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PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikum-Derivates Iso-cyclosporin D (Formel I),
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dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum Cyclosporin D (Formel II)
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einer Säurebehandlung unterwirft.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikum-Derivates Iso-cyclosporin D (Formel I).
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Erfindungsgemäss gelangt man zu Iso-cyclosporin D, indem man das Antibiotikum Cyclosporin D (Formel II)
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unter geeigneten Bedingungen einer Säurebehandlung unterwirft. Bei der Behandlung des Antibiotikums Cyclosporin D mit Säuren unter geeigneten Bedingungen entsteht nun als Resultat einer intramolekularen Wanderung der Carbonylgruppe des N-Methyl-L-valylrestes zur sekundären Hydroxylgruppe der N-Methyl-Cg-aminosäure das Umlagerungsprodukt Iso-cyclosporin D.
Zur Isomerisierung werden starke organische Säuren, wie z. B. Sulfonsäuren, eingesetzt. Als vorzugsweise geeignet haben sich Methansulfonsäure oder p-Toluolsulfonsäure erwiesen. Es können aber auch andere starke organische Säuren verwendet werden (z.B. Trifluoressigsäure).
Die Menge der starken Säure, die zur Isomerisierung angewendet wird, liegt zwischen 1 und 4 Mol pro Mol des Antibiotikums Cyclosporin D. Bei der Ausführung der Reaktion in Dioxan sind 2 bis 3 Mol Säure pro Mol des Antibiotikums Cyclosporin D günstig.
Als Lösungsmittel kommen niedrige Alkohole, z.B. Methanol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, z. B. Chloroform oder Äther, z.B. Dioxan, in Frage.
Die Reaktionstemperatur variiert zwischen 20 und 65 C; die optimalen Bedingungen sind stark vom Lösungsmittel und der Reaktionszeit abhängig. Bei der Durchführung der Reak tion in Dioxan erweist sich die Temperatur von 45-55 C als sehr günstig.
Die Reaktionszeit hängt stark von den oben angegebenen Bedingungen, d.h. Säuremenge, Lösungsmittel und Temperatur ab. Sie kann von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen variieren. Zur Ermittlung der jeweils besten Reaktionsbedingungen kann der zeitliche Verlauf der Umlagerung z. B. dünn schichtchromatograpliisch verfolgt werden.
Zur Isolierung von Iso-cyclosporin D aus dem Reaktionsgemisch wird zweckmässigerweise die starke Säure zuerst abgepuffert, z. B. mit Natriumacetat, und das Salz der starken Säure entfernt. Dies kann durch Abfiltrieren oder im Falle eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels durch Auswaschen mit Wasser erfolgen. Wurde zur Reaktion ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel verwendet, so kann man im Vakuum bei 20 bis 50 "C schonend eindampfen, in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, z.B. Chloroform, lösen und dann auswaschen. Aus dem nach Eindampfen der organischen Phase im Vakuum bei 20 bis 50 "C anfallenden rohen Reaktionsgemisch wird anschliessend durch Chromatographie das Isocyclosporin D isoliert. Dazu wird die 50- bis 150fache Menge Kieselgel verwendet.
Zur Elution eignet sich Chloroform oder Methylenchlorid unter Zusatz kleiner Mengen Methanol oder Äthanol. Die Chromatographiefraktionen werden dünnschichtchromatographisch auf Reinheit geprüft, wobei Polygram SIL G-Folien und das Fliessmittel Chloroform-Methanol-Eisessig (90:6:4) verwendet werden.
Die anfallenden reinen Fraktionen werden zum Schluss mehrmals aus Äther kristallisiert, wobei Iso-cyclosporin D in Form farbloser Kristalle anfällt.
