KR20070100284A - 시클로스포린 유사체의 대사산물 - Google Patents

Abstract

시클로스포린 유사체 ISA247의 단리된 대사산물, 및 시험관내에서 이들의 제조방법이 기재되어 있다. 상기 대사산물은 히드록실화, N-탈메틸화, 디올 형성, 에폭사이드 형성, 내부분자 고리화, 인산화, 황산화, 글루쿠로니드 형성 및 글리코실화로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상의 반응인 ISA247의 화학적 변형을 포함한다. 이들의 제조방법은 동물의 간 세포의 마이크로솜 추출물로부터, 또는 미생물을 사용한 배양물로부터 ISA247의 대사산물을 제조하는 반합성법, 및 모 화합물 또는 단리된 대사산물을 유기 합성 방법을 이용하여 화학적으로 변형시키는 것과 같은 완전한 합성법을 포함한다.

시클로스포린, ISA247, 대사산물, 마이크로솜, 유사체

Description

시클로스포린 유사체의 대사산물{Metabolites of cyclosporin analogs}

본 발명은 시클로스포린 A의 유도체인 ISA247 또는 ISA_TX247의 단리된 대사산물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 ISA247의 단리된 대사산물의 제조방법 및 분석방법에도 관한 것이다.

참조문헌 :

미국특허 6,605,593호

미국특허 6,613,739호

미국특허출원 2003/0212249호

국제특허 공개 WO 99/18120호

국제특허 공개 WO 03/033527호

국제특허 공개 WO 2003/033526호

국제특허 공개 WO 2003/033527호

시클로스포린은 강력한 면역억제 활성을 갖는 시클릭 폴리펩티드류의 멤버이다. 시클로스포린 A와 같은 이들 화합물의 적어도 일부는 톨리포클라듐 인플라툼 감스(Tolypocladium inflatum Gams)종에 의해 2차 대사산물로서 생성된다. 면역억제제로서 시클로스포린은 동종이식 거부반응, 지연된 과민반응, 실험실 알레르기성 뇌척수염, 프로인트 조제 관절염 및 이식조직에 대한 숙주질환과 같은 액성 면역 및 세포매개 면역반응을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이것은 장기 이식에서 장기 거부의 예방을 위해; 류마티스성 관절염의 치료를 위해; 또 건선의 치료를 위해 사용된다.

시클로스포린 패밀리에는 다수의 화합물이 알려져 있지만, 시클로스포린 A는 가장 널리 의학적으로 사용되고 있다. 시클로스포린 A의 면역억제 효과는 T-세포 매개 활성화의 억제와 관련된다. 면역억제는 시클로필린이라 불리는 편재하는(ubiquitous) 세포내 단백질에 시클로스포린이 결합되는 것에 의해 달성된다. 이 복합체는 효소 칼시네우린(calcineurin)의 칼슘 및 칼모둘린-의존적 세린-트레오닌 포스파타아제 활성을 억제한다. 칼시네우린의 억제는 T-세포 활성화 동안 사이토카인 유전자(IL -2, IFN -γ, IL -4 및 GM - CSF)의 도입에 필요한 NFAT_{p /c} 및 NF-κB와 같은 전사인자의 활성화를 방해한다.

시클로스포린은 또한 시험관에서 T-헬퍼 세포에 의한 림포카인(lymphokine) 생산을 억제하고, 또 흉선에서 성숙 CD8 및 CD4 세포의 발달을 저지한다. 시클로스포린의 시험관 내의 다른 특성은 IL-2 생산성 T-림프구 및 세포독성 T-림프구의 억제, 활성화된 T-세포에 의해 방출된 IL-2의 억제, 동종항원 및 외인성 림포카인에 대응한 휴지기 T-림프구의 억제, IL-1 생산의 억제, 및 IL-2 생산성 T-림프구의 미토겐 활성화의 억제를 포함한다.

시클로스포린의 유리한 면역억제성, 항염증성 및 항건선 효과에도 불구하고, 시클로스포린 A 요법에는 수많은 나쁜 효과가 있다. 이들 효과는 몇 개 예를 들어 콩팥독성, 간독성, 파라세시스(parathesis), 및 잇몸증식증을 포함한다. 이들 중에 서 콩팥독성은 시클로스포린 투여에 기인한 아주 심각한 투여량 관련된 나쁜 효과 중의 하나이다. 즉각 방출성 시클로스포린 A 약물 제품(예컨대 Neoral^® 및 Sandimmune^®)은 이들의 혈류로의 신속한 방출 및 신속 방출의 결과로서 고농도에 기인한 콩팥독성 및 다른 독성 부작용을 초래할 수 있다. 시클로스포린이 신장 손상을 유발하는 정확한 메카니즘은 알려져 있지 않지만, 혈관수축성 물질의 양이 신장에서 증가하면 구심성의 사구체 세동맥의 혈관수축을 초래하는 것이 제안되어 있다. 이것은 신허혈, 사구체 여과속도의 감소 및 장시간이 지나면 세포사이질 섬유증을 초래한다.

따라서, 천연산출 화합물 시클로스포린 A에 필적하는 약리학적 효능을 갖지만 독성 부작용은 적은 면역억제제가 요청되고 있다.

시클로스포린이 처음 발견된 이후로, 다양한 종류의 천연 산출 시클로스포린이 단리되어 확인되었다. 부가적으로, 천연 산출이 아닌 다수의 시클로스포린이 부분적으로 합성 수단 또는 전체적인 합성 수단에 의해 제조되고 또 변형된 세포 배양 수법을 적용하여 제조되고 있다. 따라서, 시클로스포린을 포함하는 종류는 실체적이고 예컨대 천연 산출 시클로스포린 A 내지 Z; 다양한 비-천연 산출 시클로스포린 유도체; 디히드로- 및 이소-시클로스포린을 비롯한 인공 또는 합성 시클로스포린 ; 유도화된 시클로스포린 (예컨대 MeBmt 잔기의 3'-O-원자는 아실화되거나, 또는 추가의 치환기는 3-위치에서 사르코실 잔기에서 도입될 수 있다); MeBmt 잔기가 이성질체 형태로 존재하는 시클로스포린 (예컨대 MeBmt 잔기의 위치 6' 및 7'에 걸 친 구조가 트랜스라기 보다는 시스임); 및 변이 아미노산이 펩티드 서열 내의 특정 위치에 혼입되어 있는 시클로스포린을 포함한다.

1-위치에서 변형 아미노산을 함유하는 시클로스포린 유사체는 본원 발명의 양수인에게 양도된 WO 99/18120호 및 WO 03/033527호에 기재되어 있으며, 이들은 모두 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 이들 출원은 "ISA_TX247" 또는 "ISA247" 또는 "ISA"로 공지된 시클로스포린 유도체를 개시하고 있다. 이 유사체는 아미노산-1 잔기에서 변형을 제외하고는 시클로스포린 A와 구조적으로 동일하다. 출원인들은 주로 트랜스 ISA247로 구성된 혼합물을 비롯한 ISA247의 시스 및 트랜스 이성질체의 특정 혼합물이 천연산출의 현재 시클로스포린으로 공지된 것에 비하여 향상된 세기와 감소된 독성을 나타낸다는 것을 이미 발견한 바 있었다. ISA247의 특정 알킬화된, 아릴화된, 및 중수소화된 유도체도 또한 개시되었다.

시클로스포린 A의 대사산물은 연구되어 왔고, 또 일부 경우, 모(parent) 약물과 거의 동일한 효력을 갖는 것으로 밝혀져 있다. 또한, 대사산물들은 대사산물을 인식하는 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 환자의 혈액에서 약물의 양을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다(치료적 약물 모니터링 또는 TDM). 대사산물을 특이적으로 인식하는 항체는, 환자의 혈액에서 약물의 양을 잘못하면 높게 산출할 수도 있는 대사산물을 결합함으로써 이들 TDM 시험을 실시하는데 유용할 수 있다. 따라서, ISA247의 대사산물을 확인하고 단리함에 있어서 뿐만 아니라 이들 대사산물을 제조하는 방법 및 그의 용도에 대한 요청이 있었다.

발명의 요약

본 발명은 시클로스포린 유사체 ISA247의 확인 및 단리에 관한 것이다. 본 발명은 또한 시클로스포린 유사체 ISA247의 대사산물의 제조방법 및 용도도 제공한다. 이러한 대사산물은 유용한 면역억제 활성을 갖는 것으로 고려되고 있고, 또 모 화합물과 동일하거나 덜한 독성을 나타낼 수 있다. 이들은 치료적 약물 모니터링에 대한 분석방법 개발에 유용할 수 있다.

본 발명의 구체예로서, ISA247의 대사산물은 다음 화학식으로 표시되는 단리된 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 염 및 그의 용매화물을 포함한다:

상기 식에서,

각 R² 는 독립적으로 -H 또는 -CH₃ 이고;

각 R¹⁰ 은 독립적으로 -H, -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -CN, -NO₂, -OR^a, -C(O)R^a, -OC(O)R^a, -C(O)OR^a, -S(O)R^a, -SO₂R^a, -SO₃R^a, -OSO₂R^a, -OSO₃R^a, -PO₂R^aR^b, -OPO₂R^aR^b, -PO₃R^aR^b, -OPO₃R^aR^b, -N(R^aR^b), -C(O)N(R^aR^b), -C(O)NR^aNR^bSO₂R^c, -C(O)NR^aSO₂R^c, -C(O)NR^aCN, -SO₂N(R^aR^b), -SO₂N(R^aR^b), -NR^cC(O)R^a, -NR^cC(O)OR^a 또는 -NR^cC(O)N(R^aR^b) 이고;

R⁵, R⁶, R⁷, R⁸ 및 R⁹는 독립적으로 -H, -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -CN, -NO₂, -OR^a, -C(O)R^a, -OC(O)R^a, -C(O)OR^a, -S(O)R^a, -SO₂R^a, -SO₃R^a, -OSO₂R^a, -OSO₃R^a, -PO₂R^aR^b, -OPO₂R^aR^b, -PO₃R^aR^b, -OPO₃R^aR^b, -N(R^aR^b), -C(O)N(R^aR^b), -C(O)NR^aNR^bSO₂R^c, -C(O)NR^aSO₂R^c, -C(O)NR^aCN, -SO₂N(R^aR^b), -SO₂N(R^aR^b), -NR^cC(O)R^a, -NR^cC(O)OR^a 또는 -NR^cC(O)N(R^aR^b)이거나; 또는 R⁶ 및 R⁷는 합쳐져서 -O- 이거나; 또는 R⁵ 및 R⁶은 합쳐져서, 또는 R⁷ 및 R⁸은 합쳐져서 독립적으로 -O- 이고; 또는 R⁸ 및 R⁹는 합쳐져서 -O- 이거나; 또는 R⁵는 자신이 부착되어 있는 탄소원자와 합쳐져서 -C(=O)R^a, -CO₂R^a, -CH₂OR^a, -CH₂OC(O)R^a, -CH(OR^a)₂, -C(O)N(R^aR^b), -C(=NR^b)R^a, -C(=NOR^b)R^a, 또는 -C(=NNR^b)R^a 이며; 단 합쳐져서, 또는 R⁵ 및 R⁶, R⁶ 및 R⁷, 또는 R⁷ 및 R⁸ 중의 한 쌍은 탄소-탄소 결합이고 나머지는 모두 -H가 아니며; 또

R^a, R^b 및 R^c 는 각각 독립적으로 -H 또는 선택적으로 치환된 지방족, 시클로지방족, 벤질, 또는 아릴이거나, 또는 합쳐져서 -N(R^aR^b)는 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 기이거나, 또는 합쳐져서 -CH(OR^a)₂ 는 시클릭 아세탈 기임.

다양한 구체예로서, 상기 화합물은 하기 화학식으로 표시된다:

상기 식에서,

각 R² 는 독립적으로 -H 또는 -CH₃ 이고;

각 R¹⁰ 은 독립적으로 -H, -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -OR^a, -OC(O)R^a, -OSO₂R^a, -OSO₃R^a, -OPO₂R^aR^b 또는 -OPO₃R^aR^b 이며;

R⁵, R⁶, R⁷, R⁸ 및 R⁹는 독립적으로 -H, -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -OR^a, -OC(O)R^a, -OSO₂R^a, -OSO₃R^a, -OPO₂R^aR^b 및 -OPO₃R^aR^b 이거나; 또는 R⁶ 및 R⁷는 합쳐져서 -O- 이거나; 또는 R⁵ 및 R⁶은 합쳐져서, 또는 R⁷ 및 R⁸은 합쳐져서 독립적으로 -O- 이고; 또는 R⁸ 및 R⁹는 합쳐져서 -O- 이거나; 또는 R⁵는 자신이 부착되어 있는 탄소원자와 합쳐져서 -C(=O)R^a, -CO₂R^a, -CH₂OR^a, -CH₂OC(O)R^a, -CH(OR^a)₂, -C(O)N(R^aR^b), -C(=NR^b)R^a, -C(=NOR^b)R^a 또는 -C(=NNR^b)R^a 이며; 단 R⁵ 및 R⁶, R⁶ 및 R⁷, 또는 R⁷ 및 R⁸ 중의 한 쌍은 탄소-탄소 결합이고 나머지는 모두 -H가 아니며; 또

R^a, R^b 및 R^c 는 각각 독립적으로 -H 또는 선택적으로 치환된 지방족, 시클로지방족, 벤질, 또는 아릴이거나, 또는 합쳐져서 -N(R^aR^b)는 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 기이거나, 또는 합쳐져서 -CH(OR^a)₂ 는 시클릭 아세탈 기임.

특정 구체예로서, 상기 화합물은 하기 화학식으로 표시된다:

상기 식에서,

R¹ 은

로 구성된 군으로부터 선택되고;

각 R² 는 독립적으로 -CH₃ 및 -H로 구성된 군으로부터 선택되며;

각 R³은 독립적으로 -CH₂CH(CH₃)₂ 및 -CH₂C(CH₃)₂OH로 구성된 군으로부터 선택되고; 또

각 R⁴는 독립적으로 -CH(CH₃)₂ 및 -C(CH₃)₂OH로 구성된 군으로부터 선택됨.

본 발명의 다양한 구체예는 시클로{{(E)- 및 (Z)-(2S, 3R, 4R)-3-히드록시-4-메틸-2-(메틸아미노)-6,8-노나디에노일}-L-2-아미노부티릴-N-메틸-N-메틸-글리실-N-메틸-L-로이실-L-발릴-N-메틸-L-로이실-L-알라닐-D-알라닐-N-메틸-L-로이실-N-메틸-L-로이실-N-메틸-L-발릴}(ISA247)의 단리된 대사산물 및 약학적으로 허용되는 그의 염 및 그의 용매화물을 포함하며, ISA247과 비교하여, 상기 단리된 대사산물은 히드록실화, N-탈메틸화, 디올 형성, 에폭사이드 형성, 내부분자 고리화, 인산화, 황산화, 글루쿠로니드 형성 및 글리코실화로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상의 화학적 변형을 포함한다.

특정 구체예로서, 본 발명은 히드록실화, N-탈메틸화, 디올 형성, 에폭사이드 형성, 및 내부분자 고리화로 구성된 군으로부터 선택되는, 모 화합물 ISA247의 1 이상의 화학적 변형을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예는 히드록실화, N-탈메틸화, 디올 형성, 에폭사이드 형성, 및 내부분자 고리화로 구성된 군으로부터 선택되는, 모 화합물의 1 이상의 화학적 변형을 포함하는 시클로{{(E)- 및 (Z)-(2S, 3R, 4R)-3-히드록시-4-메틸-2-(메틸아미노)-6,8-노나디에노일}-L-2-아미노부티릴-N-메틸-N-메틸-글리실-N-메틸-L-로이실-L-발릴-N-메틸-L-로이실-L-알라닐-D-알라닐-N-메틸-L-로이실-N-메틸-L-로이실-N-메틸-L-발릴}(ISA247)의 대사산물을 포함한다.

다양한 구체예로서, 상기 단리된 대사산물은 아미노산-1의 측쇄에서 에폭사이드; 아미노산 1의 측쇄에서 디올; 아미노산-1의 측쇄에서 시클릭 에테르; 아미노산-1, 3, 4, 6, 9, 10 또는 11에서 탈메틸화된 아미노 질소; 아미노산 4, 6, 9 또는 10의 측쇄의 γ 탄소에서 -OH; 및 아미노산 5 또는 11의 측쇄의 β 탄소에서 -OH로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상의 화학적 변형을 포함한다. 다양한 구체예로서, 단리된 대사산물은 앞서 말한 화학적 변형을 2 이상 포함한다. 특정 구체예로서, 단리된 대사산물은 IM1-e-1, IM1-e-2, IM1-e-3, IM1-d-1, IM1-d-2, IM1-d-3, IM1-d-4, IM1-c-1 및 IM1-c-2로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

특정 구체예로서, ISA247과 비교하여, 상기 단리된 대사산물은 2 이상의 -OH 기; 2 이상의 탈메틸화 아미노산 질소; 1 이상의 -OH 기 및 1 이상의 탈메틸화 아미노산 질소; 1 이상의 디올 기 및 1 이상의 -OH 기; 1 이상의 디올 기 및 1 이상의 탈메틸화 아미노산 질소; 1 이상의 시클릭 에테르 및 1 이상의 -OH 기; 1 이상의 시클릭 에테르 및 1 이상의 탈메틸화 아미노산 질소; 1 이상의 -OH 기 및 1개의 포스페이트, 술페이트, 글루쿠로니드 또는 글리코실화 잔기;로 구성되는 군으로부터 선택되는 화학적 변형을 포함한다. 구체예는 에폭사이드, 디올 및 고리화(cyclization)을 비롯한 ISA247의 아미노산-1에서 대사산물을 포함한다. 부가적인 구체예는 ISA247 화합물이 1) 1 이상의 메틸 로이신 아미노산, 예컨대 아미노산 4, 6, 9 또는 10에서; 2) 발린 잔기 5에서; 3) 또는 메틸 발린 잔기 11에서 히드록실화된 대사산물을 포함한다. 다른 구체예는 ISA247의 아미드 결합의 1 이상의 메틸화된 질소가 탈메틸화된 대사산물을 포함한다. 다른 구체예는 ISA247의 아미노산 1, 3, 4, 6, 9, 10 및 11의 아미드 결합의 1 이상의 질소가 탈메틸화된 대사산물을 포함한다. ISA247의 대사산물의 예는 IM1-d-1, IM1-d-2, IM1-d-3, IM1-d-4, IM9, IM1-c-1, IM1-c-2, IM4n, IM6, IM46, IM69, IM49, IM1-e-1, IM1-e-2 및 IM1-e-3을 포함한다.

부가적인 구체예는 아미노산 잔기에서 1 이상의 히드록실화 또는 1 이상의 N-탈메틸화와 조합된 ISA247의 아미노산-1에서 디올 또는 고리화를 갖는 대사산물을 포함한다. 부가적으로, 구체예는 다른 아미노산 잔기에서 1 이상의 히드록실화 및 1 이상의 N-탈메틸화와 조합된 ISA247의 아미노산-1에서 디올 또는 고리화를 갖는 대사산물을 포함한다.

다양한 구체예로서, ISA247의 대사산물은 약물을 투여한 후 체액으로부터 단리될 수 있거나, 또는 반합성적으로(즉, 동물 간 세포의 마이크로솜 균질물 또는 미생물의 배양물로부터) 또는 예컨대 유기 합성 분야에서 공지된 반응을 이용하여 모 화합물을 화학적으로 변형하는 것에 의해 완전히 합성적으로 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명의 일부 구체예는 a) 포유동물 세포(예컨대 포유동물 간 세포)를 균질화하여 균질물(예컨대 형질막을 파쇄하여 간세포의 내용물을 방출하기 위한)을 형성하는 단계; b) 상기 균질물을 원심분리시켜 1 이상의 약물-대사 효소, 예컨대 사이토크롬 P450을 함유하는 마이크로솜 펠릿을 얻는 단계; 또 c) ISA247의 1 이상의 대사산물의 생산을 초래하는 조건하에서 ISA247, 마이크로솜 펠릿, 에너지 공급원 및 전자 공여 종을 함유하는 반응 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는, 시험관내에서 ISA247의 대사산물을 제조하는 방법을 제공한다. 다른 구체예로서, 상기 방법은 영장류, 래트(rat), 개 및 토끼로 구성된 군으로부터 선택된 포유동물 간세포, 또는 일부 구체예의 경우 개 또는 토끼의 간세포를 이용할 수 있다. 전자 공여 종은 예컨대 NADH 또는 NADPH일 수 있다. 에너지 공급원은 예컨대 글루코오스-6-포스페이트 및 이소시트레이트로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 구체예로서, 상기 반응 혼합물은 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제(dehydrogenase) 및 이소시트레이트 데히드로게나아제로 구성된 군으로부터 선택된 효소를 포함한다.

부가적 구체예로서, 본 발명은 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 ISA247의 대사산물을 분리하는 방법을 제공한다. 다른 구체예로서, 상기 크로마토그래피 칼럼은 n-옥타데실, n-옥틸, n-부틸, 디페닐 및 시아노프로필 칼럼일 수 있고, 또 길이는 약 150 내지 250 mm 일 수 있으며, 직경은 약 0.1 내지 4.6 mm이며 또 유량은 약 500 내지 2,000 μL/분이다. 또한 본 발명의 다른 구체예는 대사산물이 중량 분광측정법에 의해 확인될 수 있는 것을 포함한다.

본 발명의 구체예는 a) ISA247의 1-아미노산 잔기의 β-알코올을 보호하여 보호된-ISA247 화합물을 형성하는 단계; b) 보호된-ISA247을 4, 6 또는 9-아미노산 잔기 1 이상의 측쇄의 γ-탄소에서 할로겐화제에 의해 할로겐화시켜 할로겐화된 생성물을 형성하는 단계; c) 단계 b)의 할로겐화된 생성물을 아세테이트 시약의 존재하에서 가열하여 아세테이트 성분을 갖는 아세테이트-함유 생성물을 형성하는 단계; 및 d) 단계 c)의 아세테이트-함유 생성물의 아세테이트 성분을 알코올 성분으로 교환하기 위해 에스테르교환반응을 실시하여 ISA247의 히드록실화된 대사산물을 형성하는 단계를 포함하는, ISA247의 히드록실화된 대사산물을 제조하는 방법을 제공한다. 특별한 구체예로서, 상기 할로겐화제는 예컨대 N-브로모숙신이미드(NBS)일 수 있고 또 아세테이트 시약은 예컨대 테트라부틸암모늄 아세테이트일 수 있다.

다양한 구체예는 전술한 방법에 의해 생성된 ISA247의 단리된 히드록실화된 대사산물을 포함한다. 단리된 히드록실화된 대사산물의 예는 IM9, IM4, IM6, IM46, IM69 및 IM49로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 구체예는 단리된 ISA247의 1-아미노산 잔기의 측쇄의 알켄 성분(moiety)을 산화제(예컨대 프릴레즈하에브(Prilezhaev) 반응)로써 산화시켜 ISA247의 에폭사이드 대사산물을 형성하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 ISA247의 에폭사이드 대사산물을 제조하는 방법을 제공한다. 산화제는 예컨대 m-클로로과벤조산 (MCPBA), 과아세트산, 트리플루오로과아세트산, 과벤조산, 3,5-디니트로과벤조산, 과산화수소, 알킬 과산화물, 산소 등일 수 있다.

