CN101120012A - 环孢菌素类似物的代谢物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了环孢菌素类似物ISA247的分离的代谢物及其体外制备方法。所述代谢物含有对ISA247的化学修饰，其中该修饰为选自以下的至少一个反应：羟基化、N－脱甲基化、二醇形成、环氧化物形成和分子内环化、磷酸化、硫酸化、葡糖苷酸形成和糖基化。制备方法包括半合成方法，其中ISA247代谢物从动物肝细胞微粒体提取物制造或从使用微生物的培养物制造，以及还包括完全合成法，例如使用有机合成方法化学修饰母体化合物或分离的代谢物。

Description

环孢菌素类似物的代谢物

与相关申请的交叉引用

本申请书要求2004年12月17日提交的美国临时专利申请序列号60/637,392的优先权，其全文教导通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及ISA247或ISA_TX247(环孢菌素A的衍生物)的分离的代谢物。本发明还涉及制造和分析分离的ISA247代谢物的方法。

参考文献

美国专利号No.6,605,593

美国专利号No.6,613,739

美国2003/0212249。

国际公开号WO 99/18120

国际公开号WO 03/033527

国际公开号WO 2003/033526

国际公开号WO 2003/033527

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背景技术

环孢菌素是具有有效免疫抑制剂活性的环多肽家族的一个成员。至少部分这类化合物(如环孢菌素A)是由物种Tolypocladium inflatum Gams作为次级代谢物产生的。作为一种免疫抑制剂，环孢菌素被证明能抑制体液免疫和细胞介导的免疫反应，如同种异体移植物排斥、迟发型超敏反应、实验性变应性脑脊髓炎、Freund’s佐剂关节炎和移植物抗宿主疾病。其被用于在器官移植中预防器官排斥；以及用于治疗类风湿性关节炎和用于治疗银屑病。

尽管环孢菌素家族中大量化合物是已知的，环孢菌素A可能是医学应用最为广泛的。环孢菌素A的免疫抑制效应涉及对T细胞介导的激活作用的抑制。免疫抑制通过环孢菌素与被称为亲环蛋白的普遍存在的细胞内蛋白结合来完成。该复合物依次抑制钙依赖磷酸酶的钙和钙调蛋白依赖性丝氨酸-苏氨酸磷酸酶活性。对钙依赖磷酸酶的抑制阻止转录因子如NFAT_p/c和NF-_KB的激活，所述转录因子对于T细胞激活中细胞因子基因(IL-2、IFN-γ、IL-4和GM-CSF)的诱导是必需的。

环孢菌素还抑制T辅助细胞体外对淋巴因子的生产，并阻止胸腺中成熟CD8和CD4细胞的发育。环孢菌素的其它体外特性包括抑制产生IL-2的T淋巴细胞和细胞毒性T细胞，抑制由激活的T细胞释放的IL-2，抑制应答异型抗原和外源淋巴因子的静止(resting)T淋巴细胞，抑制IL-1产生和抑制产生IL-2的T淋巴细胞的促分裂原激活。

尽管环孢菌素具有有利的免疫抑制、抗炎症和抗寄生虫效应，环孢菌素A治疗涉及到大量不良作用。这些作用包括肾毒性、肝毒性、致白内障、多毛症、parathesis和牙龈增生(仅列出部分)。其中，肾毒性是由环孢菌素给药引起的最为严重的剂量相关副作用之一。立即释放环孢菌素A药物产品(例如Neoral和Sandimmune)可引起肾毒性和其它毒性副作用，因为它们快速释放进血流中，并产生快速释放的后果一一高浓度。尽管环孢菌素A引起肾损伤的精确机制是未知的，但已提出：提高肾中血管收缩物质的水平引起传入血管小球微动脉的收缩。这可引起肾缺血、肾小球滤过率的降低和长时间时引起间质纤维化。

因此，需要这样一种免疫抑制剂：其药理学效力与天然存在的环孢菌素A化合物相当，但是具有降低的毒性副作用。

自从最初发现环孢菌素以来，已经分离和鉴定了大量天然存在的环孢菌素。另外，已经通过部分或完全合成手段和应用改造的细胞培养技术制备了许多并非天然存在的环孢菌素。因此，该分类包含实质上的环孢菌素，并包括例如天然存在的环孢菌素A到Z；多种非天然存在环孢菌素衍生物；人工的或合成的环孢菌素，包括二氢环孢菌素和异环孢菌素；衍生的环孢菌素(例如MeBmt残基的3’-O-原子可被酰化，或3-位置上十二烷基肌氨酸钠残基上可引入其它取代基)；其中MeBmt残基以异构形式存在的环孢菌素(例如其中MeBmt残基位置6’和7’间的构型为顺式而非反式)；和其中肽序列中特定位置上并入变异氨基酸的环孢菌素。

在位置1含有修饰的氨基酸的环孢菌素类似物公开于WO 99/18120和WO 03/033527中，其被转让给本申请的受让人，其整体通过引用并入本文。这些申请文件描述了称为“ISA_TX247”或“ISA247”或“ISA”的环孢菌素衍生物。该类似物除了氨基酸-1残基上的修饰外，结构上与环孢菌素A相同。申请人先前发现ISA247的顺式和反式异构体的某些混合物(包括主要包含反式ISA247的混合物)与天然存在和目前已知的环孢菌素相比，显示组合了加强的效力和降低的毒性。也已公开ISA247某些烷基化的、芳基化的和氘化的衍生物。

已经研究了环孢菌素A的代谢物，并在一些情况下发现其具有与母体药物同样有力的效用。另外，已使用代谢物制造识别这些代谢物的抗体。这些抗体可用于监测患者血(治疗药物监测或TDM)中的药物数量。特异识别代谢物的抗体可通过结合代谢物用于进行这些TDM检测，所述代谢物可以其它方式引起患者血中药物数量的错误高计算。因此，本领域需要鉴定和分离ISA247代谢物，以及用于制备和使用这些代谢物的方法。

发明内容

本发明涉及对环孢菌素类似物ISA247的代谢物的鉴定和分离。本发明还提供了制备和使用环孢菌素类似物ISA247的方法。这类代谢物被认为具有有用的免疫抑制活性，并可显示比母体化合物小或相等的毒性。它们还可用于开发用于治疗药物监测的测定法。

在本发明的实施方案中，ISA247的代谢物包括由下式代表的分离的化合物及其药学可接受盐和溶剂化物：

其中

各R²独立地为-H或-CH₃；

各R¹⁰独立地为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO₂、-OR^a、-C(O)R^a、-OC(O)R^a、-C(O)OR^a、-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₃R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-PO₂R^aR^b、-OPO₂R^aR^b、-PO₃R^aR^b、-OPO₃R^aR^b、-N(R^aR^b)、-C(O)N(R^aR^b)、-C(O)NR^aNR^bSO₂R^c、-C(O)NR^aSO₂R^c、-C(O)NR^aCN、-SO₂N(R^aR^b)、-SO₂N(R^aR^b)、-NR^cC(O)R^a、-NR^cC(O)OR^a或-NR^cC(O)N(R^aR^b)；

R⁵、R⁶、R⁷、R⁸和R⁹独立地为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO₂、-OR^a、-C(O)R^a、-OC(O)R^a、-C(O)OR^a、-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₃R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-PO₂R^aR^b、-OPO₂R^aR^b、-PO₃R^aR^b、-OPO₃R^aR^b、-N(R^aR^b)、-C(O)N(R^aR^b)、-C(O)NR^aNR^bSO₂R^c、-C(O)NR^aSO₂R^c、-C(O)NR^aCN、-SO₂N(R^aR^b)、-SO₂N(R^aR^b)、-NR^cC(O)R^a、-NR^cC(O)OR^a或-NR^cC(O)N(R^aR^b)；或R⁶和R⁷一起为-O-；或R⁵和R⁶一起或R⁷和R⁸一起，为独立的-O-；或R⁸和R⁹一起为-O-；或R⁵与其结合的碳一起为-C(＝O)R^a、-CO₂R^a、-CH₂OR^a、-CH₂OC(O)R^a、-CH(OR^a)₂、-C(O)N(R^aR^b)、-C(＝NR^b)R^a、-C(＝NOR^b)R^a或-C(＝NNR^b)R^a；并且，R⁵和R⁶、R⁶和R⁷或R⁷和R⁸中一对为碳-碳键，且其余并非全为-H；和

R^a、R^b和R^c各自独立地为-H或任选被取代的脂肪族、环脂肪族、苯甲基或芳香基，或与-N(R^aR^b)一起为任选被取代的杂环基团，或与-CH(OR^a)₂一起为环缩醛基团。

在多种实施方案中，该化合物由下式为代表：

其中

各R²独立地为-H或-CH₃；

各R¹⁰独立地为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-OR^a、-OC(O)R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-OPO₂R^aR^b或-OPO₃R^aR^b；

R⁵、R⁶、R⁷、R⁸和R⁹独立地为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-OR^a、-OC(O)R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-OPO₂R^aR^b或-OPO₃R^aR^b；或R⁶和R⁷一起为-O-；或R⁵和R⁶一起，或R⁷和R⁸一起为独立的-O-；或R⁸和R⁹一起为-O-；或R⁵与其结合的碳一起为-C(＝O)R^a、-CO₂R^a、-CH₂OR^a、-CH₂OC(O)R^a、-CH(OR^a)₂、-C(O)N(R^aR^b)、-C(＝NR^b)R^a、-C(＝NOR^b)R^a或-C(＝NNR^b)R^a；并且，R⁵和R⁶、R⁶和R⁷或R⁷和R⁸中一对为碳-碳键，且其余并非全为-H；和

R^a、R^b和R^c各自独立地为-H或任选的取代的脂肪族、环脂肪族、苯甲基或芳香基，或与-N(R^aR^b)一起为任选的取代的杂环基团，或与-CH(OR^a)₂一起为环缩醛基团。

在某些实施方案中，该化合物以下式为代表：

其中

R¹选自下组：

各R²独立选自-CH₃和-H；

各R³独立选自-CH₂CH(CH₃)₂和-CH₂C(CH₃)₂OH；和

各R⁴独立选自-CH(CH₃)₂和-C(CH₃)₂OH。

本发明的多种实施方案包括环{{(E)-和(Z)-(2S，3R，4R)-3-羟基-4-甲基-2-(甲氨基)-6，8-壬二烯基(nonadienoyl)}-L-2-氨基丁酰-N-甲基-甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-丙胺酰-D-丙胺酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-缬氨酰}(ISA247)的分离的代谢物及其药学可接受盐和溶剂化物，其中与ISA247相比，分离的代谢物包含至少一种选自以下的化学修饰：羟基化、N-脱甲基化、形成二醇、形成环氧化物、分子内环化、磷酸化、硫酸化、形成葡糖苷酸和糖基化。

在具体的实施方案中，本发明提供了对母体化合物ISA247的至少一种化学修饰，其中该化学修饰选自羟基化、N-脱甲基化、形成二醇、形成环氧化物和分子内环化。

本发明的某些实施方案包括环{{(E)-和(Z)-(2S，3R，4R)-3-羟基-4-甲基-2-(甲氨基)-6，8-壬二烯基}-L-2-氨基丁酰-N-甲基-甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-丙胺酰-D-丙胺酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-缬氨酰}(ISA247)的代谢物，其包含对母体化合物的至少一种化学修饰，其中化学修饰选自以下：羟基化、N-脱甲基化、形成二醇、形成环氧化物和分子内环化。

在多种实施方案中，分离的代谢物包含至少一种选自以下的化学修饰：氨基酸-1侧链上环氧化物；氨基酸1侧链上的二醇；氨基酸-1侧链上的环醚；氨基酸-1、3、4、6、9、10或11上的脱甲基化氨基氮；氨基酸4、6、9或10侧链上γ碳上的-OH；和氨基酸5或11侧链上β碳上的-OH。在多种实施方案中，分离的代谢物包含两种或更多前述化学修饰。在特定的实施方案中，分离的代谢物可选自IM1-e-1、IM1-e-2、IM1-e-3、IM1-d-1、IM1-d-2、IM1-d-3、IM1-d-4、IM1-c-1和IM1-c-2。

在某些实施方案中，与ISA247相比，分离的代谢物包含选自以下的化学修饰：至少两个-OH基团；至少两个去甲基化的氨基酸氮；至少一个-OH基团和至少一个去甲基化的氨基酸氮；至少一个二醇基团和至少一个-OH基团；至少一个二醇基团和至少一个去甲基化的氨基酸氮；至少一个环醚和至少一个-OH基团；至少一个环醚和至少一个去甲基化的氨基酸氮；至少一个-OH基团和磷酸酯、硫酸酯、葡糖苷酸或糖基化残基；和至少一个二醇和磷酸酯、硫酸酯、葡糖苷酸或糖基化残基。实施方案包括ISA247氨基酸-1上的代谢物，包括环氧化物、二醇和环化物。其它的实施方案包括这样的代谢物，其中ISA247化合物在1)至少一个甲基亮氨酸氨基酸上，例如氨基酸4、6、9或10；2)缬氨酸残基5；3)或缬氨酸残基11上被羟基化。其它的实施方案包括其中ISA247的酰胺键中至少一个甲基化氮被去甲基化的代谢物。其它实施方案还包括其中ISA247的氨基酸1、3、4、6、9、10和11的酰胺键中至少一个氮被去甲基化的代谢物。ISA247示例性的代谢物包括IM1-d-1、IM1-d-2、IM1-d-3、IM1-d-4、IM9、IM1-c-1、IM1-c-2、IM4n、IM6、IM46、IM69、IM49、IM1-e-1、IM1-e-2和IM1-e-3。

其它的实施方案包括ISA247的氨基酸-1上具有二醇或环化，且另一氨基酸残基有至少一处羟基化或至少一处N去甲基化的代谢物。另外，实施方案包括ISA247的氨基酸-1上具有二醇或环化，且另一氨基酸残基有至少一处羟基化或至少一处N去甲基化的代谢物。

在多种实施方案中，ISA247代谢物可在施用药物后从体液中分离，或可以半合成(即从动物肝细胞微粒体匀浆中，或微生物培养物中)或完全合成方式(例如使用有机合成领域已知的反应通过化学修饰母体化合物)制造。

因此，本发明的一些实施方案提供体外制备ISA247代谢物的方法，包括以下步骤：a)均质化哺乳动物细胞(如哺乳动物肝细胞)以形成匀浆(例如破坏其质膜并释放肝细胞内容物)；b)离心匀浆以形成微粒体沉淀，所述微粒体沉淀包含至少一种药物代谢酶，例如细胞色素P450；和c)在引起产生至少一种ISA247代谢物的条件下，制备含有ISA247、微粒体沉淀、能量来源和电子供体种类的反应混合物。在其它实施方案中，该方法可使用选自灵长类、大鼠、犬和兔的哺乳动物肝细胞，或在一些实施方案中来自犬或兔。电子供体种类可以是例如NADH和NADHP。能量来源可以是例如选自葡萄糖-6-磷酸和异柠檬酸盐。在某些实施方案中，反应混合物还包含选自葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的酶。

在其它实施方案中，本发明提供使用高效液相色谱制备ISA247的分离的代谢物的方法。在其它实施方案中，色谱柱可以是正十八烷基、正辛基、正丁基、联苯和氰基丙基柱，并可具有约150mm到250mm范围内的长度，约O.1到4.6mm范围内的直径和约500到2,000μL/min的流速。另外，本发明的实施方案还提供可通过质谱法鉴定的代谢物。

本发明的实施方案还提供了制备ISA247的羟基化代谢物的方法，该方法包括以下步骤：a)保护ISA2471-氨基酸残基上的β-醇，形成受保护的ISA247化合物；b)用卤化剂在至少4、6或9-氨基酸残基之一侧链上的γ-碳上卤化受保护的ISA-247化合物，从而形成卤化的产物；c)在存在乙酸盐试剂时加热步骤b)的卤化产物形成具有乙酸基的含乙酸基产物；和d)进行酯交换，将步骤c)的含乙酸基产物中的乙酸基部分与醇部分交换，从而形成ISA247的羟基化代谢物。在具体的实施方案中，卤化剂可以是例如N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，而乙酸盐试剂可以是例如乙酸四丁基铵。

多种实施方案包括通过上述方法制造的ISA247的分离的羟基化代谢物。示例性的分离的羟基化代谢物可选自IM9、IM4、IM6、IM46、IM69和IM49。

本发明的实施方案提供了用于体外制造ISA247的环氧化物代谢物的方法，所述方法包括如下步骤：用氧化剂氧化(例如使用Prilezhaev反应)分离的ISA247 1-氨基酸残基侧链的烯部分，从而形成ISA247的环氧化物代谢物。氧化剂可以是例如m-氯过苯甲酸(MCPBA)、过氧乙酸、三氟过氧乙酸、过苯甲酸、3，5-双氮过苯甲酸、过氧化氢、烷基过氧化物、氧等。

