PL210841B1 - Sposób wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247 - Google Patents

Sposób wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247

Info

Publication number
PL210841B1
PL210841B1 PL370772A PL37077202A PL210841B1 PL 210841 B1 PL210841 B1 PL 210841B1 PL 370772 A PL370772 A PL 370772A PL 37077202 A PL37077202 A PL 37077202A PL 210841 B1 PL210841 B1 PL 210841B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
mixture
cyclosporin
isomers
isatx247
isomer
Prior art date
Application number
PL370772A
Other languages
English (en)
Other versions
PL370772A1 (pl
Inventor
Selvaraj Naicker
Randall W. Yatscoff
Robert T. Foster
Mark Abel
Seetharaman Jayaraman
Hans-Jurgen Mair
Jean-Michel Adam
Bruno Lohri
Original Assignee
Isotechnika Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isotechnika Inc filed Critical Isotechnika Inc
Publication of PL370772A1 publication Critical patent/PL370772A1/pl
Publication of PL210841B1 publication Critical patent/PL210841B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0087—Galenical forms not covered by A61K9/02 - A61K9/7023
    • A61K9/0095—Drinks; Beverages; Syrups; Compositions for reconstitution thereof, e.g. powders or tablets to be dispersed in a glass of water; Veterinary drenches
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4841—Filling excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/4858—Organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 370772 (22) Data zgłoszenia: 17.10.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
17.10.2002, PCT/CA02/001559 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
24.04.2003, WO03/33526 (11) 210841 (13) B1 (51) Int.Cl.
C07K 7/64 (2006.01) C07K 7/00 (2006.01) A61K 38/13 (2006.01)
Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54)
Sposób wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247
(73) Uprawniony z patentu: ISOTECHNIKA PHARMA INC., Edmonton, CA
(30) Pierwszeństwo: 19.10.2001, US, 60/346,201 (72) Twórca(y) wynalazku:
05.04.2002, US, 60/370,596 SELVARAJ NAICKER, Edmonton, CA
(43) Zgłoszenie ogłoszono: RANDALL W. YATSCOFF, Edmonton, CA ROBERT T. FOSTER, Edmonton, CA MARK ABEL, Edmonton, CA
30.05.2005 BUP 11/05 SEETHARAMAN JAYARAMAN, Edmonton, CA
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: HANS-JURGEN MAIR, Lorrach, DE JEAN-MICHEL ADAM, Reinach, BL, CH BRUNO LOHRI, Reinach, BL, CH
30.03.2012 WUP 03/12 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Zofia Sulima
PL 210 841 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247 (mieszaniny izomerów analogów cyklosporyny, pokrewnych cyklosporynie A).
Uważa się, że mieszaniny te odznaczają się zwiększoną skutecznością i/lub zmniejszoną toksycznością, w porównaniu z pojedynczymi izomerami oraz z występującymi w naturze i innymi obecnie znanymi cyklosporynami i pochodnymi cyklosporyn.
Pochodne cyklosporyny tworzą grupę cyklicznych polipeptydów składających się z jedenastu aminokwasów, wytwarzanych jako wtórne metabolity przez gatunek grzyba Tolypocladium inflatum Gams. Stwierdzono, że odwracalnie hamują one immunokompetentne limfocyty, zwłaszcza limfocyty T, w fazie G0 lub G1 cyklu komórkowego. Stwierdzono również , że pochodne cyklosporyny odwracalnie hamują wytwarzanie i uwalnianie limfokin (Granelli-Piperno i in., 1986). Chociaż znane są liczne pochodne cyklosporyny, to najszerzej stosuje się cyklosporynę A. Hamujące działania cyklosporyny A związane są z hamowaniem zdarzeń aktywacyjnych, w których pośredniczą komórki T. To hamowanie dokonywane jest przez wiązanie się cyklosporyny z wszechobecnym wewnątrzkomórkowym białkiem, cyklofiliną. Z kolei kompleks ten hamuje zależną od wapnia i kalmoduliny aktywność kalcyneuryny jako fosfatazy serynowo-treoninowej. Hamowanie kalcyneuryny zapobiega aktywacji czynników transkrypcyjnych, takich jak NFATp/c i NF-κΒ, koniecznych do indukcji genów cytokinowych (IL-2, IFN-γ, IL-4 i GM-CSF) podczas aktywacji komórek T. Cyklosporyna hamuje również wytwarzanie limfokiny przez komórki pomocnicze T in vitro i zatrzymuje rozwój dojrzałych komórek CD8 i CD4 w grasicy (GranelliPiperno i in., 1986). Inne właściwości in vitro cyklosporyny obejmują hamowanie limfocytów T wytwarzających IL-2 i cytoksycznych limfocytów T, hamowanie IL-2 uwalnianych przez aktywowane komórki T, hamowanie spoczynkowych limfocytów T w odpowiedzi na aloantygeny i egzogenną limfokinę, hamowanie wytwarzania IL-1 oraz hamowanie aktywacji przez mitogen limfocytów T wytwarzających IL-2 (Granelli-Piperno i in., 1986).
Wykazano, że cyklosporyna jest silnym środkiem immunosupresyjnym tłumiącym odporność humoralną i reakcje immunologiczne za pośrednictwem komórek, takie jak odrzucanie aloprzeszczepów, opóźniona nadwrażliwość, doświadczalne alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia, zapalenie stawów wywołane adiuwantem Freunda i reakcja przeszczepu przeciwko gospodarzowi. Stosuje się ją do profilaktyki w celu zapobieżenia odrzucania narządów po przeszczepach narządów; do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów; do leczenia łuszczycy; oraz do leczenia innych chorób autoimmunologicznych, w tym cukrzycy typu I, choroby Crohna, tocznia i tym podobnych chorób.
Od odkrycia cyklosporyny wyodrębniono i zidentyfikowano bardzo wiele różnych cyklosporyn występujących w naturze, a także wiele cyklosporyn wytworzono na drodze pełnej lub częściowej syntezy, albo z zastosowaniem zmodyfikowanych metod hodowli. Grupa obejmująca cyklosporyny jest zatem obecnie grupą znaczącą i obejmuje np. występujące w naturze cyklosporyny A do Z [Traber i in., (1977); Traber i in., (1982); Kobel i in., (1982); oraz von Wartburg i in., (1986)], jak również różne niewystępujące w naturze pochodne cyklosporyny oraz nienaturalne lub syntetyczne cyklosporyny, w tym dihydro- i izocyklosporyny; pochodne cyklosporyn (np. w których atom 3'-O grupy -MeBmt- jest acylowany lub inny podstawnik jest wprowadzony przy atomie węgla α w grupie sarkozylowej w pozycji 3); cyklosporyny, w których grupa -MeBmt- występuje w postaci izomerycznej (czyli w której konfiguracja pomiędzy pozycjami 6' i 7' grupy -MeBmt- jest raczej cis, a nie trans); oraz cyklosporyny, w których alternatywne aminokwasy są wprowadzone w określonych pozycjach sekwencji peptydowej, z wykorzystaniem np. totalnej syntezy cyklosporyn opracowanej przez R. Wengera, patrz np. Traber i in. (1977), Traber i in. (1982) oraz Kobel i in. (1982); opisy patentowe US nr 4108985, 4210581, 4220641, 4288431, 4554351 i 4396542; europejskie opisy patentowe nr 0034567 i 0056782; publikacja międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 86/02080; Wenger (1983); Wenger (1985); oraz Wenger (1986). O analogach cyklosporyny A zawierających zmodyfikowane aminokwasy w pozycji 1 doniósł Rich i in. (1986). Immunosupresyjne, przeciwzapalne i przeciwpasożytnicze anologi cyklosporyny A opisano w opisach patentowych US nr 4384996, 4771122, 5284826 i 5525590 (uprawniony Sandoz). Dodatkowe analogi cyklosporyny ujawniono w WO 99/18120 (uprawniony Isotechnika Inc.).
Obserwuje się liczne działania niepożądane związane z terapią cyklosporyną A, w tym nefrotoksyczność, toksyczność w stosunku do wątroby, powodowanie zaćmy, nadmierne owłosienie, paratezję i rozrost dziąseł (Sketris i in., 1995). Z wymienionych, jednym z najpoważniejszych działań niepożądanych jest nefrotoksyczność, zależna od wielkości dawki podawanej cyklosporyny A. Leki o naPL 210 841 B1 tychmiastowym uwalnianiu cyklosporyny A (np. Neoral® i Sandimmune®) mogą powodować nefrotoksyczność i inne toksyczne działania uboczne, ze względu na szybkie uwalnianie i wchłanianie, a zatem i wysokie stężenie leku we krwi. Postuluje się, że działania uboczne związane są z maksymalnymi stężeniami leku (Bennett, 1998). Dokładny mechanizm powodowania przez cyklosporynę A uszkodzeń nerek nie jest znany. Jednakże wysunięto hipotezę, że wzrost poziomu substancji zwężających naczynia w nerkach prowadzi do zwężenia doprowadzających tętniczek kłębkowych. Rezultatem tego może być niedokrwienie nerek, zmniejszenie szybkości filtracji kłębkowej i w długim okresie zwłóknienie śródmiąższowe. Jeśli dawka jest zmniejszana lub cyklosporyna zastępowana jest innym środkiem immunosupresyjnym, to działanie nerek ulega poprawie (Valantine i Schroeder, 1995).
W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na skuteczne środki immunosupresyjne o zmniejszonej toksyczności.
Analogi cyklosporyny zawierające zmodyfikowane aminokwasy w pozycji 1 ujawniono w WO 99/18120 (uprawnieni Isotechnika Inc. i Hoffman-La Roche, Ltd.). Również w WO 03/033527 (uprawnieni Isotechnika Inc. i Hoffmann-La Roche, Ltd.) ujawniono szczególnie korzystny analog cyklosporyny A oznaczony jako „ISATX247. Analog ten jest strukturalnie identyczny z cyklosporyną A, z wyjątkiem modyfikacji grupy aminokwasowej w pozycji 1. Stwierdzono, że pewne mieszaniny izomerów cis i trans ISATX247 odznaczają się jednocześnie zwiększoną skutecznością działania i zmniejszoną toksycznością, w porównaniu do występujących w naturze i znanych obecnie cyklosporyn. Ujawniono również pewne alkilowane, arylowane i deuterowane pochodne ISATX247.
Typowo mieszaniny ujawnione w WO 03/033527 zawierają około 10 - 90% wag. izomeru trans i około 90 - 10% wag. izomeru cis. W innej postaci mieszanina zawiera około 15 - 85% wag. izomeru trans i około 85 - 15% wag. izomeru cis; w innej postaci mieszanina zawiera około 25 - 75% wag. izomeru trans i około 75 - 25% wag. izomeru cis; w innej postaci mieszanina zawiera około 35 - 65% wag. izomeru trans i około 65 - 35% wag. izomeru cis; w innej postaci mieszanina zawiera około 45 - 55% wag. izomeru trans i około 55 - 45% wag. izomeru cis. W jeszcze innej postaci mieszanina izomerów jest mieszaniną ISATX247, zawierającą około 45 - 50% wag. izomeru trans i około 50 - 55% wag. izomeru cis. Procentowe udziały wagowe podane są w przeliczeniu na całkowitą masę kompozycji. Innymi słowy, mieszanina może zawierać 65% wag. izomeru (E) i 35% wag. izomeru (Z) lub vice versa. W alternatywnej nomenklaturze izomer cis można określić jako izomer (Z), a izomer trans można nazwać izomerem (E).
W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na sposoby wytwarzania analogów cyklosporyny, w tym izomerów ISATX247. Potrzebne są szlaki syntetyczne prowadzą ce do wytworzenia kompozycji wzbogaconych w poszczególne izomery, jak również mieszanin izomerów o pożądanym stosunku dwóch izomerów. Potrzebne są także sposoby wytwarzania pochodnych ISATX247.
Cyklosporyna i jej analogi należą do klasy cyklicznych polipeptydów o silnym działaniu immunosupresyjnym. Pomimo wielu korzyści jakie oferują te leki ze względu na ich działanie immunosupresyjne, przeciwzapalne i przeciwpasożytnicze, występują liczne działania niepożądane związane z terapią cyklosporyną A, obejmują ce nefrotoksyczność i toksyczność w stosunku do wą troby. Z tego względu istnieje zapotrzebowanie na nowe środki immunosupresyjne o takim samym działaniu farmakologicznym, jakie wykazuje występująca w naturze cyklosporyna A, ale bez towarzyszących toksycznych działań ubocznych.
Zgodnie z wynalazkiem uzyskano pewne mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, które są farmaceutycznie użyteczne. Mieszaniny izomerów ISATX247 odznaczają się jednocześnie zwiększoną skutecznością działania i zmniejszoną toksycznością, w porównaniu do występujących w naturze i znanych obecnie cyklosporyn.
Wynalazek opiera się częściowo na ustaleniu, że pewne mieszaniny izomerów analogów cyklosporyny zapewniają doskonałe działanie immunosupresyjne, bez niepożądanych działań związanych z cyklosporyną A. W szczególności nieoczekiwanie stwierdzono, że mieszaniny izomerów (czyli mieszaniny izomerów cis i trans) w stosunku od około 10:90 do około 90:10 (trans do cis) analogów cyklosporyny ze zmodyfikowaną grupą aminokwasową w pozycji 1 zapewniają doskonałą skuteczność i bezpieczeństwo. Przykłady takich analogów ujawniono w WO 99/18120 i obejmują związki deuterowane i niedeuterowane. Stwierdzono w szczególności, że wyjątkowo skuteczne są mieszaniny o stosunku około 45:55 do około 50:50 (trans do cis) oraz zawierające około 50 - 55% izomeru trans i około 45 - 50% izomeru cis. Ponadto wykazano, że te mieszaniny izomerów odznaczają się jednocześnie doskonałą skutecznością działania i zmniejszoną toksycznością, w porównaniu do występujących w naturze i znanych obecnie cyklosporyn i pochodnych cyklosporyn.
PL 210 841 B1
Szczególny analog (określany tu jako „ISATX247) jest strukturalnie podobny do cyklosporyny A, z wyjątkiem zmodyfikowanej grupy funkcyjnej na obrzeż u cząsteczki, w grupie aminokwasowej w pozycji 1. Strukturę tej konkretnej mieszaniny izomerycznych analogów, w porównaniu do struktury cyklosporyny A, przedstawiono na fig. 1A, 1B, 2A i 2B.
Mieszaniny izomerów mogą być stosowane między innymi do immunosupresji i pomocy w różnych immunologicznych zaburzeniach, chorobach i stanach, w tym w profilaktyce, ograniczaniu, łagodzeniu i leczeniu.
Izomery ISATX247 (i ich pochodne) można syntetyzować stereoselektywnymi sposobami, mogącymi różnić się stopniem selektywności. Stereoselektywnymi sposobami otrzymuje się kompozycje wzbogacone w izomer (E) lub (Z), przy czym kompozycje te można łączyć ze sobą w taki sposób, że powstała mieszanina ma pożądany stosunek dwóch izomerów. Alternatywnie warunki reakcji stereoselektywnej syntezy można dostosować tak, aby otrzymać pożądany stosunek bezpośrednio w wytwarzanej mieszaninie. Procentową zawartość jednego lub drugiego izomeru można sprawdzić metodą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub innymi znanymi metodami.
Każdy ze szlaków typowo przebiega z zastosowaniem grupy zabezpieczającej wrażliwą alkoholową grupę funkcyjną. W jednej z postaci alkohol zabezpiecza się jako octan. W innych postaciach grupami zabezpieczającymi są ugrupowania estrów benzoesanowych lub eterów sililowych. Chociaż octanowe grupy zabezpieczające są powszechnie stosowane, należy zwrócić uwagę, że w wielu przykładowych opisanych postaciach można uniknąć pewnych niepożądanych reakcji ubocznych związanych z octanową grupą zabezpieczającą, przez użycie grup zabezpieczających, takich jak ugrupowania estrów benzoesanowych lub eterów sililowych.
Zabezpieczony związek może następnie służyć jako prekursor dla różnych steroselektywnych sposobów syntezy, w tym syntez z zastosowaniem reagentów zawierających fosfor, biorących udział w reakcji Wittiga, oraz pierwiastków nieorganicznych wchodzą cych w skł ad reagentów metaloorganicznych. Ten drugi typ może przebiegać przez sześcioczłonowe pierścieniowe stany przejściowe, w których zawada przestrzenna decyduje o rezultacie konfiguracyjnym. Dostępnych jest wiele reagentów metaloorganicznych, w tym cechujących się obecnością pierwiastków, takich jak bor, krzem, tytan, lit i siarka. Poszczególne izomery mogą być wytworzone z pojedynczego prekursora lub z wielu prekursorów.
Stosunek izomerów (E) do (Z) w dowolnej mieszaninie, niezależnie czy wytwarzanej stereoselektywnie czy nie-stereoselektywnie, może przyjmować szeroki zakres wartości. Przykładowo, mieszanina może zawierać około 10 - 90% wag. izomeru (E) i około 90 - 10% wag. izomeru (Z). W innych postaciach mieszanina może zawierać około 15 - 85% wag. izomeru (E) i około 85 - 15% wag. izomeru (Z). W innej postaci mieszanina zawiera około 25 - 75% wag. izomeru (E) i około 75 - 25% wag. izomeru (Z). W innej postaci mieszanina zawiera około 35 - 65% wag. izomeru (E) i około 65 - 35% wag. izomeru (Z). W innej postaci mieszanina zawiera około 45 - 55% wag. izomeru (E) i około 55 - 45% wag. izomeru (Z). W jeszcze innej postaci mieszanina izomerów jest mieszaniną ISATX247, zawierającą około 45 - 50% wag. izomeru (E) i około 50 - 55% wag. izomeru (Z). Procentowe udziały wagowe podane są w przeliczeniu na całkowitą masę kompozycji i należy rozumieć, że suma procentów wagowych izomeru (E) i izomeru (Z) wynosi 100% wag. Innymi słowy, mieszanina może zawierać 65% wag. izomeru (E) i 35% wag. izomeru (Z) lub vice versa.
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, w którym szlak syntezy obejmuje etapy (a) ogrzewania acetylo-n-chlorowcocyklosporyny A z pierwszym związkiem wybranym z grupy obejmującej triarylofosfinę, trialkilofosfinę, aryloalkilofosfinę i triaryloarsynę, z wytworzeniem związku pośredniego;
(b) wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu, przez zmieszanie związku pośredniego z formaldehydem; oraz (c) wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, przez podziałanie zasadą na mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu.
Korzystnie jako acetylo-n-chlorowcocyklosporynę A stosuje się acetylo-n-bromocyklosporynę A.
Korzystnie sposób obejmuje dodatkowo etap chlorowcowania atomu węgla η w bocznym łańcuchu grupy aminokwasowej w pozycji 1 cyklosporyny A, w reakcji bromowania prowadzonej przez ogrzewanie w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin acetylocyklosporyny A z N-bromosukcynoimidem i azo-bisizobutyronitrylem.
PL 210 841 B1
W korzystnym sposobie pierwszy zwią zek stanowi trifenylofosfina, a zwią zek poś redni stanowi halogenek trifenylofosfoniowy acetylocyklosporyny A.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, w którym szlak syntezy obejmuje etapy (a) przeprowadzania aldehydu acetylocyklosporyny A w mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo1,3-dienu, w reakcji Wittiga aldehydu acetylocyklosporyny A z ylidem fosforowym, ewentualnie w obecnoś ci halogenku litu; oraz (b) wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, przez podziałanie zasadą na mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu.
Korzystnie w reakcji Wittiga stosuje się ylid fosforowy otrzymany ze związku wybranego z grupy obejmującej trifenylofosfinę, triarylofosfinę, trialkilofosfinę i aryloalkilofosfinę.
Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, w którym szlak syntezy obejmuje etapy (a) zabezpieczania β-alkoholu cyklosporyny A przez wytworzenie pierwszego związku pośredniego, acetylocyklosporyny A;
(b) utleniania acetylocyklosporyny A, z wytworzeniem drugiego związku pośredniego, aldehydu acetylocyklosporyny A;
(c) przeprowadzania pośredniego aldehydu acetylocyklosporyny A do mieszaniny izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu, drogą reakcji Wittiga tego związku pośredniego z ylidem fosforowym, ewentualnie w obecności halogenku litu; oraz (d) wytwarzanie mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, przez podziałanie zasadą na mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu.
Korzystnie etap utleniania prowadzi się z użyciem środka utleniającego wybranego z grupy obejmującej ozon, nadmanganian potasu, tetratlenek rutenu, tetratlenek osmu, tetratlenek osmu osadzony na polimerze i chlorek rutenu.
Korzystnie środki utleniające, tetratlenek rutenu i chlorek rutenu, stosuje się ze współutleniaczem wybranym z grupy obejmującej nadjodan i podchloryn.
Równie korzystnie środki utleniające, tetratlenek rutenu i chlorek rutenu, stosuje się z acetonitrylem.
Korzystnie w powyższych sposobach na acetylo-1,3-dien działa się zasadą wybraną z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglanu potasu, alkoholan sodu i alkoholan potasu.
Korzystnie w pierwszym sposobie związek pośredni stanowi bromek trifenylo- lub trialkilofosfoniowy acetylocyklosporyny A i w którym etap mieszania związku pośredniego z formaldehydem prowadzi się w obecności halogenku litu.
Korzystnie w drugim i trzecim sposobie wytwarzania aldehydu cyklosporyny A obejmuje etapy (a) zabezpieczania β-alkoholu cyklosporyny A przez utworzenie acetylocyklosporyny A; oraz (b) utleniania acetylocyklosporyny A ozonem jako środkiem utleniającym, a następnie obróbka środkiem redukującym.
Korzystnie etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80°C do 0°C.
Także korzystnie stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej trialkilofosfiny, triarylofosfiny i trialkiloaminy, lub środek redukujący wybrany z grupy obejmującej sulfidy alkiloarylowe, tiosiarczany i sulfidy dialkilowe.
Szczególnie korzystnie jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy, tributylofosfinę, trialkiloaminę, trietyloaminę.
Korzystnie w ozonolizie acetylocyklosporyny A jako rozpuszczalnik stosuje się niższy alkohol.
Szczególnie korzystnie jako alkohol stosuje się metanol.
Korzystnie w ozonolizie stosuje się rozpuszczalnik wybrany z grupy obejmującej dichlorometan oraz mieszaninę dichlorometanu i niższego alkoholu.
Korzystnie jako niższy alkohol stosuje się metanol.
Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, w którym szlak syntezy obejmuje etapy (a) przeprowadzania pośredniego związku, aldehydu acetylocyklosporyny A, w mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu, drogą reakcji związku pośredniego z ylidem fosforowym wytworzonym z halogenku tributyloallilofosfoniowego lub halogenku trifenylofosfoniowego w reakcji Wittiga, ewentualnie w obecności halogenku litu; oraz (b) wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, przez podziałanie zasadą na mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu.
PL 210 841 B1
Korzystnie halogenek fosfoniowy stanowi bromek fosfoniowy.
Korzystnie reakcję Wittiga prowadzi się w rozpuszczalniku wybranym z grupy obejmującej tetrahydrofuran i toluen, przy czym rozpuszczalnik stosuje się w obecności związku wybranego z grupy obejmującej butylolit, niższy alkoholan sodu, niższy alkoholan potasu i węglan, w temperaturze od około -80°C do 110°C.
Korzystnie jako niższy alkoholan potasu stosuje się t-butanolan potasu.
Korzystnie jako rozpuszczalnik stosuje się tetrahydrofuran w obecności t-butanolanu potasu w temperaturze od okoł o -70°C do -100°C.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, obejmującego szlak syntezy, w którym tak wytwarza się izomer (E) i izomer (Z) ISATX247, że izomer (E) i izomer (Z) są obecne w mieszaninie w uprzednio okreś lonym stosunku, przy czym szlak syntezy obejmuje etapy (a) zabezpieczania β-alkoholu aminokwasu 1 cyklosporyny A;
(b) utleniania zabezpieczonej cyklosporyny A, z wytworzeniem aldehydu zabezpieczonej cyklosporyny A;
(c) przeprowadzania aldehydu zabezpieczonej cyklosporyny A w mieszaninę izomerów (E) i (Z) zabezpieczonego 1,3-dienu, drogą reakcji aldehydu zabezpieczonej cyklosporyny A, poprzez reakcję Wittiga z ylidem fosforowym, ewentualnie w obecności halogenku litu; oraz (d) wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z), poprzez odbezpieczenie zabezpieczonego
1,3-dienu.
Korzystnie wynalazek dotyczy sposobu, w którym grupę β-alkoholową aminokwasu 1 cyklosporyny A zabezpiecza się poprzez reakcję z reagentem, z wytworzeniem zabezpieczonej cyklosporyny A wybranej z grupy obejmującej estry octanowe, estry benzoesanowe, podstawione estry benzoesanowe, etery i etery sililowe.
Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, w którym szlak syntezy obejmuje etapy (a) przeprowadzania związku pośredniego, aldehydu TMS-cyklosporyny A, w mieszaninę izomerów (E) i (Z) TMS-1,3-dienu, w reakcji związku pośredniego z ylidem fosforowym wytworzonym z halogenku tributyloallilofosfoniowego lub halogenku trifenylofosfoniowego, w warunkach reakcji Wittiga, ewentualnie w obecności halogenku litu; oraz (b) wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, przez odbezpieczenie mieszaniny izomerów (E) i (Z) TMS-1,3-dienu z użyciem kwasu.
Korzystnie jako halogenek fosfoniowy stosuje się bromek fosfoniowy.
Korzystnie etap (a) prowadzi się w rozpuszczalniku, który stanowi tetrahydrofuran i/lub toluen, stosowanym w obecności niższego alkoholanu sodu lub potasu, albo węglanu, w temperaturze od około -80°C do 110°C. Korzystniej jako niższy alkoholan sodu lub potasu stosuje się t-butanolan potasu.
Korzystnie stosuje się kwas wybrany z grupy obejmującej kwas chlorowodorowy, kwas octowy, kwas cytrynowy, kwas Lewisa i reagenty na bazie HF.
Synteza
Cyklosporyna i jej analogi są przedstawicielami klasy związków typu cyklicznych polipeptydów o silnym działaniu immunosupresyjnym. Pomimo wielu korzyści jakie oferują te leki pod względem ich działania immunosupresyjnego, przeciwzapalnego i przeciwpasożytniczego, występują liczne działania niepożądane związane z terapią cyklosporyną A, obejmujące nefrotoksyczność i toksyczność w stosunku do wątroby. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na nowe środki immunosupresyjne o takim samym działaniu farmakologicznym, jakie wykazuje występująca w naturze cyklosporyna A, ale bez związanych z nią toksycznych działań ubocznych.
Poprzednio ujawniono analog cyklosporyny oznaczony jako „ISATX247. Analog ten jest strukturalnie podobny do cyklosporyny A, z wyjątkiem modyfikacji grupy aminokwasowej w pozycji 1. Stwierdzono, że pewne mieszaniny izomerów cis i trans ISATX247 odznaczają się jednocześnie zwiększoną skutecznością działania i zmniejszoną toksycznością, w porównaniu z występującymi w naturze i znanymi obecnie cyklosporynami.
Izomery ISATX247 (i ich pochodne) można syntetyzować stereoselektywnymi sposobami, mogącymi różnić się stopniem selektywności. Stereoselektywnymi sposobami wytwarza się kompozycje wzbogacone w jeden z izomerów (E) i (Z), przy czym kompozycje te można łączyć ze sobą w taki sposób, że otrzymana mieszanina ma pożądany stosunek ilościowy tych dwóch izomerów. AlternaPL 210 841 B1 tywnie warunki reakcji stereoselektywnego szlaku można dostosować w celu bezpośredniego wytwarzania mieszaniny o pożądanym stosunku.
Nazwa chemiczna immunosupresyjnego analogu cyklosporyny wytwarzanego sposobem według wynalazku, zwanego ISATX247, brzmi cyklo{{E,Z)-(2S,3R,4R)-3-hydroksy-4-metylo-2-(metyloamino)-6,8-nonadienoilo}-L-2-aminobutyrylo-N-metyloglicylo-N-metylo-L-leucylo-L-walilo-N-metylo-L-leucylo-L-alanylo-D-alanylo-N-metylo-L-leucylo-N-metylo-L-leucylo-N-metylo-L-walil}. Związek ten ma wzór empiryczny C63H111N11O12 i masę cząsteczkową około 1214,85. Symbol „ISATX247 jest oznaczeniem handlowym tego aktywnego farmakologicznie związku.
Strukturę ISATX247 potwierdzono głównie metodą spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR). Zarówno widma 1H, jak i 13C przyporządkowano stosując serię jedno- i dwuwymiarowych eksperymentów NMR i przez porównanie ze znanym przyporządkowaniem widma NMR dla cyklosporyny A. Bezwzględne konfiguracje izomerów (E) i (Z) ISATX247 potwierdzono eksperymentami z ją drowym efektem Overhausera (NOE). Dodatkowe dowody potwierdzające uzyskano na podstawie spektralnej analizy masowej, która potwierdziła masę cząsteczkową, i na podstawie widma w podczerwieni, które było bardzo podobne do widma cyklosporyny A. Tego drugiego rezultatu należało oczekiwać, ze względu na podobieństwo obu tych związków.
Strukturę cyklosporyny A zilustrowano na fig. 1A. Struktura obejmuje identyfikację 11 grup aminokwasowych tworzących w cząsteczce pierścień cyklicznego peptydu. Tych 11 grup aminokwasowych oznaczono numerami rosnącymi zgodnie z kierunkiem ruchu wskazówek zegara, poczynając od aminokwasu pokazanego pośrodku u góry pierścienia (i identyfikowanego jako „aminokwas 1”). Dla przejrzystości pierwszy aminokwas obramowany jest ramką utworzoną przez linię przerywaną. Boczny łańcuch aminokwasu 1 narysowano w sposób odzwierciedlający jego strukturę chemiczną, gdyż zazwyczaj w tym miejscu zachodzą opisywane reakcje syntezy. Zwyczajowo atom węgla sąsiadujący z grupą karbonylową aminokwasu oznaczany jest jako atom węgla α, z kolejnymi literami alfabetu greckiego użytymi do oznaczania sąsiadujących atomów węgla wzdłuż łańcucha, poczynając od pierścienia peptydowego. Jak pokazano na fig. 1A, w przypadku cyklosporyny A z atomem węgla β łańcucha bocznego związana jest grupa hydroksylowa, a zorientowane trans wiązanie podwójne znajduje się pomiędzy atomami węgla ε i ζ łańcucha bocznego.
