CN110320364B - 一种双抗夹心胶体金检测试剂盒、及其制备方法与应用 - Google Patents

一种双抗夹心胶体金检测试剂盒、及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种双抗夹心法胶体金检测的试剂盒，该试剂盒使用了特定成分的金标抗体封闭液、金标抗体稀释液、固定抗体稀释液。该试剂盒通过三种特定成分的试剂，使得原本胶体金检测中的金标抗体和固定抗体能够互换，当使用该三种试剂后，检测灵敏度与原有的胶体金检测结果相比增加或相当。

Description

一种双抗夹心胶体金检测试剂盒、及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种双抗夹心胶体金检测试纸条的试剂盒、及其制备方法与应用，属于疫病快速诊断检测领域。
背景技术
目前，在疫病快速诊断检测领域利用双抗体夹心检测抗原较为常见，如吕字华等(参见吕字华等.抗鹅副粘病毒NA-1株单抗及NA-1株抗原检测胶体金试纸条的制备.家畜生产与禽病防治专题,597)中报道的以单克隆抗体-多克隆抗体夹心原理建立的胶体金检测试纸条检测鹅副粘病毒抗原；以及Dong-Jun An等(参见Dong-Jun An等.Animmunochromatography assay for rapid antemortem diagnosis of dogs suspectedto have canine distemper.Journal of Virological Methods,2008,147:244-249)中报道的以单克隆抗体-单克隆抗体夹心原理建立的胶体金检测试纸条检测犬瘟热病毒抗原。其中，以单克隆抗体-单克隆抗体(双单抗)夹心检测抗原最为常见。
但是，现有技术以及反复试验摸索中发现：以双抗体(双单抗)夹心原理涉及的快速检测产品，在确定2种抗体可用于双抗体夹心检测抗原后，研究搭配模式时发现其中1种单克隆抗体只能固定用于标记抗体、另1种单克隆抗体只能作为检测线上固定用抗体，若将2种抗体的搭配模式改变，即将产品中2种单抗的位置互换，则会引起非特异反应或降低灵敏度。
另外，现有胶体金类产品中样品处理液所含成分不一，当处理非针对的动物疫病抗原样本，该抗原未得到充分裂解，且不同试剂盒样品处理液仅针对特定来源的待检样品有效，对其它类型的动物疫病抗原样本未必有效，且商品化胶体金试剂盒的说明书多标有“不能使用其它试剂盒的样品处理液或样本稀释液”之用语，当混杂使用时甚至会导致检测时灵敏度低、敏感性不好，甚至出现非特异反应，影响确诊速度，严重时会使病情恶化并导致疾病肆意传播。
因此，现有技术中缺乏一种能够解决双抗夹心检测抗原时，标记抗体和固定抗体能互换配对的试剂盒，也缺少一种能够解决对不同来源的样品均能充分处理以保证检测效果的试剂盒，还缺少一种能和多种商品化双抗夹心试纸条的配合使用的样品处理试剂盒。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种双抗夹心法胶体金检测的试剂盒，其中，所述试剂盒包括双抗夹心法胶体金测试纸条和样品处理液；所述双抗夹心法胶体金测试纸条上的金标抗体使用金标抗体封闭液处理，所述金标抗体封闭液包括磷酸盐缓冲液、大分子蛋白、Tween-20，所述磷酸盐缓冲液为pH7.4 0.1M PBS溶液，所述大分子蛋白为BSA、OVA、胎牛血清、脱脂奶中的任一种；所述金标抗体封闭液优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.02％～0.1％W/V Tween-20，及0.2％～1.0％W/V BSA、OVA、胎牛血清、脱脂奶中的任一种；所述金标抗体使用金标抗体稀释液稀释，所述金标抗体稀释液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、PEG4000、Proclin300，或包括pH7.4 0.1M PBS溶液、PEG6000、Proclin300；所述金标抗体稀释液优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1％V/V PEG4000、0.02％V/V Proclin300，或pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1％V/V PEG6000、0.02％V/V Proclin300；以及所述双抗夹心法胶体金测试纸条上的固定抗体使用固定抗体稀释液稀释，所述固定抗体稀释液包括pH7.40.1M PBS溶液、糖类稳定剂、Triton-X 100；优选地，所述固定抗体稀释液包括pH7.4 0.1MPBS溶液、蔗糖、Triton-X 100；所述固定抗体稀释液进一步优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1％V/V Triton-X 100，及0.5％V/V蔗糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇中的任一种。
本发明的试剂盒通过特定组分的金标抗体封闭液、金标抗体稀释液、固定抗体稀释液，实现了原有双抗中金标抗体和固定抗体的互换。当使用原抗体配对组合时，提高了检测的灵敏度；而使用互换的抗体配对组合时，检测灵敏度与原有的检测灵敏度相当或更优。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条上包被有金标抗体，所述金标抗体标记的胶体金其胶体金溶液最大吸收峰为515～530nm、最大吸收峰对应的ODmax值为0.9～1.1、0.75×ODmax值对应的吸收峰峰间距为55～72nm。
作为本发明的一种优选的实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述金标垫上吸附有金标抗体，所述硝酸纤维素膜上近所述底板第二端的位置包括检测线和质控线，所述检测线上固定化有固定抗体，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述金标抗体的结合体能在其上向底板第二端迁移。
作为本发明的一种更优选的实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述金标抗体溶解于金标抗体稀释液中的浓度为10～250μg/ml；所述固定抗体、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别经固定抗体稀释液稀释至0.5～3mg/ml、1～3mg/ml。
作为本发明的一种优选的实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述金标抗体溶解于金标抗体稀释液中的浓度为25～100μg/ml。
作为本发明的一种更优选的实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述检测线和质控线两线间距≥5mm。
作为本发明的一种优选的实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述双抗为CCTCCNo:C2014198小鼠杂交瘤细胞3G12分泌的猪圆环病毒2型单克隆抗体3G12，和CCTCC No:C2014199小鼠杂交瘤细胞2F8分泌的猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8；或者所述双抗为猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB2，和猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1，所述单克隆抗体PEDV-McAB2重链可变区为SEQ ID No.1所示，轻链可变区为SEQ ID No.2所示，所述单克隆抗体PEDV-McAB1重链可变区为SEQ ID No.3所示，轻链可变区为SEQ ID No.4所示；或者所述双抗为猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-3D2，和猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-4B4，所述单克隆抗体TGEV-3D2重链可变区为SEQ ID No.5所示，轻链可变区为SEQ ID No.6所示，所述单克隆抗体TGEV-4B4重链可变区为SEQ ID No.7所示，轻链可变区为SEQ ID No.8所示；或者所述双抗为抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体IV-McAB1，和抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体IV-McAB2，所述单克隆抗体IV-McAB1重链可变区为SEQ IDNo.9所示，轻链可变区为SEQ ID No.10所示，所述单克隆抗体IV-McAB2重链可变区为SEQID No.11所示，轻链可变区为SEQ ID No.12所示；或者所述双抗为CCTCC No:C201578小鼠骨髓杂交瘤细胞10B11株分泌的犬细小病毒单克隆抗体CPV-10B11，和CCTCC No:C201579小鼠骨髓杂交瘤细胞10H4株分泌的犬细小病毒单克隆抗体CPV-10H4；或者所述双抗为CCTCCNo：C2015201小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5分泌的犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-1G5，和CCTCC No：C2015202小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌的犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-6E11；或者所述双抗为犬腺病毒单克隆抗体CAV-5G4，和犬腺病毒单克隆抗体CAV-1A1，所述单克隆抗体CAV-5G4重链可变区为SEQ.ID No.13所示，轻链可变区为SEQ.ID No.14所示，所述单克隆抗体CAV-1A1重链可变区为SEQ.ID No.15所示，轻链可变区为SEQ.ID No.16所示。
作为本发明的一种实施方式，所述金标抗体为PCV2-3G12，所述固定抗体为PCV2-2F8；或所述金标抗体为PCV2-2F8，所述固定抗体为PCV2-3G12。
作为本发明的一种实施方式，所述金标抗体为PEDV-McAB2，所述固定抗体为PEDV-McAB1；或所述金标抗体为PEDV-McAB1，所述固定抗体为PEDV-McAB2。
