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PATENTANSPRUCH
Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Cyclosporin D (Formel 1),
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dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams auf oder in einem Nährmedium züchtet und hierauf das neue Antibiotikum Cyclosporin D aus dem Nährmedium isoliert und reinigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Cyclosporin D (Formel I).
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Erfindungsgemäss gelangt man zum neuen Antibiotikum
Cyclosporin D, indem man einen Stamm der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams auf oder in einem Nährmedium züch- tet, das neue Antibiotikum aus der Fermentationsbrühe auf an sich bekannte Weise durch extraktive und/oder adsorptive Arbeitsmethoden isoliert und hierauf chromatographisch oder mittels Gegenstromverteilung reinigt.
Ein Stamm der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams wurde in der DOS 2455859 beschrieben. Er wurde aus einer in Norwegen gesammelten Erdprobe isoliert und eine Kultur davon beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, llI., USA am 12August1974 unter der Nummer NRRL 8044 deponiert.
Das neue Antibiotikum Cyclosporin D kann man beispielsweise in der Weise herstellen, dass ein flüssiges Medium mit einer Konidien- und Mycelsuspension des Stammes NRRL 8044 beimpft und die Kultur 11 bis 18 Tage, vorzugsweise 13 Tage, bei 25 bis 30 , vorzugsweise bei 27 , und bei einem pH-Wert von 4,3 bis 6,2, vorzugsweise 5,6, in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Lufti MinSLiter Nährlösung) inkubiert wird.
Sobald eine maximale Menge an Antibiotikum produziert ist, wird dieses aus der Kulturbrühe durch extraktive undloder adsorptive Methoden auf an sich bekannte Weise gewonnen.
Charakterisierung von Cyclosporin D: Farblose, prismatische Kristalle; Smp. 148-151 "C = = - 2450 (C = 0,52 in Chloroform) [a = - 2110 (c = 0,51 in Methanol) Löslichkeit:
Cyclosporin D ist leicht löslich in Alkoholen, Äther, Aceton und chlorierten Kohlenwasserstoffen; praktisch unlöslich in Wasser und gesättigten Kohlenwasserstoffen.
Das neue Antibiotikum Cyclosporin D zeichnet sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden. So hemmt es das Wachstum von Aspergillus niger und Curvularia lunata. Insbesondere zeichnet sich die Substanz Cyclosporin D durch eine immunosuppressive und entzündungshemmende Wirkung aus.
Die immunosuppressive Wirkung von Cyclosporin D kann wie folgt gezeigt werden: a) Im Lymphozytenstimulationstest nach Jänossy wird in vitro in Konzentrationen von 0,01 bis 10,0 ugiml eine starke Hemmung des H3-Thymidin-Einbaus, der Proliferationsrate und der Blastogenese von mit Concanavalin A stimulierten Lymphozyten aus Mäusemilz festgestellt.
b)Hämagglutinationstest an der Maus: Erfasst werden die gegen Schaferythrozyten gebildeten Antikörper. Die Hemmung wird im suppressiven Index (ski) ausgedrückt, wobei die unbehandelte Kontrolle mit 1,00 angegeben wird; Sl = 0,53 nach p. o.5x250 mg/kg.
Aufgrund ihrer immunosuppressiven Wirkung kann Cyclosporin D zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten, die mit der Beeinflussung der Abwehrreaktion im negativen Sinn zusammenhängen, angewandt werden.
Das neue Antibiotikum besitzt ebenfalls eine Arthritis-hemmende Wirkung. So wirkt es z. B. im Freund-Adjuvans-Arthritis-Latenzzeitversuch an der Ratte in Dosen von etwa 50 mg/kg KörpergewichtlTag stark schwellungshemmend.
Eine ähnliche Wirkung wird im Freund-Adjuvans-Arthritis Therapieversuch an der Ratte in Dosen von etwa 50 mg/kglTag beobachtet.
Aufgrund seiner Arthritis-hemmenden Wirkung kann das Antibiotikum zur Prophylaxe und Behandlung von Arthritis und rheumatischen Krankheiten angewandt werden.
Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach Art des Antibiotikums, der Administration und des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 10 bis 200 mglkg Körpergewicht erzielt. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden.
Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 50 bis 900 mg. Für orale Applikationen können die Teildosen beispielsweise etwa 25 bis 300 mg des neuen Antibiotikums neben festen und flüssigen Trägersubstanzen enthalten.
