CN112608310A - 一种利培酮和9-羟基利培酮半抗原、抗原和抗体以及其应用 - Google Patents

一种利培酮和9-羟基利培酮半抗原、抗原和抗体以及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及免疫学检测技术领域，具体公开了一种利培酮和9‑羟基利培酮的半抗原、抗原和抗体以及其应用。所述半抗原的结构如式I所示：
Figure DDA0002841649730000011
所述抗原是由所述半抗原和载体蛋白通过共价偶联法而形成的偶联物。所述抗体是响应于所述抗原而生成的。本申请建立了对利培酮和9‑羟基利培酮具有专一性强、灵敏度高的免疫学检测方法。

Description

一种利培酮和9-羟基利培酮半抗原、抗原和抗体以及其应用
技术领域
本申请涉及免疫学检测技术领域，更具体的说，它涉及一种利培酮和9-羟基利培酮半抗原、抗原和抗体以及其应用。
背景技术
精神分裂症是一种严重的、致残性的精神疾病。随着社会竞争不断加剧、生活节奏加快、家庭结构发生变化，人们所面临的压力越来越大，结果是精神卫生问题日益凸显。精神分裂症在精神疾病中是最多见的疾病。
利培酮是苯丙异噁唑衍生物，化学名称为3-[2-[4-(6-氟-1,2-苯并异噁唑-3-基)-1-哌啶基]乙基]-6,7,8,9-四氢-2-甲基-4H-吡啶并[1,2-α]嘧啶-4-酮，是新型的精神病药物。利培酮靶向5-羟色胺(5-HT2)受体和多巴胺(D2)受体，阻断其各自的神经递质吸收，从而有效改善精神病症状。
利培酮的主要代谢9-羟基利培酮与利培酮具有相似的药理作用，两者构成抗精神病的有效成分。但是，患者服用利培酮后还会代谢有无活性的代谢产物7-羟基利培酮和N-脱烷基利培酮，并且绝大多数患者在服用利培酮的同时，还会服用镇静剂、三环类抗抑郁剂、选择性五经色胺再摄取抑制剂等，上述因素均会给利培酮和9-羟基利培酮的检测造成影响。
目前，利培酮和9-羟基利培酮的血浓度测定多采用放射免疫法以及高效液相色谱法，但是放射免疫法具有成本高、易造成放射污染、仪器普及率低的缺点，而高效液相色谱法需要多次重复提取,具有操作繁琐、复杂、费时费力、通量低等的缺点，不利于临床推广。
如申请公布日为2015年07月01日、申请公布号为CN104755479A的专利文献公开了一种利培酮和帕潘立酮的半抗原，以及申请公布日为2015年06月24日、申请公布号为CN104736565A的专利文献公开了一种利培酮半抗原的抗体及其用途，上述两篇专利文献提出在9-羟基利培酮分子的9号羟基位和F原子位置进行衍生，制备的抗体同无活性代谢物7-羟基利培酮存在明显交叉反应，且由该抗体所制备的检测试剂可能会造成测定血液样品中利培酮和帕潘立酮的血药浓度的偏高。如申请公布日为2018年08月21日、申请公布号为CN108431040A的专利文献公开了一种利培酮抗体氨基酸序列，但是该抗体依然同无活性代谢物7-羟基利培酮存在严重的交叉反应，专一性较差。
因此，建立专一性强、灵敏度高的利培酮和9-羟基利培酮的免疫学检测方法，对制定利培酮个体化剂量方案,评价其临床疗效及安全性,有十分重要的意义。
发明内容
为了建立对利培酮和9-羟基利培酮具有专一性强、灵敏度高的免疫学检测方法，本申请提供一种利培酮和9-羟基利培酮的半抗原、抗原和抗体以及其应用。
第一方面，本申请提供的一种利培酮和9-羟基利培酮的半抗原采用如下的技术方案：一种利培酮和9-羟基利培酮的半抗原，其结构如式I所示：
Figure BDA0002841649710000021
第二方面，本申请提供的一种利培酮和9-羟基利培酮的半抗原的制备方法采用如下的技术方案：
一种利培酮和9-羟基利培酮的半抗原的制备方法，包括如下步骤：