Eigenschaften von Iso-cyclosporin D
Farblose Prismen Smp. 1421440 [(Lin20 = -205,5 0 (c = 0,51 in CHCl3) = -144,4 (c = 0,64 in CH3OH)
Elementaranalyse C63H113N11012
Ber.: C 62,2 H 9,4 N 12,7 0 15,8%
Gef.: C 62,0 H 9,4 N 12,7 0 16,3%
Iso-cyclosporin D ist gut löslich in Methanol, Aceton, Essigester, Chloroform; mässig löslich in Äther; fast unlöslich in Wasser und gesättigten Kohlenwasserstoffen,
Im Dünnschichtchromatogramm auf Polygram SIL G-Folien mit Chloroform-Methanol-Eisessig (90:6:4), Laufstrecke
10 cm, werden folgende RrWerte beobachtet:
Iso-cyclosporin D 0,31
Antibiotikum Cyclosporin D 0,57
Die Detektion erfolgt mit Joddampf.
Iso-cyclosporin D ist eine Base. Bei der Titration mit l/lo N HCl in Methylcellosolve-Wasser (80: 20-Gew.- %) wird ein pKE,Cs = 5,10 festgestellt.
UV-Spektrum in CH3OH: Endabsorption IR-Spektrum in CH2CI2: siehe Fig. 1 lH-NMR-Spektrum in CDCI3, 90 MHz, mit Tetramethylsilan als internem Standard: siehe Fig. 2.
Iso-cyclosporin D zeichnet sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden. So hemmt es das Wachstum von Aspergillus niger und Curvularia lunata. Insbesondere zeichnet sich die Substanz durch eine immunosuppressive und enzündungshemmende Wirkung aus.
Die immunosuppressive Wirkung von Iso-cyclosporin D kann wie folgt gezeigt werden: a) Im Lymphozytenstimulationstest nach Jänossy wird in vitro in Konzentrationen von 0,01 bis l0,0,ug/ml eine starke
Hemmung des H3-Thymidin-Einbaus, der Proliferations rate und der Blastogenese von-mit Concanavalin A stimu lierten Lymphozyten aus Mäusemilz festgestellt.
b) Oxazolon-Test an der Maus:
Die Abnahme der Ohrschwellung wird als suppressiver In dex (ski) ausgedrückt: SI = 0,55 nach 5 x 70 mg/kg p.o.
Aufgrund seiner immunosuppressiven Wirkung kann Isocyclosporin D zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten, die mit der Beeinflussung der Abwehrreaktion im negativen Sinn zusammenhängen, angewandt werden.
Iso-cyclosporin D besitzt ebenfalls eine arthritishemmende Wirkung. So wirkt es z. B. im Freund-Adjuvans-Arthritis-Latenzzeitversuch an der Ratte in Dosen von 30 mg/kg Körpergewicht/Tag stark schwellungshemmend.
Aufgrund seiner arthritishemmenden Wirkung kann Isocyclosporin D zur Prophylaxe und Behandlung von Arthritis und rheumatischen Krankheiten angewandt werden.
Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach Art der Administration und des zu behandelnden Zustandes.
Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 10 bis 200 mg/kg Körpergewicht erzielt. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden. Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 50 bis 900 mg. Für orale Applikationen können die Teildosen beispielsweise etwa 25 bis 300 mg Iso-cyclosporin D neben festen und flüssigen Trägersubstanzen enthalten.
Als Heilmittel kann Iso-cyclosporin D allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden.
In dem nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutert, ihren Umfang aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel
Zur Lösung von 18,25 g Antibiotikum Cyclosporin D in 120 ml absolutem Dioxan gibt man die Lösung von 3,60 g Methansulfonsäure in 60 ml Dioxan und hält das Gemisch bei 50 unter Feuchtigkeitsausschluss. Der Fortgang der Reaktion wird im Dünnschichtchromatogramm verfolgt (Polygram SIL G-Fo lien, Chloroform-Methanol-Eisessig (90:6:4), Joddampf zur Sichtbarmachung). Nach 17 Stunden wird auf Raumtemperatur gekühlt. Durch Zufügen von 3,38 g wasserfreiem Natriumacetat wird die Säure abgestumpft, nach Rühren während 15 Minuten das ausgeschiedene Salz abgenutscht und das Filtrat im Vakuum bei 45" eingedampft. Die 21 g Rückstand werden an 1,5 kg Kieselgel, Merck, Korngrösse 0,063-0,2 mm, chromatographiert, wobei zur Elution Chloroform-Methanol (98:2) dient.
