CN117801057A - 一种同位素探针的合成及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学蛋白质组学领域，尤其涉及无需点击化学的可用于多种氨基酸残基反应的一体化同位素探针的合成及其应用。本发明目标在于改进现有定量蛋白质组学流程中需要进行点击化学、通过烟草蚀纹病毒蛋白酶将肽段从磁珠上释放而导致的操作繁杂的不足，设计并合成出能够准确进行蛋白质组定量且简化操作流程的同位素探针。该探针获取方便，且简化了实验流程，并可准确定量多种蛋白靶标，当其以竞争的方式使用时可以达到药物靶标发现的目的。
Description
技术领域
本发明涉及化学蛋白质组学领域，尤其涉及无需点击化学的可用于多种氨基酸残基反应的一体化同位素探针的合成及其应用。
背景技术
绝大多数生物活性分子是通过与蛋白靶标结合而发挥作用，因此研究他们的蛋白靶标对于阐明其作用机制以及了解其毒副作用具有重要意义。在新药的研究与开发中，药物靶标的明确也至关重要。例如，许多天然产物在实际应用中被证明具有良好的药效和较低的毒性，但由于其作用靶标及作用机制尚未明确而不能作为药物进入市场；而已上市的药物对其靶标进行阐明，也有利于指导对新发现的靶标进行候选分子的结构设计和优化。随着新药研发领域对于明确药物作用机制的要求逐步提高，小分子药物的靶标发现是亟待革新的技术瓶颈。
经典的靶标发现手段如亲和纯化色谱，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法，该方法步骤繁琐，依赖于对目标化合物的修饰和固定，这可能会干扰其与靶蛋白的相互作用，难以获得真实生理环境下与小分子配体产生相互作用的靶标蛋白。随着后基因组时代的到来，化学蛋白质组学成为化学生物学研究的热点方向之一。目前最常用的用于靶标发现的化学蛋白质组学策略是基于活性的蛋白质分析(Activity-based proteinprofiling，简称ABPP)，传统的ABPP技术需要在目标药物分子上不影响活性的区域进行修饰通过连接基团引入可发生点击化学的报告基团，如叠氮，炔基等基团；这些探针可以选择性地与蛋白质组中某一类蛋白的活性中心结合，继而通过富集发现药物靶标。但该方法需要针对目标药物分子进行逐个基于活性及构效关系的设计，且合成实验过程繁杂、周期长、通量低，难以作为普适性的小分子靶标发现技术进行推广。随着研究领域的不断发展和定量组学方法的不断开发，基于定量的化学蛋白质组学已经越来越多的应用于未知蛋白功能的解析，活性小分子靶标蛋白的鉴定，翻译后修饰位点的发现以及小分子抑制剂的筛选等众多方向。科学家们开发了基于同位素标记的定量化学蛋白质组学技术，包括基于一级谱定量的isoTOP(基于同位素的串联正交蛋白水解)-ABPP技术和rdTOP(基于还原二甲基化的串联正交蛋白解)-ABPP技术。这种同位素标记的定量蛋白质组学技术可在小分子药物未经任何修饰的情况下完成其靶标蛋白的发现。然而这些技术依然存在着操作流程繁琐，周期长等问题。
发明内容
本发明提供了一种无需点击化学的可与多种氨基酸残基反应的一体化同位素探针的合成方法及其生物应用，该探针获取方便，且简化了实验流程，并可准确定量多种蛋白靶标，当其以竞争的方式使用时可以达到药物靶标发现的目的。
为此，本发明第一方面提供通式A所示的化合物
其中：
X为N或其同位素15N，Y为C或其同位素13C；
R为可标记蛋白中活性氨基酸残基的化学标记试剂；
n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数。
根据本发明第一方面任一项化合物，其为选自下列的化合物：
其中，星号标记表示同位素15N和13C的位置。
本发明第二方面提供了制备本发明第一方面任一项所述化合物的方法，其包括以下步骤：
甘氨酸通过与化合物A1反应接上保护基得到化合物A2，化合物A2通过亲核取代反应接上叔丁基来保护羧基得到化合物A3，进而脱去氨基保护基得到化合物A4。化合物A2通过缩合反应得到化合物A5，进而与化合物A4缩合得到化合物A7。化合物A8通过脱硫得到化合物A9，化合物A9通过缩合得到化合物A10，进而与化合物A7发生缩合得到化合物A11，化合物A11脱除羧基保护基得到化合物A12，再与R基团缩合得到通式A化合物。
本发明第三方面提供了一组组合物，包含第一方面任意一项所述的化合物或其可接受的盐或可接受的载体，赋形剂，稀释剂，辅剂，媒介物或它们的组合。
本发明第三方面提供了第一方面任一项的化合物或其可接受的盐或第四方面所述组合物在制备在定量蛋白质组学中的应用。
本发明第四方面提供了根据第三方面的应用，这些应用包括但不限于：
(1)共价标记：利用功能化同位素探针共价修饰生物样本中特定活性氨基酸；
(2)利用定量蛋白质组学技术获得定量结果数据，比较目标分子处理或未处理的生物样本中全蛋白组水平下，被修饰的特定活性氨基酸丰度的差异，以此表征蛋白位点的可及性变化，从而筛选出具有显著位点变化的蛋白作为候选靶标。
有益技术效果
本发明目标在于改进现有定量蛋白质组学流程中需要进行点击化学、通过烟草蚀纹病毒蛋白酶将肽段从磁珠上释放而导致的操作繁杂的不足，设计并合成出能够准确进行蛋白质组定量且简化操作流程的同位素探针。
