，抽滤后倒入10mL 5％碳酸氢钠水溶液中，30mL乙酸乙酯进行提取，旋转蒸发至干；
S2：以N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，在20mL N,N-二甲基甲酰胺中加入2.64g 6-溴己酸叔丁酯和3.16g赛拉嗪，再加入2.70g碳酸钾和1.23g碘化钾，95-125℃(优选100℃)反应过夜后直接倒入水中，使用30mL乙酸乙酯提取，旋转蒸发至干，利用硅胶柱进行纯化，收集产物；
S3：将S2所得产物溶于20mL二氯甲烷中，加入5mL三氟乙酸，室温反应2-4h(优选2h)，浓缩至恒重，倒入水中，使用20mL二氯甲烷进行提取，干燥旋干二氯甲烷，即得。
式(II)所示赛拉嗪半抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)将6.42g 4-溴甲基苯甲酸加入到5mL二氯亚砜中，80-100℃回流反应1-3h(优选1h)，直接旋转蒸发至干，滴加到10mL含有5％的碳酸氢钠的叔丁醇溶液中，室温反应过夜，抽滤后倒入8mL 5％碳酸氢钠水溶液中，30mL乙酸乙酯提取，旋干；
(2)以N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，在30mL N,N-二甲基甲酰胺中加入3.12g 4-溴甲基苯甲酸叔丁酯和4.33g赛拉嗪，再加入3.11g碳酸钾，80-100℃(优选80℃)反应2-4h(优选2h)后直接倒入水中，20mL乙酸乙酯提取，旋转蒸发至干，利用硅胶柱进行纯化，收集产物；
(3)将(2)所得产物溶于20mL二氯甲烷中，加入5mL三氟乙酸，室温反应2-4h(优选2h)，浓缩至恒重，倒入水中，使用20mL二氯甲烷进行提取，干燥旋干二氯甲烷，即得。
第三方面，本发明提供一种赛拉嗪人工抗原，由式(I)或式(II)的赛拉嗪半抗原与载体蛋白偶联后得到。
其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白等；优选牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白。
第四方面，本发明提供所述赛拉嗪人工抗原的制备方法，采用活泼酯法将载体蛋白偶联于式(I)或式(II)赛拉嗪半抗原的羧基碳上。
第五方面，本发明提供所述赛拉嗪半抗原或所述赛拉嗪人工抗原的以下任一应用：
(1)用于制备抗赛拉嗪特异性抗体；
(2)用于检测抗赛拉嗪特异性抗体；
(3)用于制备赛拉嗪检测试剂。
第六方面，本发明提供由所述赛拉嗪人工抗原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体，优选多克隆抗体。所述多克隆抗体可通过赛拉嗪人工抗原免疫实验动物(如新西兰大白兔)，收集血清纯化获得。
所述单克隆抗体可通过杂交瘤技术来制备。
第七方面，本发明提供由所述特异性抗体制备的赛拉嗪检测试剂或试剂盒。
第八方面，本发明提供所述特异性抗体的以下任一应用：
(i)用于赛拉嗪检测；
(ii)用于制备赛拉嗪的免疫层析试纸条；
(iii)用于制备赛拉嗪的胶体金检测试纸条。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明首次公开了两种新的赛拉嗪半抗原、人工抗原及其制备方法，用所述赛拉嗪人工抗原免疫动物，可以得到效价高，灵敏度高的特异性抗体。本发明提供的赛拉嗪半抗原及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的赛拉嗪检测方法提供了新手段。
利用本发明提供的半抗原与载体蛋白的偶联物制备赛拉嗪抗体(多克隆抗体)，制备过程简单、经济，抗体对赛拉嗪的检测灵敏度可达0.25ng/mL，实用价值高，特别是在兽药残留检测中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中式(I)所示赛拉嗪半抗原制备的流程图。
图2为本发明实施例1中式(II)所示赛拉嗪半抗原制备的流程图。
图3为本发明实施例1中式(I)所示赛拉嗪半抗原的质谱图。
图4为本发明实施例1中式(II)所示赛拉嗪半抗原的质谱图。
图5为本发明实施例1中式(I)所示赛拉嗪半抗原的1H NMR图。
图6为本发明实施例1中式(II)所示赛拉嗪半抗原的1H NMR图。
图7为本发明实施例2中BSA的MALDI-TOF-MS图。
图8为本发明实施例2中XYL①-BSA的MALDI-TOF-MS图。
图9为本发明实施例2中XYL②-BSA的MALDI-TOF-MS图。
图10为本发明实施例4中利用多克隆抗体检测赛拉嗪的标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。所用PBS缓冲液均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。所用碳酸盐缓冲液均为pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液。
