CN110357886A - 甲氨蝶呤半抗原和完全抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甲氨蝶呤半抗原衍生物和相应的完全抗原及其在甲氨蝶呤抗体制备和免疫法检测中的应用。所述甲氨蝶呤半抗原的结构如式2所示，而所述完全抗原的结构如式3所示。本发明还公开了用该完全抗原制备的抗甲氨蝶呤单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞以及用于检测甲氨蝶呤的检测卡和检测试剂盒。本发明公开了检测甲氨蝶呤的ELISA法和荧光免疫层析法，其中荧光免疫层析发操作简单、检测时间短、成本低、特异性高、重复性好。

Description

甲氨蝶呤半抗原和完全抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及小分子药物的检测。具体地说，本发明涉及甲氨蝶呤半抗原、利用该半抗原获得的完全抗原、获得的甲氨蝶呤单克隆抗体及其在荧光免疫层析法检测甲氨蝶呤中的应用。

背景技术

化疗是临床上常用的肿瘤治疗手段，但是化疗药物的毒副作用较强，治疗窗口窄，因此化疗的基本考虑是在可承受的毒副作用范围内通过提高药效来改善治疗效果。基于此，提高化疗的精准性必须考量个体间广泛存在的药物代谢动力学(pharmacokinetcs,PK)的巨大差异。不同机体对特定药物的代谢能力不同，从而直接关系到药物疗效和毒副作用的强弱。若药物在体内代谢较慢，代谢产物不易排出体外，容易积聚而引起药物性肝炎或药物中毒；若药物在体内代谢过快，就会导致常规剂量疗效降低或者无效，延误病情，但是盲目地增加剂量又容易导致用药过量引起的药物中毒。而且，大量的研究表明相比于剂量和剂量强度，化疗药物的毒副作用和效果与系统暴露的相关性更大。不同的人的药物暴露和清除存在很大的差异。目前，普遍的化疗药物的剂量决定是基于患者的体表面积(BodySurface Area，BSA)。基于BSA给药的缺陷为体表面积和药物暴露之间缺乏相关性。事实上，基于BSA给药的不同患者间实际系统药物暴露程度存在10倍或者更高的差异。这意味着有些人的药物剂量大大过高了，而有些则又大大过低了。BSA给药剂量仅考虑了患者的身高和体重因素，缺乏对个体的差异调整。而影响药物在个体内吸收、清除等过程的因素众多，诸如遗传背景、疾病阶段、器官功能、年龄、种族、药物间相互作用等等。众多临床研究表明，基于BSA给药的大部分患者都没有接受到最佳的系统药物暴露。

推进肿瘤个体化用药理念，促进临床安全、有效、经济地用药，目前主要是通过临床血药浓度监测和药物基因组学为依据指导个体化用药。药物基因组学只是针对临床上部分由于遗传多态性导致的血药浓度与药效不一致的情况，且对于给药指导只是笼统的。然而，与药物基因组学相比，在大多数情况下临床血药浓度监测更加真实展现个体实时的药物代谢差异，通过测定药物在患者体内的浓度,以药动学原理计算药动学参数,设计个体化给药方案，指导个体化用药。

甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是一种广泛应用于临床的抗叶酸类抗肿瘤药物。MTX化学结构与叶酸相似，可与二氢叶酸还原酶(DHFR)形成不可逆结合，阻止二氢叶酸还原为四氢叶酸，从而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的合成原料耗竭，导致DNA的生物合成受到抑制，达到抑制细胞的增生和复制，起到细胞毒作用。达到阻碍肿瘤细胞的合成，而抑制肿瘤细胞的生长与繁殖。MTX主要作用于细胞S期，尤其对处于对数增殖期的细胞作用最强。因此，MTX对所有快速分裂的正常细胞如肠道上皮细胞和骨髓细胞等有严重毒性，主要表现为口腔炎、胃炎、腹泻，严重时有便血；白细胞减少，严重时血象下降、自发性出血和危及生命的感染危险。通常，在使用MTX后应用四氢叶酸钙(CF)进行解救从而减轻MTX不良反应，但仍然有不同程度的毒性反应，甚至有致死的危险。如何保证临床上既要大剂量治疗肿瘤而又不致产生严重的毒副反应就是监测MTX血药浓度。目前，只有MTX的血药浓度监测才能满足治疗的个体化，增加疗效，减少毒副作用，降低药动学差异，增加患者依从性。