(i)化合物1和N-溴代丁二酰亚胺经过自由基溴化反应得化合物2；
(ii)化合物2经过碱解反应得化合物3；
(iii)化合物3和苄胺经过还原胺化反应得化合物4；
(iv)化合物4和丁二酸酐经过缩合反应得式I化合物，式I化合物即为利培酮和9-羟基利培酮的半抗原；
具体反应路线如下：
Figure BDA0002841649710000031
其中，化合物1为利培酮，化学名称为3-[2-[4-(6-氟-1,2-苯并异噁唑-3-基)-1-哌啶基]乙基]-6,7,8,9-四氢-2-甲基-4H-吡啶并[1,2-α]嘧啶-4-酮；
化合物2的化学名称为3-[2-[4-(6-氟-1,2-苯并异恶唑-3-基)-1-哌啶基]乙基]-6,7,8,9-四氢-2-二溴甲基-4H-吡啶并[1,2-α]嘧啶-4-酮；
化合物3的化学名称为3-[2-[4-(6-氟-1,2-苯并异恶唑-3-基)-1-哌啶基]乙基]-6,7,8,9-四氢-2-甲醛-4H-吡啶并[1,2-α]嘧啶-4-酮；
化合物4的化学名称为3-[2-[4-(6-氟-1,2-苯并异恶唑-3-基)-1-哌啶基]乙基]-6,7,8,9-四氢-2-甲基-4H-吡啶并[1,2-α]嘧啶-4-酮。
其中，步骤(i)中化合物1和N-溴代丁二酰亚胺以任意比例反应均有化合物2的生成；以提高化合物2的反应收率，优选的，所需N-溴代丁二酰亚胺的物质的量和所需化合物1的物质的量的比值≥1，更优选的，所需N-溴代丁二酰亚胺的物质的量和所需化合物1的物质的量的比值≥2；为节省N-溴代丁二酰亚胺的使用量，所需N-溴代丁二酰亚胺的物质的量和所需化合物1的物质的量的比值＝(2-2.5):1。并且，相关技术凡是能够适用于化合物1和N-溴代丁二酰亚胺的自由基溴化反应的条件均可采用；优选的，步骤(i)中自由基溴化反应的条件是：溶剂为四氯化碳、催化剂为过氧苯甲酰、反应体系避光、反应温度为80℃。
步骤(ii)中，相关技术凡是能够适用于化合物2发生碱解反应的条件均可采用；优选的，步骤(i1)中碱解反应的条件是：溶剂为1,4-二氧六环、引发剂为氢氧化锂和水、反应温度为50℃、反应时间为3h。
步骤(iii)中，化合物3和苄胺以任意比例反应均有化合物4的生成；以提高化合物4的反应收率，优选的，所需苄胺的物质的量和所需化合物3的物质的量的比值≥0.5，更优选的，为节省N-溴代丁二酰亚胺的使用量，所需N-溴代丁二酰亚胺的物质的量和所需化合物3的物质的量的比值＝(0.5-1.5):1；更优选的，所需N-溴代丁二酰亚胺的物质的量和所需化合物3的物质的量的比值＝1。并且，相关技术凡是能够适用于化合物3和苄胺的还原胺化反应的条件均可采用；优选的，步骤(iii)中还原胺化反应的条件是：溶剂为甲醇、催化剂为Pd/C催化剂、氢气保护、反应温度为80℃、反应时间为12h。
步骤(iv)中，化合物4和丁二酸酐以任意比例反应均有式I化合物的生成；以提高式I化合物的反应收率，优选的，所需丁二酸酐的物质的量和所需化合物4的物质的量的比值≥0.5，更优选的，为节省丁二酸酐使用量，所需丁二酸酐的物质的量和所需化合物4的物质的量的比值＝(0.5-1.5):1；更优选的，所需丁二酸酐的物质的量和所需化合物4的物质的量的比值＝1。并且，相关技术凡是能够适用于化合物4和丁二酸酐的缩合反应的条件均可采用；优选的，步骤(iv)中缩合反应的条件是：溶剂为乙腈、催化剂为4-二甲氨基吡啶、室温反应、反应时间为12h。
第三方面，本申请提供的一种利培酮和9-羟基利培酮抗原采用如下的技术方案：
一种利培酮和9-羟基利培酮抗原，由上述所述的利培酮和9-羟基利培酮的半抗原和载体蛋白通过共价偶联法而形成的偶联物。
优选的，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白中的任意一种。