Inną schematyczną strukturę cyklosporyny A pokazano na fig. 1B, gdzie różne części cząsteczki obramowano ramką utworzoną linią przerywaną. Rysunek ten definiuje nomenklaturę stosowaną w tym opisie, gdzie okreś lenie „CsA odnosi się do części cyklosporyny A ograniczonej ramk ą . Nomenklatura ta dostarcza skrótowych środków obrazowania rejonu, w którym zachodzą opisywane reakcje (tj. bocznego łańcucha grupy aminokwasowej w pozycji 1, narysowanego poza ramką utworzoną przez linię przerywaną na fig. 1B), bez konieczności ponownego rysowania pozostałej części cząsteczki za każdym razem opisywania reakcji. Dla fachowców jest oczywiste, że wiązanie pomiędzy atomami węgla α i β łańcucha bocznego ma normalną długość i jest ona przesadzona tylko na tym rysunku, w celu ułatwienia zdefiniowania określenia „CsA.
Jak stwierdzono powyżej, szczególny analog cyklosporyny A jest oznaczony jako ISATX247, a jego dwa stereoizomery E (czyli trans) i Z (czyli cis), przedstawiono odpowiednio na fig. 2A i 2B. Konfiguracja cis lub trans tych stereoizomerów dotyczy konfiguracji podwójnego wiązania pomiędzy atomami węgla ε i ζ łańcucha bocznego, czyli podwójnego wiązania bliżej pierścienia peptydowego, w przeciwień stwie do podwójnego wią zania znajdują cego się na koń cu ł a ń cucha.
Poniżej podano kilka dodatkowych uwag dotyczących nomenklatury stereochemicznej. W opisie określenia cis i (Z) stosowane są wymiennie, podobnie jak wymiennie stosowane są określenia trans i (E). Stosowanie okreś leń „erytro i „treo bę dzie ograniczone do minimum, ze wzglę du na oczywiste zamieszanie w literaturze dotyczące znaczenia tych określeń. Patrz R.W. Hoffmann i H.-J Zei w „Stereoselective synthesis of Alcohols. 8. Diastereoselective Synthesis of β-Methylhomoallyl Alcohols via Crotylboronates, J. Org. Chem., tom 46, str. 1309 - 1314 (1981); A. Streitwieser i C.H. Heathcock, Introduction to Organic Chemistry, 2. wydanie (Macmillan, New York, 1981), str. 845 - 846; oraz M.B. Smith i J. March, March's Advanced Organic Chemistry (Wiley, New York, 2001), str. 144 - 147. W kilku przypadkach, gdy stosuje się tutaj terminologię treo/erytro stosowana jest konwencja Streitwiesera i Heathcocka, gdzie izomer „erytro dotyczy konfiguracji (R,S) i (S,R), a izomer „treo dotyczy konfiguracji (R,R) i (S,S).
Ostatnie wyjaśnienie związane z nomenklaturą dotyczy końcowego wiązania podwójnego węgiel-węgiel pokazanego na fig. 2A i 2B. W alternatywnym schemacie numeracji węgle w bocznym łańcuchu grupy aminokwasowej w pozycji 1 mogą być numerowane poczynając od węgla końcowego (θ)
PL 210 841 B1 w kierunku do pierś cienia peptydowego. W tym układzie izomery ISATX247 mogą być traktowane jako
1,3-dieny, zgodnie z konwencjonalną nomenklaturą chemii organicznej, gdzie każde wiązanie podwójne identyfikowane jest swoim najniżej numerowanym węglem.
Poniżej omówiono schematy syntezy przedstawione na fig. 3-8. Zgodnie z postaciami wynalazku, mieszaniny izomerów można wytwarzać bezpośrednio, jeśli warunki reakcji konkretnego szlaku syntezy dostosowane są tak, aby osiągnąć pożądany stosunek izomerów w mieszaninie. Alternatywnie można wytwarzać kompozycje wzbogacone w jeden z dwóch izomerów geometrycznych analogu cyklosporyny A i kompozycje te łączyć w ustalonym stosunku w celu otrzymania żądanej mieszaniny.
Przegląd szlaków syntezy, zgodnych z postaciami wynalazku przedstawiono na fig. 3, przy czym szczególny nacisk położono na pogrupowanie szlaków reakcji, według ich chemizmu i stereoselektywności. Na fig. 3 szlaki syntetyczne, w których wykorzystuje się reakcję Wittiga, pokazano ogólnie po prawej stronie schematu i oznaczono numerem odniesienia 31, podczas gdy szlaki 32 i 33, w których stosuje się reagenty metaloorganiczne tworzące, jak się sądzi, sześcioczłonowe pierścienie w stanie przejściowym, pokazano pośrodku i po lewej stronie schematu. Każdy ze szlaków syntezy może prowadzić do otrzymania mieszaniny izomerów lub kompozycji wzbogaconych w jeden z dwóch izomerów.
Postacie wynalazku dotyczą różnych sposobów otrzymywania żądanej mieszaniny izomerów. Elastyczność i różnorodność strategii syntezy ujawnionych w wynalazku może być częściowo odzwierciedlona w symetriach i asymetriach fig. 3. Wspólną reakcją dla wszystkich szlaków jest zabezpieczanie funkcyjnej grupy cyklosporyny A 34. W tej przykładowej postaci reakcję stanowi przemiana cyklosporyny A 34 w acetylocyklosporynę A 35. Asymetrię na fig. 3 stanowi stosowanie aldehydu acetylo-cyklosporyny A 51 jako prekursora dla wszystkich szlaków z użyciem tytanowych lub litowych reagentów metaloorganicznych, ale tylko dla niektórych szlaków z zastosowaniem reakcji Wittiga z odczynnikiem zawierającym fosfor.
Ogólnie w szlakach syntezy na fig. 3, których warunki reakcji mogą być dostosowane do wytwarzania mieszaniny o żądanym stosunku izomerów, w reakcji Wittiga wykorzystuje się reagenty zawierające fosfor. W innych stereoselektywnych szlakach wykorzystuje się również nieorganiczne pierwiastki, zwykle wchodzące w skład reagentów metaloorganicznych, działających poprzez sześcioczłonowe pierścieniowe stany przejściowe, w których zawada przestrzenna decyduje o konfiguracyjnym rezultacie reakcji. W realizacji wynalazku przydatne są liczne reagenty metaloorganiczne, w tym związki pierwiastków nieorganicznych, takich jak bor, krzem, lit i siarka.
Kompozycje wzbogacone w jeden lub drugi z pary izomerów można wytwarzać z jednego prekursora. Alternatywnie, dwie kompozycje można wytwarzać z różnych prekursorów. W jednym ze stereoselektywnych szlaków fig. 3 (szlak 32) jeden prekursor prowadzi do otrzymania obu izomerów ISATX247, w zależności od wybranych warunków reakcji. W innym szlaku stereoselektywnym (szlak 33) potrzebne są dwa różne prekursory do wytworzenia każdej ze wzbogaconych kompozycji.
Poniżej omówiono szczegółowo reakcje z fig. 3. Reakcją wspólną dla każdego szlaku jest zabezpieczanie alkoholu w pozycji β bocznego łańcucha grupy aminokwasowej w pozycji 1. Taki schemat zabezpieczania dotyczy problemu zwykle spotykanego w syntezie organicznej, gdy pierwsza grupa funkcyjna zostaje w niezamierzony sposób modyfikowana w reakcji przeznaczonej dla (podobnej i/lub identycznej) drugiej grupy funkcyjnej, zlokalizowanej w innym miejscu cząsteczki. W celu zrealizowania tego schematu pierwszą funkcyjną grupę poddaje się reakcji z grupą zabezpieczającą, przeprowadza się pożądaną reakcję drugiej grupy funkcyjnej, a następnie usuwa się grupę zabezpieczającą z pierwszej grupy funkcyjnej.
Grupy zabezpieczające są dobrze znane w syntezie organicznej i zostały omówione przez J. R. Hansona w rozdziale 2, „The Protection of Alcohols w publikacji Protecting Groups in Organic Synthesis (Sheffield Academic Press, Sheffield, Anglia, 1999), str. 24 - 25. Hanson opisuje jak zabezpieczać grupy hydroksylowe przez przeprowadzanie ich w estry albo w etery. Estry octanowe są prawdopodobnie najczęściej używanym typem chemicznego zabezpieczania grup hydroksylowych. Zakres warunków, jakie można zastosować do wprowadzania grup octanowych, jest bardzo szeroki. Reagentami i rozpuszczalnikami są bezwodnik octowy i pirydyna; bezwodnik octowy, pirydyna i di-metyloaminopirydyna (DMAP); bezwodnik octowy i octan sodu; bezwodnik octowy i kwas p-toluenosulfonowy, chlorek acetylu, pirydyna i DMAP; oraz keten. DMAP jest użytecznym katalizatorem acylowania, ze względu na tworzenie z bezwodnika bardzo reaktywnej soli N-acylopirydyniowej.
β-Alkohol cyklosporyny A 34 można zabezpieczyć jako octan, drogą reakcji związku 34 z chlorkiem acetylu, octanem etylu lub z ich mieszaniną, w wyniku czego tworzy się acetylocyklosporyna A 35.
PL 210 841 B1
Alternatywnie β-alkohol poddaje się nukleofilowej addycji do bezwodnika octowego, w wyniku czego tworzy się acetylocyklosporyna A 35 i kwas octowy. Reakcje te można prowadzić w obecności dimetyloaminopirydyny (DMAP), przy czym nadmiar bezwodnika octowego pełni rolę rozpuszczalnika. W tych przypadkach przedrostek „acetylo może być używany w nazwach przez cały szlak syntezy lub do usunięcia grupy acetylowej. Przykładowo, w jednym ze szlaków ostatni związek pośredni mający grupę acetylową przy atomie węgla β nazywany jest „acetylo-(E)-1,3-dienem.
Chociaż wytwarzanie acetylocyklosporyny A ma ustaloną pozycję w literaturze, to dla fachowców jest zrozumiałe, że do zabezpieczania β-alkoholu grupy aminokwasowej w pozycji 1 cyklosporyny A 34 można stosować grupy zabezpieczające inne niż estry octanowe. Tymi grupami zabezpieczającymi mogą być ugrupowania estrów benzoesanowych, podstawionych estrów benzoesanowych, eterów i eterów sililowych. W pewnych warunkach reakcji octanowe grupy zabezpieczające mają skłonność do niepożądanych reakcji ubocznych, takich jak eliminacja i hydroliza. Z uwagi na to, że estry benzoesanowe, etery i etery sililowe są często bardziej odporne na takie reakcje uboczne w takich samych warunkach reakcji, często korzystne jest stosowanie takich grup zabezpieczających zamiast grup octanowych. Cyklosporyna lub pochodne cyklosporyny zabezpieczone grupą acetylową lub dowolną inną grupą zabezpieczającą są określane jako „zabezpieczona cyklosporyna A. Podobnie końcowy związek pośredni w przykładowym szlaku wspominanym powyżej byłby nazywany „zabezpieczony(E)-1,3-dien zamiast „acetylo-(E)-1,3-dien. Charakter wybranej grupy zabezpieczającej może mieć wpływ na pożądany przebieg dalszych etapów sekwencji reakcji.
W nawiązaniu do fig. 3, acetylocyklosporyna A 35 jest w tym przykładowym szlaku zabezpieczonym β-alkoholem służącym jako prekursor syntezy izomerów ISATX247 w kilku szlakach syntetycznych. Najpierw zostaną omówione szlaki obejmujące reakcję Wittiga.
Synteza mieszanin izomerów (E) i (Z) ISATX247 poprzez reakcję Wittiga
Przykładowe szlaki obejmujące reakcję Wittiga są identyfikowane na fig. 3 odnośnikiem liczbowym 31. Sposób 1 realizuje się wykorzystując bromowy związek pośredni, acetylo-n-bromocyklosporynę 41, podczas gdy w sposobie 2 stosuje się jako związek wyjściowy aldehyd acetylocyklosporyny A 51. W opisanych poniżej przykładowych sposobach stosuje się reakcję Wittiga do wprowadzenia grupy alkenowej, w wyniku czego otrzymuje się mieszaninę produktów o różnych konfiguracjach stereochemicznych.
Reakcje Wittiga stosowane w przykładowych ujawnionych w wynalazku sposobach syntezy mieszanin izomerów (E) i (Z) ISATX247 można ewentualnie prowadzić w obecności halogenku litu. Wiadomo, że obecność halogenków litu w reakcjach Wittiga ma wpływ na stosunek wytwarzanych izomerów geometrycznych i z tego powodu dodanie takiego związku może pomóc w wytwarzaniu żądanej mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247.
Sposób 1
Mieszaninę izomerów (E) i (Z) ISATX247 można wytwarzać w sposób przedstawiony na fig. 4. Użycie na fig. 4 linii falistych (zwłaszcza w przypadku związków 43 i 44) oznacza, że w przykładowej sekwencji reakcji otrzymuje się mieszaninę izomerów (E) i (Z). Udział procentowy wytwarzanych izomerów (E) i (Z) wynosi około 10 - 90% izomeru (E) oraz około 90 - 10% izomeru (Z), ale te zakresy są jedynie przykładowe i możliwe jest wiele innych zakresów. Przykładowo, mieszanina może zawierać około 15 - 85% izomeru (E) i około 85 - 15% izomeru (Z). Alternatywnie mieszanina zawiera około 25 - 75% izomeru (E) i około 75 - 25% izomeru (Z); około 35 - 65% izomeru (E) i około 65 - 35% izomeru (Z); oraz około 45 - 55% izomeru (E) i około 55 - 45% izomeru (Z). Alternatywnie mieszanina izomerów stanowi mieszaninę ISATX247 zawierającą około 45 - 50% izomeru (E) i około 50 - 55% izomeru (Z). Te procentowe udziały wagowe podane są w przeliczeniu na całkowitą masę kompozycji i należy rozumieć, że suma procentów wagowych izomeru (E) i izomeru (Z) wynosi 100% wag. Innymi słowy, mieszanina może zawierać 65% wag. izomeru (E) i 35% wag. izomeru (Z) lub vice versa.
W nawiązaniu do fig. 4, końcowy atom węgla η w bocznym łańcuchu grupy aminokwasowej pozycji 1 acetylocyklosporyny A bromuje się w następnym etapie reakcji acetylocyklosporyny A 35 z N-bromosukcynoimidem i azobisizobutyronitrylem, w takim rozpuszczalniku jak tetrachlorek węgla, w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin, w wyniku czego otrzymuje się pośredni związek acetylo-n-bromocyklosporynę 41. N-Bromosukcynoimid jest reagentem często stosowanym do zastępowania allilowych atomów wodoru bromem i sądzi się, że następuje to według mechanizmu wolnorodnikowego. Wytwarzanie związku pośredniego 41 opisali M.K. Eberle i F. Nuninger w „Synthesis of the Main Metabolite (OL-17) of Cyclosporin A, J. Org. Chem., tom 57, str. 2689 - 2691 (1992).
PL 210 841 B1
Nowy związek pośredni bromek trifenylofosfoniowy acetylocyklosporyny A 42 można wytworzyć z acetylo-n-bromocyklosporyny 41, przez ogrzewanie tego związku z trifenylofosfiną, w takim rozpuszczalniku jak toluen.
Uważa się, że nowy związek pośredni 42 i inne podobne związki są kluczowymi związkami pośrednimi w syntezie wielu analogów cyklosporyny A, zawierających sprzężony układ dienowy w grupie aminokwasowej w pozycji 1. Przykładowo, oprócz trifenylofosfiny, takie związki jak triarylofosfiny, trialkilofosfiny, aryloalkilofosfiny i triaryloarsyny można poddać reakcji z acetylo-n-bromocyklosporyną 41, w celu wytworzenia innych aktywowanych związków podobnych do 42.
Ponownie w nawiązaniu do fig. 4, mieszanina izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu 43 można wytworzyć przez zmieszanie w temperaturze pokojowej bromku trifenylofosfoniowego acetylocyklosporyny A 42 w toluenie z nadmiarem formaldehydu. Po dodaniu formaldehydu wkrapla się zasadę, taką jak wodorotlenek sodu, i prowadzi się ekstrakcję mieszaniny izomerów dienów octanem etylu.
Reakcję Wittiga opisano w licznych podręcznikach chemii organicznej. Opis taki znajduje się w szczególności w publikacji J. McMurry, Organic Chemistry, 5. wydanie (Brooks/Cole, Pacific Grove, 2000), str. 780 - 783. Reakcję Wittiga można zastosować w celu przeprowadzenia ketonu lub aldehydu w alken. W takiej reakcji ylid fosforowy zwany także fosforanem można poddać reakcji z aldehydem lub ketonem, w wyniku czego powstaje dipolarny związek pośredni zwany betainą. Zazwyczaj pośredniej betainy nie wyodrębnia się, ale raczej ulega ona samorzutnemu rozkładowi poprzez czteroczłonowy pierścień do alkenu i tlenku trifenylofosfiny. Końcowym rezultatem jest zastąpienie karbonylowego atomu tlenu grupą R2C= pierwotnie związaną z atomem fosforu.
Dla fachowców jest zrozumiałe, że bardzo dużo różnych reagentów może zastąpić podane wyżej przykładowe reagenty stosowane w reakcji Wittiga. Przykładowo liczne związki alkilowe, arylowe, aldehydy i ketony mogą zastępować formaldehyd, w celu wytworzenia dużej liczby pochodnych cyklosporyny. Powyższe syntezy przeprowadzono z użyciem formaldehydu oraz, zamiast formaldehydu, takich związków jak aldehyd octowy, deuterowany formaldehyd, deuterowany acetaldehyd, 2-chlorobenzaldehyd, benzaldehyd i aldehyd masłowy. Takie reakcje Wittiga można przeprowadzać ze związkami innymi niż pochodne trifenylofosfoniowe, takimi jak triarylofosfiny, trialkilofosfiny, aryloalkilofosfiny i triaryloarsyny. Zamiast wodorotlenku sodu można stosować różne inne zasady, takie jak węglan sodu, butylolit, heksylolit, amidek sodu, litowe zasady z zawadą przestrzenną, takie jak diizopropyloamidek litu oraz alkoholany metali alkalicznych. Oprócz zmieniania reagentów, reakcję można prowadzić w różnych rozpuszczalnikach organicznych lub mieszaninach rozpuszczalników organicznych i wody, w obecności różnych soli, zwłaszcza halogenków litu, oraz w różnych temperaturach. Wszystkie wymienione powyżej czynniki mogą być dobrane przez fachowca, w celu uzyskania żądanego wpływu na stereochemię utworzonego wiązania podwójnego, czyli żądanego wpływu na stosunek izomerów cis do trans. W jednej postaci wynalazku reakcję Wittiga prowadzi się w rozpuszczalniku wybranym z grupy obejmującej tetrahydrofuran i toluen, przy czym rozpuszczalnik stosuje się w obecności związku wybranego z grupy obejmującej butylolit, niższy alkoholan sodu, niższy alkoholan potasu i węglan, w temperaturze od około -80°C do 110°C. Niższym alkoholanem potasu może być t-butanolan potasu. Ponadto rozpuszczalnik może stanowić tetrahydrofuran stosowany w obecności t-butanolanu potasu w temperaturze od około -70°C do -100°C.
W końcowym etapie syntezy grupę zabezpieczającą przy atomie węgla β usuwa się w następujący sposób. Mieszaninę acetylo-(E)-1,3-dienu i acetylo-(Z)-1,3-dienu 43 rozpuszcza się w metanolu i dodaje się wodę. Następnie dodaje się zasadę, taką jak węglan potasu i mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej. Do zasad, które można stosować zamiast węglanu potasu, należą wodorotlenek sodu, węglan sodu, alkoholan sodu i alkoholan potasu. Do ekstrakcji końcowego produktu w postaci mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247 44 stosuje się octan etylu.
Sposób 2
W alternatywnym szlaku syntezy mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247 z zastosowaniem reakcji Wittiga można stosować następujący czteroetapowy szlak syntezy: 1) zabezpieczanie β-alkoholu, tak jak w sposobie 1, 2) utlenianie acetylocyklosporyny A wytworzonej w pierwszym etapie, do aldehydu; 3) reakcja Wittiga; oraz 4) odacetylowanie produktu reakcji Wittiga, albo równoważnie, hydroliza estru octanowego w celu odtworzenia alkoholu. Tę sekwencję reakcji zilustrowano na fig. 5.
Ten szlak syntezy zaczyna się w sposób podobny do szlaku reakcji Wittiga z fig. 4, w którym w pierwszym etapie zabezpiecza się β-alkohol octanową grupą estrową. Dwa szlaki różnią się jednak od tego miejsca tym, że w następnym etapie sposobu 2 acetylocyklosporynę A 35 przeprowadza się
PL 210 841 B1 w aldehyd, aldehyd acetylocyklosporyny A 51. W reakcji tej stosuje się środek utleniający wystarczająco silny dla rozszczepienia wiązania C=C z wytworzeniem dwóch fragmentów. Rozszczepienie alkenów jest znane. Ozon jest prawdopodobnie najczęściej stosowanym środkiem rozszczepiającym wiązanie podwójne, ale inne reagenty utleniające, takie jak nadmanganian potasu (KMnO4) lub tetratlenek osmu, mogą również powodować rozszczepienie wiązania podwójnego.
Acetylocyklosporynę A można przeprowadzić w aldehyd z użyciem ozonu jako środka utleniającego, po czym działa się środkiem redukującym, w celu wytworzenia aldehydu acetylocyklosporyny A. Etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80°C do 0°C. Rozpuszczalnikiem stosowanym podczas ozonolizy może być niższy alkohol, taki jak metanol. Jako środek redukujący można stosować trialkilofosfinę, taką jak tributylofosfina, triarylofosfinę, trialkiloaminę, taką jak trietyloamina, sulfid alkiloarylowy, tiosiarczan lub sulfid dialkilowy, taki jak sulfid dimetylowy. Przy pracy z tributylofosfiną jako środkiem redukującym, fachowcy wiedzą, że reakcja jest kontrolowana ilością środka redukującego.
β Alkohol cyklosporyny A można zabezpieczać grupą trimetylosililową (TMS) i utleniać ozonem jako środkiem utleniającym, po czym działa się środkiem redukującym, w celu wytworzenia aldehydu TMS-cyklosporyny A. Etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80 do 0°C. Rozpuszczalnikiem stosowanym podczas ozonolizy może być mieszanina niższego alkoholu i dichlorometanu. Środek redukujący można wybrać z grupy obejmującej trialkilofosfiny, takie jak tributylofosfina, triarylofosfiny, trialkiloaminy, takie jak trietyloamina, sulfidy alkiloarylowe, tiosiarczany lub sulfidy dialkilowe, takie jak sulfid dimetylowy. Przy pracy z tributylofosfiną jako środkiem redukującym, fachowcy wiedzą, że reakcja jest kontrolowana ilością środka redukującego.
Dodatkowo aldehyd cyklosporyny A można wytworzyć przez zabezpieczenie β alkoholu cyklosporyny A przez utworzenie acetylocyklosporyny A, a następnie przeprowadzenie acetylocyklosporyny A w epoksyd acetylocyklosporyny A, za pomocą mono-nadsiarczanu, korzystnie oksonu, w obecności ketonu, takiego jak acetoksyaceton lub diacetoksyaceton. Etap ten prowadzi się w rozpuszczalniku organicznym obojętnym w warunkach reakcji, takim jak acetonitryl i woda. W celu związania jonów metali ciężkich, które mogą być obecne w środowisku reakcji, dodaje się sól disodą kwasu etylenodiaminotetraoctowego. Reakcję epoksydowania prowadzi się korzystnie w pH większym od 7. Po reakcji epoksydowania prowadzi się reakcję utleniającego rozszczepienia epoksydu kwasem nadjodowym lub nadjodanem w środowisku kwaśnym. Utlenianie i utleniające rozszczepianie można ewentualnie połączyć w jeden etap procedury obróbki. Reakcje te opisali Dan Yang i in. w „A C2 Symmetric Chiral Ketone for Catalytic Asymmetric Epoxidation of Unfunctionalized Olefins, J. Am. Chem. Soc, tom 118, str. 491 - 492 (1996) oraz „Novel Cyclic Ketones for Catalytic Oxidation Reactions, J. Org. Chem., tom 63, str. 9888 - 9894 (1998).
Zastosowanie środków utleniających opartych na rutenie opisali H.J. Carlsen i in. w „A Greatly Improved Procedure for Ruthenium Tetroxide Catalyzed Oxidations of Organic Compounds, J. Org. Chem., tom 46, nr 19, str. 3736 - 3738 (1981). Carlsen i in. stwierdzili, że z historycznego punktu widzenia, koszt rutenu stał się bodźcem dla opracowania katalitycznych procedur, przy czym w najczęściej stosowanych procedurach wykorzystuje się nadjodany lub podchloryny jako stechiometryczne utleniacze. Badacze ci postulują, że utrata aktywności katalitycznej stwierdzona podczas przebiegu reakcji z tradycyjnym zastosowaniem rutenu związana jest z obecnością kwasów karboksylowych. Stwierdzono, że dodanie nitryli do mieszaniny reakcyjnej, zwłaszcza acetonitrylu, znacznie zwiększa szybkość i stopień utleniającego rozszczepiania alkenów w układzie CCl4/H2O/IO4-.
Aldehyd acetylocyklosporyny A 51 można otrzymać z acetylocyklosporyny A 35 przez rozpuszczenie jej w mieszaninie acetonitrylu i wody, a następnie dodanie najpierw nadjodanu sodu, a następnie hydratu chlorku rutenu. Aldehyd acetylocyklosporyny A 51 można wyekstrahować octanem etylu. Należy zauważyć, że synteza aldehydu 51 przez utleniające rozszczepienie odgrywa istotną rolę w wielu stereoselektywnych szlakach opisywanych poniżej i w związku z tym ta część opisu będzie odpowiednio powoływana.
Dodatkowo aldehyd cyklosporyny A można wytworzyć przez zabezpieczenie β alkoholu cyklosporyny A, drogą utworzenia acetylocyklosporyny A, a następnie przeprowadzenia acetylocyklosporyny A w epoksyd acetylocyklosporyny A, za pomocą mono-nadsiarczanu, korzystnie oksonu, w obecności ketonu, korzystnie aktywowanego ketonu, korzystnie acetoksyacetonu lub diacetoksyacetonu. Etap ten prowadzi się w rozpuszczalniku organicznym obojętnym w warunkach reakcji, takim jak acetonitryl i woda. W celu związania jonów metali ciężkich, które mogą być obecne w środowisku reakcji, dodaje się sól disodową kwasu etylenodiaminotetraoctowego. Reakcję epoksydowania prowadzi się
PL 210 841 B1 korzystnie w pH większym od 7. Po reakcji epoksydowania następuje reakcja utleniającego rozszczepienia epoksydu kwasem nadjodowym lub nadjodanem w środowisku kwaśnym. Utlenianie i utleniające rozszczepianie można ewentualnie połączyć w jeden etap procedury obróbki. Reakcje te opisali Dan Yang i in. w „A C2 Symmetric Chiral Ketone for Catalytic Asymmetric Epoxidation of Unfunctionalized Olefins, J. Am. Chem. Soc, tom 118, str. 491 - 492 (1996) oraz „Novel Cyclic Ketones for Catalytic Oxidation Reactions, J. Org. Chem., tom 63, str. 9888 - 9894 (1998).
Trzeci etap sposobu 2 obejmuje przeprowadzanie aldehydu 51 w mieszaninę dienów (E) i (Z) w reakcji Wittiga, w podobny sposób do opisanego w sposobie 1. Tak jak w sposobie 1, ylid fosforowy dodaje się do aldehydu w celu wytworzenia betainy (nie wyodrębnianej), przy czym w efekcie następuje zastąpienie karbonylowego atomu tlenu w aldehydzie grupą R2C= pierwotnie związaną z fosforem. Tak jak wspomniano, takie reakcje Wittiga można przeprowadzać z użyciem innych związków zawierających fosfor niż pochodne trifenylofosfoniowe, takich jak triarylofosfiny, trialkilofosfiny, aryloalkilofosfiny i triaryloarsyny, w różnych temperaturach i stosując różne roztwory zasad i rozpuszczalniki lub dodając różne sole nieorganiczne, w celu wpływania na stereochemię nowowytworzonych wiązań podwójnych.
Aldehyd acetylocyklosporyny A 51 można rozpuścić w toluenie i dodać zasadę, taką jak wodorotlenek sodu w wodzie. Następnie dodaje się bromek allilotrifenylofosfoniowy 52 i przez pewien czas miesza się mieszaninę reakcyjną. Obróbka produktu będącego mieszaniną acetylo-(E)-1,3-dienu i acetylo-(Z)-1,3-dienu 53 obejmuje ekstrakcje heksanem i/lub octanem etylu, przy czym określenie „obróbka oznacza proces ekstrahowania i/lub wyodrębniania produktów reakcji z mieszaniny reagentów, produktów, rozpuszczalnika, itp.
W końcowym etapie sposobu 2, podobnym do końcowego etapu sposobu 1, octanową estrową grupę zabezpieczającą alkohol w pozycji atomu β usuwa się za pomocą węglanu potasu, w wyniku czego otrzymuje się mieszaninę izomerów (E) i (Z) ISAtx247 54. Do zasad, które można stosować zamiast węglanu potasu do usuwania grupy zabezpieczającej, należą wodorotlenek sodu, węglan sodu, alkoholan sodu i alkoholan potasu.