甲氨蝶呤的检测方法，目前国外文献报道有液质联用检测法、高效液相色谱法(HPLC)。液质联用检测对仪器要求高，国内难以普及。国内有甲氨蝶呤HPLC法的报道，但采用外标法，且方法的回收率低。虽然此方法特异性强、灵敏度高、精确，但是样本前处理操作步骤繁琐，成本高，再加上设备昂贵、花费大、操作技能要求高等原因而不适合大批量样品的筛选检测。免疫分析法(如酶联免疫法、胶体金法以及荧光免疫层析法)，由于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便分析样本大等优点弥补了理化分析的不足，在小分子药物检测中起着越来越重要的作用。酶联免疫吸附测定法可同时检测多个样品，具有灵敏、特异性强等优点，但是不适用于现场及时检测。荧光免疫层析法操作简单、快速、无需大型检测仪器设备，更适用于现场及时检测，是快速检测发展的趋势。

影响免疫分析法检测质量的根本原因是抗体的特异性与亲和性，这些性质又取决于免疫半抗原的分子结构，所以免疫半抗原分子设计与选择是产生特异性抗体和建立小分子药物含量快速检测技术最关键的步骤。

因此，本领域急需甲氨蝶呤的半抗原，通过该半抗原可以获得甲氨蝶呤的完全抗原，进而获得甲氨蝶呤的特异性抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种甲氨蝶呤的半抗原以及通过该半抗原获得的甲氨蝶呤的完全抗原。

本发明的另一目的是提供甲氨蝶呤的特异性抗体以及包含该抗体的检测试剂盒和利用该抗体检测甲氨蝶呤的方法。

在第一方面，本发明提供一种半抗原，所述半抗原具有式2所示的结构：

式中，R包括但不限于以下基团：-CH₂-、或它们的组合；

n＝1-8的整数。

在优选的实施方式中，R为-CH₂-。

在优选的实施方式中，n＝3-6的整数；最优选3。

在第二方面，本发明提供一种完全抗原，所述完全抗原具有式3所示的结构：

其中，Protein为蛋白质载体；和

R和n如本发明第一方面所述。

在优选的实施方式中，所述蛋白质载体为选自下组中的任何一种蛋白质：牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。

在优选的实施方式中，所述蛋白质载体是牛血清白蛋白(BSA)、或卵清蛋白(OVA)。

在第三方面，本发明提供一种制备本发明第一方面所述半抗原的方法，所述方法包括步骤：

(a)将式4所示4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸(CAS：19741-14-1)和式5所示化合物反应得到第一方面所述的半抗原

其中，R和n如第一方面所述。

在具体的实施方式中，所述方法在步骤(a)之前还包括将甲氨蝶呤制成式4所示4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸的步骤。

在优选的实施方式中，步骤(b)的条件如下：反应温度为20～28℃，优选24～26℃，更优选25℃；反应时间为12～20小时，优选15～18小时，更优选15小时；反应溶剂为THF、DMF、二氯甲烷、四氢呋喃，优选DMF、四氢呋喃，更优选二甲基亚砜。

在第四方面，本发明提供一种制备本发明第二方面所述完全抗原的方法，所述方法包括步骤：

将本发明第一方面所述的半抗原与蛋白质载体连接，以制得本发明第二方面所述的完全抗原。

在优选的实施方式中，将得到的半抗原与蛋白质载体连接的条件如下：反应温度为20-28℃，优选23-25℃，更优选24℃；反应pH为7.0-8.0，优选7.2-7.6，更优选7.5；反应时间为1-6小时，优选3-4小时，更优选3.5小时。

在优选的实施方式中，所述蛋白质载体为选自下组中的任何一种蛋白质：牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。

在优选的实施方式中，所述蛋白质载体是牛血清白蛋白(BSA)、或卵清蛋白(OVA)。

在第五方面，本发明提供一种本发明第一方面所述半抗原或第二方面所述完全抗原的用途，用于制备甲氨蝶呤的特异性单克隆抗体。

在第六方面，本发明提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合于甲氨蝶呤。

在具体的实施方式中，所述单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系产生，所述杂交瘤细胞系由中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏号为CCTCC NO:C201821；分类命名为：杂交瘤细胞株MT6A10C09。