다양한 구체예는 전술한 방법으로 제조한 ISA247의 단리된 에폭사이드 대사산물을 포함한다. 단리된 에폭사이드 대사산물의 예는 IM1-e-1, IM1-e-2 및 IM1-e-3을 포함한다.

본 발명의 부가적 구체예는 a) β-OH 기를 보호하는 단계; b) ISA247의 아미노산-1 잔기의 측쇄의 알켄 성분을 알켄 성분이 모노-에폭사이드로 변환되도록 산화제로 처리시키는 단계; c) 상기 에폭사이드로부터 ISA247의 대사산물을 함유하는 디올을 형성하는 단계; 및 d) 염기를 사용하여 β-OH 기를 보호기 제거(deprotecting)하는 단계를 포함하는 ISA247의 디올 함유 대사산물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 부가적인 구체예는 a) ISA247의 1-아미노산 잔기의 측쇄의 알켄 성분을 산화제와 처리하여 ISA247의 에폭사이드 대사산물(예컨대 프릴레즈하에브(Prilezhaev) 반응)을 형성하는 단계; 및 b) 상기 단리된 ISA247의 에폭사이드 대사산물로부터 ISA247의 단리된 디올 대사산물을 형성하는 단계를 포함하는 ISA247의 디올 함유 대사산물을 제조하는 방법을 제공한다. 산화제의 전형적인 예는 m-클로로과벤조산(MCPBA), 과아세트산, 트리플루오로과아세트산, 과벤조산, 3,5-디니트로과벤조산, 과산화수소, 알킬 과산화물, 및 산소를 포함한다. 다른 구체예로서, 에폭사이드로부터 ISA247의 디올 함유 대사산물을 형성하는 단계 b)는 단계 a)의 에폭사이드를 물을 사용한 친핵성 공격(예컨대 가수분해)처리하는 것을 포함한다. 물에 의한 친핵성 공격은 산 및 염기, 예컨대 과염소산, 알칼리수, Nafion-H, 포름산 등으로 구성된 군으로부터 선택된 물질에 의해 촉진(catalyzed)될 수 있다. 특히 구체예로서, 단계 b)의 가수분해는 과염소산 또는 Nafion-H에 의해 촉진된 가수분해; 디메틸 술폭사이드 중의 알칼리성 가수분해; 및 마이크로솜 에폭사이드 가수분해효소에 의해 촉진된 가수분해로부터 선택된다.

다양한 구체예는 상술한 방법에 의해 제조된 ISA247의 단리된 디올 대사산물을 포함한다. 단리된 디올 대사산물의 예는 IM1-d-1, IM1-d-2, IM1-d-3 및 IM1-d-4를 포함한다.

다른 구체예로서, 본 발명은 사산화 오스뮴 및 알칼리성 과망간산 칼륨 또는 과산화수소, 또는 t-부틸 히드로과산화물 또는 과산화수소/포름산, 또는 모노과숙신산을 사용하여 직접 ISA247의 디올 대사산물을 형성하는 단계를 포함하는, ISA247의 디올-함유 대사산물을 제조하는 방법을 제공한다. 전형적인 구체예로서, ISA247을 사산화 오스뮴, 알칼리성 과망간산칼륨, 과산화수소, 모노과숙신산 및 t-부틸 히드로과산화물로 구성된 군으로부터 선택되는 시약과 반응시켜 ISA247의 디올 대사산물을 형성한다. 전형적으로, ISA247은 촉매량의 사산화 오스뮴과 반응할 수 있다. 다른 구체예로서, ISA247은 과산화수소/포름산 및 모노과숙신산으로 구성된 군으로부터 선택되는 시약과 반응할 수 있다.

일부 구체예로서, ISA247의 디올 대사산물의 제조방법은 a) ISA247을 요오드/은 벤조에이트 및 은 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택된 시약과 반응시켜 ISA247의 디에스테르를 형성하는 단계; 및 b) ISA247의 디에스테르를 가수분해하여 ISA247의 디올 대사산물을 형성하는 단계를 포함한다.

다양한 구체예는 상술한 방법으로 제조한 ISA247의 단리된 디올 대사산물을 포함한다. 단리된 디올 대사산물의 예는 IM1-d-1 및 IM1-d-2를 포함한다.

일부 구체예로서, ISA247의 디올 대사산물의 제조방법은 a) ISA247을 납 테트라아세테이트 및 탈륨 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택된 시약과 반응시켜 ISA247의 디올 비아세테이트를 형성하는 단계; 및 b) 상기 ISA247의 디올 비아세테이트를 가수분해시켜 ISA247의 디올 대사산물을 형성하는 단계를 포함한다.

다양한 구체예는 상술한 방법으로 제조한 ISA247의 단리된 디올 대사산물을 포함한다. 단리된 디올 대사산물의 예는 IM1-d-1 및 IM1-d-2를 포함한다.

부가적인 구체예로서, 대사산물 디올은 할로알릴붕소화(halloallylboration)와 같은 유기금속 성분에 의해 얻을 수 있는 비닐 에폭사이드로부터 제조한다. 이러한 비닐 에폭사이드는 샤프리스(Sharpless) 디히드록실화 수순에 의해 입수할 수 있다.

본 발명의 특정 구체예는 약학적으로 허용되는 담체 및 본 발명의 단리된 화합물 또는 대사산물을 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 시클로스포린 유사체 ISA247의 대사산물을 확인한다. 본 발명은 또한 시클로스포린 유사체 ISA247의 대사산물의 제조방법도 제공한다. 이러한 대사산물은 면역억제 활성을 갖는다. 이들은 항체 생산을 비롯하여 치료적 약물 모니터링을 위한 분석법의 개발에 유용하다.

시클로스포린 A는 톨리포클라듐 인플라툼 감스(Tolypocladium inflatum Gams) 종의 액침배양(submerged culture)에서 생성된 중성의, 고 친유성 시클릭 운데카펩티드이다. 이것은 임상 코드 OL 27-400을 가지며, 또 상표명 Sandimmune^® 을 갖는 면역억제 제제의 활성 성분이다.

시클로스포린 A는 최근 "시클로스포린"으로 개명되었다(Carruthers, 1983에 의해). 본 발명에서는 약어 "CsA"는 특정 화합물 시클로스포린 A를 의미하기 위해 사용되고, 용어 "시클로스포린"은 시클로스포린 유사체를 비롯하여 면역억제 활성을 갖는 시클릭 펩티드를 포함하는 면역억제제의 일반류를 지칭한다. 따라서, 용어 "시클로스포린"은 일반적으로 시클로스포린 A 내지 Z를 비롯하여 그의 변형태 및 유사체를 포괄하여 지칭한다. 특히, 용어 시클로스포린은 화합물 CsA 및 ISA247을 포함한다.

CsA 및 그의 대사산물의 구조 및 명명

시클로스포린 A의 구조는 도 1에 도시한다. N.R. Hartman 및 I. Jardine에 의해 "Mass Spectrometric Analysis of Cyclosporine Metabolites" Biomed . Environ. Mass Spectrom . Vol. 13, pp.361-372 (1986)에 기재된 바와 같이, 시클로스포린 A는 거의 전체적으로 소수성 아미노산으로 구성된 시클릭 운데카펩티드이다. 이들 아미노산의 다수는 단백질에서 보통 발견되지 않는다. 도 1은 상기 분자의 시클릭 펩티드 고리를 포함하는 11개의 아미노산 잔기를 확인하고 있다. CsA 분자는 (4R)-4-[(E)-2-부테닐]-4,N-디메틸-L-트레이오닌(MeBmt)에 독특한 1개의 사르코신 잔기(Sar 또는 메틸화된 글리신 잔기 MeGly), 각각 1개씩의 D- 및 L-알라닌(Ala) 잔기, α-아미노 부티르산 잔기(Abu), 발린(Val) 잔기, N-메틸 발린 (MeVal) 잔기, 4개의 N-메틸 로이신(MeLeu) 잔기, 및 알켄-함유 9-탄소, β-히드록실화된 아미노산을 함유한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기는 (4R)-4-[(E)-2-부테닐]-4,N-디메틸-L-트레이오닌(MeBmt)에서 시작해서 인접하는 MeVal 로까지 순차적으로 1-11로 넘버링된다.

CsA의 아미노산 각각은 R-구조를 갖는 위치 8에서의 알라닌 잔기(알라닌의 D-이성질체)를 제외하고는 S-구조 (아미노산의 L-이성질체)를 갖는다. 상기 아미노산의 7개는 이들의 아민 질소 원자에서 메틸화되며; 이들은 잔기 1, 3, 4, 6, 9, 10 및 11이다. 시클로스포린 A의 구조를 발견할 당시, 10개 아미노산 2-11이 알려졌지만, β-히드록실화된 아미노산 MeBmt는 알려지지 않았다.

ISA247(또는 ISA_TX247 또는 ISA)의 구조는 도 2에 도시되어 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, ISA247 및 기재된 대사산물에서 아미노산 잔기 위치는 도 1의 CsA에서와 같이 넘버링된다. 도 1과 비교하면, CsA 및 ISA247은 아미노산 잔기 1에서 측쇄를 제외하고는 동일하다. 이들 시클로스포린의 공통되는 구조는 ISA247의 E(트랜스) 및 Z(시스) 이성질체 형태를 도시하는 도 3 및 4에 도시된 박스모양으로 표시될 수 있으며, 이때 숫자 1은 표시된 측쇄가 결합되어 있는 아미노산 잔기 1을 나타낸다. 아미노산-1의 구조는 도 41 및 도 42 및 표 5에 유사하게 도시되어 있다.

아미노산의 측쇄의 구조를 본 명세서에 도시할 때, 그 측쇄의 탄소는 당분야에 통상적으로 공지된 바와 같이 그리스 문자로 라벨링할 수 있다. 예컨대, 아미노산의 카르보닐 기에 인접한 탄소는 통상적으로 α-탄소로 표시되며, 이어지는 그리스 알파벳 글자를 사용하여 펩티드 고리로부터 앞쪽으로 떨어지는 탄소원자를 나타낼 수 있다. 이러한 명명법의 일례는 도 1 및 도 2에 도시되어 있다. 예컨대, CsA의 경우, MeBmt 측쇄의 β-탄소는 히드록실 기에 결합되어 있고, 또 측쇄의 ε 및 ζ-탄소 사이에는 이중결합이 있다.

CsA의 구조에 대한 추가의 정보는 P.A. Keown에 의해 Immunosuppression in Tansplantation (Blackwell Science, Madlden MA, 1999), pp.1-12에 "Molecular and Clinical Therapuetics of Cyclosporine in Transplantation" 제목의 채프터에 제공되어 있다. Keown에 따르면, 비수성 용액 중의 고체 상태 x-선 회절 및 핵자기 공명 연구는 CsA 분자가 2개 구조 모티브를 특징으로 하는 것으로 본다. MeLeu(위치 6)에 대한 잔기 MeBmt (위치 1)은 수소 결합에 의해 안정화된 항평행 β-시트를 포함하는 반면에, MeVal (위치 11)에 대한 잔기 Ala (위치 7)은 잔기 9와 10 사이의 펩티드 결합이 시스 구조인 루프를 형성한다. 면역억제성 시클로스포린은 2개의 조절 도메인을 갖는다. 잔기 1, 2, 9, 10 및 11은 수용체 결합 도메인을 나타내는 반면에, 잔기 4 내지 8은 이팩터(effector) 도메인으로 작용한다. R.M. Wenger에 의한 논문 "Synthesis of Cyclosporine and Analogs: Structural Requirements for Immunosuppressive Activity" Angew Chem Int . Ed . Engl . Vol. 24, No. 2, pp.77-138 (1985)에 따르면, 면역억제에 필수적인 아미노산은 위치 1, 2, 3 및 11에 있는 MeBmt, Abu, Sar 및 MeVal이다.

CsA의 시클릭 운데카펩티드 구조는 모든 밝혀진 대사산물에 보존된다(Copeland, 1990). 이들 시클릭 펩티드의 생체변환(biotransformation)에 관련된 반응은 무엇보다도 히드록실화, 에폭사이드 형성, N-탈메틸화 및 내부분자 고리화이다. 용어 "히드록실화"는 단일히드록실화를 지칭하지만, 다중 히드록실화가 동일 분자의 다른 위치에서 생길 수 있다. 디히드록실화는 알켄을 에폭사이드로 산화한 다음 디올 형성하는 것에 의해 생길 수 있다. N-탈메틸화는 시클릭 펩티드 고리 중의 인접 아미노산 잔기를 연결하는 아미드 결합의 메틸화된 질소에서 생긴다. CsA의 대사산물은 알데히드 및 카르복시산 유도체를 포함한다. CsA의 카르복시산 대사산물의 형성은 독성을 초래할 수 있다. 상기 기재한 반응의 조합도 생길 수 있다.

다수의 상이한 연구자들이 CsA 대사산물을 기재하였으나, 언제나 동일한 명칭을 사용한 것은 아니었다. 이러한 상황을 분명히 하기 위해, CsA의 공지 대사산물의 표를 도 5에 나타낸다. 도 5를 참조하면, 시클로스포린 A의 대사산물은 접두사 "CsA-Am"으로 표시하며, 표시의 "CsA" 부분은 그 화합물이 시클로스포린 A의 대사산물이라는 것을 나타내며, 또 기호의 "Am" 부분은 대사 변형이 생긴 아미노산 위치를 나타낸다. 기호는 대사반응의 성질을 특정한다. 이 명명법을 이용하면 이하의 ISA247 대사산물의 논의와 관련하여 더욱 명백해 질 것이다.

ISA247 및 그의 대사산물의 구조 및 명명

본 발명자들은 앞서 시클로스포린 A 유도체를 "ISA", "ISA247" 또는 "ISA_TX247"로 기재하였다(미국특허 6,605,593호 및 6,613,739호 참조). 상술한 바와 같이, 상기 유사체는 아미노산-1 잔기에서 변형을 제외하고는 시클로스포린 A와 구조적으로 유사하다. 본 발명자들은 ISA247의 시스-이성질체(Z-이성질체로 공지됨) 및 트랜스-이성질체(E-이성질체로 공지됨)의 특정 혼합물이 천연산출의 현재 공지된 시클로스포린에 비하여 효능이 증가하고 감소된 독성을 나타내는 것을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 주로 트랜스-이성질체로 구성된 시스-이성질체와 트랜스-이성질체의 혼합물이 천연산출의 공지된 시클로스포린에 비하여 감소된 독성과 증가된 효능을 갖는다는 것도 발견하였다.

ISA247의 화학명칭은 시클로{{(E)- 및 (Z)-(2S, 3R, 4R)-3-히드록시-4-메틸-2-(메틸아미노)-6,8-노나디에노일}-L-2-아미노부티릴-N-메틸-N-메틸-글리실-N-메틸-L-로이실-L-발릴-N-메틸-L-로이실-L-알라닐-D-알라닐-N-메틸-L-로이실-N-메틸-L-로이실-N-메틸-L-발릴} 이다. 그의 실험식은 C₆₃H₁₁₁N₁₁O₁₂ 이며, 그의 분자량은 약 1214.85 이다. 용어 "ISA", "ISA247" 및 "ISA_TX247"은 그의 약리학적 활성 화합물에 주어진 상품명이다.

ISA247의 구조는 핵자기 공명(NMR) 분광측정을 통하여 주로 확인되었다. 일련의 1차원 및 2차원 NMR 실험을 이용하고 또 ISA247 피이크를 시클로스포린 A의 공지된 NMR 지정(assignment)과 비교함으로써 ¹H 및 ¹³C 스펙트럼이 배치되었다. ISA247의 (E) 및 (Z)-이성질체의 절대 지정은 NOE(Nuclear Overhauser Effect) 실험에 의해 확인하였다. 부가적인 지지 증거는 분자량을 확인하는 질량 스펙트럼 분석에 의해 및 적외선 스펙트럼에 의해 제공되었으며, 시클로스포린 A와 아주 유사한 것이 밝혀졌다. 후술한 결과는 2개 화합물 사이의 밀접한 구조적 유사성을 고려하여 예상되었다. 그러나, ISA247은 1-아미노산 잔기의 측쇄에서, CSA에서는 존재하지 않는, 콘쥬게이트된 디엔을 함유한다. CsA 처럼, ISA247은 그의 아미노산-1 측쇄의 ε- 및 ζ-탄소 사이에 탄소-탄소 이중결합을 갖지만, CsA와는 달리, η와 θ 탄소 사이에에서 ISA247 내에 부가적인 탄소-탄소 이중결합을 갖는다.

CsA 와 ISA247의 구조 사이의 유사성으로 인하여, ISA247의 기재된 대사산물에 대한 명명은 CsA 대사산물에 대해 개발된 명명법을 기초로 한다. 여기서 확인된 대사산물은 ISA247 대사산물이 접두어 "ISA" 대신 "I"가 앞에 붙는 것을 제외하고는 유사한 패턴을 따를 것이다. 또한 문자 "AM"은 CsA 대사산물의 변형 아미노산을 나타내기 위해 사용되는 반면에, ISA 대사산물은 "IM"을 사용할 것이다. 예컨대, 아미노산-9의 γ-탄소에서 단일히드록실화된 CsA 대사산물은 CsA-Am9 또는 AM9로 나타낸다. 아미노산-9의 γ-탄소에서 단일히드록실화된 ISA 대사산물은 IM9로 나타낸다. 위치 4에서 MeLeu의 질소가 탈메틸화된 CsA 대사산물은 CsA-Am4n 또는 AM4n으로 나타낸다. 위치 4에서 MeLeu의 질소가 탈메틸화된 ISA247 대사산물은 IM4n (ISA Metabolite at amino acid-4, n-demethylation)로 나타낸다.

ISA247은 아미노산-1에서 1,3 디엔을 갖기 때문에, CsA로부터는 형성될 수 없는 몇 개의 디올 대사산물이 ISA247로부터 형성될 수 있다. 이들 디올 대사산물에 대한 명명은 앞서 기재한 표준을 따를 것이다. 예컨대, 구조가 밝혀진 첫째 디올 대사산물은 IM1-d-1 (조사된 ISA Metabolite at the amino acid-1-diol-1 ^st 구조)이다.

CsA와 마찬가지로, ISA247은 생체내에서 대사되어 대사산물을 형성할 수 있다. 이들 대사산물은 혈류를 통하여 이동하며 요(urine) 및/또는 담즙을 통하여 분비될 수 있다. 따라서, ISA247 대사산물은 약물을 투여한 후 동물의 전체 혈액, 담즙 및 요를 비롯한 체액으로부터 단리될 수 있다. ISA247 대사산물은 생체변환을 통하여 미생물에 의해 제조될 수 있다. 또한 ISA247 대사산물은 포유류 마이크로솜 계를 사용하여 제조할 수 있다. ISA247 대사산물은 화학적으로 합성될 수 있다. 대사산물은 질량 분광계와 결합된 크로마토그래피 수법 및 핵자기 공명(NMR) 수법에 의해 단리되고 특징화될 수 있다.

다른 구체예로서, 본 발명은 본 발명의 대사산물을 특이적으로 인식하는 항체를 제공한다. 특히 고려할 수 있는 것은 소정 대사산물을 인식하지만 시클로스포린, ISA247 또는 기타 대사산물과는 교차반응하지 않는 항체이다. 이들 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된, 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 항원결정기-결합 단편(예컨대 Fab, Fab' 및 F(ab')2) 등일 수 있다. 본 발명의 대사산물은 항체를 제조하고 및/또는 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 폴리클로날 항체 혼합물(항혈청과 같은)이 시클로스포린, ISA247, 또는 바람직하지 않은 대사산물과 교차반응하면, 상기 혼합물은 교차반응성 항체를 제거하기 위하여 면역선택 또는 면역흡착에 의해 처리될 수 있다. 예컨대, 면역선택에서, 상기 혼합물은 관심을 갖고 있는 대사산물이 고정된 칼럼을 통과할 수 있다. 칼럼에 결합된 항체는 용출되어 수집될 수 있다. 역으로, 면역흡착의 경우, 혼합물이 교차반응하는 화합물이 고정되고 바람직하지 않는 항체를 흡수하기 위해 사용된다. 항체의 제조방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예컨대 Harlow and Lane, "Antibodies. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988 참조). 항체들은 예컨대 치료적 약물 모니터링에서 유용하다.