本发明有以下几点优势：
(1)探针获取方便，所用到的合成原料皆可市售或可通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单制备得到；
(2)本发明优化了传统的操作流程，大大降低了由“点击化学”带来的背景干扰；
(3)本发明利用脱硫生物素与链霉亲和素的作用力可在酸性或加热条件下被破坏的特点，优化了传统流程中需通过烟草蚀纹病毒蛋白酶将肽段从磁珠上释放而导致的操作繁杂的不足，提高了效率以及结果分析的准确性；
(4)本发明中的探针分子具有标记蛋白质组的能力，并且具有良好的蛋白质定量的准确性。
该发明可用于各类活性小分子的靶标研究。
技术方案
本发明的同位素探针化合物具有如下结构通式(通式A)：
其中：
X为N或其同位素15N，Y为C或其同位素13C；
R为可标记活性氨基酸反应的化学标记试剂；
n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数。
化学标记试剂选自如下结构：
代表性化合物为以下化合物：
其中星号标记表示同位素15N和13C的位置。
下文中提供的实施例和制备例进一步阐明和举例说明本发明化合物及其制备方法。应当理解，下述实例和制备例的范围并不以任何方式限制本发明的范围。本发明第二方面提供了制备本发明第一方面任一项所述化合物的方法，其包括以下步骤：
(1)
1)步骤a：将甘氨酸溶于极性溶剂中，加入酰化试剂发生进行酯化反应，得到中间体A2。
2)步骤b：将化合物A2溶于有机溶剂中(优选二氯甲烷和四氢呋喃的混合溶液)，与叔丁基三氯乙酰亚胺酯反应发生叔丁基的迁移，得到中间体A3。
3)步骤c：将化合物A3溶于醇溶剂(优选甲醇)，再通入氢气，在钯碳的催化下发生氢化反应，得到中间体A4。
4)步骤d：将化合物A2溶于有机溶剂中，在缩合剂的作用下与N-羟基丁二酰亚胺发生酯化反应，得到中间体A5。
5)步骤e：将化合物A5溶于有机溶剂中，在碱的作用下与化合物A4发生缩合反应，得到中间体A6。
6)步骤f：将化合物A6溶于醇溶剂(优选甲醇)，再通入氢气，在钯碳的催化下发生氢化反应，得到中间体A7。
7)步骤g：将生物素溶于水中，在碱和雷尼镍的作用下发生硫的脱除，得到中间体A9。
8)步骤h：将化合物A9溶于有机溶剂中，在缩合剂的作用下与N-羟基丁二酰亚胺发生酯化反应，得到中间体A10。
9)步骤i：将化合物A10溶于有机溶剂中，在碱的作用下与化合物A7发生缩合反应，得到中间体A11。
10)步骤j：将化合物A11溶于有机溶剂中，在三氟乙酸的作用下脱除保护基，得到中间体A12。
11)步骤k：将化合物A12溶于有机溶剂中，在缩合剂的作用下与各种R基团(包括但不限于氟苯酚、N-羟基琥珀酰亚胺、磺化NHS)发生酯化反应，得到化合物A13。
其重标探针的制备方法如下：
1)步骤a：将甘氨酸溶于极性溶剂中，加入酰化试剂发生进行酯化反应，得到中间体A2*。
2)步骤b：将化合物A2*溶于有机溶剂中(优选二氯甲烷和四氢呋喃的混合溶液)，与叔丁基三氯乙酰亚胺酯反应发生叔丁基的迁移，得到中间体A3*。
3)步骤c：将化合物A3*溶于醇溶剂(优选甲醇)，再通入氢气，在钯碳的催化下发生氢化反应，得到中间体A4*。
4)步骤d：将化合物A2*溶于有机溶剂中，在缩合剂的作用下与N-羟基丁二酰亚胺发生酯化反应，得到中间体A5*。
5)步骤e：将化合物A5*溶于有机溶剂中，在碱的作用下与化合物A4*发生缩合反应，得到中间体A6*。
6)步骤f：将化合物A6*溶于醇溶剂(优选甲醇)，再通入氢气，在钯碳的催化下发生氢化反应，得到中间体A7*。
7)步骤g：将生物素溶于水中，在碱和雷尼镍的作用下发生硫的脱除，得到中间体A9*。
8)步骤h：将化合物A9*溶于有机溶剂中，在缩合剂的作用下与N-羟基丁二酰亚胺发生酯化反应，得到中间体A10*。
9)步骤i：将化合物A10*溶于有机溶剂中，在碱的作用下与化合物A7*发生缩合反应，得到中间体A11*。
10)步骤j：将化合物A11*溶于有机溶剂中，在三氟乙酸的作用下脱除保护基，得到中间体A12*。
11)步骤k：将化合物A12*溶于有机溶剂中，在缩合剂的作用下与各种R基团(包括但不限于氟苯酚、N-羟基琥珀酰亚胺、磺化NHS)发生酯化反应，得到化合物A13*。
或(2)
1)步骤a：以Fmoc-甘氨酸(B1)及Boc-乙二胺为原料，在碱及缩合试剂的作用下发生缩合反应制得式(B2)。
2)步骤b：式(B2)化合物在碱及缩合试剂的作用下与(B1)发生缩合反应制得式(B3)。
3)步骤c：式(B3)在碱及缩合试剂的作用下与脱硫生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯发生缩合反应制得式(B4)。
4)步骤d：式(B4)在酸性条件下脱去Boc保护基团，随后在碱的作用下与碘乙酸酐发生反应制得式(B5)。
其重标探针的制备方法如下：
1)步骤a：以甘氨酸(13C2,15N)与9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯为原料，在碱的作用下制得式(B1*)。