作为本发明的一种实施方式，所述金标抗体为TGEV-3D2，所述固定抗体为TGEV-4B4；或所述金标抗体为TGEV-4B4，所述固定抗体为TGEV-3D2。
作为本发明的一种实施方式，所述金标抗体为IV-McAB1，所述固定抗体为IV-McAB2；或所述金标抗体为IV-McAB2，所述固定抗体为IV-McAB1。
作为本发明的一种实施方式，所述金标抗体为CPV-10B11，所述固定抗体为CPV-10H4；或所述金标抗体为CPV-10H4，所述固定抗体为CPV-10B11。
作为本发明的一种实施方式，所述金标抗体为CDV-1G5，所述固定抗体为CDV-6E11；或所述金标抗体为CDV-6E11，所述固定抗体为CDV-1G5。
作为本发明的一种实施方式，所述金标抗体为CAV-5G4，所述固定抗体为CAV-1A1；或金标抗体为CAV-1A1，所述固定抗体为CAV-5G4。
作为本发明的一种优选的实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述样品处理液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、CHAPS、皂苷、Proclin300；所述样品处理液优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1％～1.0％W/V CHAPS、0.1％～1.0％W/V皂苷、0.02％V/V Proclin300；所述样品处理液进一步优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％W/V CHAPS、0.5％W/V皂苷、0.02％V/VProclin300。
作为本发明的一种更优选的实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述样品处理液1ml溶解固体样品0.08～0.5g和/或所述样品处理液1ml溶解液体样品500～1500μl。
作为本发明的一种进一步优选的实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述样品选自组织、血清、肛门分泌物、粪便、咽鼻分泌物、眼鼻分泌物、病毒培养物。
本发明还涉及一种制备所述的双抗夹心法胶体金检测的试剂盒的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)用胶体金标记单克隆抗体为金标抗体，用所述金标抗体封闭液封闭所述金标抗体，再用所述金标抗体稀释液稀释所述金标抗体至10～250μg/ml，然后将所述金标抗体吸附于玻璃纤维膜或聚酯膜即成金标垫，干燥后使用；步骤(2)固定抗体、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别经所述固定抗体稀释液稀释至0.5～3mg/ml、1～3mg/ml，分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线、质控线，所述检测线、质控线两线间距≥5mm，干燥所述硝酸纤维素膜；步骤(3)配制样品处理液，分装；以及步骤(4)将所述步骤(1)所制备的金标垫、所述步骤(2)制备的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴底板上，裁剪；连同所述步骤(3)制备的样品处理液组装成试剂盒。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤1)中所述胶体金为最大吸收峰为515～530nm、最大吸收峰对应的ODmax值为0.9～1.1、0.75×ODmax值对应的吸收峰峰间距为55～72nm的胶体金溶液，所述金标抗体封闭液为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.2％～1.0％W/V BSA、0.02％～1.0％W/V Tween-20，所述金标抗体稀释液为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1％V/VPEG4000、0.02％V/V Proclin300，或pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1％V/V PEG6000、0.02％V/VProclin300；
所述步骤2)中所述固定抗体稀释液为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％V/V蔗糖、0.1％V/V Triton-X 100；
所述步骤3)中所述样品处理液为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％W/V CHAPS、0.5％W/V皂苷、0.02％V/V Proclin300。
本发明还提供了所述试剂盒的检测方法，包括：
步骤(1)根据动物疫病抗原的排毒途径采集临床样品，取固体样品0.08～0.5g和/或液体样品500～1500μl溶解于样品处理液中。
步骤(2)将处理后的样品滴加50～150μl至加样孔中，静置10分钟在检测区观察结果。
本发明还提供了所述试剂盒用于非诊断目的的动物疫病抗原检测中的应用，所述非诊断目的的动物疫病抗原检测包括流行病学分析、健康体检、对离体组织进行定性定量检测、表位鉴定研究。
作为本发明的一种实施方式，所述动物疫病抗原包括但不限于猪、禽、犬所产生的疫病抗原。
作为本发明的一种实施方式，所述动物疫病抗原包括猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A型流感病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒。
本发明还提供了一种金标抗体封闭液，所述金标抗体封闭液包括磷酸盐缓冲液、大分子蛋白、Tween-20，所述磷酸盐缓冲液为pH7.4 0.1M PBS溶液，所述大分子蛋白为BSA、OVA、胎牛血清、脱脂奶中的任一种；优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.2％～1.0％W/V BSA、0.02％～1.0％W/V Tween-20。
本发明还提供了一种金标抗体稀释液，所述金标抗体稀释液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、PEG4000、Proclin300，或pH7.4 0.1M PBS溶液、PEG6000、Proclin300；优选为pH7.40.1M PBS溶液、0.1％V/V PEG4000、0.02％V/V Proclin300，或pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1％V/V PEG6000、0.02％V/V Proclin300。
本发明还提供了一种固标抗体稀释液，所述固定抗体稀释液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、糖类稳定剂、Triton-X 100；所述固定抗体稀释液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、蔗糖、Triton-X 100；进一步优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％V/V蔗糖、0.1％V/V Triton-X100。
本发明还涉及一种样品处理液，其中，所述样品处理液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、CHAPS、皂苷、Proclin300；所述样品处理液优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1％～1.0％W/VCHAPS、0.1％～1.0％W/V皂苷、0.02％V/V Proclin300；所述样品处理液进一步优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％W/V CHAPS、0.5％W/V皂苷、0.02％V/V Proclin300。
本发明的样品处理液可以作为多种商业上的试剂盒的样品处理液使用，能有效裂解多种动物疫病抗原样品，使用本发明的样品处理液，能增加商业试剂盒的检测灵敏度。
作为本发明的一种实施方式，本发明的样品处理液处理的样品选自组织、血清、肛门分泌物、粪便、咽鼻分泌物、眼鼻分泌物、病毒培养物。
本发明制备的样品处理液，可用于病毒液、粪便、血清、微生物拭子(含眼鼻拭子、鼻咽拭子、泄殖拭子)、研磨后的组织样品、病毒培养物的溶解，以用于双单抗夹心原理构建的胶体金检测类试纸条准确检测处理后的样品。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述样品处理液1ml溶解固体样品0.08～0.5g和/或所述样品处理液1ml溶解液体样品500～1500μl。
本发明的样品处理液不仅可以在多种双抗夹心胶体金检测试纸条中作为通用的样品处理液，克服现有双抗夹心胶体金检测试纸条的样品处理液之间不能互换的问题，且使用本发明的样品处理液后，能较原试纸条自身配套的样品处理液处理后的检测结果相比，检测灵敏度提高。
本发明的优势：
(1)本发明制备的样品处理液，可用于多种动物病毒液、粪便、血清、微生物拭子(含眼鼻拭子、鼻咽拭子、泄殖拭子)、研磨后的组织样品的溶解，以用于双单抗夹心原理构建的胶体金检测类试纸条准确检测处理后的样品；
(2)本发明的金标抗体封闭液、金标抗体稀释液、固定抗体稀释液、样品处理液组合使用时能使以双抗体(特别是双单抗)夹心原理制备的现有产品所用到的固定、标记的2种单克隆抗体位置实现互换，完成用不同搭配模式2种单克隆抗体的制备的产品，检测样品后并不引起非特异反应并适当提高灵敏度。
(3)本发明制备的试剂盒中金标抗体用单克隆抗体、固定抗体用单克隆抗体可互换位置，完成用不同搭配模式2种单克隆抗体的制备的产品，检测样品后并不引起非特异反应并适当提高灵敏度。
附图说明
图1：不同胶体金溶液经紫外分光光度法扫描结果，a表示表1中胶体金溶液A6，b表示表1中胶体金溶液A7。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明中“胶体金检测试纸条”或“检测试纸条”可互换使用。
本发明中“胶体金标记标抗体”可与“标记抗体”、“金标抗体”互换使用，是以胶体金标记为主的单克隆抗体。
本发明中“金标抗体稀释液”也可称“金标抗体缓冲液”、“金标抗体复溶液”、“金标抗体重悬液”。
本发明中“固定抗体”又称捕获抗体，固定于检测试纸条检测线(简称T线)上，用于捕获层析而来的抗原与标记抗体形成的复合物。
术语“玻璃纤维膜”简称玻璃纤维，包括玻璃纤维素膜、玻璃纤维滤膜及玻璃纤维滤纸。