정의

본 명세서에 사용된 바와 같이, "대사산물"은 포유동물에서 ISA247의 대사에 의해 제조되며 추가로 화학적으로 변형될 수 있는 ISA247의 유도체를 의미한다. 본 명세서에 기재된 ISA247의 단리된 대사산물은 ISA247을 포유동물에 투여한 다음 단리에 의해; 본 명세서에 기재된 바와 같은 ISA247, CsA 또는 시클로스포린 유도체의 화학적 변형에 의해; ISA247, CsA 또는 다른 시클로스포린 유도체의 미생물 전환에 의해 또는 상술한 방법의 2 이상의 조합에 의해 제조할 수 있다. 예컨대, ISA247은 포유동물에 투여될 수 있고 포유동물로부터 단리된 ISA247의 대사산물은 화학적으로 변형되어 다른 대사산물을 형성하거나; 또는 ISA247은 생체내에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 마이크로솜 제제와 반응하여 대사산물을 형성할 수 있으며, 이것은 다시 화학적으로 변형되어 다른 대사산물을 형성할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "화학적으로 변형"되는 것은 화합물이 기준 구조와 비교하여 1 이상의 화학적 구조의 차이를 갖는 것을 의미한다. 화학적 변형은 본 명세서에 기재된 바와 같은 합성적, 효소적, 또는 대사적 방법으로 제조할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, ISA247의 1-아미노산 잔기의 β-알코올을 보호하여 보호된-ISA247 화합물을 형성하기 위한 적합한 보호 기 및 보호 및 보호기 제거를 위한 조건은 당해 분야에 공지되어 있고 또 예컨대 Greene and Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons (1991)에 기재되어 있으며, 이 문헌의 가르침은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 적합한 히드록실 보호기의 특정 예는 비제한적으로 치환된 메틸 에스테르 (예컨대 메톡시메틸, 벤질옥시메틸) 치환된 에틸 에테르 (예컨대 에톡시메틸, 에톡시에틸)벤질 에테르 (벤질, 니트로벤질, 할로벤질) 실릴 에테르 (예컨대 트리메틸실릴), 에스테르 등을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "할로겐화제"는 -H 또는 기타 기 대신 할로겐을 치환할 수 있는 당해 분야에 공지된 화합물이다. 예컨대, 다양한 구체예로서, 할로겐화제는 브롬, 염소, N-클로로숙신이미드, N-브로모숙신이미드 등, 특히 N-브로모숙신이미드일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 프릴에즈하에브 반응은 알켄을 과산과 반응시키는 것에 의해 에폭사이드를 형성하는 것을 의미한다. 예컨대, N.Prilezhaev, Ber. 42, 4811 (1909); D. Swern, Chem. Rev. 45, 16(1949); Org. React. 7, 378(1953); H.O. House, Modern Synthetic Reactions (W.A.Benjamin, Menlo Park, California, 2nd ed., 1972) pp 302-319; D.I. Metlitra, Russ. Chem. Rev. 41, 807 (1972); 및 D. Schnurgfeil, Z. Chem. 20, 445 (1980) 참조. 이들 참고문헌의 전체 가르침은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "약물 대사 효소"는 생체내 또는 시험관에서 CsA, ISA247 또는 그의 대사산물을 화학적으로 변형할 수 있는 효소이다. 전형적으로, 약물 대사 효소는 동물 또는 미생물로부터, 예컨대 포유동물로부터 유도되며, 예컨대 포유동물 세포(예컨대 간 세포)를 균질화시켜 약물 대사 효소를 함유하는 마이크로솜 제제를 제조하는 것에 의해 유도한다. 특별한 구체예로서, 약물 대사 효소는 효소의 사이토크롬 P450 패밀리의 1 이상의 멤버를 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "에너지 공급원"은 ISA247을 화학적으로 변형시켜 ISA247의 대사산물을 제조하기 위해 제공되는 약물 대사 효소에 의해 사용되는 1 이상의 화합물을 포함한다. 예컨대, 에너지 공급원은 탄수화물, 예컨대 특정 구체예로서, 글루코오스-6-포스페이트, 이소시트레이트 등일 수 있다. 에너지 공급원의 분해를 실시하는 효소, 예컨대 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 이소시트레이트 탈수소효소 등은 마이크로솜 제제에 포함될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "전자 공여 종"은 ISA247을 화학적으로 변형시켜 ISA247의 대사산물을 제조하기 위한 산화환원 전자 공급원으로서 약물 대사 효소에 의해 사용될 수 있는 화합물이다. 예컨대, 전형적인 전자 공여 종은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH) 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADPH)를 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "단리"된다는 것은 화합물, 즉 ISA247의 기재된 대사산물이 생물학적 계, 예컨대 포유동물, 미생물 세포 배양액의 세포 등으로부터 분리되는 것을 의미한다. 전형적으로, 단리된 화합물은 예컨대 크로마토그래피 분리, 결정화, 친화성 정제, 또는 기타 당해 분야에 공지된 수법에 의해 정제된다. 예컨대, 특정 구체예로서, 기재된 ISA247 대사산물은 고압 액체 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "N-탈메틸화"는 아미노산 질소로부터 메틸 기를 제거하는 것을 의미한다. "아미노산 질소"는 아미노산 측쇄에 있는 질소가 아니라 아미노산의 주쇄에 있는 질소를 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "글루쿠로니드 형성"은 글루쿠론산을 글루코시드 결합을 통하여 ISA247 또는 다른 ISA247 대사산물에 결합시키는 것에 의해 글루쿠로니드 ISA247 대사산물을 형성하는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "글리코실화"는 사카라이드를 ISA247 대사산물의 히드록실 기에 결합시켜 글리코실화된 ISA247 대사산물을 형성하는 것을 의미한다. 사카라이드(또는 글리코실화 잔기)는 1 이상의 당, 예컨대 이당류, 올리고당류, 다당류 등을 가질 수 있다. 글리코실화 잔기에 포함된 전형적인 당은 글루코오스, 만노오스, 및 N-아세틸 글루코사민이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 지방족 기는 완전히 포화되거나 또는 1 이상의 불포화 단위를 함유하는 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 비방향족 탄화수소이다. 알킬 기는 포화 지방족 기이다. 전형적으로, 직쇄 또는 분지쇄 지방족 기는 1 내지 10개 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 약 4개의 탄소원자를 갖고, 또 시클릭 지방족 기는 3 내지 약 10개 탄소원자, 바람직하게는 3 내지 약 8개의 탄소원자를 갖는다. 지방족 기는 바람직하게는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 펜틸 또는 옥틸이거나, 또는 3 내지 약 8개 탄소원자를 갖는 시클로알킬 기이다. C1-C4 직쇄 또는 분지쇄 알킬 또는 알콕시 기는 C3-C8 시클릭 알킬 또는 알콕시 기(바람직하게는 C1-C4 직쇄 또는 분지쇄 알킬 또는 알콕시 기임)는 "저급 알킬" 또는 "저급 알콕시"라 칭하며; -F, -Cl, -Br 또는 -I에 의해 치환된 기는 "저급 할로알킬" 또는 "저급 할로알콕시" 기이다; "저급 히드록시알킬"은 -OH에 의해 치환된 저급 알킬 등이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "알킬렌 기"는 -(CH₂)_n- 으로 표시되는 연결 알킬 사슬이며, 이때 n은 1 내지 10의 정수, 바람직하게는 1 내지 4이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "아릴"은 페닐, 비피넬 등과 같은 C6-C14 카르보시클릭 방향족 기를 의미한다. 아릴 기는 카르보시클릭 방향족 고리가 다른 아릴, 시클로알킬, 또는 시클로지방족 고리에 융합된 융합 폴리시클릭 방향족 고리 계, 예컨대 , 예컨대 나프틸, 피레닐, 안트라실 등을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로아릴"은 1 또는 그 이상의 O, S 또는 N 헤테로원자를 갖는 5-14원 헤테로아릴 기를 의미한다. 헤테로아릴 기의 예는 이미다졸릴, 이소이미다졸릴, 티에닐, 푸라닐, 플루오레닐, 피리딜, 피리미딜, 피라닐, 피라졸릴, 피롤릴, 피라지닐, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 이미다졸릴, 티에닐, 피리미디닐, 퀴나졸리닐, 인돌릴, 테트라졸릴 등을 포함한다. 헤테로아릴 기는 카르보시클릭 방향족 고리 또는 헤테로아릴 고리가 1 이상의 다른 헤테로아릴 고리에 융합된 융합된 다환식(polycyclic) 방향족 고리 계를 포함한다. 그 예는 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 인돌릴, 퀴놀리닐, 벤조티아졸릴, 벤조이소티아졸릴, 벤조옥사졸릴, 벤조이소옥사졸릴, 벤즈이미다졸릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐 및 이소인돌릴을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 비방향족 헤테로시클릭 기는 고리에 N, O 또는 S와 같은 1 이상의 헤테로원자를 포함하는 비방향족 카르보시클릭 고리이다. 이 고리는 5원, 6원, 7원 또는 8원 고리일 수 있다. 그 예는 옥사졸리닐, 티아졸리닐, 옥사졸리디닐, 티아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티오페닐, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 피롤리디닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 티아졸리디닐, 시클릭 사카라이드(예컨대 피라노오스 및 푸라노오스 형태의 글루코오스, 만노오스, 갈락토오스, 알로오스, 알트로오스, 굴로오스, 이도오스, 탈로오스 등) 등을 포함한다.

알킬, 시클로알킬, 지방족, 시클로지방족, 헤테로시클릭, 벤질, 아릴, 또는 헤테로아릴 기 중의 치환가능한 원자에 대한 적합한 선택적 치환기는 기재된 ISA247 대사산물의 약학적 활성을 실질적으로 방해하지 않는 치환기이다. "치환기 원자"는 치환기와 함께 1 이상의 상응하는 공유결합 또는 이온 결합을 형성하기에 충분한 1 이상의 원자가 또는 전하를 갖는 원자이다. 예컨대, 1가의 탄소원자(예컨대 -C(-H)=)는 알킬기에 대하여 단일 결합(예컨대 -C(-알킬)=)을 형성할 수 있고, 2가 탄소원자(예컨대 -C(H₂)-)는 1 또는 2개 치환기에 대하여 1 또는 2개의 단일 결합(예컨대 -C(알킬)(H)-, -C(알킬)(Br))-)을 형성하거나, 또는 1개 치환기에 대한 이중결합(예컨대 -C(=O)-)을 형성할 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 치환은 안정한 화합물을 형성하는 치환만을 포함한다.

예컨대, 치환가능한 탄소원자에 대한 적합한 선택적 치환기(예컨대 R⁵ - R¹⁰ 으로 표시되는 치환기)는

경우에 따라 치환된 알킬, 경우에 따라 치환된 시클로알킬, 경우에 따라 치환된 지방족, 경우에 따라 치환된 시클로지방족, 경우에 따라 치환된 헤테로시클릭, 경우에 따라 치환된 벤질, 경우에 따라 치환된 아릴, 및 경우에 따라 치환된 헤테로아릴을 포함하며, 이때 R^a - R^d 는 독립적으로 -H 또는 경우에 따라 치환된 지방족, 경우에 따라 치환된 시클로지방족, 경우에 따라 치환된 헤테로시클릭, 경우에 따라 치환된 벤질, 경우에 따라 치환된 아릴, 또는 경우에 따라 치환된 헤테로아릴이거나, 또는 합쳐져서 -N(R^aR^d)는 경우에 따라 치환된 헤테로시클릭 기이다.

다른 원자에 대해 2개의 공유 결합을 갖는 질소원자(예컨대 기재된 ISA247 대사산물 중의 아미노산 잔기 1-11 중의 아미노산 질소)에 대한 적합한 치환기는 예컨대 경우에 따라 치환된 알킬, 경우에 따라 치환된 시클로알킬, 경우에 따라 치환된 지방족, 경우에 따라 치환된 시클로지방족, 경우에 따라 치환된 헤테로시클릭, 경우에 따라 치환된 벤질, 경우에 따라 치환된 아릴, 경우에 따라 치환된 헤테로아릴,

등을 포함한다.

질소 함유 헤테로아릴 또는 비방향족 헤테로사이클은 산소에 의해 치환되어 N-옥사이드, 예컨대 피리딜 N-옥사이드, 피페리딜 N-옥사이드 등을 형성한다. 예컨대, 다양한 구체예로서, 질소함유 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 기 중의 고리 질소원자는 치환되어 N-옥사이드를 형성할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는"는 물질(예컨대 조성물, 담체, 희석제, 시약, 염 등)이 포유동물에 투여될 수 있는 것을 의미한다.

기재된 ISA247 대사산물이 약학적으로 허용되는 염도 본 발명에 속한다. 이들 대사산물은 적합한 유기 또는 무기 염기와 반응하여 염기 부가염을 형성할 수 있는 1 이상의 충분한 산성 양성자를 가질 수 있다. 화합물이 산소, 질소 또는 황 원자에 결합된 수소원자를 갖는다면, 그 화합물은 그 수소원자가 적합한 유기 또는 무기 염기와 반응하여 염기 부가 염을 형성한 그의 염을 포함한다고 할 수 있다. 염기 부가 염은 암모늄 또는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 수산화물, 카보네이트, 비카보네이트 등과 같은 무기 염기, 및 알콕사이드, 알킬 아미드, 알킬 및 아릴 아민 등과 같은 유기 염기를 포함한다. 본 발명의 염 제조에 유용한 이러한 염기는 수산화나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 탄산칼륨 등을 포함한다.

예컨대, 약학적으로 허용되는 염은 기재된 ISA247 대사산물과 1 당량의 적합한 염기에 의해 형성한 일가 염(즉, 화합물은 약학적으로 허용되는 대향 양이온(counter cation), 예컨대 1가 양이온에 의해 균형을 이룬 단일 음전하를 갖는다) 또는 2 당량의 적합한 염기와 반응하여 형성한 2가 염(예컨대 화합물은 약학적으로 허용되는 2개의 대향 양이온(counter cation), 예컨대 약학적으로 허용되는 2개의 1가 양이온 또는 1개의 약학적으로 허용되는 2가 양이온에 의해 균형을 이룬 2개 의 음전하를 갖는다)을 포함할 수 있다. "약학적으로 허용되는"것은 양이온이 검체에 투여되기에 적합하다는 것을 의미한다. 그 예는 Li⁺, Na⁺, K⁺, Mg^{2 +}, Ca^{2 +} 및 NR₄ ⁺ 를 포함하며, 이때 각 R은 독립적으로 수소, 경우에 따라 치환된 지방족 기(예컨대 히드록시알킬 기, 아미노알킬 기 또는 암모늄알킬 기임) 또는 경우에 따라 치환된 아릴 기이거나, 또는 2개 R 기는 합쳐져서 경우에 따라 치환되고 방향족 고리에 경우에 따라 융합된 비방향족 헤테로시클릭 고리를 형성한다. 일반적으로 약학적으로 허용되는 양이온은 Li⁺, Na⁺, K⁺, NH₃(C₂H₅OH)⁺, N(CH₃)₃(C₂H₅OH)⁺ 이다.

기재된 ISA247 대사산물과 아민과 같은 충분한 염기성 기와의 약학적으로 허용되는 염은 기재된 ISA247 대사산물을 유기 또는 무기 산과 반응시켜 산 부가염을 형성함으로써 형성할 수 있다. 염기성 기를 갖는 화합물로부터 산 부가염을 형성하기 위해 흔히 적용되는 산은 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 인산 등과 같은 무기산, 및 p-톨루엔술폰, 메탄술폰산, 옥살산, p-브로모페닐-술폰산, 탄산, 숙신산, 시트르산, 벤조산, 아세트산 등과 같은 유기 산을 포함한다. 이러한 염의 예는 술페이트, 파이로술페이트, 비술페이트, 술파이트, 비술파이트, 포스페이트, 모노히드로겐포스페이트, 디히드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 파이로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프로에이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 부티르네-1,4-디오에이트, 헥사인-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 술포네이트, 크실렌술포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 감마-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 타르트레이트, 메탄술포네이트, 프로판술포네이트, 나프탈렌-1-술포네이트, 나프탈렌-2-술포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.

약학적으로 허용되는 용매화물도 포함된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "용매화물"은 비-공유결합적 분자간 결합에 의해 결합된, 화학양론적 또는 비-화학양론적 양의 용매, 예컨대 물 또는 유기 용매를 더 포함하는 본 발명의 화합물 또는 그의 염을 의미한다.

기재된 ISA247 대사산물을 포함하는 약학적 조성물도 포함된다. "약학적 조성물"은 기재된 ISA247 대사산물과 함께 검체에게 투여할 약학적 조성물의 일부로서 허용되는 약학적 담체를 포함한다. 투여될 화합물의 제제는 선택된 투여 경로에 따라서 달라질 것이다(예컨대 경구, 정맥내, 비경구 또는 국소 투여 용액, 에멀젼, 캅셀, 크림, 연고 등). 적합한 약학적 담체는 화합물과 상호작용하지 않는 불활성 성분을 함유할 수 있다. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa에 기재된 바와 같은 표준 약학적 제형화 수법이 이용될 수 있다. 비경구적 투여를 위한 적합한 약학적 담체는 예컨대 멸균수, 생리학적 식염수, 살균 식염수(약 0.9% mg/ml 벤질 알코올을 함유하는 염수), 포스페이트 완충 염수, 행크 용액, 링거-락테이트 등을 포함한다. 조성물을 캅셀화하는 방법(경질 젤라틴 또는 시클로덱스트란의 코팅에 캅셀화하는 것과 같은)은 당해 분야에 공지되어 있다(Baker, et al., "Controlled Release of Biological Active Agents", John Wiley and Sons, 1986 참조).

기재된 ISA247 대사산물의 특정의 것은 상이한 입체이성질체(예컨대 부분입체이성질체 및 에난티오머)로 수득될 수 있고 또 본 발명은 기재된 화합물의 모든 이성질체 형태 및 라세미체 혼합물 및 순수한 이성질체 및 라세미체 혼합물을 비롯한 이들의 혼합물로 검체를 치료하는 방법도 포함한다. 입체이성질체는 크로마토그래피와 같은 적합한 방법에 의해 분리 및 단리될 수 있다.

인간의 전체 혈액, 요 또는 담즙으로부터 ISA247 대사산물의 확인 및 단리

이들 체액에 대한 유기 추출물을 사용하여, 대사산물을 추출하고, 건조하고 메탄올에서 재구성하며 또 질량 분광측정과 결합된 크로마토그래피 수법을 이용하여 확인하였다.

ISA247 대사산물의 화학적 합성

ISA247의 대사산물은 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다. 시클로스포린 A의 모노히드록실화 대사산물 CsA-Am1은 M.K. Eberle 및 F. Nuninger에 의해 "Synthesis of the main metabolite (OL-17) of cyclosporin A", J. Org. Chem. Vol. 57, No. 9, pp.2689-2691 (1992)에 보고된 바와 같이 합성하였다. Eberle 등은 시클로스포린 A는 인간 및 동물에서 시클로스포린으로 대사되어, 원래의 알릴성 메틸 기(1-아미노산 잔기의 측쇄 상)가 상응하는 알릴 알코올로 산화된다. Eberle 등은 아미노산-1 잔기의 β-알코올을 보호한 다음, 아세틸-CsA를 N-브로모숙신이미드(NBS)로 처리시킴으로써 상기 생성한 아세틸-시클로스포린 A (아세틸-CsA)를 알릴성 브롬화 조건에 처리하는 "시험관 내에서 상기 대사경로를 모방"하려고 하였다. 상기 단계로부터 얻은 생성물을 테트라부틸암모늄 아세테이트의 존재하에서 가열하여 아세테이트에 의해 브로마이드의 교환에 영향을 준다. 마지막으로, 상기 합성은 메탄올 중의 아세테이트를 메톡시화 나트륨 존재하에서 에스테르교환반응을 실시하여 상기 아세테이트 기를 알코올 작용으로 교환함으로써 완료되었다. 시클로스포린 A를 OL-17 대사산물로 전환시키는 것은 역상 칼럼 크로마토그래피에 의해 28% 수율로 얻어지는 것으로 보고되었다.

유사한 합성 경로를 이용하여 IM4, IM6 및 IM9와 같은 ISA247 대사산물을 생성하거나, 또는 현수(pendant) 메틸 기와 같은 알킬 탄소가 히드록실화된 대사산물을 생성할 수 있다. 예컨대, 히드록실화는 ISA247의 아미노산-1 잔기의 측쇄의 γ-CH₃ 에서 생길 수 있으므로, 측쇄의 β-γ-CH₃ 탄소에 걸쳐서 1,2 디올을 생성한다.

다른 구체예로서, 대사산물 IM4, IM6 및 IM9는 1) 모 화합물 ISA247의 아미노산-1 잔기의 β-알코올을 보호하여 보호된-ISA247 화합물을 형성하고, 2) 상기 보호된-ISA247을 N-브로모숙신이미드(NBS)와 같은 할로겐화제와 처리시켜 4,6 또는 9-아미노산 잔기의 γ-탄소에서 할로겐화된(일개 구체예로서 브롬화된) 보호된-ISA247을 형성하며, 3) 전 단계의 생성물을 테트라부틸암모늄 아세테이트와 같은 치환 시약 존재하에서 가열하여 아세테이트-함유 생성물을 형성하고, 또 4) 전 단계의 아세테이트-함유 생성물의 아세테이트 잔기를 알코올 잔기로 교환하기 위한 에스테르 교환반응을 실시하여 히드록실화된 대사산물을 형성하는 것에 의해 합성될 수 있다. ISA247의 아미노산-1 잔기보다 다른 잔기의 측쇄의 모노히드록실화하는 일반적 화학적 개념은 CsA의 아미노산-1 잔기의 측쇄의 상술한 모노히드록실화의 화학적 개념과 유사할 수 있다. 그러나, CsA가 아니라 ISA247에 존재하는 콘쥬게이트된 디엔 계 측면에서 ISA247의 아미노산-1 잔기에서 히드록실화된 대사산물을 얻기 위해서는 실질적으로 상이한 합성 전략을 이용하여야 한다.

ISA247 대사산물을 화학적으로 합성하기 위한 다른 구체예로서, ISA247의 아미노산-1의 측쇄의 알켄 성분은 디올로 직접적으로 전환되거나 또는 에폭사이드 중간체를 거쳐 디올로 전환될 수 있다. 예컨대, 알켄을 에폭사이드로 전환하는 것은 화학 문헌에 공지되어 있다. 프릴레즈하에브 반응을 이용하는 일개 구체예로서, 올레핀을 적합한 산화제와 처리하여 올레핀의 탄소-탄소 이중결합 전반에 산소 부가를 초래하여 에폭사이드를 형성한다. 상기 반응에 적용될 수 있는 보통의 산화제는 과산이며, 본 발명의 다른 구체예로서, m-클로로과벤조산(MCPBA)가 바람직하다. 과아세트산, 트리플루오로과아세트산, 과벤조산 및 3,5-디니트로과벤조산과 같은 다른 과산도 사용될 수 있다. 본 발명의 알켄-함유 시클로스포린을 과산화수소, 알킬 과산화물 또는 산소로 처리하는 것은 에폭사이드 형성을 초래할 수 있는 것으로 고려된다.

본 발명의 에폭사이드-함유 대사산물은 물에 의해 친핵성 공격을 거쳐 1,2-디올을 형성한다. 이 반응은 산 또는 염기에 의해 촉진될 수 있다. 본 발명의 일개 구체예로서, 과염소산이 바람직하지만, Nafion-H 또는 포름산과 같은 다른 산 촉매도 효과적일 수 있다. 다른 구체예로서, 디메틸 술폭사이드 중의 에폭사이드-대사산물의 알칼리성 가수분해는 염기성 조건하에서 실시될 수 있다. 효소 마이크로솜 에폭사이드 가수분해효소에 의한 에폭사이드 가수분해의 촉진은 다른 방법으로 고려할 수 있다. 이 방법은 이 반응이 반응 생성물에 어느 정도의 입체선택성을 도입할 수 있기 때문에 특히 유리함을 제공한다.

다르게는, 알켄은 다수의 상이한 시약에 의해 1,2-디올로 직접적으로 전환될 수 있다. 사산화오스뮴 및 알칼리성 과망간산 칼륨은 syn 부가를 할 수 있다. 유사하게, 과산화수소 또는 t-부틸 히드로과산화물와 같은 시약은 촉매량의 사산화오스뮴 존재하에서 syn 부가를 생성할 수 있다. 역으로, 항-부가는 과산화수소 및 포름산 또는 모노과숙신산과의 처리를 통하여 가능하다. 알켄을 요오드 및 은 벤조에이트 또는 은 아세테이트와 처리하면 중간체 디에스테르를 초래하며, 이는 쉽게 가수분해되어 1,2-디올을 생성할 수 있다. 유사하게, 납 테트라아세테이트 또는 탈륨 아세테이트를 사용한 산화는 디올의 가수분해가능한 비스아세테이트를 생성한다. 따라서, 당업자라면 다수의 수법을 이용하여 올레핀을 직접 1,2-디올로 전환할 수 있음을 알고 있을 것이다.

알켄을 1,2-디올로 전환시키는 상술한 합성 방법은 ISA247의 디올 대사산물의 합성 제조에 유용한 것으로 고려된다. ISA247의 아미노산-1 잔기의 측쇄의 콘쥬게이트된 디엔 성분의 알켄은 직접적으로 또는 에폭사이드와 같은 중간체를 거쳐 화학적으로 디올로 전환될 수 있다. 생성한 화합물은 토끼 또는 개의 마이크로솜 계에 의해 생성된 것과 같은 다른 수법으로 생산된 대사산물과 비교 및 매칭될 수 있다. 본 발명자들의 생각으로는 ISA247로부터 형성된 에폭사이드 중간체는 약리학적 활성을 보유할 것이므로, 강력한 치료제로서 중요할 수 있다.

ISA247은 아미노산-1의 화학 조성에서만 시클로스포린 A와 구조적으로 상이하기 때문에, 시클로스포린 A의 특정 대사산물은 ISA247 대사산물의 합성을 위한 중간체로서 사용될 수 있다. 예컨대, AM4n (아미노산-4 잔기의 N-탈메틸화) 및 AM 9(아미노산-9 잔기의 측쇄 상에서 히드록실화)와 같은 시클로스포린 A 대사산물은 시클로스포린 A를 ISA247로 전환하는 동일한 화학 과정을 통하여 유사체 ISA247 대사산물로 전환될 수 있다.