2)步骤b：以(B1*)及Boc-乙二胺为原料，在碱及缩合试剂的作用下发生缩合反应制得式(B2*)；
3)步骤c：式(B2*)化合物在碱及缩合试剂的作用下与(B1*)发生缩合反应制得式(B3*)
4)步骤d：式(B3*)在碱及缩合试剂的作用下与脱硫生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯发生缩合反应制得式(B4*)
5)步骤e：式(B4*)在酸性条件下脱去Boc保护基团，随后在碱的作用下与碘乙酸酐发生反应制得式(B5*)，
在第三方面，本发明还提供了使用上述化合物相对定量两个样本中多种蛋白含量的方法。所述定量分析包括生物样品预处理和质谱分析，所述生物样品预处理步骤包括：对两份样本化学选择性标记后的蛋白进行沉淀，链霉亲和素珠富集和烷基化，酶切，酸切解离链霉亲和素珠与脱硫生物素的结合，除盐。
(1)所述两份样本标记步骤包括：将两份样品经蛋白裂解后，分别加入相同量的轻标探针和重标探针，在室温下进行化学选择性标记反应。反应1小时后将两份样品进行混合。
(2)所述蛋白沉淀步骤包括：在蛋白裂解液混合物中加入2倍体积的冰丙酮，于-20℃过夜沉淀蛋白。次日取出离心收集蛋白沉淀，用冷甲醇洗2次。
(3)所述链霉亲和素珠富集步骤包括：将蛋白沉淀复溶在含SDS的PBS中，加到链霉亲和素珠中，最终的体系为0.2％SDS的PBS，在29℃下进行富集，之后离心，弃去上清。分别用PBS洗涤链霉亲和素珠三次，再用去离子水洗涤三次去除SDS与非特异性吸附蛋白。
(4)所述烷基化步骤包括：将链霉亲和素珠转移到Eppendorf管中，加入Urea的PBS(溶有尿素的PBS)。之后加入DTT(二硫苏糖醇)在37℃反应。加入IAA(碘乙酰胺)在35℃反应，使得DTT打开的二硫键全部反应上IAA，以防止再次结合形成二硫键。
(5)所述酶切步骤包括：在烷基化后的链霉亲和素珠中加入含有Urea的PBS(溶有尿素的PBS)，再加入CaCl2溶液与胰蛋白酶buffer，37℃过夜反应。
(6)所述酸切步骤包括：将酶切后的样品在含三氟乙酸的乙腈、水混合溶液中反应15分钟，酸切完全后将酸切的上清液进行合并，旋干保存，进行质谱分析。
(7)所述质谱分析包括：预处理后的生物样品需进行质谱分析，质谱采用LC-MS/MS，并对LC-MS/MS数据分析。在第四方面，本发明还提供了使用上述式DbGG-TFP/DbG*G*-TFP，DbGG-I/DbG*G*-I化合物基于化学蛋白质组学鉴定小分子靶标的方法，包括：
小分子共价标记：准备两份等浓度等体积的细胞裂解液，一份中加入DMSO室温反应一小时，另一份加入所需鉴定靶标的小分子化合物室温反应一小时。
探针标记：将两份样品分别加入相同量的轻标探针和重标探针，在室温下进行标记反应。反应1小时后将两份样品进行等体积混合，之后用丙酮沉淀蛋白。
(3)所述链霉亲和素珠富集步骤包括：将蛋白沉淀复溶在含SDS的PBS中，加到链霉亲和素珠中，最终的体系为0.2％SDS的PBS，富集之后离心，弃去上清。分别用PBS洗涤链霉亲和素珠三次，再用去离子水洗涤三次去除SDS与非特异性吸附蛋白。
(4)所述烷基化步骤包括：将链霉亲和素珠转移到Eppendorf管中，加入Urea的PBS(溶有尿素的PBS)。之后加入DTT(二硫苏糖醇)在37℃反应。加入IAA(碘乙酰胺)在35℃反应，使得DTT打开的二硫键全部反应上IAA，以防止再次结合形成二硫键。
(5)所述酶切步骤包括：在烷基化后的链霉亲和素珠中加入含有Urea的PBS(溶有尿素的PBS)，再加入CaCl2溶液与胰蛋白酶缓冲液，37℃过夜反应。
(6)所述酸切步骤包括：将酶切后的样品在含三氟乙酸的乙腈、水混合溶液中反应15分钟，酸切完全后将酸切的上清液进行合并，旋干保存，进行质谱分析。
(7)所述质谱分析包括：预处理后的生物样品需进行质谱分析，质谱采用LC-MS/MS，并对LC-MS/MS数据分析。所述的可供标记及定量的活性氨基酸指具有化学活性基团的氨基酸，包含但不限于赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等。
本发明基于化学蛋白质组学的一种无需点击化学的可用于多种氨基酸修饰位点定量及鉴定的一体化同位素探针的合成方法及其应用，具有以下优点：
(1)探针合成简便，且在应用中无需点击化学，简化了蛋白质组学的工作流程；
(2)不需要复杂、耗时的针对配体合成衍生化探针，利用小分子共价标记活性氨基酸的反应，结合定量蛋白质组学流程即能够快速高效的发现小分子靶标；
(3)适用于多种复杂的生物体系，包括但不限于本发明示例的多种样本如纯蛋白、细胞裂解液、菌液、活细胞；
(4)针对小分子与靶标由于相互作用导致对化学标记试剂产生位阻筛选靶标，适用于与小分子存在弱结合的靶蛋白，避免了DARTS、CETSA等靶标发现技术要求小分子与靶标结合后水解稳定性、热稳定性等发生显著变化而导致的假阴性结果。
附图说明
图1代表性同位素探针的水解稳定性。
图2 SDS-PAGE胶检测浓度依赖性同位素探针的蛋白质组标记情况。
图3 LC-MS/MS检测同位素探针的定量准确性。