多种实施方案包括通过上述方法制造的ISA247的分离的环氧化物代谢物。示例性的分离的环氧化物代谢物包括IM1-e-1、IM1-e-2和IM1-e-3。

本发明的另一实施方案提供了体外制备ISA247的含二醇代谢物的方法，包括步骤：a)保护β-OH基团；b)用氧化剂处理ISA247侧链氨基酸-1残基的烯部分，从而将烯部分转化为单环氧化物；c)从环氧化物形成ISA247的含二醇代谢物；和d)使用碱脱保护β-OH基团。

本发明的其它实施方案包括制造ISA247的含二醇代谢物的方法，该方法包括如下步骤：用氧化剂氧化ISA247的1-氨基酸残基侧链的烯部分，形成ISA247的环氧化物代谢物(例如Prilezhaev反应)；和b)从分离的ISA247的环氧化物代谢物形成ISA247的分离的二醇代谢物。氧化剂的典型例子包括m-氯过苯甲酸(MCPBA)、过氧乙酸、三氟过氧乙酸、过苯甲酸、3，5-双氮过苯甲酸、过氧化氢、烷基过氧化物和氧。在另一实施方案中，从环氧化物形成ISA247的含二醇代谢物的步骤b)包括将步骤a)的环氧化物用水(例如水解)进行亲核攻击。通过水的亲核攻击可用选自酸和碱的试剂催化，例如高氯酸、碱水、Nafion-H、甲酸等。在具体的实施方案中，步骤b)中的水解选自由高氯酸或Nafion-H催化的水解；在二甲基亚砜中进行的碱水解和由微粒体环氧化物水解酶催化的水解。

多种实施方案包括由上述方法制备的ISA247的分离的二醇代谢物。示例性的分离的二醇代谢物包括IM1-d-1、IM1-d-2、IM1-d-3和IM1-d-4。

在另一实施方案中，本发明提供制造ISA247的含二醇代谢物的方法，包括使用四氧化锇和碱性高锰酸钾或过氧化氢，或叔丁基过氧化氢或过氧化氢/甲酸或单过琥珀酸和，从ISA247直接形成二醇代谢物的步骤。在典型的实施方案中，ISA247与选自四氧化锇、碱性高锰酸钾、过氧化氢、单过琥珀酸和t-丁基过氧化氢的试剂反应，从而形成ISA247的二醇代谢物。一般而言，ISA247可与催化数量的四氧化锇反应。在一些实施方案中，ISA247可与选自过氧化氢/甲酸和单过琥珀酸的试剂反应。

在一些实施方案中，制造ISA247的二醇代谢物的方法包括步骤：a)用选自碘/苯甲酸银和乙酸银的试剂处理ISA247，形成ISA247二酯；和b)水解ISA247二酯，从而形成ISA247二醇代谢物。

多种实施方案包括由上述方法制备的ISA247的分离的二醇代谢物。示例性的分离的二醇代谢物包括IM1-d-1和IM1-d-2。

在一些实施方案中，制备ISA247的二醇代谢物的方法包括步骤：a)将ISA247与选自四乙酸铅和乙酸亚铊的试剂反应，形成ISA247二醇bisacetate；和b)水解ISA247二醇bisacetate从而形成ISA247二醇代谢物。

多种实施方案包括由上述方法制备的ISA247的分离的二醇代谢物。示例性的分离的二醇代谢物包括IM1-d-1和IM1-d-2。

在另一实施方案中，从乙烯基环氧化物制备代谢物二醇，其可被有机金属部分如卤代烯丙基硼酸化(haloallylborations)接近。这类乙烯基环氧化物也可得自Sharpless二羟基化流程。

本发明具体的实施方案包括药学组合物，其含有药学可接受载体和本发明的任何分离的化合物或代谢物。

附图概述

图1是CsA结构图解。

图2是ISA247的结构图解。

图3是ISA247 E(反式)异构体的图解。

图4是OSA247 Z(顺式)异构体的图解。

图5是显示已知的CsA代谢物的表格。

图6是施用ISA247后人全血中存在的代谢物HPLC-MRM扫描。

图7是分离的ISA247代谢物的混合标准HPLC-MRM扫描。

图8显示了来自样品KI-2的E-ISA247、Z-ISA247和IM1-d-1的¹H-NMR谱。

图9是来自样品KI-2的IM1-d-1的2D TOCSY谱。

图10显示了IM1-d-1的结构。

图11显示了来自样品KI-3A的E-ISA247和IM1-d-2的¹H-NMR谱。

图12显示了来自样品KI-3A的IM1-d-2的2D COSY和TOCSY谱。

图13显示了来自样品KI-3A的IM1-d-2在3.8和6.2ppm之间的放大的2D COSY谱。

图14显示了来自样品KI-3A的IM1-d-2的在3.8和6.2ppm之间的放大的¹H-NMR谱。

图15显示了IM1-d-2(样品KT-3A)双键质子的放大的¹H-NMR谱，指出信号的分裂模式。

图16显示了放大的IM1-d-2(样品KI-3A)的2D COSY谱，显示aa-1侧链质子的相关性。

图17阐释了IM1-d-2的ε位置aa-1侧链的R和S差向异构体的结构。

图18显示了IM1-d-2的氨基酸-1结构及其质子化学迁移。

图19显示了IM1-d-1、IM1-d-3、E-ISA247和Z-ISA247的¹H-NMR谱。

图20显示了IM1-d-3(样品KI-3)的2D TOCSY谱。

图21显示在IM1-d-3(样品KI-3)的放大的TOCSY谱中对应相应α质子的酰胺质子。

图22也显示在IM1-d-3(样品KI-3)的放大的TOCSY谱中，酰胺质子与相应的侧链甲基质子的相关性。

图23显示了在3.5和6.1ppm之间放大的IM1-d-3(样品KI-3)的¹HNMR谱和一些TOCSY相关性。

图24显示了3.4和6.3ppm之间的放大的IM1-d-3(样品KI-3)的2DTOCSY谱，和交叉峰相关性。

图25显示了放大的IM1-d-3(样品KI-3)的¹H-NMR谱，和δ5.62ppm处的信号分析。

图26显示了IM1-d-3的aa-1侧链η位置的R和S异构体的结构。

图27显示了IM1-d-4(样品KI-8A)和E-ISA247的¹H-NMR谱。

图28A显示了2D COSY谱，而图28B显示IM1-d-4(样品KI-8A)的2D TOCSY谱。

图29显示了3.5和6.2之间放大的IM1-d-4(样品KI-8A)2D COSY谱和相关性。

图30为3.7和6.2ppm间放大的IM1-d-4(样品KI-8A)¹H-NMR谱，和COSY相关性和一些质子分配。

图31是δ～6.00、5.44和5.15ppm处对IM1-d-4(样品KI-8A)的¹H-NMR信号的一级(first order)分析。

图32阐释了IM1-d-4的结构。

图33比较了E-ISA247、Z-ISA247和IM1-c-1(样品KI-5)的¹H-NMR谱。

图34显示了放大的IM1-c-1(样品KI-5)¹H-NMR谱的α质子区。

图35显示了如图34所示IM1-c-1(样品KI-5)在δ～5.75ppm处的信号分析。

图36显示了α质子区放大的IM1-c-1(样品KI-5)的2D TOCSY谱线。

图37为部分放大的IM1-c-1(样品KI-5)DQF-COSY谱线。

图38阐释了IM1-c-1的结构。

图39为IM1-c-1(样品KI-5)的2D ROESY谱。

图40为显示ROE相关性的IM1-c-1氨基酸-1侧链结构的图解。

图41为阐释ISA247氨基酸-1代谢物形成的示例性反应流程图。

图42A是阐释从反式ISA247形成ISA247氨基酸-1代谢物的示例性反应流程图。

图42B是阐释从顺式ISA247形成ISA247氨基酸-1代谢物的示例性反应流程图。

图43是从反式ISA247形成IM1-d-1和从顺式ISA247形成IM1-d-3的示例性反应流程图。

图44A为KI-7C、E-ISA247和Z-ISA247¹H-NMR谱的比较。

图44阐释了IM9的结构。

图45是IM4(样品KI-6)、ISA247 E和Z-ISA247的¹H-NMR谱比较。

图46是IM4(样品KI-6)、ISA247 E和Z-ISA247在0.5和1.5ppm之间的放大的¹H-NMR谱比较。

图47是显示IM4新甲基信号的放大的¹H-NMR。

图48是IM4(样品KI-6)的2D TOCSY谱。

图49是显示氨基酸-4γ位置转化形成IM4的流程。

图50阐释了IM4的结构。

图51是IM4n(样品KI-1)、ISA247 E和Z-ISA247的¹H-NMR谱的比较。

图52是放大的IM4n(样品KI-1)2D TOCSY谱。

图53阐释了IM4n的结构。

图54阐释了使用Sharpless方法的化学反应流程。

图55阐释了用于指导特定的顺或反二醇合成的化学合成方法。

图56阐释了使用氯烯丙基硼酸化(chloroallylboration)的化学合成方法。

图57是阐释了从E-ISA247形成IM-1、IM-1-缩醛、IM1-醛和IM1-羧酸的示例性反应流程。

图58A是显示钙依赖磷酸酶的抑制百分比与ISA247代谢物IM1-二醇-1、IM9、IM4n、IM1c和IM1的代谢物浓度(ng/mL)相比较的图。

图58B是显示钙依赖磷酸酶的抑制百分比与反式ISA247、顺式ISA247和CsA浓度(ng/mL)相比较的图。

图59是显示ATCC11635在ISA247产生中的典型的代谢分布谱的柱形图。显示的转化率为与1mg/mL环孢菌素A标准相比的百分比。

发明详述

本发明鉴定了环孢菌素类似物ISA247的代谢物。本发明还提供了制备环孢菌素类似物ISA247的代谢物的方法。这类代谢物具有免疫抑制活性。它们还可用于开发治疗药物监测的测定法，包括制造抗体。

环孢菌素A是由Tolypocladium inflatum Gams深层培养物产生的中性的、高度亲脂的环状十一肽。其临床编码为27-400，并是商标为Sandimmune的免疫抑制配方的活性成分。

环孢菌素A最近被重新命名为“环孢霉素”(根据Carruthers，1983)。在本申请书中，缩写“CsA”将用于表示特定的化合物环孢菌素A，且术语“环孢菌素”旨在表示含有具免疫抑制活性环肽的一般免疫抑制剂类别，包括环孢菌素类似物。因此，术语“环孢菌素”通常是指环孢菌素A到Z之任一，包括修饰物和类似物。术语环孢菌素特别包括化合物CsA和ISA247。

CsA及其代谢物的结构和命名

环孢菌素A的结构显示在图1中。如N.R.Hartman and I.Jardine in“Mass Spectrometric Analysis of Cyclosporine Metabolites，”Biomed.Environ.Mass Spectrom.Vol.13，pp.361-372(1986)所述，环孢菌素A是基本上完全由疏水氨基酸组成的环状十一肽。许多这类氨基酸通常不存在于蛋白质中。图1鉴别了包含该分子环状肽环的11氨基酸残基。C_sA分子含有肌氨酸(Sar或甲基化的甘氨酸残基MeGly)、D和L丙氨酸(Ala)残基各一、α-氨基丁酸残基(Abu)、缬氨酸(Val)残基、N-甲基缬氨酸(MeVal)、四个N-甲基亮氨酸(MeLeu)残基和一个仅与环孢菌素有关的含烯9碳β-羟基化氨基酸——即(4R)-4-[(E)-2-丁烯基]-4，N-二甲基-L-苏氨酸(MeBmt)的。

本文使用的氨基酸残基从(4R)-4-[(E)-2-丁烯基]-4，N-二甲基-L-苏氨酸(MeBmt)开始到佐剂MeVal为止依次排序为1-11(在图1中，从MeBmt开始顺时针排序)。

除了位置8上丙氨酸残基为R构型(丙氨酸D-异构体)外，各C_sA氨基酸均具有S-构型(氨基酸的L-异构体)。七个氨基酸(为残基1、3、4、6、9、10和11)在其氨基氮原子上被甲基化。发现环孢菌素A结构时，2-11的十个氨基酸是已知的，但是β-羟基化的氨基酸MeBmt是未知的。

ISA247(或ISA_TX247或ISA)的结构显示于图2中。本文使用的ISA247中氨基酸残基位置和公开的代谢物如图1在CsA中排序。通过与图1比较可以看出，除氨基酸残基1的侧链外，CsA和ISA247是相同的。这些环孢菌素的一般结构可由图3和图4中所示方框代表，其说明了ISA247的E(反式)和Z(顺式)异构体形式，其中数字1指出所示侧链所结合的氨基酸残基1。图41和42和表5中类似地说明了氨基酸残基l的结构。

当本公开文件中明确绘出氨基酸侧链的结构时，应如本领域常规已知的用希腊字母标记该侧链的碳。例如与氨基酸羰基相邻的碳惯例上标记为α-碳，用使用的希腊字母表中递增的字母标记离肽环越来越远的碳原子。该命名法的例子显示在图1和2中。例如在C_SA情况下，MeBmt侧链的β-碳与羟基结合，侧链的ε和ζ-碳之间存在双键。

P.A.Keown在Immunosuppression in Transplantation(Blackwell Science，Malden MA，1999)，pp.1-12的称为“Molecular and Clinical Therapeutics ofCyclosporine in Transplantation”的一章中提供了C_SA结构的其它信息。据Keown所述，在非水溶液中的固相X射线衍射和核磁共振研究显示C_SA分子以两种结构基序为特征。残基MeBmt(位置1)到MeLeu(位置6)包含通过氢键稳定的反向平行的β-折叠，而残基Ala(位置7)到MeVal(位置11)形成环，该环中残基9和10之间的肽键为顺式构型。免疫抑制性环孢菌素具有两个调节结构域。残基1、2、9、10和11代表受体结合结构域，而残基4到8起效应子结构域作用。根据R.M.Wenger，“Synthesis of Cyclosporine and Analogs：Structural Requirements forImmunosuppressive Activity，”Angew Chem Int.Ed.Engl.Vol.24，No.2，pp.77-138(1985)，免疫抑制的关键氨基酸为位置1、2、3和11的MeBmt、Abu、Sar和MeVal。

CsA的环状十一肽结构保留在所有所述代谢物中(Copeland，1990)。这些环状肽生物转化中涉及的反应为(对于大部分而言)羟基化、环氧化物形成、N-脱甲基化和分子内环化。术语“羟基化”是指单羟基化，尽管可在同一分子的不同位点发生多重羟基化。二羟基化也可通过将烯氧化为环氧化物，随后形成二醇而发生。N-脱甲基化发生在连接环状肽环上相邻氨基酸残基的酰胺键的甲基化的氮上。CsA代谢物包括醛和羧酸衍生物。CsA的羧酸代谢物的形成可产生毒性。也可发生上述反应的组合。

大量不同的研究者已经描述了C_SA代谢物，尽管并非总使用相同的命名法。为了澄清这种情况，在图5中构建了已知的C_SA代谢物表格。根据图5，环孢菌素A的代谢物以前缀“C_SA-Am”识别，其中名称中的“C_SA”部分指明该化合物为环孢菌素A的代谢物，而符号中的“Am”部分指明代谢修饰发生的氨基酸位置。后面的标志指定了代谢反应的性质。使用该命名法将使得以下对ISA247代谢物的讨论更为清楚。

ISA247及其代谢物的结构和命名法

本发明的发明人先前公开了称为“ISA”、“ISA247”或“ISA_TX247”(参阅美国专利号No.6,605,593和6,613,739)的环孢菌素A类似物。如上文所述，该类似物除氨基酸-1残基上的修饰外，在结构上与环孢菌素A类似。本发明发现ISA247的顺式异构体(也称为Z-异构体)和反式异构体(也称为E-异构体)的某些混合物显示了与天然存在和目前已知的环孢菌素相比，组合了增强的效力和降低的毒性。另外，本发明人还发现主要由反式异构体组成的顺式异构体和反式异构体的混合物与天然存在和目前已知的环孢菌素相比，具有降低的毒性和提高的效力。

ISA247的化学名称为环{{(E)-和(Z)-(2S，3R，4R)-3-羟基-4-甲基-2-(甲氨基)-6，8-nonadienoyl}-L-2-氨基丁酰-N-甲基-甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-丙胺酰-D-丙胺酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-缬氨酰}。其经验式为C₆₃H₁₁₁N₁₁O₁₂，且其具有约1214.85的分子量。术语“ISA”、“ISA247”和“ISA_TX247”是给予该药学活性化合物的商品名。

ISA247的结构最初通过核磁共振(NMR)光谱确认。¹H和¹³C谱均使用一系列一维和二维NMR实验并通过将ISA247峰与已知的环孢菌素A的NMR分配比较来确定。ISA247的(E)和(Z)异构体的绝对分配通过NuclearOverhauser Effect(NOE)实验确认。额外的支持证据由质谱分析法(其确定分子量)和红外光谱(发现其与环孢菌素A极为相似)提供。鉴于这两种化合物之间的结构类似性，后者的结果是预期的。然而，ISA247在其1-氨基酸残基侧链上含有CSA中不存在的共轭二烯。类似C_SA，ISA247在其氨基酸-1侧链上ε-和ζ-碳之间具有碳-碳双键，但是与CSA不同，ISA247中η和θ碳之间有一个额外的碳-碳双键。