术语“质控线”又称对照线。
试剂盒
本发明所指的试剂盒，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条、样品处理液；
所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述金标垫上吸附有金标抗体，所述硝酸纤维素膜上近所述底板第二端的位置包括检测线和质控线，所述检测线上固定化有固定抗体，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述金标抗体的结合体能在其上向底板第二端迁移。
其中，所述金标抗体标记时胶体金优选为最大吸收峰为515～530nm、最大吸收峰对应的ODmax值为0.9～1.1、0.75×ODmax值对应的吸收峰峰间距为55～72nm的胶体金溶液。
优选地，所述金标抗体标记时单克隆抗体浓度为5～50μg/ml。
单克隆抗体双抗
本发明所指的单克隆抗体双抗，可以包括：
猪类单克隆抗体双抗，主要包括：
(1)猪圆环病毒2型单克隆抗体3G12(简称PCV2-3G12)由小鼠杂交瘤细胞3G12(保藏号为CCTCC No:C2014198)分泌获得，猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8(简称PCV2-2F8)由小鼠杂交瘤细胞2F8(保藏号为CCTCC No:C2014199)分泌获得。2株小鼠杂交瘤细胞均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2014年11月3日，公开于中国专利CN105717293A。
(2)猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB2、和猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1，其中，所述单克隆抗体PEDV-McAB2重链可变区为SEQ ID No.1所示、轻链可变区为SEQ ID No.2所示，所述单克隆抗体PEDV-McAB1重链可变区为SEQ ID No.3所示、轻链可变区为SEQ ID No.4所示，公开于中国专利CN105461805A。
(3)猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-3D2，其重链可变区的氨基酸序列为SEQID No.5、轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.6；猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-4B4，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.7、轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.8。
禽类单克隆抗体双抗，主要包括：
(4)抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体IV-McAB1、抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体IV-McAB2，其中，所述单克隆抗体IV-McAB1重链可变区为SEQ ID No.9所示、轻链可变区为SEQ ID No.10所示，所述单克隆抗体IV-McAB2重链可变区为SEQ ID No.11所示、轻链可变区为SEQ ID No.12所示，公开于中国专利CN104062430A。
犬类单克隆抗体双抗，主要包括：
(5)犬细小病毒单克隆抗体CPV-10B11由小鼠骨髓杂交瘤细胞10B11株(保藏号为CCTCC No:C201578)分泌获得，犬细小病毒单克隆抗体CPV-10H4由小鼠骨髓杂交瘤细胞10H4株(保藏号为CCTCC No:C201579)分泌获得。2株小鼠杂交瘤细胞均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年05月20日，公开于中国专利CN104928258A。
(6)犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-1G5由小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5(保藏号为CCTCCNo：C2015201)分泌获得，犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-6E11由小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株(保藏号为CCTCC No：C2015202)分泌获得。2株杂交瘤细胞均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年11月25日，公开于中国专利CN105695420A。
(7)犬腺病毒单克隆抗体CAV-5G4，其重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.13所示的氨基酸序列，轻链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.14所示的氨基酸序列；和犬腺病毒单克隆抗体CAV-1A1，其重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.15所示的氨基酸序列，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.16所示的氨基酸序列。
优选地，所述金标抗体终含量为25～250μg/ml，用金标抗体封闭液封闭后经金标抗体稀释液稀释至终含量后吸附于玻璃纤维膜或聚酯膜后干燥而成。
术语“大分子蛋白”包括但不限于牛血清白蛋白BSA、OVA、胎牛血清、脱脂奶。
术语“防腐剂”包括但不限于庆大霉素、硫酸卡那霉素、叠氮钠、硫柳汞及其盐类、Proclin300，优选为Proclin300。
术语“糖类稳定剂”包括但不限于右旋糖酐、山梨醇、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、海藻糖，优选为蔗糖。
术语“皂苷”又称saponin、碱皂体、皂素、皂苷、皂角苷或皂草苷，是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，分类方式多种，可分为单糖链皂苷、双糖链皂苷、三糖链皂苷，又可分为酸性皂苷、中性皂苷，还可分为甾体皂苷、三萜皂苷。所述皂苷包括甾体皂苷、三萜皂苷，优选为洋地黄皂苷。
术语“洋地黄皂苷”又称digitonin、毛地黄皂苷、地芰脱皂苷、毛地黄叶苷。
术语“CHAPS”是一种去污剂或去垢剂，又称3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、3-((3-胆汁氨丙基)二甲基胺)-1-丙磺酸、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐。
处理样品
处理样品通过对动物疫病抗原的排毒途径而针对性获得。本发明中动物疫病抗原的排毒途径主要是针对靶抗原感染后通过机体排毒途径进行代谢，如猪圆环病毒主要是通过组织、血液排毒，猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒主要是通过肛拭子、粪便排毒，A型流感主要通过咽鼻拭子排毒，犬细小病毒主要是肛拭子、粪便排毒，犬瘟热病毒主要是通过眼鼻拭子、肛拭子、粪便排毒，犬腺病毒主要是通过眼鼻拭子、肛拭子、粪便、血液等排毒。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到PBS缓冲液配制示例如下：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，调pH7.4，定容1L，包括但不限于此配方；化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1现有产品所用单抗情况分析
基于双抗体夹心原理，本发明技术团队及其他研发团队研制了一系列产品，简要如下：
中国专利CN105717293A中猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8(简称PCV2-2F8)、3G12(简称PCV2-3G12)配对抗体活性检测时，发现只有包被抗体为PCV2-2F8、标记抗体PCV2-3G12时制备的酶免疫层析检测试纸条才可使用，若将2种抗体互换位置即包被抗体为PCV2-3G12、标记抗体PCV2-2F8时存在非特异反应。将2种单克隆抗体组装成胶体金检测试纸条，出现同样的问题。
中国专利CN105461805A中猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2，配对研究时发现只有固定抗体为PEDV-McAB1、标记抗体为PEDV-McAB2时制备的胶体金检测试纸条或酶免疫层析检测试纸条才可应用，若将2者互换位置制备成产品进行检测，结果为假阳性。
中国专利CN104062430A中流感病毒单克隆抗体1(简称IV-McAB1)、2(简称IV-McAB2)，配对研究时发现只有固定抗体为IV-McAB2、标记抗体为IV-McAB1时制备的酶层析法检测试纸条才可使用，若将2者互换位置制备成产品进行检测，结果会出现非特异性反应。将2种单克隆抗体组装成胶体金检测试纸条，出现同样的问题。
中国专利CN104928258A中犬细小病毒单克隆抗体10B11、10H4，配对研究时发现只有固定抗体为10B11、标记抗体为10H4时制备的酶层析法检测试纸条才可使用，若将2者互换位置制备成产品进行检测，结果会出现假阴性。将2种单克隆抗体组装成胶体金检测试纸条，出现同样的问题。
中国专利CN105695420A中犬瘟热病毒单克隆抗体6E11、1G5，配对研究时发现只有固定抗体为6E11、标记抗体为1G5时制备的酶免疫层析检测试纸条或胶体金检测试纸条才可使用，若将2者互换位置制备成产品进行检测，结果会出现假阴性。
中国专利CN101149377A中检测曲霉的2种抗体中只有固定抗体为9D47A1、标记抗体为7E11A1时制备的产品方可产生最强的信号、避免非特异。
基于此，本发明人开展了一系列研究以解决配对时2种抗体不能互换位置，或互换位置后造成灵敏度降低、产生非特异反应，造成假阳性、假阴性等技术难题。
考虑到试纸条临床应用时所需检测靶标主要包括眼鼻拭子、肛拭子、粪便、血液以及处理后的组织等，其中粪便中所含杂质较多，故本发明先就检测粪便的犬用犬细小病毒胶体金检测试纸条为例进行详细的阐述。