图4 LC-MS/MS检测同位素探针对多种氨基酸的选择性。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进是显而易见的。
对于以下全部实施例，可使用本领域技术人员已知的标准操作和纯化方法。除非另有说明，所有温度以℃(摄氏度)表示。化合物的结构是通过核磁共振氢谱(1H NMR)来确定的。核磁共振氢谱位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。耦合常数(J)以赫兹(Hz)为单位。核磁共振谱用Mercury-400或Brucker-500型核磁共振仪测定，氘代甲醇或氘代二甲基亚砜作溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标。仪器：超净工作台、恒温CO2培养箱(3111，Thermo，美国)、平板摇床(TS-8，Kylin-bell)、离心机(SIGMA)、超声波破碎仪(VCX130，SONICS)、低温离心机(5424R，Eppendorf)、多功能酶标仪(Spark 20M，TECAN)。
试剂：DMEM(GIBCO)、胎牛血清(GIBCO)、胰蛋白酶(SIGMA)，DMSO(SIGMA)、链霉亲和素琼脂糖纯化树脂Streptavidin Agarose Resin(Thermo，20353)、测序级修饰胰蛋白酶(Promega，V5111A)、NP-40裂解液、PBS缓冲液、SDS、蛋白酶抑制剂(Roche)、Absci SDS-PAGE蛋白快速染液、PageRulerTM预染蛋白marker(Thermo，26617)、白蛋白标准品(Thermo，23209)。
实施例1同位素探针DbGG-TFP的合成
合成路线：
(1)中间体Ⅰ的合成
将甘氨酸(200mg，2.66mmol)和氢氧化钠(234mg，5.90mmol)溶于水(4mL)和四氢呋喃(1mL)的混合溶液中并在冰浴下搅拌5分钟。缓慢滴入氯甲酸苄酯(412.5μL，2.93mmol)，后于冰浴下反应过夜。反应完成后，减压除去四氢呋喃，用1M的浓盐酸调节PH至2，析出白色固体，过滤，水洗，干燥得到白色固体454.7mg，收率81.6％。1H NMR(600MHz,CD3OD)δ7.38–7.31(m,4H),7.31–7.27(m,1H),5.10(s,2H),3.83(s,2H).
(2)中间体Ⅱ的合成
将化合物Ⅰ(200mg，0.96mmol)溶于二氯甲烷(4mL)和四氢呋喃(1mL)的混合溶液中并在冰浴下搅拌5分钟。加入叔丁基三氯乙酰亚胺酯(417.78mg，1.91mmol)的环己烷(1mL)溶液，再缓慢滴加三氟化硼乙醚(19.2μL)，后于冰浴下反应过夜。将反应液减压浓缩，粗残余物使用石油醚/乙酸乙酯(10/1，v/v)的柱色谱法纯化，得到无色油状液体181mg，收率71.4％。1H NMR(600MHz,CD3OD)δ7.36(d,J＝6.6Hz,1H),7.36–7.26(m,4H),3.74(s,2H),1.46(s,9H).
(3)中间体Ⅲ的合成
将化合物Ⅱ(150mg，0.57mmol)溶于甲醇(5mL)中，加入钯碳(80mg)，并鼓入氢气，在室温下反应4小时。反应完成后，抽滤，有机相减压浓缩干燥，得到无色油状液体33.6mg，产率45％。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.25(s,2H),1.47(s,9H).
(4)中间体IV的合成
将化合物(235.1mg，1.12mmol)和N,N'-二环己基碳二亚胺溶于超干乙酸乙酯(6mL)中并在冰浴下搅拌30分钟。再加入N-羟基丁二酰亚胺，后于将反应过夜。将反应液置于4℃冰箱中冷却6小时，抽滤，有机相减压浓缩干燥，得到白色固体300mg，产率98％。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.36(s,5H),5.15(s,2H),4.36(d,J＝5.8Hz,2H),2.85(s,4H).
(5)中间体Ⅴ的合成
将化合物IV(3.2g，10.4mmol)和化合物Ⅲ(1.37g，10.4mmol)溶于超干二氯甲烷(5mL)，再加入三乙胺(2.6mL，15.7mmol)，后于室温下反应过夜。将反应液减压浓缩，粗残余物使用石油醚/乙酸乙酯(1/1，v/v)的柱色谱法纯化，得到无色油状液体3.2g，收率94.5％。1HNMR(600MHz,d6-DMSO)δ7.30(t,J＝6.0Hz,1H),6.62(t,J＝6.3Hz,1H),6.54–6.36(m,5H),4.15(s,2H),2.85(s,2H),2.77(s,2H),0.52(s,9H).
(6)中间体Ⅶ的合成
将化合物Ⅱ(3.2g，9.93mmol)溶于甲醇(20mL)中，加入钯碳(300mg)，并鼓入氢气，在室温下反应4小时。反应完成后，抽滤，有机相减压浓缩干燥，得到无色油状液体1.8g，产率98％。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.83(s,2H),3.28(s,2H),1.43(s,9H).