在优选的实施方式中，所述的单克隆抗体检测甲氨蝶呤的灵敏度为0.19μg/ml。

在另一优选的实施方式中，所述的单克隆抗体不结合其它相关小分子药物。

在另一优选的实施方式中，所述的其它相关小分子药物是茶丁美酮、吲哚美辛、米非司酮、金诺芬、来氟米特、沙利度胺、亚叶酸钙、尼美舒利、柳氮磺吡啶、甲酰四氢叶酸钙、硫酸氢氯喹。

在第七方面，本发明提供一种产生本发明第六方面所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系是由中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏号为CCTCC NO:C201821的小鼠杂交瘤细胞系；分类命名为：杂交瘤细胞株MT6A10C09。

在第八方面，本发明提供本发明第六方面所述的单克隆抗体的用途，用于制备检测样品中甲氨蝶呤的试剂、检测卡或试剂盒。

在优选的实施方式中，所述样品是生物样品，优选血液样品。

在第九方面，本发明提供一种检测生物样品中是否存在甲氨蝶呤的方法，所述方法包括步骤：

(a)将所述生物样品与本发明第六方面所述的单克隆抗体接触；

(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在甲氨蝶呤。

在优选的实施方式中，所述单克隆抗体带有可检测标记物；优选地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

在优选的实施方式中，所述检测方法为荧光检测法。

在优选的实施方式中，所述检测方法是体外非诊断性的。

在第十方面，本发明提供一种检测甲氨蝶呤的荧光免疫层析检测卡，所述检测卡包括基片；吸液部件；检测部件；加样部件，其特征在于，检测部件固定在基片上，在检测部件中部设置质控带和检测带，在检测部件的两端以部分重叠的方式固定吸液部件和加样部件，其中，检测带上包被有本发明第二方面所述的完全抗原，质控带上包被有兔抗体IgG。

在优选的实施方式中，所述甲氨蝶呤荧光免疫层析检测卡还包括卡盒，所述卡盒由下盖和上盖组成，上盖设有加样窗口和检测窗口，所述甲氨蝶呤荧光免疫层析检测卡完全设置于下盖中，所述检测窗口和加样窗口分别对应与所述甲氨蝶呤荧光免疫层析检测卡上的加样部件和质控带及检测带。

在优选的实施方式中，所述上盖上还设有产品编号区；条形码识别区。

在优选的实施方式中，所述基片是深色硬质基片；优选黑色PVC基片。

在优选的实施方式中，所述检测部件是硝酸纤维素膜。

在优选的实施方式中，所述加样部件是玻璃纤维。

在优选的实施方式中，所述吸液部件是吸水纸。

在第十一方面，本发明提供一种检测甲氨蝶呤的检测试剂盒，所述试剂盒装有：

(a)本发明第十方面所述的甲氨蝶呤荧光免疫层析检测卡；和

(b)与本发明第十方面所述的甲氨蝶呤荧光免疫层析检测卡配套的甲氨蝶呤检测分析液；和

(c)利用所述甲氨蝶呤检测试剂盒检测甲氨蝶呤的使用说明书；

其中，所述检测分析液为包含有荧光标记的本发明第六方面所述的单克隆抗体和抗兔IgG抗体的检测分析液。

在优选的实施方式中，所述检测分析液中的标记用荧光染料包括但不限于，FITC(Fluorescein)、Alexa Fluor 647、CFTM647、TRITC(Rhodamine)和CAL Fluor(R)Red 610等。

在优选的实施方式中，所述检测分析液的溶剂部分是含有BSA的磷酸缓冲液。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了甲氨蝶呤衍生物的¹H-NMR鉴定结果；

图2显示了甲氨蝶呤免疫原和包被原的紫外扫描图谱；

图3显示了甲氨蝶呤荧光免疫层析检测卡的结构的示意图；其中：

图3A显示了未装塑料卡的试纸卡结构；1：黑色PVC基片；2：吸水纸：3：硝酸纤维素膜；4：玻璃纤维；5：质控线带(C线)；6：检测线带(T线)；

图3B显示了带有塑料卡盒的甲氨蝶呤检测卡结构；1’：下盖；2’：上盖；3’：加样窗口；4’：玻璃纤维；5’：检测窗口；6’：质控线带(C线)；7’：检测线带(T线)；8’：硝酸纤维素膜；9’：甲氨蝶呤项目标志(LIN)；10’：条形码识别区域；

