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PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikum-Derivates Dihydro-cyclosporin D (Formel I),
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dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum Cyclosporin D (Formel II)
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katalytisch hydriert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikum-Derivates Dihydro-cyclosporin D (Formel 1).
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Erfindungsgemäss gelangt man zu Dihydro-cyclosporin D durch katalytische Hydrierung des Antibiotikums Cyclosporin D
(Formel II).
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Die Hydrierung des Antibiotikums Cyclosporin D wird vorteilhafterweise so ausgeführt, dass man das Antibiotikum Cyclosporin D in einem geeigneten Lösungsmittel in Gegenwart von katalytisch aktiviertem Wasserstoff hydriert. Als Lösungsmittel kommen vorzugsweise niedere aliphatische Alkohole, wie z. B. Methanol, Äthanol, Isopropanol, oder Äthylacetat in Frage. Die Hydrierung erfolgt zweckmässigerweise im neutralen Bereich bei Temperaturen zwischen 20 und 30 "C und bei Atmosphärendruck oder wenig erhöhtem Druck. Als Katalysator kommt vorzugsweise Palladium, z. B. Palladium auf Kohle, in Frage. Das so erhaltene Hydrierungsprodukt des Antibiotikums Cyclosporin D kann hierauf in an sich bekannter Weise gereinigt werden, z. B. durch Chromatographie an Kieselgel.
Das als Ausgangsmaterial benützte Antibiotikum Cyclosporin D kann, wie in nachstehendem Beispiel beschrieben, hergestellt werden.
Eigenschaften von Dihydro-cyclosporin D
Farbloses, amorphes Pulver
Smp. 153-156 [alD20 = -237" (c = 0,56 in CHCla) = -196 (c = 0,58 in CH3OH)
Elementaranalyse C63H115N11012
Ber.: C 62,1 H 9,5 N 12,6 0 15,8%
Gef.: C 61,8 H 9,5 N 12,9 0 16,0%
Dihydro-cyclosporin D ist bei Raumtemperatur gut löslich in Methanol, Äthanol, Äther, Aceton und chlorierten Kohlenwasserstoffen; praktisch unlöslich in Wasser und in gesättigten Kohlenwasserstoffen.
UV-Spektrum in CH3OH: Endabsorption
IR-Spektrum in CH2CI2: Siehe Fig. 1 lH-NMR-Spektrum in CDCI3, 90 MHz, mit Tetramethylsilan als internem Standard: siehe Fig. 2
Die RrWerte von Dihydro-cyclosporin D im Dünnschichtchromatogramm gehen aus folgender Tabelle hervor: Fliessmittel RrWerte Chloroform-Methanol (96:4) 0,42 Chloroform-Methanol-Eisessig (90:6:4) 0,57 Chloroform-Aceton (1:1) 0,57 Aceton-Hexan (1:1) 0,43
Polygram SIL G-Folien, Laufstrecke 10 cm.
Aufgetragene Substanzmenge: 40 y
Sichtbarmachung: mit Joddampf gelbbraune Flecken.
Das neue Antibiotikum-Derivat Dihydro-cyclosporin D zeichnet sich durch interessante pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden. So hemmt es das Wachstum von Aspergillus niger und Curvularia lunata.
Insbesondere zeichnet sich die Substanz durch eine immunosuppressive Wirkung aus.
Die immunosuppressive Wirkung kann wie folgt gezeigt werden: a) Im Lymphozytenstimulationstest nach Jänossy wird in vitro in Konzentrationen von 0,01 bis 10,0g/ml eine starke Hemmung des H3-Thymidin-Einbaus, der Proliferationsrate und der Blataogenese von mit Concanavalin A stimulierten Lymphozyten aus Mäusemilz festgestellt.
b) Oxazolon-Test an der Maus: Die Abnahme der Ohrschwellung wird als suppressiver Index (SI) ausgedrückt; SI 0,62 nach 5 x 70 mg/kg p.o.