Synteza kompozycji wzbogaconych w jeden z izomerów (E) i (Z) ISATX247 z zastosowaniem związków metaloorganicznych
W stereoselektywnych szlakach syntezy można stosować reagenty nieorganiczne zawierające pierwiastki takie jak krzem, bor, tytan, siarka, fosfor i/lub lit. Szlaki te mogą przebiegać przez sześcioczłonowy pierścieniowy stan przejściowy, w którym jednym z członów pierścienia jest nieorganiczny pierwiastek pochodzący z reagenta metaloorganicznego. Zawada przestrzenna związana ze stanem przejściowym może wpływać na rezultat stereochemiczny reakcji.
W opisie będą omówione dwa przykładowe schematy stereoselektywne. Zgodnie z pierwszym schematem stereoselektywnym (sposób 3, pokazany również jako szlak 32 na fig. 3) związek zawierający krzem poddaje się reakcji eliminacji z wytworzeniem izomeru (E) albo izomeru (Z), w zależności od tego, czy reakcję eliminacji prowadzi się w warunkach kwasowych, czy w zasadowych. Jest to przykład reakcji olefinowania Petersona. Zgodnie z drugim schematem stereoselektywnym (sposób 4, pokazany również na fig. 3 jako szlak 33) każdy z izomerów wytwarza się z innego prekursora. Izomer (Z) wytwarza się ze związków pośrednich zawierających tytan i fosfor, podczas gdy izomer (E) wytwarza się poprzez związek pośredni zawierający lit.
Sposób 3
Szlak ten jest realizowany poprzez aldehyd acetylocyklosporyny A 51.
Podobny schemat reakcji omówili ogólnie D.J.S. Tsai i D.S. Matteson w „A Stereocontrolled Synthesis of (Z) and (E) Terminal Dienes from Pinacol (E)-1-Trimethylsilyl-1-Propene-3-Boronate, Tetrahedron Letters, tom 22, nr 29, str. 2751 - 2752 (1981). Sposób ten zilustrowano na fig. 6. Ogólnie synteza obejmuje wytwarzanie estrowego reagenta, trimetylosililoalliloboronianu 62, a następnie podziałanie związkiem 62, na aldehyd acetylocyklosporyny A 51, w wyniku czego tworzy się β-trimetylosililoalkohol 64. Sądzi się, że alkohol ten tworzy się poprzez stan przejściowy zawierający bor 63. Ponieważ estry boronianowe są wolno reagującymi reagentami w reakcjach alliloborowania, dla fachowców będą docenione zalety wynikające z zastosowania szybciej działającego reagenta borowego, takiego jak E-Y-trimetylosililodietylobor lub 9-(E-Y-trimetylosililoallilo)-9-BBN. β-Trimetylosililoalkohol 64 można następnie poddać olefinowaniu Petersona, w celu wytworzenia alkenu, w tym przypadku dienu 65 albo dienu 67.
Tworzenie się alkenu następuje zgodnie z jednym z dwóch odmiennych szlaków, w zależności od tego, czy reakcję eliminacji (olefinowania) prowadzi się w kwasowych, czy w zasadowych warunPL 210 841 B1 kach. W warunkach kwasowych zachodzi eliminacja typu anty, z wytworzeniem izomeru (E), podczas gdy w warunkach zasadowych zachodzi eliminacja typu cis, z wytworzeniem izomeru (Z). Dla fachowców jest zrozumiałe, że stosując ten szlak syntezy każdy z izomerów można wytworzyć z tego samego prekursora. Produkt każdej reakcji eliminacji stanowi kompozycję wzbogaconą w jeden z dwóch izomerów. Określenie wzbogacona może oznaczać, że kompozycja zawiera około 75% wag. lub więcej izomeru. Alternatywnie, wzbogacona kompozycja może zawierać 80, 85 i 90% wag. jednego z izomerów. Kompozycje wzbogacone w jakiś izomer można następnie połączyć w określonym stosunku, w celu uzyskania pożądanej mieszaniny, tak jak zilustrowano to na fig. 10.
Reakcje przedstawione na fig. 6 omówiono poniżej szczegółowo, poczynając od wytwarzania reagenta zawierającego bor 62. Ogólne badania zastosowania krzemowych reagentów w syntezie z tworzeniem wiązania węgiel-węgiel omówili E. Ehlinger i P. Magnus w „Silicon in Synthesis. 10. The (Trimethylsilyl)allyl Anion: A β-Acyl Anion Equivalent for the Conversion of Aldehydes and Ketones into γ-Lactones, J. Am. Chem. Soc, tom 102, nr 15, str. 5004 - 5011 (1980). W szczególności badacze ci zajmowali się reakcją pomiędzy anionem (trimetylosililo)allilowym i aldehydem. Anion można otrzymać przez deprotonowanie allilotrimetylosilanu s-butylolitem w tetrahydrofuranie w -76°C, zawierającym 1 równoważnik tetrametyloetylenodiaminy (TMEDA).
Deprotonowanie allilotrimetylosilanu (tego etapu nie pokazano na fig. 6) omówili J.-F. Biellmann i J.-B. Ducep w „Allylic and Benzylic Carbanions Substituted by Heteroatoms, Organic Reactions, tom 27 (Wiley, New York, 1982), str. 9. Proton alfa w stosunku do heteroatomu w podstawionych układach allilowych można usunąć bardziej zasadowym środkiem. Dostępnych jest wiele takich środków, przy czym prawdopodobnie najbardziej rozpowszechniony jest n-butylolit. n-Butylolit stosuje się w ilości stechiometrycznej ze związkiem metalowanym w roztworze tetrahydrofuranowym (THF). Temperatura jest zwykle utrzymywana poniżej 0°C (często poniżej -76°C), gdyż w takiej temperaturze n-butylolit ma niską reaktywność ze względu na swój polimerowy charakter. Dodanie środka chelatującego, takiego jak N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina (TMEDA), powoduje dysocjację polimeru. Jednakże reakcję można prowadzić również w temperaturze pokojowej, nawet bez obecności TMEDA.
Allilosilany są łatwe do deprotonowania, gdyż wytwarzany anion jest stabilizowany nie tylko przez sprzężenie z przyległym wiązaniem podwójnym, ale także z sąsiadującą grupą sililową. Anion może reagować ze środkami elektrofilowymi albo przez swój atom węgla α, albo atom węgla γ. Regiochemiczny i stereochemiczny rezultat tych reakcji zależy od kilku czynników, z których najważniejszym jest rodzaj przeciwjonu. Allilosilany omówił S.E. Thomas w Organic Synthesis: The Roles of Boron and Silicon (Oxford University Press, New York, 1991), str. 84 - 87.
Zgodnie z tym schematem reakcji deprotonowany allilosilan poddaje się następnie elektrofilowemu wychwytowi przez boran trimetylu z wytworzeniem związku pośredniego, z którego, w wyniku reakcji z pinakonem otrzymuje się trans-(trimetylosililo)alliloboronian 62. Boronian 62 może być także zwany „alliloborem (estrem alliloboronianowym). Alternatywnie, jeśli przy wychwycie elektrofilowym stosuje się 9-metoksy-9-dialkilobor, prowadzi to do boronianowego kompleksu, który można odmetoksylować przy użyciu odczynnika trifluoroborowego (takiego jak BF3Et2O), w celu wytworzenia odpowiedniego 9-(Y-trans-trimetylosililoallilo)-9-dialkiloboru.
Przyłączanie aldehydu do alliloboru omówił S.E. Thomas w powyżej cytowanej publikacji na stronach 34 - 35. Przyłączanie aldehydu do alliloboru niesymetrycznie podstawionego przy dystalnym końcu podwójnego wiązania węgiel-węgiel („dystalny oznacza znajdujący się najdalej od atomu boru) powoduje powstanie homoallilowego alkoholu zawierającego dwa sąsiadujące centra chiralności. Z (E)-alliloborów otrzymuje się diastereoizomer treo, podczas gdy z (Z)-alliloborów otrzymuje się diastereoizomer erytro. Przykładową reakcję (E)-allilo-boru 62 z aldehydem acetylocyklosporyny A 51 pokazano na fig. 6, gdzie związek pośredni zawierający bor 63 tworzy się po kilkudniowym mieszaniu reagentów w roztworze THF.
Liczbowy odnośnik 69 w pośrednim związku zawierającym bor 63 (fig. 6) oznacza, że możliwa jest dowolna liczba struktur przy atomie boru. Przykładowo, gdyby reagentem boronianowym 62 był trialkilosililoalliloboronian, wtedy strukturę 69 stanowiłby pięcioczłonowy pierścień zawierający dwa atomy tlenu. Podstawniki w boronianowych lub borowych reagentach stosowanych w 62 będą obecne w strukturze 63.
Postulowano, że stereoselektywność osiągana w reakcjach związków alliloborowych z aldehydami może być związana z krzesełkowym stanem przejściowym sześcioczłonowego pierścienia, którego przykład stanowi zawierający bor związek pośredni 63, przedstawiony na fig. 6. Tylko dwa karbonylowe atomy aldehydu (atomy węgla i tlenu połączone wiązaniem podwójnym) stają się członami
PL 210 841 B1 sześcioczłonowego pierścienia jako stanu przejściowego; pozostała część aldehydu wystaje poza pierścień. Postuluje się, że część CsA aldehydu wystająca z sześcioczłonowego pierścienia jest raczej w pozycji ekwatorialnej, a nie aksjalnej względem pierścienia, ponieważ ta druga konfiguracja stwarzałaby niekorzystną zawadę przestrzenną pomiędzy podstawnikiem i atomem tlenu alliloboru 62. Dla fachowców jest zrozumiałe, że grupa SiMe3 z anionu (trimetylosililo)allilowego pokazana na fig. 6 zajmuje pozycję ekwatorialną, ponieważ w przykładzie tym wyjściowym związkiem był diastereoizomer (E) alliloboru. Alternatywnie grupa SiMe3 mogłaby być narysowana w pozycji aksjalnej, jeśli wyjściowym alliloborem byłby diastereoizomer (Z).
Alternatywnie możliwe jest wytwarzanie alkoholu erytro-sililowego, w którym kwasowa eliminacja prowadziłaby do izomeru cis, a zasadowa eliminacja do izomeru trans, przeciwnie niż w przypadku reakcji eliminacji omówionych powyżej. Oczywiste jest dla fachowców, że na końcu syntezy byłyby otrzymane takie same produkty.
Działanie trietanoloaminą na produkt w stanie przejściowym 63 prowadzi do otrzymania β-trimetylosililoalkoholu 64. Z drugiej strony produkt alliloborowania (trimetylosililoallilo)dialkiloboru daje sililoalkohol 64, w wyniku utleniania z użyciem NaOH/H2O2 lub obróbki wodą. Alkohol 64 przedstawiony na fig. 6 jest diastereoizomerem treo, ponieważ stan przejściowy alliloboru 63 był w konfiguracji (E), chociaż dla fachowca jest zrozumiałe, że inny diastereoizomer mógłby być również wytworzony, gdyby wyjściowym reagentem był (Z)-allilobor. Diastereoselektywność w nowopowstałych centrach chiralności nie jest określana na tym etapie, ze względu na usuwanie tych centrów na późniejszym etapie syntezy. Strukturę β-trimetylosililoalkoholu 64 pokazaną na fig. 6 potwierdzono stosując metody spektralne.
W metodzie syntezy alkenów znanej jako olefinowanie Petersona eliminacja grupy trialkilosililowej i grupy hydroksylowej z β-trimetylosililoalkoholu 64 prowadzi do alkenu, w tym przypadku dienu, z uwagi na podwójne wiązanie już istniejące pomiędzy dwoma końcowymi atomami węgla w łańcuchu. Opis przeprowadzania β-hydroksysilanów w alkeny zamieszczono w publikacji S.E. Thomasa na stronach 68 - 69. Dalszy opis tej reakcji przedstawili P.F. Hurdlik i D. Peterson w „Stereospecific Olefin-Forming Elimination Reactions of β-Hydroxysilanes, J. Am. Chem. Soc, tom 97, nr 6, str. 1464 - 1468 (1975).
W odniesieniu do fig. 6, reakcja eliminacji, przeprowadzająca alkohol 64 w dien może przebiegać zgodnie z jednym z dwóch mechanizmów, w zależności od tego czy reakcję prowadzi się w warunkach kwasowych, czy w zasadowych. Jeden szlak prowadzi do dienu 65, podczas gdy drugi szlak prowadzi do dienu 67. W warunkach kwasowych zachodzi eliminacja typu anty, podczas gdy w warunkach zasadowych zachodzi eliminacja typu syn. Innymi słowy, reakcje eliminacji β-hydroksysilanów są stereo-specyficzne i reakcje wspomagane kwasem i zasadą mają odwrotny przebieg stereochemiczny. Typowymi kwasami dla reakcji wspomaganych kwasami są kwas octowy, kwas siarkowy i różne kwasy Lewisa. Typowymi zasadami są wodorek sodu i wodorek potasu lub t-butanolan potasu. Może się zdarzać, że reakcje eliminacji z użyciem wodorku sodu w THF będą reakcjami powolnymi w temperaturze pokojowej, podczas gdy reakcje eliminacji z użyciem wodorku potasu zachodzą łatwiej.
Stereospecyficzność występuje w tym etapie ciągu przemian, ponieważ eliminacja w warunkach kwasowych wymaga, aby grupy trimetylosililowe i hydroksylowe były w konformacji antyperiplanarnej. W przeciwieństwie do tego, eliminacja w warunkach zasadowych wymaga aby grupy trimetylosililowe i hydroksylowe były w konformacji synperiplanarnej. Te drugie warunki ułatwiają powstawanie silnego wiązania krzem-tlen i pośredniego czteroczłonowego pierścienia, rozpadającego się w sposób analogiczny do końcowego etapu reakcji Wittiga. Dla fachowca jest zrozumiałe, że silne wiązanie krzemtlen zastępuje słabsze wiązanie krzem-węgiel, co jest nadrzędne w stosunku do zastępowania silnego wiązania węgiel-tlen słabszym wiązaniem π węgiel-węgiel.
Produktami stereospecyficznej eliminacji β-hydroksyalkilosilanu są zatem acetylo-(E)-1,3-dien 67 i acetylo-(Z)-1,3-dien 65. Tak jak w poprzednich sposobach, grupa zabezpieczająca może być teraz usunięta z każdego z tych dienów, przez podziałanie K2CO3 w metanolu i wodzie. Usuwa się w ten sposób grupę octanową związaną z węglem β grupy aminokwasowej w pozycji 1, odtwarzając alkoholową grupę funkcyjną przy tym atomie węgla. Do zasad innych niż węglan potasu, jakie można stosować do usuwania grupy zabezpieczającej, należą wodorotlenek sodu, węglan sodu, alkoholan sodu i alkoholan potasu.
Na tym etapie synteza jest zasadniczo zakończona. Kompozycje wzbogacone w jeden lub drugi izomer można zmieszać w celu otrzymania żądanego stosunku izomerów w mieszaninie. „Wzbogacenie oznacza, że produkt zawiera co najmniej około 75% wag. tego izomeru. Innymi słowy produkt
PL 210 841 B1 może zawierać do 25% wag. „niepożądanego izomeru. Mieszaninę opracowuje się tak, aby osiągnąć żądany rezultat farmakologiczny.
Sposób 4
Szlak ten realizowany jest również poprzez aldehyd acetylocyklosporyny A 51.
Alternatywny schemat wytwarzania stereoselektywnych izomerów zilustrowano na fig. 7-8. Ten szlak syntezy różni się od poprzednio omówionych tym, że 1) szlak syntezy wytwarzania izomeru (E) ISATX247 przebiega poprzez odmienne związki pośrednie niż w przypadku izomeru (Z), oraz 2) w tych szlakach syntetycznych wykorzystuje się reagenty i/lub związki pośrednie zawierające tytan i lit.
Wiadomo, że reagenty tytanowe są szczególnie użyteczne w syntezie organicznej, ponieważ są one regio- i stereoselektywne w ich reakcjach z aldehydami i ketonami. Ogólną rolę tytanu w chemii stereoselektywnej omówili M.T. Reetz w Organotitanium Reagents in Organic Synthesis (SpringerVerlag, Berlin, 1986), str. VII, 148 - 149 i 164 - 165. Stwierdzono tam, że charakter tytanowego ligandu może być zmieniany w taki sposób, że elektronowa i steryczna natura reagenta może być modyfikowana i wynik stereochemiczny wielu reakcji prowadzących do utworzenia wiązania C-C może być przewidziany. Zgodnie z tym chemizmem, połączenie dwóch centrów prochiralnych cząsteczek achiralnych tworzy dwa centra chiralności. Ogólna reguła rządząca rezultatami stereoselektywnymi jest taka, że enolany w konfiguracji Z lub związki krotylowe metalu tworzą preferencyjnie związki addycyjne syn, podczas gdy reagenty w konfiguracji E sprzyjają diasteroizomerom anty. Tendencje te mogą być ponownie wyjaśnione przez przyjęcie sześcioczłonowego cyklicznego stanu przejściowego o geometrii krzesełkowej.
Konkretny przykład tego typu syntezy stereoselektywnej omówili Y. Ikeda i in. w „Stereoselective Synthesis of (Z)- and (E)-1,3-Alkadienes from Aldehydes Using Organotitanium and Lithium Reagents, Tetrahedron, tom 43, nr 4, str. 723 - 730 (1987). W tej publikacji podano, że allilodifenylofosfinę można stosować do wytwarzania [3-(difenylofosfino)allilo]tytanu, który z kolei można skondensować z aldehydem, a następnie wytworzyć sól fosfoniową, w celu otrzymania (Z)-1,3-alkadienu, w wysoce regio- i stereoselektywny sposób. W przeciwieństwie do tego, litowany tlenek allilodifenylofosfiny można skondensować z aldehydem, prowadząc do otrzymania (E)-1,3-alkadienu, ponownie o pożądanej stereoselektywności.
W nawiązaniu do fig. 7, synteza izomeru (Z) ISATX247 przebiega (tak jak w poprzednich schematach) poprzez wytwarzanie aldehydu acetylocyklosporyny A 51 z cyklosporyny A 34. [3-(Difenylofosfino)allilo]tytan 72 wytwarza się przez deprotonowanie allilodifenylofosfiny 71 mocną zasadą, taką jak t-BuLi, a następnie reakcję produktu z tetraizopropanolanem tytanu. Teoretycznie proponowany stan przejściowy 73 prowadzi do erytro-a-adduktu 74, który może być następnie przeprowadzony w sól β-oksydofosfoniową 75, przez podziałanie na związek 74 jodometanem (Mel). Postuluje się, że obecność stanu przejściowego 73 jest co najmniej częściowo odpowiedzialna za stereoselektywność tego szlaku syntezy.
Zgodnie z przykładowymi sposobami przedstawionymi ogólnie w opisie, metal reagenta metaloorganicznego może być tym ośrodkiem, który reguluje regioselektywność (Ikeda, str. 725). Oznacza to, że aldehyd 51 na fig. 7 reaguje ze związkiem difenylofosfinowym 72 w pozycji α, prowadząc do otrzymania α-adduktu 74, gdyż atom węgla γ grupy difenylofosfinowej jest skoordynowany z metalem, którym w tym przypadku jest tytan. Obserwowaną selektywność Z produktu dienowego można wyjaśnić zakładając występowanie sześcioczłonowego stanu przejściowego 73. Ponieważ postuluje się, że zarówno zajmujący wiele miejsca boczny łańcuch aldehydu cyklosporyny A 35, jak i grupa difenylofosfinowa zajmują pozycje ekwatorialne w stanie przejściowym, to selektywnie tworzy się erytro α-addukt 74, co prowadzi do powstania (Z)-1,3-dienu 76.
W przeciwieństwie do sekwencji reakcji przedstawionych na fig. 7, w którym wytwarza się izomer (Z) ISATX247 poprzez stan przejściowy tytanu, tym sposobem nie wytwarza się tak łatwo izomeru (E). W rzeczywistości doniesiono, że próby syntezy izomeru (E) tym sposobem kończą się niskimi wydajnościami. Natomiast, jak przedstawiono na fig. 8, pochodną litową 82 można poddać reakcji z aldehydem 51 z wytworzeniem stanu przejściowego zawierającego lit 83, z którego tworzy się 1,3-dien o stosunku E/Z większym od około 75:25. Tak jak na fig. 7, wysoka stereoselektywność produktu reakcji jest prawdopodobnie związana ze stanem pośrednim 83, w którym, jak się postuluje, grupa winylowa reagenta zawierającego lit 82 i boczny łańcuch aldehydu cyklosporyny A 51 zajmują pozycję ekwatorialną, tak że otrzymuje się (E)-1,3-dien 84 w sposób stereoselektywny. Jak omówiono poprzednio, pewnych niepożądanych reakcji ubocznych z udziałem octanowych grup zabezpieczających
PL 210 841 B1 można uniknąć we wszystkich syntezach stereoselektywnych przez użycie grup zabezpieczających, takich jak estry benzoesanowe lub etery sililowe.
Wytwarzanie mieszanin
Jak stwierdzono powyżej, pewne mieszaniny izomerów cis i trans ISATX247 odznaczają się jednocześnie zwiększoną skutecznością działania i/lub zmniejszoną toksycznością, w porównaniu do występujących w naturze i znanych obecnie cyklosporyn.
Zgodnie z postaciami wynalazku izomery ISATX247 (i ich pochodne) syntetyzowane są w stereoselektywnych szlakach, różniących się stopniem stereoselektywności. W stereoselektywnych szlakach można wytwarzać pierwszy składnik lub kompozycję wzbogaconą w izomer (E) oraz drugi składnik lub kompozycję wzbogaconą w izomer (Z) i składniki te można następnie połączyć ze sobą w taki sposób, że wytworzona mieszanina ma pożądany stosunek dwóch izomerów. Alternatywnie dopuszcza się, że pierwszy składnik można wytworzyć przez wydzielenie produktu reakcji, w celu wyodrębnienia i wzbogacenia zawartości izomeru (E), oraz drugi składnik można wytworzyć przez wydzielenie produktu reakcji, w celu wyodrębnienia i wzbogacenia zawartości izomeru (Z), W jeszcze innej postaci, warunki reakcji mogą być dostosowane do wytwarzania pożądanego stosunku izomerów bezpośrednio w wytwarzanej mieszaninie.
Zasady te zilustrowano na fig. 9A-C i 10. Na fig. 9A-C pokazano trzy hipotetyczne reakcje syntezy prowadzące do wytworzenia izomerów (E) do (Z) w stosunku odpowiednio około 65 do 35% wag., 50 do 50% wag. oraz 35 do 65% wag. Oczywiście te stosunki są przykładowe i podane tylko do celów ilustracyjnych, w związku z czym mógłby być dobrany dowolny hipotetyczny zestaw liczbowy. Dla fachowca jest oczywiste, że warunki reakcji stosowane do osiągnięcia stosunku podanego na fig. 9A mogą być różne od warunków dla stosunków na fig. 9B i 9C, w celu osiągnięcia innego stosunku izomerów w mieszaninie produktów. Warunki dla każdej reakcji dostosowywano do wytwarzania konkretnego stosunku dwóch izomerów.
W przeciwieństwie do niektórych szlaków syntezy, w których wytwarza się mieszaninę izomerów, izomery można najpierw wytwarzać oddzielnie, a następnie mieszać w ustalonych proporcjach, w celu osiągnięcia żądanego stosunku. Tę koncepcję zilustrowano na fig. 10, gdzie produkt jednego szlaku stereoselektywnego jest wzbogacony w jeden z izomerów, tak że produkt zawiera więcej niż około 75% wag. izomeru (E), a produkt innego szlaku stereoselektywnego jest wzbogacony w inny izomer, tak że ten produkt zawiera więcej niż około 75% wag. izomeru (Z). Te liczby są również przykładowe i czystość żądanego izomeru, powstającego w stereoselektywnym szlaku w jednej z postaci może być większa niż lub równa około 75% wag. Czystość żądanego izomeru może być odpowiednio większa niż lub równa około 80, 85, 90 i 95% wag.
Po oddzielnej syntezie izomerów można je zmieszać w celu osiągnięcia żądanego stosunku, tak jak zilustrowano to na fig. 10. Dla celów ilustracyjnych, takie same hipotetyczne stosunki wybrano na fig. 10, jak i na fig. 9A-C. W nawiązaniu do fig. 10, zmieszano izomery (E) i (Z), otrzymując trzy różne mieszaniny, w których stosunki izomerów (E) do (Z) wynoszą odpowiednio około 65 do 35% wag., 50 do 50% wag. oraz 35 do 65% wag.
Mieszaninę izomerów (E) i (Z) ISATX247 można rozdzielić w ten sposób, że uzyskuje się wzbogacenie mieszaniny w jeden z izomerów, w odniesieniu do drugiego. Przykładowo może być zastosowana reakcja Dielsa-Aldera do przeprowadzania izomeru cis w zamknięty pierścień, w reakcji z alkenem. Jeśli alken związany jest z substratem możliwym do wyodrębnienia (np. odsączalnym), to izomer cis można zasadniczo usunąć z mieszaniny, pozostawiając kompozycję wzbogaconą w izomer trans. Izomer cis można odzyskać ze związku o zamkniętym pierścieniu przez doprowadzenie ciepła, wytwarzając kompozycję wzbogaconą w izomer cis. W ten sposób izomery cis i trans można rozdzielić.
W praktyce stosunek izomerów (E) i (Z) w dowolnej mieszaninie, niezależnie od stopnia stereselektywności sposobu jaki posłużył do ich otrzymania, może przyjmować szeroki zakres wartości. Przykładowo, mieszanina może zawierać około 10 - 90% izomeru (E) i około 90 - 10% izomeru (Z). Przykładowo mieszanina może zawierać około 15 - 85% wag. izomeru (E) i około 85 - 15% wag. izomeru (Z), albo około 25 - 75% wag. izomeru (E) i około 75 - 25% wag. izomeru (Z), albo około 35 - 65% wag. izomeru (E) i około 65 - 35% wag. izomeru (Z), albo około 45 - 55% wag. izomeru (E) i około 55 - 45% wag. izomeru (Z). Mieszaninę izomerów może stanowić mieszanina ISATX247, zawierająca około 45 - 50% wag. izomeru (E) i około 50 - 55% wag. izomeru (Z). Procentowe udziały wagowe podane są w przeliczeniu na całkowitą masę kompozycji i należy rozumieć, że suma procentów wagowych izomeru (E) i izomeru (Z) wynosi 100% wag. Innymi słowy, mieszanina może zawierać 65% wag. izomeru (E) i 35% wag. izomeru (Z) lub vice versa.
PL 210 841 B1
Procentowe udziały jednego lub drugiego izomeru w mieszaninie mogą być zweryfikowane metodą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub innymi znanymi metodami.
Kompozycje farmaceutyczne
Możliwy jest sposób leczenia pacjentów potrzebujących immunosupresji, polegający na podawaniu kompozycji farmaceutycznych zawierających jako składniki czynne mieszaninę wytwarzaną sposobem według wynalazku. Kompozycje te wskazane są w szczególności w stanach autoimmunologicznych i zapalnych oraz stanach związanych z odrzuceniem przeszczepu lub powodujących odrzucenie przeszczepu, np. w leczeniu (w tym łagodzeniu, zmniejszeniu, eliminowaniu lub leczeniu etiologii lub objawów) albo zapobieganiu (w tym znaczącemu lub całkowitemu ograniczeniu, profilaktyce lub unikaniu) następujących przypadków
a) ostre odrzucenie przeszczepu narządów lub tkanek, np. leczenie biorców, np. przeszczepów serca, płuc, łącznie serca i płuc, wątroby, nerek, trzustki, skóry, jelita lub rogówki, szczególnie zapobieganie i/lub leczenie odrzutu pośredniczonego przez komórki T, jak również reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi, takiej jaka następuje po przeszczepie szpiku kostnego.
b) przewlekłe odrzucanie przeszczepionego narządu, w szczególności zapobieganie chorobie naczyń przeszczepu, np. charakteryzującej się zwężeniem tętnic przeszczepu na skutek zgrubienia błony wewnętrznej naczyń, ze względu na proliferację komórek mięśni gładkich i związanych z tym efektów.
c) odrzucanie heteroprzeszczepów, w tym ostre, nadostre i przewlekłe odrzucanie narządu, występujące w przypadku, gdy dawca narządu nie pochodzi z tego samego gatunku co biorca, zwłaszcza odrzuty pośredniczone przez komórki B lub odrzuty pośredniczone przez przeciwciała.
d) choroby autoimmunologiczne i stany zapalne, w szczególności stany zapalne z etiologią obejmującą składnik immunologiczny lub autoimmunologiczny, takie jak zapalenie stanów (np. reumatoidalne zapalenie stawów, przewlekłe postępujące zapalenie stawów i zniekształcające zapalenie stawów) i inne choroby reumatyczne. Konkretnymi chorobami autoimmunologicznymi, które mogą być leczone synergicznymi mieszaninami wytwarzanymi sposobem według wynalazku, są autoimmunologiczne zaburzenia hematologiczne (w tym np. anemia hemolityczna, anemia aplastyczna, wybiórcza aplazja czerwonokrwinkowa i małopłytkowość samoistna), toczeń rumieniowaty układowy, zapalenie wielochrząstkowe, twardzina, ziarniniakowatość Wegenera, zapalenie skórno-mięśniowe, przewlekle aktywne zapalenie wątroby, miastenia, łuszczyca, zespół Stevena-Johnsona, sprue samoistne, (autoimmunologiczna) zapalna choroba jelit (w tym np. wrzodziejące zapalenie okrężnicy i choroba Crohna), oftalmopatia endokrynna, choroba Gravesa, sarkoidoza, stwardnienie rozsiane, pierwotna żółciowa marskość wątroby, cukrzyca młodzieńcza (cukrzyca typu I), zapalenie błony naczyniowej oka (przedniego i tylnego odcinka), wysychające zapalenie rogówki i spojówek oraz wiosenne zapalenie rogówki i spojówek, śródmiąższowe zwłóknienie płuc, artropatia łuszczycowa, zapalenie kłębuszków nerkowych (z lub bez zespołu nerczycowego, np. włącznie z samoistnym zespołem nerczycowym lub nefropatią z minimalnymi zmianami) i młodzieńcze zapalenie skórno-mięśniowe. Autoimmunologiczne i zapalne stany skórne, które także uważa się za możliwe do leczenia i profilaktyki za pomocą synergicznych mieszanin wytwarzanych sposobem według wynalazku, obejmują np. łuszczycę, zapalenie skóry kontaktowe, zapalenie skóry atopowe, wyłysienie plackowate, rumień wielopostaciowy, zapalenie skóry opryszczkowe, twardzinę skóry, bielactwo nabyte, zapalenie naczyń z nadwrażliwości, pokrzywkę, pęcherzowy pemfigoid, liszaj rumieniowaty, pęcherzycę, nabyte pęcherzowe oddzielanie się naskórka oraz inne zapalne lub alergiczne stany skóry, jak również zapalne stany płuc i dróg oddechowych, włączając w to astmę, alergie i pylicę płuc.