由于CsA和ISA247结构之间的类似性，公开的ISA247代谢物的命名法基于为CsA代谢物开发的命名方案。本文鉴定的代谢物将遵循类似的模式，除了ISA247代谢物带有前缀“I”表示“ISA”，以代替“A”表示环孢菌素“A”。并且，当字母“AM”用于识别CsA代谢物的修饰的氨基酸时，ISA代谢物将使用“IM”。例如，氨基酸-9的γ-碳上单羟基化的CsA代谢物被鉴定为CsA-Am9或AM9。氨基酸-9的γ-碳上单羟基化的ISA247代谢物被鉴定为IM9。位置4 MeLeu上的氮脱甲基化的CsA代谢物被鉴定为CsA-Am4n或AM4n。位置4 MeLeu上的氮脱甲基化的ISA247代谢物被鉴定为IM4n(ISA Metabolite at amino acid-4，n-demethylation)。

由于ISA247在氨基酸-1上具有1，3二烯，一些不能从CsA形成的二醇代谢物可从ISA247形成。这些二醇代谢物的命名法模仿上述的标准。例如，结构被阐明的第一个二醇代谢物为IM1-d-1(ISA Metabolite at theamino acid-1-diol-1 ^st structure examined)。

类似CsA，ISA247可体内代谢形成代谢物。这些代谢物通过血流运输并可通过尿和/或胆汁分泌。因此，ISA247代谢物可在施用药物后从动物体液(包括全血、胆汁和尿)中分离。ISA247代谢物还可由微生物通过生物转化制造。另外，ISA247代谢物可使用哺乳动物微粒体体系制备。ISA247代谢物还可化学合成。可通过与质谱法结合的色谱技术与核磁共振(NMR)技术分离并分析代谢物。

在额外的实施方案中，本发明提供特异识别本发明代谢物的抗体。特别包括的是识别给定代谢物而不与环孢菌素、ISA247或其它代谢物交叉反应的抗体。抗体可以是多克隆、单克隆、多特异性的、人的、人源化的、灵长源化的(primatized)、嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段(例如Fab、Fab’和F(ab’)2)等。本发明的代谢物可用于制备和/或筛选抗体。另外，如果多克隆抗体混合物(例如抗血清)与环孢菌素、ISA247或不期望的代谢物交叉反应，可用免疫选择或免疫吸附法处理混合物去除交叉作用的抗体。例如在免疫选择中，混合物可以经过固定了目的代谢物的柱。然后洗脱并收集与柱结合的抗体。相反的，在免疫吸附中，可以固定混合物与之交叉反应的化合物并用于吸收不期望的抗体。制备抗体的方法为本领域已知(参阅例如Harlow and Lane，“Antibodies.A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1988)。抗体可用于例如治疗药物监测。

定义

本文使用的“代谢物”是指通过在哺乳动物中代谢ISA247产生的ISA247衍生物，其还可被化学修饰。本文公开的ISA247的分离的代谢物可通过对哺乳动物施用ISA247然后分离制备；通过如本文所述化学修饰ISA247、CsA或另一环孢菌素衍生物制备；通过ISA247、CsA或另一环孢菌素衍生物体外与酶反应制备；通过ISA247、CsA或另一环孢菌素衍生物的微生物转化制备；或通过这些步骤中两种或更多以任意顺序组合制备。例如，可将ISA247施用给哺乳动物，并且从该哺乳动物中分离的ISA247代谢物可化学修饰以形成其它代谢物；或可将ISA247在体外与本文所述的微粒体制剂反应形成代谢物，其可化学修饰形成其它代谢物。

本文使用的“化学修饰的”是指化合物与参考结构相比，至少具有一处化学结构差异。化学修饰可通过任何本文所述的合成方法、酶方法或代谢方法制造。

本文使用的合适的保护基团(例如用于保护ISA247的1-氨基酸残基的B-醇以形成受保护的ISA247化合物)和用于保护和脱保护的条件为本领域已知，并被描述于例如Greene and Wuts，“Protective Groups in OrganicSynthesis”，John Wiley & Sons(1991)，其整体教导通过引用并入本文。合适的羟基保护基团的特定例子包括但不仅限于：取代的甲醚(例如甲氧基甲基、苯甲氧基甲基)、取代的乙醚(例如乙氧基甲基、乙氧基乙基)、二甲苯醚(苯甲基、硝基苯甲基、卤素苯甲基)、甲硅烷醚(例如三甲基硅烷基)、酯等。

本文使用的“卤化剂”是本领域已知能够将-H或其它基团取代为卤素的化合物。例如，在多种实施方案中，卤化剂可以是溴、氯、N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺等，特别是N-溴代琥珀酰亚胺。

本文使用的Prilezhaev反应是指通过烯烃与过酸的反应形成环氧化物。参阅例如N.Prilezhaev，Ber.42，4811(1909)；D.Swern，Chem.Rev.45，16(1949)；Org.React.7，378(1953)；H.O.House，Modem Synthetic Reactions(W.A.Benjamin，Menlo Park，California，2nd ed.，1972)pp 302-319；D.I.Metelitra，Russ，Chem.Rev.41，807(1972)；和D.Schnurgfeil，Z.Chem.20，445(1980)。这些参考资料的整体教导通过引用并入本文。

本文使用的“药物代谢酶”是体内或体外能够化学修饰CsA、ISA247或其代谢物的酶。药物代谢酶一般来自动或微生物(如哺乳动物)，例如通过匀浆哺乳动物细胞(例如肝细胞)制造含有药物代谢酶的微粒体制剂。在具体的实施方案中，药物代谢酶包括细胞色素P450酶家族的一个或多个成员。

本文使用的“能量源”包括可被药物代谢酶使用，以为化学修饰ISA247产生ISA247代谢物提供能量的一种或多种化合物。例如，能量源可以是碳水化合物，例如在具体的实施方案中为葡萄糖-6-磷酸、异柠檬酸盐等。微粒体制剂中可包含利于消化能量源的酶，例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸盐脱氢酶等。

本文使用的“电子供体种类”是可被药物代谢酶利用，作为化学修饰ISA247产生ISA247代谢物的氧化还原电子来源的化合物。例如，典型的电子供体种类包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。

本文使用的“分离的”是指从生物体系(例如哺乳动物、微生物细胞培养物的细胞等)中分离化合物(例如公开的ISA247代谢物)。分离的化合物一般也是纯化的，例如通过色谱分离、结晶、亲和纯化或其它本领域已知方法纯化。例如在具体的实施方案中，可通过高压液相色谱纯化公开的ISA247代谢物。

本文使用的“N-脱甲基化”是指从氨基酸氮上去除甲基。“氨基酸氮”是氨基酸主链上的氮，并非氨基酸侧链上的氮。

本文使用的“葡糖苷酸形成”是指通过将葡糖醛酸经糖苷键连接至ISA247或另一ISA247代谢物形成葡糖苷酸ISA247代谢物。

本文使用的“糖基化”是指糖与ISA247代谢物的羟基基团结合形成糖基化的ISA247代谢物。糖(或糖基化残基)可以具有一种或多种糖，例如包括二糖、低聚糖、多糖等。糖基化残基中包括的典型的糖为葡萄糖、甘露糖和N-乙酰葡糖胺。

本文使用的脂肪族基团是直链的、分支的或环状的非芳香烃，其可以完全饱和或含有一个或多个不饱和度。烷基为饱和的脂肪族基团。直链或分支的脂肪族基团一般具有1到约10个碳原子，优选1到约4个，且环状脂肪族基团具有3到约10个碳原子，优选3到约8个。脂肪族基团优选为直链或分支的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基或辛基，或具有3到约8个碳原子的环烷基。C1-C4直链或分支的烷基或烷氧基，或C3-C8的环烷基或烷氧基(优选C1-C4直链的或分支的烷基或烷氧基)也称为“低级烷基”或“低级烷氧基”；用-F、-Cl、-Br或-I取代的这类基团为“低级卤代烷基”或“低级卤代烷氧基”；“低级羟基烷基”是用-OH取代的低级烷基；等。

本文使用的“烯基”是由-(CH₂)_n-代表的连接烃基链，其中n为1-10的整数，优选1-4。

本文使用的术语“芳基”是指C6-C14的碳环芳香族基团，例如苯基、联苯等。芳基还包括融合的多环芳香环系统，其中碳环芳香环与其它芳基、环烷基或环脂肪环融合，例如萘基、芘基、蒽基等。

本文使用的术语“杂芳基”是指具有1个或更多O、S或N杂原子的5-14个成员的杂芳基基团。杂芳基基团的例子包括咪唑基、杂咪唑基、噻吩基、呋喃基(furanyl)、芴基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑基、杂噻唑基、噁唑基、杂噁唑基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、咪唑基、噻吩基、嘧啶基、喹唑啉基、吲哚基、四唑基等。杂芳基基团还包括融合的多环芳香族环体系，其中碳环芳香族环或杂芳基环与一个或多个其它的杂芳基环融合。例子包括苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并杂三唑基、苯并噁唑基、苯并杂噁唑基、苯并咪唑基、喹啉基、杂喹啉基和杂吲哚基。

本文使用的非芳香族杂环基团是环中包含一个或多个杂原子如N、O或S的非芳香族碳环。该环可以是五、六、七或八元的。例子包括噁唑啉基、噻唑啉基、噁唑烷基、噻唑烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基(tetrahydrothiophenyl)、吗啉代、硫代吗啉代、吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基、噻唑烷基、环状糖(例如以吡喃糖或呋喃糖形式的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖等)等。

针对烷基、环烷基、脂肪基、环脂肪基、杂环、苄基、芳基或杂芳基基团中可取代原子的合适的任选取代基为实质上不影响公开的ISA247代谢物药学活性的那些取代基。“可取代原子”是具有一个或多个化合价或电荷，能够与取代基形成一种或多种对应的共价键或离子键的原子。例如一价有效的碳原子(例如-C(-H)＝)可与烷基(例如-C(-烷基)＝)形成单键，二价有效的碳原子(例如-C(H₂)-)可与一个或两个取代基(例如-C(烷基)(H)-，-C(烷基)(Br))-)形成一个或两个单键，或与一个取代基(例如-C(＝O)-)形成一个双键，等等。本文包括的取代仅包括形成稳定化合物的取代。

例如，可取代碳原子(例如由R⁵-R¹⁰代表的取代基)的合适的任选的取代基包括-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO₂、OR^a、-C(O)R^a、-OC(O)R^a、-C(O)OR^a、-SR^a、-C(S)R^a、-OC(S)R^a、-C(S)OR^a、-C(O)SR^a、-C(S)SR^a、-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₃R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-PO₂R^aR^b、-OPO₂R^aR^b、-PO₃R^aR^b、-OPO₃R^aR^b、-N(R^aR^b)、-C(O)N(R^aR^b)、-C(O)NR^aNR^bSO₂R^c、-C(O)NR^aSO₂R^c、-C(O)NR^aCN、-SO²N(R^aR^b)、-SO₂N(R^aR^b)、-NR^cC(O)R^a、-NR^cC(O)OR^a、-NR^cC(O)N(R^aR^b)、-C(NR^c)-N(R^aR^b)、-NR^d-C(NR^c)-N(R^aR^b)、-NR^aN(R^aR^b)、-CR^c＝CR^aR^b、-C≡CR^a、＝O、＝S、＝CR^aR^b、＝NR^a、＝NOR^a、＝NNR^a、任选的取代的烷基、任选的取代的环烷基、任选的取代的脂肪族基团、任选的取代的环脂肪族基团、任选的取代的杂环、任选的取代的苯甲基、任选的取代的芳基和任选的取代的杂芳基，其中R^a-R^d各自独立地为-H或任选的取代的脂肪族基团、任选的取代的环脂肪族基团、任选的取代的杂环、任选的取代的苯甲基、任选的取代的芳基或任选的取代的杂芳基，或同-N(R^aR^b)一起为任选的取代的杂环基团。

针对氮原子(例如公开的ISA247代谢物氨基酸残基1-11上的氨基酸氮)的合适取代基具有两个与其它原子的共价键，包括例如任选的取代的烷基、任选的取代的环烷基、任选的取代的脂肪族基团、任选的取代的环脂肪族基团、任选的取代的杂环、任选的取代的苯甲基、任选的取代的芳基、任选的取代的杂芳基、-CN、-NO₂、-OR^a、C(O)R^a、-OC(O)R^a、-C(O)OR^a、-SR^a、-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₃R^a、-N(R^aR^b)、-C(O)N(R^aR^b)、-C(O)NR^aNR^bSO₂R^c、-C(O)NR^aSO₂R^c、-C(O)NR^aCN、-SO₂N(R^aR^b)、-SO₂N(R^aR^b)、-NR^cC(O)R^a、-NR^cC(O)OR^a、-NR^cC(O)N(R^aR^b)等。

含氮杂芳基或非芳香族的杂环可被氧取代形成N-氧化物，例如吡啶基在N-氧化物、哌啶基N-氧化物等中。例如在多种实施方案中，含氮杂环或杂芳基基团中的环氮原子可被取代形成N-氧化物。

本文使用术语“药学可接受”是指材料(例如组合物、载体、稀释剂、试剂、盐等)能够施用给或施用在哺乳动物上。

公开的ISA247代谢物的药学可接受盐也包括在本发明中。这些代谢物可具有一个或多个足够与合适的有机或无机碱反应形成碱加成盐(baseaddition salt)的酸性质子。当化合物具有与氧、氮或硫原子结合的氢原子时，认为该化合物还包括其盐，其中氢原子已与合适的有机或无机碱反应形成碱加成盐。碱加成盐包括从无机碱(如铵或碱金属或碱土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)或有机碱(如醇盐、烷基酰胺、烷基和芳基胺等)衍生的那些。这类碱可用于制备本发明的盐，从而包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。

例如，药学可接受盐可包括通过以下方式形成的盐：将公开的ISA247代谢物与合适碱的一种等价物反应形成单价盐(即该化合物带有一个负电荷，其被药学可接受的反阳离子(counter cation)如单价阳离子平衡)或与合适碱的两种等价物反应形成二价盐(例如化合物带有两个电子的负电荷，其被两个药学可接受的反阳离子如两个药学可接受的单价阳离子或一个药学可接受的二价阳离子平衡)。“药学可接受的”是指阳离子适合于施用给受试者。例子包括Li⁺、Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺和NR₄ ⁺，其中各R为独立的氢、任选的取代的脂肪族基团(例如羟基烷基基团、氨基烷基基团或铵基烷基基团)或任选的取代的芳基，或两个R基团一起形成的任选地与芳香族环融合的任选的取代的非芳香族杂环。药学可接受阳离子一般为Li⁺、Na⁺、K⁺、NH₃(C₂H₅OH)⁺或N(CH₃)₃(C₂H₅OH)⁺。

带有充分碱基(如胺)的公开的ISA247代谢物的药学可接受盐可通过将公开的ISA247代谢物与有机或无机酸反应形成酸加成盐而形成。通常用于从带有碱基的化合物形成酸加成盐的酸可包括无机酸(例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸)和有机酸(例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、醋酸等)。这类盐的例子包括硫酸盐、焦硫酸盐、重硫酸盐、亚硫酸盐、重亚硫酸盐、、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、乙二酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、乙炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯代苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、临苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。

还包括药学可接受的溶剂化物。本文使用术语“溶剂化物”是指本发明的化合物或其盐，其还包含通过非共价分子间力结合的化学计量或非化学计量数量的溶剂(例如水或有机溶剂)。

还包括包含公开的ISA247代谢物的药学组合物。“药学组合物”包含与药学可接受载体(作为施用给受试者的药学组合物的部分)缀合的公开的ISA247代谢物。要施用的化合物的配制根据所选的施用途径(例如口服、静脉内、肠胃外或局部施用溶液、乳剂、胶囊、乳膏、软膏等)而变化。合适等药学载体可包含不与化合物相互作用的惰性填充剂。可使用标准的药学配制技术，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，Pa.中所述的技术。用于肠胃外给药的合适的药学载体包括例如无菌水、生理盐水、抑菌盐水(含有约0.9％mg/ml苯甲醇的盐水)、磷酸盐缓冲盐水、Hank’s溶液、Ringer’s乳酸盐等。用于包封组合物的方法(例如包封于硬明胶或环糊精包衣中)为本领域已知(Baker，等，“Controlled Release of Biological Active Agents”，John Wiley and Sons，1986)。

还应理解部分公开的ISA247代谢物可作为不同的立体异构体(例如非对映异构体和对映异构体)获得，且本发明包括公开的化合物的所有的异构体形式和消旋混合物，以及用纯净异构体及其混合物(包括消旋混合物)治疗受试者的方法。可使用任何合适的方法(如色谱法)分开并分离立体异构体。