Aufgrund ihrer immunosuppressiven Wirkung kann die Substanz zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten, die mit der Beeinflussung der Abwehrreaktion im negativen Sinn zusammenhängen, angewandt werden.
Das neue Antibiotikum-Derivat Dihydro-cyclosporin D ist ferner indiziert als Antiarthriticum. So bewirkt es im Freund Adjuvans-Arthritis-Latenzzeitversuch an der Ratte in Dosen von ca. 30 mg/kg p. o, Körpergewicht/Tag eine starke Hemmung der primären und sekundären Entzündung.
Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach Art der Administration und des zu behandelnden Zustandes.
Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 60 bis 300 mg/kg Körpergewicht erzielt. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden. Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 300 bis 900 mg. Für orale Applikationen können die Teildosen beispielsweise etwa 150 bis 300 mg des neuen Antibiotikum-Derivates Dihydro-cyclosporin D neben festen und flüssigen Trägersubstanzen enthalten.
Als Heilmittel kann das neue Antibiotikum-Derivat Dihy dro-cyclosporin D allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht wer den.
In dem nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutert, ihren Umfang aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel
400 mg Palladium-Kohle (10% Palladium) werden in
15 ml Äthanol während 20 Minuten vorhydriert.Zu dieser Sus pension des Palladiumkatalysators wird die Lösung von 3,66 g
Cyclosporin D in 30 ml Äthanol zugegeben und darauf bei 24 und einem Druck von 736 mm Quecksilbersäule bis zur been deten Wasserstoffaufnahme hydriert. Anschliessend filtriert man vom Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum bei 20 bis 40" zur Trockne ein. Dabei fällt das dünnschicht chromatographisch einheitliche Dihydro-cyclosporin D als farbloses amorphes Pulver an, das im Hochvakuum während 4 Stunden bei 70" getrocknet wird.
Das als Ausgangsmaterial verwendete Cyclosporin D wird wie folgt hergestellt:
500 1 einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 5 g
Caseinpepton, 5 g MgSO4 - 7H2O, 2 g KH2P04, 3 g NaN03,
0,5 g KCI, 0,01 g FeSO4 und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 501 einer Vorkultur des Stammes NRRL
8044 angeimpft und in einem Stahifermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) 13 Tage bei 27 inkubiert (siehe DOS 2 455 859).
Die Kulturbrühe wird mit der gleichen Menge n-Butyl-acetat ausgerührt, nach Abtrennung der organischen Phase wird diese im Vakuum konzentriert und der Rohextrakt durch 3stufige Verteilung zwischen Methanol-Wasser (9: 1) und Petroläther entfettet. Die methanolische Phase wird abgetrennt, im Vakuum konzentriert und das Rohprodukt durch Zugabe von Wasser ausgefällt. Das nach der Filtration gewonnene Material wird an der 5- bis 7fachen Menge Sephadex LH-20 mit Methanol als Elutionsmittel chromatographiert. Die Spitzenfraktionen werden anschliessend an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,20 mm (Merck) mit Hexan-Aceton (2: 1) chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen vorwiegend Cyclosporin A und Cyclosporin D enthalten, die später eluierten Anteile vorwiegend Cyclosporin C.
Zur weiteren Reinigung werden die Cyclosporin A- und D-haltigen Fraktionen aus der 2- bis 2,5fachen Menge Aceton bei -15" kristallisiert und anschliessend durch zweimalige Chromatographie an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,20 mm (Merck) weiter aufgetrennt, wobei die mit Hexan-Aceton (2: 1) zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D in stark angereicherter Form enthalten. Diese werden in der doppelten Menge Aceton gelöst und bei 150 kristallisieren lassen. Das dabei erhaltene Rohkristallisat von Cyclosporin D wird zur weiteren Reinigung in der 10fachen Menge Aceton gelöst, mit 2 Gewichtsprozent Aktivkohle versetzt und während 5 Minuten auf 60 erwärmt.