포유동물 마이크로솜 계를 통한 ISA247 대사산물의 제조

시클로스포린 A 및 ISA247은 인간 및 다른 동물로부터 마이크로솜 계에 의해 광범위하게 대사된다(Christians, 1993). 인간의 간 마이크로솜 제조의 경우, 시클로프소린을 그의 대사산물로 전환하는 것은 NADPH 의존적이다. 상기 대사는 일산화탄소, 케토콘아졸, 시메티딘 및 SKF525A에 의해 억제될 수 있다. 이들 억제제들은 특정 사이토크롬 P-450 억제제인 것으로 알려져 있으므로, 시클로스포린의 대사는 사이토크롬 P-450 계의 모노옥시게나아제의 작용을 통하여 매개되는 것으로 제시되었다. 본 발명자들은 앞서 ISA247이 사이토크롬 P-450 효소 계에 의해 대사된다고 나타내었다. 마이크로솜 계는 또한 당해 분야에 잘 공지되어 있고 적합한 조직(토끼, 개, 돼지, 소, 양, 영장류, 래트, 마우스 등과 같은 포유동물로부터의 간, 신장, 위장관 조직 등으로부터 얻은 조직을 포함할 수 있다)을 균질화하고 100,000 x g에서 원심분리하여 마이크로솜 펠릿을 얻는 것에 의해 제조하며, 이것은 재구성되면 ISA247의 생체내 대사를 모방하는데 사용될 수 있다. 대사산물이 마이크로솜 제제에서 생성되면, HPLC/MS 또는 NMR 또는 기타 수법을 이용하여 ISA247 대사산물을 단리 및 분석할 수 있다.

미생물을 사용한 생체변환을 통한 ISA247 대사산물의 제조

본 발명의 구체예로서, ISA247의 대사산물은 미생물의 배양액 및 생체변환을 이용하여 제조할 수 있다. 특정 미생물은 인간의 사이토크롬 P-450 계의 활성을 모방하는 능력을 갖기 때문에 생체변환을 이용하여 인간에서 ISA247 대사산물에 상응하는 ISA247의 대사산물을 생성할 수 있다.

생체변환 방법에 유용할 수 있는 미생물의 예는 액티노플라네스 (Actinoplanes) 종 (예컨대 ATCC 번호 53771, 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 미국 버지니아 매나사스 소재), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)(예컨대 ATCC 13273), 사카로폴리스포라 에리쓰라에아(Saccharopolyspora erythraea)(예컨대 ATCC 번호 11635) 및 스트렙토마이세스 세토니 (Streptomyces setonii)(예컨대 ATCC 번호 39116)을 포함한다. 다른 유용한 미생물은 아미콜라타 아우토트로피카(Amycolata autotrophica)(예컨대 ATCC 번호 35204, 슈도노카르디아 아우토트로피카(Pseudonocardia autotrophica)로 공지된 것), 스트렙토마이세스 칼리포르니카(Streptomyces californica)(예컨대 ATCC 번호 15436), 사카로폴리소라 히르수테(Saccharopolysora hirsute)(예컨대 ATCC 번호 20501), 스트렙토마이세스 라반둘라애(Streptomyces lavandulae) (예컨대 ATCC 55209), 스트렙토마이세스 아우레오파시엔스(Streptomyces aureofaciens) (예컨대 ATCC 10762), 스트렙토마이세스 리모수스(Streptomyces rimosus) (예컨대 ATCC 28893, 페닐실리움 엑스판숨 (Penicillim expansum)으로 공지된 것), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtillis) (예컨대 ATCC 55060), 및 노카르디아 아스테로이드 (Nocardia asteroids) (예컨대 ATCC 3318, 노카르디아 파르시니카 (Nocardia farcinica)로 공지된 것)를 포함할 수 있다. 다양한 구체예로서, 유용한 미생물은 쿠르불라리아 루나타(Curvularia lunata) (예컨대 ATCC 12017 또는 UAMH 9191, 유니버시티 어브 알베르타 마이크로푼갈 콜렉션으로부터 입수, 캐나다 알베르타 에드몬톤 헤르바륨 소재), 쿠닝하멜라 에키눌라타 변종 엘레간스 (Cunninghamella echinulata var. elegans)(예컨대 UAMH 7370, ATCC 36112), 쿠르불라리아 에키눌라타 변종 블레이크슬레나(Curvularia echinulata var. blakesleena)(예컨대 UAMH 8718, ATCC 8688a), 쿠닝하멜라 에키눌라타 변종 엘레간스(Cunninghamella echinulata var . elegans)(예컨대 UAMH 7369, ATCC 26269), 베아우바리아 바시아나(Beauvaria bassiana)(예컨대 UAMH 8717, ATCC 7159), 액티노마이세테스(Actinomyetes) (예컨대 ATCC 53828), 액티노플라네스(Actinoplanes)(예컨대 ATCC 53771), 쿠닝하멜라 에키눌라타(Cunninhamella echinulata)(예컨대 UAMH 4144, ATCC 36190), 쿠닝하멜라 에키눌라타(Cunninghamella echinulata)(예컨대 UAMH 7368, ATCC 9246), 쿠닝하멜라 바이니에레(Cunninghamella bainiere)(에키눌라타)(echinulata)(예컨대 UAMH 4145, ATCC 9244) 및 사카로폴리스포라 에리쓰라에(Saccharopolyspora erythrae)(예컨대 ATCC 11635)를 포함할 수 있다.

본 발명자들이 알고 있는 한, 통상적인 생체변환 방법은 시클로스포린 및 ISA247의 대사산물을 생성하는데 그리 성공적이지 못하였는데, 아마도 이들 화합물의 친유성 성질에 기인한 것으로 생각된다. 어떠한 이론에 얽매이는 것은 아니나, ISA247과 같은 소수성 화합물은 배양 및 방법을 실시하기 위해 사용되는 필터, 칼럼 및 기타 하드웨어에 부착되는 경향이 있고 또 ISA247과 같은 생성물 대사산물은 배양 매질에 약물을 무균적으로 부가하기 위해 사용되는 필터 표면에 부착되는 경향이 있는 것으로 생각된다.

본 발명의 구체예로서, CsA 및 ISA247의 대사산물을 비롯한 ISA247의 대사산물은 약물 및 1 이상의 계면활성제의 혼합물을 제조한 다음 이 약물-계면활성제 혼합물을 미생물의 생장 배지에 직접 부가하는 것에 의해 생성될 수 있다. 상기 계면활성제는 멸균될 수 있다. 상기 단계를 실시할 때, 본 발명자들은 생체변환이 보다 생산적인 것이라는 것을 알게 되었다. 본 방법의 특정 구체예로서, 계면활성제는 Tween이다.

적합한 계면활성제는 미생물 생장 환경에 도입되기 전에 오토클레이브를 견딜 수 있다. 적합한 계면활성제는 생체적합성 계면활성제이며 또 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비이온성 계면활성제, 예컨대 PEG 300, PEG 400, PEG 600 (BASF가 제조한 Lutrol®E 300, Lutrol®E 400, Lutrol®E 600, Lutrol®F 127 및 Lutrol®F 68로 공지된 것임); Labrasol® (Gatte Fosse, Cedex France)와 같은 카프릴로카프로일 마크로골-8 글리세리드; Tween® 20, Tween® 21, Tween® 40, Tween® 80, Tween® 80K, Tween® 81 및 Tween® 85 (ICI Americas Inc.제조, 브릿지워터 뉴저지, 알드리히 케미컬 컴패니 인코포레이티드로부터 구입, 위스콘신 밀워키 소재)과 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르; 글리세린(BDH Fine Chemicals, 토론토 온타리오); 피마자유(Wiler Fine Chemicals Ltd., 런던 Ont. 소재); 이소프로필 미리스테이트(Wiler Fine Chemicals Ltd, London Ont.); 크레마포르 EL (Sigma Chemicals, St Louis MO); 및 Pluronics®F127 및 Pluronics® L108 (BASF)과 같은 폴옥사머를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 계면활성제는 틸옥사폴 [4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페놀 중합체와 포름알데히드 및 옥시란]과 같은 윤활제 또는 유화제로 작용할 수 있는 것; 폴리에톡시화 피마자유, 예컨대 Cremaphor A25, Cremaphor A6, Cremaphor EL, Cremaphor ELP, Cremaphor RH(BASF 제조) 및 롱 플랑 컴패니로부터 구입한 Alkamuls EL 620; 폴리에톡시화된 수소화된 피마자유, 예컨대 HCO-40; 및 폴리에틸렌 9 피마자유를 포함한다.

사용될 수 있는 다른 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80; Cremaphor RH; 폴옥사머; Pluronics L10, L31, L35, L42, L43, L44, L61, L62, L63, L72, L81, L101, L121, L122; PEG 아몬드 글리세리드; PEG 20 옥수수 글리세리드 등을 포함한다. 적합한 계면활성제는 또한 알킬글루코시드; 알킬말토시드; 알킬티오글루코시드; 라우릴 마크로골글리세리드; 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르; 폴리옥시에틸렌 알킬페놀; 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르; 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체; 폴리글리세롤 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 글리세리드; 폴리옥시에틸렌 스테롤; 폴리옥시에틸렌 식물유; 폴리옥시에틸렌 수소화된 식물유; 폴리옥시에틸렌 알킬에테르; 폴리옥시에틸렌 글리콜 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 글리세롤 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 -폴리옥시프로필렌 블록 공중합체; 폴리글리세롤 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 글리세리드; 폴리옥시에틸렌 식물유; 폴리옥시에틸렌 수소화된 식물유; PEG-10 라우레이트, PEG-12 올레에이트, PEG-20 라우레이트, PEG-32 라우레이트, PEG-32 디라우레이트, PEG-12 올레에이트, PEG-15 올레에이트, PEG-20 올레에이트, PEG-20 디올레에이트, PEG-32 올레에이트, PEG-200 올레에이트, PEG-400 올레에이트, PEG-15 스테아레이트, PEG-32 디스테아레이트, PEG-40 스테아레이트, PEG-100 스테아레이트, PEG-20 디라우레이트, PEG-25 글리세릴 트리올레에이트, PEG-32 디올레에이트, PEG-20 글리세릴 라우레이트, PEG-30 글리세릴 라우레이트, PEG-20 글리세릴 스테아레이트, PEG-20 글리세릴 올레에이트, PEG-30 글리세릴 올레에이트, PEG-30 글리세릴 라우레이트, PEG-40 글리세릴 라우레이트, PEG-40 팜 알곡유, PEG-50 수소화된 피마자유, PEG-40 피마자유, PEG-35 피마자유, PEG-60 피마자유, PEG-40 수소화된 피마자유, PEG-60 수소화된 피마자유, PEG-60 옥수수유, PEG-6 카프레이트/카프릴레이트 글리세리드, PEG-8 카프레이트/카프릴레이트 글리세리드, 폴리글리세릴-10 라우레이트, PEG-30 콜레스테롤, PEG-25 피토스테롤, PEG-30 콩 스테롤, PEG-20 트리올레에이트, PEG-40 소르비탄 올레에이트, PEG-80 소르비탄 라우레이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, POE-9 라우릴 에테르, POE-23 라우릴 에테르, POE-10 올레일 에테르, POE-20 올레일 에테르, POE-20 스테아릴에테르, 토코페릴 PEG-100 숙시네이트, PEG-24 콜레스테롤, 폴리글리세릴-10 올레에이트, 수크로오스 모노스테아레이트, 수크로오스 모노라우레이트, 수크로오스 모노팔미테이트, PEG10-100 노닐 페놀 시리즈, PEG 15-100 옥틸 페놀 시리즈, 폴옥사머; PEG-35 피마자유, PEG-40 수소화된 피마자유, PEG-60 옥수수유, PEG-25 글리세릴 트리올레에이트, PEG-6 카프레이트/카프릴레이트 글리세리드, PEG-8 카프레이트/카프릴레이트 글리세리드, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 토코페릴 PEG-1000 숙시네이트, 및 PEG-24 콜레스테롤, 폴옥사머를 포함한다. 또한 오일, 예컨대 아몬드유; 바바수유; 보라지유(borage oil); 까막까치밥 종자유; 카놀라유; 코코넛유; 옥수수유; 면실유; 앵초유; 포도씨유; 땅콩유; 겨자씨유; 올리브유; 팜유; 팜 알곡유; 낙화생유; 평지유; 잇꽃유; 참기름; 상어간유; 콩기름; 해바라기유; 수소화된 피마자유; 수소화된 코코넛유; 수소화된 팜유; 수소화된 콩기름; 수소화된 식물유; 수소화된 면실유 및 피마자유; 부분적으로 수소화된 콩기름; 대두유; 글리세릴 트리카프로에이트; 글리세릴 트리카프릴레이트; 글리세릴 트리카프레이트; 글리세리 트리운데카노에이트; 글리세릴 트리라우레이트; 글리세릴 트리올레에이트; 글리세릴 트리리놀레에이트; 글리세릴 트리리놀레네이트; 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트; 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/라우레이트; 글리세릴 트리카프릴레이트;카프레이트;리놀레에이트; 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/스테아레이트; 포화 폴리글리콜화된 글리세리드; 리놀레 글리세리드; 카프릴릭/카프릭 글리세리드도 또한 사용될 수 있다. 또한 계면활성제 및/또는 오일 및/또는 알코올의 혼합물도 사용될 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에서, 모 화합물은 활발하게 생장하는 미생물 배양액에 부가하기 전에 에탄올과 같은 알칸올과 적합한 비이온성 계면활성제의 혼합물이다. 모 화합물이 알코올과 혼합되면, 알코올은 에탄올일 수 있다. 부가적인 적합한 알코올은 메탄올 및 당해 분야에 공지된 기타 적합한 알코올을 포함한다.

생장 배지에 미생물을 함유하는 생체반응 혼합물에 모 화합물-계면활성제 혼합물을 부가한 후, 상기 생체반응은 모 화합물이 대사되는 조건하에서 일정 시간 동안 진행된다. 소망하는 시간 후, 대사산물을 생체반응 혼합물로부터 추출하고, 예컨대 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 스펙트럼 분석(HPLC-MS)와 같은 크로마토그래피에 의해 분리 정제한다. 핵자기 공명 분석을 이용하여 개별 대사산물이 다른 것으로부터 단리되었는지 확인하고 또 그의 구조도 확인하였다.

본 발명의 일부 구체예로서, 에탄올 중의 ISA247은 글리세린과 혼합된 다음 사카로폴리스포라 에리쎄라에아 (Saccharopolyspora erytheraea) ATCC 11635를 함유하는 생체변환 계에 부가하였다. 다른 구체예로서, ISA247을 생체변환계에 부가하기 전에 PEG 400을 에탄올 중의 ISA247과 혼합한다. 다른 구체예로서, ISA247을 생체변환계에 부가하기 전에 에탄올 중의 ISA247과 피마자유를 혼합한다. 다른 구체예로서, ISA247을 생체변환 계에 부가하기 전에, 이소프로필 미리스테이트를 에탄올 중의 ISA247과 혼합였다. 다른 구체예로서, ISA247을 생체변환계에 부가하기 전에 Cremaphor를 에탄올 중의 ISA247과 혼합한다. 다른 구체예로서, ISA247을 생체변환 계에 부가하기 전에 Labrasol®을 에탄올 중의 ISA247과 혼합하였다. 다른 구체예로서, ISA 247을 생체변환 계에 부가하기 전에 Tween40을 에탄올 중의 ISA247과 혼합하였다.

ISA247 대사산물의 분석 및 설명

ISA247의 대사산물은 이들의 화학적 특징 및 이들의 역학적 변수에 따라 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 함께 질량 분광측정과 결합된(HPLC-MS 또는 LC-MS/MS)것을 이용하여 분리할 수 있다.

본 발명자들은 질량 분광측정과 조합된 액체 크로마토그래피 수법을 이용하여 ISA247 대사산물을 분석하는 정량적 및 정성적 방법을 개발하였다. 이들 방법은 생체내 및 시험관 내에서 생산된 ISA247 대사산물을 단리하고 특징화할 수 있으며 또 약물동태학 연구의 일부로서 전체 혈액 또는 기타 체액 중의 ISA247 대사산물의 양적 모니터링에 아주 적합하다.

분석물의 확인은 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 데이터 및 전자스프레이 이온화(ESI) 질량 스펙트럼 데이터로부터 얻은 구조-특이적 이온 단편 정보로부터 얻은 체류시간을 기초로 하여 실시하였다. 도 6은 SCIEX^TM 트리플 쿼드 질량 분광계를 이용하여 MRM 모드(Multiple Reaction Monitoring mode)의 LCMS 트레이스이다.

도 6의 HPLC-MRM 스캔은 인간 전체 혈액으로부터 단리한 전형적인 ISA247 대사산물을 도시하며 또 간 마이크로솜으로부터 및 생체변환 공급원으로부터 제조한 ISA247 추출물에 대해 관측한 LC-MS 단편화 프로필과 일치한다. 도 6의 MRM 스캔은 1271/1113 범위에서 4개의 피이크를 확인하며, 비-대사(non-metabolized) 표준에 의해 확인된 바와 같이, ISA247에 대하여 적어도 4개의 상이한 디올 피이크(디올(1), 디올(2), 디올(3) 및 디올(4)), IMXnX(2), IMXnX(4) 및IMXnX(6)으로 라벨링된 1239/1115 범위에서의 3개의 작은 피이크, IMX(1), IM9, IM4 및 IMX(2)로 라벨링된 1253/1225 범위에서 2개의 피이크 및 1237/1113에서 1개의 대형 피이크를 나타낸다. 몇 개의 부가적인 피이크가 나타나지만 라벨링은 되지 않았다.

변환된 ISA247의 HPLC 정제된 물질의 구조는 이하의 일반적 조건을 이용한 핵자기 공명(NMR) 수법을 이용하여 밝혀졌다. 1D 및 2D NMR 스펙트럼은 Varian Inova 800 및/또는 500 MHz 상에 및/또는 Varian Mercuryplus 400 MHz 분광기 상에, 25- 27℃에서 벤젠-d6 중에 기록하였다. 벤젠 시그널은, 참조로 ¹H-NMR에 대해 δ 7.15 ppm에 설정되었고 또 ¹³C-NMR에 대해 δ 128.06 ppm으로 설정되었다. 샘플 농도 0.5 ~ 1 mg/~0.7 ml의 벤젠 d₆ 을 사용하였다. 얻어진 스펙트럼은 ACD/Labs (Advanced Chemistry Development Inc. 제조, 캐나다 토론토 소재)의 2D NMR Processor 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

아미노산-1에서 변형: 디올 , 시클릭 및 에폭사이드

도 6에 도시된 바와 같이, 인간 전체 혈액으로부터 단리된 대사산물은 약 6.5 내지 8 분의 체류시간 및 1271/1113 m/z의 모(parent) 이온/단편 이온 쌍에서 일련의 주요 대사산물 피이크가 생김을 나타낸다. 이것은 모 ISA247 질량에 대하여 34 질량 단위의 1237 m/z의 부가를 나타낸다. 또한 대사산물을 포함하는 화학적 변형은 단편 이온이 1113 m/z의 질량을 갖기 때문에 아미노산-1 잔기에 편재화되어 있다고 결론지을 수 있다. 이 정보로부터, 또한 상기 변형은 ε 탄소와 θ 탄소 위치 사이의 아미노산-1의 디엔 영역에서 디올 형성일 것이라는 가정을 할 수 있다.

디올 대사산물은 구조적 분석을 더하기 위하여 HPLC로부터 단리될 수 있다. 물질의 공급원, 화학적 합성에 의한 것인지 또는 생체변환, 마이크로솜 또는 혈액 또는 요로부터 단리된 것인지에 따라, HPLC에 나타나는 피이크는 상이할 수 있다. 예컨대 화학적 합성은 디올 구조의 R 및 S 부분입체이성질체로서 존재하는 디올을 생성할 수 있는 반면에, 효소적 대사는 디올 구조의 1개 부분입체이성질체를 형성할 수 있고 다른 하나는 생성할 수 없다. 효소는 1개 방향만의 물질을 선호하고 다른 방향의 것은 선호하지 않으므로, 1개 부분입체이성질체를 생성하고 다른 부분입체이성질체는 생성하지 않는다. 디올 대사산물의 부분입체이성질체는 상이한 화학적 특성을 갖기 때문에 HPLC 상에서 상이한 피이크로서 나타나며, 이들은 칼럼을 통하여 상이하게 이동한다. 따라서 상이한 수단, 화학적 합성 또는 생체변환에 의해 생성된 대사산물에 대한 HPLC 트레이스는 상이한 피이크를 가질 수 있다. 따라서, 도 6에 도시된 HPLC는 인간 전체혈액으로부터 단리되지 않은 대사산물에 대한 HPLC 트레이스의 대표가 아닐 수 있음이 중요하다. 또한, 디올에 대해 이용된 명명, 즉, IM1-d-1은 도 6에 도시된 HPLC 피이크에 반드시 상응하는 것은 아니다. 이 명명은 표 1에 나타낸 구조를 기초로 고려해야 한다.

화학적 합성, 생체변환 또는 혈액 또는 요로부터 단리된 것에 의해 생성된 ISA247의 디올 대사산물의 구조를 확인하기 위하여 ¹H-NMR 및 2D NMR 수법을 이용하였다. 도 8은 IM1-d-1 화합물의 HPLC 정제된 생성물로부터 얻은 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시하며, 상기 생성물은 ISA247의 E 및 Z 이성질체에 대한 ¹H-NMR 스펙트럼과 비교함으로써 상기 기재된 미생물 생체변환법(KI-2로 라벨링됨)에 의해 제조되었다. 3개 스펙트럼의 대조는 약 δ 6 및 7 ppm 사이의 디엔 영역에서 IM1-d-1 또는 IM1-d-1 ¹H-NMR 에서의 변화를 나타내며, 이것은 aa-1 측쇄 변환을 나타낸다. 아미드 NH 양성자 및 N-메틸 양성자 영역은 대사산물이 2개 주요 생성물과 미량의 오염물의 혼합물임을 나타내며, 4개의 NH 및 7개의 N-메틸 시그널이 주요 생성물로부터 각각 생기는 것으로 추정된다. 이러한 추정은 아미드 양성자 시그널을 이용하는 상관관계 스펙트럼에 의해 확증된다. 관련 α 양성자와 측쇄 메틸 기의 아미드 NH 양성자 교차-피이크 상관관계는 IM1-d-1의 2D TOCSY 스펙트럼으로부터 얻었다(도 9). NMR 분석을 기본으로 하여, 상기 디올 분획(KI-2)은 2개 부분입체이성질체의 1:1 혼합물로 구성되며, 아미노산-1 (aa-1)의 η탄소에서 입체화학이 상이하다. 트랜스 이중결합 구조는 J_εζ = 15.0 Hz를 갖는 부분입체이성질체에 대해 커플링 상수로부터 결정하였다. IM1-d-1의 제안된 구조는 도 10에 도시한다.