图4显示了甲氨蝶呤荧光免疫层析检测的标准曲线图谱；

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，合成了作为半抗原的甲氨蝶呤衍生物，并将其与适当的蛋白质载体连接产生了完全抗原，以此为免疫原免疫Balb/C小鼠，将其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP20细胞融合，获得特异性分泌抗甲氨蝶呤单克隆抗体的杂交瘤细胞株，进而制备并纯化得到了甲氨蝶呤单克隆抗体，随后利用所述完全抗原和甲氨蝶呤抗体制备了具有高灵敏度和特异性的甲氨蝶呤免疫检测卡。在此基础上，完成了本发明。

半抗原

某些小分子物质，例如甲氨蝶呤的分子量不大，单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。

因此，为了制备甲氨蝶呤的完全抗原，本发明人对甲氨蝶呤进行了衍生化，从而制得了本发明的半抗原。本文所用的术语，“半抗原”、“甲氨蝶呤半抗原”或“甲氨蝶呤衍生物”均是指经衍生得到的具有以下结构式2的甲氨蝶呤衍生物：

式中，R包括但不限于以下基团：-CH₂-、或它们的组合；

n＝2-8的整数。

在优选的实施方式中，R为-CH₂-。在优选的实施方式中，n＝3-6的整数；最优选n＝3。

本发明的甲氨蝶呤半抗原可采用如下所示的方法制备：

(a)将式4所示4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸(CAS：19741-14-1)和式5所示化合物反应得到本发明的半抗原

其中，R和n如上所述。

在优选的实施方式中，步骤(b)的条件如下：反应温度为20～28℃，优选24～26℃，更优选25℃；反应时间为12～20小时，优选15～18小时，更优选15小时；反应溶剂为THF、DMF、二氯甲烷、四氢呋喃，优选DMF、四氢呋喃，更优选二甲基亚砜。

在具体的实施方式中，甲氨蝶呤半抗原的制备如以下反应式所示：

完全抗原

具有免疫原性与免疫反应性的物质，称为完全抗原(complete antigen)，如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素、动物血清等。完全抗原既能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，还能与其在体内、体外发生特异性结合反应。

通常，半抗原需要和大分子如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或血蓝蛋白(KLH)或以共价键方式偶联，成为既具有免疫反应性，又具有免疫原性的完全抗原。

本文所用的术语，“完全抗原”是指本发明的甲氨蝶呤半抗原与适当的蛋白质载体结合后的产物。本文所用的术语，“蛋白质载体”是指任何在免疫学上可接受的用于形成完全抗原的蛋白质，包括但不限于：牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等，优选牛血清白蛋白(BSA)、或卵清蛋白(OVA)。

本发明的甲氨蝶呤完全抗原的结构如式3所示：

其中，Protein为蛋白质载体，本发明中优选为牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)；与蛋白质载体共价交联的部分为式2所示的甲氨蝶呤衍生物；R和n如上文所述。

在如上所述制备得到甲氨蝶呤半抗原的基础上，可以进一步将得到的半抗原与蛋白质载体连接，从而制备得到本发明的完全抗原。

在优选的实施方式中，将得到的半抗原与蛋白质载体连接的条件如下：反应温度为20-28℃，优选23-25℃，更优选24℃；反应pH为7.0-8.0，优选7.2-7.6，更优选7.5；反应时间为1-6小时，优选3-4小时，更优选3.5小时。

单克隆抗体的制备

本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即，除了可能存在少量可能的自发突变，组成该群体的抗体个体都相同。因此，修饰语“单克隆的”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明完全抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。

代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞系，例如鼠类的骨髓瘤细胞系，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞系(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。

对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(MonoclonalAntibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。

本发明的单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系产生，所述杂交瘤细胞系已于2016年02月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)，保藏号为CCTCCNO:C201821；分类命名为：杂交瘤细胞株MT6A10C09。