第四方面，本申请提供的一种利培酮和9-羟基利培酮抗原的制备方法采用如下的技术方案：
一种利培酮和9-羟基利培酮抗原的制备方法，包括如下步骤：
(i)将如权利要1所述的半抗原溶解于二甲基亚砜中得半抗原的二甲基亚砜溶液；
(ii)将偶联剂溶解于水中得偶联剂的水溶液；
(iii)将半抗原的二甲基亚砜溶液和偶联剂水溶液和混合，室温反应0.5-2小时得反应液，其中所述半抗原和偶联剂的重量比为1:(0.5-2)；
(iv)将载体蛋白溶解于PBS缓冲液中，得载体蛋白溶液；
(v)将载体蛋白溶液和反应液混合，室温搅拌1-3小时得反应混合液，其中，所述半抗原和载体蛋白的重量比为1:(0.5-2)；
(vi)将反应混合液对PBS缓冲液透析得所述抗原，其中，反应混合液和PBS缓冲液的体积比为1:(400-600)。
为获得纯净的抗原，优选的是所述透析的次数为多次；进一步，为避免PBS缓冲液的使用量，最优选的是所述透析的次数为四次。
优选的，所述偶联剂选自1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
第五方面，本申请提供的一种抗体采用如下的技术方案：
一种利培酮和9-羟基利培酮抗体，是响应于上述所述的利培酮和9-羟基利培酮抗原而生成的。
优选的，所述抗体为单克隆抗体。
优选的，所述抗体具体采用下述方法制备而得：
(i)选择用于抗体产生的宿主；
(ii)采用偶联物接种至宿主；
(iii)将来自接种宿主的细胞系与Sp2/0细胞融合，获得产生所述抗体的杂交瘤细胞；
(iv)所述杂交瘤细胞采用宿主腹水制备，并纯化获得所述抗体。
优选的，所述宿主选自小鼠、兔、山羊、绵羊中的任意一种。
值得指出的是本申请利培酮和9-羟基利培酮抗体意为可结合至利培酮和9-羟基利培酮的抗体。
第六方面，本申请提供的一种利培酮和9-羟基利培酮抗体的应用采用如下的技术方案：一种利培酮和9-羟基利培酮抗体在检测利培酮和/或9-羟基利培酮中的应用。
第七方面，本申请提供的一种检测试剂盒采用如下的技术方案：
一种检测试剂盒，包含上述所述的抗体。
第八方面，本申请提供的一种检测装置采用如下的技术方案：
一种检测装置，包含上述所述的抗体。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
第一、由于利培酮和9-羟基利培酮为小分子药物，没有免疫原性，需要制备利培酮和9-羟基利培酮半抗原，再利用利培酮和9-羟基利培酮半抗原制备抗体。这是由于利培酮和9-羟基利培酮半抗原，该利培酮衍生物的衍生位点远离7-号位点且靠近9-号位点，并且没有改变利培酮分子的其它结构，保留了利培酮特异性的官能团。因此，由利培酮和9-羟基利培酮半抗原作为免疫原和载体蛋白通过偶联形成利培酮和9-羟基利培酮抗原，再由利培酮和9-羟基利培酮抗原刺激产生利培酮和9-羟基利培酮抗体，该利培酮和9-羟基利培酮抗体对利培酮和9-羟基利培酮具有专一性强、灵敏度高的优点、且对无活性代谢物7-羟基利培酮和N-脱烷基利培酮无交叉反应。
该抗体能够特异性识别利培酮和9-羟基利培酮，且该抗体能够同时识别利培酮和9-羟基利培酮，推测是由于载体蛋白对9-羟基利培酮的9号位部分结构有一定的遮蔽作用，这对于利培酮活性物质的测定非常有利，只需要一种抗体即可实现。
该抗体同7-羟基利培酮和N-脱烷基利培酮无交叉反应，推测是由于利培酮和9-羟基利培酮半抗原的衍生位点远离7号位，能够更好地暴露7号位结构，使制备的抗体特异性高。
第二、采用本申请提供的利培酮和9-羟基利培酮半抗原、抗原和抗体制备的检测试剂盒和检测装置能够特异性测定利培酮和9-羟基利培酮的总浓度，且灵敏度高、操作简单、省时省力。
附图说明