Die praktisch aus reinem Iso-cyclosporin D bestehenden Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum bei 50 eingedampft und der Rückstand zwei- bis dreimal aus Äther kristallisiert, wobei Iso-cyclosporin D vom Smp. 142-144 anfällt.
Das als Ausgangsmaterial verwendete Cyclosporin D wird wie folgt hergestellt:
500 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 5 g Caseinpepton, 5 g MgSO4 7H2O, 2 g KH2PO4, 3 g NaNO3, 0,5 g KCI, 0,01 g FeSO4 und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 50 Liter einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) 13 Tage bei 27 inkubiert (siehe DOS 2 455 859).
Die Kulturbrühe wird mit der gleichen Menge n-Butylacetat ausgerührt, nach Abtrennung der organischen Phase wird diese im Vakuum konzentriert und der Rohextrakt durch 3stufige Verteilung zwischen Methanol-Wasser (9: 1) und Petrol äther entfettet. Die methanolische Phase wird abgetrennt, im Vakuum konzentriert und das Rohprodukt durch Zugabe von Wasser ausgefällt. Das nach der Filtration gewonnene Material wird an der 5- bis 7fachen Menge Sephadex LH-20 mit Methanol als Elutionsmittel chromatographiert. Die Spitzenfraktionen werden anschliessend an Kieselgel 60, Korngrösse (),()63-0,20 mm (Merck) mit Hexan-Aceton (2:1) chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen vorwiegend Cyclosporin A und Cyclosporin D enthalten, die später eluierten Anteile vorwiegend Cyclosporin C.
Zur weiteren Reinigung werden die Cyclosporin A- und D-haltigen Fraktionen aus der 2- bis 2,5 fachen Menge Aceton bei -15" kristallisiert und anschliessend durch zweimalige Chromatographie an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,20 mm (Merck) weiter aufgetrennt, wobei die mit Hexan-Aceton (2: 1) zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D in stark angereicherter Form enthalten. Diese werden in der doppelten Menge Aceton gelöst und bei -15" kristallisieren lassen. Das dabei erhaltene Rohkristallisat von Cyclosporin D wird zur weiteren Reinigung in der lûfachen Menge Aceton gelöst, mit 2 Gewichtsprozent Aktivkohle versetzt und während 5 Minuten auf 60 erwärmt.
Das nach Filtration über Talk erhaltene klare und beinahe farblose Filtrat wird auf ein Drittel des Volumens eingeengt und auf Raumtemperatur erkalten lassen, wobei Cyclosporin D spontan auskristallisiert. Durch Stehenlassen bei -17" wird die Kristallisation vervollständigt. Die durch Abfiltrieren gewonnenen Kristalle werden mit wenig eiskaltem Aceton gewaschen und anschliessend im Hochvakuum bei 80 "C während 2 Stunden getrocknet.
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PATENT CLAIM Process for the production of the new antibiotic derivative isocyclosporin D (Formula I),
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characterized in that the antibiotic cyclosporin D (formula II)
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subjected to an acid treatment.
The present invention relates to a process for the preparation of the new antibiotic derivative isocyclosporin D (formula I).
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According to the invention, isocyclosporin D is obtained by using the antibiotic cyclosporin D (formula II)
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subject to acid treatment under suitable conditions. In the treatment of the antibiotic cyclosporin D with acids under suitable conditions, the rearrangement product isocyclosporin D arises as a result of an intramolecular migration of the carbonyl group of the N-methyl-L-valyl radical to the secondary hydroxyl group of N-methyl-Cg-amino acid.
For the isomerization strong organic acids, such as. B. sulfonic acids used. Methanesulfonic acid or p-toluenesulfonic acid have proven to be particularly suitable. However, other strong organic acids can also be used (e.g. trifluoroacetic acid).
The amount of strong acid used for the isomerization is between 1 and 4 moles per mole of the antibiotic cyclosporin D. When carrying out the reaction in dioxane, 2 to 3 moles of acid per mole of the antibiotic cyclosporin D are favorable.