在具体的实施方式中，本发明的单克隆抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

在具体的实施方式中，本发明的单克隆抗体检测甲氨蝶呤的灵敏度为0.19μg/ml。本发明的单克隆抗体与甲氨蝶呤完全抗原的载体蛋白，例如BSA或OVA没有交叉反应。进一步地，本发明的单克隆抗体也不结合其它抗生素，包括但不限于茶丁美酮、吲哚美辛、米非司酮、金诺芬、来氟米特、沙利度胺、亚叶酸钙、尼美舒利、柳氮磺吡啶、甲酰四氢叶酸钙、硫酸氢氯喹。

检测试剂盒

本发明的检测试剂盒是指含有本发明的单克隆抗体并可用于甲氨蝶呤检测的试剂盒。所述的试剂盒可根据需要包括容器、使用说明书、缓冲剂、免疫助剂等。

本发明的检测试剂盒可采用多种形式，例如检测卡、含有各种测试所需试剂的测试盒等。实施例中采用检测卡为例对本发明的试剂盒进行说明，但不应理解为本发明的试剂盒仅限于检测卡。

在具体的实施方式中，本发明的检测甲氨蝶呤的荧光免疫层析检测卡包括基片；吸液部件；检测部件；和加样部件；其中，检测部件固定在基片上，在检测部件中部设置质控带和检测带，在检测部件的两端以部分重叠的方式固定吸液部件和加样部件，其中，检测带上包被有本发明的完全抗原，质控带上包被有兔抗体IgG。

在优选的实施方式中，本发明的甲氨蝶呤荧光免疫层析检测卡还包括卡盒，所述卡盒由下盖和上盖组成，上盖设有加样窗口和检测窗口，所述甲氨蝶呤荧光免疫层析检测卡完全设置于下盖中，所述检测窗口和加样窗口分别对应与所述甲氨蝶呤荧光免疫层析检测卡上的加样部件和质控带及检测带。在上盖上还可设有产品编号区；条形码识别区。所述基片可以是深色硬质基片；优选黑色PVC基片。所述检测部件可以是硝酸纤维素膜。所述加样部件可以是玻璃纤维。所述吸液部件可以是吸水纸。

本文所述的“部分重叠的方式固定”表示相邻的两个部件形成一定的重叠区域，而非一个部件完全包含在另一部件中的完全重叠，并且该两部件通过该重叠区域而固定。固定的方式可由本领域技术人员自主选择，例如通过粘合等方式。

在上述检测卡的基础上，本发明还提供一种检测甲氨蝶呤的检测试剂盒，其装有：

(a)上述甲氨蝶呤荧光免疫层析检测卡；

(b)与所述甲氨蝶呤荧光免疫层析检测卡配套的甲氨蝶呤检测分析液；和

(c)利用所述甲氨蝶呤检测试剂盒检测甲氨蝶呤的使用说明书；

其中，所述检测分析液为包含有荧光标记的本发明的单克隆抗体和抗兔IgG抗体的检测分析液。

本领域技术人员可根据需要自主选择荧光标记，包括但不限于FITC(Fluorescein)、Alexa Fluor 647、CFTM647、TRITC(Rhodamine)和CAL Fluor(R)Red 610等。

在优选的实施方式中，所述检测分析液的溶剂部分是含有BSA的磷酸缓冲液。

甲氨蝶呤半抗原以及人工抗原的免疫检测应用

本发明的甲氨蝶呤半抗原和人工抗原应用于抗体制备，所述抗体应为单克隆抗体或者多克隆抗体；本发明的甲氨蝶呤半抗原和人工抗原应用以及利用甲氨蝶呤人工抗原制备的相应抗体应用于各种检测甲氨蝶呤含量的免疫学检测领域，包括但不限于ELISA、化学发光法、胶体金法和荧光免疫层析法等免疫学检测领域。

上述所述的“甲氨蝶呤半抗原和人工抗原应用于抗体制备”是指利用本发明的甲氨蝶呤半抗原衍生物制人工抗原，利用人工抗原去免疫实验动物，制备抗甲氨蝶呤多克隆抗体和单克隆抗体；所述实验动物不应该理解为具体实施方式中单纯的小鼠，应该包括但不限于：小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊、马、驴、鸡、狗等实验动物。