从人全血、尿或胆汁中鉴定并分离ISA247代谢物

使用这些液体的有机萃取物得到代谢物，对其进行干燥并在甲醇中重溶代谢物，并使用色谱技术练习质谱法对其鉴定。

化学合成ISA247代谢物

可通过化学合成制备ISA247代谢物。环孢菌素A的单羟基化代谢物CsA-Aml已被M.K.Eberle and F.Nuninger合成，如“Synthesis of the mainmetabolite(OL-17)of cyclosporin A，”J.Org.Chem.Vol.57，No.9，pp.2689-2691(1992)中所报导。Eberle等注意到环孢菌素A在人和动物中代谢为环孢菌素，其中初始的烯丙型甲基(在1-氨基酸残基的侧链上)被氧化为相应的烯丙醇。Eberle等曾经通过保护氨基酸-1残基的β-醇，然后通过用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)处理乙酰CsA将得到的乙酰环孢菌素A(乙酰CsA)置于烯丙型溴化的条件下，“尝试在体外模仿该代谢途径”。然后在存在四丁基铵乙酸盐(其影响乙酸盐对溴化物的改变)时加热该步骤的产物。最终通过在甲醇中存在甲氧基钠时进行乙酸盐的酯交换，将乙酸盐基团交换为醇官能团。环孢菌素A到OL-17代谢物的该转化据报导根据反相柱色谱获得28％的产率。

可使用类似的合成途径制造ISA247代谢物，例如IM4、IM6和IM9，或其中烷基碳(如悬挂的甲基基团)被羟基化的任何代谢物。例如，羟基化可发生于ISA247氨基酸-1残基的侧链γ-CH₃上，从而产生横跨侧链β-γ-CH₃碳的1，2-二醇。

在其它一些实施方案中，代谢物IM4、IM6和IM9可通过以下步骤合成：1)保护母体化合物ISA247的氨基酸-1残基的β-醇，形成受保护的ISA247化合物；2)用卤化剂(如N-溴代琥珀酰亚胺(NBS))处理受保护的ISA247，形成4、6或9氨基酸残基侧链γ-碳被卤化的受保护的ISA247(其在一个实施方案中被溴化)；3)在存在取代试剂(例如四丁基铵)时加热上步产物，形成含乙酸盐产物，和4)进行酯交换，将上步的含乙酸盐产物的乙酸盐部分与醇部分交换，形成羟基化的代谢物。单羟基化ISA247的氨基酸-1以外残基侧链的一般化学概念可与上述单羟基化CsA的氨基酸-1残基侧链类似。然而应当考虑到，考虑到存在于ISA247中但不存在于CsA中的共轭二烯体系，将必须使用实质上不同的合成策略获得ISA247的氨基酸-1残基羟基化的代谢物。

在指导化学合成ISA247的一个可选的实施方案中，ISA247氨基酸-1侧链的烯部分可直接或通过环氧化物中间体转化为二醇。例如，烯到环氧化物的转化为化学文献中已知。在使用Prilezhaev反应的一个实施方案中，可用合适的氧化剂处理链烯烃，引起氧加成进链烯烃的碳-碳双键中，从而形成环氧化物。可用于该反应的一般氧化剂为过酸，并在本发明的一个优选的实施方案中，m-氯过苯甲酸(MCPBA)为优选的试剂。也可使用其它的过酸如过乙酸、三氟过乙酸、过苯甲酸和3，5-二硝基过苯甲酸。认为用过氧化氢、烷基过氧化物或氧处理本发明的含烯环孢菌素也可导致形成环氧化物。

本发明的含环氧化物代谢物可随后经历用水进行的亲核攻击，形成1，2-二醇。该反应可用酸或碱催化。在本发明的一个实施方案中，过氯酸为优选的试剂，但是其它酸性催化剂(如Nafion-H或甲酸)也可是有效的。在另一实施方案中，可在碱性条件下在二甲基亚砜中进行环氧化物代谢物的碱水解。由微粒体环氧化物水解酶催化的环氧化物水解考虑作为另一方法。该方法提供了特别的优点在于该反应可向反应产物中引入一定程度的立体选择性。

或者可通过大量不同的试剂将烯直接转化为1，2-二醇。四氧化锇和碱性高锰酸钾可引起共加成。类似地，例如过氧化氢或t-丁基过氧化物的试剂在存在催化性四氧化锇时也可引起共加成。相反，通过用例如过氧化氢和甲酸或单过琥珀酸处理，可能进行抗加成(anti-addition)。用碘和苯甲酸银或醋酸银处理烯产生中间体二酯，其可容易地被水解，得到1，2-二醇。类似地，用四乙酸铅或醋酸亚铊氧化得到可水解的二醇双乙酸盐。因此，本领域技术人员会理解大量的方法可用于链烯烃到1，2-二醇的直接转化。

上述用于将烯转化为1，2-二醇的合成途径被认为可用于合成制备ISA247的二醇代谢物。ISA247氨基酸-1残基侧链的共轭二烯部分的烯烃可直接或通过中间体(例如环氧化物)化学转化为二醇。然后可将得到的化合物与通过其它技术产生的代谢物(例如通过兔或犬微粒体体系产生的代谢物)比较并匹配。本发明人认为从ISA247形成的环氧化物中间体很可能具有药学活性，并从而可作为可能的治疗剂而值得注意。

由于ISA247结构上与环孢菌素A仅在氨基酸-1的化学组成上有所区别，环孢菌素A的某些代谢物可用作合成ISA247代谢物的中间体。例如可通过将环孢菌素A转化为ISA247的相同化学过程，将环孢菌素A代谢物如AM4n(氨基酸-4残基N-脱甲基化)和AM9(氨基酸-9残基侧链羟基化)转化为类似的ISA247代谢物。

通过哺乳动物微粒体体系制备ISA247代谢物

通过来自于人和其它动物的微粒体体系将环孢菌素A和ISA247大量代谢(Christians，1993)。在人肝微粒体制剂中，环孢菌素到其代谢物的转化是依赖于NADPH的。可通过一氧化碳、酮康唑(ketoconazole)、甲腈咪胍和SKF525A来抑制代谢。因为这些抑制剂已知对细胞色素P-450抑制剂特异，这提示环孢菌素的代谢通过细胞色素P-450体系的单氧合酶功能介导。本发明人之前已显示ISA247也通过细胞色素P-450体系代谢。

微粒体体系为本领域公知，其通过匀浆适当的组织(其可包括来自动物如兔、犬、猪、牛、羊、灵长类、大鼠小鼠等哺乳动物的肝、肾、胃肠组织等的组织)和在100,000xg下离心产生微粒体沉淀制备，所述沉淀然后被重溶并可用于模拟ISA247的体内代谢。一旦在微粒体制剂中产生了代谢物，可使用HPLC/MS或NMR或其它技术分离并分析ISA247代谢物。

用微生物通过生物转化方法制备ISA247

在本发明的实施方案中，可使用微生物培养物和生物转化制备ISA247代谢物。可能使用生物转化制造对应于人中ISA247代谢物的ISA247代谢物，因为某些微生物具有模拟人细胞色素P-450体系活性的能力。

可用于生物转化方法的示例性微生物包括Actinoplanes sp.(例如ATCCNo.53771，可得自American Type Culture Collection Manassas，VA USA)、Streptomyces griseus(例如ATCC 13273)、Saccharopolyspora erythraea(例如ATCC No.11635)和Streptomyces setonii(例如ATCC No.39116)。其它有用的微生物可包括Amycolata autotrophica(例如ATCC No.35204，也已知为Pseudonocardia autotrophica)、Streptomyces caljfornica(例如ATCCNo.15436)、Saccharopolysora hirsute(例如ATCC No.205th)、Streptomyceslavandulae(例如ATCC 55209)、Stretomyces aureofaciens(例如ATCC10762)、Streptomyces rimosus(例如ATCC 28893，也已知为Penicilliumexpansum)、Bacillus subtillis(例如ATCC 55060)和Nocardia asteroids(例如ATCC 3318，也已知为Nocardia farcinica)。在多种实施方案中，有用的微生物可包括Curvularia lunata(例如ATCC 12017，或UAMH 9191，可得自University of Alberta Microflingal Collection and Herbarium，Edmonton，Alberta，Canada)、Cunninghamella echinulata var.elegans(例如UAMH 7370，ATCC 36112)、Curvularia echinulata var.blakesleena(例如UAMH 8718，ATCC 8688a)、Cunninghamella echinulata var.elegans(例如UAMH 7369，ATCC 26269)、Beauvaria bassiana(例如UAMH 8717，ATCC 7159)、Actinomycetes(例如ATCC 53828)、Actinoplanes(例如ATCC 53771)、Cunninghamella echinulata(例如UAMIH 4144，ATCC 36190)、Cunninghamella echinulata(例如UAMH 7368，ATCC 9246)、Cunninghamella bainiere(echinulata)(例如UAMII 4145，ATCC 9244)和Saccharopolyspora erythrae(例如ATCC 11635)。

就发明者的知识而言，常规的生物转化方法并未成功地制造环孢菌素和ISA247代谢物，这可能是由于这些化合物的亲脂性质导致的。不希望受任何理论束缚，我们相信疏水化合物(如ISA247)可趋向于附着在用于进行培养和加工产物代谢物的滤纸、柱和其它设备的表面上，例如ISA247可趋向于附着在用于向培养基中无菌添加药物的滤纸表面上。

在本发明的实施方案中，ISA247的代谢物(包括CsA和ISA247的代谢物)可通过制备药物和至少一种表面活性剂的混合物，并将药物-表面活性剂混合物直接加入微生物培养基中制造。表面活性剂可以是已灭菌的。进行该步骤时，本发明的发明者发现生物转化成为更有效果的方法。在该方法的具体实施方案中，表面活性剂为Tween。

在引入微生物生长环境中之前，合适的表面活性剂能够经受住高压灭菌。合适的表面活性剂为生物相容的表面活性剂，其包括但不仅限于：非离子型表面活性剂如聚乙二醇，例如PEG 300、PEG 400、PEG 600(也已知为来自BASF的LutrolE 300、LutrolE 400、LutrolE 600、LutrolF 127和LutrolF 68)；caprylocaproyl聚乙二醇-8甘油酯如Labrasol(Gatte Fosse，Cedex France)；聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯例如Tween20、Tween21、Tween40、Tween80、Tween80K、Tween81和Tween85(ICI Americas Inc.，Bridgewater NJ，obtained from AldrichChemical Company Inc.，Milwaukee Wis.)；甘油(BDH Fine Chemicals，Toronto Ont.)；蓖麻油(Wiler Fine Chemicals Ltd，London Ont.)；十四烷酸异丙酯(Wiler Fine Chemicals Ltd，London Ont.)；Cremaphor EL(Sigma Chemical，St Louis MO)；和poloxamer如PluronicsF 127和PluronicsLI 08(BASF)。可使用的其它表面活性剂包括可作为润滑剂或乳化剂作用的表面活性剂，如四丁酚醛[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)酚与甲醛和环氧乙烷的聚合物]；聚乙氧基化的蓖麻油，如来自BASF的Cremaphor A25、Cremaphor A6、Cremaphor EL、Cremaphor ELP、Cremaphor RH和来自Rhone Poulenc Co的Alkamuls EL620；聚乙氧基化的氢化的蓖麻油，如HCO-40；和聚乙烯9蓖麻油。

可使用的其它表面活性剂包括：聚山梨酯20、聚山梨酯60和聚山梨酯80；Cremaphor RH；poloxamer；Pluonics L10、L31、L35、L42、L43、L44、L61、L62、L63、L72、L81、L1O1、L121、L122；PEG 20杏仁甘油酯；PEG 20玉米甘油酯等。合适的表面活性剂还包括烷基葡糖苷；烷基麦芽苷；烷基葡糖硫苷；十二烷基聚乙二醇甘油酯；聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯烷基酚；聚乙二醇脂肪酸酯；聚乙二醇甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；聚甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油酯；聚氧乙烯甾醇；聚氧乙烯植物油；聚氧乙烯氢化植物油；聚氧乙烯烷基醚；聚乙二醇脂肪酸酯；聚乙二醇甘油脂肪酸酯；氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；聚甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油酯；聚氧乙烯植物油；聚氧乙烯氢化植物油；多元醇如月桂酸PEG-10、月桂酸PEG-12、月桂酸PEG-20、月桂酸PEG-32、双月桂酸PEG-32、油酸PEG-12、油酸PEG-15、油酸PEG-20、二油酸PEG-20、油酸PEG-32、油酸PEG-200、油酸PEG-400、硬脂酸PEG-15、双硬脂酸PEG-32、硬脂酸PEG-40、硬脂酸PEG-100、双月桂酸PEG-20、甘油三油酸PEG-25、二油酸PEG-32、丙三基月桂酸PEG-20、丙三基月桂酸PEG-30、丙三基硬脂酸PEG-20、丙三基油酸PEG-20、丙三基油酸PEG-30、丙三基月桂酸PEG-30、丙三基月桂酸PEG-40、PEG-40棕榈仁油、PEG-SO氢化蓖麻油、PEG-40蓖麻油、PEG-35蓖麻油、PEG-60蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、PEG-60氢化蓖麻油、PEG-60玉米油、PEG-6癸酸/辛酸甘油酯、PEG-8癸酸/辛酸甘油酯、月桂酸多聚甘氨酸-10、PEG-30胆固醇、PEG-25植物固醇、PEG-3O大豆固醇、PEG-20甘油三油酸酯、PEG-40油酸山梨坦、PEG-80山梨聚糖月桂酸盐、聚山梨酯20、聚山梨酯80、POE-9月桂基醚、POE-23月桂基醚、POE-10油基醚、POE-20油基醚、POE-20硬脂酰醚、生育酚基PEG-100琥珀酸盐、PEG-24胆固醇、多聚甘氨酸-10油酸酯、单硬脂酸蔗糖、单月桂酸蔗糖、单棕榈酸蔗糖、PEG 10-100壬基苯酚系列、PEG 15-100辛基苯酚系列、poloxamer的反应混合物；PEG-35蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、PEG-60玉米油、PEG-25甘油三油酸酯、PEG-6癸酸/辛酸甘油酯、PEG-8癸酸/辛酸甘油酯、聚山梨酯20、聚山梨酯80、生育酚基PEG-1000琥珀酸盐和PEG-24胆固醇、poloxamer。另外，也可使用油，如杏仁油；美洲棕榈仁油(babassu oil)；琉璃苣油；黑穗状醋栗种子油；芸苔油；椰子油；玉米油；棉子油；夜来香油；葡萄子油；花生油；芥子油；橄榄油；棕榈油；棕榈仁油；花生油；菜籽油；红花油；芝麻油；鲨鱼肝油；大豆油；葵花子油；氢化蓖麻油；氢化椰子油；氢化棕榈油；氢化大豆油；氢化植物油；氢化棉籽和蓖麻油；部分氢化的大豆油；大豆油；甘油三己酸酯(glyceryl tricaproate)；甘油三辛酸酯(glyceryl tricaprylate)；甘油三癸酸酯(glyceryl tricaprate)；甘油三十一酸酯(glyceryltriundecanoate)；甘油三月桂酸酯(glyceryl trilaurate)；甘油三油酸酯(glyceryl trioleate)；甘油三亚麻油酸酯(glyceryl trilinoleate)；甘油三亚麻酸酯(glyceryl trilinolenate)；甘油三辛酸/癸酸酯(glyceryltricaprylate/caprate)；甘油三辛酸/癸酸/月桂酸酯(glyceryltricaprylate/caprate/laurate)；甘油三辛酸/癸酸/亚油酸酯(glyceryltricaprylate/caprate/linoleate)；甘油三辛酸/癸酸/硬脂酸酯(glyceryltricaprylate/caprate/stearate)；饱和的聚乙二醇化甘油酯(saturatedpolyglycolized glycerides)；亚油酸甘油酯；辛酸/癸酸甘油酯。另外，可使用表面活性剂和/或油和/或醇的混合物。

在本发明的某些实施方案中，在加入活性生长微生物培养基之前，将母体化合物与链烷醇(如乙醇)和合适的非离子型表面活性剂混合。如果母体化合物与醇混合，醇可以是乙醇。额外的合适的醇包括甲醇和本领域公知的其它合适的醇。

将母体化合物-表面活性剂混合物添加到含有培养基中的微生物的生物反应混合物中后，使该生物反应在允许母体化合物代谢的条件下进行一段时间。在所需时间之后，从生物反应混合物中抽提代谢物，通过分离纯化，如通过色谱法，如高压液相色谱和质谱分析(HPLC-MS)。可使用核磁共振分析确认个体代谢物已彼此分离并确认其结构。

在本发明的一些实施方案中，溶于乙醇的ISA247与甘油混合，然后加入含有Saccharopolyspora erytheraea ATCC 11635的生物转化体系中。在其它实施方案中，在将ISA247加入生物转化体系中之前将PEG 400与溶于乙醇的ISA247混合。在其它实施方案中，在将ISA247加入生物转化体系中之前将蓖麻油与溶于乙醇的ISA247混合。在其它实施方案中，在将ISA247加入生物转化体系中之前将十四烷酸异丙酯与溶于乙醇的ISA247混合。在其它实施方案中，在将ISA247加入生物转化体系中之前将Cremaphor与溶于乙醇的ISA247混合。在其它实施方案中，在将ISA247加入生物转化体系中之前将Labrasol与溶于乙醇的ISA247混合。在其它实施方案中，在将ISA247加入生物转化体系中之前将Tween 40与溶于乙醇的ISA247混合。