实施例2试剂盒的制备
为更好地评价层析类试纸条如犬细小病毒胶体金检测试纸条，本发明先以固定抗体为10H4、标记抗体为10B11进行试纸条制备(对应实施例2.1部分)，并将犬细小病毒CVCCAV298株(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)，犬细小病毒流行株CPV不同基因型的S2株、S0425株、S0304株(参见Preparation and application of two monoclonalantibodies against canine parvovirus vaccine and field strains,Journal ofVaccines and Immunology,2017,3(1):001-004)，以及20份阳性粪便、20份阴性粪便(分别经犬细小病毒PCR鉴定结果为阳性、阴性)作为样品盘，对试纸条进行全面调控。
2.1检测试纸条的制备
2.1.1金标垫的制备
2.1.1.1胶体金的制备
配制0.01％的氯金酸HAuCl4水溶液，取100ml加热煮沸。搅动下加入1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，继续煮沸直至液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温补足失水。用外观和紫外分光光度法扫描对胶体金溶液进行质控，外观颜色如表1所示，均纯净、透亮、无沉淀和漂浮物；紫外分光光度法测定结果见表1：最大吸收峰为510～535nm、对应的ODmax值为0.9～1.1、0.75×ODmax值对应的吸收峰峰间距为50～80nm(大量的试验结果统计发现0.75×ODmax吸收峰峰间距在一定范围内可代替昂贵的电镜以质控胶体金粒径的均一性，本发明仅以表1中的数据为例进行展示)。
表1不同胶体金溶液检测结果
Figure BDA0001618132600000141
Figure BDA0001618132600000151
将金标垫(金标抗体含量为25μg/ml，制备金标抗体时所用金标抗体封闭液为B6(见实施例2.1.1.2)及金标抗体稀释液为C3(见实施例2.1.1.3))、硝酸纤维素膜(按实施例2.1.2制备，固定抗体稀释液为D4)，按实施例2.2所描述的方法依次制备成试纸条A1～A8，并按实施例2.3将样品盘样品用实施例2.1.3制备的样品处理液E4稀释并进行检测，结果见表2，显示：当胶体金溶液为A2～A7(胶体金溶液为红色澄清液体，经紫外分光光度法测定其最大吸收峰为515～530nm、对应的ODmax值为0.9～1.1、0.75×ODmax值对应的吸收峰峰间距为55～72nm)时制备的金标抗体进而制备的试纸条检测后CPV毒株的灵敏度较高(103.5～104.0TCID50/ml)，检测临床样品与PCR检测结果一致性较高(＞50％)；当胶体金溶液为A1、A8时制备的金标抗体进而制备的试纸条检测灵敏度下降(＞104.5TCID50/ml)，且检测临床样品出现非特异反应较强(与PCR一致性＜50％)。图1中选择了A5、A6胶体金溶液紫外-可见吸收光谱图，A5、A6胶体金溶液分别对应曲线a、线b。
表2不同胶体金制备金标抗体进而制备的试纸条后检测结果汇总
Figure BDA0001618132600000152
注：阳性结果占阳性粪便比例、阴性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
2.1.1.2金标抗体封闭液的制备
按实施例2.1.1.4中金标抗体制备过程，用不同的金标抗体封闭液(见表3)，封闭金标抗体，之后再匀速搅拌30min。
表3金标抗体封闭液组分汇总
编号 金标抗体封闭液组分
B1 pH7.4的0.1M PBS
B2 pH7.4的0.1M PBS、0.02％V/V Tween-20
B3 pH7.4的0.1M PBS、0.02％V/V Tween-80
B4 pH7.4的0.1M PBS、0.2％W/V BSA
B5 pH7.4的0.1M PBS、1％W/V BSA
B6 pH7.4的0.1M PBS、0.2％W/V BSA、0.02％V/V Tween-20
B7 pH7.4的0.1M PBS、0.2％W/V BSA、0.1％V/V Tween-20
B8 pH7.4的0.1M PBS、0.2％W/V OVA、0.1％V/V Tween-20
B9 pH7.4的0.1M PBS、0.2％W/V胎牛血清、0.1％V/V Tween-20
B10 pH7.4的0.1M PBS、0.2％W/V脱脂奶、0.1％V/V Tween-20
将金标垫(金标抗体含量为25μg/ml，制备金标抗体时所用金标抗体稀释液为C3(见实施例2.1.1.3))、硝酸纤维素膜(按实施例2.1.2制备，固定抗体稀释液为D4)，按实施例2.2所描述的方法依次制备成试纸条B1～B7，并按实施例2.3将样品盘样品用实施例2.1.3制备的样品处理液E4稀释并进行检测，结果见表4，显示：当金标抗体封闭液为B6、B7、B9、B10时制备的金标抗体进而制备的试纸条检测后CPV毒株的灵敏度较高(103.3～104.0TCID50/ml)，检测临床样品与PCR检测结果一致；当金标抗体封闭液为B1、B2、B3、B4、B5时制备的金标抗体进而制备的试纸条检测灵敏度下降(＞104.2TCID50/ml)，且检测临床样品出现非特异反应。
表4不同金标抗体封闭液制备金标抗体后制备的试纸条后检测结果汇总
Figure BDA0001618132600000161
Figure BDA0001618132600000171
注：阳性结果占阳性粪便比例、阴性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
为评价金标抗体制备时金标抗体封闭液中所含BSA的浓度，特在B6、B7的基础上将BSA浓度稀释成终浓度为0.1％、0.2％、1％、1.5％W/V，连同B6、B7进行对比，结果：当金标抗体封闭液中BSA工作浓度为0.1％、1.5％时制备的金标抗体进而制备的试纸条检测CPV的灵敏度均下降10～100倍，且检测阳性粪便、阴性粪便存在假阳性假阴性结果；故而将金标抗体封闭液中BSA的浓度设定为0.2％～1.0％W/V。
为评价金标抗体制备时金标抗体封闭液中所含Tween-20的浓度，特在B6、B7的基础上将Tween-20浓度稀释成终浓度为0.01％、0.15％W/V，连同B6、B7进行对比，结果：当金标抗体封闭液中Tween-20工作浓度为0.01％、0.15％W/V时制备的金标抗体进而制备的试纸条检测CPV的灵敏度均下降10倍，且检测阳性粪便、阴性粪便存在非特异性结果；故而将金标抗体封闭液中Tween-20的浓度设定为0.02％～0.1％W/V。
为评价其它大分子蛋白如OVA、胎牛血清、脱脂奶分别替代BSA进行调试(见表3中B8、B9、B10)，检测结果(见表4)：与含BSA的缓冲液组装试纸条的检测灵敏度相当，一致性较高，表明：其它大分子也可作为缓冲液组分并可达到检测较好的效果。
2.1.1.3金标抗体稀释液的制备
用不同的金标抗体稀释液见表5，重悬以获得金标抗体，将其鉴定后吸附于玻璃纤维膜或聚酯膜，干燥后使用。
表5金标抗体稀释液组分汇总
Figure BDA0001618132600000172
Figure BDA0001618132600000181
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将金标垫(金标抗体含量为25μg/ml，制备金标抗体时所用金标抗体封闭液为B6(见实施例2.1.1.2))、硝酸纤维素膜(按实施例2.1.2制备，固定抗体稀释液为D4)，按实施例2.2所描述的方法依次制备成试纸条C1～C7，并按实施例2.3将样品盘样品用实施例2.1.3制备的样品处理液E4稀释并进行检测，结果见表6，显示：当金标抗体稀释液C3或C4时制备的金标抗体进而制备的试纸条检测后CPV毒株的灵敏度较高(103.5～104.0TCID50/ml)，检测临床样品与PCR检测结果一致性高；当金标抗体封闭液为C1、C2、C5、C6、C7时制备的金标抗体进而制备的试纸条检测灵敏度下降(＞104.2TCID50/ml)，且检测临床样品出现非特异反应强。
表6不同金标抗体稀释液制备金标抗体进而制备的试纸条后检测结果汇总
Figure BDA0001618132600000182
注：阳性结果占阳性粪便比例、阳性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
2.1.1.4金标垫的制备
用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至待标记单克隆抗体的蛋白等电点pI，匀速搅拌30min，按5～50μg/ml加入待标记单克隆抗体，匀速搅拌30min，之后逐滴加入金标抗体封闭液，匀速搅拌30min。置于2～8℃静置2小时后，4℃2000r/min离心30min，弃沉淀，上清于10000r/min继续离心30min，弃上清、取沉淀并用金标抗体稀释液重悬，即为金标抗体。金标抗体外观为红色澄清液体，经紫外分光光度计扫描发现最大吸收峰为515～536(与标记前相应的胶体金最大吸收峰相比红移4～6nm)，经BCA定量金标抗体浓度为25～250μg/ml。将鉴定后的金标抗体吸附于玻璃纤维膜或聚酯膜，干燥后使用。
为评价金标垫制备时金标抗体的使用浓度，特在B6、C3的基础上用金标抗体稀释液将金标抗体稀释成工作浓度为5、10、15、20、25、100、250、280μg/ml以制备试纸条及其检测结果见表7：当金标抗体工作浓度为5μg/ml、280μg/ml时制备的试纸条检测CPV的灵敏度下降25～50倍，且存在非特异性强；而当金标抗体工作浓度为10、15、20、25、100、250μg/ml时制备的试纸条检测灵敏度与C3结果略差或相当，检测阳性粪便、阴性粪便结果均正确率高(＞50％)，故而将金标抗体工作浓度设定为10～250μg/ml，优选25～100μg/ml。
表7不同金标抗体工作浓度制备试纸条后检测结果汇总
Figure BDA0001618132600000191
注：阳性结果占阳性粪便比例、阴性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
2.1.2硝酸纤维素膜的制备
将固定线用固定抗体用固定抗体稀释液(见表8)稀释至0.5～1mg/ml，质控线用pH7.4 0.1M PBS缓冲液或D4稀释至1～3mg/ml，分别吸附于硝酸纤维素膜的一端，两线间距≥5mm，干燥后使用。
表8固定抗体稀释液组分汇总
Figure BDA0001618132600000192
Figure BDA0001618132600000201