上述所述的“甲氨蝶呤半抗原和人工抗原应用于测定甲氨蝶呤免疫检测领域”是指利用由甲氨蝶呤半抗原制备人的工抗原，及由甲氨蝶呤人工抗原制备得到的相应抗体作免疫检测原料建立各种检测甲氨蝶呤含量的免疫检测方法。所述免疫检测领域包括但不限于ELISA、化学发光法、胶体金法和荧光免疫层析法等免疫学检测方法；所述检测甲氨蝶呤免疫检测方法不仅仅指定量检测，还包括半定量以及各中基于免疫学检测的定性检测方法。

在具体实施方式中，本发明以免疫小鼠制备特异性单克隆抗体为例，以及以ELISA和荧光免疫层析法为具体实例阐述了甲氨蝶呤半抗原以及人工抗原在甲氨蝶呤免疫学检测中的应用。

本发明的优点：

1.本发明首次公开了一种甲氨蝶呤半抗原衍生物通式结构，以及该半抗原衍生物衍生化方法，即：以现有的4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸为原料，在其羧基端添加多碳链羧基完成衍生化，最大限度的保留了甲氨蝶呤的核心结构，用于制备特异性的甲氨蝶呤抗体；

2.本发明首次公开了一种甲氨蝶呤完全(人工)抗原的结构以及其制备方法；

3.本发明首次公开了甲氨蝶呤半抗原以及人工抗原在甲氨蝶呤抗体制备和免疫学检测领域的应用，为推进临床上甲氨蝶呤血药浓度检测提供了可靠地方法；

4.本发明的单克隆抗体可高灵敏度地检测甲氨蝶呤，且不与其它相关小分子药物发生结合；和

5.本发明的甲氨蝶呤检测试剂盒可简单、快捷地现场检测甲氨蝶呤。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例.

实施例1.甲氨蝶呤半抗原的制备

以化合物4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸(CAS：19741-14-1)(化合物1)为原料，通过一步反应制备，其制备路径如下所示：

称50mg4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸，19mg 4-氨基丁酸，96mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷,40mg N,N-二异丙基乙胺，溶于1.5ml二甲基亚砜，室温搅拌1h。向反应后液体中加入7ml冰水，将沉淀物过滤，水洗，晾干。油状液体经柱层析法纯化后，波层色谱法(展开剂为：二氯甲烷:甲醇:醋酸＝5:1:0.05；254nm紫外检测)看到一个黄色斑点。向黄色油状物中加入2mol/L氢氧化钠调pH到4，将析出的固体过滤，冰水洗涤，冻干。最终得到黄色固体甲氨喋呤衍生物31mg，产率49％。经过¹H-NMR鉴定，其结果如图1所示。

实施例2.甲氨蝶呤完全抗原(免疫原和包被原)的制备

将实施例1所得的甲氨蝶呤衍生物(半抗原)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)通过碳化亚胺法偶联。具体偶联方法如下：

称取20mg甲氨蝶呤衍生化合物，溶解于1ml DMF中，形成20mg/ml的终浓度，取其中107.8μL与9.1μL EDC(100mg/ml)混合，再加入11μL NHS(50mg/ml)，均匀混合后在搅拌条件下反应15～60mins。

将上述反应混合液离心(1600rmp)后加入到1ml的6mg/ml BSA溶液中(或加入1ml的4.5mg/ml OVA溶液中)在室温搅拌条件下反应1～5h后，用磷酸缓冲液透析4次，12h换一次液。收集透析液，用美国伯乐(BIO-RAD)公司的Quick Start Bradford Protein AssayKit测定免疫原和包被原的浓度分别为4.8mg/ml和3.7mg/ml。得到的甲氨蝶呤人工抗原(免疫原和包被原)结构式如下所示，其中“Protein”为BSA(牛血清蛋白)或OVA(卵清蛋白)

甲氨蝶呤人工抗原(免疫原和包被原)用紫外扫描波峰结果比较如图2所示，偶联物的波峰与BSA以及OVA波峰有区别说明偶联成功。

实施例3.利用甲氨蝶呤完全抗原制备单克隆抗体

1.免疫动物

将实施例2得到的甲氨蝶呤免疫原稀释成0.2mg/ml，取500ul免疫原与等体积的弗氏完全佐剂混合后，乳化完全，免疫BALB/c小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，在小鼠背部皮下及足部进行注射免疫。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后用不完全弗氏佐剂。第四次免疫后一周眼眶取血，分离血清，测抗甲氨蝶呤抗体的效价。经ELISA检测，小鼠四次免疫后的抗体效价为1:128,000。