(7)中间体Ⅷ的合成
将生物素(1g，4.09mmol)、雷尼镍(24.56g)和碳酸钠(5mg，0.05mmol)溶于50mL水中，反应48小时。反应完成后，用1M的浓盐酸调节PH至4，抽滤，重结晶，得到无色固体536mg，产率39.98％。
(8)中间体Ⅸ的合成
将化合物Ⅷ(720mg，2.3mmol)和化合物Ⅶ(434.7mg，2.3mmol)溶于超干二氯甲烷(20mL)中，再加入三乙胺(480μL，3.46mmol)，后于室温下过夜反应。将反应液减压浓缩，粗残余物使用二氯甲烷/甲醇(10/1，v/v)的柱色谱法纯化，得到无色固体710mg，收率80.2％。1HNMR(500MHz,d6-DMSO)δ8.09(t,J＝5.7Hz,1H),8.01(t,J＝5.7Hz,1H),3.71(m,4H),3.61(t,J＝6.8Hz,1H),3.48(t,J＝7.9,1H),2.12(t,J＝7.5Hz,2H),1.4z9(t,J＝7.5Hz,2H),1.40(s,9H),1.35-1.17(m,5H),0.96(d,J＝6.2Hz,3H).
(9)中间体Ⅹ的合成
将化合物Ⅸ(252.91mg，0.68mmol)和三氟乙酸(2mL，14.4mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，后于室温下反应过夜。反应完成后，有机相减压浓缩干燥，得到无色油状液体208.2mg，产率96.43％。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ8.11(t,J＝5.8Hz,1H),8.04(t,J＝5.9Hz,1H),3.78–3.73(m,2H),3.73–3.67(m,2H),3.66–3.54(m,1H),3.52–3.42(m,1H),2.12(t,J＝7.4Hz,2H),1.49(p,J＝7.4Hz,2H),1.37–1.13(m,6H),0.95(d,J＝6.4Hz,3H).
(10)探针DbGG-TFP的合成
将化合物Ⅹ(225g，0.69mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(144.52mg，0.75mmol)和四氟苯酚(125.2mg，0.75mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，后于冰浴下反应过夜。反应完成后减压浓缩，通过高效液相色谱法(HPLC)纯化粗制残余物，得到白色固体58mg，产率18％。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.51–7.39(m,1H),4.42–4.36(m,2H),3.93(s,2H),3.86–3.77(m,1H),3.75–3.65(m,1H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.66(p,J＝7.3Hz,2H),1.53–1.35(m,6H),1.10(d,J＝6.5Hz,3H).
实施例2同位素探针DbGG-PFP的合成
合成路线：
将化合物Ⅹ(200g，0.61mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(139.9mg，0.73mmol)和五氟苯酚(134.37mg，0.73mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，后于冰浴下反应过夜。反应完成后减压浓缩，通过高效液相色谱法(HPLC)纯化粗制残余物，得到白色固体49mg，产率16％。1H NMR(600MHz,CD3OD)δ4.38(s,2H),3.93(s,2H),3.82(dt,J＝7.8,6.4Hz,1H),3.70(q,J＝7.5Hz,1H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.66(p,J＝7.4Hz,2H),1.50(m,2H),1.47–1.27(m,4H),1.10(d,J＝6.5z,3H).
实施例3同位素探针DbGG-NHS的合成
合成路线：
将化合物Ⅹ(215g，0.66mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(189.07mg，0.98mmol)和NHS(113.51mg，0.99mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，后于冰浴下反应过夜。反应完成后减压浓缩，通过高效液相色谱法(HPLC)纯化粗制残余物，得到白色固体50mg，产率18％。1H NMR(500MHz,d6-DMSO)δ8.07(t,J＝5.6Hz,1H),8.02(d,J＝5.6Hz,1H),3.75(d,J＝5.6Hz,2H),3.70(d,J＝5.5Hz,2H),3.61(t,J＝6.9Hz,1H),3.48(q,J＝3.8Hz,1H),2.13(t,J＝7.3Hz,2H),1.49(t,J＝7.6Hz,2H),1.38–1.32(m,2H),1.30(d,J＝8.9Hz,1H),1.25(q,J＝6.5Hz,2H),1.18(s,1H),0.96(d,J＝6.2Hz,3H).