分析和阐明ISA247代谢物

使用高效液相色谱(HPLC)联合质谱法(HPLC-MS或LC-MS/MS)，根据ISA247代谢物的化学特性和动力学参数将其分离。

本发明人已开发了使用液相色谱技术联合质谱法用于分析ISA247代谢物的定性和定量方法。这些方法能够分离和表征体外和体内产生的ISA247代谢物，也同样适用于在全血或其它体液中定量监测ISA247代谢物，作为药物代谢动力学研究的一部分。

根据从高压液相色谱法(HPLC)数据获得的滞留时间和从电喷射离子化(ESI)质谱数据获得的结构特异离子片段信息完成对分析物的鉴定。图6是使用SCIEX^TM triple quad质谱仪在MRM模式(多重反应监测模式)下的LCM6痕线。

图6的HPLC-MRM扫描显示典型的从人全血分离的ISA247代谢物谱并与从肝微粒体或从生物转化来源制备的ISA247抽提物所观察到的LC-MS片段谱一致。图6的MRM扫描鉴定了1271/1113范围内的四个峰，指出至少四个不同的二醇峰(Diol(1)、Diol(2)、Diol(3)和Diol(4))；1239/1115范围内的3个小峰，标记为IMXnX(2)、IMXnX(4)和IMXnX(6)；1253/1225范围内的四个峰，标记为IMX(1)、IM9、IM4和IMX(2)；1223/1099范围内的两个峰，标记为IM4n和IMXn(2)；和1237/1113的一个ISA247大峰，如通过未代谢的标准所鉴定的。也显示了其它的一些峰，但是没有标记。

进一步使用核磁共振(NMR)技术，使用以下的一般条件，来阐示转化的ISA247的HPLC纯化的材料结构。在苯-d6中，25～27℃时在VarianInova 800和/或500MHz，和/或Varian Mercuryplus 400MHz光谱测定仪上记录1D和2D NMR谱。作为参考，苯信号对¹H-NMR设定为δ7.15ppm，对¹³C-NMR设定为δ128.06ppm。使用0.5～1mg/～0.7ml的苯d₆浓度。使用ACD/Labs(Advanced Chemistry Development Inc.，Toronto，Canada)的2D NMR数据处理软件分析获得的谱。

氨基酸-1的转化：二醇、环和环氧化物

如图6所示，从人全血分离的代谢物显示在约6.5到8分钟的滞留时间处发生一系列主要代谢物的峰，以及1271/1113m/z的母体离子/片段离子对。这指出在1237m/z的母体ISA247质量上加上了34质量单位。另外，可推断出：包含代谢物的化学修饰位于氨基酸-1残基上，因为片段离子具有1113m/z的质量。根据该信息可能假设该修饰很可能是氨基酸-1的ε碳和θ碳位置之间二烯区形成二醇。

可由HPLC分离二醇代谢物，用于进一步的结构分析。非常值得注意的是，取决于材料的来源(无论是化学合成，或从生物转化、微粒体或血或尿中分离)，HPLC中出现的峰可以是不同的。例如化学合成可产生以二醇结构的R和S非对映异构体存在的二醇，而酶代谢可形成二醇结构的一种非对映异构体，而不形成另一种。酶可偏好一种方向的的底物而不偏好另一种，并因此可产生一种非对映异构体而不产生另一种。二醇代谢物的非对映异构体可在HPLC上作为不同的峰出现，因为它们可具有不同的化学性质，使得它们在柱中移动得不同。因此，通过不同手段(例如化学合成和生物转化)制造的代谢物的HPLC痕线可具有不同的峰。因此，值得注意的是图6所示的HPLC可不代表不是从人全血分离的代谢物的HPLC痕线。另外，值得注意的是用于二醇的命名法(即IM1-d-1)并不一定对应于图6所示的HPLC峰。该命名法应认为是根据表1所示的结构。

使用¹H-NMR和2D NMR技术进一步阐述通过化学合成、生物转化制造的或从血或尿中分离的和使用HPLC-MS分离的ISA27二醇代谢物的结构。图8显示了与ISA247的E和Z异构体的¹H-NMR谱比较的、HPLC纯化的IM1-d-1产物的¹H-NMR谱，其中产物通过上述微生物生物转化方法制造(也标记为KI-2)。这三个谱的比较显示了IM1-二醇-1或IM1-d-1的¹H-NMR在约δ6和7ppm间二烯区的改变，表明了氨基酸-1侧链转化。假设四个NH和七个N-甲基信号来自各主要产物，则酰胺NH质子和N-甲基质子区表明代谢物是带有少量污染的两种主要产物的混合物。通过使用酰胺质子信号的相关谱证明了该假设。酰胺NH质子交叉峰与相关的α质子和侧链甲基的相关性得自IM1-d-1的2D TOCSY谱(图9)。根据NMR分析发现，该二醇片段(KI-2)主要由两种非对映异构体1∶1的混合物组成，所述非对映异构体氨基酸-1(aa-1)的η碳立体化学不同。两个非对映异构体均具有J_εζ＝15.0Hz的偶合常数确定了反式双键构型。推定的IM1-d-1结构显示于图10。

图10显示IM1-d-1的结构是反式ISA247的氨基酸-1(aa-1)侧链的η和θ位置上的二醇。因为η位置为手性中心，所以IM1-d-1化合物可以以两种非对映异构体存在，区别在于氨基酸-1的η碳构型，如图10所示。两种非对映异构体显示不同的NMR谱是因为各非对映异构体为具有特异理化性质的不同的化学个体。

令人惊奇的是，NMR研究显示50∶50顺式∶反式ISA247的起始材料(使用生物转化方法制造代谢物(使用真菌，KI-2样品))导致获得图10所示的反式构型的IM1-d-1非对映异构体混合物(1∶1的非对映异构体比例)。然而，使用HPLC-MS分离并使用NMR研究时，化学合成制备(KI-2A样品)的大部分为反式ISA247的起始材料产生3∶2比例的IM1-d-1非对映异构体混合物。IM1-d-1是从反式ISA247形成的代谢物，如图42和43所示。虽然KI-2A NMR谱中检测的异构体比例差异使得可能获得各非对映异构体的质子化学位移分配，但是不可能将如图10所示的结构之一指定给通过NMR确定的比例。该偏差表明了一种非对映异构体代谢物高于另一种的偏好制造的可能性，这取决于使用天然存在酶(来自肝或来自真菌)或使用实验室化学反应时是否产生该代谢物。例如在化学合成期间，一种方向的化学中间体可产生一种异构体多于另一种的非对映异构体混合物。或者生物转化过程可创造非对映异构体代谢物，且这些非对映异构体之一可被优先地进一步加工为不同于IM 1-d-1的另一种代谢物，其改变了HPLC中存在相应峰的产物比例。或者化学加工或生物转化过程可创造非对映异构体，其被进一步加工为不同于IM 1-d-1化合物的另一种代谢物，其改变了使用HPLC时存在特异峰的产物比例。表1显示了根据上面的NMR分析的IM1-d-1的化学位移分配。尽管该表代表了通过NMR鉴定的一种化合物，但该样品中明显存在多于一种化合物。第二种化合物的化学位移信息未显示在表1中。然而，两种末端二醇非对映异构体IM1-d-1显示在图43中。

表1

IM1-d-1(KI-2A

样品)为大部分

氨基酸	Hs	化学位移
					(ppm)3)
氨基酸-1
			CH(α)	1	5.60
CH(β)	1	4.21
			CH(γ)	1	2.13
γ-CH3	3	1.08
			CH(δ1)	1	2.38
CH(δ2)	1	2.35
			CH(ε)	1	5.944)
CH(ζ)	1	5.534)
			CH(η)	1	4.28
CH(θ1)	1	3.63
			CH(θ2)	1	3.63
N-Me	3	3.62
氨基酸-2
			CH(α)	1	5.07
CH(β1)	1	1.77
			CH(β2)	1	1.77
CH3(γ)	3	0.86
			NH	1	8.35
			氨基酸-3
CH(α1)	1	3.98

氨基酸	Hs	化学位移
			氨基酸-6
CH(α)	1	5.39
			CH(β1)	1	2.34
CH(β2)	1	1.46
			CH(γ)	1	2.15
CH3(δ1)	3	1.16
			CH3(δ2)	3	1.05
N-Me	3	3.23
氨基酸-7
			CH(α)	1	4.79
CH3(β)	3	1.66
			NH	1	7.99
			氨基酸-8
CH(α)	1	4.81
			CH3(β)	3	1.00
NH	1	7.68
氨基酸-9
			CH(α)	1	5.87
CH(β1)	1	2.18
			CH(β2)	1	1.25
CH(γ)	1	1.25

CH(α2)	1	2.17
			N-Me	3	3.07
			氨基酸-4
CH(α)	1	5.60
			CH(β1)	1	2.24
CH(β2)	1	1.54
			CH(γ)	1	1.33
CH3(δ1)	3	1.08
			CH3(δ2)	3	0.88
N-Me	3	2.57
氨基酸-5
			CH(α)	1	4.80
CH(β)	1	2.55
			CH3(γ1)	3	1.07
CH3(γ2)	3	0.88
			NH	1	7.61

CH3(δ1)	3	0.91
			CH3(δ2)	3	0.83
N-Me	3	2.96
氨基酸-10
			CH(α)	1	5.34
CH(β1)	1	2.44
			CH(β2)	1	1.29
CH(γ)	1	1.78
			CH3(δ1)	3	1.15
CH3(δ2)	3	1.15
			N-Me	3	2.86
			氨基酸-11
CH(α)	1	5.16
			CH(β)	1	2.26
CH3(γ1)	3	0.90
			CH3(γ2)	3	0.63
N-Me	3	2.99

3)化学位移(ppm)在δ标度中表达。

4)反式构型的指定基于偶合常数(J_εζ＝15.0Hz)。

第二种要研究的二醇(样品KI-3A)IM1-d-2是使用HPLC纯化从化学转化的ISA247(顺式∶反式-5∶95)中分离的，并用¹H-NMR和2DTOCSY分析确定其结构。图11显示了对IM1-d-2的¹H-NMR谱与反式ISA247的¹H-NMR谱比较。这些¹H-NMR谱的比较说明δ6和7ppm之间二烯质子的缺失，提示aa-1侧链的转化。平常区中观察到四个酰胺NH双峰和七个N-甲基单峰提示环肽结构是完整的。图12显示二醇的2D COSY和TOCSY谱。这些谱提供了信号的相关性，使得除观察到变化的aa-1侧链质子外，大部分质子能够直接分配。图13显示δ3.8和6.2ppm之间α质子区的COSY谱放大图，实线指出交叉峰相关性。这也在图14显示的放大的1D ¹H-NMR谱中用质子的一些额外分配说明。

COSY谱说明该区存在四个交叉峰相关性：

δ5.80ppm处的信号与δ5.55、4.29和4.16ppm处的信号。

δ5.55ppm处的信号与δ4.16和4.02ppm处的信号。

d5.24ppm处的1-α信号与δ4.26ppm处的1-β信号。

δ4.29处的信号与δ4.16处的信号。

在δ5.80和5.55ppm处观察到到信号指示烯属质子(-CH＝CH-)，而δ4.29、4.16和4.02ppm处的信号指示连接醇碳(＞CH-OH)的质子。δ4.29和4.16ppm处信号之间的偶合关系，和这些信号与δ5.80ppm处烯属质子信号之间的偶合关系提示δ4.29和4.16ppm处的信号属于与双键(-C＝CH-)结合的伯醇(HO-CH2-)亚甲基质子，得到(HO-CH2-CH＝CH2)的烯丙醇结构。另外，δ4.02ppm处的信号与δ5.55ppm处的其它烯属质子的偶联指出这些质子的以下总体结构：

上述结构还与在δ5.55和δ4.16ppm质子之间的COSY谱中观察到的大范围四键偶联(⁴J)相关性一致。

如图15中放大的双键质子1D谱所示，根据观察到的15.2Hz的偶合常数指定双键构型为反式。根据δ5.80ppm处信号和δ4.29和4.16ppm的亚甲基质子及δ5.55ppm处的另一双键质子的偶联，δ5.80ppm处信号的分裂模式(双峰和三峰)与推定的结构一致。观察到δ5.55ppm处的双键质子双峰和双峰信号的轻微拓宽表现可由δ4.16ppm处信号⁴J的存在解释。

其余aa-1侧链质子的以下信号相关性由COSY谱额外获得：δ4.26ppm处的1-β到δ2.28ppm处的1-γ，δ2.28ppm处的1-γ到δ1.88ppm处的1-δ₁，δ1.59ppm处的1-δ₂和δ1.45ppm处的1-γCH₂；δ4.02ppm处的1-ε到δ1.88ppm处的1-δ₁，δ1.59ppm处的1-δ₂。这些相关性在图16的部分放大的COSY谱中说明。上述分光镜的发现指示IM1-d-2的结构如图17所示。

图17说明了IM1-d-2两种非对映异构体形式的结构。本领域技术人员会注意图17中说明的结构为aa-1处的反式双键构型，并且是通过如图42中机理性阐明的ε位置环氧化物(IM1-e-2)环打开与协同的水攻击形成的双键移行产物(IM1-d-2)。因此，该化合物可以以图17显示的任一非对映异构体形式存在。然而与上述IM1-d-1不同的是，该化合物给出一个相对干净的NMR谱。因此推定其结构为图17所示非对映异构体之一。图18显示了IM1-d-2的氨基酸结构及属于碳的质子的化学位移指定。IM1-d-2的编辑的图谱数据和化学位移指定列于表2。

表2.IM1-d-2(KI-3A)的¹H-NMR化学位移指定。^1)，2)

氨基酸	Hs	化学位移(ppm)3)	偶合常数(Hz)
				氨基酸-1
CH(α)	1	5.24	d，10.6
				CH(β)	1	4.26	d，10.6

CH(γ)	1	2.28	m
				Γ-CH3	3	1.45	d，7.1
CH(δ1)	1	1.88	m
				CH(δ2)	1	1.59	m
CH(ε)	1	4.02	dd，10.5和6.6
				CH(ζ)	1	5.55	dd，15.2和6.6
CH(η)	1	5.80	dt，15.2和4.2
				CH(θ1)	1	4.29	m
CH(θ2)	1	4.16	m
				N-Me	3	3.71	s
				氨基酸-2
CH(α)	1	5.06	m
				CH(β1)	1	1.88	m
CH(β2)	1	1.76	m
				CH3(γ)	3	0.91	重叠
NH	1	8.64	d，9.8
氨基酸-3
				CH(α1)	1	3.92	d，13.4
氨基酸	Hs	化学位移(ppm)3)	偶合常数(Hz)
				CH(α2)	1	2.20	d，13.4
N-CH3	3	3.11	S

氨基酸-4
				CH(α)	1	5.36	dd，11.9和3.6
CH(β1)	1	2.15	M
				CH(β2)	1	1.47	M
CH(γ)	1	1.32	M
				CH2(δ1)	3	1.02	重叠
CH2(δ2)	3	0.90	重叠
				N-CH3	3	2.53	S
				氨基酸-5
CH(α)	1	4.96	t，9.2
				CH(β)	1	2.55	m
CH3(γ1)	3	1.05	d，6.5
				CH3(γ2))	3	0.84	d，6.5
NH	1	7.74	d，9.2
氨基酸-6
				CH(α)	1	5.59	dd，12.2和3.8
CH(β1)	1	2.48	m
				CH(β2)	1	1.48	m
CH(γ)	1	2.28	m
				CH3(δ1)	3	1.18	d，6.6
CH3(δ2)	3	1.02	重叠
				N-CH3	3	3.36	s

氨基酸-7
				CH(α)	1	4.61	m
CH3(β)	3	1.59	d，7.1
				NH	1	8.31	d，6.8
				氨基酸-8
CH(α)	1	4.80	m
				CH3(β)	3	1.02	重叠
NH	1	8.07	d，7.9
氨基酸-9
				CH(α)	1	5.93	dd，11.3和3.8
CH(β1)	1	2.27	m
				CH(β2)	1	1.23	m
CH(γ)	1	1.24	m
				CH3(δ1)	3	0.94	d，6.5
CH3(δ2)	3	0.84	d，6.5
				N-CH3	3	3.09	S
				氨基酸	Hs	化学位移(ppm)3)	偶合常数(Hz)
氨基酸-10
				CH(α)	1	5.38	t，7.0
CH(β1)	1	2.35	m
				CH(β2)	1	1.41	m
CH(γ)	1	1.74	m
				CH3(δ1)	3	1.13	d，6.4

CH3(δ2)	3	1.12	d，6.4
				N-CH3	3	2.90	s
				氨基酸-11
CH(α)	1	5.28	d，11.0
				CH(β)	1	2.35	m
CH3(γ1)	3	0.88	d，6.5
				CH3(γ2)	3	0.67	d，6.5
N-CH3	3	3.03	s