Als Heilmitel kann das neue Antibiotikum allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden.
In dem nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel:
500 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 5 g Caseinpepton. 5 g MgSO4- 7dz0, 2 g KH2PO4,3 g NaNO3,0,5 g KCI, 0,01 g FeSO4 und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 50 Liter einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter LuftlMinJLiter Nährlösung) 13 Tage bei 27 inkubiert (siehe DOS 2 455 859).
Die Kulturbrühe wird mit der gleichen Menge n-Butylacetat ausgerührt, nach Abtrennung der organischen Phase wird diese im Vakuum konzentriert und der Rohextrakt durch 3stufige Verteilung zwischen Methanolwasser (9:1) und Petroläther entfettet. Die methanolische Phase wird abgetrennt, im Vakuum konzentriert und das Rohprodukt durch Zugabe von Wasser ausgefällt. Das nach der Filtration gewonnene Material wird an der 5- bis 7fachen Menge Sephadex LH-20 mit Methanol als Elutionsmittel chromatographiert. Die Spitzenfraktionen werden anschliessend an Kieselgel 60, Korngrösse 0,0630,20 mm (Merck) mit Hexanaceton (2:1) chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen vorwiegend Cyclosporin A und Cyclosporin D enthalten, die später eluierten Anteile vorwiegend Cyclosporin C.
Zur weiteren Reinigung werden die Cyclosporin A- und D-haltigen Fraktionen aus der 2- bis 2,fachen Menge Aceton bei - 15 kristallisiert und anschliessend durch zweimalige Chromatographie an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,20 mm (Merck) weiter aufgetrennt, wobei die mit Hexanaceton (2:1) zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D in stark angereicherter Form enthalten. Diese werden in der doppelten Menge Aceton gelöst und bei - 15 kristallisieren lassen. Das dabei erhaltene Rohkristallisat von Cyclosporin D wird zur weiteren Reinigung in der 10fachen Menge Aceton gelöst, mit 2 Gewichtsprozent Aktivkohle versetzt und wäh- rend 5 Minuten auf 60 erwärmt.
Das nach Filtration über Talk erhaltene klare und beinahe farblose Filtrat wird auf ein Drittel des Volumens eingeengt und auf Raumtemperatur erkalten lassen, wobei Cyclosporin D spontan auskristallisiert. Durch Ste henlassen bei - 17 wird die Kristallisation vervollständigt. Die durch Abfiltrieren gewonnenen Kristalle werden mit wenig eiskaltem Aceton gewaschen und anschliessend im Hochvakuum bei 80" während 2 Stunden getrocknet.
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PATENT CLAIM
Process for the preparation of the new antibiotic cyclosporin D (Formula 1),
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characterized in that a strain of the fungus species Tolypocladium inflatum Gams is grown on or in a nutrient medium and then the new antibiotic cyclosporin D is isolated from the nutrient medium and purified.
The present invention relates to a process for the preparation of the new antibiotic cyclosporin D (formula I).
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According to the invention, the new antibiotic is obtained
Cyclosporin D, by cultivating a strain of the fungus species Tolypocladium inflatum Gams on or in a nutrient medium, isolating the new antibiotic from the fermentation broth in a manner known per se by extractive and / or adsorptive working methods and then purifying it chromatographically or by means of countercurrent distribution.
A strain of the fungus species Tolypocladium inflatum Gams has been described in DOS 2455859. It was isolated from a soil sample collected in Norway and a culture of it was deposited with the United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, llI., USA on August 12, 1974 under number NRRL 8044.
The new antibiotic cyclosporin D can be prepared, for example, by inoculating a liquid medium with a conidia and mycelium suspension of the strain NRRL 8044 and the culture for 11 to 18 days, preferably 13 days, at 25 to 30, preferably at 27, and at a pH of 4.3 to 6.2, preferably 5.6, in a steel fermenter with stirring (170 rpm) and aeration (1 liter of Lufti MinSLiter nutrient solution).
As soon as a maximum amount of antibiotic is produced, this is obtained from the culture broth by extractive and / or adsorptive methods in a manner known per se.
Characterization of Cyclosporin D: Colorless, prismatic crystals; 148-151 "C = = - 2450 (C = 0.52 in chloroform) [a = - 2110 (c = 0.51 in methanol) Solubility:
Cyclosporin D is easily soluble in alcohols, ether, acetone and chlorinated hydrocarbons; practically insoluble in water and saturated hydrocarbons.