2.细胞融合和筛选

四次免疫后的小鼠经腹腔注射约100μg免疫原再次加强免疫，3天后，取该小鼠脾脏用于融合。取SP2/0细胞(南京军事医学科学院)与脾细胞混合，加入无血清培养液(Hyclone SH30022.01DMEM(High Glucose))，离心(1500rpm，3min)，取沉淀细胞，逐滴加入1ml 50％聚乙二醇4000，静置90秒。然后逐滴加入37℃预温的无血清培养液10ml，静置5min。融合后细胞悬液离心(1000rpm，3min)，用完全培养液，接种于加有饲养层细胞的96孔板内，每孔2×10⁴/ml骨髓瘤细胞。置37℃，5％CO₂培养箱内培养两天，加入2×HAT的完全培养液，使孔内终浓度为1×HAT。待杂交瘤细胞集落长至孔底1/10-1/5面积的时候，即用ELISA方法筛选融合细胞抗体阳性孔。

3.腹水制备和抗体纯化

取BALB/c小鼠，于腹腔注射0.5ml石蜡油，7天后，腹腔注射0.5ml 1×10⁶阳性杂交瘤细胞。观察小鼠生长情况，7天左右可见腹部隆起，及时采集腹水。利用亲和层析技术(Protein G Resin亲和纯化)纯化得到高纯度的单克隆抗体，蛋白量为4mg。

实施例4.利用甲氨蝶呤完全抗原进行免疫检测

1.荧光免疫层析检测

1)检测分析液制备

a.分别荧光标记实施例3得到的单克隆抗体以及抗兔IgG抗体(杭州启泰生物技术有限公司)；

b.用含有BSA的磷酸缓冲液将荧光标记后的抗体稀释配制成检测分析液。

2)甲氨蝶呤荧光免疫层析试纸卡的制备

a.用包被缓冲液(磷酸缓冲液)分别将制备得到的甲氨蝶呤包被原(MTX-OVA)和兔抗体IgG稀释到适当浓度(0.5-2.5mg/ml)。在25±5℃的温度下，将稀释后的MTX-OVA和兔抗体IgG均匀喷于硝酸纤维膜上(分别形成检测线和质控线)，在12％-30％的湿度条件下烘干4～7小时左右，干燥保存备用；

b.在黑色PVC基片上分别依次粘贴步骤a所得到的包被硝酸纤维素膜、玻璃纤维纸和吸水纸形成检测卡(如图3A所示)，视需要切割成适当宽度。

c.将步骤b所得到的检测卡装入卡盒的下盖中，盖上上盖，形成完整的带卡盒检测卡(如图3B所示)。

3)检测

取100μl稀释后的样本与60μl的检测分析液均匀混合，取130μL加入检测卡的加样窗口，反应5～10min后，在FCR荧光免疫分析仪(湖州申科生物科技有限公司)检测，根据样本的T线信号值与C线信号比值(T/C值)与内置的标准曲线比对显示检测结果。

4)甲氨蝶呤荧光免疫层析检测试纸卡检测原理

采用竞争法检测，样品中的甲氨蝶呤抗原和检测线(T线)上的甲氨蝶呤抗原(包被原)竞争结合检测分析液中的荧光标记的抗甲氨蝶呤抗体。当样本中抗原浓度很低时，检测线上结合的荧光抗体增多，进而检测线上的荧光信号就强，因此，检测线(T线)荧光信号与质控线(C线)上荧光信号的比值(T/C值)就大；反之，样本中甲氨蝶呤抗原浓度较高时，T/C值就很小。所以，样本中甲氨蝶呤含量越高，T/C值越低。根据T/C值与内置标准曲线比较并显示检测结果。

5)荧光免疫层析法检测甲氨蝶呤的灵敏度以及标准曲线

将空白血清中添加甲氨蝶呤标准品，配置成0μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml、1.6μg/ml、3.2μg/ml、6.4μg/ml、12.8μg/ml系列浓度样品。将上述系列浓度样品按照上述检测的步骤进行检测，每个样品重复3次，检测的实验结果如表1所示，根据表1数据以浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线(Logit-log直线回归)如图4所示。图4中曲线对应的方程如表2所示，计算得IC₅₀＝1.05μg/ml。