1)N-甲基信号的化学位移根据得自COSY和TOCSY谱的四键偶合(⁴J)和五键偶合(⁵J)关联指定。

2)反式构型根据aa-1H(ζ)和H(η)间15.2Hz的质子偶合常数指定为aa-1处的双键。

3)化学位移(ppm)在δ标度中表达。

第三种二醇代谢物IM1-d-3(样品KI-3)从ISA247(顺式∶反式＝50∶50)的微生物生物转化用HPLC纯化得到。图19显示了对IM1-d-3化合物(样品KI-3)的¹H-NMR谱与IM1-d-1化合物以及反式-ISA247(E-ISA247)和顺式-ISA247(Z-ISA247)的比较。图19显示的NMR谱比较揭示了δ6和7ppm之间二烯区IM1-d-3(样品KI-3)¹H-NMR谱的变化，提示aa-1侧链的转化。质量研究信息还指出了氨基酸-1侧链形成二醇的改变。这些改变与IM1-d-1代谢物中获得的类似，尽管图谱比较指出IM1-d-3和IM1-d-1结构上是不同的。

图谱的酰胺NH质子和N-甲基质子区指出样品KI-3是一种主要产物和若干少量污染的混合物。因此，NMR分析主要通过得自2D TOCSY谱(见图20)的交叉峰相关集中于KI-3(IM1-d-3)的主要产物上。如通常在ISA247及其代谢物中所观察的那样，酰胺NH质子区的2D TOCSY谱显示主要的NH质子为aa-2、aa-5、aa-7和aa-8，并且可以通过观察2D与特征性信号(例如2-γCH₃、7-βCH₃和8-βCH₃)的关联来鉴定。图21和22显示酰胺质子关联的放大的TOCSY谱和一些位移指定。主要代谢物的大部分氨基酸侧链质子的化学位移根据TOCSY谱关联类似地指定。四个酰胺质子和七个N-甲基基团单峰的存在以及与ISA247及其它代谢物类似的信号相关性模式指示母体ISA247的环结构是完整的。

对2D TOCSY谱的α质子区的密集检查指示了δ5.86-5.62-4.62-3.72-3.60ppm处的一系列关联信号(见图24)，假定为氨基酸-1侧链质子。这也显示在该区放大的1D谱中(见图23)。δ5.86(与9-α重叠)和5.62ppm处的质子信号清楚地指示烯属质子(-CH＝CH-)；δ5.62处的信号指示醇质子(＞CH-OH)；而δ3.72和3.60ppm处的信号指示伯醇质子(-CH2-OH)。这些在图24中由实线表示的质子关联与在代谢物IM1-d-1(KI-2或KI-2A)中观察到的类似，尽管IM1-d-3的δ5.62ppm处的质子更向前位移。因此，代谢物IM1-d-3的NMR谱和质量信息与氨基酸-1处二醇形成是一致的。

对δ5.62ppm处信号(见图25)的第一次分析显示了偶合常数为9.6Hz的三峰，这指示顺式构型的双键，尽管假定的双键的反质子与9-α重叠并不能获得用于该分析。δ3.72和3.60ppm处的化学位移提示结构基团(-CH2-OH)并非直接结合在双键上。因此，根据这些观察，推定图26中的结构是样品KI-3中的主要产物——代谢物IM1-d-3。如图26所示，IM1-d-3二醇可以以氨基酸-1的手性η位置不同的两种非对映异构体存在。图26中看到结构的η位置的立体化学并不确定。然而，当研究另一样品KI-4A(其为从顺式∶反式比例为1∶1的ISA247制造的化学合成样品)时，样品KI-4A的NMR分析(未显示)显示KI-4A样品的主要成分为KI-3样品主要成分的非对映异构体，在aa-1的η位置的立体化学彼此不同。KI-4A样品显示与图19-28中KI-3样品所显示的不同的NMR谱。尽管可能鉴定这些结构并可能分离并研究各非对映异构体，但是将非对映异构体结构确定地指定给一个样品或另一样品是不可能的。不可能确定aa-1的η位置的R或S异构体中哪一个属于KI-4A或KI-3样品。

图26阐释了1-d-3为顺式构型的二醇，aa-1的η位置为手性中心，从而以两种非对映异构体(K1-3和K1-4A)存在。IM1-d-3是与IM1-d-1同样的二醇，除了IM1-d-3中的双键为顺式构型而IM1-d-1中的双键为反式构型。该差异在图6显示的HPLC扫描中将IM1-d-1和IM1-d-3代谢物分开。IM1-d-3的化学位移指定列于表3中。

表3.IM1-d-3(KI-3)的¹H-NMR化学位移指定。^1)，2)

氨基酸	Hs	化学位移		氨基酸	Hs	化学位移
									(ppm)3)			(ppm)3)
氨基酸-1				氨基酸-6
							CH(α)	1	5.68	CH(α)	1	5.38
CH(β)	1	4.12		CH(β1)	1	2.27
							CH(γ)	1	2.14	CH(β2)	1	1.60
γ-CH3	3	1.14		CH(γ)	1	2.08
							CH(δ1)	1	2.48	CH3(δ1)	3	1.14
CH(δ2)	1	～2.14		CH3(δ2)	3	1.05
							CH(ε)	1	5.86	N-Me	3	3.19
CH(ζ4)	1	5.62
							CH(η)	1	4.62	氨基酸-7
CH(θ1)	1	3.72		CH(α)	1	4.84
							CH(θ2)	1	3.60	CH3(β)	3	1.69
N-Me	3	3.68		NH	1	7.90

							氨基酸-2			氨基酸-8
CH(α)	1			CH(α)	1	4.80
							CH(β1)	1	5.07	CH3(β)	3	1.01
CH(β2)	1	1.77		NH	1	7.55
							CH3(γ)	3	1.77
NH	1	0.86		氨基酸-9
							氨基酸	Hs	化学位移	氨基酸	Hs	化学位移
氨基酸-3				CH(β1)	1	2.18
							CH(α1)	1		CH(β2)	1	1.24
CH(α2)	1	3.95		CH(γ)	1	1.24
							N-CH3	3	2.13	CH3(δ1)	3	0.91
		3.01		CH3(δ2)	3	0.82
							氨基酸-4			N-CH3	3	2.95
CH(α)	1	5.50
							CH(β1)	1	2.21	氨基酸-10
CH(β2)	1	1.49		CH(α)	1	5.36
							CH(γ)		1.31	CH(β1)	1	2.45
CH3(δ1)	3	0.96		CH(β2)	1	1.27
							CH3(δ2)	3	0.88	CH(γ)	1	1.80
N-CH3	3	2.52		CH3(δ1)	3	1.17
										CH3(δ2)	3	1.14
氨基酸-5				N-CH3	3	2.86
							CH(α)	1	4.75
CH(β)	1	2.53		氨基酸-11
							CH3(γ1)	3	1.10	CH(α)	1	5.26

CH3(γ2)	3	0.90		CH(β)	1	2.28
							NH	1	7.58	CH3(γ1)	3	0.94
				CH3(γ2)	3	0.64
										N-CH3	3	2.99

1)指定最初根据TOCSY谱获得。

2)N-甲基信号是临时指定的，因此它们中的一些可以互换。

3)化学位移(ppm)在δ标度中表达。

4)根据观察到的具有9.6Hz偶合常数的质子三峰，将顺式构型指定给aa-1的双键。

第四个要分离的二醇为IM1-d-4(样品KI-8A)。除样品KI-2A(IM1-d-1)和KI-3A(IM1-d-2)外，带有少量污染的样品KI-8A得自化学转化ISA247(顺式∶反式＝5∶95)。对HPLC分离的IM1-d-4(样品KI-8A)的NMR分析显示δ6和7ppm之间二烯质子的缺失，提示如所期望的aa-1侧链的转化。平常区中观察到四个酰胺NH双峰和七个N-甲基单峰提示环肽结构是完整的。图27是IM1-d-4(样品KJ-8A)与反式ISA247或E-ISA247的¹H-NMR谱比较。

IM1-d-4似乎是样品KI-8的主要成分，尽管谱中可看到少量污染物。另外，图28A和28B中所示2D COSY和TOCSY谱的分析提供了对大部分质子的位移指定，除了由于aa-1侧链转化而在谱α质子区观察到的一些峰之外。该比较阐释了δ6和7ppm之间二烯质子的缺失，提示aa-1侧链的转化。如图29所示，α质子区放大的2D COSY谱说明1-α和1-β以及未指定的质子(可假定为aa-1侧链质子)的交叉峰相关性。图30中显示了该区放大的1D谱和得自COSY谱的一些峰指定和峰关联。δ6.00(ddd)、5.44(dt)、5.15(dt)、4.28(m)和3.73ppm(m)处信号(各作为一个质子引用)的相关性指示这些质子是结构相关的，例如aa-1的侧链质子。其中，显示可辨别分裂模式的δ6.00(ddd)、5.44(dt)和5.15ppm(dt)处的信号被放大，如图31所示。

δ6.00ppm的化学位移暗示该质子为与J＝17.2Hz的δ5.44ppm处和J＝10.6Hz的δ5.15ppm的质子偶合的烯属质子，所述两个质子以1.8Hz的偶合常数彼此偶合，并表明末端双键成对质子，如E-ISA247和Z-ISA247谱中所示。平常区中观察到四个酰胺NH双峰和七个N-甲基单峰提示环肽结构是完整的。

图32中阐释了IM1-d-4的总体结构。注意aa-1的ε和ζ碳均为手性中心。因此，图32所示结构可具有四种构型。具有图32所示结构的化合物的精确构型未确定。然而，提示少量污染物可在主要化合物aa-1侧链的ε和ζ碳上含有立体异构体。

IM1-d-4的化学位移指定列于表4。

表4.IM1-d-4的¹H-NMR化学位移指定。¹⁾

氨基酸	Hs	化学位移(ppm)2)	偶合常数(Hz)
				氨基酸-1
CH(α)	1	5.46	d，9.5
				CH(β)	1	4.33	d，9.5
CH(γ)	1	2.20	m
				γ-CH3	3	1.27	d，6.9
CH(δ1)	1	1.82	m
				CH(δ2)	1	1.70	m
氨基酸	Hs	化学位移(ppm)2)	偶合常数(Hz)
				CH(ε)	1	3.73	m
CH(ζ)	1	4.28	m

CH(η)	1	6.00	ddd，17.2，10.6和5.1
				CH(θ1)	1	5.15	dt，10.6和1.8
CH(θ2)	1	5.44	dt，17.2和1.8
				N-Me	3	3.63	s
				氨基酸-2
CH(α)	1	5.10	m
				CH(β1)	1	1.81	m
CH(β2)	1	1.81	m
				CH3(γ)	3	0.86	重叠
NH	1	8.45	d，9.6
氨基酸-3
				CH(α1)	1	3.93	d，13.8
CH(α2)	1	2.15	d，13.8
				N-CH3	3	3.08	s
				氨基酸-4
CH(α)	1	5.52	dd，11.2和4.0
				CH(β1)	1	2.25	m
CH(β2)	1	1.48	m
				CH(γ)	1	1.38	m
CH3(δ1)	3	0.96	d，6.6
				CH3(δ2)	3	0.88	d，6.6
N-CH3	3	2.58	s

				氨基酸-5
CH(α)	1	4.89	t，9.1
				CH(β)	1	2.55	m
CH3(γ1)	3	1.10	d，6.6
				CH3(γ2)	3	0.88	d，6.6
NH	1	7.55	d，9.1
氨基酸-6
				CH(α)	1	5.56	dd，11.6和4.1
CH(β1)	1	2.37	m
				CH(β2)	1	1.64	m
CH(γ)	1	2.21	m
				CH3(δ1)	3	1.18	d，6.6
CH3(δ2)	3	1.05	d，6.6
				N-CH3	3	3.26	s
				氨基酸-7
CH(α)	1	4.69	m
				氨基酸	Hs	化学位移(ppm)2)
CH3(β)	3	1.58	d，7.1
				NH	1	8.14	d，7.2

氨基酸-8
				CH(α)	1	4.82	m
CH3(β)	3	1.01	d，6.9
				NH	1	7.89	d，7.9
				氨基酸-9
CH(α)	1	5.90	dd，11.9和3.5
				CH(β1)	1	2.23	m
CH(β2)	1	1.23	m
				CH(γ)	1	1.23	m
CH3(δ1)	3	0.91	d，6.2
				CH3(δ2)	3	0.82	d，6.2
N-CH3	3	3.03	S
氨基酸-10
				CH(α)	1	5.36	t，7.0
CH(β1)	1	2.35	m
				CH(β2)	1	1.39	m
CH(γ)	1	1.73	m
				CH3(δ1)	3	1.12	d，6.7
CH3(δ2)	3	1.11	d，6.7
				N-CH3	3	2.86	s
				氨基酸-11
CH(α)	1	5.09	d，10.8
				CH(β)	1	2.31	m
CH3(γ1)	3	0.86	d，6.5

CH3(γ2)	3	0.66	d，6.5
				N-CH3	3	3.00	s

1)N-甲基信号的化学位移根据得自COSY和TOCSY谱的四键偶合(⁴J)和五键偶合(⁵J)关联指定。

2)化学位移(ppm)在δ标度中表达。

环化的代谢物IM1-c-1(样品KI-5)得自用HPLC纯化的生物转化ISA247(顺式∶反式＝1∶1)。图33显示了代谢物(样品KI-5)的¹H-NMR与E-ISA247和Z-ISA247的¹H-NMR谱比较。NMR分析揭示了样品含有单一化合物而非非对映异构混合物。这可由谱的酰胺NH和N-质子区证实：四个酰胺NH质子和七个N-甲基单峰信号。如图33所示，谱中从ISA化合物到代谢物的主要变化为二烯区(δ6-7ppm)质子的缺失。

这些烯属质子信号是ISA247分子特征性的，来自于氨基酸-1侧链并通常在δ6和7ppm之间观察到。因此该区中这些峰的缺失指示着氨基酸-1侧链的结构转化。δ3.9和6.0ppm之间的代谢物氨基酸α质子区放大的图谱显示在图34中，带有某些α质子和1-β质子的位移指定，如峰顶部所示。如图36所示，这些指定和其它指定得自2D谱，且除氨基酸-1侧链质子外考虑到所有的其它氨基酸侧链和N-甲基质子。因此推出：图34中δ5.75(通过整合对应于1H)、δ4.35(1H)和δ3.94(2Hs)处未指定的信号是氨基酸-1侧链的质子。

δ5.75ppm处峰的密集检查揭示其含有两个在δ5.77和5.74ppm处共振的质子，其还彼此偶合，如图35所示。化学位移和偶合常数(15.8Hz)提示烯属(-CH＝CH-)基团具有反式构型。图36的2D谱显示δ5.75ppm处的信号与δ3.94和4.35ppm处的峰相关，所述两个峰依次显示信号相关性。另外，δ3.94ppm处的多重信号说明为两个质子，而δ4.35处的一个信号说明为一个质子。因此，计划由结构基团(-CH-CH＝CH＝CH2-)解释这些峰(δ5.77、5.74、4.35和3.9ppm)的信号相关性。

δ4.35和3.94ppm处的化学位移还提示这些质子与碳结合，所述碳紧邻氧原子并具有(-O-CH-CH＝CH-CH₂-O-)的结构。图37所示的放大的DQF-COSY谱揭示了δ5.77ppm处的信号与δ4.35ppm处的信号偶合，且δ 5.74ppm处的信号与δ3.94ppm处的信号偶合。与质量信息结合的NMR分析清楚地指明了IM1-c-1的结构，如图38所示。

侧链ε位置的立体化学从ROESY谱演绎获得(见图39)。ROESY谱aa-1侧链质子的密集检查显示以下的ROE关联：

(1)δ4.35(1-ε)-δ2.30(1-δ₂)

(2)δ4.25(1-β)-δ1.26(1-γCH₃)

(3)δ2.49(1-γ)-δ2.30(1-δ₂)

(4)δ1.35(1-δ1)-δ1.26(1-γCH₃).

