CN112707839B - 辣椒素半抗原和人工抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及辣椒素半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。所述辣椒素半抗原的结构如式(1)或式(2)所示：
Figure DDA0002246493230000011
其中，R1、R2各自独立地为‑(CH2)nCOOH，n为4～12之间的整数。所述辣椒素人工抗原是由式(1)或式(2)所示半抗原与载体蛋白偶联得到。利用所述辣椒素人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的特异性抗体。本发明提供的辣椒素半抗原及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的辣椒素检测方法提供了新手段。

Description

辣椒素半抗原和人工抗原及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体地说，涉及辣椒素半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术
食用油在人们的日常生活中必不可少，常用于食品制作，对人体健康及食品风味等具有重要作用。在多种因素的影响下，我国食用油质量安全事件频发，其中“地沟油”问题是多年来我国食用油质量安全领域面临的重大难题。因地沟油对人体健康的严重危害，加强对地沟油的鉴别检测具有重要的意义。
由于人们的饮食习惯和口味爱好，在菜肴中或多或少都会加入辣味等调料，而辣椒在全国各地的菜系中都有涉及，是一种常用的调味作料。辣椒素类物质是引起辣味的主要化学成分，其中辣椒素(capsaicin，CPC)，是天然辣椒素的主要成分，在天然辣椒素中占比高达69％。辣椒素因为脂溶性较强而存在于油中，且理化性质比较稳定，能够耐受高温，在随食物烹饪过程中，化学结构不易被破坏，而且在地沟油精炼的整个过程中，依然难以被全部去除。经过相关研究机构学者们的大量研究和尝试，确定可将辣椒素类物质作为标志物进行地沟油的鉴定。
目前，辣椒素的检测手段主要为液相色谱(LC)、液质联用(LC-MS/MS)方法，但大型仪器价格昂贵、操作复杂、便携性差，难以实现生产一线的检测，严重制约了对于“地沟油”的有效监管。而基于抗原-抗体特异性反应的免疫分析技术，具有检测速度快，成本低的优点。
发明内容
本发明的目的是提供辣椒素半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种辣椒素半抗原，其结构如式(1)或式(2)所示：
Figure BDA0002246493210000011
其中，R1、R2各自独立地为-(CH2)nCOOH，n为4～12之间的整数。
优选地，n＝5，所述辣椒素半抗原的结构如式(I)或式(II)所示：
Figure BDA0002246493210000021
第二方面，本发明提供所述辣椒素半抗原的制备方法。
当所述辣椒素半抗原为式(I)化合物时，制备方法包括如下步骤：
第一步：将天然辣椒素和碳酸钾加入乙腈中，搅拌均匀，加入6-溴己酸乙酯，回流反应24h，后处理浓缩除去大部分乙腈，倒入水中，乙酸乙酯，提取，水洗，干燥，过柱纯化；
第二步：将上步产物溶于四氢呋喃中，加入等量的乙醇，再滴加氢氧化钠水溶液，加热至50℃反应1h，后处理浓缩除去大部分乙醇和四氢呋喃，冷却至室温，加盐酸调至酸性，产品析出，收集干燥。
当所述辣椒素半抗原为式(II)化合物时，制备方法包括如下步骤：
第一步：将二氢辣椒素和碳酸钾加入乙腈中，搅拌均匀，加入6-溴己酸乙酯，回流反应24h，后处理浓缩除去大部分乙腈，倒入水中，乙酸乙酯，提取，水洗，干燥，过柱纯化；
第二步：将上步产物溶于四氢呋喃中，加入等量的乙醇，再滴加氢氧化钠水溶液，加热至50℃反应1h，后处理浓缩除去大部分乙醇和四氢呋喃，冷却至室温，加盐酸调至酸性，产品析出，收集干燥。
第三方面，本发明提供一种辣椒素人工抗原，由式(1)或式(2)的辣椒素半抗原与载体蛋白偶联后得到；
其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白等；优选牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白。
第四方面，本发明提供所述人工抗原的制备方法，采用活化酯法将载体蛋白偶联于式(1)或式(2)辣椒素半抗原的羧基碳上。
优选地，式(I)化合物与载体蛋白的偶联摩尔比为4-61:1(优选5.9:1)。式(II)化合物与载体蛋白的偶联摩尔比为4-61:1(优选6.3:1)。
第五方面，本发明提供所述辣椒素半抗原或所述辣椒素人工抗原的以下任一应用：
①用于制备抗辣椒素特异性抗体；
②用于检测抗辣椒素特异性抗体。
第六方面，本发明提供由所述辣椒素人工抗原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体，优选多克隆抗体。所述多克隆抗体可通过辣椒素人工抗原免疫实验动物(如新西兰大白兔)，收集血清纯化获得。