도 10은 IM1-d-1의 구조가 트랜스-ISA247의 아미노산-1 (aa-1) 측쇄의 η 및 θ 위치에서 디올임을 나타낸다. η 위치는 키럴 중심이기 때문에, IM1-d-1 화합물은 2개의 부분입체 이성질체로 존재하며, 이들은 도 10에 도시한 바와 같이 아미노산-1의 η 탄소에서 구조가 상이하다. 2개의 부분입체이성질체는 상이한 NMR 스펙트럼을 제공하는데, 이는 각 부분입체이성질체가 특정 물리화학적 특성을 갖는 상이한 화학 존재(entity)이기 때문이다.

놀랍게도, NMR 연구는 생체변환법을 이용하여 대사산물이 만들어진(진균 사용, KI-2 샘플) 시스:트랜스 ISA247 50:50의 출발물질이, 도 10에 도시된 바와 같이, 트랜스 구조로 도시된 1:1 비율로 IM1-d-1 부분입체이성질체의 혼합물을 초래함을 나타내었다. 그러나, 화학적 합성법으로 제조된 주로 트랜스-ISA247 출발물질(KI-2A 샘플)은 HPLC-MS에 의해 단리되고 NMR을 이용하여 연구될 때 3:2 비율로 IM1-d-1 부분입체이성질체의 혼합물을 초래함을 보여준다. IM1-d-1은 도 42 및 43에 도시된 바와 같이 트랜스-ISA247로부터 형성된 대사산물이다. KI-2A NMR 스펙트럼에서 관찰된 이성질체 비율의 차이는 각 부분입체이성질체에 대한 양성자 화학적 이동 지정을 얻을 수 있게 하였지만, 도 10에 도시된 바와 같은 구조의 하나를 NMR에 의한 비율 측정에 지정할 수는 없었다. 이러한 차이는 대사산물이 천연산출 효소(간 또는 진균으로부터)를 사용하여 제조되었는지 또는 실험실에서 화학적 반응을 이용하여 제조되었는지에 따라 1개 부분입체이성질체 대사산물의 우선적 생산 가능성을 나타낸다. 예컨대, 화학적 합성 동안, 화학적 중간체의 방향은 1개 이성질체가 다른 것에 비해 더 많은 부분입체이성질체 혼합물을 생성할 수 있다. 다르게는, 생체변환 과정은 부분입체이성질체 대사산물을 생성할 수 있고, 이들 부분입체이성질체의 1개는 IM1-d-1과는 상이한 다른 대사산물로 우선적으로 가공될 수 있고, 이는 HPLC에서 상응하는 피이크로 존재하는 생성물의 비율을 불균등하게 만든다. 다르게는, 화학적 과정 또는 생체변환 과정은 IM1-d-1 화합물과는 상이한 다른 대사산물로 가공될 수 있는 부분입체이성질체를 생성할 수 있고, 이것은 HPLC를 이용한 특정 피이크로 존재하는 생성물의 비율을 불균등하게 한다. 표 1은 상기 NMR 분석을 기초로 한 IM1-d-1에 대한 화학적 이동 지정을 나타낸다. 이 표는 NMR에 의해 확인된 1개 화합물을 나타내지만, 1 이상의 화합물이 상기 샘플에서 분명하였다. 제2 화합물에 대한 화학적 이동 정보는 표 1에 나타내지 않았다. 그러나, 2개의 말단 디올 부분입체이성질체 IM1-d-1를 도 43에 도시한다.

연구할 두번째 디올(샘플 KI-3A), IM1-d-2은 화학적으로 변형된 ISA247(시스: 트랜스 = 5: 95)로부터 HPLC 정제를 이용하여 단리하였고 ¹H-NMR 및 2D TOCSY에 의해 분석하여 그의 구조를 결정하였다. 도 11은 트랜스-ISA247의 ¹H-NMR 스펙트럼과 비교하여 IM1-d-2의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 이들 ¹H-NMR 스펙트럼의 비교는 δ 6 내지 7 ppm 사이의 디엔 양성자의 손실을 나타내며, 이것은 aa-1의 측쇄에서 변환을 의미한다. 보통 영역에서 4개의 아미드 NH 더블렛 및 7개의 N-메틸 싱글렛의 관찰은 시클릭 펩티드 구조가 완전하다는 것을 의미한다. 도 12는 디올의 2D COSY 및 TOCSY 스펙트럼을 도시한다. 이들 스펙트럼은 변화가 관찰된 aa-1 측쇄를 제외하고는, 대부분의 양성자의 직접적 지정을 가능하게 하는 시그널의 연결성(connectivity)을 제공한다. δ 3.8 내지 6.2 ppm 사이의 α 양성자 영역의 COSY 스펙트럼의 확장은 도 13에 도시하며, 실선은 교차 피이크 상관관계를 나타낸다. 이는 양성자의 일부 부가적 지정을 갖는 도 14에 도시된 확대된 1D ¹H-NMR 스펙트럼으로 나타낸다.

COSY 스펙트럼은 다음 영역에서 4개의 교차 피이크 상관관계에 있음을 나타내었다:

δ 5.80 ppm에서의 시그널로부터 δ 5.55, 4.29 및 4.16 ppm에서의 시그널까지

δ5.55 ppm에서의 시그널로부터 δ 4.16 내지 4.02 ppm 에서의 시그널까지

d 5.24 ppm에서의 1-α 시그널로부터 δ 4.26 ppm에서의 1-β의 시그널까지

δ 4.29에서의 시그널로부터 δ 4.16에서의 시그널까지

δ 5.80 ppm 내지 5.55 ppm에서 관찰된 시그널은 올레핀 양성자(-CH=CH-)를 나타내고, 또 δ 4.29, 4.16 및 4.02 ppm의 시그널은 알코올성 탄소(>CH-OH)에 부착된 양성자를 의미한다. δ 4.29 및 4.16 ppm의 시그널 및 이들 시그널과 δ5.80 ppm에서의 올레핀성 양성자 시그널 사이의 커플링 관계는 δ 4.29 및 4.16 ppm의 시그널이 이중결합(-C=CH-)에 부착된 일차 알코올(HO-CH₂-)의 메틸렌 양성자인 것으로 제시되었다. 또한 δ 4.02 ppm에서의 시그널과 δ 5.55 ppm에서 올레핀 양성자와의 커플링은 이들 양성자에 대하여 다음의 전체 구조를 나타내었다:

상기 구조는 δ 5.55 및 δ 4.16 ppm에서의 양성자 사이의 COSY 스펙트럼에서 관찰된 긴 범위의 4개 결합 커플링(⁴J) 연결성과 일치한다.

이중결합 구조는, 도 15에 있는 이중결합 양성자의 확대된 1D 스펙트럼에 도시된 바와 같이, 상기 관찰된 커플링 상수 15.2 Hz로부터 트랜스로 지정되었다. δ 5.80 ppm에서 시그널의 스플릿(splitting) 패턴(더블렛 및 트리플렛)은 δ 4.29 ppm과 4.16 ppm에서의 메틸렌 양성자와 결합 및 δ 5.55 ppm에서 다른 이중결합 양성자로 인하여, 제시된 구조와 일치한다. δ 5.55 ppm에서 이중결합 양성자에 대해 관찰된 더블렛 및 더블렛 시그널의 약간의 넓은 외관은 δ 4.16 ppm에서의 시그널을 갖는 ⁴J 의 존재에 의해 설명될 수 있다.

aa-1 측쇄 양성자의 나머지의 이하 시그널 연결성은 COSY 스펙트럼으로부터 부가적으로 얻을 수 있다: δ 4.26 ppm에서의 1-β로부터 δ 2.28 ppm에서의 1-γ까지; δ 2.28 ppm에서의 1-γ로부터 δ 1.88 ppm에서의 1-δ₁; δ 1.59 ppm에서의 1-δ₂ 및 δ 1.45 ppm에서의 1-γCH₂ 까지; δ 4.02 ppm에서의 1-ε로부터 δ 1.88 ppm에서의 1-δ₁, δ 1.59 ppm에서의 1-δ₂ 까지. 이들 상관관계는 부분적으로 확대된 COSY 스펙트럼의 도 16에 도시되어 있다. 상기 분광학적 발견은 IM1-d-2 구조가 도 17에 도시된 바와 같음을 나타낸다.

도 17은 2개 부분입체이성질체 형태의 IM1-d-2 의 구조를 도시한다. 당업자라면 도 17에 도시된 구조가 aa-1에서 트랜스 이중결합 구조로 존재하고 또 도 42에 기계적으로 도시된 바와 같이 ε 위치에서 합동된 물 공격에 의한 에폭사이드(IM1-e-2) 개환에 의해 형성된 이중결합 이동된 생성물(IM1-d-2)임을 알 것이다. 따라서, 상기 화합물은 도 17에 도시된 부분입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 그러나 상기 기재한 IM1-d-1 구조와는 달리, 상기 화합물은 비교적 깨끗한 NMR 스펙트럼을 나타내었다. 따라서, 상기 구조는 도 17에 도시된 부분입체이성질체 중의 하나인 것으로 제안된다. 도 18은 탄소에 부착된 양성자의 화학적 이동 지정을 갖는 IM1-d-2의 아미노산-1 구조를 도시한다. 화학적 이동 지정을 갖는 IM1-d-2의 스펙트럼 데이터를 표 2에 나타낸다.

1) N-메틸 시그널에 대한 화학적 이동은 COSY 및 TOCSY 스펙트럼으로부터 얻은 4개 결합 커플링(⁴J) 및 5개 결합 커플링((⁵J) 상관관계를 기본으로 하여 지정되었다.

2) 트랜스 구조는 aa-1의 H(ζ) 및 H(η) 사이의 15.2 Hz의 양성자 커플링 상수를 기본으로 하여 aa-1에서 이중결합에 대해 지정되었다.

3) 화학적 이동(ppm)은 δ 스케일로 표시한다.

세번째 디올 대사산물, IM1-d-3 (샘플 KI-3)은 ISA247(시스: 트랜스 = 50: 50)의 미생물 생체변환으로부터 HPLC 정제에 의해 단리하였다. IM1-d-1 화합물과 함께 트랜스-ISA247 (E-ISA247) 및 시스-ISA247 (Z-ISA247)과 비교한 IM1-d-3 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼을 도 19에 도시한다. 도 19에 도시된 NMR 스펙트럼의 비교는 δ 6 내지 7 ppm 사이의 디엔 영역에서 IM1-d-3 (샘플 KI-3) ¹H-NMR 스펙트럼에서 변화를 나타내며, 이는 aa-1의 측쇄에서 변환을 의미한다. 질량 연구 정보는 디올의 형성에 의한 아미노산-1 측쇄에서 변화를 나타내었다. 이들 변화는, 스펙트럼 비교가 IM1-d-3 및 IM1-d-1가 구조적으로 상이하지만, IM1-d-1 대사산물로부터 얻은 것과 유사하다.

스펙트럼의 아미드 NH 양성자 및 N-메틸 양성자 영역은 1개 주요 및 몇 개의 미량 오염물의 혼합물임을 나타내었다. 따라서 NMR 분석은 2D TOCSY 스펙트럼(도 20 참조)으로부터 얻은 교차 피이크 상관관계에 의해 KI-3 (IM1-d-3)의 주요 생성물에 집중되었다. 아미드 NH 양성자 영역에서 2D TOCSY 스펙트럼은 주요 아미드 NH 양성자가, ISA247 및 그의 대사산물에서 전형적으로 관찰되는 바와 같이, aa-2, aa-5, aa-7 및 aa-8의 양성자임을 나타내고 또 2-γCH₃, 7-βCH₃, 및 8-βCH₃ 와 같은 특징적 시그널과의 2D 상관관계를 관찰함으로써 확인함을 보여준다. 아미드 양성자 상관관계의 확대된 TOCSY 스펙트럼은, 일부 이동 지정이 표시된, 도 21 및 22에 도시되어 있다. 주요 대사산물의 아미노산 측쇄 양성자의 화학적 이동은 TOCSY 스펙트럼 상관관계를 기본으로 하여 유사하게 지정되었다. 4개 아미드 양성자 및 7개 N-메틸기 싱글렛 및 ISA247 및 다른 대사산물의 패턴에 대하여 유사한 시그널 연결 패턴은 모 ISA247의 시클릭 고리 구조가 완전하다는 것을 보여준다.

2D TOCSY 스펙트럼의 α 양성자 영역의 면밀한 조사는 아미노산-1 측쇄 양성자의 δ 5.86 - 5.62 - 4.62 - 3.72 - 3.60 ppm (도 24 참조)에서의 상관관계 시그널 세트를 나타내었다. 이것은 상기 영역에서 확대된 1D 스펙트럼에도 도시되었다(도 23 참조). δ 5.86 (9-α와 중첩) 및 5.62 ppm에서의 양성자 시그널은 올레핀 양성자(-CH=CH-)를 나타내며; δ 5.62에서의 시그널은 2차 알코올 양성자(>CH-OH)를 나타내며; 및 δ3.72 및 3.60 ppm에서의 시그널은 일차 알코올 양성자(-CH₂-OH)를 나타낸다. 도 24에서 실선으로 표시한 이들 양성자 상관관계는, IM1-d-3의 δ5.62 ppm에서의 양성자가 더욱 다운필드(downfield)로 이동하지만, 대사산물 IM1-d-1 (KI-2 또는 KI-2A)에서 관찰된 것과 유사하다. 따라서, 대사산물 IM1-d-3 상에서 NMR 스펙트럼 및 질량 정보는 아미노산-1에서 디올 형성과 일치한다.

δ5.62 ppm에서 시그널의 1차 분석(도 25 참조)은 커플링 상수 9.6 Hz의 트리플렛을 나타내며, 이는 이중 결합의 추정 카운터(counter) 양성자가 9-α와 중첩되고 분석에는 이용할 수 없을지라도, 시스 구조의 이중 결합을 나타낸다. δ3.72 및 3.60 ppm에서의 화학적 이동은 구조 기(-CH₂-OH)가 이중 결합에 직접적으로 결합되지 않은 것을 제시한다. 따라서, 이들 관찰을 기본으로 하여, 도 26의 구조는 샘플 KI-3, 대사산물 IM1-d-3 중의 주요 생성물임을 제안하였다. IM1-d-3 디올은, 도 26에 도시된 바와 같이, aa-1의 키럴 η 위치에서 상이한 2개의 부분입체이성질체로서 존재할 수 있다. 도 26에 도시된 구조의 η 위치의 입체화학은 결정되지 않았다. 그러나, ISA247로부터 화학적으로 합성된 샘플인 다른 샘플 KI-4A(시스: 트랜스 비율 1:1)을 연구할 때, 샘플 KI-4A의 NMR 분석(도시되지 않음)은, aa-1의 η위치에서 입체화학이 각각 상이한, KI-3 샘플의 주요 성분의 부분입체이성질체임을 보여준다. KI-4A 샘플은 KI-3 샘플에 대하여 도 19 내지 도 25에 제시된 것과는 구별되는 NMR 스펙트럼을 나타내었다. 이들 구조를 확인할 수 있고 또 각 부분입체이성질체를 단리하고 연구할 수 있었지만, 1개 부분입체이성질체 구조를 1개 샘플 또는 다른 샘플에 지정할 수는 없었다. aa-1의 η 위치에서 R- 또는 S-이성질체가 KI-4A 또는 KI-3 샘플에 속하는지 결정할 수는 없었다.

도 26은 IM1-d-3이 aa-1의 η탄소에서 키럴 중심을 갖는 시스 구조의 디올임을 나타내므로, 2개의 부분입체이성질체(KI-3 및 KI-4A)로서 존재한다. IM1-d-3은 IM-1-d-3 중의 이중결합이 시스 구조이고 또 IM1-d-1이 트랜스 구조인 것을 제외하고는 IM1-d-1과 동일한 디올이다. 이러한 차이는 도 6에 도시된 HPLC 스캔에서 IM1-d-1 및 IM1-d-3 대사산물을 분리한다. IM1-d-3에 대한 화학이동 지정은 표 3에 나타낸다.

1) 상기 지정은 TOCSY 스펙트럼을 기본으로 하여 실시하였다.

2) N-메틸 시그널은 이들의 일부가 상호교환될 수 있도록 시험적으로 지정되었다.

3) 화학적 이동(ppm)은 δ 스케일로 표시한다.

4) 시스 구조는 커플링 상수 9.6 Hz의 양성자에 대하여 관찰된 트리플렛을 기초로 aa-1에서 이중결합에 대해 지정되었다.

단리된 4번째 디올은 IM1-d-4 (샘플 KI-8A)이었다. 미량 오염물을 갖는 샘플 KI-8A는 샘플 KI-2A (IM1-d-1) 및 KI-3A(IM1-d-2) 이외에 ISA247 (시스:트랜스 = 5:95)의 화학적 변환으로부터 얻었다. HPLC 단리된 IM-1d-4 (샘플 KI-8A)의 NMR 분석은 δ 6 및 7 ppm 사이에서 디엔 양성자의 손실을 나타내며, 이것은 예상된 바와 같이 aa-1의 측쇄에서 변환을 의미한다. 보통 영역에서 4개의 아미드 NH 더블렛 및 7개의 N-메틸 싱글렛의 관찰은 시클릭 펩티드 구조가 완전하다는 것을 의미한다. 도 27은 IM1-d-4 (샘플 KI-8A) 및 트랜스 ISA247 또는 E-ISA247의 ¹H-NMR 스펙트럼을 비교한다.

IM1-d-4는, 미량의 오염물이 스펙트럼에 보이긴 하지만, 샘플 KI-8의 주요 성분인 것으로 보인다. 다시, 도 28A 및 도 28B에 도시한 2D COSY 및 TOCSY 스펙트럼의 분석은, aa-1 측쇄의 변환에 기인한 스펙트럼의 α양성자 영역에서 관찰된 몇 개의 피이크를 제외하고는, 대부분 양성자에에 대한 이동 지정을 제공하였다. 이러한 비교는 δ 6 및 7 ppm 사이의 디엔 양성자의 손실을 나타내며, 이는 aa-1 측쇄에서 변환을 의미한다. 도 29에 도시된 바와 같은 α 양성자 영역에서 확대된 2D COSY 스펙트럼은 1-α 및 1-β와 미지정(unassigned) 양성자 - aa-1 측쇄 양성자의 교차 피이크 연결성을 나타낸다. 상기 영역의 확대된 1D 스펙트럼은 COSY 스펙트럼으로부터 얻은 일부 피이크 지정 및 피이크 상관관계와 함께 도 30에 도시한다. 각각 1개 양성자로서 인테그레이트된 δ6.00 (ddd), 5.44(dt), 5.15(dt), 4.28(m) 및 3.73 ppm (m)에서의 시그널 연결성은 이들 양성자가 aa-1의 측쇄 양성자와 같이 구조적으로 관련되어 있음을 나타낸다. 이들 중에서, 구별가능한 스플릿 패턴을 나타낸 δ6.00(ddd), 5.44(dt) 및 5.15 ppm (dt)에서의 시그널은 도 31에 도시된 바와 같이 확대되었다.

δ6.00 ppm에서의 화학적 이동은 이 양성자가 J = 17.2 Hz를 갖는 δ5.44 및 J = 10.6 Hz을 갖는 δ 5.15 ppm에서의 양성자와 커플링된 올레핀성 양성자임을 의미하며, 이들 모두는 1.8 Hz의 커플링 상수로 각각 결합되고 E-ISA247 및 Z의 스펙트럼에 나타낸 바와 같이 말단 이중결합 제미날(geminal) 양성자를 나타낸다. 보통 영역에서 4개의 아미드 NH 더블렛 및 7개의 N-메틸 싱글렛의 관찰은 시클릭 펩티드 구조가 완전함을 나타낸다.

IM1-d-4의 전체 구조를 도 32에 도시한다. aa-1의 ε 및ζ탄소는 모두 키럴 중심이다. 따라서, 도 32에 도시된 구조는 4개의 배열구조(configuration)를 취할 수 있다. 도 32에 도시된 바와 같은 구조를 갖는 화합물의 정확한 배열구조는 결정되지 않았다. 그러나, 미량 오염물이 주요 화합물의 aa-1 측쇄의 ε 및ζ 탄소에서 입체이성질체를 함유할 수 있음이 제시되었다.

IM1-d-4의 화학적 이동 지정은 하기 표 4에 나타낸다.

1) N-메틸 시그널에 대한 화학적 이동은 4개 결합 커플링(⁴J)을 기준으로 지정되었다. 5개 결합 커플링(⁵J) 상관관계는 COSY 및 TOCSY 스펙트럼으로부터 얻었다.

2) 화학적 이동(ppm)은 δ 스케일로 표현한다.

고리화된 대사산물, IM1-c-1 (샘플 KI-5)은 ISA247(시스: 트랜스 = 1: 1)의 생체변환으로부터 HPLC 정제에 의해 단리하였다. 상기 대사산물(샘플 KI-5)의 ¹H-NMR 은 E-ISA247 및 Z-ISA247의 ¹H-NMR 스펙트럼과 비교하여 도 33에 도시한다. NMR 분석은 샘플이 부분입체이성질체 혼합물이 아니라 단일 화합물을 함유하고 있음을 보여주었다. 이것은 스펙트럼의 아미드 NH 및 N-메틸 양성자 영역으로부터 분명하였다: 4개의 아미드 NH 양성자 및 7개의 N-메틸 싱글렛 시그널. 도 33에 도시한 바와 같이, 상기 대사산물에 대한 ISA 화합물로부터 얻은 스펙트럼에서의 주요 변화는 디엔 영역(δ 6 - 7 ppm)에서의 양성자 손실이다.

이들 올레핀성 양성자 시그널은 아미노산-1 측쇄에서 생긴 ISA247 분자에 대한 특징이며, 주로 δ 6 - 7 ppm에서 관찰된다. 따라서, 상기 영역으로부터 이들 피이크의 부재는 아미노산-1 측쇄에서 구조 변형을 나타낸다. 아미노산 α 양성자 영역에서 대사산물의 δ 3.9 및 6.0 ppm 사이에서의 확대된 스펙트럼은 피이크의 상부에 나타낸 바와 같이, 특정 α 양성자 및 1-β-양성자에 대한 이동 지정을 갖도록 도 34에 도시하였다. 이들 지정 및 기타는, 도 36에 도시한 바와 같이, 2D 스펙트럼으로부터 얻을 수 있으며, 아미노산-1 측쇄 양성자를 제외하고는 모든 다른 아미노산 사슬 및 N-메틸 양성자를 해석하였다. 따라서, 도 34 중의 δ 5.75 (세기에 의해 1H에 상응), δ4.35 (1H) 및 δ3.94 (2Hs)에서 미지정 시그널은 아미노산-1 측쇄 양성자의 시그널이라고 결론지었다.

δ5.75 ppm에서 피이크의 밀접 조사는 도 35에 도시된 바와 같이 서로에 대해 또한 커플링되는 δ 5.77 및 5.74 ppm에서 공명되는 2개 양성자로 구성됨이 밝혀졌다. 화학적 이동 및 커플링 상수(15.8 Hz)는 트랜스 구조를 갖는 올레핀(-CH=CH-) 기를 제시하였다. 도 36의 2D 스펙트럼은 δ5.75 ppm에서의 시그널이 δ3.94 및 4.35 ppm에서의 피이크와 상관관계가 있음을 보여주며, 즉 시그널 연결성을 나타낸다. 또한 δ 3.94 ppm에서의 멀티플 시그널은 2개 양성자 및 δ 4.35에서의 1개 시그널은 1개 양성자를 설명한다. 따라서, 구조 기(-CH-CH=CH=CH2-)는 이들 피이크의 시그널 연결성을 설명하기 위해 제시되었다(δ5.77, 5.74, 4.35 및 3.9 ppm).