基于这些观察，阐明了IM1-c-1的aa-1侧链结构(图40)。本领域技术人员会将aa-1的ε碳鉴定为手性中心，从而ε碳可以是如图40所示的R构型或未显示的S构型。基于ROESY谱分析，从IM1-c-1峰中分离的代谢物绝大部分为R构型。然而图40所示代谢物也可以以S构型存在。

不希望受任何理论束缚，根据对来自氨基酸-1残基代谢的代谢物ISA247的该结构分析，阐明了图41中的反应流程。该反应流程可从顺式ISA247或反式ISA247开始。ISA247(1)代谢的第一步为环氧化反应。ISA247的环氧化得到可以以IM1-e-1、IM1-e-2或IM1-e-3构型存在的环氧化物，所述构型在图41中分别显示为结构2、3和6。这些环氧化物通过HPLC鉴定并未分离。所述环氧化物显示出具有极高的反应性。它们可以是ISA247与上述转化产物之间的反应的中间体或过渡态。

不希望受任何理论束缚，相信一旦形成环氧化物，水便可攻击环氧化物形成二醇。图42说明用于从反式ISA247形成ISA247二醇和环状aa-1代谢物的计划反应机制。在图42反应流程1中(见箭头标记的“1”)，如果水可攻击IM1-e-1环氧化物的ε或ζ位置，则环氧化物打开并可形成IM1-d-4代谢物。注意IM1-d-4代谢物具有两个位于ε和ζ的新的手性中心，从而IM1-d-4代谢物可以以图42所示的四种非对映异构体形式存在。如果水攻击反式环氧化物的η或θ位置，环氧化物IM1-e-2打开并形成IM1-d-1代谢物。注意IM1-d-1代谢物的η碳为手性中心。因此，IM1-d-1代谢物的可以以图42所示的各非对映异构体存在。如果在水攻击IM1-e-2环氧化物ε位置后同时发生环氧化物环打开与双键移位(见箭头标记2)，则形成IM1-d-2结构，如图42所示。注意IM1-d-2的ε碳为手性中心。因此，IM1-d-2代谢物可以以如图42所示的各非对映异构体存在。另一方面，如果IM1-e-2环氧化物的β碳羟基攻击IM1-e-2环氧化物的ε碳，形成环状代谢物IM1-c-1。另外，注意ε碳为手性中心，且IM1-c-1代谢物可以以图42中所示的各非对映异构体存在。

类似地，可能从顺式-ISA247开始经由中间体环氧化物形成二醇。图43显示用于反式环氧化物IM1-e-2(IM1-e-2反式)环氧化物环打开的计划反应流程，其中IM1-e-2是指为环氧化物的氨基酸1代谢物(第二个鉴定的环氧化物)。图43还显示了用于顺式环氧化物IM1-e-2(IM1-e-2顺式)环氧化物环打开形成1，2-二醇的反应流程。如图42和图43所示从IM1-e-2顺式反应得到了IM1-d-1代谢物，相反，如图43所示从IM1-e-2顺式形成IM1-d-3。注意IM1-d-1和IM1-d-3均在η位置具有手性中心，并从而可以以任一非对映异构体存在。

由于ISA247的氨基酸-1侧链含有缀合的二烯体系，与CsA相比时具有一个碳原子的延长，因此在ISA247化合物中可形成与CsA相比更大数量的二醇和环氧化物构型的代谢物。由于ISA247分子氨基酸-1残基的末端碳为烯官能团的一部分，不存在与CsA-Am1(其中氨基酸-1侧链的θ-碳被单羟基化)类似的ISA247代谢物。

图57是说明从E-ISA247形成IM-1、IM-1-缩醛、IM1-醛和IM1-羧酸的示例性反应流程。不希望被任何理论束缚，相信E-ISA247如上所述在η、θ烯处被环氧化形成IM1-e-2。环氧化物可打开形成阳离子中间体，其可经受键移位或1，2-氢化物移位后形成IM-1-醛。醛可被还原形成醇IM-1，被氧化形成IM-1-羧酸或经受H₂O加成形成IM1-缩醛。

表5显示在氨基酸-1上显示修饰的ISA247代谢物列表。表5并非详尽列表。例如氨基酸-1代谢物可包括5、6、7或8元环。

表5 ISA247的氨基酸-1代谢物

羟基化代谢物

图6的LCMS显示了1253/1129m/z母体离子/片段离子对处的四个峰。图6中具有8.5分钟色谱滞留时间的主峰1253/1129离子对代表了除氨基酸-1外其它氨基酸侧链的羟基化。这与除氨基酸-1外其它氨基酸上的IMX型或羟基化型代谢物一致。考虑到C_sA和ISA247的HPLC滞留时间相同并且1253/1129m/z离子对峰的HPLC滞留时间和CsA-Am9标准也是不可区分的，很可能该代谢物为IM9。

样品KI-7C得自ISA247(顺式∶反式＝1∶1)的微生物转化并通过HPLC纯化。KI-7C、ISA247的E和Z异构体的1D ¹H-NMR谱显示于图44A中。该比较说明在该样品中δ6和7ppm之间的aa-1二烯质子未受影响，这指示aa-1未被转化。还揭示了样品为Z和E异构体的混合物。在相应的化学位移区观察到两组来自E和Z异构体的四个酰胺NH和七个N-甲基信号，这指示该样品(KI-7C)中肽环是完整的。大部分氨基酸质子通过2D技术(TOCSY和DQF-COSY，未显示)指定。与侧链甲基基团质子缺乏相关性的唯一氨基酸为aa-9。因此，结合羟基化的质量分析结果，提示aa-9侧链转化具有以下结构：

上述观察被¹H-检测的HMQC(Heteronuclear Multiple QuantumCorrelation)和HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Correlation)技术(数据未显示)进一步确认，其通过单键和双键到三键使两个甲基质子与适当的碳分别关联起来。以下显示了从自上述异核相关技术得到的甲基质子与氨基酸-9(aa-9)侧链上相关碳的HMBC相关性和化学位移。因此，KI-7C的NMR分析说明了样品KI-7C为IM9。

甲基质子：～δ0.95和1.05ppm

甲基碳(δ₁和δ₂)：～δ30.6ppm

羟化γ-碳：～δ69.8ppm

图44B显示了IM9的结构——氨基酸-9残基上羟基化。注意ISA247的IM9代谢物的氨基酸-1侧链可以以顺式或反式构型存在。表6显示了基于样品KI-7C(IM9代谢物)的1H-NMR的化学位移指定。

表6.KI-7c(IM-9)的¹H-NMR指定。^1)，2)

KI-7C为E和Z异构体的混合物(E∶Z＝2∶3)

KI-7C    KI-7C(Z)

(E)

氨基酸	Hs	化学位移(ppm)		氨基酸	Hs	化学位移(ppm)
							氨基酸-1			氨基酸-1
CH(α)		5.79		CH(α)	1	5.77
							CH(β)	1	4.21	CH(β)	1	4.21
β-OH	1	3.80		β-OH	1	3.47
							CH(γ)	1	2.12	CH(γ)	1	2.12
γ-CH3	3	1.12		γ-CH3	3	1.12
							CH(δ1)	1	2.72	CH(δ1)	1	2.70
CH(δ2)	1	2.31		CH(δ2)	1	2.50
							CH(ε)	1	5.85	CH(ε)	1	5.73
CH(ζ)	1	6.20		CH(ζ)	1	6.29
							CH(η)	1	6.59	CH(η)	1	6.84
CH(θ1)	1	5.09		CH(θ1)	1	5.19
							CH(θ2)	1	5.01	CH(θ2)	1	5.08
N-Me	3	3.77		N-Me	3	3.74
氨基酸-2				氨基酸-2
							CH(α)	1	5.14	CH(α)	1	5.13
CH(β1)	1	～1.75		CH(β1)	1	～1.76
							CH(β2)	1	～1.75	CH(β2)	1	～1.76
CH3(γ)	3	0.85		CH3(γ)	3	0.86
							NH	1	8.09	NH	1	8.22

							氨基酸-3		化学位移(ppm)	氨基酸-3		化学位移(ppm)
CH(α1)	1	3.96		CH(α1)	1	3.98
							CH(α2)	1	2.13	CH(α2)	1	2.15
N-CH3	3	3.04		N-CH3	3	3.05
氨基酸-4				氨基酸-4
							CH(α)	1	5.55	CH(α)		5.58
CH(β1)	1	2.28		CH(β1)	1	2.33
							CH(β2)	1	1.52	CH(β2)	1	1.52
CH(γ)	1	1.39		CH(γ)	1	1.39
							CH3(δ1)	3	0.97	CH3(δ1)	3	0.98
CH3(δ2)	3	0.89		CH3(δ2)	3	0.90
							N-CH3	3	2.56	N-CH3	3	2.57
							氨基酸-5			氨基酸-5
CH(α)	1	4.84		CH(α)	1	4.84
							CH(β)	1	2.61	CH(β)	1	2.61
CH3(γ1)	3	1.14		CH3(γ1)	3	1.14
							CH3(γ2)	3	0.91	CH3(γ2)	3	0.91
NH	1	7.46		NH	1	7.46
氨基酸-6				氨基酸-6
							CH(α)	1	5.33	CH(α)	1	5.36
CH(β1)	1	2.26		CH(β1)	1	2.26
							CH(β2)	1	1.52	CH(β2)	1	1.52

CH(γ)	1	2.06		CH(γ)	1	2.08
							CH3(δ1)	3	1.16	CH3(δ1)	3	1.17
CH3(δ2)	3	1.07		CH3(δ2)	3	1.08
							N-CH3	3	3.20	N-CH3	3	3.21
							氨基酸-7			氨基酸-7
CH(α)	1	4.89		CH(α)	1	4.88
							CH3(β)	3	1.74	CH3(β)	3	1.71
NH	1	7.81		NH	1	7.92
氨基酸-8				氨基酸-8
							CH(α)	1	4.91	CH(α)	1	4.91
CH3(β)	3	1.07		CH3(β)	3	1.06
							NH	1	7.50	NH	1	7.56
							氨基酸-9			氨基酸-9
CH(α)	1	6.05		CH(α)	1	6.05
							CH(β1)	1	1.87	CH(β1)	1	1.87
CH(β2)	1	1.87		CH(β2)	1	1.87
							CH3(δ1)	3	～1.053)	CH3(δ1)	3	～1.053)
氨基酸	Hs	化学位移(ppm)		氨基酸	Hs	化学位移(ppm)
							CH3(δ2)	3	～0.953)	CH3(δ2)	3	～0.953)
N-CH3	3	2.91		N-CH3	3	2.94
氨基酸-10				氨基酸-10
							CH(α)	1	5.26	CH(α)	1	5.26

CH(β1)	1	2.50		CH(β1)	1	2.50
							CH(β2)	1	1.41	CH(β2)	1	1.41
CH(γ)	1	1.87		CH(γ)	1	1.87
							CH3(δ1)	3	1.26	CH3(δ1)	3	1.26
CH3(δ2)	3	1.16		CH3(δ2)	3	1.16
							N-CH3	3	2.86	N-CH3	3	2.87
							氨基酸-11			氨基酸-11
CH(α)	1	5.34		CH(α)	1	5.32
							CH(β)	1	2.26	CH(β)	1	2.26
CH3(γ1)	3	0.98		CH3(γ1)	3	0.97
							CH3(γ2)	3	0.65	CH3(γ2)	3	0.65
N-CH3	3	2.99		N-CH3	3	3.00

1)E和Z异构体根据以下的aa-1处的偶合常数指定。

E-异构体：

CH(ζ)，δ6.20(dd，15.0和10.3Hz).

CH(η)，δ6.59(dt，16.9，10.3Hz).

Z-异构体：

CH(ζ)，δ6.29(t，10.6Hz).

CH(η)，δ6.84(dt，16.9，10.6Hz).

2)N-甲基化学位移根据E-ISA247和Z-ISA247的指定而指定。

3)直接从¹H-检测的HMQC和HMBC获得。

对应于母体离子/片段离子对为1253/1129m/z的图6的LCMS扫描中第二个HPLC峰的材料(样品KI-6)从ISA247(顺式∶反式1∶1)微生物转化中分离，并使用¹H-NMR对其进行分析。该代谢物对IM9的类似质量信息指出KI-6也是IMX-型代谢物。KI-6的¹H-NMR谱指出代谢物为两种化合物的混合物，对酰胺NH质子(δ7.5-8.7ppm)、二烯(δ6.0-7.0ppm)和N-甲基区(δ2.5-4.0ppm)的进一步检查揭示代谢物为aa-1处E和Z异构体的混合物，具有3∶2的E∶Z比例。有趣的是，起始材料是E和Z异构体1∶1比例的ISA247。这指出可能存在E-ISA247和Z异构体向该代谢物的代谢率差异。

ISA二烯结构和七对N-甲基基团的特征性信号的存在提示aa-1侧链是完整的并且没有发生N-脱甲基化。图45是对代谢物(标记为KI-6)的¹H-NMR和E-ISA247和Z-ISA247的¹H-NMR谱的比较。对二烯和氨基酸α质子区的NMR谱比较清楚地显示了δ5.58ppm处的信号，其对应于Z-ISA247和E-ISA247的NMR谱中aa-4α质子，并在谱中不存在或者位移到另一位置，如图45中箭头所指。该观察结果提示结构上的修饰在靠近aa-4α位置处发生。侧链甲基质子区(δ0.5-1.5ppm)的进一步NMR比较指出新甲基基团信号的出现，如图46中箭头所指。如图46所示，这些峰的放大图揭示在δ1.33和1.30ppm，以及δ1.29和1.26ppm处存在两组单峰甲基信号。2∶3的峰强度比例提示δ1.33和1.30ppm处的甲基信号是Z异构体的，且δ1.29和1.26ppm处的甲基信号是E异构体的。图47显示了放大的KI-6新甲基信号。图46中说明区域中的ISA247 E和Z的甲基基团峰指定显示来自aa-4侧链的甲基基团4-CH3(δ1)和(δ2)在KI-6谱相应区域中不存在，指出图47中新的甲基峰属于aa-4侧链。aa-4侧链的各甲基基团显示为双峰，因为甲基基团与γCH质子，如在E-ISA247和Z时那样。另外，对KI-6样品的质量研究指出除氨基酸-1外的氨基酸羟基化。因此推出：aa-4的δ甲基基团的单峰信号得自图48所示aa-4γ位置的ISA氧化转化。2D TOCSY谱(图49)也证实了上述修饰，前提是这些甲基基团没有信号相关性。这与KI-4(即IM4，氨基酸-4处γ-羟基化)一致。IM4的结构显示于图50。

尽管在该研究中未分离和分析羟基化代谢物，但与上述IM9和IM4类似，其也可发生于氨基酸-10的γCH(IM10)、氨基酸-6的γCH(IM6)和氨基酸-5的βCH(IM5)。这些羟基化代谢物中的一些在图6所示的HPLC中鉴定，但未进行NMR研究。例如，IMX(2)为未知氨基酸处羟基化的代谢物。

N-脱甲基化代谢物

通过¹H-NMR分析具有1223/1099m/z的母体离子/片段离子对的分离的代谢物(样品KI-1)。代谢物的1223/1099m/z母体离子/片段对提示其为N-脱甲基化代谢物。代谢物KI-1的¹H-NMR谱显示代谢物为E和Z异构体1∶1比例的混合物，如E和Z的aa-1侧链二烯质子峰的存在(指示aa-1侧链是完整的)所证明。该谱还揭示δ2.5ppm处一对N-甲基峰的缺失，如图51中箭头所指。该代谢物的¹H-NMR谱与E-ISA247和Z-ISA247的¹H-NMR谱的比较指出对应于该区的丢失的信号是氨基酸-4的N-甲基基团(每种异构体各一个)的信号。因此提示了代谢物氨基酸-4的N-脱甲基化。

代谢物的aa-4α质子信号也与ISA247 E和IDS247Z的aa-4α质子信号(其分别在δ5.56和5.59ppm处共振)相比发生位移，并且不容易在谱上定位。另外，δ7和δ8.7ppm间的酰胺NH质子区仅显示了来自各异构体的八个酰胺NH质子而不是十个，尽管来自各异构体的aa-4的两个NH质子应该出现在该区，这指出aa-4酰胺NH质子在更高的区域共振。

对2D TOCSY谱的分析揭示了δ5.2ppm处与δ4.7ppm处信号相关的两组信号。放大的图谱(图52)给出了这些信号的清楚的关联：δ5.26ppm到4.76ppm，和δ5.23ppm到4.72ppm。各组峰均与其它的氨基酸质子重叠：δ5.2ppm处的峰与aa-11α质子重叠，而δ4.7ppm处的峰与aa-5、aa-7和aa-8α质子重叠。然而aa-5、aa-7、aa-8和aa-11的化学位移排除了来自这些氨基酸的δ5.2和δ4.7ppm处信号的可能性。因此提示δ4.72到5.23ppm和δ4.76到5.26ppm的交叉峰相关性得自各异构体的酰胺NH和aa-4的α质子。根据该观察结果并通过¹H-¹⁵N HSQC确认(未显示)，δ5.26ppm和5.23ppm处的信号指定为NH质子，而δ4.76ppm和δ4.72ppm处的信号指定为aa-4的α质子。图53显示代谢物KI-1作为IM4n的建议的结构。

可使用化学合成方法制造ISA247的代谢物。这些代谢物的化学合成通常遵循以下步骤：1)保护环孢菌素A或ISA247的1氨基酸侧链的β-OH；2)环氧化；3)形成二醇和4)脱保护。尽管对β-OH的保护对于环氧化物和二醇代谢物的形成是有利的，但是其并不适用于环状代谢物的形成。β-OH处可能的保护基团包括乙酰基、三甲基硅烷基、苯甲酸酯、取代的苯甲酸酯、醚和甲基硅烷醚。在某些反应条件下，乙酸盐保护基团易于引起不期望的副反应，如消除和水解。由于苯甲酸酯、醚和甲硅烷基醚在相同的反应条件下通常对这类副反应更具有抵抗力，因此通常有利地使用这些保护基团代替乙酸盐。

在碱性条件下，受保护的CsA或ISA247可形成环氧化物。图54说明了使用Sharpless方法(R.A.Johnson，K.B.Sharpless.Catalytic AsymmetricSynthesis：Edited by I.Ojima；VCH Publishers：New York；1993；p.103；K.B.Sharpless等，J.Org.Chem.1992，57，2768)的合成途径。如图54所示，可对带有烯丙醇部分的受保护的CsA化合物进行Sharpless环氧化。涉及到氧化、Witting反应和环氧化物环打开的一系列反应可产生二醇代谢物(参阅WO 2003/033526和US 2003/0212249)。另外，使用市售可购得的试剂如AD-mix-β/AD-mix-α(K.B.Sharpless et al J.Am.Chem.Soc.1992，114，7570)的Sharpless二羟基化可用于二醇代谢物的合成。代表性例子在图54中说明。