图1是本申请提供的抗体所建立的磁微粒发光法测定利培酮和9-羟基利培酮的总浓度与HPLC-MS法相关性分析。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
实施例1
利培酮和9-羟基利培酮的半抗原的结构如式I所示，且式I化合物的具体合成路线如下：
Figure BDA0002841649710000061
化合物2的制备：将利培酮(4.1g，0.01mol)加入到250mL单口瓶中，加入150mL四氯化碳、过氧苯甲酰(0.24g，0.001mol)和NBS(3.9g，0.022mol)，体系避光回流6小时，TLC检测反应结束，体系降至室温。将反应液倒入200mL水中萃取，分出有机相，水相用二氯甲烷萃取三次，每次二氯甲烷的用量为50mL，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干得粗产品。粗产品经过柱层析纯化得到1.8g的化合物2(收率32％)。
化合物3的制备：将化合物2(1.8g，3.17mmol)、氢氧化锂(364mg，15.9mmol)和1，4-二氧六环50mL加入至100mL单口瓶中，加入3mL水，体系50℃反应3小时，TLC检测反应结束，旋干得粗产品。粗产品经过柱层析纯化得到0.86g的化合物3(收率64％)。
化合物4的制备：将化合物3(0.8g，1.89mmol)、苄胺(200mg，1.89mmol)、Pd/C催化剂(100mg)和甲醇30mL加入到100mL单口瓶中，体系用氢气置换三次，氢气保护下反应12小时，TLC检测反应结束，体系过滤，蒸干滤液得粗产品。粗产品经过柱层析纯化得到0.27g的化合物4(收率32％)。
利培酮和9-羟基利培酮的半抗原(式I化合物)的制备：将化合物4(230mg，0.54mmol)、丁二酸酐(54mg，0.54mmol)和DMAP(131mg，1.08mmol)加入到100mL单口瓶中，加入30mL乙腈，体系室温反应12小时，TLC检测反应结束，体系直接柱层析纯化得到0.12g的利培酮和9-羟基利培酮的半抗原(收率42％)。
利培酮和9-羟基利培酮的半抗原的表征：
1H-NMR(400MHZ,CDCl3):12.18(S,1H)；9.34(S,1H)；4.70(t,2H)；2.51-2.41(m,4H)；6.97(d,1H)；7.41(m,H)；2.78(m,1H)；7.12(t,1H)；2.26(m,2H)；1.74(m,4H)；1.90(m,2H)；1.77(m,2H)；3.41(t,2H)；3.87(m,2H)；2.06(m,2H)；2.60(m,2H)；2.49(m,2H)；
13C-NMR(400MHZ,CDCl3):166.5,147.1,117.8,164.2,162.0,155.2,146.6,46.8,48.6,96.9,123.5,27.5,115.0,111.0,31.4,30.1,22.7,18.5,173.8,171.9,59.4,44.6,22.4,30.2,29.2；
MS,m/Z 526(M+H)。
实施例2
利培酮和9-羟基利培酮抗原，具体制备方法如下：
(i)将10mg利培酮和9-羟基利培酮的半抗原溶解于1mL的二甲基亚砜中得半抗原的二甲基亚砜溶液；
(ii)将10mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶解于100uL的水中得1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的水溶液；
(iii)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的水溶液加入至半抗原的二甲基亚砜溶液中，室温反应1小时得反应液；
(iv)将10mg的牛血清白蛋白溶解于5mL的PBS缓冲液中得牛血清白蛋白溶液；