Low alcohols, e.g. Methanol, halogenated hydrocarbons, e.g. Chloroform or ether, e.g. Dioxane, in question.
The reaction temperature varies between 20 and 65 C; the optimal conditions strongly depend on the solvent and the reaction time. When carrying out the reaction in dioxane, the temperature of 45-55 C proves to be very favorable.
The response time strongly depends on the conditions given above, i.e. Amount of acid, solvent and temperature. It can vary from a few hours to several days. To determine the best reaction conditions in each case, the time course of the rearrangement z. B. thin layer chromatographically.
To isolate isocyclosporin D from the reaction mixture, the strong acid is expediently buffered first, for. B. with sodium acetate, and the salt of the strong acid is removed. This can be done by filtration or, in the case of a water-immiscible solvent, by washing with water. If a water-miscible solvent was used for the reaction, it can be gently evaporated in vacuo at 20 to 50 ° C., dissolved in a water-immiscible solvent, for example chloroform, and then washed out. From which after the organic phase has been evaporated in vacuo 20 to 50 "C resulting crude reaction mixture is then isolated by chromatography, the isocyclosporin D. For this, 50 to 150 times the amount of silica gel is used.
Chloroform or methylene chloride with the addition of small amounts of methanol or ethanol is suitable for elution. The chromatographic fractions are checked for purity by thin layer chromatography, using Polygram SIL G foils and the eluent chloroform-methanol-glacial acetic acid (90: 6: 4).
The resulting pure fractions are finally crystallized several times from ether, with isocyclosporin D being obtained in the form of colorless crystals.
Properties of Isocyclosporin D
Colorless prisms mp 1421440 [(Lin20 = -205.5 0 (c = 0.51 in CHCl3) = -144.4 (c = 0.64 in CH3OH)
Elemental analysis C63H113N11012
Calc .: C 62.2 H 9.4 N 12.7 0 15.8%
Found: C 62.0 H 9.4 N 12.7 0 16.3%
Isocyclosporin D is readily soluble in methanol, acetone, ethyl acetate, chloroform; moderately soluble in ether; almost insoluble in water and saturated hydrocarbons,
In a thin layer chromatogram on polygram SIL G foils with chloroform-methanol-glacial acetic acid (90: 6: 4), running distance
10 cm, the following Rr values are observed:
Isocyclosporin D 0.31
Antibiotic cyclosporin D 0.57
The detection is done with iodine vapor.
Isocyclosporin D is a base. When titrated with 1 / 10N HCl in methyl cellosolve water (80:20% by weight), a pKE, Cs = 5.10 was found.
UV spectrum in CH3OH: final absorption IR spectrum in CH2CI2: see FIG. 1 1 H-NMR spectrum in CDCI3, 90 MHz, with tetramethylsilane as internal standard: see FIG. 2.
Iso-cyclosporin D is characterized by interesting chemotherapeutic and pharmacological properties and can therefore be used as a remedy. It inhibits the growth of Aspergillus niger and Curvularia lunata. In particular, the substance is characterized by an immunosuppressive and anti-inflammatory effect.
The immunosuppressive effect of isocyclosporin D can be shown as follows: a) In the lymphocyte stimulation test according to Janossy, a strong in vitro concentration of 0.01 to 10.0 µg / ml is shown
Inhibition of H3-thymidine incorporation, the proliferation rate and the blastogenesis of lymphocytes stimulated with concanavalin A from mouse spleen were found.
b) Oxazolone test on the mouse:
The decrease in ear swelling is expressed as a suppressive index (ski): SI = 0.55 after 5 x 70 mg / kg p.o.
Due to its immunosuppressive effect, isocyclosporin D can be used for the prophylaxis and treatment of diseases that are related to the negative effects of the defense reaction.
Isocyclosporin D also has an anti-arthritic effect. So it works z. B. in Freund's adjuvant arthritis latency test on the rat in doses of 30 mg / kg body weight / day strongly anti-swelling.