将金标垫(金标抗体含量为25μg/ml，制备金标抗体时所用金标抗体封闭液为B6(参见实施例2.1.1.2)、金标抗体稀释液为C3(参见实施例2.1.1.3))、硝酸纤维素膜(按实施例2.1.2制备，固定抗体稀释液为D4)，按实施例2.2所描述的方法依次制备成试纸条D1～D6，并按实施例2.3将样品盘样品用实施例2.1.3制备的样品处理液E4稀释并进行检测，结果见表9，显示：当固标抗体稀释液为D4、D7、D8、D9时制备的硝酸纤维素膜进而制备的试纸条检测后CPV毒株的灵敏度较高(103.5～104.0TCID50/ml)，检测临床样品与PCR检测结果一致；当固标抗体稀释液为D1、D2、D3、D5、D6时制备的硝酸纤维素膜进而制备的试纸条检测灵敏度下降(＞104.2TCID50/ml)，且检测临床样品出现非特异反应。
表9不同固标抗体稀释液制备硝酸纤维素膜进而制备的试纸条后检测结果汇总
Figure BDA0001618132600000202
注：阳性结果占阳性粪便比例、阴性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
为评价其它糖类稳定剂如海藻糖、葡萄糖、山梨醇分别替代蔗糖进行调试(见表8中D7、D8、D9)，检测结果见表9：与含蔗糖的固定抗体稀释液组装试纸条的检测灵敏度相当，一致性较高，表明：其它糖类稳定剂也可作为固定抗体稀释液组分并可达到检测较好的效果。
为评价硝酸纤维素膜制备时固定抗体浓度，用固定抗体稀释液将固定抗体稀释成工作浓度为0.4、0.5、1.0、1.2、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/ml以制备试纸条，结果见表10：当固定抗体工作浓度为0.4、3.5mg/ml时制备的试纸条检测CPV流行株的灵敏度下降25～100倍，且与PCR符合率＜50％，存在严重的非特异现象；而当固定抗体浓度为0.5、1.0、1.2、1.5、2.0、2.5、3.0mg/ml时制备的试纸条检测灵敏度与D4结果略差或相当，检测阳性粪便、阴性粪便结果均正确率较高(与PCR符合率＞50％)，故而将固定抗体工作浓度设定为0.5～3.0mg/ml。
表10不同固定抗体工作浓度制备试纸条后检测结果汇总
Figure BDA0001618132600000211
注：阳性结果占阳性粪便比例、阴性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
2.1.3样品处理液的制备
配制以下样品处理液(见表11)，取样进行外观检测、无菌检验(按现行中国兽药典附录进行)及保存期研究，结果见表11～12。
表11样品处理液所含组分汇总
Figure BDA0001618132600000212
将金标垫(金标抗体含量为25μg/ml，制备金标抗体时所用金标抗体封闭液为B6(参见实施例2.1.1.2)、金标抗体稀释液为C3(参见实施例2.1.1.3))、硝酸纤维素膜(按实施例2.1.2制备，固定抗体稀释液为D4)，按实施例2.2所描述的方法依次制备成试纸条，并按实施例2.3将样品盘样品用实施例2.1.3制备的样品处理液E1～E6分别稀释并进行检测，结果见表12，显示：当样品处理液为E4时制备的试剂盒检测后CPV毒株的灵敏度较高(103.5～104.0TCID50/ml)，检测临床样品与PCR检测结果一致性高；当样品处理液为E1、E2、E3、E5、E6时制备的试剂盒检测灵敏度下降(＞104.2TCID50/ml)，且检测临床样品出现严重的非特异反应。
表12用不同样品处理液制备试剂盒后检测结果汇总
Figure BDA0001618132600000221
注：阳性结果占阳性粪便比例、阳性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
为评价样品处理液中CHAPS的含量，在E4中其他成分保持不变的情况下将CHAPS含量调整为0.05％、0.1％、1.0％、1.5％W/V以制备试剂盒并进行检测，结果：当样品处理液中所含CHAPS为0.05％时制备的试剂盒检测CPV的灵敏度下降10倍；当样品处理液中所含CHAPS为1.5％时制备的试剂盒检测阳性粪便为阴性、阴性粪便为阳性，存在严重的非特异；而当样品处理液中CHAPS含量为0.1％、1.0％时制备的试剂盒检测灵敏度与E4结果相当，检测阳性粪便、阴性粪便结果均正确，故而将样品处理液中CHAPS含量设定为0.1％～1.0％W/V。
为评价样品处理液中皂苷的含量，在E4中其他成分保持不变的情况下将皂苷含量调整为0.05％、0.1％、1.0％、1.5％W/V以制备试剂盒并进行检测，结果：当样品处理液中所含皂苷为0.05％时制备的试剂盒检测CPV的灵敏度下降20倍且检测阴性粪便为阳性；当样品处理液中所含CHAPS为1.5％时制备的试剂盒检测阳性粪便为阴性、阴性粪便为阳性，存在严重的非特异；而当样品处理液中皂苷含量为0.1％、1.0％时制备的试剂盒检测灵敏度与E4结果相当，检测阳性粪便、阴性粪便结果均正确，故而将样品处理液中皂苷含量设定为0.1％～1.0％W/V。
2.2试剂盒的制备方法
胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述金标垫上吸附有金标抗体，所述硝酸纤维素膜上近所述底板第二端的位置包括检测线和质控线，所述检测线上固定化有固定抗体，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述金标抗体的结合体能在其上向底板第二端迁移。
试剂盒制备时，包括以下步骤：
步骤1)用胶体金标记单克隆抗体为金标抗体，用金标抗体封闭液先封闭金标抗体，再用金标抗体稀释液稀释至25～250μg/ml，吸附于玻璃纤维膜或聚酯膜即成金标垫，干燥后使用；
步骤2)固定抗体、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别经固定抗体稀释液稀释至0.5～1mg/ml、1～3mg/ml，分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线、质控线，两线间距≥5mm，干燥后使用；
步骤3)配制样品处理液，分装成1ml/管；
步骤4)将步骤1)所制备的金标垫、步骤2)所制备的的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴底板上，裁剪；连同步骤3)制备的样品处理液组装成试剂盒。
2.3试剂盒的检测方法
试剂盒的检测方法包括：
(1)根据动物疫病抗原的排毒途径采集临床样品，取固体样品0.08～0.5g和/或液体样品500～1500μl溶解于样品处理液中。
(2)将处理后的样品滴加50～150μl至加样孔中，同时迅速按下缓冲液按钮，静置10分钟在检测区观察结果。
结果判定标准：反应10分钟时，若质控线无条带，无论检测线是否有条带结果均无效；若质控线有条带，检测线有条带即为阳性，检测线无条带即为阴性。
根据以上调试结果，本发明仅以此条件(即将胶体金A4、金标抗体封闭液B6、金标抗体稀释液C3、固定抗体稀释液D4组装的试纸条，以及样品处理液E4)为例制备的同类试剂盒及其评价与应用进行详细阐述。
2.4 2种单克隆抗体不同搭配模式制备的试剂盒评价
2.2.1不同搭配模式制备的试剂盒灵敏度比较
将试纸条中的2种单克隆抗体互换位置(见表13)，并用样品盘进行评价，同时用商品化韩国安捷犬细小病毒胶体金检测试纸条进行平行试验，结果见表12：原有2种单抗配对模式制备的试剂盒(见
实施例1，标记为CPV试剂盒2.1)检测样品盘中的样品灵敏度为103.5～104.0TCID50/ml；根据本发明优化后制备的CPV试剂盒2检测样品盘中的灵敏度为103.0～103.3TCID50/ml，比优化前、市售的常用胶体金产品灵敏度高2～10倍；将原有2种单抗配对模式改变后(见表11中CPV试剂盒1)检测灵敏度与“CPV试剂盒2.1”相当或更优，且检测阳性、阴性样品结果均准确，未出现非特异性反应。
表13用不同搭配模式制备试剂盒后检测结果汇总
Figure BDA0001618132600000241
2.2.2不同搭配模式制备的试剂盒特异性检测
将CPV试剂盒1、2、2.1分别检测特异性样品，包括犬瘟热病毒液、犬副流感病毒液、犬腺病毒1型病毒液、犬腺病毒2型病毒液、犬狂犬病毒液、健康犬粪便、犬瘟热病毒阳性犬粪便、犬轮状病毒阳性犬粪便、犬冠状病毒细胞毒样品，结果均为阴性，表明特异性良好。
2.2.3不同搭配模式制备的试剂盒重复性研究
分别将CPV试剂盒1、2用样品盘中样品、特异性样品进行批间、批内重复性研究，结果：CPV试剂盒1、2的批间、批内重复性良好。
2.2.4不同搭配模式制备的试剂盒保存期研究
分别将CPV试剂盒1、2于2～8℃放置6、9、12、15、18、21、24、27个月进行灵敏度、特异性检测，结果：检测结果符合率均为100％，表明试剂盒1、2均可在2～8℃保存24个月甚至27个月。
2.2.5不同搭配模式制备的试剂盒的临床应用
将经PCR鉴定为阳性200份、阴性200份临床样品分别用CPV试剂盒1、2进行检测，结果见表14：CPV试剂盒1检测总符合率为92％，CPV试剂盒2检测总符合率为95％，优于调试前及商品化试剂盒，且可代替操作耗时且繁琐、需要专门的技术人员、专门的仪器设备才能实现的PCR检测方法，进行临床的快速、准确的鉴定。
表14不同试剂盒检测临床样品结果汇总
试剂盒 阳性/鉴定总阳性 阴性/鉴定总阴性 总符合率
CPV试剂盒1 168/200 232/200 92％
CPV试剂盒2 180/200 220/200 95％
CPV试剂盒2.1 164/200 236/200 91％
商品化-韩国安捷CPV试纸条 160/200 240/200 90％
实施例3其他胶体金检测试纸条的制备
为进一步评价实施例2所优化的各个条件能否满足猪、禽、猫、犬其它抗原等动物疫病诊断检测中的应用，特将猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A型流感病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒等逐一进行调试及评价，结果：(1)灵敏度，原有搭配模式制备的试剂盒灵敏度均优于市售或调试前的(高2～20倍)，互换位置后的搭配模式制备的试剂盒灵敏度与原有搭配模式调试前的相当或更优；(2)特异性，均良好，无非特异性现象发生；(3)重复性，均良好；(4)保存期，均满足要求；(5)临床应用效果较好，均能快速、实地、准确地确诊。以下就猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、A型流感病毒为代表进行简要阐述。
3.1猪流行性腹泻病毒胶体金检测试纸条
3.1.1不同搭配模式制备的试剂盒灵敏度比较