Mieszaniny izomerów analogów wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być podawane same lub z farmaceutycznym nośnikiem ciepłokrwistym istotom żywym potrzebującym takiego leczenia. Nośnik farmaceutyczny może być substancją stałą lub cieczą. Mieszaninę można podawać doustnie, miejscowo, pozajelitowo, przez inhalację sprayem lub doodbytniczo, w preparatach w postaci dawkowanej, zawierających zwykłe nietoksyczne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, środki wspomagające i zaróbki. Stosowane w opisie określenie „pozajelitowe obejmuje wstrzykiwania podskórne, dożylne, domięśniowe, wstrzykiwania domostkowe lub metody infuzyjne.
Kompozycje farmaceutyczne zawierające mieszaniny wytwarzane sposobem według wynalazku mogą korzystnie mieć postać odpowiednią do podawania doustnego, np. tabletek, kołaczyków, pastylek do ssania, zawiesin wodnych lub olejowych, proszków lub granulek do dyspergowania, emulsji, kapsułek twardych lub miękkich, syropów lub eliksirów. Kompozycje przeznaczone do podawania doustnego można wytwarzać znanymi sposobami wytwarzania kompozycji farmaceutycznych, przy
PL 210 841 B1 czym takie kompozycje mogą zawierać jeden lub większą liczbę środków wybranych z grupy obejmującej środki słodzące, środki smakowo-zapachowe, środki barwiące i środki konserwujące, w celu uzyskania farmaceutycznie eleganckiego i apetycznego preparatu. Tabletki zawierające składnik czynny zmieszany z nietoksycznymi, farmaceutycznie dopuszczalnymi zaróbkami można również wytwarzać znanymi sposobami. Stosowanymi zaróbkami mogą być np. (1) obojętne rozcieńczalniki, takie jak węglan wapnia, laktoza, fosforan wapnia lub fosforan sodu; (2) środki granulujące i rozsadzające, takie jak skrobia kukurydziana lub kwas alginowy; (3) środki wiążące, takie jak skrobia, żelatyna lub guma arabska, oraz (4) środki poślizgowe, takie jak stearynian magnezu, kwas stearynowy lub talk. Tabletki mogą być niepowlekane lub mogą być powlekane znanymi sposobami dla opóźnienia ich rozpadu i wchłaniania w układzie żołądkowo-jelitowym i zapewnienia przez to opóźnionego działania przez dłuższy okres. Przykładowo można stosować substancję opóźniającą uwalnianie, taką jak monostearynian glicerylu lub distearynian glicerylu. Mogą być one również powlekane metodami opisanymi w opisach patentowych US nr 4256108, 4160452 i 4265874, w celu wytworzenia osmotycznych tabletek terapeutycznych o kontrolowanym uwalnianiu.
W pewnych przypadkach preparaty do podawania doustnego mogą mieć postać twardych żelatynowych kapsułek, w których składnik czynny wymieszany jest z obojętnym stałym rozcieńczalnikiem, np. z węglanem wapnia, fosforanem wapnia lub kaolinem. Mogą one mieć także postać miękkich kapsułek żelatynowych, w których składnik czynny zmieszany jest z wodą lub fazą olejową, na przykład z olejem arachidowym, ciekłą parafiną lub z olejem oliwkowym.
Zawiesiny wodne zazwyczaj zawierają składniki czynne zmieszane z zaróbkami odpowiednimi do wytwarzania zawiesin wodnych. Takimi zaróbkami są (1) środki suspendujące, takie jak sól sodowa karboksymetylocelulozy, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, alginian sodu, poliwinylopirolidon, żywica tragakantowa i guma arabska; albo (2) środki dyspergujące lub zwilżające, którymi mogą być występujące w naturze fosfatydy, takie jak lecytyna, produkt kondensacji tlenku alkilenu z kwasem tłuszczowym, np. stearynian polioksyetylenu, produkt kondensacji tlenku etylenu z alkoholem alifatycznym o długim łańcuchu, np. heptadekaetylenoksycetanol, produkt kondensacji tlenku etylenu z częściowym estrem kwasu tłuszczowego i heksytolu, taki jak monooleinian oksyetylenowanego sorbitu, albo produkt kondensacji tlenku etylenu z częściowym estrem kwasu tłuszczowego i bezwodnika heksytolu, np. monooleinian oksyetylenowanego sorbitanu.
Zawiesiny wodne mogą także zawierać jeden lub większą liczbę środków konserwujących, np. p-hydroksybenzoesan etylu lub n-propylu; jeden lub większą liczbę środków barwiących; jeden lub większą liczbę środków słodzących, takich jak sacharoza, aspartam lub sacharyna.
Zawiesiny olejowe można otrzymać przez wytwarzanie zawiesiny składnika czynnego w oleju roślinnym, np. w oleju arachidowym, oleju oliwkowym, oleju sezamowym lub oleju kokosowym, w tranie rybnym zawierającym kwas tłuszczowy omega 3, albo w oleju mineralnym, takim jak ciekła parafina. Zawiesiny olejowe mogą zawierać środek zagęszczający, np. wosk pszczeli, parafinę twardą lub alkohol cetylowy. Dla uzyskania apetycznego preparatu doustnego można dodać środek słodzący i środek smakowo-zapachowy. Kompozycje te mogą być konserwowane przez dodanie przeciwutleniacza, takiego jak kwas askorbinowy.
Proszki lub granulki do dyspergowania są odpowiednie do przygotowywania zawiesin wodnych. Zawierają one składnik czynny w mieszaninie ze środkiem dyspergującym lub zwilżającym, środkiem suspendującym i jednym lub większą liczbą środków konserwujących. Przykładowymi środkami dyspergującymi lub zwilżającymi oraz środkami suspendującymi są środki wymienione powyżej. Mogą być również obecne dodatkowe zaróbki, np. opisane powyżej środki słodzące, smakowo-zapachowe i barwiące.
Kompozycje farmaceutyczne zawierające mieszaniny wytwarzane sposobem według wynalazku mogą również być w postaci emulsji typu olej w wodzie. Fazę olejową może stanowić olej roślinny, taki jak olej oliwkowy lub olej arachidowy, albo olej mineralny, taki jak ciekła parafina, albo mieszanina tych olejów. Odpowiednimi środkami emulgującymi mogą być (1) występujące w naturze żywice, takie jak guma arabska i żywica tragakantowa, (2) występujące w naturze fosfatydy, takie jak soja i lecytyna, (3) estry lub częściowe estry 30, pochodzące od kwasów tłuszczowych i bezwodników heksytoli, np. monooleinian sorbitanu, (4) produkty kondensacji tych częściowych estrów z tlenkiem etylenu, np. monooleinian oksyetylenowanego sorbitanu. Emulsje mogą także zawierać środki słodzące i środki smakowo-zapachowe.
PL 210 841 B1
Syropy i eliksiry można formułować ze środkami słodzącymi, np. z gliceryną, glikolem propylenowym, sorbitem, aspartamem lub sacharozą. Preparaty takie mogą również zawierać środek łagodzący, środek konserwujący, środek smakowo-zapachowy i środki barwiące.
Kompozycje farmaceutyczne mogą być w postaci jałowych zawiesin wodnych lub olejowych do wstrzykiwań. Zawiesiny te można formułować znanymi sposobami, stosując odpowiednie, wymienione wyżej środki dyspergujące lub zwilżające oraz suspendujące. Jałowy preparat do wstrzykiwań może mieć także postać jałowych roztworów lub zawiesin do wstrzykiwań w nietoksycznym pozajelitowo dopuszczalnym rozcieńczalniku lub rozpuszczalniku, np. w 1,3-butanodiolu. Do dopuszczalnych zaróbek i rozpuszczalników, jakie można stosować, należy woda, roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Dodatkowo jako rozpuszczalniki lub ośrodki suspendujące zwykle stosuje się jałowe nielotne oleje roślinne. Można w tym celu stosować dowolny obojętny ciekły olej, w tym syntetyczne mono- lub diglicerydy. Dodatkowo w preparatach do wstrzykiwań znajdują zastosowanie kwasy tłuszczowe, takie jak kwas oleinowy.
Mieszaniny wytwarzane sposobem według wynalazku można również podawać w postaci czopków do doodbytniczego podawania leku. Kompozycje te można wytwarzać przez zmieszanie leku z odpowiednią, niedrażniącą zaróbką, stałą w zwykłych temperaturach, ale ciekłą w temperaturze odbytu i z tego względu topiącą się w odbytnicy z uwolnieniem leku. Takimi składnikami są masło kakaowe i glikole polietylenowe.
Do stosowania miejscowego wykorzystuje się kremy, maści, żele, roztwory lub zawiesiny, itp., zawierające ujawnione cyklosporyny.
Korzystnie stosuje się ciekły roztwór zawierający jako składniki nieaktywne środek powierzchniowo czynny, etanol, rozpuszczalnik lipofilowy i/lub amfifilowy. Konkretnie stosuje się doustną wieloskładnikową emulsję zawierającą mieszaninę izomerów analogów wytwarzanych sposobem według wynalazku oraz następujące składniki nielecznicze: bursztynian d-a-tokoferylo-glikolu polietylenowego 1000 (witamina E TPGS), olej triglicerydowy o średnim łańcuchu (MCT), Tween 40 i etanol. Korzystnie można również stosować miękką kapsułkę żelatynową (zawierającą żelatynę, glicerynę, wodę i sorbit), zawierającą mieszaninę izomerów analogów wytwarzanych sposobem według wynalazku oraz takie same nielecznicze składniki jakie zawiera roztwór doustny.
W leczeniu wyżej wymienionych stanów dzienny poziom dawkowania wynosi około 0,05 - 50 mg/kg masy ciała. Poziom dawki i harmonogram podawania mogą zmieniać się w zależności od rodzaju stosowanej mieszaniny izomerów, stanu osoby leczonej i dodatkowych czynników, takich jak wiek i stan pacjenta. Korzystne dawki wynoszą około 0,5 - 10 mg/kg/dzień oraz około 0,1 - 10 mg/kg/dzień. W korzystnej postaci dawkę około 2 - 6 mg/kg/dzień podaje się doustnie dwa razy dziennie. W szczególnie korzystnej postaci dawkę około 0,5 - 3 mg/kg/dzień podaje się doustnie dwa razy dziennie.
Ilość składnika czynnego, jaka może być połączona ze składnikami nośnika przy wytwarzaniu pojedynczej postaci dawkowanej zmienia się zależnie od leczonego osobnika i sposobu podawania. Przykładowo preparat przeznaczony do podawania doustnego ludziom może zawierać od 2,5 mg do
2,5 g środka czynnego połączonego z właściwą i dogodną ilością materiału nośnikowego, który stanowi 5 - 95% całości kompozycji. Jednostkowe postacie dawkowane na ogół zawierają około 5 - 500 mg składnika czynnego. W korzystnej postaci do doustnego podawania stosuje się pojedyncze kapsułki zawierające około 50 mg mieszaniny izomerów. W innej korzystnej postaci do doustnego podawania stosuje się roztwory zawierające około 50 mg/ml mieszaniny izomerów.
Należy jednak rozumieć, że konkretny poziom dawki dla poszczególnego pacjenta zależy od różnorodnych czynników, włączając w to aktywność stosowanego związku, wiek, dietę, masę ciała, ogólny stan zdrowia, płeć, czas podawania, drogę podawania, szybkość wydalania, połączenie leków oraz charakter i ciężkość konkretnej leczonej choroby lub stanu.
Metodologia
Stosowanie pochodnych cyklosporyny, klasy cyklicznych polipeptydów wytwarzanych przez grzyb Tolypocladium inflatum Gams, zwiększa się w immunosupresyjnej terapii, ze względu na korzystny wpływ na reakcje, w których pośredniczą komórki T. Zaobserwowano, że pochodne cyklosporyny odwracalnie hamują immunokompetentne limfocyty, zwłaszcza limfocyty T, jak również hamują wytwarzanie i uwalnianie limfokiny. Działanie to wywoływane jest głównie przez pobudzane cyklosporyną A hamowanie kalcyneuryny, fosfatazowego enzymu znalezionego w cytoplazmie komórek (Schreiber i Crabtree, 1992). Wskaźnikiem skuteczności cyklosporyny A lub pochodnej cyklosporyny A jest ich zdolność do hamowania fosfatazowej aktywności kalcyneuryny. W teście hamowania kal20
PL 210 841 B1 cyneuryny mierzy się aktywność leku w miejscu jego działania, w związku z czym jest to najdokładniejsza i bezpośrednia ocena in vitro skuteczności analogów cyklosporyny A (Fruman i in., 1992).
ISATX247 jest analogiem cyklosporyny A podobnym do cyklosporyny A z wyjątkiem nowej modyfikacji funkcyjnej grupy w grupie aminokwasowej w pozycji 1. Obecnie stwierdzono, że ISATX247 wykazuje do 3 razy większą skuteczność niż cyklosporyna A w teście hamowania kalcyneuryny in vitro.
Badania farmakodynamiczne (in vivo i in vitro) wykazały, że ISATX247 ma większą skuteczność niż inne istniejące związki cyklosporynowe. Skuteczność mieszaniny izomerów analogów cyklosporyny o składzie od około 10:90 do około 90:10 (trans- do cis-), w szczególności ISATX247 zawierającego 50 - 55% izomeru Z i 45 - 50% izomeru E, jako środka immunosupresyjnego (w porównaniu do cyklosporyny A) zademonstrowano w teście aktywności kalcyneuryny in vitro, modelu przeszczepu serca szczura, modelu aloprzeszczepu komórek wysp trzustkowych u myszy, modelu zapalenia stawów u myszy wywołanego kolagenem i/lub modelu zapalenia stawów u królika wywołanego antygenem. Dane te pokazują, że mieszaniny izomerów są równoważne lub bardziej skuteczne niż cyklosporyna A i z tego powodu są użyteczne w leczeniu zaburzeń immunoregulacyjnych.
Obserwuje się liczne działania niepożądane związane z terapią cyklosporyną A, w tym nefrotoksyczność, toksyczność w stosunku do wątroby, powodowanie zaćmy, nadmierne owłosienie, paratezję i rozrost dziąseł (Sketris i in., 1995). Z wymienionych, jednym z najpoważniejszych działań niepożądanych jest nefrotoksyczność, zależna od wielkości dawki podawanej cyklosporyny A. Dokładny mechanizm powodowania przez cyklosporynę A uszkodzeń nerek nie jest znany. Jednakże wysunięto hipotezę, że wzrost poziomu substancji zwężających naczynia w nerkach prowadzi do miejscowego zwężenia doprowadzających tętniczek kłębkowych. Rezultatem tego może być niedokrwienie nerek, zmniejszenie szybkości filtracji kłębkowej i w długim okresie zwłóknienie śródmiąższowe.
Niekliniczne bezpieczeństwo ISATX247 oszacowano na pewnej liczbie gatunków zwierząt. Badania toksyczności przy powtarzalnych dawkach doustnych u szczurów, psów i naczelnych wykazały, że ISATX247 jest dobrze tolerowany i doprowadzał do efektów odpowiadających immunosupresyjności. Jedynym zauważonym we wszystkich gatunkach efektem toksykologicznym była biegunka/wolne stolce.
ISATX247 nie wykazuje działania mutagennego, co wykazano w testach in vitro bakteryjnej mutacji wstecznej i aberracji chromosomowej oraz testu in vivo mikrojądra u szczurów. Nie zakończono badań nad rakotwórczością. Badania toksyczności ciążowej ISATX247 przeprowadzono na szczurach i królikach. Nie stwierdzono żadnych związanych z leczeniem wad rozwojowych lub zmian. Przy dawkach które powodowały toksyczność u matki, obserwowano także wpływ toksyczny na zarodek.
Poniżej opisano figury rysunku powołane w opisie wynalazku.
Fig. 1A przedstawia strukturę cyklosporyny A, ilustrując 11 grup aminokwasowych tworzących pierścień cyklopeptydowy, jak również budowę bocznego łańcucha aminokwasowego w pozycji 1;
Fig. 1B stanowi inną ilustrację cyklosporyny A, ze szczególnym uwypukleniem znaczenia używanego w opisie określenia „CsA;
Fig. 2A przedstawia strukturę izomeru (E) (lub izomeru trans) analogu cyklosporyny A o nazwie ISATX247;
Fig. 2B przedstawia strukturę izomeru (Z) (lub izomeru cis) analogu cyklosporyny A ISATX247;
Fig. 3 przedstawia przegląd przykładowych szlaków syntezy, które można zastosować do wytwarzania analogów cyklosporyny zgodnie z wynalazkiem, przy czym stereoselektywne szlaki są pogrupowane według warunków reakcji;
Fig. 4 przedstawia szlak syntezy prowadzącej do wytworzenia izomerów (E) i (Z) ISATX247 z prekursora bromowego;
Fig. 5 przedstawia inny szlak syntezy prowadzącej do wytworzenia izomerów (E) i (Z) ISATX247 z prekursora aldehydowego;
Fig. 6 przedstawia przykładowy schemat stereoselektywnej reakcji, który można zastosować do wytwarzania kompozycji wzbogaconych w izomer (E) lub w izomer (Z) ISATX247, przy czym każdy z izomerów może być wytworzony z tego samego alkoholu prekursorowego;
Fig. 7 przedstawia alternatywny schemat stereoselektywnej syntezy kompozycji wzbogaconej w izomer (Z) ISATX247;
Fig. 8 przedstawia alternatywny schemat stereoselektywnej syntezy kompozycji wzbogaconej w izomer (E) ISATX247;
PL 210 841 B1
Fig. 9A-C przedstawia przykładowe szlaki syntezy mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, przy czym warunki każdej reakcji są dostosowane do wytwarzania przykładowego konkretnego stosunku dwóch izomerów;
Fig. 10 przedstawia przykładowe steroselektywne szlaki wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, w których najpierw wytwarza się kompozycje wzbogacone w jeden z dwóch izomerów, a następnie miesza się je ze sobą zgodnie z ustalonymi proporcjami, w celu osiągnięcia pożądanego stosunku;
Fig. 11 przedstawia wyniki testu wykazującego, że hamowanie aktywności fosfatazy kalcyneurynowej przez ISATX247 (45 - 50% izomeru (E) i 50 - 55% izomeru (Z)) było do 3 razy skuteczniejsze (oznaczone przez IC50) w porównaniu do cyklosporyny A.
Fig. 12 przedstawia strukturę i skład izomeryczny pewnych mieszanin izomerycznych deuterowanych i niedeuterowanych analogów.
Fig. 13 przedstawia wyniki testu wykazującego, że hamowanie aktywności fosfatazy kalcyneurynowej przez różne mieszaniny izomeryczne deuterowanych i niedeuterowanych analogów było co najmniej równie skuteczne (na podstawie IC50), jak w przypadku cyklosporyny A.
Wynalazek ilustrują następujące przykłady.
P r z y k ł a d 1. Acetylowanie cyklosporyny A
Do cyklosporyny A (50,0 gramów, 41,6 milimola) w atmosferze N2 dodano bezwodnik octowy (140 mililitrów) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej do rozpuszczenia się cyklosporyny A. Dodano dimetyloaminopirydynę (7,62 g, 62,4 mmola) i w atmosferze N2 mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny do zakończenia reakcji. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 5°C, a następnie przesączono. Otrzymaną substancję stałą przemyto heksanem w celu usunięcia dodatkowej ilości bezwodnika octowego. Otrzymaną pastowatą substancję stałą przeniesiono powoli w trakcie intensywnego mieszania do 5% wodnego roztworu wodorowęglanu sodu (1,5 litra). Otrzymaną zawiesinę mieszano do otrzymania drobnoziarnistej zawiesiny i ustania wydzielania się CO2. Substancję stałą odsączono i przemyto wodą do uzyskania przesączu o obojętnym pH. Stały produkt wysuszono przez noc w suszarce próżniowej (55°C) i otrzymano 44,0 g (85%) produktu w postaci bezbarwnej substancji stałej.
P r z y k ł a d 2. Utlenianie produktu z przykładu 1
Do acetylocyklosporyny A (42,97 g, 34,54 mmola) dodano acetonitryl (320 ml) i wodę (80 ml), po czym mieszaninę mieszano do rozpuszczenia całego materiału. Dodano nadjodan sodu (14,77 g, 69,08 mmola). Następnie dodano hydrat chlorku rutenu (0,358 g, 1,73 mmola) i w atmosferze N2 mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Dodano wodę (300 ml) i mieszaninę przeniesiono do rozdzielacza. Mieszaninę wyekstrahowano dwukrotnie octanem etylu (300 ml, a następnie 250 ml). Ciemnoczarne ekstrakty octanu etylu połączono ze sobą i przemyto 250 ml wody, a następnie 250 ml solanki. Roztwór organiczny wysuszono nad MgSO4 i rozpuszczalnik odparowano, w wyniku czego otrzymano zielonkawoczarną substancję stałą. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny 40% aceton/60% heksan i otrzymano produkt (29,1 g, 68%) w postaci bezbarwnej substancji stałej.
P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie acetylo-ISATX247 i) Wytwarzanie ylidu in situ
Do 340 ml toluenu dodano aldehyd acetylocyklosporyny A (31,84 g, 25,84 mmola) i mieszaninę mieszano do rozpuszczenia całego substratu. Do otrzymanego roztworu dodano 340 ml 1N wodnego roztworu wodorotlenku sodu. Otrzymaną mieszaninę mieszano intensywnie i dodano bromek allilotrifenylofosfoniowy (58,22 g, 151,90 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, a następnie dodano dodatkową ilość bromku allilotrifenylofosfoniowego (16,64 g, 43,42 mmola) i mieszanie kontynuowano przez dalsze 24 godziny. Mieszaninę przeniesiono do rozdzielacza i oddzielono fazę toluenową. Fazę wodną wyekstrahowano dodatkowo 200 ml toluenu. Połączono dwa ekstrakty toluenowe i przemyto kolejno 200 ml dejonizowanej wody i 200 ml nasyconego wodnego roztworu chlorku sodu. Roztwór wysuszono nad MgSO4, przesączono i odparowano toluen, w wyniku czego uzyskano bardzo lepki żel. Na produkt ten podziałano 142 ml octanu etylu i mieszano do uzyskania drobnoziarnistej zawiesiny. W trakcie szybkiego mieszania dodano powoli heksan (570 ml). Mieszanie kontynuowano przez 30 minut, otrzymaną zawiesinę przesączono i zebraną substancję stałą przemyto 160 ml mieszaniny 5:1 heksan/octan etylu. Połączone przesącze zatężono w wyparce obrotowej do lepkiej substancji półstałej. Na tę substancję podziałano 75 ml octanu etylu i mieszano do otrzymania drobnoziarnistej zawiesiny. W trakcie szybkiego mieszania dodano powoli
PL 210 841 B1 heksan (225 ml). Mieszanie kontynuowano przez 30 minut, otrzymaną zawiesinę przesączono i otrzymaną substancję stałą przemyto 100 ml mieszaniny 5:1 heksan/octan etylu. Przesącz zatężono w wyparce obrotowej i otrzymano jasnożółtą substancję stałą. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny 40% aceton/60% heksan i otrzymano produkt (14,09 g) w postaci bezbarwnej substancji stałej.
ii) Wytwarzanie ylidu i reakcja w obecności LiBr
Do zawiesiny bromku allilotrifenylofosfoniowego (7,67 g, 20 mmoli) w THF (20 ml) ochłodzonej do 0°C w trakcie mieszania dodano roztwór KO-t-Bu w tetrahydrofuranie (20 ml, 20 mmoli, 1M roztwór). Następnie w tej temperaturze kontynuowano mieszanie przez 30 minut i dodano roztwór LiBr w THF (10 ml, 10 mmoli, 1M roztwór). Mieszaninę mieszano przez 30 minut i przez kaniulę dodano roztwór aldehydu acetylo-CsA (4,93 g, 4 mmole) w THF (10 ml). Po mieszaniu przez 15 minut w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną zadano nasyconym roztworem NH4CI (25 ml). Obróbkę i chromatografię prowadzono w sposób opisany powyżej, w wyniku czego otrzymano acetylowany ISATX247, w postaci bezbarwnej substancji stałej (3,5 g).
P r z y k ł a d 4. Wytwarzanie ISATX247
Acetylo-ISATX247 (14,6 g, 11,62 mmola) rozpuszczono w 340 ml metanolu i następnie dodano 135 ml dejonizowanej wody. Dodano węglan potasu (13,36 g, 96,66 mmola) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 - 48 godzin do zakończenia reakcji. Odparowano większość metanolu i w trakcie mieszania dodano 250 ml octanu etylu. Powoli dodano 10% wodnego roztworu kwasu cytrynowego (120 ml), a następnie oddzielono fazę octanu etylu. Fazę wodną wyekstrahowano dodatkową 200 ml porcją octanu etylu. Połączone ekstrakty octanu etylu przemyto kolejno 150 ml dejonizowanej wody, 100 ml 10% wodnego roztworu kwasu cytrynowego i 150 ml nasyconego wodnego roztworu chlorku sodu, a następnie wysuszono nad MgSO4. Odparowano octan etylu i uzyskano jasnożółtą substancję stałą. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny 40% aceton/60% heksan i otrzymano ISATX247 (10,51 g, 75%), w postaci bezbarwnej substancji stałej. ISATX247 zawierał 45 - 50% izomeru E i 50 - 55% izomeru Z.
Produkty z przykładów 1-4 scharakteryzowano metodą spektrometrii masowej i/lub spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego.
P r z y k ł a d 5. Wytwarzanie acetylo-n-bromocyklosporyny A
Acetylocyklosporynę A (41,48 g, 33,3 mmola) wytworzoną jak w przykładzie 1, N-bromosukcynoimid (10,39 g, 58,4 mmola) i azo-bis-izobutyronitryl (1,09 g, 6,67 mmola) rozpuszczono w 250 ml tetrachlorku węgla i otrzymaną mieszaninę ogrzewano 2,5 godziny w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin. Mieszaninę ochłodzono i rozpuszczalnik odparowano. Na pozostałość podziałano 350 ml eteru dietylowego i przesączono w celu usunięcia substancji nierozpuszczalnej. Przesącz przemyto kolejno 150 ml wody i 150 ml solanki, wysuszono nad MgSO4 i rozpuszczalnik odparowano. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny (2:3) aceton/heksan, w wyniku czego otrzymano 28,57 g (65%) acetylo-Y-bromocyklosporyny A, w postaci żółtej substancji stałej.
P r z y k ł a d 6. Wytwarzanie bromku trifenylofosfoniowego acetylocyklosporyny A
Acetylo-Y-bromocyklosporynę A (28,55 g, 21,6 mmola) i trifenylofosfinę (7,55 g, 28,8 mmola) rozpuszczono w 210 ml toluenu i otrzymany roztwór ogrzewano do 100°C przez 21 godzin. Roztwór ochłodzono i odparowano toluen. Na otrzymaną oleistą substancję półstałą podziałano 250 ml mieszaniny heksan/eter (1:4), starannie wymieszano i zdekantowano rozpuszczalnik. Proces ten powtórzono jeszcze 3 razy z 150 ml eteru. Pozostałość następnie rozpuszczono w 50 ml octanu etylu i wytrącono 220 ml heksanu. Powstałą substancję stałą odsączono i otrzymano 22,5 g (66%) bromku trifenylofosfoniowego acetylocyklosporyny A, w postaci jasnobrązowej substancji stałej.
P r z y k ł a d 7. Reakcja Wittiga
Bromek trifenylofosfoniowy acetylocyklosporyny A (100 mg, 0,06 mmola), nadmiar 37% formaldehydu (0,25 ml) i toluen (2 ml) mieszano szybko w temperaturze pokojowej. Wkroplono 1N wodny roztwór wodorotlenku sodu (2 ml) i mieszanie kontynuowano przez 3,5 godziny. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu (20 ml) i wodą (10 ml). Fazę octanu etylu oddzielono, przemyto kolejno wodą (10 ml) i solanką (10 ml), wysuszono nad siarczanem magnezu i rozpuszczalnik odparowano. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny (2:3) aceton/heksan, w wyniku czego otrzymano 70 mg (88%) mieszaniny izomerów (E) i (Z) acetyloISATX247, w postaci bezbarwnej substancji stałej.
PL 210 841 B1
P r z y k ł a d 8. Odacetylowanie produktu reakcji Wittiga
Mieszaninę izomerów z przykładu 7 (70 mg, 0,056 mmola) rozpuszczono w metanolu (5 ml), a następnie dodano wodę (1 ml). Dodano węglan potasu (75 mg) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 19 godzin. Odparowano większość metanolu i do pozostałości dodano 15 ml octanu etylu, a następnie 10 ml 10% wodnego roztworu kwasu cytrynowego. Oddzielono fazę octanu etylu, a fazę wodną wyekstrahowano dodatkowymi 10 ml octanu etylu. Przed wysuszeniem nad siarczanem magnezu i odparowaniem rozpuszczalnika, połączone ekstrakty octanu etylu przemyto kolejno 10 ml wody, 10 ml 10% wodnego roztworu kwasu cytrynowego i 10 ml solanki. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny (2:3) aceton/heksan, w wyniku czego otrzymano 37 mg (54%) ISATX247, w postaci bezbarwnej substancji stałej zawierającej około 85% izomeru E i około 15% izomeru Z.