所述单克隆抗体可通过杂交瘤技术来制备。
第七方面，本发明提供由所述特异性抗体制备的辣椒素检测试剂或试剂盒。
第八方面，本发明提供所述特异性抗体的以下任一应用：
(1)在检测辣椒素中的应用；
(2)在制备辣椒素的免疫层析试纸条中的应用；
(3)在制备辣椒素的胶体金检测试纸条中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明首次公开了两种新的辣椒素半抗原、人工抗原及其制备方法，用所述辣椒素人工抗原免疫动物，可以得到效价高，灵敏度高的特异性抗体。本发明提供的辣椒素半抗原及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的辣椒素检测方法提供了新手段。
利用本发明提供的半抗原与载体蛋白的偶联物制备辣椒素抗体(多克隆抗体)，制备过程简单、经济，抗体对辣椒素的检测灵敏度可达0.89ng/mL，实用价值高，特别是在地沟油检测中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中式(I)所示辣椒素半抗原制备的流程图。
图2为本发明实施例1中式(II)所示辣椒素半抗原制备的流程图。
图3为本发明实施例1中式(I)所示辣椒素半抗原的质谱图。
图4为本发明实施例1中式(II)所示辣椒素半抗原的质谱图。
图5为本发明实施例1中式(I)所示辣椒素半抗原的1H NMR图。
图6为本发明实施例1中式(II)所示辣椒素半抗原的1H NMR图。
图7为本发明实施例2中BSA的MALDI-TOF-MS图。
图8为本发明实施例2中CPC①-BSA的MALDI-TOF-MS图。
图9为本发明实施例2中CPC②-BSA的MALDI-TOF-MS图。
图10为本发明实施例4中利用多克隆抗体检测辣椒素的标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。所用PBS缓冲液均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。所用碳酸盐缓冲液均为pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液。
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的缩写。DMF为N,N-二甲基甲酰胺的缩写。NHS、EDC、牛血清白蛋白(Albumin frombovine serum,BSA)、钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)以及弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司。柱层析所用固定相均为200-300目的硅胶。
实施例1辣椒素半抗原的制备和表征
一、辣椒素半抗原的制备
1、式(I)所示辣椒素半抗原的制备
第一步：称取3.05g天然辣椒素和2.76g碳酸钾加入乙腈中，搅拌均匀，加入2.68g6-溴己酸乙酯，回流反应24h，后处理浓缩除去大部分乙腈，倒入水中，乙酸乙酯，提取，水洗，干燥，过柱纯化，收率约70％。第二步：将上步产物溶于四氢呋喃中，加入等量的乙醇，再滴加0.02mol氢氧化钠水溶液，加热至50℃反应1h，后处理浓缩除去大部分乙醇和四氢呋喃，冷却至室温，加盐酸调至酸性，产品析出，得到辣椒素半抗原6-(2-甲氧基-4-((8-甲基-6-壬烯酰胺)甲基)苯氧基)己酸，分子式C24H37NO5,结构如式(I)所示，收集干燥，收率为90％。
式(I)所示辣椒素半抗原制备的流程见图1。
2、式(II)所示辣椒素半抗原的制备
第一步：称取3.07g二氢辣椒素和2.76g碳酸钾加入乙腈中，搅拌均匀，加入2.68g6-溴己酸乙酯，回流反应24h，后处理浓缩除去大部分乙腈，倒入水中，乙酸乙酯，提取，水洗，干燥，过柱纯化，收率约70％。第二步：将上步产物溶于四氢呋喃中，加入等量的乙醇，再滴加0.02mol氢氧化钠水溶液，加热至50℃反应1h，后处理浓缩除去大部分乙醇和四氢呋喃，冷却至室温，加盐酸调至酸性，产品析出，得到辣椒素半抗原6-(2-甲氧基-4-((8-甲基壬酰胺)甲基)苯氧基)己酸，分子式C24H39NO5,结构如式(II)所示，收集干燥，收率为90％。
式(II)所示辣椒素半抗原制备的流程见图2。
二、辣椒素半抗原的表征
1、质谱鉴定
步骤一的式(I)所示辣椒素半抗原的质谱鉴定结果：MS m/z[M+H]+理论值：419.56；实测值：420.0，与目标产物的分子量相吻合，质谱见图3。
步骤一的式(II)所示辣椒素半抗原的质谱鉴定结果：MS m/z[M+H]+理论值：421.58；实测值：422.0，与目标产物的分子量相吻合，质谱见图4。
2、核磁共振鉴定