δ4.35 및 3.94 ppm에서 시그널의 화학적 이동은 이들 양성자가 구조: (-O-CH-CH=CH-CH₂-O-)를 갖는 산소 원자 옆의 탄소에 부착되어 있다고 제시하였다. 도 37에 도시된 확대된 DQF-COSY 스펙트럼은 δ 5.77 ppm에서의 시그널이 δ4.35 ppm에서의 시그널에 커플링되고, 또 δ5.74 ppm에서의 시그널이 δ 3.94 ppm에서의 시그널에 커플링됨을 나타내었다. 질량 정보와 조합된 NMR 분석은 도 38에 도시된 바와 같은 IM1-c-1에 대한 구조를 분명히 나타내었다.

측쇄의 ε 위치에서 입체화학은 ROESY 스펙트럼(도 39 참조)으로부터 유추하였다. aa-1 측쇄 양성자에 대한 ROESY 스펙트럼의 면밀한 조사는 이하의 ROE 상관관계를 나타내었다:

이들 관찰을 기준으로 하여, 1M1-c-1에 대한 aa-1 측쇄 구조를 밝혀내었다(도 40). 당업자들은 aa-1 의 ε탄소가 키럴 중심이므로, ε탄소는 도 40에 도시한 바와 같이 R 배열구조일 수 있음을 인식할 것이다. ROESY 스펙트럼의 분석을 기본으로 하여, IM1-c-1 피이크로부터 단리된 대사산물은 주로 R 배열구조이다. 그러나 도 40에 도시된 대사산물은 S 배열구조로 존재할 수도 있다.

어떠한 이론에 얽매이는 것은 아니나, 아미노산-1 잔기에서 대사로 기인한 ISA247의 대사산물의 상기 구조 분석을 기본으로 하여, 도 41에 도시된 반응도를 작성하였다. 이 반응도는 시스-ISA247 또는 트랜스-ISA247로 시작할 수 있다. ISA247(1)의 대사의 첫 단계는 에폭사이드화 반응이다. ISA247의 에폭사이드화는 도 41에서 구조 2, 3 및 6으로 나타낸 IM1-e-1, IM1-e-2 또는 IM1-e-3 구조로 존재할 수 있는 에폭사이드를 초래한다. 이들 에폭사이드는 HPLC에 의해 확인되지 않으며 단리되지 않았다. 이들 에폭사이드는 반응성이 아주 강하다. 이들은 ISA247 및 상술한 변형 산물 사이의 반응에서 중간체 또는 전이 상태일 수 있다.

어떠한 이론에 얽매이는 것은 아니나, 에폭사이드가 일단 형성되면, 물이 에폭사이드를 공격하여서 디올을 형성한다. 도 42는 트랜스 ISA247로부터 ISA247 디올 및 시클릭 aa-1 대사산물을 형성하기 위한 반응 메카니즘을 도시한다. 도 42에서, 반응도 1("1"로 표시된 화살표 참조)에서 물이 IM1-e-1 에폭사이드의 ε 또는ζ 위치를 공격하면, 에폭사이드는 열려서 IM1-d-4 대사산물을 형성할 수 있다. IM1-d-4 대사산물은 ε 또는ζ 탄소에서 2개의 신규 키럴 중심을 가지므로, IM1-d-4 대사산물은 도 42에 도시된 4개의 부분입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 물이 트랜스 에폭사이드의 η 또는 θ 위치를 공격하면, 에폭사이드 IM1-e-2가 열려서 IM1-d-1 대사산물을 형성한다. IM1-d-1 대사산물의 η 탄소는 키럴 중심이다. 따라서, IM1-d-1 대사산물은 도 42에 도시한 바와 같이 부분입체이성질체로 존재한다. 에폭사이드 개환 반응이 IM1-e-2 에폭사이드의 ε 위치에서 물 공격에 이은 이중결합 이동과 합동적으로 실시되면(2로 표시된 화살), 도 42에 도시된 바와 같은 IM1-d-2 구조가 형성된다. IM1-d-2의 ε 탄소는 키럴 중심이다. 따라서, IM1-d-2 대사산물은 도 42에 도시한 바와 같이 부분입체이성질체로서 존재할 수 있다. 한편, IM1-e-2 에폭사이드의 β 탄소의 히드록실 기가 IM1-e-2 에폭사이드의 ε 탄소를 공격하면, 시클릭 대사산물 IM1-c-1이 형성된다. ε 탄소는 키럴 중심이고, 또 IM1-c-1 대사산물은 도 42에 도시한 바와 같은 부분입체이성질체로 존재할 수 있다.

유사하게, 중간체 에폭사이드보다 앞선 디올 형성은 시스-ISA247로부터 출발할 수 있다. 도 43은 IM1-e-2가 확인된 두번째 에폭사이드인 아미노산 1 대사산물을 나타내는 트랜스-에폭사이드 IM1-e-2 (IM1-e-2 트랜스)의 에폭사이드 개환반응에 대한 제시된 반응도를 도시한다. 도 43은 또한 시스-에폭사이드 IM1-e-2 (IM1-e-2시스)의 에폭사이드 개환반응에 의해 1,2-디올을 형성하는 반응도를 도시한다. IM1-e-2 트랜스로부터의 반응은 도 42 및 도 43에 도시한 바와 같이 IM1-d-1 대사산물을 초래한다. 대조적으로, 도 43에 도시한 바와 같이 IM1-d-3은 IM1-e-2 시스로부터 형성된다. 양쪽 IM1-d-1 및 IM1-d-3은 모두 η 탄소에서 키럴 중심을 가지므로, 부분입체이성질체로서 존재할 수 있다.

ISA247의 아미노산-1 측쇄는 콘쥬게이트된 디엔 계를 함유하기 때문에, CsA와 비교할 때 1개 탄소의 연장과 더불어, CsA에 비해서 다수의 디올 및 에폭사이드 구조물이 ISA247 화합물에 대사산물로서 형성된다. ISA247 분자의 아미노산-1 잔기의 말단 탄소는 알켄 작용기의 일부이기 때문에, 아미노산-1 측쇄의 θ-탄소가 모노히드록실화된 CsA-Am1과 유사한 ISA247 대사산물이 존재하지 않는다.

도 57은 E-ISA247로부터 IM-1, IM-1-아세탈, IM1-알데히드 및 IM1-카르복시산의 형성을 나타내는 예시적 반응도이다. 어떠한 이론에 얽매이지 않고, E-ISA247은 상술한 바와 같이 η,θ 알켄에서 에폭사이드화되는 것으로 믿어진다. 상기 에폭사이드는 개환하여 양이온성 중간체를 형성할 수 있으며, 이것은 IM-1-알데히드의 형성에 의해 결합 이동 또는 1,2-히드리드 이동을 거칠 수 있다. 상기 알데히드는 환원되어 알코올 IM-1을 형성하거나, 산화되어 IM-1-카르복시산을 형성하거나, 또는 H₂O 부가를 거쳐 IM1-아세탈을 형성한다.

하기 표 5는 아미노산-1에서 변형을 나타내는 ISA247 대사산물의 목록을 나타낸다. 표 5는 예시적 목록이다. 예컨대, 아미노산 1 대사산물은 5, 6, 7 또는 8원 고리를 포함할 수 있다.

히드록실화 대사산물

도 6의 LCMS 스캔은 1253/1129 m/z의 모 이온/단편 이온쌍에서 4개의 피이크를 나타낸다. 도 6에서 8.5분의 크로마토그래피 체류 시간을 갖는 주요 피이크 1253/1129 이온쌍은 아미노산-1과 다른 아미노산의 측쇄 상에서 히드록실화를 나타낸다. 이것은 아미노산-1에서 보다는 아미노산에서 IMX-형 또는 히드록실화-형 대사산물과 일치한다. CsA 및 ISA247의 HPLC 체류 시간이 동일하고 또 1253/1129 m/z 이온쌍 피이크와 CsA-Am9 표준의 HPLC 체류 시간을 구별할 수 없는 것을 고려할 때, 이 대사산물은 IM9일 것이다.

ISA247(시스:트랜스 = 1:1)의 미생물 변환으로부터 샘플 KI-7C를 얻고 HPLC에 의해 정제하였다. ISA247의 KI-7C, E- 및 Z-이성질체의 1D ¹H-NMR 스펙트럼을 도 44A에 도시한다. 이 비교는 δ 6 및 7 ppm 사이에서 aa-1의 디엔 양성자가 상기 샘플에 영향을 주지 않음을 나타내므로, aa-1은 변환되지 않음을 의미한다. 상기 샘플은 Z 및 E 이성질체의 혼합물임이 밝혀졌다. E 및 Z 이성질체로부터 생긴 4개의 아미드 NH 및 7N-메틸 시그널의 2개 세트는 상응하는 화학적 이동 영역에서 관찰되었고, 이는 펩티드 고리가 샘플(KI-7C)에서 완전하다는 것을 의미하였다. 대부분의 아미노산 양성자는 2D 수법(TOCSY 및 DQF-COSY, 도시되지 않음)에 의해 지정되었다. 측쇄 메틸 기에 연결성이 부족한 아미노산이 aa-9이었다. 따라서, 히드록실화의 질량 분석 결과와 조합하여, 이하의 구조를 갖는 aa-9 측쇄 변환이 제시되었다:

상기와 같은 관찰은 적합한 탄소가 1 또는 2 내지 3개 결합을 통하여 메틸 양성자와 상호관련된 ¹H-검출된 HMQC (Heteronuclear multiple quatum correlation) 및 HBMC (Heteronuclear multiple bond correlation헤테로뉴클리어 멀티플 본드 코릴레이션) 수법(데이터 도시되지 않음)에 의해 또한 확인되었다. 이하는 상술한 헤테로뉴클리어 코릴레이션 수법으로부터 얻은 HMBC 상호관계 및 아미노산-9 (aa-9)측쇄의 메틸 양성자와 관련 탄소의 화학적 이동을 나타낸다. 따라서, KI-7C의 NMR 스펙트럼은 샘플 KI-7C가 IM9임을 나타내었다.

도 44B는 IM9의 구조, 아미노산-9 잔기에서 히드록실화를 도시한다. ISA247의 IM9 대사산물의 아미노산-1 측쇄는 시스 또는 트랜스 구조로 존재할 수 있다. 표 6은 샘플 KI-7C, 즉 IM9 대사산물의 1H-NMR을 기본한 화학적 이동 지정을 나타낸다.

IM4로 라벨링된 도 6의 LCMS 스캔에서 1253/1129 m/z의 모 이온/단편 이온 쌍을 갖는 제2 HPLC 피이크에 상응하는 물질(샘플 KI-6)은 ISA247 (시스:트랜스 = 1:1)의 미생물 변환으로부터 단리하고 ¹H-NMR을 이용하여 분석하였다. IM9에 대한 상기 대사산물의 유사한 질량 정보는 KI-6이 IMX-형 대사산물이라는 것을 나타내었다. KI-6의 ¹H-NMR 스펙트럼은 상기 대사산물이 2개 화합물의 혼합물이라는 것을 나타내고, 또 아미드 NH 양성자 (δ 7.5-8.7 ppm), 디엔(δ 6.0-7.0 ppm) 및 N-메틸 영역(δ 2.5 - 4.0 ppm)에 대한 추가의 조사는 상기 대사산물이 E 및 Z 비율이 3:2인 aa-1에서의 E 및 Z-이성질체의 혼합물이라는 것을 나타내었다. 흥미롭게는, 출발물질은 ISA247의 1:1 비율의 E 및 Z 이성질체였다. 이것은 상기 대사산물에 대한 E-ISA247 및 Z 이성질체의 대사산물의 비율의 차이가 있음을 보여준다.

ISA의 디엔 구조 및 N-메틸 기의 7개 쌍에 대한 특징적 시그널의 존재는 aa-1의 측쇄가 완전하고 또 N-탈메틸화가 생기지 않았음을 제시하였다. 도 45는 E-ISA247 및 Z-ISA247의 ¹H-NMR 스펙트럼과 대사산물(라벨링된 KI-6)의 ¹H-NMR을 비교한 것이다. 디엔 및 아미노산 양성자 영역에서 NMR 스펙트럼의 비교는 δ 5.58 ppm에서 시그널을 분명히 나타내며, 이것은 Z-ISA247 및 E의 NMR 스펙트럼에서 aa-4α 양성자에 상응하며, 이들은 도 45에서 화살표에 의해 나타낸 바와 같이, 스펙트럼에 존재하지 않거나 다른 위치로 이동한다. 이러한 관찰은 aa-4의 α 위치 근처에서 구조적 변화가 생겼음을 의미한다. 측쇄 메틸 양성자 영역(δ 0.5-1.5 ppm)의 NMR 비교는, 도 46에서 화살표로 표시한 바와 같이,새로운 메틸 기 시그널의 출현을 의미한다. 도 46에 도시한 바와 같이, 이들 피이크의 확대는 δ 1.33 및 1.30 ppm, δ 1.29 및 1.26 ppm에서의 싱글렛 메틸 시그널 2세트가 존재함을 밝혀내었다. 피이크 세기 비율 2:3은 δ 1.33 및 1.30 ppm에서의 메틸 시그널이 Z-이성질체이고 또 δ 1.29 및 1.26 ppm에서의 시그널은 E-이성질체임을 제시한다. 도 47은 KI-6의 확대된 메틸 시그널을 도시한다. 도 46에 도시된 영역에서 ISA247 E 및 Z의 메틸 기 피이크의 지정은 aa-4 측쇄로부터 메틸기, 4-CH₃ (δ1) 및 (δ2)가 상응하는 영역의 KI-6 스펙트럼에는 존재하지 않는데, 이는 도 47에 도시된 새로운 메틸 피이크가 aa-4 측쇄에 속함을 의미한다. aa-4 측쇄의 각 메틸 기는, E-ISA247 및 Z의 경우에서처럼, 보통 메틸 기가 γCH 양성자에 커플링되기 때문에, 더블렛으로 나타나는 것으로 보인다. 더구나 KI-6 샘플의 질량 연구는 아미노산-1 이외의 아미노산의 히드록실화를 의미한다. 따라서, aa-4의 δ 메틸 기에 대한 관찰된 싱글렛 시그널은 도 48에 도시된 바와 같은 aa-4γ 위치에서 ISA의 산화적 변형에 기인한 것으로 결론지었다. 2D TOCSY 스펙트럼(도 49)도 상술한 변형을 확인시켜 주며, 메틸기에 대하여 시그널 연결성의 부재를 제공한다. 이것은 아미노산-4에서 IM4인 KI-4, γ-히드록실화와 일치한다. IM4의 구조는 도 50에 도시한다.

상기 연구에서 단리되고 분석되지는 않았지만, 상기 IM9 및 IM4와 유사한 히드록실화된 대사산물은 아미노산-10(IM10)의 γCH, 아미노산-6 (IM6)의 γCH에서 및 아미노산-5 (IM5)의 βCH에서 생길 수 있음을 보여준다. 일부 히드록실화된 대산물은 도 6에 도시된 HPLC 상에서 확인되었지만, NMR에 의해서는 아니다. 예컨대, IMX(2)는 미공지 아미노산에서 히드록실화된 대사산물이다.

N- 탈메틸화 대사산물

1223/1099 m/z의 모 이온/단편 이온 쌍을 갖는 단리된 대사산물(샘플 KI-1)을 ¹H-NMR에 의해 분석하였다. 상기 대사산물의 1223/1099 m/z의 모 이온/단편 쌍은 그것이 N-탈메틸화된 대사산물이라는 것을 제시한다. 대사산물 KI-1의 ¹H-NMR 스펙트럼은, E- 및 Z-이성질체의 aa-1 측쇄의 디엔 양성자 피이크의 존재에 의해 증명되는 바와 같이 약 1:1 비율의 E 및 Z-이성질체의 혼합물임을 나타내며, 이는 aa-1 측쇄가 완전함을 의미한다. 이 스펙트럼은 또한 도 51에 도시된 화살표로 나타내는 바와 같이 δ 2.5 ppm에서 N-메틸 피이크 쌍의 손실을 나타내었다. 대사산물의 ¹H-NMR 스펙트럼을 E-ISA247 및 Z의 ¹H-NMR 스펙트럼과 비교하면 상기 영역에 상응하는 없어진 시그널이 아미노산-4의 N-메틸 기(각 이성질체로부터 1개)임을 나타내었다. 따라서, 상기 대사산물에서 아미노산-4의 N-탈메틸화가 제시되었다.

대사산물의 aa-4α 양성자의 시그널은 δ 5.56 및 5.59 ppm에서 공명하는 ISA247 E 및 IDS 247Z의 aa-4 양성자의 스펙트럼에서 쉽게 위치를 찾을 수 없었다. 또한 δ 7 및 δ 8.7 ppm 사이의 아미드 NH 양성자 영역은 양쪽 이성질체의 aa-4로부터의 2개 NH 양성자가 상기 영역에서 추정될 때 10개 대신 양쪽 이성질체로부터 생기는 8개의 아미드 NH 양성자를 나타내므로, 더 높은 필드(field)에서 aa-4의 아미드 NH 양성자가 공명함을 의미한다.

2D TOCSY 스펙트럼의 분석은 δ4.7 ppm에서의 시그널과 상관관계가 있는 δ5.2 ppm에서의 시그널 2세트를 나타내었다. 확대된 스펙트럼(도 52 참조)은 이들 시그널의 분명한 상관관계를 보여준다: δ 5.26 ppm 내지 4.76 ppm, 및 δ5.23 ppm 내지 4.72 ppm. 이들 양쪽 피이크 세트는 다른 아미노산 양성자와 중첩되었다: δ 5.2 ppm에서의 피이크와 aa-1 1개 양성자, δ 4.7 ppm에서 피이크와 aa-5, aa-7 및 aa-8 α 양성자. 그러나, aa-5, aa-7, aa-8 및 aa-11의 화학적 이동 지정은 이들 아미노산으로부터 생기는 δ 5.2 및 δ 4.7에서의 시그널의 가능성을 배제하였다. 따라서 δ 4.72 에서 5.23 ppm 그리고 δ 4.76 내지 5.26 ppm의 교차 피이크 연결성은 양쪽 이성질체의 aa-4의 아미드 NH 및 α 양성자로부터 기인한 것으로 제안된다. 이러한 관찰을 기본으로 하고 또 ¹H- ¹⁵-HSQC (도시되지 않음)에 의해 확인되는 바와 같이, δ 5.26 ppm 및 5.23 ppm에서의 시그널은 NH 양성자에 지정되었고 또 δ 4.76 ppm 및 δ 4.72 ppm에서의 시그널은 aa-4의 α 양성자에 지정되었다. 도 53은 IM4n인 대사산물 KI-1의 제시된 구조를 도시한다.

화학적 합성 방법을 이용하여 ISA247의 대사산물을 제조할 수 있다. 이들 대사산물의 화학적 합성은 다음 단계를 따른다: 1) 시클로스포린 A 또는 ISA247의 1 아미노산 측쇄의 β-OH를 보호하는 단계; 2) 에폭사이드화하는 단계; 3) 디올 형성하는 단계 및 4) 보호기 제거하는 단계. β-OH의 보호는 에폭사이드 및 디올 대사산물을 형성하기 위해 바람직할 수 있지만, 시클릭 대사산물의 형성에는 모순되지는 않는다. β-OH에서 가능한 보호 기는 아세틸, 트리메틸실릴, 벤조에이트 에스테르, 치환된 벤조에이트 에스테르, 에테르 및 실릴 에테르를 포함한다. 특정 반응 조건하에서, 아세테이트 보호기는 제거 및 가수분해와 같은 바람직하지 않은 부작용 반응을 유발하기 쉽다. 벤조에이트 에스테르, 에테르 및 실릴 에테르는 상기와 동일 조건하에서 그러한 부작용 반응에 더 잘 견디기 때문에, 이러한 보호기가 아세테이트 대신 유리하게 사용된다.

염기성 조건하에서, 보호된 CsA 또는 ISA247은 에폭사이드를 형성할 수 있다. 도 54는 샤프리스 방법(R.A. Johnson, K.B. Sharpless. Catalytic Asymmetric Synthesis: Edited by I. Ojima; VCH Publishers: New York; 1993; p. 103; K.B. Sharpless et al., J. Org. Chem. 1992, 57, 2768)을 이용하는 합성 경로를 도시한다. 도 54에 도시한 바와 같이, 알릴성 알코올 성분을 갖는 보호된 CsA 화합물은 샤프리스 에폭사이드화를 거칠 수 있다. 산화, 비티히 반응 및 에폭사이드-고리 개환을 비롯한 일련의 반응은 디올 대사산물을 초래할 것이다(WO 2003/033526호 및 US 2003/0212249호 참조). 다르게는, AD-mix-β/AD-mix-α와 같은 시중에서 구입할 수 있는 시약을 사용한 샤프리스 디히드록실화(K.B. Sharpless etal J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 7570)는 디올 대사산물의 합성에 이용될 수 있다. 대표적인 예를 도 54에 도시한다.

도 55는 합성 syn 또는 항 디올의 합성을 지시하기 위해 화학적 합성 방법이 사용될 수 있음을 도시한다. 예컨대, 도 55에서, 시스 알콕시알릴 보로네이트 에스테르 시약을 사용하여 IM1-d-4의 syn 디올을 형성할 수 있다. 트랜스-실릴알릴 보로네이트 에스테르 시약이 사용되면 IM1-d-4의 항 디올이 형성될 수 있다(H.C. Brown, et al., J. Am. Cehm. Soc. 1988, 110, 1535, Marshall, J.A.Chem. Rev. 1996, 96, 31, Barrett, A.G.M et al., J. Org. Chem. 1991, 56, 5243 참조).

도 56은 클로로알릴붕소화 방법을 이용하는 에폭사이드(및 디올)의 형성을 도시한다. 도 56은 Hu et al., J. Org. Chem. 1998, 63, 8843에 기재된 방법을 이용하는 디알킬(클로로알킬)보란 시약의 사용이 디올로 변환될 수 있는 시스-에폭사이드의 형성을 초래함을 도시한다. WO 2003/033526호 및 US 2003/0212249호 참조.

5원 고리 형성을 나타내는 상술한 시클릭 아미노산-1 대사산물 이외에, 6, 7 또는 8원 고리를 함유하는 부가적인 시클릭 아미노산-1 대사산물도 가능하다. 예컨대, 도 42에서는, IM1-e-2 에폭사이드 대사산물의 β-OH가 물 존재하에서 자신의 ε 탄소를 공격하면 시클릭 대사산물의 형성이 도시되어 있다. IM1-e-20 에폭사이드 대사산물의 β-OH가 자신의 ζ-탄소를 공격하면 6원 고리 구조의 시클릭 대사산물이 형성될 것이다. IM-1-e-2 에폭사이드 대사산물의 β-OH가 자신의 θ 탄소를 공격하면, 8원 고리 구조의 시클릭 대사산물이 형성될 것이다. 유사하게, IM1-e-2 에폭사이드 대사산물의 β-OH가 자신의 η 탄소를 공격하면, 7원 고리 구조의 시클릭 대사산물이 가능하다.