将试纸条中的2种单克隆抗体互换位置(见表14)，并用PEDV不同类型毒株(经典株CV777株、变异株HN1301株，见专利CN105461805A)以及RT-PCR鉴定的临床阳性粪便、阴性粪便进行评价，同时用市售商品化韩国安捷PEDV胶体金检测试纸条做比较。结果见表14：原有2种单抗配对模式制备的试剂盒(参见中国专利CN105461805A，标记为PDEV试剂盒2.1)检测样品盘中的样品灵敏度为104.5TCID50/ml；根据本发明优化后制备的PEDV试剂盒2检测样品盘中的灵敏度为103.5～103.8TCID50/ml，比优化前的灵敏度高5～10倍；将原有2种单抗配对模式改变后(见表15中PEDV试剂盒1)检测灵敏度与“PEDV试剂盒2.1”相当或更优，且检测阳性、阴性样品结果均准确，未出现非特异性反应。
表15用不同搭配模式制备试剂盒后检测结果汇总
Figure BDA0001618132600000261
3.2.2不同搭配模式制备的试剂盒特异性检测
将PEDV试剂盒1、2分别检测特异性样品，包括猪圆环病毒2型病毒液、猪繁殖与呼吸综合征病病毒液、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病病毒液、猪细小病毒液、猪伪狂犬病病毒液、猪瘟病毒液，结果均为阴性，表明特异性良好。
3.2.3不同搭配模式制备的试剂盒重复性研究
分别将PEDV试剂盒1、2用样品盘中样品、特异性样品进行批间、批内重复性研究，结果：PEDV试剂盒1、2的批间、批内重复性良好。
3.2.4不同搭配模式制备的试剂盒保存期研究
分别将PEDV试剂盒1、2于2～8℃放置6、9、12、15、18、21、24、27个月进行灵敏度、特异性检测，结果：检测结果符合率均为100％，表明试剂盒1、2均可在2～8℃保存24个月甚至27个月。
3.2.5不同搭配模式制备的试剂盒的临床应用
将经病毒分离鉴定及RT-PCR鉴定为阳性250份、阴性250份临床样品分别用PEDV试剂盒1、2进行检测，结果(见表16)：PEDV试剂盒1检测总符合率为91％，PEDV试剂盒2检测总符合率为94％，均优于原有搭配模式调试前(PEDV试剂盒2.1)的结果，可代替操作耗时且繁琐、需要专门的技术人员、专门的仪器设备才能实现的病毒分离鉴定或RT-PCR检测方法进行临床的快速、准确的鉴定。
表16不同试剂盒检测临床样品结果汇总
试剂盒 阳性/鉴定总阳性 阴性/鉴定总阴性 总符合率
PEDV试剂盒1 205/250 295/250 91％
PEDV试剂盒2 215/250 285/250 93％
PEDV试剂盒2.1 150/250 350/250 80％
安捷PEDV胶体金试纸条 150/250 350/250 80％
3.2猪圆环病毒2型胶体金检测试纸条
3.2.1不同搭配模式制备的试剂盒灵敏度比较
将试纸条中的2种单克隆抗体互换位置见表16，并用PCV2不同亚型毒株以及PCR鉴定的临床阳性血清、阴性血清进行评价，结果(见表16，阳性组织、阴性组织、阳性血清、阴性血清均经PCR鉴定)：原有2种单抗配对模式制备的试剂盒(参见实施例1，标记为PCV2试剂盒2.1)检测样品盘中的样品灵敏度为104.3～104.5TCID50/ml；根据本发明优化后制备的PCV2试剂盒2检测样品盘中的灵敏度为103.3～103.6TCID50/ml，比优化前的灵敏度高5～15倍；将原有2种单抗配对模式改变后(见表17中PCV2试剂盒1)检测灵敏度比“PCV2试剂盒2前”更优，且检测阳性、阴性样品结果均准确，未出现非特异性反应。
表17用不同搭配模式制备试剂盒后检测结果汇总
Figure BDA0001618132600000281
3.2.2不同搭配模式制备的试剂盒特异性检测
将PCV2试剂盒1、2分别检测特异性样品，包括猪圆环病毒1型病毒液、猪繁殖与呼吸综合征病病毒液、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病病毒液、猪细小病毒液、猪伪狂犬病病毒液、猪瘟病毒液、猪流行性腹泻病病毒液，结果均为阴性，表明特异性良好。
3.2.3不同搭配模式制备的试剂盒重复性研究
分别将PCV2试剂盒1、2用样品盘中样品、特异性样品进行批间、批内重复性研究，结果：PCV2试剂盒1、2的批间、批内重复性良好。
3.2.4不同搭配模式制备的试剂盒保存期研究
分别将PCV2试剂盒1、2于2～8℃放置6、9、12、15、18、21、24、27个月进行灵敏度、特异性检测，结果：检测结果符合率均为100％，表明试剂盒1、2均可在2～8℃保存24个月甚至27个月。
3.2.5不同搭配模式制备的试剂盒的临床应用
将经病毒分离鉴定及PCR鉴定为阳性250份、阴性250份临床样品(含血清、研磨后的组织样品)分别用PCV2试剂盒1、2进行检测，结果见表18：PCV2试剂盒1检测总符合率为89％，PCV2试剂盒2检测总符合率为95％，均优于原有搭配模式调试前(PCV2试剂盒2.1)的结果，可代替操作耗时且繁琐、需要专门的技术人员、专门的仪器设备才能实现的病毒分离鉴定或PCR检测方法进行临床的快速、准确的鉴定。
表18不同试剂盒检测临床样品结果汇总
试剂盒 阳性/鉴定总阳性 阴性/鉴定总阴性 总符合率
PCV2试剂盒1 195/250 305/250 89％
PCV2试剂盒2 225/250 275/250 95％
PCV2试剂盒2.1 190/250 310/250 88％
3.3A型流感胶体金检测试纸条
3.3.1不同搭配模式制备的试剂盒灵敏度比较
将试纸条中的2种单克隆抗体互换位置(见表18)，并用流感不同亚型毒株以及动物攻毒试验前、后所采集的微生物拭子(即阴性拭子、阳性拭子)组成的样品盘进行评价，结果见表19～20：原有2种单抗配对模式制备的试剂盒(参见实施例1，标记为IV试剂盒2.1)检测样品盘样品的灵敏度为0.05～0.2HA或105.0～105.8EID50/100μl；根据本发明优化后制备的IV试剂盒2检测样品盘中的灵敏度为0.01～0.1HA或103.8～104.5EID50/100μl，比优化前的检测灵敏度低的样品高2.5～20倍；将原有2种单抗配对模式改变后(见表17中IV试剂盒1)检测灵敏度与“IV试剂盒2.1”相当或更优，且检测阳性、阴性样品结果均准确，未出现非特异性反应。
表19用不同搭配模式制备试剂盒
Figure BDA0001618132600000291
表20用不同搭配模式制备试剂盒检测结果汇总
Figure BDA0001618132600000292
Figure BDA0001618132600000301
3.3.2不同搭配模式制备的试剂盒特异性检测
将IV试剂盒1、2分别检测特异性样品，包括阴性SPF鸡的咽、泄殖腔拭子样品，健康鸡的咽、泄殖腔拭子样品，健康猪的鼻咽拭子样品，健康犬的鼻咽拭子样品，结果均为阴性，表明特异性良好。
3.3.3不同搭配模式制备的试剂盒重复性研究
分别将IV试剂盒1、2用样品盘中样品、特异性样品进行批间、批内重复性研究，结果：IV试剂盒1、2的批间、批内重复性良好。
3.3.4不同搭配模式制备的试剂盒保存期研究
分别将IV试剂盒1、2于2～8℃放置6、9、12、15、18、21、24、27个月进行灵敏度、特异性检测，结果：检测结果符合率均为100％，表明试剂盒1、2均可在2～8℃保存24个月甚至27个月。
3.3.5不同搭配模式制备的试剂盒的临床应用
将经SPF鸡胚接种病毒分离方法和RT-PCR方法鉴定为阳性200份、阴性200份临床样品分别用IV试剂盒1、2、2.1进行检测，结果见表21：IV试剂盒1检测总符合率为90％，IV试剂盒2检测总符合率为92％，均优于原有搭配模式检测的符合率85％，可代替操作耗时且繁琐、需要专门的技术人员、专门的仪器设备才能实现的SPF鸡胚接种病毒分离鉴定或PCR检测方法进行临床的快速、准确的鉴定。
表21不同试剂盒检测临床样品结果汇总
试剂盒 阳性/鉴定总阳性 阴性/鉴定总阴性 总符合率
IV试剂盒1 160/200 240/200 90％
IV试剂盒2 168/200 232/200 92％
IV试剂盒2.1 140/200 260/200 85％
综上所述，本发明制备的金标抗体封闭液、金标抗体稀释液、固定抗体稀释液、样品处理液组合使用时能使以双单抗夹心原理制备的层析类试纸条如胶体金检测试纸条所用到的固定、标记的2种单克隆抗体位置实现互换，完成用不同搭配模式2种单克隆抗体的制备的产品，并且检测样品后并不引起非特异反应并适当提高灵敏度。
实施例4样品处理液替换商品化样品处理液后检测样品结果
将实施例2-3中的商品化试纸条即韩国安捷CPV试纸条、上海快灵CPV胶体金检测试纸条、北京天恩泰CPV胶体金检测试纸条、以及韩国安捷PEDV试纸条中的样品处理液更换为实施例2.1.3制备的样品处理液E4，并对相应的样品进行检测，结果见表22，检测阳性样品更为准确，总符合率更高。
表22商品化试剂盒中样品处理液更换后检测效果
Figure BDA0001618132600000311
注：*表示更换了相应的样品处理液。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 洛阳中科基因检测诊断中心有限公司
<120> 一种双抗夹心胶体金检测试剂盒、及其制备方法与应用
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Thr Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Arg Tyr Gly Asn Tyr Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
115
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 3
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Pro Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Asp Gly Thr Trp Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Thr Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Arg Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Asn
100 105
<210> 5
<211> 114
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 5
Met Cys Ser Trp Trp Ser Pro Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ala Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Pro Phe Ala Tyr Trp Gly His Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ala