实施例4同位素探针DbGG-I的合成
合成路线：
(1)中间体II的合成
在一单颈瓶中，加入Fmoc-甘氨酸(I)(0.9eq,1.7mmol,504.9mg)，4-甲基吗啉(NMM,1.1eq,2.1mmol,226μL),2-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU,1.0eq,1.9mmol,710.6mg)，用5ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，在冰浴下搅拌1-2小时。再加入N-Boc-乙二胺(Boc-NH2,1.0eq,1.9mmol,296.0μL)并搅拌1小时，后于室温下反应过夜。反应溶液加入100ml乙酸乙酯稀释，合并的有机层用饱和NaCl水溶液(30mL)洗涤5-6次，然后用硫酸钠干燥，过滤，蒸发溶剂。有机相旋干，柱层析(PE/EA＝1:1)，真空干燥过夜得到白色固体617.0mg，产率83.6％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(d,J＝7.6Hz,1H),7.60(d,J＝7.2Hz,1H),7.40(t,J＝7.2Hz,1H),7.31(dt,J＝7.6,1.2Hz,1H),6.66(s,1H),5.49(s,1H),4.93(s,1H),4.43(d,J＝7.0Hz,2H),4.22(t,J＝7.0Hz,1H),3.86(d,J＝3.2Hz,2H),3.40-3.35(m,2H),3.28-3.25(m,2H),1.43(s,9H)。
(2)中间体III的合成
将II(1.0eq,2.28mmol,1.0g)溶解在6mL 40％二乙胺/DMF的溶液中并在室温下搅拌2h直到通过TLC监测反应完成。除去二乙胺以获得溶液A。将I(0.9eq，2.1mmol，608.9mg)、NMM(1.1eq，2.5mmol，276.0μL)、HATU(1.0eq，2.3mmol，866.4mg)溶于5mL DMF中，在冰浴下搅拌的1-2小时，得到溶液B。将溶液A加入溶液B中，0℃反应1小时。反应溶液反应过夜并用乙酸乙酯(100mL)洗涤四次。合并的有机层用饱和NaCl水溶液(30mL)洗涤，然后用硫酸钠干燥，过滤，蒸发溶剂。有机相旋干，柱层析(EA:MeOH＝400:1)，真空干燥过夜得到白色固体681.7mg，产率67.0％。1H NMR(500MHz,d6-DMSO)δ8.08(t,1H),7.89(d,J＝7.6Hz,2H),7.81(d,1H),7.72(d,J＝7.5Hz,2H),7.58(t,1H),7.42(t,J＝7.5Hz,2H),7.33(t,J＝7.5Hz,2H),6.79(t,1H),4.30(d,J＝7.0Hz,2H),4.23(t,J＝7.1Hz,1H),3.67(m,4H),3.08(m,2H),2.97(m,2H),1.36(s,9H)。
(3)中间体IV的合成
将III(1.0eq,0.3mmol,131.7mg)溶解在3mL 40％二乙胺/DMF的溶液中并在室温下搅拌2h直到通过TLC监测反应完成。除去二乙胺。然后加入三乙胺(5.0eq，1.5mmol，208.5μL)并在氮气氛下反应15分钟，然后加入脱硫生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯(Db-NHS，1.0eq，0.3mmol，93.4mg)。将反应混合物搅拌过夜，蒸发至干并通过RP-HPLC分离。将产物级分冻干得到白色固体86.5mg，产率61.3％。1H NMR(500MHz,d6-DMSO)δ8.12(m,1H),8.07(m,1H),7.79(m,1H),6.79(m,1H),3.67(m,4H),3.60(m,1H),3.48(m,1H),3.08(m,2H),2.97(m,2H),2.13(t,J＝7.5Hz,2H),1.50(t,J＝7.4Hz,2H),1.37(s,9H),1.34–1.12(m,6H),0.95(d,J＝6.4Hz,3H)。
(4)化合物V的合成
将IV(1.0eq,0.18mmol,86.3mg)溶解在8mL 20％TFA/DCM(v/v)中并在室温下搅拌2小时。然后减压除去TFA和DCM。用DIPEA将pH值调节至8-9。在氮气保护下，将碘乙酸酐(0.71eq，0.13mmol，46.0mg)和DIEPA(1.6eq，0.29mmol，47.8μL)加入3mL DCM和6mL DMF的溶液中。将反应在黑暗中搅拌直至通过RP-HPLC分离。将产物级分冻干得到白色固体28.0mg，产率40.0％。1H NMR(500MHz,d6-DMSO)δ8.26(s,1H),8.09-8.01(m,2H),7.81(s,1H),6.27(s,1H),6.09(s,1H),3.70(d,J＝5.7Hz,2H),3.66(d,J＝5.7Hz,2H),3.61(m,3H),3.51-3.45(m,1H),3.10(d,J＝2.7Hz,4H),2.14(t,J＝7.5Hz,2H),1.50(t,J＝7.4Hz,2H),1.39-1.16(m,6H),0.96(d,J＝6.4Hz,3H)。
实验例1探代表性同位素探针的水解稳定性。
将代表性同位素探针均配成0.4mM的PBS溶液，在相同时间间隔通过HPLC测定其水解比例。
结果如图1所示，代表性探针有较好的水解稳定性。
实验例2 SDS-PAGE胶检测浓度依赖性同位素探针的蛋白质组标记情况。