Produkty z przykładów 5-8 scharakteryzowano metodą spektrometrii masowej i/lub spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego.
P r z y k ł a d 9. Wytwarzanie izomerów geometrycznych ISATX247
Izomery cis i trans ISATX247 można niezależnie otrzymać w następujący sposób. Sekwencja obejmuje znane metalowanie allilotrimetylosilanu, elektrofilowy wychwyt przez boran trimetylu, z następującą potem hydrolizą, a potem transestryfikację z wytworzeniem pośredniego estru, trans-(trimetylosililo)alliloboronianu. Alliloborowanie aldehydu cyklosporyny prowadzi do wytworzenia pośredniego związku boru, który przez kompleksowanie przeprowadza się w żądany β-trimetylosililo-alkohol. Na tym etapie nie jest określana diastereoselektywność przy tworzeniu się nowych centrów chiralności, gdyż centra te są usuwane w późniejszym etapie. Należy zauważyć, że zgodnie z oczekiwaniami względna stereochemia dwóch centrów w β-trimetylosililoalkoholu jest anty i wynika z wiązania podwójnego trans w prekursorze, trans-(trimetylosililo)alliloboronianie.
Eliminacja z udziałem zasady (Hudrlick i in., 1975) β-trimetylosililoalkoholu prowadzi do kompozycji wzbogaconej w acetylo-(Z)-1,3-dien, podczas gdy eliminacja z udziałem kwasu prowadzi do kompozycji wzbogaconej w acetylo-(E)-1,3-dien. Odbezpieczanie prowadzi do odpowiednich alkoholi dienowych, odpowiednio izomerów (Z) i (E) ISATX247.
W alternatywnym podejściu do dienów stosuje się związki allilofosforowe. Metalowanie allilodifenylofosfiny, a następnie transmetalowanie z użyciem Ti(O-i-Pr)4 prowadzi do wytworzenia pośredniego związku tytanu. W wyniku allilotytanowania, z następującą potem stereospecyficzną eliminacją, otrzymuje się kompozycję wzbogaconą w dien (Z).
Z drugiej strony, jeśli tlenek allilodifenylofosfiny zastosuje się w podobnej sekwencji reakcji (fig. 8), to otrzyma się głównie (75%) izomer (E).
i) Alliloborowanie acetylo-CsA-CHO (E)-1-Trimetylosililo-1-propeno-3-boronian wytworzono sposobami uprzednio opisanymi (Ikeda i in., 1987). W atmosferze azotu do roztworu (E)-1-trimetylosililo-1-propeno-3-boronianu (0,2 g, 0,832 mmola) w THF (3 ml) w trakcie mieszania dodano aldehyd acetylocyklosporyny A (1,026 g, 0,832 mmola). Mieszaninę reakcyjną monitorowano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (kolumna C-8, odwrócony układ faz) i mieszano ją przez 7 dni. Następnie dodano trietanoloaminę (0,196 g, 1,3 mmola) i mieszanie kontynuowano przez dalsze 4 dni. β-Trimetylosililoalkohol otrzymano przez oczyszczanie w kolumnie z żelem krzemionkowym. MS (ES) m/z 1368,9 (M + Na+).
Do zawiesiny KH (3,5 mg, 26,4 μmola, 30% dyspersja oleju mineralnego przemyta bezwodnymi heksanami) w bezwodnym THF (1 ml) dodano β-trimetylosililoalkohol (10 mg, 7,4 mikromoli) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono eterem dietylowym (10 ml), a następnie przemyto nasyconym roztworem NaHCO3 (2 x 5 ml). Po wysuszeniu (Na2SO4) i usunięciu rozpuszczalnika otrzymano wzbogacony (Z)-acetylo-1,3-dien. MS (ES) m/z
1294,8 (M + K+).
ii) Allilotytanowanie acetylo-CsA-CHO
Do ochłodzonego (-78°C) roztworu allilodifenylofosfiny (0,54 g, 2,4 mmola) w bezwodnym THF (8 ml) w trakcie mieszania dodano t-BuLi (1,42 ml, 2,4 mmola, 1,7M roztwór w pentanie). W tej temperaturze ceglastoczerwony roztwór mieszano przez 15 minut, a następnie w 0°C przez 30 minut. Mieszaninę ponownie ochłodzono do -78°C i dodano Ti(O-i-Pr)4 (0,71 ml, 2,4 mmola). W tej temperaturze brązowy roztwór mieszano przez 15 minut, po czym przez kaniulę dodano roztwór acetylo-CsA-CHO (2,5 g, 2 mmole) w THF (10 ml). Jasnożółty roztwór mieszano przez kolejne 30 minut, a następnie przez noc ogrzano do temperatury pokojowej. W temperaturze 0°C do mieszaniny reakcyjnej dodano Mel (0,15 ml, 2,4 mmola). W tej temperaturze kontynuowano mieszanie przez 1 godzinę, a następnie
PL 210 841 B1 w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną wlano do lodowatego 1% HCl (100 ml). Warstwę wodną wyekstrahowano EtOAc (3 x 50 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto wodą (2 x 25 ml) i solanką (25 ml). Po usunięciu rozpuszczalnika otrzymano żółtą substancję stałą, którą poddano chromatografii w kolumnie z żelem krzemionkowym. W wyniku elucji mieszaniną 1:3 aceton/heksany otrzymano acetylo-ISATX247 wzbogacony w izomer (Z). Jak w przykładzie 4 odbezpieczanie doprowadziło do ISATX247 wzbogaconego w izomer (Z) (stosunek Z/E, 75:25).
P r z y k ł a d 10. Wytwarzanie mieszaniny izomerów ISATX247 wzbogaconej w izomer (E)
Do roztworu tlenku allilodifenylofosfiny (1 mmol) i heksametylofosforoamidu (2 mmole) w tetrahydrofuranie (5 ml) dodano w -78°C n-butylolit (1 mmol, w heksanach). Mieszaninę mieszano w -78°C przez 30 minut. Dodano roztwór aldehydu acetylocyklosporyny A (0,8 mmola) w tetrahydrofuranie (7 ml) i pozostawiono mieszaninę reakcyjną do stopniowego ogrzania się do temperatury pokojowej, a następnie mieszano ją przez 18 godzin. Mieszaninę wlano do lodowato zimnego 1N kwasu chlorowodorowego (50 ml), a następnie przeprowadzono ekstrakcję octanem etylu. Ekstrakt organiczny przemyto wodą, wysuszono nad siarczanem magnezu i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny 25% aceton/75% heksany, w wyniku czego otrzymano mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-ISATX247. Po usunięciu octanowej grupy zabezpieczającej, jak opisano w przykładzie 4, otrzymano mieszaninę izomerów ISATX247 wzbogaconą w izomer (E). Protonowa spektroskopia NMR wykazała, że mieszanina zawierała 75% izomeru (E) i 25% izomeru (Z) ISATX247. Reakcję tę przeprowadzono również zgodnie z modyfikacją Schlossera (R. Liu, M. Schlosser, Synlett, 1996, 1195). Do ochłodzonego (-78°C) roztworu tlenku allilodifenylofosfiny (1,21 g, 5 mmoli) w THF (20 ml) w trakcie mieszania dodano n-BuLi (2 ml, 5 mmol, 2,5M roztwór w heksanach). Czerwony roztwór mieszano przez 40 minut w -78°C. Następnie przez kaniulę dodano w ciągu 15 minut roztwór acetylo-CsA-CHO (1,25 g, 1,02 mmola) w THF (12 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Po obróbce tej mieszaniny i chromatografii w sposób opisany powyżej otrzymano acetylo-ISATX247 (stosunek Z:E wynosił 40:60, oznaczony na podstawie analizy 1H NMR).
P r z y k ł a d 11. Wytwarzanie cyklosporyny A zabezpieczonej grupą benzoilową Cyklosporynę A (6,01 g, 5 mmoli) i 4-dimetyloaminopirydynę (305 mg, 2,5 mmola) rozpuszczono w pirydynie (5 ml). Dodano bezwodnik benzoesowy (3,4 g, 15 mmoli) i mieszaninę mieszano przez 19 godzin w 50°C. Dodano więcej bezwodnika benzoesowego (1,7 g, 7,5 mmola) i DMAP (305 mg,
2,5 mmola) i w 50°C kontynuowano mieszanie przez dalsze 24 godziny. Dodano bezwodnik benzoesowy (0,85 g, 3,8 mmola) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez dodatkowe 23 godziny. Następnie mieszaninę reakcyjną wlano powoli do wody, w trakcie mieszania roztworu. Wytrącony benzoesan cyklosporyny A odsączono i przemyto wodą. Zebrany placek filtracyjny rozpuszczono w minimalnej ilości metanolu, dodano 10% roztworu kwasu cytrynowego i mieszaninę mieszano przez 1 godzinę. Wytrącony produkt odsączono i przemyto wodą do uzyskania pH przesączu, takiego samego jak woda. Stały benzoesan cyklosporyny A wysuszono w 50°C pod próżnią i otrzymano bezbarwną substancję stałą.
P r z y k ł a d 12. Wytwarzanie cyklosporyny A zabezpieczonej eterową grupą trietylosililową Cyklosporynę A (3,606 g, 3 mmole) rozpuszczono w bezwodnej pirydynie (8 ml) i dodano
DMAP (122 mg, 1 mmol). Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C, a następnie wkroplono trifluorometanosulfonian trietylosililu (3,6 mmola). Mieszaninę pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano ją przez noc. Następnie mieszaninę reakcyjną wlano powoli do wody, w trakcie mieszania. Wytrącony eter trietylosililowy odsączono i przemyto wodą. Zebrany placek filtracyjny rozpuszczono w minimalnej ilości metanolu, dodano 5% roztwór kwasu cytrynowego i mieszaninę mieszano przez 30 minut. Wytrącony produkt odsączono i przemyto wodą do uzyskania pH przesączu, takiego samego jak woda. Stały eter trietylosililowy wysuszono w 50°C pod próżnią i otrzymano bezbarwną substancję stałą. Grupy zabezpieczające triizopropylosililową i t-butylodimetylosililową również wprowadzano stosując analogiczny sposób postępowania.
P r z y k ł a d 13. Test aktywności immunosupresyjnej z zastosowaniem hamowania kalcyneuryny Wskaźnikiem skuteczności cyklosporyny A lub pochodnej cyklosporyny A jest ich zdolność do hamowania fosfatazowej aktywności kalcyneuryny. W teście hamowania kalcyneuryny mierzy się aktywność leku w miejscu jego działania, w związku z czym jest to bezpośrednia ocena in vitro skuteczności analogów cyklosporyny A (Fruman i in., 1992).
Immunosupresyjną aktywność ISATX247 (45 - 50% izomeru E i 50 - 55% izomeru Z) w porównaniu z cyklosporyną A oszacowano w teście hamowania kalcyneuryny (CN). Rezultaty tego testu
PL 210 841 B1 pokazują, że hamowanie fosfatazowej aktywności kalcyneuryny przez ISATX247 (45 - 50% izomeru Z i 50 - 55% izomeru E) było do 3 razy silniejsze (na podstawie IC50) w porównaniu z cyklosporyną A (fig. 11).
Immunosupresyjną aktywność różnych mieszanin izomerów deuterowanych i niedeuterowanych analogów, w porównaniu z cyklosporyną A, oszacowano stosując test hamowania kalcyneuryny (CN). Strukturę i skład izomeryczny kompozycji tych analogów przedstawiono na fig. 12. Na fig. 12 oznaczenie „I4 odpowiada strukturze ISATX247. I4-M2 oznacza ISATX247 wytworzony sposobem opisanym w przykładach 5-8 (oznaczonych na tym rysunku jako sposób 2). I4-D4 oznacza deuterowany ISATX247 wytworzony sposobem opisanym w przykładach 1-4. I4-D2 oznacza deuterowany ISATX247 wytworzony sposobem opisanym w przykładach 5-8. Inne mieszaniny izomerów opisane są na rysunku.
Wyniki tego testu pokazują, że hamowanie aktywności fosfatazy kalcyneurynowej przez te mieszaniny izomerów analogów było co najmniej tak skuteczne (na podstawie IC50) jak hamowanie przez cyklosporynę A (fig. 13). CsA oznacza cyklosporynę A; Izocyklo4 oznacza ISATX247 wytworzony sposobem opisanym w przykładach 1-4. Izocyklo5 odpowiada I5-M1 z fig. 12. Izocyklo4-d4 odpowiada I4-D4 z fig. 12. Izocyklo5-d5 odpowiada I5-D5 z fig. 12. Izocyklo4-d2 odpowiada I4-D2 z fig. 12. Izocyklo4-M2 odpowiada I4-M2 z fig. 12. Izocyklo5-M2 odpowiada I5-M5 z fig. 12.
P r z y k ł a d 14. Aktywność immunosupresyjna z zastosowaniem modelu przeszczepu serca u szczurów
Oszacowano skuteczność ISATX247 (45 - 50% izomeru E i 50 - 55% izomeru Z) zapobiegania odrzucaniu przeszczepianych serc pomiędzy różnymi szczepami szczurów i porównano ją ze skutecznością cyklosporyny A. Model przeszczepów serca u szczurów jest najczęściej stosowanym modelem szacowania in vivo skuteczności nowych leków immunosupresyjnych, ponieważ przedłużenie przeżywania przeszczepu jest w tym modelu trudne do osiągnięcia, ze względu na odrzuty immunologiczne.
Procedura obejmuje heterotopowy przeszczep (do aorty brzusznej i dolnej żyły głównej) serca szczurów rasy Wistar Furth szczurom Lewis. Dootrzewnowe wstrzykiwania cyklosporyny A albo mieszaniny izomerów analogów dokonywano biorcom przeszczepów zaczynając 3 dni przed transplantacją i kontynuowano je przez 30 dni po transplantacji. Jeśli zauważono zaburzenie czynności przeszczepu podczas 30-dniowego okresu potransplantacyjnego, to zwierzęta uśmiercano. Jeśli zwierzę przeżywało dłużej niż 30 dni po transplantacji, przerywano test i odłączano czujniki kontrolne i zwierzętom zezwolono na dalszą egzystencję, aż do zaburzeń czynności przeszczepu lub do 100 dni po transplantacji.
Średnie współczynniki przeżycia dla każdej grupy biorców zestawiono w tabeli 1. Rezultaty te pokazują, że ISATX247 (45 - 50% izomeru E i 50 - 55% izomeru Z) w optymalnej dawce 1,75 mg/kg/dzień przedłużało czas przeżycia około 3-krotnie, w porównaniu do cyklosporyny A. Pewna liczba zwierząt otrzymujących ISATX247 miała ciągle funkcjonujące przeszczepy 100 dni po transplantacji (70 dni po przerwaniu dawkowania). Dane te wykazują aktywność immunosupresyjną mieszanin izomerów analogów przy zapobieganiu odrzutom przeszczepów.
T a b e l a 1. Wpływ ISATX247 i cyklosporyny A podawanych dootrzewnowo na średnie czasy przeż ycia szczurów z przeszczepionymi sercami [średnia z dwóch oddzielnych badań, n 13]
Dawka (mg/kilogram/dzień) Średni czas przeżycia (liczba dni po operacji) Średnia ± SEM (skaningowy mikroskop elektronowy)
Zaróbka kontrolna Cyklosporyna A ISAtx247
0 9 ± 1
0,5 13a ± 4 11a ± 2
1,75 18b ± 7 57b ± 32
3 50c ± 8 55c ± 12
a,c nieznacznie różne b znacząco róż ne (p<0,01)
Oszacowano również skuteczność różnych deuterowanych i niedeuterowanych mieszanin izomerów analogów (strukturę podano na fig. 12) w zapobieganiu odrzucaniu przeszczepianych serc
PL 210 841 B1 pomiędzy różnymi szczepami szczurów i porównano ją ze skutecznością cyklosporyny A. Dawki wynosiły 1,75 mg/kg/dzień przez 30 dni. Wyniki zebrano w tabeli 2. Wyniki te pokazują, że mieszaniny izomerów w dawce 1,75 mg/kg/dzień przedłużały czas przeżycia co najmniej w takim samym stopniu jak cyklosporyna A oraz wykazują aktywność immunosupresyjną tych mieszanin izomerów analogów w zapobieganiu odrzutom przeszczepów.
T a b e l a 2. Wpływ różnych mieszanin izomerów analogów i cyklosporyny A podawanych dootrzewnowo w dawce 1,75 mg/kg/dzień na średnie czasy przeżycia szczurów z przeszczepionymi sercami
Testowany związek Średni czas przeżycia (liczba dni po operacji)
Zaróbka kontrolna 9
Cyklosporyna A 20
I5-M1 20
I4-M2 20+
I4-D2 30
P r z y k ł a d 15. Aktywność immunosupresyjna w przypadku aloprzeszczepów komórek wysp trzustkowych
Zdolność ISATX247 (45 - 50% izomeru E i 50 - 55% izomeru Z) w porównaniu do cyklosporyny A do przedłużenia przeżycia w modelu przeszczepionych komórek wysp trzustkowych u myszy sprawdzono w badaniach obejmujących przeszczep 500 wysp trzustkowych z myszy CBA/J do torebki nerkowej cukrzycowych biorców, jakimi były myszy Balb/c.
Po transplantacji, ISATX247 lub cyklosporynę A podawano przez wstrzykiwania dootrzewnowe (i.p.) w dawkach 0 (zaróbka), 1,75, 10, 20 lub 25 mg/kg/dzień przez 30 dni. Poziom glukozy we krwi monitorowano codziennie aż do momentu niewydolności przeszczepu, zdefiniowanego poziomem glukozy większym od 17 mmola/litr, w dwóch kolejnych dniach.
Wyniki wskazują na to, że ISATX247 w dawkach 20 mg/kg/dzień przedłużał czas przeżywania przeszczepu o 40% (tabela 3). Zauważono również, że przy zwiększaniu dawki ISATX247 był mniej toksyczny niż cyklosporyna A. Było to szczególnie widoczne przy dawce 25 mg/kg/dzień.
T a b e l a 3. Przeżywanie aloprzeszczepów wysp trzustkowych u cukrzycowych myszy otrzymujących ISATX247 albo cyklosporynę A podawane przez wstrzykiwania dootrzewnowe w dawkach 1,75, 10, 20 lub 25 mg/kg/dzień
Dawka (mg/kg/dzień) Leczenie N Mediana czasu przeżycia (dni) Średni czas przeżycia (dni)
0 Zaróbka 7 17 16,8
1,75 CsA 9 17 17,4
1,75 ISA 9 18 18,7
10 CsA 6 21 25,3
10 ISA 5 18 19,2
0 Zaróbka 12 16 15,9
20 CsA 9 19 20,2
20 ISA 9 >28 >28
0 Zaróbka 5 21 21,1
25 CsA 10 ND* ND*
25 ISA 8 50 46,4
* 7 z 10 zwierząt z tej grupy nie przeżyło ze względu na toksyczność CsA.
PL 210 841 B1
Z tego powodu tylko 3 zwierzęta zakończyły ten test w tej grupie i nie przeprowadzono analizy statystycznej.
P r z y k ł a d 16. Aktywność immunosupresyjna w przypadku zapalenia stawów
W ostatnich trzech dekadach prowadzono rozległe badania na trzech zwierzęcych modelach reumatoidalnego zapalenia stawów u ludzi oraz szeroko stosowano przedkliniczne badania przesiewowe i opracowywania nowych środków przeciwreumatycznych. Obejmowały one modele zapalenia stawów wywołanego adiuwantem, wywołanego kolagenem i wywołanego antygenem. Poniższe badania miały na celu ocenę przeciwzapalnej skuteczności ISATX247 (45 - 50% izomeru E i 50 - 55% izomeru Z) w modelu zapalenia stawów u myszy wywołanego kolagenem i modelu zapalenia stawów u królika wywołanego antygenem. Histopatologia i immunopatologia obserwowana w tych dwóch modelach przypomina wyniki uzyskiwane w tej chorobie u ludzi. W obu modelach badano skuteczność ISATX247 zapobiegania początkowi zapalenia stawów (protokół zapobiegania) i leczenia zapalenia stawów (protokół leczenia). Badania te potwierdzają immunosupresyjne działanie opisanych mieszanin izomerów analogów cyklosporyny.
A. Zapalenie stawów wywołane kolagenem
Samce myszy DBA/1 Lac J, trzymane w warunkach wolnych od przeciwciał wirusa, w wieku 8-10 tygodni immunizowano podskórnie 100 mikrogramami kolagenu z kurczaków typu II, zemulgowanego w kompletnym adiuwancie Freunda. ISATX247, cyklosporynę A lub zaróbkę (Chremophor EL/etanol 72:28, obj.) podawano codziennie przez wstrzykiwanie dootrzewnowe (i.p.) 1 - 50-krotnie rozcieńczonego solą fizjologiczną podstawowego roztworu leku (0,25, 0,5 lub 1 mg/ml), co doprowadziło do uzyskania stężeń 0 (zaróbka), 125, 250 lub 500 μg/mysz ISATX247 oraz 250 lub 500 μg/mysz cyklosporyny A. W przypadku zwierząt przeznaczonych do protokołu zapobiegania (12/grupę) rozpoczęto dawkowanie od dnia immunizacji kolagenem (dzień 0) do uśmiercenia w dniu 40. W przypadku zwierząt przeznaczonych do protokołu leczenia (12/grupę) rozpoczęto dawkowanie od dnia rozpoczęcia choroby (~dzień 28) do uśmiercenia zwierząt w dniu 38.
Ocenianymi parametrami były śmiertelność, kreatynina surowicza, histologia i oszacowanie rezultatu, takie jak kliniczna ocena (wizualna), puchnięcie tylnych łap, ocena histologiczna, ocena nadżerek i immunohistochemia.
Oceny nadżerek dokonano na ślepo badając strzałkowe sekcje bliższego stawu międzypaliczkowego (PIP) palca środkowego na obecność lub brak nadżerek (zdefiniowanych jako oddzielone ubytki w chrząstkach lub kościach wypełnione tkanką zapalną). Takie podejście umożliwiło porównywanie tego samego stawu. Uprzednie badania wykazały obecność nadżerek w >90% tych stawów u zwierząt z nieleczonym zapaleniem stawów.
Wyniki wskazują, że ujemne oceny nadżerek w przypadku grupy leczonej wysokimi dawkami ISATX247 (500 μg/mysz) były znacząco wyższe niż ujemne oceny nadżerek w przypadku grupy leczonej zaróbką (p<0,05). Zarówno grupy leczone średnimi dawkami ISATX247 (250 μg/mysz), jak i wysokimi dawkami cyklosporyny A (500 μg/mysz) miały wyższe ujemne oceny nadżerek, w porównaniu do grupy leczonej zaróbką (p<0,1). Ponadto grupy kontrolne leczone niskimi dawkami ISATX247 (125 μg/mysz) i średnimi dawkami cyklosporyny A (250 μg/mysz), miały wyższe, chociaż statystycznie nieznaczące, ujemne oceny nadżerek, w porównaniu do grupy kontrolnej leczonej zaróbką.
Jedynym rodzajem leczenia znacząco zapobiegającym rozwojowi nadżerek w stawach było ISATX247 w dawce 500 μg/mysz. To znaczące zmniejszenie udziału stawów PIP wykazujących nadżerkowe zmiany u myszy potraktowanych ISATX247, w porównaniu do kontrolnej grupy myszy potraktowanych zaróbką, demonstruje, że ISATX247 ma właściwości modyfikujące chorobę.
B. Zapalenie stawów wywołane antygenem
Króliki New Zealand White, utrzymywane w warunkach wolnych od konkretnych czynników chorobotwórczych, immunizowano 10 mg albuminy jaja kurzego w soli fizjologicznej, zemulgowanej w kompletnym adiuwancie Freunda, podawano domięśniowo i podskórnie w kilku miejscach karku. Czternaście dni później wszystkie zwierzęta zaczęły otrzymywać 2 razy dziennie dostawowe zastrzyki 5 mg albuminy jaja kurzego i 65 ng ludzkiego rekombinowanego transformującego czynnika wzrostu 2 w soli fizjologicznej.
ISATX247, cyklosporynę A lub zaróbkę (Chremophor EL/etanol 72:28, obj.) podawano codziennie przez wstrzykiwanie podskórne 1 - 4-krotnie rozcieńczonego solą fizjologiczną podstawowego roztworu leku (w zaróbce), co doprowadziło do uzyskania stężeń 0 (zaróbka), 2,5, 5,0 lub 10 mg/kg/dzień dla ISATX247 oraz 5,0, 10 lub 15 mg/kg/dzień dla cyklosporyny A. Zwierzętom przeznaczonym do protokołu zapobiegania (8/grupę) rozpoczęto dawkowanie od dnia immunizacji albuminą jaja kurzego
PL 210 841 B1 (dzień 0) do uśmiercenia w dniu 42. Zwierzętom przeznaczonym do protokołu leczenia (8/grupę) rozpoczęto dawkowanie od dnia rozpoczęcia choroby (-dzień 28) do uśmiercenia zwierząt w dniu 42.
Ocenianymi parametrami były śmiertelność, masa ciała, kreatynina surowicza, histologia i oszacowanie rezultatu, takie jak puchnięcie stawu kolanowego, liczba komórek w mazi stawowej, ogólna ocena pośmiertna i histologia.
Zaobserwowano znaczne zmniejszenie histopatologicznej oceny mazi u zwierząt po 28-dniowej terapii (protokół zapobiegania) ISATX247 (P 0,05) i cyklosporyną A (P 0,05), w porównaniu do zwierząt kontrolnych traktowanych zaróbką. Towarzyszyło temu znaczne zmniejszenie liczby komórek w mazi stawowej (ISATX247, P 0,05; cyklosporyna A, P 0,05). Znaczne polepszenie histopatologicznej oceny mazi u zwierząt z rozwiniętym zapaleniem stawów było również widoczne po 14 dniowym leczeniu ISATX247 (P 0,05) i cyklosporyną A (P 0,05), w porównaniu do zwierząt kontrolnych traktowanych zaróbką (protokół leczenia). Znaczące zmniejszenie makroskopowej oceny zapalenia stawów było widoczne u zwierząt leczonych ISATX247 (P=0,01), ale nie u zwierząt leczonych cyklosporyną A. Leczenie było dobrze tolerowane, bez znaczącej toksyczności ocenianej analizą kreatyniny w surowicy lub histolologią pośmiertną.
Dane te pokazują, że ISATX247 jest równoważny lub potencjalnie bardziej skuteczny niż cyklosporyna A w leczeniu i zapobieganiu reumatoidalnemu zapaleniu stawów w modelu wywoływanego antygenem zapalenia stawów u królików.
P r z y k ł a d 17. Właściwości farmakokinetyczne i toksykokinetyczne
Farmakokinetyczne i toksykokinetyczne parametry ISATX247 (45 - 50% izomeru E i 50 - 55% izomeru Z) i cyklosporyny A testowano na modelu królika. Królik był także stosowany jako model w badaniach nefrotoksyczności cyklosporyny A, ale dużo rzadziej niż szczur. Badania wykazały, że cyklosporyna A podawana królikom powoduje zmiany strukturalne i funkcjonalne w dawkach nie tylko niższych od uprzednio podawanych w innych modelach zwierzęcych, ale także w mieszczących się na co najmniej górnym poziomie zakresu terapeutycznego u ludzi (Thliveris i in., 1991, 1994). Wykrycie zwłóknienia śródmiąższowego i arteriopatii, oprócz cytologicznych zmian w kanalikach, również sugeruje, że królik jest właściwszym modelem do badania nefrotoksyczności, gdyż te strukturalne jednostki są cechami charakterystycznymi nefrotoksyczności obserwowanej u ludzi. ISATX247 podawano dożylnie (i.v.) przez pierwsze 7 dni i podskórnie (s.c.) przez dodatkowe 23 dni, zgodnie z następującym harmonogramem.
T a b e l a 4. Harmonogram podawania dawek w badaniach właściwości farmakokinetycznych i toksykokinetycznych ISATX247 w modelu królika
Grupa badanych zwierząt Dni 1-7: dawka i.v. (mg/kg) Dni 8-30: dawka s.c. (mg/kg) Liczba zwierząt
Samce Samice
1. Kontrolna z podawaniem zaróbki 0 0 4 4
2. Kontrolna z podawaniem cyklosporyny A 10 10 6 6
3. Niska dawka 5 5 0 2
4. Średnia dawka 10 10 4 4
5. Wysoka dawka 15 15 4 4
Dla uzyskania pewności, że jakiekolwiek obserwowane zmiany nerkowe spowodowane są działaniem ISATX247, a nie czynników chorobotwórczych, w badaniach użyto królików pozbawionych czynników chorobotwórczych (SPF). W dniach 1 i 7 pobrano próbki krwi przed podaniem leku i 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 18 i 24 godziny po podaniu dawki, dla utworzenia profilu farmakokinetycznego. Innymi ocenianymi parametrami były obserwacje kliniczne, masa ciała, spożywanie pokarmu, hematologia, chemia kliniczna, ogólna patologia oraz histopatologiczne badania wybranych tkanek/narządów.
Próbki krwi analizowano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią masową (LCMS). W poniższej tabeli 5 zestawiono wartości średnich parametrów farmakokinetycznych u królików, którym podano 10 mg/kg cyklosporyny A lub ISATX247.