<210> 6
<211> 113
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Glu Asn His Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 7
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asn Gly Asp Val Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Leu Tyr Asp Gly Tyr Tyr Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
115 120
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Asn Phe Asp Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 9
<211> 147
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 9
Met Ala Trp Leu Val Leu Phe Phe Cys Leu Trp Thr Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
Ile Leu Ser Gln Val Gln Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
20 25 30
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Ile Trp Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Gly Tyr Gly Val His Val Val Lys Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Val Leu Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser
65 70 75 80
Thr Leu Arg Ser Lys Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asp Ser Arg Ser Gln
85 90 95
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Lys Val Asp Tyr Asn Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Val Gly
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130 135 140
Ser Ile His
145
<210> 10
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<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 10
Met Lys Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Val Phe Leu
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Gly Ala Lys Cys Asp Trp Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Ile Trp Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly
35 40 45
Thr Asn Ile Asn Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Arg Ala Pro
50 55 60
Asn Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Lys Val Ser Gly Ser Lys Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Glu Asp Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Pro Gln Gln Ser
100 105 110
Tyr Leu Pro Lys Gly Lys Ser Val Glu Ala Pro Lys Val Lys Ser Asn
115 120 125
Gly Leu Met Leu His Gln Leu Tyr Pro Ser Ser His His Pro
130 135 140
<210> 11
<211> 137
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 11
Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly Trp Leu Ser Glu Trp Gln Leu
1 5 10 15
Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Trp Arg Pro Gly Thr Ser Val Arg Ile
20 25 30
Ser Cys Arg Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Val
35 40 45
Val Arg Gln Ser His Val Arg Ser Leu Glu Trp Ile Gly Lys Ile Asn
50 55 60
Pro Tyr Asp Gly Trp Ser Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Arg Asp Lys Ala
65 70 75 80
Ser Leu Thr Trp Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu His
85 90 95
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Lys Asn Tyr
100 105 110
Gly Tyr Asp Gly Ala Met Ala Tyr Val Gly Gln Gly Thr Ser Trp Thr
115 120 125
Val Ser Ser Ala Arg Thr Thr Pro Pro
130 135
<210> 12
<211> 131
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 12
Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser Trp Ile Met Ser Lys Gly
1 5 10 15
Gln Ile Trp Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
20 25 30
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu His Val Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Val
50 55 60
Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Lys Phe Ser
65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
85 90 95
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Leu Ser Pro
100 105 110
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Lys Ala Asp Ala
115 120 125
Ala Pro Thr
130
<210> 13
<211> 117
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 13
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ile Ser Gly Leu Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Phe Asp Pro Val Asn Val Asn Ser Lys Tyr Asp Pro Lys Tyr
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asn Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 14
Asp Val Val Met Thr Pro Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Val Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Phe Ala Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 15
Val Phe Ala Ser Gly Ala His Gly Glu Gly Val Met Ile Arg Thr Thr
1 5 10 15
Lys Phe Gly Lys Arg Ser Pro Gly Val His Leu Val Asp Met Lys Met
20 25 30
Trp Val Asn Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Thr Asn Asn Glu Val Ser Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asp Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Asp Ser Ser Gly Tyr Val Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 16