将处于生长对数期的10cm培养皿的U87MG细胞消化，加入含蛋白酶抑制剂的0.4％NP-40，先冰上超声10-30s，再进行冰上裂解30min。将裂解液离心(15000rpm，20min，4℃)，取5μL进行2倍稀释，测定其蛋白浓度，将其配成浓度为2mg/mL。取50mM同位素探针分别稀释成10mM、25mM、50mM、100mM、200mM，分别加1μL加入到上述细胞99μL9裂解液中，以及一份DMSO对照组，37℃避光孵育1h。加入800μL冰丙酮，-20℃过夜沉淀蛋白。将上述沉淀的蛋白离心去上清液(5500rpm，5min，4℃)，冰甲醇洗3次以去除多余残留探针(第一次用超声超声2-5s)，挥干甲醇。向每份挥干甲醇的蛋白样品中加入200μL 1.2％SDS-PBS，400μL PBS，50μL磁珠，室温反应4h。离心(5min，5500rpm)，用6M尿素(36.16g/100mL)洗2次，PBS洗3次，水洗3次。加入80μL0.4％SDS/PBS，20μL 5×loading buffer，混匀，95℃变性10min。将input组和pull down组每份浓度样品30μL上样。
所得结果如图2所示，DbGG-TFP/DbG*G*-TFP探针所标记蛋白质组的能力随浓度升高而升高，在100μM时达到最大标记。DbGG-I/DbG*G*-I探针在50μM为最适宜工作浓度。
实验例3 LC-MS/MS检测同位素探针的定量准确性。
(1)样本处理：将处于生长对数期的10cm培养皿的U87MG细胞消化，加入含蛋白酶抑制剂的NP-40，先冰上超声10s，再进行冰上裂解30min。将裂解液离心15000rpm，20min，4℃，测定浓度将其配成浓度为2mg/ml。将同位素探针稀释至100mM，分别加5μL加入到上述细胞495μL裂解液中,37℃孵育1h，按照轻重标签体积1:1，2:1混合，加入冰丙酮，-20℃过夜沉淀。将上述沉淀的蛋白离心去上清液(5500rpm，5min，4℃)，冰甲醇洗3次以去除多余残留探针(第一次用超声超声2-5s)，挥干甲醇。向每份挥干甲醇的蛋白样品中加入200μL 1.2％SDS-PBS，400μL PBS，50μL磁珠，室温反应4h。离心(5min，5500rpm)，用6M尿素(36.16g/100mL)洗2次，PBS洗3次，水洗3次。加入500μL 6M尿素，15μL DTT(31mg/mL)，45min，37℃，1000rpm；15μL IAA(74mg/mL)，30min，35℃，1000rpm；15μL DTT(31mg/mL)，30min，35℃，1000rpm。加900μL水，1400g，3min，离心取上清。加入2M尿素200μL，2μL 100mM CaCl2，4μL0.5mg/mL Trypsin，37℃，1200rpm过夜。过夜样品离心，1400g，3min，200μL水洗两次。加入200μL 0.1％TFA/50％ACN/H2O，24℃，5min，1000rpm，收集上清，重复两次，合并上清；95℃，5min，1000rpm，收集上清，合并旋干。
(2)样品除盐：将得到的样品分别用100μL 0.1％FA/H2O溶解，涡旋，离心(小的离心机，约离心3-5s)。吸取100μL的50％ACN/H2O润湿吸头。弃溶液，重复两次。吸取100μL的0.1％FA/H2O平衡吸头，弃溶液，重复两次。将样品(100μL)转移至C18吸头中，离心3-5s。溶液重复冲洗，重复十次。用100μL 0.1％FA(in 5％ACN/H2O)冲洗，弃溶液，重复五次。换新的EP管，用100μL 0.1％FA(in 75％ACN/H2O)冲洗除盐柱，重复五次。旋干溶剂，进行质谱分析。
(3)质谱检测样品：样品分析在Ultimate 3000LC系统串联Orbitrap FusionTMLumosTM TribridTM质谱仪(Thermo Fisher Scientific)上进行。将用于蛋白质组分析的样品重新溶于含有0.1％甲酸的水中，并在4℃/15000rpm下离心30分钟。将肽加载到预柱上(0.3mm×5mm,C18,5μm,100160454)，并在含有0.1％甲酸的100％缓冲液中以10μL/min的流速上样10分钟。然后样品以0.3μL/min的流速转移到分析柱上(Acclaim PepMap RSLC 70μm×15cm，nanoViper C18，2μm，100A)，使用90分钟梯度进行分离(缓冲液A：0.1％甲酸，HPLC级水；缓冲液B：0.08％甲酸，80％乙腈；0-5分钟，4％B；5.01-70分钟，4-30％B；70.01-75分钟，30-80％B；75.01-80分钟，80％B；80.01-85分钟，80-4％B；85.01-90分钟4％B)。使用2.4kV的喷雾电压和320℃的离子传输管温度将肽段离子化。Orbitrap FusionTM LumosTMTribridTM质谱仪以数据相关模式在MS和MS2扫描之间自动切换，排除持续时间为25秒。MS光谱分辨率为60,000，最大进样时间为50ms，自动增益控制(AGC)目标值为4×105个电荷。全扫描MS光谱的扫描范围为350-1,500(m/z)。将具有30％归一化能量的高能碰撞解离(HCD)应用于肽片段化。MS2光谱以15,000的分辨率获得，最大进样时间为30ms，AGC目标值为5×104。仅选择电荷态范围为2至7的前体进行碎裂。隔离窗口为1.6m/z。
(4)数据分析处理：通过开放数据库MSfragger进行对人类蛋白质数据库(ipi.HUMAN.v.3.68.fasta)进行搜索分析，导入质谱原始文件，设置搜索参数：固定修饰(半胱氨酸，+57.0215Da)，动态修饰(甲硫氨酸，+15.9949Da；赖氨酸，+310.1641Da/+316.1716Da或半胱氨酸+353.2063Da/+359.2138Da)。利用origin软件(version 2022)对所得结果中每条肽段的“Log2Ratio”值进行数据分析。
所得结果如图3所示：轻重标DbGG-TFP/DbG*G*-TFP、DbGG-I/DbG*G*-I为1:1和1:4时，Log2Ratio heavy:light的肽段定量值分别集中在0和-2，说明探针具备准确定量蛋白质组的能力。