The new antibiotic Cyclosporin D is characterized by interesting chemotherapeutic and pharmacological properties and can therefore be used as a remedy. It inhibits the growth of Aspergillus niger and Curvularia lunata. In particular, the substance cyclosporin D is characterized by an immunosuppressive and anti-inflammatory effect.
The immunosuppressive effect of cyclosporin D can be shown as follows: a) In the lymphocyte stimulation test according to Janosy, a strong inhibition of H3-thymidine incorporation, the proliferation rate and the blastogenesis of with concanavalin is shown in vitro in concentrations of 0.01 to 10.0 µg A stimulated lymphocyte from mouse spleen was found.
b) Hemagglutination test on the mouse: The antibodies formed against sheep erythrocytes are recorded. The inhibition is expressed in the suppressive index (ski), the untreated control being given as 1.00; Sl = 0.53 according to p. o.5x250 mg / kg.
Due to its immunosuppressive effect, cyclosporin D can be used for the prophylaxis and treatment of diseases which are related to the negative effects of the defense reaction.
The new antibiotic also has an arthritis-inhibiting effect. So it works z. B. in Freund's adjuvant arthritis latency experiment on the rat in doses of about 50 mg / kg body weight per day, strongly inhibiting swelling.
A similar effect is observed in Freund's adjuvant arthritis therapy experiment in rats at doses of approximately 50 mg / kg / day.
Due to its arthritis-inhibiting effect, the antibiotic can be used for the prophylaxis and treatment of arthritis and rheumatic diseases.
The doses to be used naturally vary depending on the type of antibiotic, the administration and the condition to be treated. In general, however, satisfactory results are obtained with test animals with a dose of 10 to 200 mglkg body weight. If necessary, this dose can be administered in 2 to 3 portions or as a slow-release form.
For larger mammals, the daily dose is around 50 to 900 mg. For oral applications, the partial doses can contain, for example, about 25 to 300 mg of the new antibiotic in addition to solid and liquid carriers.
As a healing agent, the new antibiotic can be administered alone or in a suitable pharmaceutical form with pharmacologically indifferent auxiliaries.
In the following example, which explains the invention in more detail but is not intended to restrict its scope in any way, all the temperatures are given in degrees Celsius.
Example:
500 liters of a nutrient solution containing 40 g glucose, 5 g casein peptone per liter. Containing 5 g MgSO4-7dz0, 2 g KH2PO4.3 g NaNO3.0.5 g KCI, 0.01 g FeSO4 and demineralized water are inoculated with 50 liters of a pre-culture of strain NRRL 8044 and in a steel fermenter with stirring (170 rpm ) and aeration (1 liter air / min / liter of nutrient solution) for 13 days at 27 (see DOS 2 455 859).
The culture broth is stirred with the same amount of n-butyl acetate, after the organic phase has been separated off, it is concentrated in vacuo and the crude extract is degreased by 3-stage distribution between methanol water (9: 1) and petroleum ether. The methanolic phase is separated off, concentrated in vacuo and the crude product is precipitated by adding water. The material obtained after the filtration is chromatographed on the 5- to 7-fold amount of Sephadex LH-20 with methanol as the eluent. The top fractions are then chromatographed on silica gel 60, particle size 0.0630.20 mm (Merck) with hexane acetone (2: 1), the fractions which eluted first contain mainly cyclosporin A and cyclosporin D, the later eluted parts predominantly cyclosporin C.
For further purification, the cyclosporin A- and D-containing fractions are crystallized from 2 to 2 times the amount of acetone at -15 and then further separated by two chromatography on silica gel 60, particle size 0.063-0.20 mm (Merck), whereby the fractions first eluted with hexane acetone (2: 1) contain cyclosporin D in a highly enriched form. These are dissolved in twice the amount of acetone and left to crystallize at - 15. The crude crystallizate of cyclosporin D obtained in the process is dissolved in 10 times the amount of acetone for further purification, 2% by weight of activated carbon is added and the mixture is heated to 60 for 5 minutes.
The clear and almost colorless filtrate obtained after filtration over talc is concentrated to a third of the volume and allowed to cool to room temperature, cyclosporin D spontaneously crystallizing out. The crystallization is completed by leaving at - 17. The crystals obtained by filtering are washed with a little ice-cold acetone and then dried in a high vacuum at 80 "for 2 hours.