Due to its anti-arthritic effect, isocyclosporin D can be used for the prophylaxis and treatment of arthritis and rheumatic diseases.
The doses to be used naturally vary depending on the type of administration and the condition to be treated.
In general, however, satisfactory results are obtained with test animals with a dose of 10 to 200 mg / kg body weight. If necessary, this dose can be administered in 2 to 3 portions or as a slow-release form. For larger mammals, the daily dose is around 50 to 900 mg. For oral applications, the partial doses can contain, for example, about 25 to 300 mg of isocyclosporin D in addition to solid and liquid carriers.
As a remedy, isocyclosporin D can be administered alone or in a suitable pharmaceutical form with pharmacologically indifferent auxiliaries.
In the following example, which explains the invention in more detail but is not intended to restrict its scope in any way, all the temperatures are given in degrees Celsius.
example
To the solution of 18.25 g of antibiotic cyclosporin D in 120 ml of absolute dioxane, the solution of 3.60 g of methanesulfonic acid in 60 ml of dioxane is added and the mixture is kept at 50 with the exclusion of moisture. The progress of the reaction is monitored in a thin layer chromatogram (Polygram SIL G foils, chloroform-methanol-glacial acetic acid (90: 6: 4), iodine vapor for visualization). After 17 hours, the mixture is cooled to room temperature. By adding 3.38 g of anhydrous sodium acetate, the acid is blunted, after stirring the precipitated salt is filtered off with suction for 15 minutes and the filtrate is evaporated in vacuo at 45 ". The 21 g residue is dissolved in 1.5 kg of silica gel, Merck, particle size 0.063- 0.2 mm, chromatographed using chloroform-methanol (98: 2) for elution.
The fractions consisting practically of pure isocyclosporin D are combined, evaporated in vacuo at 50 and the residue is crystallized two to three times from ether, with isocyclosporin D of mp 142-144 being obtained.
The cyclosporin D used as the starting material is produced as follows:
500 liters of a nutrient solution containing 40 g of glucose, 5 g of casein peptone, 5 g of MgSO4 7H2O, 2 g of KH2PO4, 3 g of NaNO3, 0.5 g of KCI, 0.01 g of FeSO4 and demineralized water are mixed with 50 liters of one Pre-culture of strain NRRL 8044 inoculated and incubated in a steel fermenter with stirring (170 rpm) and aeration (1 liter air / min. / Liter nutrient solution) at 27 for 13 days (see DOS 2 455 859).
The culture broth is stirred with the same amount of n-butyl acetate, after the organic phase has been separated off, it is concentrated in vacuo and the crude extract is degreased by 3-stage distribution between methanol-water (9: 1) and petroleum ether. The methanolic phase is separated off, concentrated in vacuo and the crude product is precipitated by adding water. The material obtained after the filtration is chromatographed on the 5- to 7-fold amount of Sephadex LH-20 with methanol as the eluent. The peak fractions are then chromatographed on silica gel 60, particle size (), () 63-0.20 mm (Merck) with hexane-acetone (2: 1), the fractions which eluted first contain mainly cyclosporin A and cyclosporin D, which later eluted Mostly cyclosporin C.
For further purification, the cyclosporin A and D-containing fractions are crystallized from the 2 to 2.5 times the amount of acetone at -15 "and then further separated by double chromatography on silica gel 60, particle size 0.063-0.20 mm (Merck) , the fractions first eluted with hexane-acetone (2: 1) containing cyclosporin D in a highly enriched form. These are dissolved in twice the amount of acetone and allowed to crystallize at -15 ". The crude crystallizate of cyclosporin D obtained in this way is dissolved in a 10-fold amount of acetone for further purification, 2% by weight of activated carbon is added and the mixture is heated to 60 for 5 minutes.
The clear and almost colorless filtrate obtained after filtration over talc is concentrated to a third of the volume and allowed to cool to room temperature, cyclosporin D spontaneously crystallizing out. Allowing to stand at -17 "completes the crystallization. The crystals obtained by filtering are washed with a little ice-cold acetone and then dried in a high vacuum at 80" C for 2 hours.