PL 210 841 B1
T a b e l a 5. Farmakokinetyczne parametry u samców królików, którym podawano dożylnie cyklosporynę A i ISATX247, w ilości 10 mg/kg/dzień. Wyniki wyrażono jako wartości średnie ± SD
Mierzony parametr Cyklosporyna A ISAtx247
Dzień 1 Dzień 7 Dzień 1 Dzień 7
‘max (godziny) 0,5 0,5 0,5 0,5
Cmax (M-g/l) 1954±320 2171±612 1915±149 1959±470
t1/2 (godziny) 7,4±2,8 9,0±4,0 7,4±1,7 9,2±1,1
Powierzchnia pod krzywą (pgah/litr) 6697±1717 6685±1247 5659±1309 5697±1373
Nie zaobserwowano statystycznie znaczących różnic pomiędzy farmakokinetycznymi parametrami cyklosporyny A i ISATX247 u samców królików otrzymujących dawkę 10 mg/kg/dzień. Farmakokinetyczne parametry ISATX247 u samic królików otrzymujących taką samą dawkę nie różniły się znacząco od parametrów obserwowanych u samców królików, z wyjątkiem maksymalnego stężenia w 7 dniu.
Nie zanotowano znaczących zmian w hematologicznych parametrach królików otrzymujących kontrolną zaróbkę, cyklosporynę A i ISATX247. Podczas badań zauważono różnicę w poziomie kreatyniny w różnych grupach, tak jak pokazano to w poniższej tabeli 6. Różnice te wskazują, że cyklosporyna A miała znacznie większy ujemny wpływ na nerki niż kontrolna zaróbka lub ISATX247. Należy zauważyć, że nawet przy dawce ISATX247 o 50% wyższej, tj. 15 mg/kg/dzień, w porównaniu z 10 mg/kg/dzień cyklosporyny A, nie ma znaczącego wzrostu poziomu kreatyniny w surowicy.
T a b e l a 6. Procentowa zmiana poziomu kreatyniny w surowicy ponad linią podstawową u samców królików otrzymujących zaróbkę, cyklosporynę A lub ISATX247 przez 30 dni
Rodzaj badanej grupy Dzień 15 Dzień 30
Króliki, którym podawano zaróbkę +6% -3%
Króliki, którym podawano cyklosporynę A (10 mg/kg) +22% +33%
Króliki, którym podawano ISAtx247 (10 mg/kg) + 1% + 10%
Króliki, którym podawano ISAtx247 (15 mg/kg) -19% -11%
Badania narządów we wszystkich królikach otrzymujących kontrolną zaróbkę, 10 mg/kg cyklosporyny A, 5 mg/kg ISATX247, 10 mg/kg ISATX247 nie ujawniły znaczących odchyleń od normy. Dotyczyło to w szczególności nerek, w których nie stwierdzono objawów zwłóknienia śródmiąższowego, widocznych zwykle u zwierząt leczonych cyklosporyną A (Thliveris i in., 1991, 1994). U samców królików otrzymujących 15 mg/kg ISATX247 zauważono zmniejszenie spermatogenezy. Żadnych zmian nie zanotowano u trzech samic królika, na których zakończono całość badań przy dawce 15 mg/kg ISATX247.
P r z y k ł a d 18. Immunosupresyjne działanie ISATX247
Pełną krew z makaków jawajskich (n=4) inkubowano z ISATX247 lub cyklosporyną i pobudzano różnymi mitogenami w podłożu hodowli. Proliferację limfocytów oceniano przez wprowadzenie znaczonej trytem tymidyny oraz przez badanie ekspresji antygenu jądrowego komórek proliferujących (PCNA) na komórkach fazy SG2M metodą przepływowej analizy cytometrycznej. Cytometrię przepływową stosowano także do oceny wytwarzania wewnątrzkomórkowch cytokin przez komórki T i ekspresji antygenów aktywujących limfocyty T. Następnie obliczano EC50 (stężenie leku koniecznego do osiągnięcia 50% efektu maksymalnego) stosując program komputerowy WinNonlin™. Wyniki pokazują, że proliferacja limfocytów, wytwarzanie cytokin i ekspresja powierzchniowych antygenów komórek T były skuteczniej hamowane przez ISATX247 niż przez cyklosporynę, jak wskazują na to wartości EC50 (wyrażone w ng/ml) zamieszczone w poniższej tabeli 7.
PL 210 841 B1
T a b e l a 7
Parametr ISAtx247 Cyklosporyna
Wychwyt 3H-tymidyny 160,54 565,52
Ekspresja PCNA 197,72 453,88
Wytwarzanie IL-2 103,35 504,80
Wytwarzanie IFN 102,67 465,65
Wytwarzanie TNF 90,58 508,29
Ekspresja CD 71 149,84 486,82
Ekspresja CD 25 121,00 431,53
Ekspresja CD 11a 204,40 598,90
Ekspresja CD 95 129,98 392,97
Ekspresja CD 154 160,87 975,10
Tak więc stosując test ex vivo stwierdzono, że ISATX247 hamuje różne funkcje immunologiczne 2,3 - 6 razy skuteczniej niż cyklosporyna.
P r z y k ł a d 19. Reakcja Wittiga z użyciem bromku tributylo-allilofosfoniowego
W 20 ml tetrahydrofuranu rozpuszczono t-butanolan potasu (0,31 g, 2,8 mmola). W temperaturze około -40°C powoli dodano bromek tributyloallilofosfoniowy (0,99 g, 3,1 mmola) rozpuszczony w 3 ml tetrahydrofuranu. Otrzymaną żółtą mieszaninę mieszano przez około 10 minut w około -40°C, po czym dodano powoli roztwór aldehydu acetylocyklosporyny A (1,5 g, 1,2 mmola) w 6 ml tetrahydrofuranu. Po mieszaniu żółtopomarańczowej mieszaniny przez 1,5 godziny reakcja była zakończona. W celu zadania mieszaniny reakcyjnej mieszaninę wprowadzono do wodnego roztworu kwasu fosforowego (1,2 g, 1,0 mmol). Otrzymany roztwór wodny wyekstrahowano 100 ml toluenu, a następnie 50 ml toluenu. Połączone warstwy organiczne przemyto wodą i zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt, acetylowany ISATX247, otrzymano z wydajnością około 90%, w postaci żółtawej substancji stałej. Stosunek izomerów odpowiadał zawartości około 87% izomeru E i około 13% izomeru Z (jak oznaczono to metodą spektroskopii 1H-NMR).
P r z y k ł a d 20. Reakcja Wittiga z zastosowaniem bromku tri-butyloallilofosfoniowego i zasady litowej
W mieszaninie 20 ml toluenu i 3 ml tetrahydrofuranu rozpuszczono bromek tributyloallilofosfoniowy (1,38 g, 4,3 mmola). W temperaturze około -78°C powoli dodano butylolit (1,6M w heksanie, 2,43 ml, 3,9 mmola). Otrzymaną żółtą mieszaninę mieszano przez około 10 minut w około -78°C, po czym dodano powoli roztwór aldehydu acetylocyklosporyny A (1,5 g, 1,2 mmola) w 6 ml toluenu. Po mieszaniu żółtopomarańczowej mieszaniny reakcyjnej przez 3,5 godziny reakcję przerwano przez wprowadzenie mieszaniny reakcyjnej do mieszaniny 50 ml toluenu i wodnego roztworu kwasu fosforowego (0,25 g, 2,2 mmola). Przed rozdzieleniem dwóch warstw dopuszczono do ogrzania się powstałej dwufazowej mieszaniny do temperatury pokojowej. Warstwę toluenową przemyto 20 ml wody i zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt, acetylowany ISATX247, otrzymano z wydajnością około 80%, w postaci żółtawej substancji stałej. Stosunek izomerów odpowiadał zawartości około 70% izomeru E i około 30% izomeru Z (jak oznaczono to metodą spektroskopii 1H-NMR).
P r z y k ł a d 21. Reakcja Wittiga z użyciem bromku tributyloallilofosfoniowego i zasady litowej
Reakcję SAP018 prowadzono w sposób opisany powyżej, ale w temperaturze około -40°C. Powtórzono warunki doświadczalne przykładu 20, stosując w tym przypadku temperaturę prowadzenia reakcji około -40°C. W tych warunkach stosunek izomerów w wyodrębnionym produkcie, acetylowanym ISATX247, odpowiadał zawartości około 74% wag. izomeru E i około 26% wag. izomeru Z, jak oznaczono to metodą spektroskopii 1H-NMR.
P r z y k ł a d 22. Reakcja Wittiga z użyciem bromku tributyloallilofosfoniowego
Roztwór aldehydu acetylocyklosporyny A (1,5 g, 1,2 mmola) i bromku tributyloallilofosfoniowego (0,99 g, 3,1 mmola) w 15 ml tetrahydrofuranu ochłodzono do temperatury około -80°C. Powoli dodano
PL 210 841 B1 t-butanolan potasu (0,19 g, 1,7 mmola) rozpuszczony w 9 ml tetrahydrofuranu. W celu zakończenia reakcji otrzymaną żółtą mieszaninę mieszano przez jedną godzinę w około -80°C, po czym dodano powoli roztwór 6 ml tetrahydrofuranu. Po mieszaniu żółtopomarańczowej mieszaniny reakcyjnej przez
1,5 godziny reakcja była zakończona. W celu przerwania reakcji do mieszaniny dodano wodny roztwór kwasu fosforowego (0,15 g, 1,3 mmola). Otrzymaną mieszaninę zatężono i pozostałość rozpuszczono w 5 ml metanolu. Następnie mieszaninę powoli dodano do 5 ml wody. Otrzymany osad odsączono, przemyto 4 ml mieszaniny metanol/woda (1:1) i wysuszono pod próżnią. Produkt, acetylowany ISATX247, otrzymano z wydajnością około 90%, w postaci bezbarwnej substancji stałej. Stosunek izomerów odpowiadał zawartości około 91% wag. izomeru E i około 9% izomeru Z (oznaczony metodą spektroskopii 1H-NMR).
P r z y k ł a d 23. Ozonoliza acetylo-CsA
Roztwór acetylocyklosporyny A (15 g, 12,1 mmola) w 200 ml metanolu ozonowano w temperaturze -78°C, stosując generator ozonu Sandera pod ciśnieniem około 0,11 MPa, przy przepływie 300 litrów O2/godzinę do zakończenia reakcji (około 5 minut). Przez roztwór przepuszczono argon i dodano sulfid dimetylowy rozpuszczony w metanolu. Dla zakończenia redukcji mieszaninę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Po zatężeniu do około 50 ml roztwór powoli dodano do 500 ml wody. Powstały osad odsączono, przemyto 60 ml wody i wysuszono pod próżnią. Produkt, aldehyd acetylowanego CsA otrzymano w postaci bezbarwnej substancji stałej, z wydajnością około 95% i czystością około 98% (oznaczoną metodą HPLC).
P r z y k ł a d 24. Wytwarzanie cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową
W 30°C rozpuszczono cyklosporynę A (40 g, 1 równoważnik) w dichlorometanie (100 ml) i dodano N,N-bis-(trimetylosililo)mocznik (1,1 równoważnika). Po mieszaniu przez 5 minut w 30°C dodano kwas p-toluenosulfonowy (0,02 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin do zakończenia reakcji, monitorowanej metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC), wysokociśnieniowej lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) lub spektrometrii masowej (MS), a następnie mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej. Dodano w połowie nasycony wodny roztwór wodorowęglanu sodu (100 ml). Fazę wodną oddzielono i ponownie wyekstrahowano dichlorometanem. Połączone fazy organiczne wysuszono nad bezwodnym Na2SO4 i przesączono. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano surową cyklosporynę A zabezpieczoną grupą trimetylosililową.
P r z y k ł a d 25. Wytwarzanie aldehydu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową
Cyklosporynę A zabezpieczoną grupą trimetylosililową (5 g, 1 równoważnik) rozpuszczono w dichlorometanie (50 ml) i roztwór ochłodzono do temperatury około -78°C, po czym przez roztwór przepuszczano pęcherzykami ozon aż do pojawienia się niebieskiego zabarwienia. Następnie w celu usunięcia ozonu przez roztwór przepuszczano argon aż do uzyskania bezbarwnego roztworu, przy czym etap ten prowadzi się w celu usunięcia nadmiaru ozonu. Dodano trietyloaminę (5 równoważników) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 17 godzin. Po obróbce wodą otrzymano aldehyd cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową.
P r z y k ł a d 26. Wytwarzanie dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową w postaci mieszaniny o stosunku 3:1 izomerów Z:E podwójnego wiązania, w reakcji Wittiga
Do mieszaniny t-butanolanu potasu (3 równoważniki) i bromku allilotrifenylofosfoniowego (2 równoważniki) w toluenie (10 ml), uprzednio mieszanej przez 60 minut, dodano aldehyd cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (1 g, 1 równoważnik). Po prowadzeniu reakcji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i obróbce mieszaniny reakcyjnej otrzymano mieszaninę 3:1 (NMR) izomerów Z i E podwójnego wiązania dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową.
P r z y k ł a d 27. Wytwarzanie dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową w postaci mieszaniny o stosunku 1:1 izomerów Z:E podwójnego wiązania, w reakcji Wittiga
Aldehyd cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (2,5 g) rozpuszczono w 25 ml toluenu i podziałano nań 1N wodnym roztworem wodorotlenku sodu (10 równoważników). Mieszaninę reakcyjną intensywnie mieszano i dodano bromek allilotrifenylofosfoniowy (7,5 równoważnika, porcjami). Po prowadzeniu reakcji przez kilka godzin w temperaturze pokojowej i obróbce mieszaniny reakcyjnej otrzymano mieszaninę około 1:1 (NMR) izomerów Z i E podwójnego wiązania dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową.
PL 210 841 B1
P r z y k ł a d 28. Wytwarzanie dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową w postaci mieszaniny o stosunku 1:2 izomerów Z:E podwójnego wiązania, w reakcji Wittiga
Aldehyd cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (1 g) rozpuszczono w 5 ml toluenu razem z węglanem potasu (1,5 równoważnika i bromkiem allilotrifenylofosfoniowym (1,5 równoważnika). Po prowadzeniu reakcji przez 4 godziny w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin w trakcie intensywnego mieszania, a następnie po obróbce mieszaniny reakcyjnej otrzymano mieszaninę około 1:2 (NMR) izomerów Z i E podwójnego wiązania dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową.
P r z y k ł a d 29. Wytwarzanie dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową w postaci mieszaniny o stosunku 1:3 izomerów Z:E podwójnego wiązania, w reakcji Wittiga
Bromek allilotributylofosfoniowy (3 równoważniki, wytworzony z bromku allilu i tributylofosflny) rozpuszczono w THF (3,5 ml). Dodano toluen (7,5 ml), a następnie t-butanolan potasu (4 równoważniki). Po mieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, mieszaninę ochłodzono do około -30°C. Wkroplono roztwór aldehydu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (1 g, 1 równoważnik) w toluenie (5 ml). Po 45 minutach w około -30°C, mieszaninę poddano obróbce, w wyniku czego otrzymano mieszaninę około 1:3 (NMR) izomerów Z i E podwójnego wiązania dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową.
Poniższe dwa przykłady 30 i 31 dotyczą allilometalowania.
P r z y k ł a d 30. Wytwarzanie β-trimetylosililoalkoholu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową
Do roztworu allilotrimetylosilanu (10,1 równoważnika) w THF (15 ml) w temperaturze pokojowej dodano butylolit (1,6M w heksanach, 10 równoważników). Po prowadzeniu reakcji przez 30 minut roztwór ochłodzono do -75°C i potraktowano dietylo-B-metoksyborem (10,1 równoważnika). Po 1 godzinie dodano kompleks eteru dietylowego i trifluorku boru (10,1 równoważnika), w celu wytworzenia B-(Y-trimetylosililoallilo)dietylo-boru. Po 1 godzinie wkroplono roztwór aldehydu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową (5 g, 1 równoważnik) w THF (15 ml). Po 20 minutach mieszaninę reakcyjną ogrzano do -10°C i dodano nasycony wodny roztwór NH4CI. Po mieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej dodano wodę (45 ml) i mieszaninę reakcyjną wyekstrahowano 3 razy 25 ml octanu etylu. Fazy organiczne przemyto kolejno wodą (25 ml) i nasyconym wodnym roztworem NH4CI (25 ml). Połączone fazy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt poddano chromatografii (żel krzemionkowy, dichlorometan/metanol lub octan etylu/heptan), w wyniku czego otrzymano β-trimetylosililoalkohol cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową.
P r z y k ł a d 31. Wytwarzanie β-trimetylosililoalkoholu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową
Do roztworu allilotrimetylosilanu (10,1 równoważnika) w THF (15 ml) w temperaturze pokojowej dodano butylolit (1,6M w heksanach, 10 równoważników). Po 30 minutach reakcji roztwór ochłodzono do -65°C i potraktowano dietylo-B-metoksyborem (10,1 równoważnika). Po 1 godzinie dodano kompleks eteru dietylowego i trifluorku boru (10,1 równoważnika), z wytworzeniem B-fy-trimetylosililoallilo)dietyloboru. Po 1 godzinie wkroplono roztwór aldehydu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (5 g, 1 równoważnik) w THF (15 ml). Po 15 minutach mieszaninę reakcyjną ogrzano do 10°C i dodano nasycony wodny roztwór NH4CI. Po mieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej dodano wodę (12,5 ml) i nasycony NaHCO3 (25 ml). Mieszaninę reakcyjną wyekstrahowano dwukrotnie 25 ml eteru t-butylowo-metylowego. Fazy organiczne przemyto dwukrotnie wodą (2 x 25 ml) i nasyconym wodnym roztworem NaCl (25 ml). Połączone fazy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt poddano chromatografii (żel krzemionkowy, heptan/octan etylu), w wyniku czego otrzymano β-trimetylosililo-alkohol cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową.
Poniższe trzy przykłady 32, 33 i 34 dotyczą reakcji eliminacji Petersona.
P r z y k ł a d 32. Wytwarzanie E-dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową β-Trimetylosililoalkohol cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową (100 mg, 1 równoważnik) rozpuszczono w THF (1 ml). Dodano stężony H2SO4 (1,24 ml, 3 równoważniki) i w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc. Dodano wodę (150 ml) i mieszaninę reakcyjną wyekstrahowano eterem t-butylowo-metylowym (200 ml). Fazę wodną ponownie wyekstrahowano eterem t-butylowo-metylowym (150 ml). Fazy organiczne przemyto wodą (150 ml). Połączone fazy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku
PL 210 841 B1 czego uzyskano dien cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową (ISATX247 zabezpieczony grupą acetylową). Surowy produkt poddano krystalizacji z mieszaniny eter t-butylowo-metylowy/THF oraz rekrystalizacji z mieszaniny eter t-butylowo-metylowy/DCM, w wyniku czego otrzymano dien cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową (ISATX247 zabezpieczony grupą acetylową), w postaci mieszaniny 99-97%:1-3% izomerów E i Z wiązania podwójnego (400 MHz NMR, 2% błąd pomiaru).
Hydrolizę E-dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową przeprowadzono następująco: Dien acetylocyklosporyny A (4 g, 1 równoważnik) rozpuszczono w metanolu (80 ml) i wodzie (32 ml). Dodano węglan potasu (3,65 g, 8,3 równoważnika). Po mieszaniu przez 15 godzin w temperaturze pokojowej, mieszaninę reakcyjną ogrzewano w 40°C przez 4 godziny. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w octanie etylu (70 ml). Powoli dodano 15% wodny roztwór kwasu cytrynowego (30 ml), a następnie wodę (10 ml). Warstwę wodną oddzielono i ponownie wyekstrahowano octanem etylu (56 ml). Fazy organiczne przemyto wodą (30 ml), 15% roztworem kwasu cytrynowego (40 ml) i nasyconym roztworem NaCl (30 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono nad Na2SO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano dien cyklosporyny A (ISATX247) w postaci mieszaniny 98:2 izomerów E/Z wiązania podwójnego (400 MHz NMR, około 2 - 3% błędu). Patrz R.W. Hoffmann, Angewandte Chemie International Edition, tom 555 (1982); W.R. Roush, „Allylorganometallics. Comprehensive Organic Synthesis, Pergamon Press, tom 2, str. 1-53; oraz Y. Yamamoto, N. Asao, Chemical Reviews, str. 2307 (1993).
P r z y k ł a d 33. Wytwarzanie Z-dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową i jego przeprowadzanie w Z-dien cyklosporyny A (ISATX247) β-Trimetylosililoalkohol cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (2 g, 1 równoważnik) rozpuszczono w THF (20 ml). Roztwór ochłodzono do 0-2°C i dodano t-butanolan potasu (4 równoważniki). Po prowadzeniu reakcji przez 1,5 godziny dodano octan etylu (20 ml) i wodę (40 ml). Oddzielono warstwę wodną i wyekstrahowano ją ponownie octanem etylu (20 ml). Fazy organiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCl (20 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano mieszaninę Z-dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (ISATX247 zabezpieczony grupą trimetylosililową) i Z-dienu cyklosporyny A (izomeru Z ISATX247). Odsililowanie zakończono przez rozpuszczenie surowej mieszaniny w metanolu (roztwór 10% wag.) i dodanie 1M wodnego roztworu kwasu chlorowodorowego (1 równoważnik). Po 15 minutach w temperaturze pokojowej dodano wodę i octan etylu. Warstwę wodną oddzielono i ponownie wyekstrahowano octanem etylu. Fazy organiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCl. Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano dien cyklosporyny A (ISATX247), w postaci mieszaniny 94:6 izomerów Z i E wiązania podwójnego (NMR).
P r z y k ł a d 34. Wytwarzanie E-dienu cyklosporyny A (ISATX247) β-Trimetylosililoalkohol cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (500 mg, 1 równoważnik) rozpuszczono w dichlorometanie. Roztwór ten ochłodzono do temperatury około 0-2°C i dodano kompleks eteru dietylowego i trifluorku boru (5 równoważników). Po 1 godzinie dodano wodę (20 ml) i dichlorometan (20 ml). Oddzielono warstwę organiczną i przemyto ją wodą (20 ml), wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego bezpośrednio otrzymano dien cyklosporyny A (ISATX247), w postaci mieszaniny 91:9 wag. izomerów E i Z wiązania podwójnego (NMR).
P r z y k ł a d 35. Odbezpieczanie dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową
Dien cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową rozpuszczono w metanolu (roztwór 10% wag.). Na roztwór ten podziałano 1M wodnym roztworem kwasu chlorowodorowego (1 równoważnik). Po 15 minutach w temperaturze pokojowej dodano wodę i octan etylu. Wodną warstwę oddzielono i ponownie wyekstrahowano ją octanem etylu. Fazy organiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCl. Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano dien cyklosporyny A (ISATX247).
P r z y k ł a d 36. Epoksydowanie acetylocyklosporyny A
Acetylocyklosporynę A (2,0 g, 1,61 mmola) rozpuszczono w acetonitrylu (30 ml). Dodano 1,3-diacetoksyaceton (0,14 g, 0,8 mmola), a następnie 0,0004M wodny roztwór soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (20 ml) i wodorowęglanu sodu (0,405 g, 4,82 mmola). W ciągu 2 godzin do mieszaniny w trakcie mieszania dodano porcjami okson (43,8% KHSO5) (2,23 g, 6,43 mmola). Utrzy34
PL 210 841 B1 mywano pH 8,2 przez ciągłe dodawanie 1N NaOH (całkowita ilość 6,4 ml) za pomocą pH-statu. Temperaturę utrzymywano na poziomie 22 - 25°C przez sporadyczne chłodzenie w łaźni z zimną wodą. Po
2,5 godziny reakcję przerwano przez dodanie kilku kropli roztworu wodorosiarczynu sodu. Dodano wodę (100 ml) i mieszaninę dwukrotnie wyekstrahowano eterem t-butylowo-metylowym (100 ml, a następnie 75 ml). Organiczne ekstrakty przemyto rozcieńczonym wodnym roztworem chlorku sodu (100 ml), połączono je ze sobą, wysuszono nad Na2SO4 i zatężono, w wyniku czego otrzymano surowy epoksyd acetylocyklosporyny A (1,92 g, 95%; HPLC: 99,4% powierzchni), w postaci białej, stałej piany.
P r z y k ł a d 37. Wytwarzanie aldehydu acetylocyklosporyny A
Surowy epoksyd acetylocyklosporyny A (1,92 g, 1,52 mmola) rozpuszczono w acetonitrylu (25 ml). Dodano wodę (20 ml), a następnie nadjodan sodu (489 mg, 2,28 mmol) i 0,5M kwas siarkowy (3,05 ml, 1,52 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 40°C przez 18 godzin, a następnie usunięto nadmiar nadjodanu sodu przez dodanie wodnego roztworu wodorosiarczynu sodu. Dodano rozcieńczony roztwór chlorku sodu (100 ml) i mieszaninę dwukrotnie wyekstrahowano eterem t-butylowo-metylowym (za każdym razem po 100 ml). Organiczne ekstrakty przemyto rozcieńczonym wodnym roztworem chlorku sodu (100 ml), połączono je, wysuszono nad Na2SO4 i zatężono i uzyskano surowy aldehyd acetylocyklosporyny A (1,74 g, 92%; HPLC: 95,7% powierzchni), w postaci białej piany. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny 40% aceton/60% heksan i otrzymano produkt w postaci białej, stałej piany (1,41 g, 71% w przeliczeniu na acetylocyklosporynę A; HPLC: 100% powierzchni).
P r z y k ł a d 38. Wytwarzanie aldehydu acetylocyklosporyny A realizowane w jednym reaktorze
Acetylocyklosporynę A (2,0 g, 1,61 mmola) rozpuszczono w acetonitrylu (30 ml). Dodano 1,3-diacetoksyaceton (0,084 g, 0,48 mmola), a następnie 0,0004M wodny roztwór soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (20 ml) i wodorowęglan sodu (0,405 g, 4,82 mmola). W ciągu 2 godzin do mieszaniny w trakcie mieszania dodano porcjami okson (43,8% KHSO5) (1,67 g, 4,82 mmola). Utrzymywano pH 8,2 przez ciągłe dodawanie 1N NaOH (całkowita ilość 3,4 ml) za pomocą pH-statu. Temperaturę utrzymywano na poziomie 20 - 25°C. Po 3,5 godzinie do mieszaniny reakcyjnej dodano 0,5M kwas siarkowy (5 ml, 2,5 mmol), a następnie kilka kropli stężonego kwasu siarkowego do osiągnięcia pH 1,3. Następnie dodano nadjodan sodu (516 mg, 2,41 mmola) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny i w 40°C przez 22 godziny. Dodano wodę (100 ml) i mieszaninę dwukrotnie wyekstrahowano eterem t-butylowo-metylowym (100 ml, a następnie 75 ml). Organiczne ekstrakty przemyto rozcieńczonym wodnym roztworem chlorku sodu (100 ml), połączono je ze sobą, wysuszono nad Na2SO4 i zatężono, w wyniku czego otrzymano surowy aldehyd acetylocyklosporyny A (1,9 g, 96%; HPLC: 83,4% powierzchni), w postaci białej piany. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny 40% aceton/60% heksan i otrzymano produkt w postaci białej, stałej piany (1,35 g, 68% w przeliczeniu na acetylocyklosporynę A; HPLC: 100% powierzchni).
P r z y k ł a d 39. (ISO) Reakcja Wittiga aldehydu acetylocyklosporyny A z 3-dimetyloaminopropylotrifenylofosforylidenem
Stereoselektywne wytwarzanie 1,3-dienów opisali E.J. Corey i M.C. Desai w Tetrahedron Letters, tom 26, nr 47, str. 5747-8, (1985). W publikacji tej ujawniono, że ylid otrzymany przez podziałanie na 3-(dimetyloamino)propylotrifenylofosforan heksametylodisilazydkiem potasu może ulegać reakcji Wittiga z aldehydem, w wyniku czego selektywnie tworzy się Z-alkenylodimetyloamina. W wyniku utleniania aminy kwasem m-chloronadbenzoesowym otrzymano odpowiedni N-tlenek, który można następnie ogrzewać w reakcji znanej jako eliminacja Cope'a, z wytworzeniem żądanego 1,3-dienu, w którym konfiguracja olefiny utworzonej w reakcji Wittiga jest wyłącznie Z czyli cis.
Analogicznie, izomer Z ISATX247 można wytworzyć w reakcji aldehydu acetylocyklosporyny A z ylidem otrzymanym przez podziałanie na bromek 3-(dimetyloamino)propylotrifenylofosfoniowy heksametylodisilazydkiem potasu. Otrzymany związek pośredni utlenia się, a następnie poddaje eliminacji Cope'a, z wytworzeniem acetylo-(Z)-ISATX247. W wyniku odbezpieczania z użyciem zasady otrzymuje się (Z)-ISATX247. Odczynnikiem utleniającym może być kwas m-chloronadbenzoesowy.
Do zawiesiny bromku 3-dimetyloaminopropylotrifenylofosfoniowego (2,5 g, 5,83 mmola) w bezwodnym toluenie (20 ml) w trakcie mieszania dodano za pomocą strzykawki heksametylodisilazydek potasu (11,6 ml, 5,8 mmola, 0,5M roztwór w toluenie). Po mieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, czerwony roztwór odwirowano i przez kaniulę przeniesiono supernatant do kolby reakcyjnej. Na substancję stałą podziałano bezwodnym toluenem (10 ml), roztwór mieszano i odwirowano.
PL 210 841 B1
Supernatant przeniesiono do kolby reakcyjnej i do połączonego czerwonego roztworu ylidu dodano OAc-CsA-CHO (1,44 g, 1,17 mmola). Mieszanie kontynuowano w temperaturze pokojowej przez kolejne 2 godziny, przy czym barwa zmieniła się na jasnożółtą. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono EtOAc (50 ml) i przemyto kolejno nasyconym roztworem NaHCO3 (50 ml) i solanką (50 ml). Po wysuszeniu i usunięciu rozpuszczalnika otrzymano bladożółtą substancję stałą. W wyniku chromatografii w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym z elucją mieszaniną aceton/heksany (gradient: 10 do 75% acetonu i 90 do 25% heksanów) usunięto wszystkie zanieczyszczenia związane z fosforem. W wyniku dalszej elucji acetonem otrzymano żądany produkt w postaci bezbarwnej substancji stałej (1,28 g, wydajność 84%). 1H NMR (300 MHz, CDCI3): 2,23 (s, 6H), 2,03 (s, 3H). 13C NMR (300 MHz, CDCI3): 129,33, 126,95; MS m/z: 1301 (M+), 1324 (M+Na+).