实验例4 LC-MS检测同位素探针对多种氨基酸的选择性。
(1)样本处理：将处于生长对数期的10cm培养皿的U87MG细胞消化，加入含蛋白酶抑制剂的NP-40，先冰上超声10s，再进行冰上裂解30min。将裂解液离心15000rpm，20min，4℃，测定浓度将其配成浓度为2mg/ml。将同位素探针稀释至100mM，加5μL加入到上述细胞495μL裂解液中，37℃孵育1h，加入冰丙酮，-20℃过夜沉淀。将上述沉淀的蛋白离心去上清液(5500rpm，5min，4℃)，冰甲醇洗3次以去除多余残留探针(第一次用超声超声2-5s)，挥干甲醇。向每份挥干甲醇的蛋白样品中加入200μL 1.2％SDS-PBS，400μL PBS，50μL磁珠，室温反应4h。离心(5min，5500rpm)，用6M尿素(36.16g/100mL)洗2次，PBS洗3次，水洗3次。加入500μL 6M尿素，15μL DTT(31mg/mL)，45min，37℃，1000rpm；15μL IAA(74mg/mL)，30min，35℃，1000rpm；15μL DTT(31mg/mL)，30min，35℃，1000rpm。加900μL水，1400g，3min，离心取上清。加入2M尿素200μL，2μL 100mM CaCl2，4μL 0.5mg/mL Trypsin，37℃，1200rpm过夜。过夜样品离心，1400g，3min，200μL水洗两次。加入200μL 0.1％TFA/50％ACN/H2O，24℃，5min，1000rpm，收集上清，重复两次，合并上清；95℃，5min，1000rpm，收集上清，合并旋干。
(2)样品除盐：将得到的样品分别用100μL 0.1％FA/H2O溶解，涡旋，离心(小的离心机，约离心3-5s)。吸取100μL的50％ACN/H2O润湿吸头。弃溶液，重复两次。吸取100μL的0.1％FA/H2O平衡吸头，弃溶液，重复两次。将样品(100μL)转移至C18吸头中，离心3-5s。溶液重复冲洗，重复十次。用100μL 0.1％FA(in 5％ACN/H2O)冲洗，弃溶液，重复五次。换新的EP管，用100μL 0.1％FA(in 75％ACN/H2O)冲洗除盐柱，重复五次。旋干溶剂，进行质谱分析。
(3)质谱检测样品：样品分析在Ultimate 3000LC系统串联Orbitrap FusionTMLumosTM TribridTM质谱仪(Thermo Fisher Scientific)上进行。将用于蛋白质组分析的样品重新溶于含有0.1％甲酸的水中，并在4℃/15000rpm下离心30分钟。将肽加载到预柱上(0.3mm×5mm,C18,5μm,100160454)，并在含有0.1％甲酸的100％缓冲液中以10μL/min的流速上样10分钟。然后样品以0.3μL/min的流速转移到分析柱上(Acclaim PepMap RSLC 70μm×15cm，nanoViper C18，2μm，100A)，使用90分钟梯度进行分离(缓冲液A：0.1％甲酸，HPLC级水；缓冲液B：0.08％甲酸，80％乙腈；0-5分钟，4％B；5.01-70分钟，4-30％B；70.01-75分钟，30-80％B；75.01-80分钟，80％B；80.01-85分钟，80-4％B；85.01-90分钟4％B)。使用2.4kV的喷雾电压和320℃的离子传输管温度将肽段离子化。Orbitrap FusionTM LumosTMTribridTM质谱仪以数据相关模式在MS和MS2扫描之间自动切换，排除持续时间为25秒。MS光谱分辨率为60,000，最大进样时间为50ms，自动增益控制(AGC)目标值为4×105个电荷。全扫描MS光谱的扫描范围为350-1,500(m/z)。将具有30％归一化能量的高能碰撞解离(HCD)应用于肽片段化。MS2光谱以15,000的分辨率获得，最大进样时间为30ms，AGC目标值为5×104。仅选择电荷态范围为2至7的前体进行碎裂。隔离窗口为1.6m/z。
(4)数据分析处理：通过开放数据库MSfragger进行对人类蛋白质数据库(ipi.HUMAN.v.3.68.fasta)进行搜索分析，导入质谱原始文件，设置搜索参数：固定修饰(半胱氨酸，+57.0215Da)，动态修饰(甲硫氨酸，+15.9949Da；赖氨酸/精氨酸/苏氨酸/丝氨酸/色氨酸/半胱氨酸+310.1641Da)。利用origin软件(version2022)对所得结果中每条肽段的“Log2Ratio”值进行数据分析。
所得结果如图4所示：DBGG-TFP同位素探针对赖氨酸有较高的选择性。
Claims (6)
1.一类含脱硫生物素的同位素分子化合物，其特征在于，其化学结构通式为式A所示：
其中：
X为N或其同位素15N，Y为C或其同位素13C；
R为可标记蛋白中活性氨基酸残基的化学标记试剂；
n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数。
2.根据权利要求1的化合物，所述化学标记试剂选自如下结构：
3.根据权利要求1-2任一项所述的化合物，所述化合物选自：
其中，星号标记表示同位素15N和13C的位置。
4.一组组合物，包含权利1-3任意一项所述的化合物或其可接受的盐或可接受的载体，赋形剂，稀释剂，辅剂，媒介物或它们的组合。
5.权利要求1-3任一项的化合物或其可接受的盐或权利要求6所述组合物在制备在定量蛋白质组学中的应用。
6.根据权利要求5的应用，这些应用包括但不限于：
(1)共价标记：利用功能化同位素探针共价修饰生物样本中特定活性氨基酸；
(2)利用定量蛋白质组学技术获得定量结果数据，比较目标分子处理或未处理的生物样本中全蛋白组水平下，被修饰的特定活性氨基酸丰度的差异，以此表征蛋白位点的可及性变化，从而筛选出具有显著位点变化的蛋白作为候选靶标。
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