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的缩写。DMF为N,N-二甲基甲酰胺的缩写。NHS、EDC、牛血清白蛋白(Albumin frombovine serum,BSA)、钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)以及弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司。柱层析所用固定相均为200-300目的硅胶。
实施例1赛拉嗪半抗原的制备和表征
本实施例提供的赛拉嗪半抗原，其结构如式(I)或式(II)所示：
一、赛拉嗪半抗原的制备
1、式(I)所示赛拉嗪半抗原的制备
第一步：将241.86mg 6-溴己酸加入到20mL二氯甲烷中，再加入5mL二氯亚砜，95℃回流反应1h，直接旋干，滴加到10mL含有5％碳酸氢钠的叔丁醇溶液中，室温反应过夜，后处理，抽滤，倒入10mL 5％碳酸氢钠水溶液中，30mL乙酸乙酯进行提取，旋转蒸发至干。
第二步：以N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，在20mL N,N-二甲基甲酰胺中加入2.64g6-溴己酸叔丁酯和3.16g赛拉嗪，再加入2.70g碳酸钾和1.23g碘化钾，100℃反应过夜，后处理直接倒入水中，使用30mL乙酸乙酯提取，旋转蒸发至干过硅胶柱纯化，收集产品。
第三步：上步产物溶于20mL二氯甲烷中，加入5mL三氟乙酸，室温反应2h，后处理浓缩至恒重，倒入水中，使用20mL二氯甲烷进行提取，干燥旋干二氯甲烷，收集产物。
式(I)所示赛拉嗪半抗原制备的流程见图1。
2、式(II)所示赛拉嗪半抗原的制备
第一步：将6.42g 4-溴甲基苯甲酸加入到5mL二氯亚砜中，80℃回流反应1h，直接旋转蒸发至干，滴加到10mL含有5％的碳酸氢钠的叔丁醇溶液中，室温反应过夜，后处理，抽滤，倒入8mL 5％碳酸氢钠水溶液中，30mL乙酸乙酯提取，旋干。
第二步：以N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，在30mL N,N-二甲基甲酰胺中加入3.12g4-溴甲基苯甲酸叔丁酯和4.33g赛拉嗪，再加入3.11g碳酸钾，80℃反应2h，后处理直接倒入水中，20mL乙酸乙酯提取，旋干，过柱，收集产品。
第三步：上步产物溶于20mL二氯甲烷中，加入5mL三氟乙酸，室温反应2h，后处理浓缩至恒重，倒入水中，使用20mL二氯甲烷进行提取，干燥旋干二氯甲烷，收集产物。
式(II)所示赛拉嗪半抗原制备的流程见图2。
二、赛拉嗪半抗原的表征
1、质谱鉴定
式(I)所示赛拉嗪半抗原的质谱鉴定结果：MS m/z[M+H]+理论值：334.17；实测值：335.3，与目标产物的分子量相吻合，质谱见图3。
式(II)所示赛拉嗪素半抗原的质谱鉴定结果：MS m/z[M+H]+理论值：354.14；实测值：355.2，与目标产物的分子量相吻合，质谱见图4。
2、核磁共振鉴定
式(I)所示赛拉嗪半抗原的核磁鉴定结果：1H NMR(400MHz,DMSO)δ:7.28(m,1H,ArH),7.20(m,2H,ArH),3.61(t,2H,CH2),3.54(t,2H,CH2),3.09(t,2H,CH2),2.15(s,6H,CH),2.12(t,2H,CH2),2.00(m,2H,CH2),1.43(m,4H,CH2),1.21(m,2H,CH2)。核磁数据表明上述方法合成的化合物即为目标产物，磁共振鉴定结果见图5。
式(II)所示赛拉嗪半抗原的核磁鉴定结果：1HNMR(400MHz,DMSO)δ:7.80(d,2H,ArH),7.31(d,2H,ArH),7.20(m,1H,ArH),7.07(m,2H,ArH),5.07(s,2H,CH2),3.03(t,2H,CH2),3.13(t,2H,CH2),2.05(m,2H,CH2),1.89(s,6H,CH3)。核磁数据表明上述方法合成的化合物即为目标产物，磁共振鉴定结果见图6。
实施例2赛拉嗪人工抗原的制备和表征
由式(I)或式(II)的赛拉嗪半抗原与载体蛋白偶联后得到。分为免疫原、包被原。在所述免疫原与包被原的制备方法中，其区别在于所用载体蛋白的类型，所述免疫原载体蛋白主要采用KLH，所述包被原载体蛋白主要采用BSA，所用偶联方法为活泼酯法。由式(I)和式(II)所示赛拉嗪半抗原制备的人工抗原结构如下：
一、赛拉嗪包被原的合成及鉴定
1、赛拉嗪包被原的制备
(1)将49mg实施例1制备得到的(I)所示化合物溶于5mL DMF中，加入21mg NHS和42mg EDC，室温下搅拌过夜，得到溶液I。
(2)将50mg BSA加入10mL PBS缓冲液中，充分溶解，即为溶液II。
(3)将溶液I缓慢滴加至溶液II中，缓慢4℃搅拌24h后装入透析袋，在生理盐水中4℃透析72h(中间换水6次)，得到赛拉嗪包被原溶液，-20℃保存。式(I)所示化合物合成的赛拉嗪包被原命名为XYL①-BSA。
(4)取49.6mg实施例1制备得到的(II)所示化合物，采用上述同样的方法制备式(II)所示化合物合成的赛拉嗪包被原，命名为XYL②-BSA。