Przemiana w N-tlenek
Do ochłodzonego (0°C) roztworu związku dimetyloaminowego otrzymanego w reakcji Wittiga (0,44 g, 0,34 mmola) w CHCI3 (3 ml) w trakcie mieszania dodano roztwór m-CPBA (0,07 g, 0,405 mmola) w CHCI3 (2 ml). Po mieszaniu przez 30 minut dodano sulfid dimetylowy (0,5 ml), a następnie CH2CI2 (50 ml). Po przemywaniu roztworem NaHCO3 (25 ml) i wodą (25 ml), wysuszeniu i usunięciu rozpuszczalnika otrzymano substancję stałą (0,43 g). 1H-NMR (300 MHz, CDCI3): 3,19 (s, 3H), 3,18 (s, 3H), 2,03 (s, 3H). 13C NMR (300 MHz, CDCI3): 131,89, 124,13; MS m/z: 1340 (M+Na+).
Eliminacja Cope'a N-tlenku. Wytwarzanie izomeru (Z)-acetylo ISATx247
Sam N-tlenek (350 mg) mieszano i ogrzewano w 100°C pod próżnią przez 2 godziny. Następnie przepuszczono go przez kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym. W wyniku elucji mieszaniną aceton/heksany (gradient: 5 do 25% acetonu i 95 do 75% heksanów) otrzymano bezbarwną substancję stałą (314 mg). 1H NMR (500 MHz, CDCI3): 6,49 (dt, J=16,99, 10,5Hz, 1H); 13C NMR (400 MHz, CDCI3): 132,20, 131,09, 129,70, 116,85; MS m/z: 1279 (M+Na+).
Izomer (Z) ISATx247
Do roztworu (Z)-acetylo-ISATx247 (50 mg) w MeOH (4 ml) dodano wodę (1,5 ml) i K2CO3 (60 mg) i w temperaturze pokojowej mieszano przez 48 godzin. Z mieszaniny reakcyjnej usunięto rozpuszczalniki i wyekstrahowano ją EtOAc (20 ml). Warstwę organiczną przemyto wodą (10 ml) i solanką (10 ml). Po wysuszeniu i usunięciu rozpuszczalnika otrzymano bezbarwną substancję stałą. 1H NMR (500 MHz, CDCI3): 6,58 (dt, J=16,99, 10,5 Hz, 1H); MS m/z: 1236,8 (M+Na+). Otrzymany związek był izomerem (Z) ISATx247. Metodą NMR nie wykryto obecności izomeru (E).
Literatura
W stosownych częściach opisu odniesienia do poniższych pozycji literaturowych lub powoływania się na nie zaznaczono numerami opisów lub zgłoszeń patentowych albo przez podanie w nawiasach autora i roku publikacji.
Bennett, W.M., „The nephrotoxicity of new and old immunosuppressive drugs Renal Failure, tom 20, str. 687-90 (1998).
J.-F. Biellmann, J.-B. Ducep w „Allylic and benzylic carbanions substituted by heteroatoms Organic Reactions, tom 27 (Wiley, New York, 1982), str. 9.
H.J. Carlsen i in. w „A Greatly Improved Procedure for Ruthenium Tetroxide Catalyzed Oxidations of Organic Compounds J. Org. Chem., tom 46, nr 19, str. 3736-3738 (1981).
T. Chang, L.Z. Benet, M.F. Hebert, „The effect of water-soluble vitamin E on cyclosporine pharmacokinetics in healthy volunteers Clin. Pharmacol. Ther., tom 59, str. 297-303 (1996).
E.J. Corey, M.C. Desai w Tetrahedron Letters, tom 26, nr 47, str. 5747-8, (1985).
M.K. Eberle, F. Nuninger, „Synthesis of the main metabolite (OL-17) of cyclosporin A J. Org. Chem., tom 57, str. 2689-2691 (1992).
E. Ehlinger, P. Magnus w „Silicon in synthesis. 10. The (trimethylsilyl)allyl anion: A β-acyl anion equivalent for the conversion of aldehydes and ketones into Y-lactones J. Am. Chem. Soc., tom 102, nr 15, str. 5004-5011 (1980).
D.S. Fruman, C.B. Klee, B.E. Bierer, S.J. Burakoff, „Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK506 and cyclosporin A Proc. Natl. Acad. Sci. USA, tom 89, str. 3686-90 (1992).
A. Granelli-Piperno, L. Andrus, R.M. Steinman, „Lymphokine and nonlymphokine mRNA levels in stimulated human cells: kinetics, mitogen requirements, and effects of cyclosporin A J. Exp. Med., tom 163, str. 922 (1986).
PL 210 841 B1
J.R. Hanson, „The Protection of Alcohols Protecting Groups in Organic Synthesis, rozdz. 2, str. 24-25 (Sheffield Academic Press, Sheffield, England, 1999).
M.F. Hebert, J.P. Roberts, T. Prueksaritanont, L.Z. Benet, „Bioavailability of cyclosporin with concomitant rifampin administration is markedly less than predicted by hepatic enzyme induction Clin. Pharmacol Ther., tom 52, str. 453-7 (1992).
R.W. Hoffmann, Angewandte Chemie International Edition, tom 555 (1982).
R. W. Hoffmann, H.-J Zei, „Stereoselective synthesis of alcohols. 8. Diastereoselective synthesis of β-methylhomoallyl alcohols via crotylboronates J. Org. Chem., tom 46, str. 1309-1314 (1981).
P.F. Hurdlik i D. Peterson w „Stereospecific Olefin-Forming Elimination Reactions of β-Hydroxysilanes J. Am. Chem. Soc, tom 97, nr 6, str. 1464-1468 (1975).
Y. Ikeda, J. Ukai, N. Ikeda, H.Yamamoto, „Stereoselective synthesis of (Z)- and (E)-1,3-alkadienes from aldehydes using organotitanium and lithium reagents Tetrahedron, tom 43, nr 4, str. 723-730 (1987).
Kobel i in., Europ. J. Applied Microbiology and Biotechnology, tom 14, str. 237-240 (1982).
J. McMurry, Organic Chemistry, 5. wydanie (Brooks/Cole, Pacific Grove, 2000), str. 780-783.
M.T. Reetz w Organotitanium Reagents in Organic Synthesis (Springer-Verlag, Berlin, 1986), str. VII, 148-149 i 164-165.
Rich i in., J. Med. Chem., tom 29, str. 978 (1986).
W.R. Roush, „Allylorganometallics Comprehensive Organic Synthesis, Pergamon Press, tom 2, str. 1-53.
S. L. Schreiber, G.R. Crabtree, „The mechanism of action of cyclosporin A and FK506 Immunol. Today, tom 13, str. 136-42 (1992).
I. Sketris, R. Yatscoff, P. Keown, D.M. Canafax, M.R. First, D.W. Holt, T.J. Schroeder, M. Wright, „Optimizing the use of cyclosporine in renal transplantation Clin. Biochem., tom 28, Str. 195-211 (1995).
M.B. Smith i J. March, March's Advanced Organic Chemistry (Wiley, New York, 2001), str. 144-147.
A. Streitwieser, C. H. Heathcock, Introduction to Organic Chemistry, 2. wydanie (Macmillan, New York, 1981), str. 845-846.
J. A. Thliveris, R.W. Yatscoff, M.P. Lukowski, K.R. Copeland, J.R. Jeffery, G.F. Murphy, „Chronic ciclosporin nephrotoxicity: A rabbit model Nephron, tom 57, str. 470-6 (1991).
J.A. Thliveris, R.W. Yatscoff, M.J. Mihatsch, „Chronic cyclosporine-induced nephrotoxicity: A rabbit model Transplantation, tom 57, str. 774-6 (1994).
S. E. Thomas w Organic Synthesis: The Roles of Boron and Silicon (Oxford University Press, New York, 1991), str. 84-87.
Traber i in., Helv. Chim. Acta, tom 60, str. 1247-1255 (1977).
Traber i in., Helv. Chim. Acta, tom 65, str. 1655-1667 (1982).
D.S. Tsai, D.S. Matteson, „A stereocontrolled synthesis of (Z) and (E) terminal dienes from pinacol (E)-1-trimethylsilyl-1-propene-3-boronate Tetrahedron Letters, tom 22, nr 29, str. 2751-2752 (1981).
H.A. Valantine, J.S. Schroeder, „Recent advances in cardiac transplantation [od wydawcy; komentarz], N. Engl. J. Med., tom 333, nr 10, str. 660-1 (1995).
von Wartburg i in., Progress in Allergy, tom 38, str. 28-45 (1986).
Wenger, Transpl. Proc, tom 15, Supl. 1, str. 2230 (1983).
Wenger, Angew. Chem. Int. Ed., tom 24, str. 77 (1985).
Wenger, Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, tom 50, str. 123 (1986).
Y. Yamamoto, N. Asao, Chemical Reviews, str. 2307 (1993).
Dan Yang i in., „A C2 Symmetric Chiral Ketone for Catalytic Asymmetric Epoxidation of Unfunctionalized Olefins J. Am. Chem. Soc, tom 118, str. 491-492 (1996).
Dan Yang i in., „Novel Cyclic Ketones for Catalytic Oxidation Reactions J. Org. Chem., tom 63, str. 9888-9894 (1998).
Opis patentowy US nr 4108985.
Opis patentowy US nr 4160452.
Opis patentowy US nr 4210581.
Opis patentowy US nr 4220641.
Opis patentowy US nr 4256108.
PL 210 841 B1
Opis patentowy US nr 4265874.
Opis patentowy US nr 4288431.
Opis patentowy US nr 4384996.
Opis patentowy US nr 4396542.
Opis patentowy US nr 4554351.
Opis patentowy US nr 4771122.
Opis patentowy US nr 5284826.
Opis patentowy US nr 5525590.
Publikacja europejskiego opisu patentowego nr 0034567. Publikacja europejskiego opisu patentowego nr 0056782. Publikacja zgłoszenia międzynarodowego nr WO 86/02080. Publikacja zgłoszenia międzynarodowego nr WO 99/18120.

Claims (36)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, znamienny tym, że szlak syntezy obejmuje etapy
    a) ogrzewania acetylo-n-chlorowcocyklosporyny A z pierwszym związkiem wybranym z grupy obejmującej triarylofosfinę, trialkilofosfinę, aryloalkilofosfinę i triaryloarsynę, z wytworzeniem związku pośredniego;
    b) wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu, przez zmieszanie związku pośredniego z formaldehydem; oraz
    c) wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, przez podziałanie zasadą na mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako acetylo-n-chlorowcocyklosporynę A stosuje się acetylo-n-bromo-cyklosporynę A.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap chlorowcowania atomu węgla n w bocznym łańcuchu grupy aminokwasowej w pozycji 1 cyklosporyny A, w reakcji bromowania prowadzonej przez ogrzewanie w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin acetylocyklosporyny A z N-bromosukcynoimidem i azobisizobutyronitrylem.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pierwszy związek stanowi trifenylofosfina, a związek pośredni stanowi halogenek trifenylofosfoniowy acetylocyklosporyny A.
  5. 5. Sposób wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, znamienny tym, że szlak syntezy obejmuje etapy
    a) przeprowadzania aldehydu acetylocyklosporyny A w mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu, w reakcji Wittiga aldehydu acetylocyklosporyny A z ylidem fosforowym, ewentualnie w obecności halogenku litu; oraz
    b) wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, przez podziałanie zasadą na mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu.
  6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w reakcji Wittiga stosuje się ylid fosforowy otrzymany ze związku wybranego z grupy obejmującej trifenylofosfinę, triarylofosfinę, trialkilofosfinę i aryloalkilofosfinę.
  7. 7. Sposób wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, znamienny tym, że szlak syntezy obejmuje etapy
    a) zabezpieczania β-alkoholu cyklosporyny A przez wytworzenie pierwszego związku pośredniego, acetylocyklosporyny A;
    b) utleniania acetylocyklosporyny A, z wytworzeniem drugiego związku pośredniego, aldehydu acetylocyklosporyny A;
    c) przeprowadzania pośredniego aldehydu acetylocyklosporyny A w mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu, drogą reakcji Wittiga tego związku pośredniego z ylidem fosforowym, ewentualnie w obecności halogenku litu; oraz
    d) wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, przez podziałanie zasadą na mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu.
    PL 210 841 B1
  8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap utleniania prowadzi się z użyciem środka utleniającego wybranego z grupy obejmującej ozon, nadmanganian potasu, tetratlenek rutenu, tetratlenek osmu, tetratlenek osmu osadzony na polimerze i chlorek rutenu.
  9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że środki utleniające, tetratlenek rutenu i chlorek rutenu, stosuje się ze współutleniaczem wybranym z grupy obejmującej nadjodan i podchloryn.
  10. 10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że środki utleniające, tetratlenek rutenu i chlorek rutenu, stosuje się z acetonitrylem.
  11. 11. Sposób według zastrz. 1, 5 albo 7, znamienny tym, że na acetylo-1,3-dien działa się zasadą wybraną z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglanu potasu, alkoholan sodu i alkoholan potasu.
  12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że związek pośredni stanowi bromek trifenylo- lub trialkilofosfoniowy acetylocyklosporyny A i w którym etap mieszania związku pośredniego z formaldehydem prowadzi się w obecności halogenku litu.
  13. 13. Sposób według zastrz. 5-7, znamienny tym, że wytwarzanie aldehydu cyklosporyny A obejmuje etapy
    a) zabezpieczania β-alkoholu cyklosporyny A przez utworzenie acetylocyklosporyny A; oraz
    b) utleniania acetylocyklosporyny A ozonem jako środkiem utleniającym, a następnie obróbka środkiem redukującym.
  14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80°C do 0°C.
  15. 15. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej trialkilofosfiny, triarylofosfiny i trialkiloaminy.
  16. 16. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej sulfidy alkiloarylowe, tiosiarczany i sulfidy dialkilowe.
  17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.
  18. 18. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.
  19. 19. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.
  20. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.
  21. 21. Sposób według zastrz. 13 - 20, znamienny tym, że w ozonolizie acetylocyklosporyny A jako rozpuszczalnik stosuje się niższy alkohol.
  22. 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że jako alkohol stosuje się metanol.
  23. 23. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że w ozonolizie stosuje się rozpuszczalnik wybrany z grupy obejmującej dichlorometan oraz mieszaninę dichlorometanu i niższego alkoholu.
  24. 24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że jako niższy alkohol stosuje się metanol.
  25. 25. Sposób wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, znamienny tym, że szlak syntezy obejmuje etapy
    a) przeprowadzania pośredniego związku, aldehydu acetylocyklosporyny A, w mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu, drogą reakcji związku pośredniego z ylidem fosforowym wytworzonym z halogenku tributyloallilofosfoniowego lub halogenku trifenylofosfoniowego w reakcji Wittiga, ewentualnie w obecności halogenku litu; oraz
    b) wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, przez podziałanie zasadą na mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu.
  26. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że halogenek fosfoniowy stanowi bromek fosfoniowy.
  27. 27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że reakcję Wittiga prowadzi się w rozpuszczalniku wybranym z grupy obejmującej tetrahydrofuran i toluen, przy czym rozpuszczalnik stosuje się w obecności związku wybranego z grupy obejmującej butylolit, niższy alkoholan sodu, niższy alkoholan potasu i węglan, w temperaturze od około -80°C do 110°C.
  28. 28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że jako niższy alkoholan potasu stosuje się t-butanolan potasu.
  29. 29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik stosuje się tetrahydrofuran w obecności t-butanolanu potasu w temperaturze od około -70°C do -100°C.
    PL 210 841 B1
  30. 30. Sposób wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, obejmujący szlak syntezy, w którym tak wytwarza się izomer (E) i izomer (Z) ISATX247, że izomer (E) i izomer (Z) są obecne w mieszaninie w uprzednio określonym stosunku, znamienny tym, że szlak syntezy obejmuje etapy
    a) zabezpieczania β-alkoholu aminokwasu 1 cyklosporyny A;
    b) utleniania zabezpieczonej cyklosporyny A, z wytworzeniem aldehydu zabezpieczonej cyklosporyny A;
    c) przeprowadzania aldehydu zabezpieczonej cyklosporyny A w mieszaninę izomerów (E) i (Z) zabezpieczonego 1,3-dienu, drogą reakcji aldehydu zabezpieczonej cyklosporyny A, poprzez reakcję Wittiga z ylidem fosforowym, ewentualnie w obecności halogenku litu; oraz
    d) wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z), poprzez odbezpieczenie zabezpieczonego 1,3-dienu.
  31. 31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że grupę β-alkoholową aminokwasu 1 cyklosporyny A zabezpiecza się poprzez reakcję z reagentem, z wytworzeniem zabezpieczonej cyklosporyny A wybranej z grupy obejmującej estry octanowe, estry benzoesanowe, podstawione estry benzoesanowe, etery i etery sililowe.
  32. 32. Sposób wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, znamienny tym, że szlak syntezy obejmuje etapy
    a) przeprowadzania związku pośredniego, aldehydu TMS-cyklosporyny A, w mieszaninę izomerów (E) i (Z) TMS-1,3-dienu, w reakcji związku pośredniego z ylidem fosforowym wytworzonym z halogenku tributyloallilofosfoniowego lub halogenku trifenylofosfoniowego, w warunkach reakcji Wittiga, ewentualnie w obecności halogenku litu; oraz
    b) wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, przez odbezpieczenie mieszaniny izomerów (E) i (Z) TMS-1,3-dienu z użyciem kwasu.
  33. 33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że jako halogenek fosfoniowy stosuje się bromek fosfoniowy.
  34. 34. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że etap a) prowadzi się w rozpuszczalniku, który stanowi tetrahydrofuran i/lub toluen, stosowanym w obecności niższego alkoholanu sodu lub potasu, albo węglanu, w temperaturze od około -80°C do 110°C.
  35. 35. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że jako niższy alkoholan sodu lub potasu stosuje się t-butanolan potasu.
  36. 36. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że stosuje się kwas wybrany z grupy obejmującej kwas chlorowodorowy, kwas octowy, kwas cytrynowy, kwas Lewisa i reagenty na bazie HF.
PL370772A 2001-10-19 2002-10-17 Sposób wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247 PL210841B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34620101P 2001-10-19 2001-10-19
US37059602P 2002-04-05 2002-04-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL370772A1 PL370772A1 (pl) 2005-05-30
PL210841B1 true PL210841B1 (pl) 2012-03-30

Family

ID=26994746

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL392749A PL210795B1 (pl) 2001-10-19 2002-10-17 Sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (E), sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (Z), sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (E) ISATX247, sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (Z) ISATX247 i sposób wytwarzania mieszaniny izomerów ISATX247
PL370772A PL210841B1 (pl) 2001-10-19 2002-10-17 Sposób wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL392749A PL210795B1 (pl) 2001-10-19 2002-10-17 Sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (E), sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (Z), sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (E) ISATX247, sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (Z) ISATX247 i sposób wytwarzania mieszaniny izomerów ISATX247

Country Status (28)

Country Link
US (13) US7141648B2 (pl)
EP (2) EP1714977B1 (pl)
JP (3) JP4261355B2 (pl)
KR (2) KR100982466B1 (pl)
CN (1) CN100334106C (pl)
AT (2) ATE425178T1 (pl)
AU (2) AU2002331509B2 (pl)
BR (1) BRPI0213658A8 (pl)
CA (1) CA2461740C (pl)
CO (1) CO5580836A2 (pl)
CY (1) CY1105111T1 (pl)
DE (2) DE60213115T2 (pl)
DK (2) DK1436321T3 (pl)
ES (2) ES2326040T3 (pl)
HK (1) HK1062568A1 (pl)
HR (2) HRP20040355B1 (pl)
IL (3) IL160763A0 (pl)
MA (1) MA27293A1 (pl)
MX (1) MXPA04003625A (pl)
NO (1) NO332459B1 (pl)
NZ (1) NZ531944A (pl)
PL (2) PL210795B1 (pl)
PT (2) PT1714977E (pl)
RU (1) RU2321593C9 (pl)
SI (1) SI1436321T1 (pl)
TN (1) TNSN04068A1 (pl)
WO (1) WO2003033526A2 (pl)
ZA (1) ZA200402269B (pl)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030220234A1 (en) * 1998-11-02 2003-11-27 Selvaraj Naicker Deuterated cyclosporine analogs and their use as immunodulating agents
ES2326040T3 (es) * 2001-10-19 2009-09-29 Isotechnika Inc. Sintesis de analogos de ciclosporina.
MY187182A (en) * 2001-10-19 2021-09-08 Isotechnika Inc Cyclosporine analogue mixtures and their use as immunomodulating agents
EP1603512A2 (en) * 2003-03-17 2005-12-14 Albany Molecular Research, Inc. Novel cyclosporins
TW200505946A (en) * 2003-04-08 2005-02-16 Hoffmann La Roche Process for preparation of cyclosporin a analog
US20040266669A1 (en) * 2003-06-20 2004-12-30 Wu Frank X. H. Cyclosporin derivatives for the treatment of immune disorders
US7799756B2 (en) 2004-07-29 2010-09-21 Albany Molecular Research, Inc. Processes for stereoselective synthesis of trans ISATX247
US7511013B2 (en) * 2004-09-29 2009-03-31 Amr Technology, Inc. Cyclosporin analogues and their pharmaceutical uses
EP1809656A4 (en) * 2004-09-29 2009-03-25 Amr Technology Inc CYCLOSPORINAL KINANALOGA AND ITS PHARMACEUTICAL APPLICATIONS
JP2008515886A (ja) * 2004-10-06 2008-05-15 エーエムアール テクノロジー インコーポレイテッド シクロスポリンアルキンおよびそれらの医用薬剤としての有用性
KR20070100284A (ko) * 2004-12-17 2007-10-10 이소테크니카 인코포레이티드 시클로스포린 유사체의 대사산물
EP1928807A4 (en) * 2005-09-02 2011-05-04 Picobella Llc ONCOGENIC REGULATORS RNA FOR DIAGNOSIS AND THERAPY
US7459280B2 (en) * 2006-02-27 2008-12-02 Picobella, Llc Methods for diagnosing and treating kidney cancer
US20070232532A1 (en) * 2006-03-28 2007-10-04 Amr Technology, Inc. Use of cyclosporin alkene analogues for preventing or treating viral-induced disorders
US7696166B2 (en) 2006-03-28 2010-04-13 Albany Molecular Research, Inc. Use of cyclosporin alkyne/alkene analogues for preventing or treating viral-induced disorders
US7696165B2 (en) * 2006-03-28 2010-04-13 Albany Molecular Research, Inc. Use of cyclosporin alkyne analogues for preventing or treating viral-induced disorders
US20080267977A1 (en) * 2007-04-26 2008-10-30 Friedrich-Alexander University Of Erlangen-Nuremberg Combined immunological agent and sensitizing agent for the treatment of cancer
WO2009048929A1 (en) 2007-10-08 2009-04-16 Lux Biosciences, Inc. Ophthalmic compositions comprising calcineurin inhibitors or mtor inhibitors
EP2151450A1 (de) * 2008-07-29 2010-02-10 Sandoz AG Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen Oligopeptiden
US20130190223A1 (en) * 2008-07-30 2013-07-25 Isotechnika Pharma Inc. Nonimmunosuppressive cyclosporine analogue molecules
DE102008060549A1 (de) 2008-12-04 2010-06-10 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Wirkstoff-Peptid-Konstrukt zur extrazellulären Anreicherung
CA2751210C (en) 2009-01-30 2015-04-21 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Cyclosporin analogues for preventing or treating hepatitis c infection
US8481483B2 (en) 2009-02-19 2013-07-09 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Cyclosporin analogues
MX338355B (es) 2009-06-09 2016-04-13 Aurinia Pharmaceuticals Inc Sistemas de suministro de farmaco topico para uso oftalmico.
US8349312B2 (en) 2009-07-09 2013-01-08 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Proline substituted cyclosporin analogues
US8685917B2 (en) 2009-07-09 2014-04-01 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Cyclosporin analogues
US8367053B2 (en) 2009-07-09 2013-02-05 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Cyclosporin analogues
GB0912584D0 (en) * 2009-07-20 2009-08-26 Ucl Business Plc Cyclosporin conjugates
US8623814B2 (en) 2010-02-23 2014-01-07 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Antiviral agents
WO2012079172A1 (en) 2010-12-15 2012-06-21 Isotechnika Pharma Inc. Cyclosporine analogue molecules modified at amino acid 1 and 3
US20140050728A1 (en) * 2011-01-28 2014-02-20 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Methods and compositions for inhibiting cyclophilin d for the treatment and prevention of obesity and kidney indications
US10429712B2 (en) 2012-04-20 2019-10-01 View, Inc. Angled bus bar
WO2012145426A1 (en) 2011-04-18 2012-10-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods to treat cancer using cyclosporine and cyclosporine derivatives
CN103517707A (zh) 2011-04-29 2014-01-15 西莱克塔生物科技公司 从合成纳米载体中控制释放免疫抑制剂
AR090964A1 (es) * 2012-05-09 2014-12-17 Novartis Ag Proceso para la elaboracion de undecapeptidos ciclicos
AU2013267435B2 (en) * 2012-06-01 2017-11-09 Allergan, Inc. Cyclosporin A analogs
EP2705856A1 (en) 2012-09-07 2014-03-12 Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen e.V. Compounds for the treatment of neurodegenerative disorders
WO2014085623A1 (en) 2012-11-28 2014-06-05 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Novel [n-me-4-hydroxyleucine]-9-cyclosporin analogues
CN105188666A (zh) 2013-04-01 2015-12-23 阿勒根公司 用于持续的眼内释放的微球药物递送系统
KR20220025909A (ko) 2013-05-03 2022-03-03 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. 면역 관용의 유도를 위한 특정된 약역학적 유효 수명을 갖는 면역억제제 및 항원의 전달
TWI685706B (zh) 2013-06-18 2020-02-21 唯景公司 非矩形之電致變色裝置
EP3038626A4 (en) 2013-08-26 2017-04-19 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Cyclosporin analogues for preventing or treating hepatitis c
BR112017001470A2 (pt) 2014-09-07 2018-02-20 Selecta Biosciences Inc métodos e composições para atenuar as respostas imunes do vetor de transferência anti-viral de terapia genética
US9669095B2 (en) 2014-11-03 2017-06-06 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Cyclosporin analogues for preventing or treating hepatitis C infection
CN107530322B (zh) * 2014-12-17 2021-10-15 维里卡制药有限公司 斑螯素和生物活性斑螯素衍生物的商业上可行的合成
US9914755B2 (en) 2015-01-08 2018-03-13 Allergan, Inc. Cyclosporin derivatives wherein the MeBmt sidechain has been cyclized
CN106554392B (zh) * 2016-11-21 2019-10-25 石家庄中天生物技术有限责任公司 一种高纯度环孢菌素衍生物stg-175的制备方法
CN110612122A (zh) 2017-03-11 2019-12-24 西莱克塔生物科技公司 与用抗炎剂和包含免疫抑制剂之合成纳米载体进行的组合治疗相关的方法和组合物
US10286036B2 (en) 2017-05-12 2019-05-14 Aurinia Pharmaceuticals Inc. Protocol for treatment of lupus nephritis
US20190224275A1 (en) 2017-05-12 2019-07-25 Aurinia Pharmaceuticals Inc. Protocol for treatment of lupus nephritis
US11584779B2 (en) 2018-10-19 2023-02-21 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Solid state forms of voclosporin
EP4201952A1 (en) 2021-12-21 2023-06-28 Curia Spain, S.A.U. Process for the controlled synthesis of voclosporin

Family Cites Families (201)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US525590A (en) * 1894-09-04 canda
US4210581A (en) * 1975-11-04 1980-07-01 Sandoz Ltd. Organic compounds
CH614931A5 (pl) * 1975-11-04 1979-12-28 Sandoz Ag
US4117118A (en) * 1976-04-09 1978-09-26 Sandoz Ltd. Organic compounds
DK25877A (da) 1977-01-21 1978-08-15 Nordisk Insulinlab Fremgangsmaade til udvinding af renset albumin fra blodplasma
US4256108A (en) 1977-04-07 1981-03-17 Alza Corporation Microporous-semipermeable laminated osmotic system
US4160452A (en) 1977-04-07 1979-07-10 Alza Corporation Osmotic system having laminated wall comprising semipermeable lamina and microporous lamina
CH628022A5 (en) 1977-05-10 1982-02-15 Sandoz Ag Process for the preparation of an antibiotic derivative
CH630061A5 (en) 1977-05-10 1982-05-28 Sandoz Ag Process for the preparation of an antibiotic derivative
DE2819094A1 (de) * 1977-05-10 1978-11-23 Sandoz Ag Cyclosporin-derivate, ihre verwendung und herstellung
CH630062A5 (en) 1977-05-23 1982-05-28 Sandoz Ag Process for the preparation of an antibiotic derivative
SE448386B (sv) * 1978-10-18 1987-02-16 Sandoz Ag Nya cyklosporinderivat, forfarande for framstellning av dem samt farmaceutisk komposition innehallande dem
US4201771A (en) * 1979-03-12 1980-05-06 Merck & Co., Inc. Antibiotic A43F
US4396542A (en) 1980-02-14 1983-08-02 Sandoz Ltd. Method for the total synthesis of cyclosporins, novel cyclosporins and novel intermediates and methods for their production
AU548156B2 (en) 1980-02-14 1985-11-28 Novartis Ag Cyclo sporin
US4265874A (en) * 1980-04-25 1981-05-05 Alza Corporation Method of delivering drug with aid of effervescent activity generated in environment of use
FR2487198A1 (fr) * 1980-07-28 1982-01-29 Berri Balzac Sa Nouvelle substance immuno-suppressive, son procede d'isolement et son application en therapeutique
US4304641A (en) 1980-11-24 1981-12-08 International Business Machines Corporation Rotary electroplating cell with controlled current distribution
US4384996A (en) 1981-01-09 1983-05-24 Sandoz Ltd. Novel cyclosporins
CH667274A5 (de) * 1984-03-23 1988-09-30 Sandoz Ag Cyclosporine, ihre herstellung und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen.