表1.荧光免疫层析法检测不同浓度甲氨蝶呤标品

表2.抑制曲线所对应的方程(Logit-log直线回归)

将0μg/ml样品重复检测10次，分别计算其T/C值的平均值(X)、标准偏差(SD)以及精密度(CV值)。灵敏度的计算方式为，X-2*SD的T/C值在图4的标准曲线里所对应的甲氨蝶呤浓度值。

表3.荧光免疫层析法重复检测0μg/ml甲氨蝶呤样本结果

将表3数据中的X-2*SD的T/C值作为y值代入图4标准曲线对应的方程中的到的浓度值为0.19μg/ml，即灵敏度为0.19μg/ml。

6)甲氨蝶呤荧光免疫层析检测体系的交叉反应

将11种常见的临床用相关药物分别用空白混合血清配置成不同梯度浓度样本，进行荧光免疫层析检测，计算其IC₅₀与甲氨蝶呤的IC₅₀值比较计算交叉反应率。计算公式：交叉反应率＝(IC_{50甲氨蝶呤}/IC_{50临床用相关药物})％，交叉反应率结果如表6所示：

表6.荧光免疫层析检测临床用相关药物的交叉反应结果

对比例1

本发明人还将其它一些甲氨蝶呤结构类似物，例如以下所示的二水合甲氨蝶呤制成半抗原以及相应的全抗原。但在利用这些全抗原制备单克隆抗体时，要么获得的单克隆抗体的检测灵敏度均不理想，要么获得的单克隆抗体的效价不好，总之，未能取得理想的技术效果(数据未展示)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种半抗原，所述半抗原具有式2所示的结构：

式中，R包括但不限于以下基团：-CH₂-、-O-、或它们的组合；

n＝2-8的整数。

2.一种完全抗原，所述完全抗原具有式3所示的结构：

其中，Protein为蛋白质载体；和

R和n如权利要求1所述。

3.一种制备权利要求1所述半抗原的方法，所述方法包括步骤：

(a)将式4所示4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸(CAS:19741-14-1)和式5所示化合物反应得到权利要求1所述半抗原；

其中，R和n如权利要求1所述。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(a)之前还包括将甲氨蝶呤制成式4所示4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸的步骤。

5.一种制备权利要求2所述完全抗原的方法，所述方法包括步骤：

将权利要求1所述半抗原与蛋白质载体连接，以制得权利要求2所述的完全抗原。

6.权利要求1所述半抗原或权利要求2所述完全抗原的用途，用于制备甲氨蝶呤的特异性单克隆抗体。

7.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合于甲氨蝶呤。

8.如权利要求7所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系产生，所述杂交瘤细胞系由中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏号为CCTCC NO:C201821。

9.一种产生权利要求7或8所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系是由中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏号为CCTCC NO:C201821的小鼠杂交瘤细胞系。

10.权利要求7或8所述的单克隆抗体的用途，其用于制备检测样品中甲氨蝶呤的试剂、检测卡或试剂盒。

11.一种检测生物样品中是否存在甲氨蝶呤的方法，所述方法包括步骤：

(a)将所述生物样品与权利要求7或8所述的单克隆抗体接触；

(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在甲氨蝶呤。

12.一种检测甲氨蝶呤的荧光免疫层析检测卡，所述检测卡包括基片；吸液部件；检测部件；加样部件，其特征在于，检测部件固定在基片上，在检测部件中部设置质控带和检测带，在检测部件的两端以部分重叠的方式固定吸液部件和加样部件，其中，检测带上包被有权利要求2所述的完全抗原，质控带上包被有兔抗体IgG。

13.一种检测甲氨蝶呤的检测试剂盒，所述试剂盒装有：

(a)权利要求12所述的甲氨蝶呤荧光免疫层析检测卡；和

(b)与权利要求12所述的甲氨蝶呤荧光免疫层析检测卡配套的甲氨蝶呤检测分析液；和

(c)利用所述甲氨蝶呤检测试剂盒检测甲氨蝶呤的使用说明书；

其中，所述检测分析液为包含有荧光标记的权利要求7或8所述的单克隆抗体和抗兔IgG抗体的检测分析液。