(v)将牛血清白蛋白溶液和反应液混合，室温搅拌2小时得反应混合液；
(vi)将反应混合液对PBS缓冲液透析，且反应混合液和PBS缓冲液的体积比为1:500，透析步骤重复四次，得利培酮和9-羟基利培酮抗原。
值得指出的是，利培酮和9-羟基利培酮抗原的保存条件为低温冷冻保存，具体的是-20℃冷冻保存。
实施例3
一种能够结合至利培酮和/或9-羟基利培酮的抗体，具体制备方法如下：
(i)选择用于抗体产生的宿主：其中，宿主可以采用小鼠、兔、山羊、绵羊等，本实施例采用小鼠作为宿主；
(ii)采用利培酮和9-羟基利培酮抗原接种至宿主：采用生理盐水将利培酮和9-羟基利培酮抗原稀释到1mg/mL，加入等体积的弗氏完全佐剂，乳化完全，小鼠按照0.1mg/只的剂量首次免疫；间隔四周后，将1mg的利培酮和9-羟基利培酮抗原和1mg的弗式不完全佐剂混合并在搅拌速度为2000rpm/min的条件下搅拌2小时完成乳化，经过首次免疫的小鼠按照0.1mg/只的剂量进行加强免疫；
(iii)将来自接种宿主的细胞系与Sp2/0细胞融合，采用利培酮和9-羟基利培酮抗原包被ELISA96孔板，对融合细胞采用对融合细胞采用间接ELISA法和间接竞争ELISA法分别进行效价及竞争测定，筛选得到3株细胞，分别为23H1，42B2，13F2。
该三株细胞分别采用小鼠腹水制备和Protein A/G亲和纯化获得抗体，并采用间接竞争ELISA法测定上述三种抗体分别与利培酮、9-羟基利培酮、7-羟基利培酮、N-dealkylrisperidone等四种小分子化合物的结合能力，结果见表1。
表1
23H1 42B2 13F2
利培酮 100％ 100％ 100％
9-羟基利培酮 99％ 78％ 95％
7-羟基利培酮 5％ 1％ 4％
N-脱烷基利培酮 ＜0.1％ ＜0.1％ ＜0.1％
由表1可知，23H1细胞产生的抗体对利培酮、9-羟基利培酮具有基本一致的亲和力，并且对无活性的7-羟基利培酮和N-dealkylrisperidone的交叉反应非常低。选择23H1细胞产生的抗体应用于在血液样品中检测利培酮和9-羟基利培酮的浓度。
实施例4
一种用于检测利培酮和/或9-羟基利培酮的检测试剂，包括磁微粒工作液、酶标工作液和指示剂溶液。
S1磁微粒工作液的获取：
S1-1：将50mg的Dynal beads M270 COOH磁微粒稀释于2mL的MES缓冲液(50mM，pH＝6.0)中得磁微粒溶液，并向磁微粒溶液中加入1mg的抗体得磁微粒-抗体混合液；
S1-2：向磁微粒-抗体混合液中加入2mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，室温震荡反应2小时；
S1-3：磁吸去除上清液，并加入TBST缓冲液使磁微粒的浓度达到0.5mg/mL，室温反应2h；
S1-4：磁吸去除上清液，加入TBST缓冲液得磁微粒工作液，且磁微粒在磁微粒工作液中的浓度为0.4mg/mL。
S2酶标工作液的获取：
S2-1：将1mg的碱性磷酸酶溶解于1mL的PBS缓冲液中得碱性磷酸酶溶液；
S2-2：将0.5mg的利培酮和9-羟基利培酮的半抗原溶解于0.1mL的二甲基亚砜中得半抗原溶液；
S2-3：将碱性磷酸酶溶液和半抗原溶液混合均匀，加入1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，室温混匀2h；
S2-4：采用PBS透析方法得酶标工作液，且标记物在酶标工作液中的浓度为1ug/mL。
S3指示剂溶液的获取：商品化的APS-5发光液。
上述用于检测利培酮和/或9-羟基利培酮的检测试剂可以现配现用，也可以将上述用于检测利培酮和/或9-羟基利培酮的检测试剂在2-8℃条件下保存随用随取；更一步，将上述用于检测利培酮和/或9-羟基利培酮的检测试剂制成检测试剂盒，且检测试剂盒需在2-8℃条件下保存。