2、赛拉嗪包被原的鉴定
用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)法分别测定XYL①-BSA溶液和XYL②-BSA溶液中BSA与半抗原的结合比。结果见图7、图8和图9。
结合比＝[M(偶联物)－M(蛋白质)]/M(半抗原)
式(I)半抗原的分子量为334.2，由质谱最高峰值分析BSA的分子量为66109.1，偶联物的分子量为72087.77，经计算得出BSA与半抗原的结合比为17.9，即XYL①-BSA中一个BSA分子上平均偶联17.9个半抗原。
式(II)半抗原的分子量为354.1，由质谱最高峰值分析分析BSA的分子量为66109.1，偶联物的分子量为73315.8，经计算得出BSA与半抗原的结合比为20.4，即XYL②-BSA中一个BSA分子上平均偶联20.4个半抗原。
二、赛拉嗪免疫原的合成及鉴定
1、赛拉嗪免疫原的制备
用KLH代替BSA，其余同步骤一。
式(I)所示化合物合成赛拉嗪免疫原命名为XYL①-KLH。
式(II)所示化合物合成赛拉嗪免疫原命名为XYL②-KLH。
实施例3赛拉嗪抗血清的制备
将实施例2制备的XYL①-KLH，XYL②-KLH溶液分别免疫2组3-4月龄，体重1.5-2.0kg的雌性新西兰大白兔，每组2只。将各免疫原用生理盐水稀释至1mg/mL，与等量弗氏佐剂乳化。首免采用弗氏完全佐剂，颈背部皮内多点注射，免疫剂量为1mg/只。4周后进行加强免疫，每隔4周加免1次，共加免3次，佐剂改为弗氏不完全佐剂，免疫剂量不变，改为颈背部皮下多点注射。第4次免疫1周后，用心脏采血的方法大量采血。取血后，将血液37℃静置2h，然后4℃静置过夜，然后3000rpm离心20min，收集上清液，即为抗血清，-20℃分装保存。
实施例4赛拉嗪抗血清的测定
一、采用间接ELISA方法检测抗血清效价，具体步骤如下：
1、包被：将实施例2中制备的抗原用0.05M、pH 9.6碳酸盐缓冲液从10μg/mL开始进行倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。
2、洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min。
3、封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。
4、加样：将抗血清从1:1000开始进行倍比稀释，并加入到各种稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃反应1h。
5、显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。
6、终止和测定:每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
7、结果判读：以OD450值≥阴性对照孔的2.1倍(即P/N≥2.1)所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。
二、半数抑制浓度以及特异性的检测
具体步骤如下：
1、用上述的间接ELISA方法确定以XYL②-BSA作为包被原，以XYL①-KLH免疫兔子获得的血清作为抗体，以OD450值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。
2、包被：将包被原用包被缓冲液稀释5000倍，100μL/孔，37℃反应2h。
3、洗涤和封闭：方法操作同上述间接ELISA法。
4、配制赛拉嗪标准溶液：将赛拉嗪标准品溶于DMF中配制成5mg/mL的母液，然后在加样前，再用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液倍比稀释成需要浓度(赛拉嗪的浓度分别为0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.1ng/mL、24.3ng/mL)。
5、加样：每孔加入50μL倍比稀释的赛拉嗪各浓度标准品，然后再加入50μL/孔最适稀释倍数的抗血清，37℃反应1h。充分洗涤后，加入1:5000稀释的HRP-羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃反应1h。
6、显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。
7、终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
8、数据处理：以赛拉嗪各浓度的对数为横坐标，以赛拉嗪各浓度对应的OD值为纵坐标，使用Origin 8.5软件，按照四参数对数拟合绘制标准曲线，如图10所示，四免后，兔子抗血清对赛拉嗪的IC50值为0.25ng/mL。
此外，通过对赛拉嗪的多个结构类似物包括溴莫尼定、替扎尼定、安普乐定、可乐定、赛拉唑及功能类似物氯丙嗪、乙酰丙嗪、丙酰丙嗪的IC50及交叉反应率测定发现所获多克隆抗体的特异性强，对所有交叉反应物的交叉反应率均小于0.7％。