US4727018A (en) * 1984-05-18 1988-02-23 Eichner Ronald D Immunoregulation of transplantable tissue
US5639724A (en) * 1984-07-24 1997-06-17 Sandoz Ltd. Cyclosporin galenic forms
GB8422253D0 (en) * 1984-09-04 1984-10-10 Sandoz Ltd Organic compounds
WO1986002080A1 (en) 1984-10-04 1986-04-10 Sandoz Ag Monoclonal antibodies to cyclosporings
US5169773A (en) 1984-10-04 1992-12-08 Sandoz Ltd. Monoclonal antibodies to cyclosporins
EP0194972B1 (en) 1985-03-11 1992-07-29 Sandoz Ag Novel cyclosporins
US5047512A (en) * 1985-05-03 1991-09-10 Handschumacher Robert E Immobilized cyclophilin and methods of using such
DE3531597A1 (de) 1985-09-04 1987-03-05 Bioferon Biochem Substanz Verwendung von interferon-gamma (ifn-gamma) enthaltenden praeparationen zur behandlung psoriatischer erkrankungen
US4765980A (en) * 1986-04-28 1988-08-23 International Minerals & Chemical Corp. Stabilized porcine growth hormone
CH670644A5 (pl) * 1986-12-18 1989-06-30 Lonza Ag
US4764503A (en) * 1986-11-19 1988-08-16 Sandoz Ltd. Novel cyclosporins
US4963683A (en) * 1986-12-18 1990-10-16 Sri International Process for preparing polyoxa tetracyclic compounds
NL194638C (nl) 1986-12-19 2002-10-04 Novartis Ag Hydrosol die vaste deeltjes van een farmaceutisch actieve stof bevat en farmaceutisch preparaat dat deze hydrosol bevat.
US5084441A (en) * 1987-03-04 1992-01-28 Shaw Jack M Acetylated low density lipoproteins: a delivery system to phagocytic cells for stimulating immunologic response and host resistance
US5239057A (en) * 1987-03-27 1993-08-24 Abbott Laboratories Fluorescence polarization assay for cyclosporin a and metabolites and related immunogens and antibodies
EP0283801A3 (en) 1987-03-27 1990-05-30 Abbott Laboratories Fluorescence polarization assay for cyclosporin a and metabolites and related immunogens and antibodies
US5427960A (en) * 1987-03-27 1995-06-27 Abbott Laboratories Fluorescence polarization assay for cyclosporin A and metabolites and related immunogens and antibodies
US4798823A (en) 1987-06-03 1989-01-17 Merck & Co., Inc. New cyclosporin analogs with modified "C-9 amino acids"
US4885276A (en) 1987-06-03 1989-12-05 Merck & Co., Inc. Cyclosporin analogs with modified "C-9 amino acids"
JP2577049B2 (ja) * 1987-06-04 1997-01-29 三共株式会社 シクロスポリン製剤
ES2059558T3 (es) 1987-06-17 1994-11-16 Sandoz Ag Ciclosporins y su uso como productos farmaceuticos.
ATE110784T1 (de) * 1987-06-19 1994-09-15 Sandoz Ag Zyklische peptolide.
GB2206119B (en) 1987-06-22 1990-10-31 Merck & Co Inc A new cyclosporin derivative with modified "8-amino acid"
EP0373260B1 (en) 1987-06-22 1994-03-09 Merck & Co. Inc. Cyclosporin derivatives with modified "8-amino acid"
GB8717299D0 (en) * 1987-07-22 1987-08-26 Nat Res Dev Peptides
GB8717300D0 (en) 1987-07-22 1987-08-26 Nat Res Dev Cyclosporins
US5227467A (en) * 1987-08-03 1993-07-13 Merck & Co., Inc. Immunosuppressive fluorinated cyclosporin analogs
GB2207678A (en) 1987-08-03 1989-02-08 Merck & Co Inc Novel immunosuppressive fluorinated cyclosporin analogs
US4963362A (en) 1987-08-07 1990-10-16 Regents Of The University Of Minnesota Freeze-dried liposome mixture containing cyclosporin
ATE109970T1 (de) * 1987-09-03 1994-09-15 Univ Georgia Res Found Cyclosporin-augenmittel.
US4839342A (en) * 1987-09-03 1989-06-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method of increasing tear production by topical administration of cyclosporin
US5089390A (en) * 1987-09-04 1992-02-18 Syntex (U.S.A.) Inc. 2-methyl-4-hexene- and 2-methyl-4-heptene-1,2-diol derivatives
US4866036A (en) * 1987-10-05 1989-09-12 Merck & Co., Inc. Dipeptidyl 5-0,6-0-acyl-2-amino-2-deoxy-D-glucofuranose compositions and methods of use in aids-immunocompromised human hosts
US4868157A (en) * 1987-10-05 1989-09-19 Merck & Co., Inc. Dipeptidyl 2-amino-1,2-dideoxy-D-glucose derivatives as host resistance enhancers in AIDS-immunocompromised hosts and methods of use
US4868155A (en) * 1987-10-05 1989-09-19 Merck & Co., Inc. Dipeptidyl 4-0-,6-0-acyl-2-amino-2-deoxy-D-glucose compositions and methods of use in AIDS-immunocompromised human hosts
US5236899A (en) * 1987-11-16 1993-08-17 Merck & Co., Inc. 6-position cyclosporin a analogs as modifiers of cytotoxic drug resistance
US4914188A (en) * 1987-11-16 1990-04-03 Merck & Co., Inc. Novel 6-position cyclosporin analogs as non-immunosuppressive antagonists of cyclosporin binding to cyclophilin
GB8729153D0 (en) 1987-12-14 1988-01-27 Efamol Ltd Fatty acid compositions
US5693760A (en) 1988-04-14 1997-12-02 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Method of causing selective immunosuppression using HL-60 related lectins
WO1989010351A1 (en) * 1988-04-21 1989-11-02 Leo Pharmaceutical Products Ltd. A/S (Løvens Kemis Novel vitamin d analogues
JPH0774799B2 (ja) 1988-04-28 1995-08-09 積水化学工業株式会社 血中成分の測定法
JP3038339B2 (ja) 1988-05-02 2000-05-08 ザイナクシス・テクノロジーズ・インコーポレーテッド バイオ粒子の表面膜に対してバイオアフェクティング物質を結合する化合物
US5013719A (en) * 1988-05-13 1991-05-07 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Method of effecting immunosuppression
DE3927804A1 (de) 1988-08-24 1990-03-01 Boehringer Ingelheim Kg Verwendung von paf-antagonisten zur behandlung von autoimmunerkrankungen
US5219884A (en) 1988-09-14 1993-06-15 Taito Co., Ltd. Immunosuppressant
GB2222770B (en) * 1988-09-16 1992-07-29 Sandoz Ltd Pharmaceutical compositions containing cyclosporins
US5342625A (en) * 1988-09-16 1994-08-30 Sandoz Ltd. Pharmaceutical compositions comprising cyclosporins
JPH02124100A (ja) 1988-11-02 1990-05-11 Tonen Corp プロリルイソメラーゼの使用方法
US5632991A (en) * 1988-11-14 1997-05-27 Brigham & Women's Hospital Antibodies specific for E-selectin and the uses thereof
AU630901B2 (en) 1988-12-02 1992-11-12 Children's Research Institute Cyclosporine binding protein and use in an assay for biologically-active cyclosporine
US5698448A (en) 1988-12-02 1997-12-16 Soldin; Steven J. Immunosuppressive drug binding proteins and use
AU4958590A (en) 1988-12-05 1990-07-10 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Novel derivatives of cyclosporine a, antibodies directed thereto and uses thereof
JPH03115228A (ja) 1988-12-09 1991-05-16 G D Searle & Co 免疫抑制剤
US5153327A (en) 1988-12-23 1992-10-06 E. R. Squibb & Sons, Inc. 7-Oxabicycloheptyl substituted heterocyclic amide or ester prostaglandin analogs useful in the treatment of thrombotic and vasospastic disease
US5100889A (en) * 1989-04-03 1992-03-31 E. R. Squibb & Sons, Inc. 7-oxabicycloheptyl substituted heterocyclic amide or ester prostaglandin analogs useful in the treatment of thrombotic and vasospastic disease
GB2227244A (en) 1989-01-19 1990-07-25 Merck & Co Inc Immunosuppressive fluorinated cyclosporin analogs
US5540931A (en) * 1989-03-03 1996-07-30 Charles W. Hewitt Methods for inducing site-specific immunosuppression and compositions of site specific immunosuppressants
US4996193A (en) * 1989-03-03 1991-02-26 The Regents Of The University Of California Combined topical and systemic method of administration of cyclosporine
US5401731A (en) * 1989-06-29 1995-03-28 Leo Pharmaceutical Products Ltd. A/S (Lovens Kemiske Fabrik Productionsaktieselskab) Vitamin D analogues
US5068247A (en) 1989-07-07 1991-11-26 Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. 2-aminopentanoic acid compounds and their use as immunosuppressants
GB8915770D0 (en) * 1989-07-10 1989-08-31 Leo Pharm Prod Ltd Chemical compounds
US5665543A (en) * 1989-07-18 1997-09-09 Oncogene Science, Inc. Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
US5284826A (en) * 1989-07-24 1994-02-08 Sandoz Ltd. 0-hydroxyethyl and acyloxyethyl derivatives of [ser]8 cyclosporins
GB8916901D0 (en) 1989-07-24 1989-09-06 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
CS277471B6 (cs) 1989-11-16 1993-03-17 Alexandr Rndr Csc Jegorov Deriváty cyklosporinu A
CS277472B6 (cs) 1989-11-16 1993-03-17 Alexandr Rndr Csc Jegorov Způsob výroby derivátů cyklosporinu A
US5514788A (en) * 1993-05-17 1996-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US5591623A (en) * 1990-08-14 1997-01-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US5129884A (en) * 1990-01-16 1992-07-14 Dysarz Edward D Trap in barrel one handed retracted intervenous catheter device
US5270419A (en) 1990-01-19 1993-12-14 Nova Pharmaceutical Corporation Polyanhydrides of oligomerized unsaturated aliphatic acids
US5171812A (en) 1990-01-19 1992-12-15 Nova Pharmaceutical Corporation Polyanhydrides of oligomerized unsaturated aliphatic acids
US5214130A (en) * 1990-02-27 1993-05-25 Merck & Co., Inc. Synthesis of novel immunosuppressive cyclosporin analogs with modified amino acids at position-8
US5122511A (en) * 1990-02-27 1992-06-16 Merck & Co., Inc. Immunosuppressive cyclosporin analogs with modified amino acids at position-8
DE4013910A1 (de) 1990-04-26 1991-10-31 Schering Ag Kombinationspraeparat zur immunsuppressiven therapie
US5385915A (en) * 1990-05-16 1995-01-31 The Rockefeller University Treatment of amyloidosis associated with Alzheimer disease using modulators of protein phosphorylation
GB9017890D0 (en) * 1990-08-15 1990-09-26 Leo Pharm Prod Ltd Chemical compounds i
DK0473961T3 (da) * 1990-08-15 1996-07-01 Abbott Lab Immunoassay-reagenser og fremgangsmåde til bestemmelse af cyklosporin
WO1992004055A1 (en) 1990-09-06 1992-03-19 The Australian National University Immunosuppressant composition
DE69124459T3 (de) * 1990-11-02 2001-05-31 Novartis Ag Zyklosporine
ES2181734T3 (es) 1990-11-20 2003-03-01 Dade Behring Marburg Gmbh Ensayo inmunologico de ciclosporina.
ES2078374T3 (es) 1991-04-06 1995-12-16 Dresden Arzneimittel Procedimiento para la produccion por fermentacion y aislamiento de ciclosporina a, y nuevas cepas formadoras de ciclosporina.
ZA923640B (en) * 1991-05-21 1993-02-24 Iaf Biochem Int Processes for the diastereoselective synthesis of nucleosides
US5578444A (en) 1991-06-27 1996-11-26 Genelabs Technologies, Inc. Sequence-directed DNA-binding molecules compositions and methods
GB9113872D0 (en) 1991-06-27 1991-08-14 Sandoz Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB9116470D0 (en) 1991-07-30 1991-09-11 Erba Carlo Spa 2-(imidazol-1-yl)-benzylethylidene-aminoxyalkanoic acid derivatives
WO1993003729A1 (en) 1991-08-12 1993-03-04 Research Corporation Technologies, Inc. N-substituted phenoxazines for treating multidrug resistant cancer cells
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5972630A (en) * 1991-08-19 1999-10-26 Dade Behring Marburg Gmbh Homogeneous immunoassays using enzyme inhibitors
US5217586A (en) 1992-01-09 1993-06-08 International Business Machines Corporation Electrochemical tool for uniform metal removal during electropolishing
US5190972A (en) * 1992-01-27 1993-03-02 The University Of Melbourne Method of combatting cyclosporine organ toxicity with prostaglandin analogs
GB9204466D0 (en) * 1992-03-02 1992-04-15 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
GB9206648D0 (en) * 1992-03-26 1992-05-06 Leo Pharm Prod Ltd Chemical compounds
US5637317A (en) * 1992-05-18 1997-06-10 Dietl; Hans Pharmaceutical preparation containing cyclosporin(s) for oral administration and process for producing same
EP0570829B1 (de) 1992-05-18 2001-04-25 CicloMulsion AG Cyclosporin(e) enthaltende pharmazeutische Zubereitung zur intravenösen Applikation sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
HU213553B (en) * 1992-05-25 1997-07-28 Biogal Gyogyszergyar Process for isolating of cyclosporin-a
WO1993025533A1 (en) 1992-06-05 1993-12-23 Abbott Laboratories Methods and reagents for the determination of immunosuppressive agents
EP0647625A1 (en) * 1992-06-23 1995-04-12 Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai Novel antibiotics with immunosuppressive activity, delaminomycins, and production thereof
GB9214202D0 (en) * 1992-07-03 1992-08-12 Leo Pharm Prod Ltd Chemical compounds
EP0578616A3 (en) 1992-07-09 1994-06-01 Sandoz Ltd Cylosporin synthetase
CZ278863B6 (en) 1992-09-07 1994-07-13 Galena Medicinal preparations with n-methylated cyclic undecapeptides
GB9220439D0 (en) 1992-09-28 1992-11-11 Leo Pharm Prod Ltd Chemical compounds
US5318895A (en) 1992-10-05 1994-06-07 Merck & Co., Inc. Aspergillus niger mutants
US5589458A (en) 1992-11-13 1996-12-31 Thomas Jefferson University Compounds that inhibit T cell proliferation and methods for using the same
US5298523A (en) * 1992-12-14 1994-03-29 Harbor Branch Oceanographic Institution, Inc. Method for treating transplant patients using mycalamide compounds
GB9226877D0 (en) * 1992-12-23 1993-02-17 Leo Pharm Prod Ltd Chemical compounds
CA2086267A1 (en) 1992-12-24 1994-06-25 Argyrios Margaritis Cyclosporin derivatives and derivative conjugates
FI92334C (fi) * 1992-12-30 1994-10-25 Leiras Oy Menetelmä syklosporiinien tuottamiseksi ja menetelmässä käytettävä uusi Tolypocladium-kanta
US5393669A (en) * 1993-02-05 1995-02-28 Martek Biosciences Corp. Compositions and methods for protein structural determinations
CA2155728C (en) * 1993-02-12 2000-04-25 Gerald R. Crabtree Regulated transcription of targeted genes and other biological events
US5834266A (en) 1993-02-12 1998-11-10 President & Fellows Of Harvard College Regulated apoptosis
US5916596A (en) 1993-02-22 1999-06-29 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Protein stabilized pharmacologically active agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof
US5665382A (en) * 1993-02-22 1997-09-09 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of pharmaceutically active agents for in vivo delivery
US5650156A (en) * 1993-02-22 1997-07-22 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods for in vivo delivery of nutriceuticals and compositions useful therefor
BR9405798A (pt) * 1993-02-22 1995-12-12 Vivorx Pharmaceuticals Inc Métodos para liberação in vivo de material biológico e composições úteis dos mesmos
US5665383A (en) * 1993-02-22 1997-09-09 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of immunostimulating agents for in vivo delivery
US5468772A (en) 1993-03-10 1995-11-21 Pharmagenesis, Inc. Tripterinin compound and method
CZ291237B6 (cs) 1993-04-20 2003-01-15 Novartis Ag Farmaceutický přípravek pro orální podání obsahující cyklosporin A
EP0696323A1 (de) 1993-04-23 1996-02-14 Novartis AG Rekombinante alanin racemase und gadph aus tolypocladium niveum
JPH09500103A (ja) * 1993-05-04 1997-01-07 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド シクロヘキサペプチジルアミノアルキルエーテル
DE4338086A1 (de) 1993-11-08 1995-05-11 Dietl Hans Cyclosporin(e) enthaltende pharmazeutische Zubereitung zur oralen Applikation sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
WO1995005372A1 (fr) 1993-08-13 1995-02-23 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Derive de cyclopentane a activite antagoniste de l'endotheline
DE69426698T2 (de) 1993-08-18 2001-08-16 Banyu Pharma Co Ltd Kondensierte heteroaromatische cyclopentenderivate mit endothelin-antagonistischer aktivität
US5421987A (en) 1993-08-30 1995-06-06 Tzanavaras; George Precision high rate electroplating cell and method
US5510239A (en) * 1993-10-18 1996-04-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
DE59409377D1 (de) 1993-10-22 2000-06-29 Hexal Ag Pharmazeutische zusammensetzung mit cyclosporin a, einen vitamin e derivat und einen emulgator
ATE372966T1 (de) 1994-03-25 2007-09-15 Isotechnika Inc Verbesserung der effektivität von arzneimitteln duren deuterierung
JPH07278187A (ja) 1994-04-07 1995-10-24 Nippon Shinyaku Co Ltd シクロスポリン類のリン酸エステル誘導体及び医薬組成物
US5798386A (en) 1994-08-03 1998-08-25 Cell Therapeutics, Inc. Angiogenic lipid formulations
US5639852A (en) 1994-09-01 1997-06-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Immunostimulatory agents
US5948693A (en) 1994-09-01 1999-09-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Solid phase synthesis of immunosuppressive agents
US5567300A (en) 1994-09-02 1996-10-22 Ibm Corporation Electrochemical metal removal technique for planarization of surfaces
US5554725A (en) * 1994-09-14 1996-09-10 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Synthesis of dolastatin 15
DE4433101A1 (de) 1994-09-16 1996-03-21 Bauer Kurt Heinz Prof Dr Wasserlösliche Dextranfettsäureester und ihre Verwendung als Solubilisatoren
HU215966B (hu) 1994-11-21 1999-07-28 BIOGAL Gyógyszergyár Rt. Orálisan alkalmazható, ciklosporint tartalmazó, összetett emulzió-előkoncentrátum
US5648376A (en) * 1995-01-19 1997-07-15 Pharmagenesis, Inc. Immunosuppressant diterpene compound
SE520730C2 (sv) 1995-01-20 2003-08-19 Eskil Elmer Behandling av hjärnischemi och hjärnskador med ett neuroprotektivt läkemedel
IE75744B1 (en) 1995-04-03 1997-09-24 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable micro- and nanospheres containing cyclosporin
US5668734A (en) 1995-04-10 1997-09-16 The Uab Research Foundation Method for analyzing 2D transferred noesy spectra of molecules undergoing multistate conformational exchange
JPH11504028A (ja) 1995-04-24 1999-04-06 イースム リサーチ ディベロップメント カンパニー オブ ザ ヒーブル ユニバーシティ オブ エルサレム 油／水エマルジョンを作り出す自己乳化性配合物
JP3934705B2 (ja) 1995-05-26 2007-06-20 ノバルティス ファーマ株式会社 サイクロデキストリン組成物
US5616595A (en) * 1995-06-07 1997-04-01 Abbott Laboratories Process for recovering water insoluble compounds from a fermentation broth
US5624902A (en) * 1995-06-07 1997-04-29 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Peptide inhibitors of calmodulin
DE19521974A1 (de) 1995-06-16 1996-12-19 Hexal Pharmaforschung Gmbh Pharmazeutische Zubereitung mit Cyclosporin A
IL122754A (en) 1995-07-17 2001-10-31 Chem Ag C History of cyclosporine, their preparation and the pharmaceutical preparations containing them
JPH0978187A (ja) 1995-09-07 1997-03-25 Daido Steel Co Ltd メッキ用快削鋼
GB9601120D0 (en) 1996-01-19 1996-03-20 Sandoz Ltd Organic compounds
CA2248192A1 (en) 1996-03-12 1997-09-18 Picower Institute For Medical Research Treatment of hiv-infection by interfering with host cell cyclophilin receptor activity
US5840305A (en) 1996-03-14 1998-11-24 The Picower Institute For Medical Research Treatment of HIV-Infection by interfering with host cell cyclophilin receptor activity
DE19611094C2 (de) 1996-03-21 1999-06-17 Dresden Arzneimittel Verfahren zur Reinigung von Cyclosporin A und/oder verwandten Cyclosporinen aus einem Cyclosporin-haltigen Rohextrakt unter Anwendung chromatographischer Verfahren mit Kieselgel als Adsorbens
AUPN880396A0 (en) 1996-03-21 1996-04-18 Fremantle Hospital Animal model for transplantation
JPH1029979A (ja) 1996-04-12 1998-02-03 Ajinomoto Co Inc 新規ピリジン誘導体
US5750510A (en) * 1997-04-04 1998-05-12 Abbott Laboratories 3-descladinose-2,3-anhydroerythromycin derivatives
US5709797A (en) * 1996-06-05 1998-01-20 Poli Industria Chimica S.P.A. Method of isolating cyclosporins
US5747330A (en) * 1996-06-05 1998-05-05 Poli Industria Chimica Antibiotic producing microbe
JP2001523221A (ja) 1996-09-01 2001-11-20 ファーモス コーポレイション 親油性物質の促進された生物学的利用能のための固形共沈物
GB9619894D0 (en) 1996-09-24 1996-11-06 Celltech Therapeutics Ltd Pharmaceutical products
CA2266622C (en) 1996-09-27 2006-08-15 Hyal Pharmaceutical Corporation Hyaluronic drug delivery system
EP0948321B1 (de) 1996-12-12 2003-10-22 Dds Drug Delivery Service Gesellschaft Zur Förderung Der Forschung In Pharmazeutischer Technologie Und Biopharmazie Mbh Zubereitung in form eines wahlweise wirkstoffhaltigen matrixmaterial-hilfsstoff compounds
FR2757521B1 (fr) 1996-12-24 1999-01-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux derives de cyclosporine, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
FR2757522B1 (fr) 1996-12-24 1999-01-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Derives de cyclosporine, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
FR2757520B1 (fr) 1996-12-24 1999-01-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Derive de cyclosporine, sa preparation et les compositions pharmaceutiques qui le contiennent
US5843520A (en) 1997-01-13 1998-12-01 Vanguard International Semiconductor Corporation Substrate clamp design for minimizing substrate to clamp sticking during thermal processing of thermally flowable layers
JPH10251137A (ja) 1997-03-14 1998-09-22 Advanced Sukin Res Kenkyusho:Kk 光線過敏症抑制剤
FR2762843B1 (fr) 1997-04-30 1999-12-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux derives de cyclosporine, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US5939406A (en) * 1997-07-21 1999-08-17 Wisconsin Alumni Research Foundation 18-substituted-19-nor-vitamin D compounds
WO1999010374A1 (en) 1997-08-26 1999-03-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Cyclosporin a conjugates and uses therefor
NZ502362A (en) 1997-10-08 2001-05-25 Isotechnika Inc Deuterated cyclosporine A derivatives and their use as immunomodulating agents
US20030220234A1 (en) * 1998-11-02 2003-11-27 Selvaraj Naicker Deuterated cyclosporine analogs and their use as immunodulating agents
FR2772768B1 (fr) * 1997-12-19 2000-01-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveau procede de preparation de derives de cyclosporine
US6706691B1 (en) 1998-07-15 2004-03-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunosupportive drug sparing diet
US6183611B1 (en) 1998-07-17 2001-02-06 Cutek Research, Inc. Method and apparatus for the disposal of processing fluid used to deposit and/or remove material on a substrate
US6187152B1 (en) 1998-07-17 2001-02-13 Cutek Research, Inc. Multiple station processing chamber and method for depositing and/or removing material on a substrate
FI110094B (fi) 1999-09-10 2002-11-29 Ecospec Ltd Oy Menetelmä maanparannusaineen valmistamiseksi
CA2383233C (en) 1999-09-21 2010-06-08 Rtp Pharma Inc. Surface modified particulate compositions of biologically active substances
EP1408930A1 (de) 1999-10-20 2004-04-21 Vesifact Ag Cyclosporine enthaltende mikroemulsion-prekonzentrate und mikroemulsionen
US6613793B2 (en) 2001-07-02 2003-09-02 Dabur Research Foundation Anticancer activity of imino acid conjugates or methylglyoxal
ES2326040T3 (es) * 2001-10-19 2009-09-29 Isotechnika Inc. Sintesis de analogos de ciclosporina.
MY187182A (en) 2001-10-19 2021-09-08 Isotechnika Inc Cyclosporine analogue mixtures and their use as immunomodulating agents
US7012065B2 (en) 2003-02-07 2006-03-14 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Cyclosporins for the treatment of immune disorders
EP1603512A2 (en) 2003-03-17 2005-12-14 Albany Molecular Research, Inc. Novel cyclosporins

Also Published As

Publication number Publication date
US20050192214A1 (en) 2005-09-01
JP2010280710A (ja) 2010-12-16
ATE425178T1 (de) 2009-03-15
IL160763A (en) 2009-11-18
EP1714977A3 (en) 2007-01-10
DE60231570D1 (de) 2009-04-23
JP4887469B2 (ja) 2012-02-29
AU2010206069A1 (en) 2010-08-19
EP1436321A2 (en) 2004-07-14
JP2005516893A (ja) 2005-06-09
CA2461740A1 (en) 2003-04-24
US7141648B2 (en) 2006-11-28
AU2002331509B2 (en) 2007-12-06
TNSN04068A1 (en) 2006-06-01
EP1436321B1 (en) 2006-07-12
KR100982466B1 (ko) 2010-09-16
NO332459B1 (no) 2012-09-24
US10472394B2 (en) 2019-11-12
MA27293A1 (fr) 2005-05-02
PL392749A1 (pl) 2011-01-03
CN1571795A (zh) 2005-01-26
EP1714977B1 (en) 2009-03-11
HRP20040355B1 (hr) 2012-10-31
US20030212249A1 (en) 2003-11-13
RU2321593C9 (ru) 2008-06-20
JP4261355B2 (ja) 2009-04-30
DE60213115D1 (en) 2006-08-24
KR20050037417A (ko) 2005-04-21
CY1105111T1 (el) 2010-03-03
US20100311944A1 (en) 2010-12-09
US7332472B2 (en) 2008-02-19
KR20090130195A (ko) 2009-12-18
US9765119B2 (en) 2017-09-19
BRPI0213658A8 (pt) 2016-12-06
US20130078280A1 (en) 2013-03-28
ES2326040T3 (es) 2009-09-29
NZ531944A (en) 2006-03-31
US20070087963A1 (en) 2007-04-19
US20160075741A1 (en) 2016-03-17
PT1436321E (pt) 2006-10-31
CO5580836A2 (es) 2005-11-30
PL370772A1 (pl) 2005-05-30
JP5396571B2 (ja) 2014-01-22
RU2004110940A (ru) 2005-06-27
US20140142277A1 (en) 2014-05-22
US20170362277A1 (en) 2017-12-21
SI1436321T1 (sl) 2006-12-31
WO2003033526A2 (en) 2003-04-24
US20100062976A1 (en) 2010-03-11
CN100334106C (zh) 2007-08-29
USRE48226E1 (en) 2020-09-29
ZA200402269B (en) 2005-05-25
DE60213115T2 (de) 2007-02-01
RU2321593C2 (ru) 2008-04-10
US20140370082A1 (en) 2014-12-18
IL186140A (en) 2012-02-29
EP1436321B9 (en) 2008-11-12
US20030139326A1 (en) 2003-07-24
CA2461740C (en) 2013-02-12
KR101006206B1 (ko) 2011-01-07
MXPA04003625A (es) 2004-12-02
PL210795B1 (pl) 2012-03-30
JP2009046515A (ja) 2009-03-05
IL186140A0 (en) 2008-01-20
PT1714977E (pt) 2009-06-23
ATE332917T1 (de) 2006-08-15
EP1714977A2 (en) 2006-10-25
HRP20070058B1 (hr) 2014-05-23
HRP20040355A2 (en) 2005-04-30
BR0213658A (pt) 2004-10-26
IL160763A0 (en) 2004-08-31
DK1436321T3 (da) 2006-11-13
US6998385B2 (en) 2006-02-14
NO20042031L (no) 2004-05-19
WO2003033526A3 (en) 2004-02-12
ES2266564T3 (es) 2007-03-01
DK1714977T3 (da) 2009-07-06
HRP20070058A2 (en) 2008-09-30
US20080171850A1 (en) 2008-07-17
HK1062568A1 (en) 2004-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL210841B1 (pl) Sposób wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247
JP5272140B2 (ja) シクロスポリン類似体混合物及びそれらの免疫調節剤としての使用
AU2007221839B2 (en) Synthesis of cyclosporin analogs

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
RECP Rectifications of patent specification