Das nach Filtration über Talk erhaltene klare und beinahe farblose Filtrat wird auf ein Drittel des Volumens eingeengt und auf Raumtemperatur erkalten lassen, wobei Cyclosporin D spontan auskristallisiert. Durch Stehenlassen bei 170 wird die Kristallisation vervollständigt. Die durch Abfiltrieren gewonnenen Kristalle werden mit wenig eiskaltem Aceton gewaschen und anschliessend im Hochvakuum bei 80" während 2 Stunden getrocknet.
Smp. 148-151 [a]D20 = -245 D (c = 0,52 in CHCl3) [a]D20 = -2110 (c = 0,51 in CH30H).
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PATENT CLAIM Process for the production of the new antibiotic derivative dihydro-cyclosporin D (Formula I),
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characterized in that the antibiotic cyclosporin D (formula II)
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catalytically hydrogenated.
The present invention relates to a process for the preparation of the new antibiotic derivative dihydro-cyclosporin D (formula 1).
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According to the invention, dihydrocyclosporin D is obtained by catalytic hydrogenation of the antibiotic cyclosporin D.
(Formula II).
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The hydrogenation of the antibiotic cyclosporin D is advantageously carried out by hydrogenating the antibiotic cyclosporin D in a suitable solvent in the presence of catalytically activated hydrogen. Lower aliphatic alcohols, such as. B. methanol, ethanol, isopropanol, or ethyl acetate in question. The hydrogenation is expediently carried out in the neutral range at temperatures between 20 and 30 ° C. and at atmospheric pressure or slightly elevated pressure. Palladium, for example palladium on carbon, is preferably used as the catalyst. The hydrogenation product of the antibiotic cyclosporin D thus obtained can then be used can be purified in a manner known per se, for example by chromatography on silica gel.
The antibiotic cyclosporin D used as the starting material can be prepared as described in the example below.
Properties of Dihydro-cyclosporin D
Colorless, amorphous powder
Mp 153-156 [alD20 = -237 "(c = 0.56 in CHCla) = -196 (c = 0.58 in CH3OH)
Elemental analysis C63H115N11012
Calc .: C 62.1 H 9.5 N 12.6 0 15.8%
Found: C 61.8 H 9.5 N 12.9 0 16.0%
Dihydro-cyclosporin D is readily soluble in methanol, ethanol, ether, acetone and chlorinated hydrocarbons at room temperature; practically insoluble in water and in saturated hydrocarbons.
UV spectrum in CH3OH: final absorption
IR spectrum in CH2CI2: see FIG. 1 1 H-NMR spectrum in CDCI3, 90 MHz, with tetramethylsilane as internal standard: see FIG. 2
The Rr values of dihydro-cyclosporin D in the thin-layer chromatogram are shown in the following table: eluent Rr values chloroform-methanol (96: 4) 0.42 chloroform-methanol-glacial acetic acid (90: 6: 4) 0.57 chloroform-acetone (1: 1 ) 0.57 acetone-hexane (1: 1) 0.43
Polygram SIL G foils, running distance 10 cm.
Amount of substance applied: 40 y
Visualization: yellow-brown spots with iodine vapor.
The new antibiotic derivative dihydro-cyclosporin D is characterized by interesting pharmacological properties and can therefore be used as a remedy. It inhibits the growth of Aspergillus niger and Curvularia lunata.
In particular, the substance is characterized by an immunosuppressive effect.
The immunosuppressive effect can be shown as follows: a) In the lymphocyte stimulation test according to Janosy, in vitro concentrations of 0.01 to 10.0 g / ml show a strong inhibition of H3-thymidine incorporation, the proliferation rate and the blataogenesis of those stimulated with concanavalin A. Lymphocytes from mouse spleen were found.
b) Oxazolone test on the mouse: The decrease in ear swelling is expressed as a suppressive index (SI); SI 0.62 after 5 x 70 mg / kg p.o.
Due to its immunosuppressive effect, the substance can be used for the prophylaxis and treatment of diseases that are related to influencing the immune response in a negative sense.