步骤一的式(I)所示辣椒素半抗原的核磁鉴定结果：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm)11.99(br，s，1H，COOH)，8.19(t，1H，NH)，6.88-6.71(dd，2H，j＝12Hz，CHar)，6.84(s，1H，CHar)，5.36-5.33(m，2H，-HC＝CH-)，4.19-4.17(d，2H，CH2)，3.92-3.88(t，2H，CH2)，3.73(s，3H，CH3)，2.25-2.20(m，3H，CH2,CH),2.14-2.09(t,2H,CH2),1.95-1.93,(q,2H,CH2),1.72-1.67(m,2H,CH2),1.58-1.49(m,4H,CH2,CH2)1.43-1.23(m,4H,CH2,CH2),0.94-0.84(dd,6H,CH3,CH3)。核磁数据表明上述方法合成的化合物即为目标产物，磁共振鉴定结果见图5。
步骤一的式(II)所示辣椒素半抗原的核磁鉴定结果：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm)11.99(br，s，1H，COOH)，8.19(t，1H，NH)，6.88-6.85(s，1H，CHar)，6.84-6.74(dd，2H，j＝1.8Hz，CHar)，4.19-4.17(d，2H，CH2)，3.92-3.88(t，2H，CH2)，3.73(s，3H，CH3)，2.25-2.20(t，2H，CH2),2.13-2.08(t,2H,CH2),1.71-1.67(q,2H,CH2),1.72-1.67(m,2H,CH2),1.56-1.40(m,7H,CH2,CH2,CH2,CH)1.24-0.83(m,8H,CH2,CH2,CH2,CH2),0.86-0.83(dd,6H,CH3,CH3)。核磁数据表明上述方法合成的化合物即为目标产物，磁共振鉴定结果见图6。
实施例2辣椒素人工抗原的制备和表征
由式(I))或式(II)的辣椒素半抗原与载体蛋白偶联后得到。分为免疫原、包被原。在所述免疫原与包被原的制备方法中，其区别在于所用载体蛋白的类型，所述免疫原载体蛋白主要采用KLH，所述包被原载体蛋白主要采用BSA，所用偶联方法为活泼酯法(活化酯法)。
一、辣椒素包被原的合成及鉴定
1、辣椒素包被原的制备
(1)将41mg实施例1制备得到的(I)所示化合物溶于500μL DMF中，加入15mg NHS和30mg EDC，室温下搅拌过夜，得到溶液I。
(2)将60mg BSA加入10mL PBS缓冲液中，充分溶解，即为溶液II。
(3)将溶液I缓慢滴加至溶液II中至溶液出现浑浊，共加入溶液I约50μL，缓慢4℃搅拌24h后装入透析袋，在生理盐水中4℃透析48h(中间换水3次)，得到辣椒素包被原溶液，-20℃保存。式(I)所示化合物合成的辣椒素包被原命名为CPC①-BSA。
(4)取41.6mg实施例1制备得到的(II)所示化合物，采用上述同样的方法制备式(II)所示化合物合成的辣椒素包被原，命名为CPC②-BSA。
2、辣椒素包被原的鉴定
用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)法分别测定CPC①-BSA溶液和CPC②-BSA溶液中BSA与半抗原的结合比。结果见图7、图8、图9。
结合比＝[M(偶联物)－M(蛋白质)]/M(半抗原)
式(I)半抗原的分子量为419.6，由质谱最高峰值分析BSA的分子量为64671.3，偶联物的分子量为67134.0，经计算得出BSA与半抗原的结合比为5.9，即CPC①-BSA中一个BSA分子上平均偶联5.9个半抗原。
式(II)半抗原的分子量为421.6，由质谱最高峰值分析偶联物的分子量为67346.2，经计算得出BSA与半抗原的结合比为6.3，即CPC②-BSA中一个BSA分子上平均偶联6.3个半抗原。
二、辣椒素免疫原的合成及鉴定
1、辣椒素免疫原的制备
用KLH代替BSA，其余同步骤一。
式(I)所示化合物合成辣椒素免疫原命名为CPC①-KLH。
式(II)所示化合物合成辣椒素免疫原命名为CPC②-KLH。
实施例3辣椒素抗血清的制备
将实施例2制备的CPC①-KLH，CPC②-KLH溶液分别免疫2组3-4月龄，体重1.5-2.0kg的雌性新西兰大白兔，每组2只。将各免疫原用生理盐水稀释至1mg/mL，与等量弗氏佐剂乳化。首免采用弗氏完全佐剂，颈背部皮内多点注射，免疫剂量为1mg/只。4周后进行加强免疫，每隔4周加免1次，共加免3次，佐剂改为弗氏不完全佐剂，免疫剂量不变，改为颈背部皮下多点注射。第4次免疫1周后，用心脏采血的方法大量采血。取血后，将血液37℃静置2h，然后4℃静置过夜，然后3000rpm离心20min，收集上清液，即为抗血清，-20℃分装保存。
实施例4辣椒素抗血清的测定
一、采用间接ELISA方法检测抗血清效价，具体操作步骤如下：
1、包被：将实施例2中制备的抗原用0.05M、pH9.6碳酸盐缓冲液从10μg/mL开始进行倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。
2、洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min。