实施例5
一种用于检测样品中利培酮和/或9-羟基利培酮的方法，具体步骤如下：
将血液样品、磁微粒工作液和酶标工作液以体积比为20:40:50的比例混合均匀，并37℃孵育反应5min，清洗，加入指示剂溶液显色并采用光电倍增管采集400-550nm的光信号。清洗的具体步骤包括磁吸去除上清液，加入TBST缓冲液重悬，再次磁吸去除上清液。
选取临床50例服用利培酮的患者血液样品，采用本申请提供的一种用于检测样品中利培酮和/或9-羟基利培酮的方法和HPLC-MS法分别测定上述血液样品中利培酮和9-羟基利培酮的总浓度，并对测定结果进行相关性分析，分析结果见图1。
由图1可知，基于本申请提供的抗体所建立的磁微粒发光法测定利培酮和9-羟基利培酮的总浓度与HPLC-MS法相关性良好，符合临床需求。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种利培酮和9-羟基利培酮半抗原，其特征在于，其结构如式I所示：
Figure FDA0002841649700000011
2.一种利培酮和9-羟基利培酮半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(i)化合物1和N-溴代丁二酰亚胺经过自由基溴化反应得化合物2；
(ii)化合物2经过碱解反应得化合物3；
(iii)化合物3和苄胺经过还原胺化反应得化合物4；
(iv)化合物4和丁二酸酐经过缩合反应得式I化合物，式I化合物即为利培酮和9-羟基利培酮的半抗原；
具体反应路线如下：
Figure FDA0002841649700000012
3.一种利培酮和9-羟基利培酮抗原，其特征在于，由如权利要求1所述的利培酮和9-羟基利培酮的半抗原和载体蛋白通过共价偶联法而形成的偶联物。
4.一种如权利要求3所述的抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(i)将如权利要1所述的半抗原溶解于二甲基亚砜中得半抗原的二甲基亚砜溶液；
(ii)将偶联剂溶解于水中得偶联剂的水溶液；
(iii)将半抗原的二甲基亚砜溶液和偶联剂水溶液和混合，室温反应0.5-2小时得反应液，其中所述半抗原和偶联剂的重量比为1:(0.5-2)；
(iv)将载体蛋白溶解于PBS缓冲液中，得载体蛋白溶液；
(v)将载体蛋白溶液和反应液混合，室温搅拌1-3小时得反应混合液，其中，所述半抗原和载体蛋白的重量比为1:(0.5-2)；
(vi)将反应混合液对PBS缓冲液透析得所述抗原，其中，反应混合液和PBS缓冲液的体积比为1:(400-600)。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述偶联剂选自1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
6.一种利培酮和9-羟基利培酮抗体，其特征在于，是响应于权利要求3所述的利培酮和9-羟基利培酮抗原而生成的。
7.根据权利要求6所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
8.一种如权利要求6-7中任意一项所述的抗体在检测利培酮和/或9-羟基利培酮中的应用。
9.一种检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求7-8中任意一项所述的抗体。
10.一种检测装置，其特征在于，包含权利要求7-8中任意一项所述的抗体。
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