상술한 IM4n 과 유사하게 탈메틸화된 대사산물은 aa-1, aa-6, aa-9, aa-10 및 aa-11에서 메틸화된 질소에서 생긴다. 이들 대사산물의 일부는 도 6의 HPLC 스캔에서 확인할 수 있다. 예컨대 IMXn(2)는 ISA247 고리 중의 미공지 아미노산에서의 탈메틸화된 대사산물이다("X"로 표기).

상술한 대사산물 이외에, 대사 단계의 조합이 존재하여 히드록실화, N-탈메틸화, 디올 형성 또는 고리화의 조합을 갖는 대사산물이 형성된다. 다중 히드록실화 및 N-탈메틸화를 갖는 대사산물도 존재할 수 있다. 예컨대, IM-1-d-1은 위치 4에서 MeLeu의 질소의 탈메틸화에 의해 더 대사되어 IM1-d-1-4n을 생성한다. 다른 예는 IM1-d-2-4n 또는 IM1-d-3-4n 또는 IM1-d-4-4n, IM1-c-1-4n 또는 IM1-c-2-4n을 포함한다. 디올 형성 또는 고리화와 조합된 탈메틸화는 N-탈메틸화될 수 있는 ISA247 분자 상의 아미노산에서 생길 수 있다. 예컨대, ISA247의 대사산물은 아미노산 1, 3, 4, 6, 9, 10 또는 11에서 1 이상의 N-탈메틸화와 조합된 아미노산-1 (IM1-d-1, IM1-d-2, IM-1-d-3 또는 IM-1-d-4)에서 형성된 디올을 포함한다. ISA247의 대사산물은 또한 히드록실화되기 쉬운 ISA247 분자 상의 아미노산에서 1 이상의 히드록실화와 조합된 아미노산-1에서 형성된 디올을 포함할 수 있다. 예컨대 ISA247의 대사산물은 아미노산 4,6 , 9, 10 또는 11에서 1 이상의 히드록실화와 조합된 아미노산-1 (IM1-d-1, IM1-d-2, IM1-d-3 또는 IM1-d-4)에서 형성된 디올을 포함한다. ISA247의 대사산물은 또한 아미노산 1,3,4,6,9,10 또는 11에서 1 이상의 N-탈메틸화, 또는 아미노산 4, 6, 9, 10 또는 11에서 1 이상의 히드록실화와 조합된 아미노산(IM1-c-1 또는 IM1-c-2)에서 고리화를 포함할 수 있다. 대사산물은 다수의 히드록실화, 예컨대 IM46, IM69 또는 IM49를 갖거나, 또는 다수의 N-탈메틸화, 예컨대 IM4n9n 또는 IM4n3n을 가질 수 있다. 도 6의 HPLC 스캔에는 다수의 대사산물이 존재한다. 예컨대, IMXnX(2)는 ISA247 고리 상의 미확인 위치에서 N-탈메틸화 및 히드록실화가 존재하는 대사산물을 나타낸다. 이들 다수 히드록실화 및/또는 다수 N-탈메틸화는 aa-1에서 디올 형성 또는 aa-1에서 고리화와 조합되어 생길 수 있다.

상술한 상 I 대사산물 이외에, 부가적인 상 II 대사산물이 생길 수 있다. 이들 상 II 대사산물은 ISA247 또는 ISA247 대사산물 분자 상의 히드록실 기에서 생길 수 있는 글루쿠로니드, 사카라이드(예컨대 글리코실화), 포스페이트, 술페이트 등과 같은 기를 포함할 수 있다. 당업자들이라면 상술한 상 II 대사산물의 목록이 한정적이지 않으며, 다수의 부가적인 상 II 대사산물이 본 발명에 고려될 수 있음을 숙지하고 있을 것이다.

도 1은 CsA의 구조를 도시한다.

도 2는 ISA247의 구조를 도시한다.

도 3은 ISA247의 E(트랜스) 이성질체를 도시한다.

도 4는 ISA247의 Z(시스) 이성질체를 도시한다.

도 5는 공지된 CsA 대사산물을 도시하는 표이다.

도 6은 ISA247을 투여한 후 인간의 전체혈액에 존재하는 대사산물의 HPLC-MRM 스캔을 도시한다.

도 7은 단리된 ISA247 대사산물의 혼합 표준의 HPLC-MRM 스캔을 도시한다.

도 8은 샘플 KI-2로부터의 E-ISA247, Z-ISA247 및 IM1-d-1에 대한 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시한다.

도 9는 샘플 KI-2로부터의 IM1-d-1의 2D TOCSY 스펙트럼을 도시한다.

도 10은 IM1-d-1의 구조를 도시한다.

도 11은 샘플 KI-3A로부터의 E-ISA247 및 IM1-d-2에 대한 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시한다.

도 12는 샘플 KI-3A로부터의 IM1-d-2의 2D COSY 및 TOCSY 스펙트럼을 도시한다.

도 13은 샘플 KI-3A로부터의 IM1-d-2의 3.8 내지 6.2 ppm 사이의 확대된 2D COSY 스펙트럼을 도시한다.

도 14는 샘플 KI-3A로부터의 IM1-d-2의 3.8 내지 6.2 ppm 사이의 확대된 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시한다.

도 15는 시그널의 스플릿 패턴을 표시하는, IM1-d-2 (샘플 KI-3A)의 이중결 합 양성자의 확대된 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시한다.

도 16은 aa-1 측쇄 양성자의 상관관계를 나타내는, IM1-d-2 (샘플 KI-3A)의 확대된 2D COSY 스펙트럼을 도시한다.

도 17은 IM1-d-2의 aa-1 Z측쇄의 ε 위치에서 R 및 S 에피머의 구조를 도시한다.

도 18은 IM1-d-2의 아미노산-1 구조 및 그의 양성자 화학적 이동(chemical shift)을 도시한다.

도 19는 IM1-d-1, IM1-d-3, E-ISA247 및 Z-ISA247에 대한 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시한다.

도 20은 IM1-d-3 (샘플 KI-3)의 2D TOCSY 스펙트럼을 도시한다.

도 21은 IM1-d-3 (샘플 KI-3)의 확대된 TOCSY 스펙트럼에서 상응하는 α 양성자에 대한 아미드 양성자 상관관계를 도시한다.

도 22는 IM1-d-3 (샘플 KI-3)의 팽창 TOCSY 스펙트럼에서 상응하는 측쇄 메틸 양성자에 대한 아미드 양성자 상관관계를 도시한다.

도 23은 3.5 내지 6.1 ppm 사이에서 IM1-d-3 (샘플 KI-3)의 확대된 ¹H-NMR 스펙트럼 및 일부 TOCSY 상관관계를 도시한다.

도 24는 크로스 피이크 상관관계를 갖는 3.4 내지 6.3 ppm 사이에서 IM1-d-3 (샘플 KI-3)의 확대된 2D TOCSY 스펙트럼을 도시한다.

도 25는 δ 5.62 ppm에서 시그널 분석한 IM1-d-3 (샘플 KI-3)의 확대된 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시한다.

도 26은 IM1-d-3의 aa-1 측쇄의 η위치에서 R 및 S 이성질체의 구조를 도시한다.

도 27은 IM1-d-4 (샘플 KI-8A) 및 E-ISA247의 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시한다.

도 28A는 2D COSY 스펙트럼을 도시하고, 도 28B는 IM1-d-4 (샘플 KI-8A)의 2D TOCSY 스펙트럼을 도시한다.

도 29는 상관관계에 있는 3.5 내지 6.2 ppm 사이에서 IM1-d-4 (샘플 KI-8A)의 확장 2D COSY 스펙트럼을 도시한다.

도 30은 COSY 상관관계 및 일부 양성자 지정된 3.7 내지 6.2 ppm 사이에서 IM1-d-4 (샘플 KI-8A)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시한다.

도 31은 IM1-d-4 (샘플 KI-8A)에 대한 δ~6.00, 5.44 및 5.15 ppm에서 ¹H-NMR 시그널의 1차 분석이다.

도 32는 IM1-d-4의 구조를 도시한다.

도 33은 E-ISA247, Z-ISA247 및 IM1-c-1(샘플 KI-5)에 대한 ¹H-NMR 스펙트럼을 비교한다.

도 34는 α 양성자 영역에서 IM1-c-1 (샘플 KI-5)에 대한 확대된 ¹H-NMR 스 펙트럼을 도시한다.

도 35는 도 34에 도시된 바와 같은 IM1-c-1 (샘플 KI-5)의 δ~5.75 ppm에서 시그널 분석을 도시한다.

도 36은 α 양성자 영역에서 IM1-c-1 (샘플 KI-5)의 확대된 2D TOCSY 스펙트럼을 도시한다.

도 37는 IM1-c-1 (샘플 KI-5)의 부분적으로 확대된 DQF-COSY 스펙트럼을 도시한다.

도 38은 IM1-c-1의 구조를 도시한다.

도 39는 IM1-c-1 (샘플 KI-5)의 2D ROESY 스펙트럼을 도시한다.

도 40은 ROE 상관관계를 나타내는 IM1-c-1의 아미노산-1 측쇄에 대한 구조를 도시한다.

도 41은 ISA247의 아미노산-1 대사산물의 형성을 개략적으로 도시한다.

도 42A는 트랜스-ISA247로부터 ISA247의 아미노산-1 대사산물의 형성을 개략적으로 도시한다.

도 42B는 시스-ISA247로부터 ISA247의 아미노산-1 대사산물의 형성을 개략적으로 도시한다.

도 43은 트랜스-ISA247로부터 IM1-d-1의 형성 및 시스-ISA247로부터 IM1-d-3의 형성을 도시하는 반응도이다.

도 44A는 KI-7C, E-ISA247 및 Z-ISA247의 ¹H-NMR 스펙트럼을 비교한다.

도 44B는 IM9의 구조를 도시한다.

도 45는 IM4 (샘플 KI-6), ISA247 E 및 Z-ISA247의 ¹H-NMR 스펙트럼을 비교한다.

도 46은 0.5 내지 1.5 ppm 사이에서 IM4 (샘플 KI-6), ISA247 E 및 Z-ISA247의 확대된 ¹H-NMR 스펙트럼을 비교한다.

도 47은 IM4의 신규 메틸 시그널을 나타내는 확대된 ¹H-NMR 스펙트럼을 비교한다.

도 48은 IM4 (샘플 KI-6)의 2D TOCSY 스펙트럼을 도시한다.

도 49는 아미노산-4 γ 위치가 변형되어 IM4를 형성하는 것을 나타내는 반응도이다.

도 50은 IM4의 구조를 도시한다.

도 51은 IM4n (샘플 KI-1), ISA247 E 및 Z-ISA247의 ¹H-NMR 스펙트럼을 비교한다.

도 52는 IM4n (샘플 KI-1)의 확대된 2D TOCSY 스펙트럼을 도시한다.

도 53은 IM4n의 구조를 도시한다.

도 54는 샤프리스 방법을 이용한 화학반응도를 나타낸다.

도 55는 특정 syn 또는 안티 디올을 합성하기 위한 화학적 합성 방법을 도시한다.

도 56은 클로로알릴붕소화를 이용한 화학적 합성 방법을 도시한다.

도 57은 E-ISA247의 IM-1, IM-1-아세탈, IM1-알데히드, 및 IM1-카르복시산의 형성을 나타내는 반응도이다.

도 58A는 ISA247 대사산물 IM1-디올-1, IM9, IM4n, IM1c 및 1M1의 경우 대사산물 농도(ng/mL)에 대한 칼시네우린 억제 %를 도시하는 그래프이다.

도 58B는 트랜스-ISA247, 시스ISA247 및 CsA의 경우 농도(ng/mL)에 대한 칼시네우린 억제 %를 도시하는 그래프이다.

도 59는 ISA247 대사산물 생산에서 ATCC 11635의 전형적인 대사산물 다양성 프로파일을 도시하는 막대 그래프이다. 나타낸 전환율은 1 mg/mL 시클로스포린 A 표준에 대한 %이다.

실시예 1: 전체 혈액으로부터 ISA247 대사산물의 제조

ISA247을 투여한 후 인간으로부터 전체 혈액을 취하였다. t-부틸-메틸-에테르(또는 메틸 t-부틸 에티르, MTBE)를 사용하여 전체 혈액으로부터 ISA247 및 그의 대사산물을 추출하고, 건조시키고 또 메탄올에 재구성시켰다. 2 mL의 MTBE (카탈로그 번호 7001-2; Caledon)을 200 μL 혈액에 부가하고, 10분간 교반한 다음 테이블 탑 원심분리기에서 2분간 휘저었다. 상부 MTBE층을 제거하고 진공하에서 농축시켰다. 잔류물을 200 μL 메탄올에 재구성시켰다. 담즙 및 요 추출물도 유사하게 실시하였다.

실시예 2: ISA247 대사산물의 화학적 합성

OAc -E- ISA247 의 모노에폭사이드의 제조

E-ISA247의 디올 대사산물을 형성하기 위하여, 도 42에 도시된 바와 같이 에폭사이드를 형성하였다. 다음 단계를 실시하였다. CHCl₃ (3 mL) 중의 OAc-E-ISA247 (125 mg, 0.1 밀리몰)의 교반되고 냉각되는 (0℃) 용액에 중탄산 칼륨(10 mg)을 부가하였다. 여기에 CHCl₃ (2 mL) 중의 m-클로로과벤조산 (23 mg, 0.1 밀리몰, 77%)의 용액을 부가하였다. 이 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 18시간 동안 교반하였다. 이 반응 생성물을 디클로로메탄(25 mL)을 사용하여 추출하였다. 유기 층을 포화 NaHCO₃ 용액 및 염수로 세척하였다. 건조(Na₂SO₄)시키고 용매 제거하여 백색 고체(110 mg)를 얻었다. MS(m/z): 1295 (M + Na⁺). 이 생성물은 에폭사이드의 혼합물이었다. OAc-Z-ISA247 또는 ISA247의 이성질체의 혼합물을 사용하여 동일 과정을 적용할 수 있지만, 생성물의 입체화학은 도 42에 도시한 바와 같이 상이할 것이다.

OAc -E- ISA247 의 에폭사이드를 디올 혼합물로 분해하기:

상기 생성물(110 mg)을 아세톤-물-88% HCO₂H의 교반되는 얼음 냉각된 혼합물 (15 mL, 64.5:33:2.5)에 부가하고 실온에서 72시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (25 mL)를 사용하여 추출하고, 유기 추출물을 포화 NaHCO₃ 용액 및 염수로 세척하였다. 건조(Na₂SO₄)시키고 용매 제거하여 백색 고체(110 mg)를 얻었다. MS(m/z): 1313 (M + Na⁺). 이 생성물은 OAc-E-ISA247 디올의 혼합물이었다.

디올의 보호기 제거:

OAc-E-ISA247 디올의 혼합물(110 mg)을 MeOH (10 mL) 및 물(4 mL)에 용해시킨 다음 고체 탄산칼륨(110 mg)을 부가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 36 시간 동안 교반한 다음 에틸 아세테이트 (25 mL)로 추출하였다. 모아진 유기 추출물을 염수로 세척하고 건조(Na₂SO₄)시켰다. 용매를 제거하여 고체(110 mg) MS (m/z) 1271 (M + Na⁺)를 얻었다. HPLC를 이용한 정제는 화합물 IM1-d-1, IM1-d-2 및 IM1-d-4를 제공하였다.

실시예 3: E- ISA247 의 에폭사이드화 ( 시클릭 대사산물의 제조):

산성 환경에서, 시클릭 화합물을 형성하였다. CHCl₃ (3 mL) 중의 E-ISA247 (250 mg, 0.2 밀리몰)의 교반되고 냉각되는 (0℃) 용액에 CHCl₃ (2 mL) 중의 m-클로로과벤조산(51 mg, 0.23 밀리몰, 77%)의 용액을 부가하고 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 0℃오 냉각시키고 과량의 m-CPBA는 Me₂S (600 μL)를 부가하여 파괴시켰다. 이 반응 생성물을 디클로로메탄(25 mL)로 추출하고 유기 층은 포화 NaHCO₃ 용액 및 염수로 세척하였다. 건조(Na₂SO₄)시키고 용매 제거하여 고체(230 mg)를 얻었다. IM1-c-1 및 IM1-c-2의 혼합물로 존재하는 시클릭화된 화합물은 보존적 HPLC를 이용하여 분리하였다.

실시예 4: E- ISA247 의 에폭사이드화 (말단 에폭사이드의 제조)

CHCl₃ (3 mL) 중의 E-ISA247 (200 mg, 0.17 밀리몰)의 교반되고 냉각되는 (0 ℃) 용액에 고체 KHCO₃ (20 mg, 0.2 밀리몰)을 부가하였다. CHCl₃ (2 mL) 중의 m-클로로과벤조산 (45 mg, 0.2 밀리몰)의 용액을 부가하였다. 실온에서 4.5 시간 동안 계속 교반하였다. 이 반응 혼합물을 얼음에서 냉각시키고 또 Me₂S (500 μL)를 부가하였다. 상기 기재한 바와 같이 세정 및 HPLC 분리를 실시하여 말단 에폭사이드, IM1-e-1을 얻었다.

실시예 5: 개의 간 마이크로솜 제제에 의한 ISA247 대사산물 제조

개의 마이크로솜의 준비

개의 간 마이크로솜은 다음과 같은 방식으로 제조하였다: 간을 제거한 후, 1.15% 염화 칼륨(KCl)로 세척하고; 소형 조각(약 25 g)으로 잘라낸 다음 냉각 연마 완충액(0.1 M 포스페이트 완충액 pH 7.4; 4℃; 완충액 : 간 비율 1:1)에 주요 큰 덩어리가 분해될 때까지 연마하였다. 폴리트론 균질기(15,000 rpm에서 3 내지 5분간)를 이용하여 간 조직을 함유하는 균질물을 얻었다. 특정 물질로부터 상층액을 따라낸 후, 그 상층액을 100,000 x g에서 90분간 원심분리하여 마이크로솜 펠릿을 얻었다. 마이크로솜 펠릿의 단백질 함량은 로리(Lowry) 단백질 분석법으로 측정하였다. 마이크로솜 제조의 단백질 농도는 약 23.2 mg/mL 이었다. 효소 활성 손실을 피하기 위하여, 마이크로솜은 냉동 해동 주기를 피하도록 -80℃에서 4.0 또는 6.0 mL 균등분할물로 저장하였다.

상술한 바와 같이 제조한 개의 간 마이크로솜의 6 mL 부피를 257 mL 엘렌마이어 플라스크에서 배양하였다: 57.3 mg의 NADP, 254 mg 의 글루코오스-6-포스페이 트 및 23.0 mg NADPH 를 6.0 mL의 포스페이트 완충액 (pH 7.4로 조정됨)에 부가하였다. 이어, 2.0 mL의 5.0 mM MgCl 및 6.0 mL 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제(10 단위/mL, CALBIOCHEM 입수, 캐나다 샌디에지 소재, 카탈로그 번호 346774)를 상기 용액에 부가하였다. 마지막으로, 10 mL의 포스페이트 완충액(pH 7.4)을 부가하였다. 플라스크를 환경적으로 제어되는 배양기/진탕기 중, 250 rpm으로 하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 2시간 후, 500 μL의 2M HCl을 부가하여 반응을 중지시켰다.

상기 방법에 의해 제조된 대사산물을 유기 용매를 사용하여 추출하고, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분리하였다. 대사산물은 전자스프레이 질량 분광측정(MS) 및 NMR에 의해 특징화하였다.

실시예 6A: 생체변환에 의한 ISA247 대사산물의 제조

생체변환 계는 인간 시토크롬 P450 마이크로솜 효소의 미생물 등가물을 함유하는 미생물 및 상기 미생물의 활발한 생장에 적합한 배지를 이용하였다. 물에 거의 용해되지 않는 모 화합물을 생체변환계에 부가하기 전에 에탄올 및 계면활성제와 혼합하였다. 이 실시예에서, 에탄올 중의 ISA247을 Tween 40과 혼합한 다음 사카로폴리스포라 에리쎄라에아(Saccharopolysproa erytheraea) ATCC 11635를 함유하는 생체변환 계에 부가하였다.

생체변환 실험은 15 슬랜트의 사카로폴리스포라 에리쎄라에아(Saccharopolysproa erytheraea)를 사용하여 개시하였다. 이들 슬랜트는 탈이온수에 용해되고 NaOH로 pH 7.0으로 조정되며 100℃에서 30분간 멸균시킨 100 mL의 ATCC 배지 196 (약 6.0 mL/슬랜트)으로부터 제조하였다. 사카로폴리스포라 에리쎄라에아(Saccharopolysproa erytheraea)를 접종한 후 슬랜트를 28℃에서 3주간 생장시켰다.

이들 슬랜트로부터 얻은 군락(colonies)을 상 I 배지로 전달하였다. 상 I 배지는 10 g/L 덱스트린, 1 g/L 글루코오스, 3 g/L 쇠고기 추출물, 10 g/L 효모 추출물, 5 g/L 황산마그네슘 및 400 mg/L 인산칼륨을 사용하여 제조하였다. 이들 성분을 탈이온수와 혼합하여 1리터로 만들고 NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정하였다. 50 mL의 등분물을 배플드(baffled) 250 mL 배양 플라스크에 전달하고 100℃에서 30분간 멸균시켰다. 상 I 배양을 개시하기 위하여, 5 mL의 배지 등분물을 사카로폴리스포라 에리쓰라에아(Saccharopolysproa erythraea)를 함유하는 한천 슬랜트에 전달하였다. 세포를 슬랜트의 표면에서 긁어내어서 세포 현탁액을 만들었다. 2.5 mL의 현탁액을 사용하여 각 플라스크를 접종하였다. 이 플라스크를 27℃의 라블린(Labline) 배양기에 놓고 250 rpm에서 3일간(72 시간) 진탕시켰다.

상 I 플라스크의 내용물을 3300 rpm에서 5분간 원심분리한 다음 상층액을 따라내어 펠릿을 얻는 것에 의해 사카로폴리스포라 에리쓰라에아(Saccharopolysproa erythraea)를 상 I 배지로부터 상 II 배지로 전달하였다. 5 mL의 상 II 배지를 상기 펠릿에 부가하고 튜브를 보르텍스처리한 다음 3300 rpm에서 4분간 원심분리하였다. 다시 그 상층액을 따라 내었다. 펠릿을 상 II 배지에 재현탁시켰다. 이어 배플드 배양 플라스크 중의 50 mL 상 II 배지에 부가하였다.

상 II 배지는 10 g/L 글루코오스, 1 g/L 효모 추출물, 1 g/L 쇠고기 추출물 및 11.6 g/L 3-N-모르폴리노프로판술폰산(MOPS) 완충액을 함유하였다. 이들 성분을 탈이온수에서 혼합하고 5M NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정하였다. 50 mL 등분물을 배플드 배양 플라스크(250 mL)에 분배하고 100℃에서 30분간 오토클레이브 처리하였다. Tween 40도 또한 오토클레이브 처리하였다.

ISA247 (4 mg)을 0.1 ml 에탄올 (95%)에 용해시킨 다음 0.4 ml Tween® (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트; 카탈로그 번호 P1504. 시그마-알드리히 제조, 미국 미주리 세인트루이스 소재)와 혼합하였다. 모 화합물-계면활성제 혼합물을 상 II 배양 배지 중의 사카로폴리스포라 에리쓰라에아(Saccharopolysproa erythraea)에 부가하였다. 0 시간 샘플을 얻고 냉동시켰다. 각 플라스크에 두껑을 막고 Innova 배양기, 27℃에 놓고 120시간 동안 170 rpm으로 진탕시키면서 배양하였다.