9、类似地，采用上述间接ELISA方法确定以XYL①-BSA作为包被原，以XYL②-KLH免疫兔子获得的血清作为抗体，以OD450值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度，测定XYL②-KLH免疫所获多克隆抗体的IC50值为30.41ng/mL。灵敏度比XYL①-KLH免疫所获多克隆抗体略差。此外，通过对赛拉嗪的多个结构类似物包括溴莫尼定、替扎尼定、安普乐定、可乐定、赛拉唑及功能类似物氯丙嗪、乙酰丙嗪、丙酰丙嗪的IC50及交叉反应率测定发现所获多克隆抗体的特异性强，对所有交叉反应物的交叉反应率均小于4％。
本发明通过基于赛拉嗪结构进行了半抗原设计与改造，设计合成了2种不同间隔臂长度与间隔臂类型的赛拉嗪半抗原。与已有方法相比，本发明除了设计传统的直链间隔臂半抗原，还通过计算机辅助设计合成了具有苯环刚性间隔臂的赛拉嗪衍生化半抗原，通过免疫兔子获得了赛拉嗪的高灵敏抗体。目前所报道的抗体仅测定了对于几个功能类似物的交叉反应率，并没有测定对于结构高度类似的α2受体激动剂的交叉反应率，相较于已有的赛拉嗪抗体，以XYL①-KLH免疫所获抗体灵敏度比已有抗体更好，并且本抗体的特异性极强，对于5个结构极其类似的α2受体激动剂溴莫尼定、替扎尼定、安普乐定、可乐定、赛拉唑的交叉反应率均小于0.7％，而对于3个功能类似物氯丙嗪、乙酰丙嗪、丙酰丙嗪的交叉反应率小于0.5％，可用于赛拉嗪残留的特异性检测。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.赛拉嗪半抗原，其特征在于，其结构如式(I)所示：
2.权利要求1所述赛拉嗪半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将241.86mg 6-溴己酸加入到20mL二氯甲烷中，再加入5mL二氯亚砜，95-110℃回流反应1-3h，直接旋转蒸发至干，滴加到10mL含有5％碳酸氢钠的叔丁醇溶液中，室温反应过夜，抽滤后倒入10mL 5％碳酸氢钠水溶液中，使用30mL乙酸乙酯进行提取，旋转蒸发至干，得到6-溴己酸叔丁酯；
S2：以N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，在20mL N,N-二甲基甲酰胺中加入2.64g 6-溴己酸叔丁酯和3.16g赛拉嗪，再加入2.70g碳酸钾和1.23g碘化钾，95-125℃反应过夜后直接倒入水中，使用30mL乙酸乙酯提取，旋转蒸发至干，利用硅胶柱进行纯化，收集产物；
S3：将S2所得产物溶于20mL二氯甲烷中，加入5mL三氟乙酸，室温反应2-4h，浓缩至恒重，倒入水中，使用20mL二氯甲烷进行提取，干燥旋干二氯甲烷，即得。
3.一种赛拉嗪人工抗原，其特征在于，由权利要求1中所述赛拉嗪半抗原与载体蛋白偶联后得到；其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。
4.根据权利要求3所述的赛拉嗪人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
5.一种权利要求3或4所述赛拉嗪人工抗原的制备方法，其特征在于，采用活泼酯法将载体蛋白偶联于权利要求1中所述的赛拉嗪半抗原的羧基碳上。
6.权利要求1所述赛拉嗪半抗原或权利要求3或4所述赛拉嗪人工抗原的以下任一应用：
(1)用于制备抗赛拉嗪特异性抗体；
(2)用于制备检测抗赛拉嗪特异性抗体的制剂；
(3)用于制备赛拉嗪检测试剂。
7.由权利要求3或4所述赛拉嗪人工抗原制备的特异性抗体，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体。
8.由权利要求7所述赛拉嗪特异性抗体制备的赛拉嗪检测试剂或试剂盒。
9.权利要求7所述赛拉嗪特异性抗体的以下任一应用：
(i)用于制备赛拉嗪检测试剂；
(ii)用于制备赛拉嗪的免疫层析试纸条；
(iii)用于制备赛拉嗪的胶体金检测试纸条。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102603550A (zh) * 2012-02-16 2012-07-25 佛山普正医药科技有限公司 一种中间体bopta的制备方法
CN111454912A (zh) * 2020-04-27 2020-07-28 江南大学 一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102603550A (zh) * 2012-02-16 2012-07-25 佛山普正医药科技有限公司 一种中间体bopta的制备方法
CN111454912A (zh) * 2020-04-27 2020-07-28 江南大学 一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

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