Asp Thr Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Ile Ser Thr Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Thr Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Phe
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Arg Lys Ser Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Lys Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (15)

1.一种双抗夹心法胶体金检测的试剂盒，其中，所述试剂盒包括双抗夹心法胶体金测试纸条和样品处理液；所述双抗夹心法胶体金测试纸条上的金标抗体使用金标抗体封闭液处理，所述金标抗体封闭液由pH7.4 0.1M PBS溶液、0.2%～1.0%W/V大分子蛋白和0.02%～1.0%W/VTween-20组成，所述大分子蛋白为BSA、OVA、胎牛血清、脱脂奶中的任一种；
所述金标抗体使用金标抗体稀释液稀释，所述金标抗体稀释液由pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1%V/V PEG4000和0.02%V/V Proclin300组成，或由pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1%V/VPEG6000、0.02%V/V Proclin300组成；以及
所述双抗夹心法胶体金测试纸条上的固定抗体使用固定抗体稀释液稀释，所述固定抗体稀释液由pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5%V/V糖类稳定剂和0.1%V/V Triton-X 100组成，所述糖类稳定剂为蔗糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇中的任一种。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述金标抗体封闭液为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.2%～1.0%W/V BSA、0.02%～1.0%W/V Tween-20。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述固定抗体稀释液为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5%V/V蔗糖、0.1%V/V Triton-X 100。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条上包被有金标抗体，所述金标抗体标记的胶体金其胶体金溶液最大吸收峰为515～530nm、最大吸收峰对应的ODmax值为0.9～1.1、0.75×ODmax值对应的吸收峰峰间距为55～72nm。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述金标垫上吸附有金标抗体，所述硝酸纤维素膜上近所述底板第二端的位置包括检测线和质控线，所述检测线上固定化有固定抗体，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述金标抗体的结合体能在其上向底板第二端迁移。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述金标抗体溶解于金标抗体稀释液中的浓度为10～250μg/ml。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述金标抗体溶解于金标抗体稀释液中的浓度为25～100μg/ml；所述固定抗体、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别经固定抗体稀释液稀释至0.5～3mg/ml、1～3mg/ml。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述检测线和质控线两线间距≥5mm。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述双抗为CCTCC No: C2014198小鼠杂交瘤细胞3G12分泌的猪圆环病毒2型单克隆抗体3G12，和CCTCC No: C2014199小鼠杂交瘤细胞2F8分泌的猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8；或者
所述双抗为猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB2，和猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1，所述单克隆抗体PEDV-McAB2重链可变区为SEQ ID No.1所示，轻链可变区为SEQ ID No.2所示，所述单克隆抗体PEDV-McAB1重链可变区为SEQ ID No.3所示，轻链可变区为SEQ ID No.4所示；或者
所述双抗为猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-3D2，和猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-4B4，所述单克隆抗体TGEV-3D2重链可变区为SEQ ID No.5所示，轻链可变区为SEQ ID No.6所示，所述单克隆抗体TGEV-4B4重链可变区为SEQ ID No.7所示，轻链可变区为SEQ ID No.8所示；或者
所述双抗为抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体IV-McAB1，和抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体IV-McAB2，所述单克隆抗体IV-McAB1重链可变区为SEQ ID No.9所示，轻链可变区为SEQ ID No.10所示，所述单克隆抗体IV-McAB2重链可变区为SEQ ID No.11所示，轻链可变区为SEQ ID No.12所示；或者
所述双抗为CCTCC No: C201578小鼠骨髓杂交瘤细胞10B11株分泌的犬细小病毒单克隆抗体CPV-10B11，和CCTCC No: C201579小鼠骨髓杂交瘤细胞10H4株分泌的犬细小病毒单克隆抗体CPV-10H4；或者
所述双抗为CCTCC No：C2015201小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5分泌的犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-1G5，和CCTCC No：C2015202小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌的犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-6E11；或者
所述双抗为犬腺病毒单克隆抗体CAV-5G4，和犬腺病毒单克隆抗体CAV-1A1，所述单克隆抗体CAV-5G4重链可变区为SEQ. ID No.13所示，轻链可变区为SEQ. ID No.14所示，所述单克隆抗体CAV-1A1重链可变区为SEQ. ID No.15所示，轻链可变区为SEQ. ID No.16所示。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述样品处理液为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1%～1.0%W/V CHAPS、0.1%～1.0%W/V皂苷、0.02%V/V Proclin300。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中，所述样品处理液为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5%W/V CHAPS、0.5%W/V皂苷、0.02%V/V Proclin300。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其中，所述样品处理液1ml溶解固体样品0.08～0.5g和/或所述样品处理液1ml溶解液体样品500～1500μl；所述样品选自组织、血清、肛门分泌物、咽鼻分泌物、眼鼻分泌物、病毒培养物。
13.一种制备权利要求1所述的双抗夹心法胶体金检测的试剂盒的方法，其中，所述方法包括：
步骤（1）用胶体金标记单克隆抗体为金标抗体，用所述金标抗体封闭液封闭所述金标抗体，再用所述金标抗体稀释液稀释所述金标抗体至10～250μg/ml，然后将所述金标抗体吸附于玻璃纤维膜或聚酯膜即成金标垫，干燥后使用；
步骤（2）固定抗体、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别经所述固定抗体稀释液稀释至0.5～3mg/ml、1～3mg/ml，分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线、质控线，所述检测线、质控线两线间距≥5mm，干燥所述硝酸纤维素膜；
步骤（3）配制样品处理液，分装；以及
步骤（4）将所述步骤（1）所制备的金标垫、所述步骤（2）制备的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴底板上，裁剪；连同所述步骤（3）制备的样品处理液组装成试剂盒。
14.一种样品处理液，其中，所述样品处理液为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1%～1.0%W/VCHAPS、0.1%～1.0%W/V皂苷、0.02%V/V Proclin300。
15.根据权利要求14所述的样品处理液，其中，所述样品处理液为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5%W/V CHAPS、0.5%W/V皂苷、0.02%V/V Proclin300。
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