3、封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。
4、加样：将抗血清从1:1000开始进行倍比稀释，并加入到各种稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃反应1h。
5、显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。
6、终止和测定:每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
7、结果判读：以OD450值≥阴性对照孔的2.1倍(即P/N≥2.1)所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。
二、最低检测限、半数抑制以及特异性的检测
具体操作步骤如下：
1、用上述的间接ELISA方法确定以CPC②-BSA作为包被原，以CPC①-KLH免疫兔子获得的血清作为抗体，以OD450值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。
2、包被：将包被原用包被缓冲液稀释5000倍，100μL/孔，37℃反应2h。
3、洗涤和封闭：方法操作同上述间接ELISA法。
4、配制辣椒素CPC标准溶液：将CPC标准品溶于DMF中配制成5mg/mL的母液，然后在加样前，再用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液倍比稀释成需要浓度(CPC的浓度分别为0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.1ng/mL、24.3ng/mL)。
5、加样：每孔加入50μL倍比稀释的CPC各浓度标准品，然后再加入50μL/孔最适稀释倍数的抗血清，37℃反应1h。充分洗涤后，加入1:5000稀释的HRP-羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃反应1h。
6、显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。
7、终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
8、数据处理：以CPC各浓度的对数为横坐标，以CPC各浓度对应的OD值为纵坐标，使用Origin 8.5软件，按照四参数对数拟合绘制标准曲线，如图10所示，通过计算IC50值(半数抑制浓度)判定抗血清对CPC是否具有高亲和力。
结果显示，四免后，兔子抗血清效价可达2000，检测限为0.05ng/mL，IC50值为0.89ng/mL，线性检测范围为0.14-5.66ng/mL。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.辣椒素半抗原，其特征在于，其结构如式(I)所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式(I)。
2.权利要求1所述辣椒素半抗原的制备方法，其特征在于，
第一步：将天然辣椒素和碳酸钾加入乙腈中，搅拌均匀，加入6-溴己酸乙酯，回流反应24 h，后处理浓缩除去大部分乙腈，倒入水中，乙酸乙酯，提取，水洗，干燥，过柱纯化；
第二步：将上步产物溶于四氢呋喃中，加入等量的乙醇，再滴加氢氧化钠水溶液，加热至50℃反应1 h，后处理浓缩除去大部分乙醇和四氢呋喃，冷却至室温，加盐酸调至酸性，产品析出，收集干燥。
3.辣椒素人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述辣椒素半抗原与载体蛋白偶联后得到；
其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。
4.根据权利要求3所述的辣椒素人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白。
5.权利要求3或4所述人工抗原的制备方法，其特征在于，采用活化酯法将载体蛋白偶联于权利要求1所述辣椒素半抗原的羧基碳上。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，式(I)化合物与载体蛋白的偶联摩尔比为4-61:1。
7.权利要求1所述辣椒素半抗原或权利要求3或4所述辣椒素人工抗原的以下任一应用：
①用于制备抗辣椒素特异性抗体；
②用于检测抗辣椒素特异性抗体。
8.由权利要求3或4所述辣椒素人工抗原制备的特异性抗体。
9.根据权利要求8所述的特异性抗体，其特征在于，其为多克隆抗体。
10.由权利要求8或9所述特异性抗体制备的辣椒素检测试剂或试剂盒。
11.权利要求8或9所述特异性抗体的以下任一应用：
（1）在检测辣椒素中的应用；
（2）在制备辣椒素的免疫层析试纸条中的应用；
（3）在制备辣椒素的胶体金检测试纸条中的应用。
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