두번째 샘플은 상 II 배양 배지로부터 얻었다. 0시간 샘플 및 제2 샘플을 t-부틸 메틸 에테르(카탈로그 번호 7001-2; Caledon)를 사용하여 추출하였다. 추출된 대사산물을 메탄올(HPLC 등급)에서 재구성시키고 이하게 기재한 바와 같이 LC-MS에 의해 분석하였다.

도 59는 ATCC 11635(즉, 대사산물 전달)에 의해 생성될 수 있는 대사산물의 양과 유형의 예를 도시하는 막대 그래프이다.

실시예 6B: 생체변환에 의한 ISA247 대사산물의 제조

상술한 생체변환예를 기본으로 한 추가의 실험으로서, 다음 생물을 비롯한 다양한 미생물을 사용하여 ISA247로부터의 ISA247 대사산물의 생산에 대해 평가하 였다: 쿠르불라리아 루나타(Curvularia lunata) (UAMH 9191, ATCC 12017), 쿠닝하멜라 에키눌라타 변종 엘레간스 (Cunninghamella echinulata var. elegans)(UAMH 7370, ATCC 36112), 쿠르불라리아 에키눌라타 변종 블레이크슬레나(Curvularia echinulata var. blakesleena)(UAMH 8718, ATCC 8688a), 쿠닝하멜라 에키눌라타 변종 엘레간스 (Cunninghamella echinulata var. elegans)(UAMH 7369, ATCC 26269),베아우바리아 바시아나(Beauvaria bassiana)(UAMH 8717, ATCC 7159), 액티노마이세테스(Actinomyetes) (ATCC 53828), 액티노플라네스(Actinoplanes)(ATCC 53771), 쿠닝하멜라 에키눌라타(Cunninhamella echinulata)(UAMH 4144, ATCC 36190), 쿠닝하멜라 에키눌라타(Cunninhamella echinulata)(UAMH 7368, ATCC 9246), 쿠닝하멜라 바이니에레(Cunninghamella bainiere)(에키눌라타)(echinulata)(UAMH 4145, ATCC 9244) 및 사카로폴리스포라 에리쓰라에(Saccharopolyspora erythrae)(ATCC 11635).

이들 미생물을 대사산물 전환 수율(공지된 ISA247 대사산물 전체 생산량 대 출발 ISA247) 뿐만 아니라 대사 다양성(제조된 상이한 ISA247 대사산물의 갯수)에 대해 스크리닝하였다. 또한, 공지된 보조제인 글리세롤과 비교하여 디메틸 술폭사이드(DMSO) 및 Tween 40을 비롯한 전달 보조제(고친유성 ISA247의 흡수를 증가시키기 위한)도 조사하였다. 배지로부터 샘플을 취하고 이하에 기재한 바와 같은 인간의 표준 ISA247 대사산물에 대한 LC-MS와 비교하였다. 표 7은 밝혀진 이온 질량, 상응하는 정량가능한 ISA247 대사산물 및 대략적인 체류시간을 수록한다. 정량된 이온 질량은 1223, 1237, 1239, 1253, 1255, 1267 및 1271을 포함한다.

표 8은 96시간의 생체변환 후 전체 전환 및 대사 다양성을 기초로 하여 시험된 미생물을 순위를 정한 것이다. 체크된 표시는 정량가능한 대사산물이 생성된 것을 나타낸다.

실시예 7: ISA247 대사산물의 분석을 위한 LC / MS 방법

이 실시예에서, ISA247 대사산물은 시험관 내에서 제조되며, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분리되며 또 전자스프레이 질량 분광측정법으로 특징화되었다.

액체 크로마토그래피 ( LC ) 조건

액체 크로마토그래피(LC 또는 HPLC)를 실시하기 위해, 거드 칼럼(guard column) 2 x 20 mm (Upcherch Scientific 카탈로그 #C-130B)를 갖고 Perisorb RP-8 (Upcherch Scientific 카탈로그 #C-601)으로 팩킹된 역상 워터스 시메트리(Waters Symmetry) C8, 21X50 mm, 3.5 ㎛ 분석 칼럼(Waters 카탈로그 #WAT 200624)를 사용하였다. LC 프로그램에 사용된 용매 % 및 유량은 하기 표 9에 나타낸다:

질량 스펙트럼( MS ) 조건

질량 분광측정법의 경우, Applied Biosystems/MDS Sciex API3000 (Analyst 소프트웨어 v 1.2) 머신을 사용하였다. 전개 시간(run time)은 15분이며, 주입 부피는 5 μL 이었고, 거드 칼럼(Guard Column) 온도 및 분석 칼럼 온도는 60℃이었다. 매뉴얼 세팅은 다음과 같았다: 터보 이온 스프레이는 8000 이었고, 터보 이온 스프레이 수평 세팅은 포지티브 4였고, 터보 이온 스프레이 측면 세팅은 10이었다. Sciex 머신은 하기 표 10에 나타낸 변수로 세팅되었다.

MS 세팅:

스캔 유형: MRM (멀티플 반응 모니터링)

극성: 포지티브

기간: 15.00 분

주기 회수: 1.32초

주기의 #: 692

어드밴스트 MS 세팅:

해상 Q1: 낮음

Q3: 낮음

세기 임계치: 0

세팅 시간: 50 msec

휴식 시간: 30 msec

변수 세팅:

이온 공급원: 터보 이온 스프레이

원자화 가스: 12

커튼 가스: 8

충돌 가스: 12

이온 스프레이 전압: 5000V

온도: 550℃

화합물 세팅:

디클러스터링(declustering) 전위: 60V

포커싱 전위: 400V

충돌 에너지: 90V

표 11은 이온 및 이온 특이적 기구 세팅을 나타낸다.

실시예 8: ISA247 대사산물의 면역억제 활성의 측정

프루만(Fruman) 등 (A Proc Natl Acad Sci USA, 1992) 및 미국특허 6,605,593호에 기재된 방법을 변형하여 칼시네우린 활성을 분석하였다. 전체 혈액 용균물을 오카다익산, 포스파타아제-유형 1 및 2 억제제 존재하에서 ³²P-라벨링된 19 아미노산 펩티드 기질을 탈인산화하는 능력에 대해 평가하였다. 백그라운드 포스파타아제 2C 활성(CsA 및 오카다익산 내성 활성)을 평가하고 또 과량 부가된 ISA247 존재하 및 부재하에서 평가한 각 샘플로부터 그 값을 차감하였다. 잔류하는 포스파타아제 활성을 칼시네우린 활성으로 취하였다.

도 58A는 칼시네우린 억제율 대 ng/mL로 부가된 대사산물의 농도를 도시하는 그래프이다. ISA247 대사산물 IM1-디올-1, IM9, IM4n, IM1c 및 IM1에 의한 농도 함수로서 칼시네우린 억제는 도 58A를 도 58B와 비교함으로써 알 수 있는 바와 같이 트랜스-ISA247, 시스 ISA247 및 CsA에 필적한다. 표 12는 트랜스 ISA247 및 CsA와 비교한 IM1, IM1-디올-1, IM4n 및 IM9의 Emax 및 EC50를 나타낸다.

본 출원에 인용된 모든 문헌, 특허 및 특허출원은 각 개별 문헌, 특허 출원 또는 특허가 특별히 또 개별적으로 전체적으로 참고문헌에 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일 정도로 전체적으로 참고문헌에 포함된다.

화학적 반응이든 효소적 반응이든 반응 메카니즘은 이론적인 것이고 본 명세서에 기재된 과정을 명확하게 하고 예시하기 위해 제시된 것이다. 이러한 메카니즘은 당해 업자가 미래의 증거가 그러한 메카니즘의 변형을 초래할 수 있을 것이라 인식한다면 진실된 것으로 믿어진다. 따라서, 출원인은 본 명세서에 기재된 실시예가 이론적 메카니즘에 한정되는 것으로 의도하는 것은 아니다.

본 발명의 상기 예시한 구체예의 다수의 변형이 생길 수 있음은 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부한 특허청구범위 내에 드는 모든 구조 및 방법을 포함하는 것으로 이해되어 져야 한다.

Claims (42)

1. 다음 화학식으로 표시되는 단리된 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 염 및 그의 용매화물:

   

   상기 식에서,

   각 R² 는 독립적으로 -H 또는 -CH₃ 이고;

   각 R¹⁰ 은 독립적으로 -H, -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -CN, -NO₂, -OR^a, -C(O)R^a, -OC(O)R^a, -C(O)OR^a, -S(O)R^a, -SO₂R^a, -SO₃R^a, -OSO₂R^a, -OSO₃R^a, -PO₂R^aR^b, -OPO₂R^aR^b, -PO₃R^aR^b, -OPO₃R^aR^b, -N(R^aR^b), -C(O)N(R^aR^b), -C(O)NR^aNR^bSO₂R^c, -C(O)NR^aSO₂R^c, -C(O)NR^aCN, -SO₂N(R^aR^b), -SO₂N(R^aR^b), -NR^cC(O)R^a, -NR^cC(O)OR^a 또는 -NR^cC(O)N(R^aR^b) 이고;

   R⁵, R⁶, R⁷, R⁸ 및 R⁹는 독립적으로 -H, -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -CN, -NO₂, -OR^a, -C(O)R^a, -OC(O)R^a, -C(O)OR^a, -S(O)R^a, -SO₂R^a, -SO₃R^a, -OSO₂R^a, -OSO₃R^a, -PO₂R^aR^b, -OPO₂R^aR^b, -PO₃R^aR^b, -OPO₃R^aR^b, -N(R^aR^b), -C(O)N(R^aR^b), -C(O)NR^aNR^bSO₂R^c, -C(O)NR^aSO₂R^c, -C(O)NR^aCN, -SO₂N(R^aR^b), -SO₂N(R^aR^b), -NR^cC(O)R^a, -NR^cC(O)OR^a 또는 -NR^cC(O)N(R^aR^b)이거나; 또는 R⁶ 및 R⁷는 합쳐져서 -O- 이거나; 또는 R⁵ 및 R⁶은 합쳐져서, 또는 R⁷ 및 R⁸은 합쳐져서 독립적으로 -O- 이고; 또는 R⁸ 및 R⁹는 합쳐져서 -O- 이거나; 또는 R⁵는 자신이 부착되어 있는 탄소원자와 합쳐져서 -C(=O)R^a, -CO₂R^a, -CH₂OR^a, -CH₂OC(O)R^a, -CH(OR^a)₂, -C(O)N(R^aR^b), -C(=NR^b)R^a, -C(=NOR^b)R^a, 또는 -C(=NNR^b)R^a 이며; 단 합쳐져서, 또는 R⁵ 및 R⁶, R⁶ 및 R⁷, 또는 R⁷ 및 R⁸ 중의 한 쌍은 탄소-탄소 결합이고 나머지는 모두 -H가 아니며; 또

   R^a, R^b 및 R^c 는 각각 독립적으로 -H 또는 선택적으로 치환된 지방족, 시클로 지방족, 벤질, 또는 아릴이거나, 또는 합쳐져서 -N(R^aR^b)는 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 기이거나, 또는 합쳐져서 -CH(OR^a)₂ 는 시클릭 아세탈 기임.
2. 제 1항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식으로 표시되는 단리된 화합물:

   

   상기 식에서,

   각 R² 는 독립적으로 -H 또는 -CH₃ 이고;

   각 R¹⁰ 은 독립적으로 -H, -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -OR^a, -OC(O)R^a, -OSO₂R^a, -OSO₃R^a, -OPO₂R^aR^b 또는 -OPO₃R^aR^b 이며;

   R⁵, R⁶, R⁷, R⁸ 및 R⁹는 독립적으로 -H, -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -OR^a, -OC(O)R^a, -OSO₂R^a, -OSO₃R^a, -OPO₂R^aR^b 및 -OPO₃R^aR^b 이거나; 또는 R⁶ 및 R⁷는 합쳐져서 -O- 이거나; 또는 R⁵ 및 R⁶은 합쳐져서, 또는 R⁷ 및 R⁸은 합쳐져서 독립적으로 -O- 이고; 또는 R⁸ 및 R⁹는 합쳐져서 -O- 이거나; 또는 R⁵는 자신이 부착되어 있는 탄소원자와 합쳐져서 -C(=O)R^a, -CO₂R^a, -CH₂OR^a, -CH₂OC(O)R^a, -CH(OR^a)₂, -C(O)N(R^aR^b), -C(=NR^b)R^a, -C(=NOR^b)R^a 또는 -C(=NNR^b)R^a 이며; 단 R⁵ 및 R⁶, R⁶ 및 R⁷, 또는 R⁷ 및 R⁸ 중의 한 쌍은 탄소-탄소 결합이고 나머지는 모두 -H가 아니며; 또

   R^a, R^b 및 R^c 는 각각 독립적으로 -H 또는 선택적으로 치환된 지방족, 시클로지방족, 벤질, 또는 아릴이거나, 또는 -N(R^aR^b)는 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 기이거나, 또는 -CH(OR^a)₂ 는 시클릭 아세탈 기임.
3. 제 1항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식으로 표시되는 단리된 화합물:

   

   상기 식에서,

   R¹ 은

   

   

   로 구성된 군으로부터 선택되고;

   각 R² 는 독립적으로 -CH₃ 및 -H로 구성된 군으로부터 선택되며;

   각 R³은 독립적으로 -CH₂CH(CH₃)₂ 및 -CH₂C(CH₃)₂OH로 구성된 군으로부터 선택되고; 또

   각 R⁴는 독립적으로 -CH(CH₃)₂ 및 -C(CH₃)₂OH로 구성된 군으로부터 선택됨.
4. 히드록실화, N-탈메틸화, 디올 형성, 에폭사이드 형성, 내부분자 고리화, 인산화, 황산화, 글루쿠로니드 형성 및 글리코실화로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상의 화학적 변형을 포함하는, 시클로{{(E)- 및 (Z)-(2S, 3R, 4R)-3-히드록시-4-메 틸-2-(메틸아미노)-6,8-노나디에노일}-L-2-아미노부티릴-N-메틸-N-메틸-글리실-N-메틸-L-로이실-L-발릴-N-메틸-L-로이실-L-알라닐-D-알라닐-N-메틸-L-로이실-N-메틸-L-로이실-N-메틸-L-발릴} (ISA247)의 단리된 대사산물 및 약학적으로 허용되는 그의 염 및 그의 용매화물.
5. 제 4항에 있어서,

   아미노산-1의 측쇄에서 에폭사이드;

   아미노산 1의 측쇄에서 디올;

   아미노산-1의 측쇄에서 시클릭 에테르;

   아미노산-1, 3, 4, 6, 9, 10 또는 11에서 탈메틸화된 아미노 질소;

   아미노산 4, 6, 9 또는 10의 측쇄의 γ 탄소에서 -OH; 및

   아미노산 5 또는 11의 측쇄의 β 탄소에서 -OH로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상의 화학적 변형을 포함하는 단리된 대사산물.
6. 제 4항에 있어서, 단리된 대사산물은 IM1-e-1, IM1-e-2, IM1-e-3, IM1-d-1, IM1-d-2, IM1-d-3, IM1-d-4, IM1-c-1 및 IM1-c-2로 구성된 군으로부터 선택되는 단리된 대사산물.
7. 제 4항에 있어서, ISA247과 비교하여, 상기 단리된 대사산물은

   2 이상의 -OH 기;

   2 이상의 탈메틸화 아미노산 질소;

   1 이상의 -OH 기 및 1 이상의 탈메틸화 아미노산 질소;

   1 이상의 디올 기 및 1 이상의 -OH 기;

   1 이상의 디올 기 및 1 이상의 탈메틸화 아미노산 질소;

   1 이상의 시클릭 에테르 및 1 이상의 -OH 기;

   1 이상의 시클릭 에테르 및 1 이상의 탈메틸화 아미노산 질소;

   1 이상의 -OH 기 및 1개의 포스페이트, 술페이트, 글루쿠로니드 또는 글리코실화 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되는 화학적 변형을 포함하는 단리된 대사산물.
8. a) 포유동물 세포를 균질화하여 균질물을 형성하는 단계;

   b) 상기 균질물을 원심분리시켜 1 이상의 약물 대사 효소를 함유하는 마이크로솜 펠릿을 얻는 단계; 및

   c) ISA247의 1 이상의 대사산물의 생산을 초래하는 조건하에서 ISA247, 마이크로솜 펠릿, 에너지 공급원 및 전자 공여 종을 함유하는 반응 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는, 시험관내에서 ISA247의 대사산물을 제조하는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 영장류, 래트, 개 및 토끼로 구성된 군으로부터 선택된 포유동물의 간세포인 방법.
10. 제 8항에 있어서, 상기 약물 대사 효소는 사이토크롬 P-450 효소인 방법.
11. 제 8항에 있어서, 상기 전자 공여 종은 NADH 및 NADPH로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
12. 제 8항에 있어서, 상기 에너지 공급원은 글루코오스-6-포스페이트 및 이소시트레이트로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제(dehydrogenase) 및 이소시트레이트 데히드로게나아제로 구성된 군으로부터 선택된 효소를 더 포함하는 방법.
14. 제 8항에 있어서, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 ISA247의 대사산물을 단리하는 단계를 더 포함하는 방법.
15. a) ISA247의 1-아미노산 잔기의 β-알코올을 보호하여 보호된-ISA247 화합물을 형성하는 단계;

    b) 보호된-ISA247을 4, 6 또는 9-아미노산 잔기 1 이상의 측쇄의 γ-탄소에서 할로겐화제에 의해 할로겐화시켜 할로겐화된 생성물을 형성하는 단계;

    c) 단계 b)의 할로겐화된 생성물을 아세테이트 시약의 존재하에서 가열하여 아세테이트 성분을 갖는 아세테이트-함유 생성물을 형성하는 단계; 및

    d) 단계 c)의 아세테이트-함유 생성물의 아세테이트 성분을 알코올 성분으로 교환하기 위해 에스테르교환반응을 실시하여 ISA247의 히드록실화된 대사산물을 형성하는 단계를 포함하는, ISA247의 히드록실화된 대사산물을 제조하는 방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 할로겐화제는 N-브로모숙신이미드(NBS)일 수 있고 또 아세테이트 시약은 테트라부틸암모늄 아세테이트인 방법.
17. 제 15항의 방법에 의해 제조된 ISA247의 단리된 히드록실화된 대사산물.
18. 제 17항에 있어서, 히드록실화된 대사산물은 IM9, IM4, IM6, IM46, IM69 및 IM49로 구성된 군으로부터 선택되는 단리된 히드록실화된 대사산물.
19. 단리된 ISA247의 1-아미노산 잔기의 측쇄의 알켄 성분을 산화제로 산화시켜 ISA247의 에폭사이드 대사산물을 형성하는 것을 포함하는, 시험관내에서 ISA247의 에폭사이드 대사산물을 제조하는 방법.
20. 제 19항에 있어서, 상기 산화단계는 프릴레즈하에브 반응인 방법.
21. 제 19항에 있어서, 상기 산화제는 m-클로로과벤조산 (MCPBA), 과아세트산, 트리플루오로과아세트산, 과벤조산, 3,5-디니트로과벤조산, 과산화수소, 알킬 과산화물 및 산소로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
22. 제 19항에 따른 방법에 의해 제조된 ISA247의 단리된 에폭사이드 대사산물.
23. 제 22항에 있어서, 상기 대사산물은 IM1-e-1, IM1-e-2 및 IM1-e-3을 포함하는 군으로부터 선택되는 단리된 에폭사이드 대사산물.
24. a) ISA247의 1-아미노산 잔기의 측쇄의 알켄 성분을 산화제와 처리하여 ISA247의 에폭사이드 대사산물을 형성하는 단계; 및

    b) 상기 단리된 ISA247의 에폭사이드 대사산물로부터 ISA247의 단리된 디올 대사산물을 형성하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 ISA247의 디올 함유 대사산물을 제조하는 방법.
25. 제 24항에 있어서, 단계 a)가 프릴레즈하에브 반응인 방법.
26. 제 24에 있어서, 산화제는 m-클로로과벤조산(MCPBA), 과아세트산, 트리플루오로과아세트산, 과벤조산, 3,5-디니트로과벤조산, 과산화수소, 알킬 과산화물, 및 산소로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
27. 제 24항에 있어서, 단계 b)는 ISA247의 에폭사이드를 가수분해하는 것을 포함하는 방법.
28. 제 27항에 있어서, 단계 b) 중의 가수분해는 산 또는 염기에 의해 촉진되는 방법.
29. 제 27항에 있어서, 단계 b)는

    과염소산 또는 Nafion-H에 의해 촉진된 가수분해;

    디메틸 술폭사이드 중의 알칼리성 가수분해; 또는

    마이크로솜 에폭사이드 가수분해효소에 의해 촉진된 가수분해를 포함하는 방법.
30. 제 24항에 따른 방법으로 제조된 ISA247의 단리된 디올 대사산물.
31. 제 30항에 있어서, 단리된 디올 대사산물이 IM1-d-1, IM1-d-2, IM1-d-3 및 IM1-d-4로 구성된 군으로부터 선택되는 단리된 디올 대사산물.
32. 단리된 ISA247를 사산화 오스뮴, 알칼리성 과망간산 칼륨, 과산화수소, 모노과숙신산 및 t-부틸 히드로과산화물로 구성된 군으로부터 선택된 시약과 반응시켜 ISA247의 디올 대사산물을 형성하는 단계를 포함하는, ISA247의 디올 대사산물을 제조하는 방법.
33. 제 32항에 있어서, ISA247을 촉매량의 사산화 오스뮴과 반응시키는 방법.
34. 제 32항에 있어서, ISA247은 과산화수소/포름산 및 모노과숙신산으로 구성된 군으로부터 선택되는 시약과 반응하는 방법.
35. a) ISA247을 요오드/은 벤조에이트 및 은 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택된 시약과 반응시켜 ISA247의 디에스테르를 형성하는 단계; 및

    b) ISA247의 디에스테르를 가수분해하여 ISA247의 디올 대사산물을 형성하는 단계를 포함하는 ISA247의 디올 대사산물을 제조하는 방법.
36. 제 35항의 방법에 의해 제조한 ISA247의 단리된 디올 대사산물.
37. 제 36항에 있어서, 상기 단리된 디올 대사산물은 IM1-d-1 및 IM1-d-2로 구성된 군으로부터 선택되는 단리된 디올 대사산물.
38. a) ISA247을 납 테트라아세테이트 및 탈륨 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택된 시약과 반응시켜 ISA247의 디올 비아세테이트를 형성하는 단계; 및

    b) 상기 ISA247의 디올 비아세테이트를 가수분해시켜 ISA247의 디올 대사산 물을 형성하는 단계를 포함하는, ISA247의 디올 대사산물의 제조방법.
39. 제 38항의 방법으로 제조한 ISA247의 단리된 디올 대사산물.
40. 제 39항에 있어서, 단리된 디올 대사산물은 IM1-d-1 및 IM1-d-2로 구성된 군으로부터 선택되는 단리된 디올 대사산물.
41. 약학적으로 허용되는 담체 및 제 1항의 단리된 화합물을 포함하는 약학적 조성물.
42. 약학적으로 허용되는 담체 및 제 2항의 단리된 화합물을 포함하는 약학적 조성물.

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