The new antibiotic derivative dihydro-cyclosporin D is also indicated as an antiarthriticum. It does so in Freund's adjuvant arthritis latency experiment on the rat in doses of approx. 30 mg / kg p. o, body weight / day a strong inhibition of primary and secondary inflammation.
The doses to be used naturally vary depending on the type of administration and the condition to be treated.
In general, however, satisfactory results are obtained with test animals with a dose of 60 to 300 mg / kg body weight. If necessary, this dose can be administered in 2 to 3 portions or as a slow-release form. For larger mammals, the daily dose is around 300 to 900 mg. For oral applications, the partial doses can contain, for example, about 150 to 300 mg of the new antibiotic derivative dihydro-cyclosporin D in addition to solid and liquid carrier substances.
As a remedy, the new antibiotic derivative Dihy dro-cyclosporin D can be administered alone or in a suitable pharmaceutical form with pharmacologically indifferent auxiliaries.
In the following example, which explains the invention in more detail but is not intended to restrict its scope in any way, all the temperatures are given in degrees Celsius.
example
400 mg palladium-carbon (10% palladium) are in
15 ml of ethanol pre-hydrogenated for 20 minutes. To this Sus pension of the palladium catalyst, the solution of 3.66 g
Cyclosporin D in 30 ml of ethanol was added and then hydrogenated at 24 and a pressure of 736 mm of mercury until the hydrogen uptake ceased. The catalyst is then filtered off and the filtrate is evaporated to dryness in vacuo at 20 to 40 ". The thin-layer chromatographically uniform dihydrocyclosporin D is obtained as a colorless amorphous powder which is dried in a high vacuum at 70" for 4 hours.
The cyclosporin D used as the starting material is produced as follows:
500 1 of a nutrient solution containing 40 g glucose, 5 g per liter
Casein peptone, 5 g MgSO4 - 7H2O, 2 g KH2P04, 3 g NaN03,
Containing 0.5 g KCI, 0.01 g FeSO4 and demineralized water, with 501 a preculture of the strain NRRL
8044 inoculated and incubated in a steel fermenter with stirring (170 rpm) and aeration (1 liter air / min. / Liter nutrient solution) at 27 for 13 days (see DOS 2 455 859).
The culture broth is stirred with the same amount of n-butyl acetate, after the organic phase has been separated off, it is concentrated in vacuo and the crude extract is degreased by 3-stage distribution between methanol-water (9: 1) and petroleum ether. The methanolic phase is separated off, concentrated in vacuo and the crude product is precipitated by adding water. The material obtained after filtration is chromatographed on 5 to 7 times the amount of Sephadex LH-20 with methanol as the eluent. The peak fractions are then chromatographed on silica gel 60, particle size 0.063-0.20 mm (Merck) with hexane-acetone (2: 1), the fractions eluted first predominantly containing cyclosporin A and cyclosporin D, the later eluted portions predominantly cyclosporin C.
For further purification, the cyclosporin A and D-containing fractions are crystallized from the 2 to 2.5 times the amount of acetone at -15 "and then further separated by double chromatography on silica gel 60, particle size 0.063-0.20 mm (Merck), the fractions first eluted with hexane-acetone (2: 1) contain cyclosporin D in a highly enriched form, which is dissolved in twice the amount of acetone and allowed to crystallize at 150. The crude crystallizate of cyclosporin D obtained in this way is 10-fold for further purification The amount of acetone dissolved, mixed with 2 percent by weight activated carbon and heated to 60 for 5 minutes.
The clear and almost colorless filtrate obtained after filtration over talc is concentrated to a third of the volume and allowed to cool to room temperature, cyclosporin D spontaneously crystallizing out. By standing at 170, the crystallization is completed. The crystals obtained by filtering are washed with a little ice-cold acetone and then dried in a high vacuum at 80 "for 2 hours.
Mp 148-151 [a] D20 = -245 D (c = 0.52 in CHCl3) [a] D20 = -2110 (c = 0.51 in CH30H).