图55表明，化学合成方法可用于直接合成特异顺二醇或反二醇。例如在图55中，顺式烷氧基烯丙基硼酸酯试剂可用于形成IM1-d-4的顺二醇。如果使用反式甲硅烷基烯丙基硼酸酯试剂则可形成IM1-d-4的反二醇(参阅H.C.Brown，等，J.Am.Chem.Soc.1988，110，1535，Marshall，J.A.Chem.Rev.1996，96，31，Barrett，A.G.M.等，J.Org.Chem.1991，56，5243)。

图56阐释了使用氯代烯丙基硼酸化方法形成环氧化物(和二醇)。图56阐释了二烷基(氯丙烯基)硼烷试剂的用途，使用Hu等，J.Org.Chem.1998，63，8843所述方法可导致形成顺式环氧化物，其可转化为二醇，也参阅WO 2003/033526和US 2003/02 12249。

除了上述显示5元环构成的环状氨基酸-1化合物外，包含6、7或8元环的额外的环状氨基酸-1代谢物是可能的。例如在图42中说明了环状代谢物形成，其中IM1-e-2环氧化物代谢物的β-OH在有水时攻击其自身的ε-碳。如果IM1-e-2环氧化物代谢物的β-OH攻击其自身的ζ-碳，则会形成具有6元环结构的环状代谢物。如果IM1-e-2环氧化物代谢物的β-OH攻击其自身的θ-碳，则会形成具有8元环结构的环状代谢物。类似地，如果IM1-e-2环氧化物代谢物的β-OH攻击其自身的η-碳，则会形成具有7元环结构的环状代谢物。

与上述IM4n类似，脱甲基化的代谢物也可发生于aa-1、aa-3、aa-6、aa-9、aa-10和aa-11的甲基化氮上。这些代谢物中的一些在图6的HPLC扫描中鉴定。例如，IMXn(2)为ISA247环上未知氨基酸(命名为“X”)脱甲基化的代谢物。

除了上述代谢物外，还可存在代谢步骤的组合，产生组合了羟基化、N-脱甲基化、二醇形成或环化的代谢物。可存在具有多重羟基化和N-脱甲基化的代谢物。例如，IM-1-d-1可通过位置4上MeLeu的氮脱甲基化进一步代谢产生IM1-d-1-4n。其它例子包括IM1-d-2-4n或IM1-d-3-4n或IM1-d-4-4n、IM1-c-1-4n或IM1-c-2-4n。与二醇结构或环化结合的脱甲基化可以是能进行于N-脱甲基化的ISA247分子上的任何氨基酸。例如ISA247代谢物包含在氨基酸-1上形成的二醇(IM1-d-1、IM1-d-2、IM1-d-3或IM1-d-4)与氨基酸1、3、4、6、9、10或11上至少一个N-脱甲基化的组合。ISA247代谢物还可包含在氨基酸-1上形成的二醇与能够进行羟基化的ISA247分子的任何氨基酸之一羟基化的组合。例如，ISA247的代谢物包含在氨基酸-1上形成的二醇(IM1-d-1、IM1-d-2、IM1-d-3或IM1-d-4)与氨基酸4、6、9、10或11上至少一处羟基化的组合。ISA247代谢物可包含氨基酸环化(I M1-c-1或IM1-c-2)与氨基酸1、3、4、6、9、10或11上至少一个N-脱甲基化或氨基酸4、6、9、10或11上至少一个羟基化组合。代谢物可具有多重羟基化，例如IM46、IM69或IM49，或多重N-脱甲基化，例如IM4n9n或IM4n3n。多重代谢物出现在图6的HPLC扫描中。例如IMXnX(2)表示在ISA247环上未定义位置上N-脱甲基化并羟基化的代谢物。这些多重羟基化和/或多重N-脱甲基化还可与aa-1处二醇形成或aa-1处环化一起发生。

除了上述I相代谢物外，额外的II相代谢物也可发生。这些II相代谢物可包括基团如葡糖苷酸、糖(例如得自糖基化的)、磷酸、硫酸等，其可在ISA247或ISA247代谢物分子的任何羟基上发生。本领域常规技术人员会理解该II相代谢物列表并非详尽的，并且该公开文献考虑了许多额外的II相代谢物。

实施例1.从全血中制备ISA247代谢物

施用ISA247后从人中采全血。使用叔丁基-甲基-醚(或甲基叔丁基醚，MTBE)从全血中萃取ISA247及其代谢物，干燥并重溶于甲醇。向200uL血中加入2mL MTBE(cat.No.7001-2；Caledon)，振荡10分钟，并在桌面离心机上离心2分钟。取出上面的MTBE层并真空浓缩。该残余物重溶于200uL甲醇中。胆汁和尿萃取类似地进行。

实施例2：化学合成ISA247代谢物

制备OAc-E-ISA247的单环氧化物

为了制备E-ISA247的二醇代谢物，如图42所示形成环氧化物。进行以下步骤。向搅匀并冷却(0℃)的OAc-E-ISA247(125mg，0.1mmol)的CHCI₃(3mL)溶液中加入碳酸氢钾(10mg)。然后添加m-氯代过苯甲酸(23mg，0.1m mol，77％)的CHCI₃(2mL)溶液。反应混合物加热至室温并持续搅拌18小时。用二氯乙烷(25mL)萃取反应产物。用饱和的NaHCO₃溶液和卤水洗涤有机层。干燥(Na₂SO₄)和溶剂去除得到白色固体(110mg)。MS(m/z)：1295(M+Na+)。产物为环氧化物的混合物。相同方法可使用OAc-Z-ISA247或ISA247异构体的混合物，但是产物的立体化学会有所不同，如图42所示。

将OAc-E-ISA247环氧化物切割为二醇混合物：

将上述产物(110mg)加入搅匀并冰冷的丙酮-水-88％的HCO₂H(15mL，64.5∶33∶2.5)中并在室温下搅拌72小时。通过乙酸乙酯(25mL)萃取处理反应混合物并用饱和NaHCO₃溶液和卤水洗涤有机萃取物。干燥(Na₂SO₄)和溶剂去除得到白色固体(110mg)。MS(m/z)：1313(M+Na⁺)。产物为OAc-E-ISA247二醇的混合物。

二醇脱保护：

将OAc-E-ISA247二醇(110mg)混合物溶于MeOH(10mL)，并加入水(4mL)，然后加入固体碳酸钾(110mg)。在室温搅拌反应混合物36小时然后用乙酸乙酯(25mL)萃取。用卤水洗涤合并的有机提取物并干燥(NaSO₄)。去除溶剂得到固体(110mg)MS(m/z)1271(M+Na⁺)。使用PHLC纯化得到化合物IM1-d-1、IM1-d-2和IM1-d-4。

实施例3：E-ISA247的环氧化(制备环化代谢物)：

在酸性环境中形成环状化合物。向搅匀并冷却(0℃)的E-ISA247(250mg，0.2mmol)的CHCI₃(3mL)溶液中加入m-氯过苯甲酸(51mg，0.23mmol，77％)的CHCl₃(2mL)水溶液并在室温搅拌48小时。反应混合物冷却至0℃并通过加入Me₂S(600uL)破坏过量的m-CPBA。用二氯甲烷(25mL)萃取反应产物并用饱和的NaHCO₃溶液和卤水洗涤有机层。干燥(NaSO₄)和溶剂去除得到固体(230mg)。以IM1-c-1和IM1-c-2混合物存在的环化的化合物使用制备HPLC分离。

实施例4：E-ISA247的环氧化(制备末端环氧化物)

向搅匀并冷却(0℃)的E-ISA247(200mg，0.17mmol)的CHCL₃(3mL)溶液中加入固体KHCO₃(20mg，0.2mmol)。然后加入m-氯过苯甲酸(45mg，0.2mmol)的CHCl₃(2mL)溶液。在室温下持续搅拌4.5小时。然后在冰上冷却反应混合物并加入Me₂S(500uL)。如上的加工和HPLC分离得到了末端环氧化物IM1-e-I。

实施例5：通过犬肝微粒体制剂制造ISA247代谢物

制备犬微粒体

以以下方式制备犬肝微粒体：取出肝后将其用1.15％氯化钾(KCl)冲洗；切成小块(约25g)并研磨，直至大块在冰冷的研磨缓冲液(0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4；4℃；缓冲液与肝比例为1∶1)中分解。使用PolytronHomogenizer(15,000rpm处理3到5分钟)形成含有肝组织的匀浆。将上清液从不溶性微粒中倒出后，将上清液在100,000xg离心90分钟得到微粒体沉淀。使用Lowry蛋白质测定法确定微粒体沉淀的蛋白质含量。该微粒体制剂的蛋白质浓度为约23.2mg/mL。为了防止酶活性丢失，将微粒体以4.0或6.0mL的等分式样保存在-80℃以防止冻熔循环。

将如上制备的6mL体积的犬肝微粒体在257mL Erlenmeyer Flask中孵育，逐步添加以下成分：向6.0mL磷酸盐缓冲液(调节至pH7.4)中加入57.3mg NADP、254mg葡萄糖-6-磷酸盐和23.0mg NADPH。然后向溶液中加入2.0mL 5.0mM MgCl和6.0mL葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶(10单位/mL，可得自CALBIOCHEM，San Diege，CA，Cat.No.346774)。最后加入10mL磷酸盐缓冲液(pH7.4)。在环境控制培养箱/摇床中于37℃，250rpm下将三角瓶孵育2小时。2小时候通过加入500μL 2M HCl终止反应。

然后用有机溶剂萃取通过该方法制造的代谢物，并使用高压液相色谱法(HPLC)进一步分离。通过电喷射质谱(MS)和NMR进一步分析代谢物。

实施例6A：通过生物转化制造ISA247代谢物

生物转化体系使用含有人细胞色素P450微粒体酶的微生物等效物的微生物，以及适用于该微生物活性生长的培养基。将弱溶于水的母体化合物与乙醇和表面活性剂混合，然后添加进生物转化体系。在该实施例中，乙醇中的ISA247与Tween 40混合然后添加进含有Saccharopolysporaerytheraea ATCC 11635的生物转化体系中。

生物转化实验用15个斜面的Saccharopolyspora erytheraea起始。这些斜面制备自100mL的ATCC培养基196(约每斜面6.0mL)，其溶解在去离子水中，用NaOH调节至pH7.0并在100℃灭菌30分钟。在用Saccharopolyspora erytheraea接种后，使这些斜面在28℃下生长三周。

然后将来自这些斜面的菌落转移至I相培养基。I相培养基用10g/L糊精、1g/L葡萄糖、3g/L牛肉提取物、10g/L酵母提取物、5g/L硫酸镁和400mg/L磷酸氢二钾制备。这些成分在去离子水中混合至1升，并用NaOH调节至pH7.0。然后将50mL等分式样转移至baffled 250mL培养基三角瓶中并在100℃灭菌30分钟。为了开始I相培养，向含有Saccharopolyspora erythraea的琼脂斜面中等分加入5mL培养基。从斜面表面上刮下细胞，形成细胞悬浮液。每个三角瓶使用2.5mL该悬浮液接种。将三角瓶置于27℃的Labline培养箱中并在250rpm下摇动3天(72小时)。

通过在3300rpm将I相三角瓶的内容物离心5分钟并弃去上清液得到沉淀，将Saccharopolyspora erythraea从I相培养基中转移至II相培养基。向该沉淀中加入5mL II相培养基并振荡管，然后在3300rpm离心4分钟。再次弃去上清液。将沉淀重悬于II相培养基中。所得的悬浮液加入baffled培养三角瓶内50mL II相培养基中。

II相培养基含有10g/L葡萄糖、1g/L酵母提取物、1g/L牛肉提取物和11.6g/L 3-N-吗啉代丙磺酸(MOPS)缓冲液。这些成分混合于去离子水中并用5M NaOH调节至pH7.0。将50mL等分式样注入带挡板的培养三角瓶(250mL)内，并在100℃下高压灭菌30分钟。Tween 40也要高压灭菌。

将ISA247(4mg)溶解于0.1ml乙醇(95％)中然后与0.4ml Tween40(聚氧乙烯单棕榈脱水山梨醇；Cat.No.P1 504.Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)混合。然后将母体化合物-表面活性剂混合物加入II相培养基中的Saccharopolyspora erythraea中。采集零时间样品并冷冻。然后将各三角瓶盖上并置于27℃的Innova培养箱中并在170rpm摇动下孵育120小时。

第二种样品得自II相培养基。零时间样品和第二种样品使用叔丁基甲醚(cat.No.700 1-2；Caledon)萃取。萃取的代谢物重溶于甲醇(HPLC级别)并通过如下所述的LC-MS分析。

图59为列出可由ATCC 11635制造的代谢物类型数量(即代谢多样性)的柱状图。

实施例6B：通过生物转化制造ISA247代谢物

在以前述生物转化实施例为基础的其它实验中，评估多种微生物从ISA247到ISA247代谢物的制造，所述微生物包括Curvularia lunata(UAMH 9191，ATCC 12017)、Cunninghamella echinulata var.elegans(UAMH 7370，ATCC 36112)、Curvularia echinulata var.blakesleena(UAMH8718，ATCC 8688a)、Cunninghamella echinulata var.elegans(UAMH 7369，ATCC 26269)、Beauvaria bassiana(UAMH 8717，ATCC 7159)、Actinomycetes(ATCC 53828)、Actinoplanes(ATCC 53771)、Cunninghamellaechinulata(UAMH 4144，ATCC 36190)、Cunninghamella echinulata(UAMH7368，ATCC 9246)、Cunninghamella bainiere(echinulata)(UAMH 4145，ATCC 9244)和Saccharopolyspora erythrae(ATCC 11635)。

筛选这些微生物的代谢物转化产率(产生的已知ISA247代谢物总量比起始的ISA247)以及代谢多样性(产生的不同ISA247代谢物的数量)。另外，与已知佐剂甘油相比来检查递送佐剂(为了促进高度亲脂ISA247的吸收)，包括二甲基亚砜(DMSO)和Tween 40。从培养基中取样并与下述人标准ISA247代谢物谱相比用LC-MS分析。表7列出发现的离子群集、对应的可定量ISA247代谢物和近似的滞留时间。定量化的离子集群包括1223、1237、1239、1253、1255、1267和1271。

表7

离子集群	来自ISA247的代谢物	近似的滞留时间(分钟)
			1223	IM4n	9.789
1237	ISA247	10.206
			1239	1239	8.340
1253	IM1-c-1；IM9；IM4	8.575；8.939；9.440
			1255	1255	8.899
1267	CSA(内标)	10.678
			1271	IM1-d-1；IM1-d-4	7.535；8.166

表8根据生物转化后96小时的总转化量和代谢多样性对检测的微生物分级。

表8

代谢物	ATCC11635	UAMH4145	ATCC53771	ATCC53828	UAMH7369	UAMH7370	UAMH8717	UAMH8718	UAMH9191
										IM1-d-1	√	√	√		√	√		√	√
IM1-d-4	√						√		√
										1239	√		√	√		√	√	√	√
1255	√	√	√				√
										IM4n	√	√	√		√			√	√
IM1-c-1	√	√	√	√	√	√		√	√
										IM9	√	√		√	√	√		√	√
IM4	√	√		√				√
										排列	第1	第4	第3	第9	第8	第7	第6	第5	第2

实施例7：ISA247代谢物分析的LS/MS方法论

在该实施例中，ISA247代谢物在体内产生，使用高压液相色谱(HPLC)分离并使用电喷射质谱法描绘特征。

液相色谱(LC)条件

对于液相色谱(LC或HPLC)而言，使用带有装填了Perisorb RP-8(Upchurch Scientific cat#C-601)的2×20mm保护柱(Upchurch Scientific cat#C-130B)的Waters Symmetry C8，2.1×50mm，3.5μm分析柱(Waters cat# WAT200624)。LC程序中使用的溶剂百分比和流速在表9中给出：

表9
				时间(分钟)	0.2％GAA+10-5M乙酸钠(％)	MeOH∶MtBE(9∶1)(％)	流速(mL/分钟)
0.00	55	45	0.5
				5.00	45	55	0.5
10.00	5	95	0.5
				12.00	5	95	0.5
12.01	55	45	0.5
				15.00	55	45	0.5

质谱(MS)条件

对于质谱而言，使用Applied Biosystems/MDS Sciex API3000(Analystsoftware v 1.2)仪器。运行时间为15分钟，注射体积为5μL，保护柱温度和分析柱温度为60℃。菜单设置如下：涡轮离子喷射为8000，涡轮离子喷射水平设定为正4，涡轮离子喷射侧向设定为10。用表10所示参数设置Sciex仪器。

表10MS设定
	MS设定：
扫描类型：MRM(多重反应监测)
	极性：正
周期时间15.00分钟
	循环周期：1.32秒
循环数：692
高级MS设定：
	分辨率Q1：低
Q3低
	强度阈值：0
调整时间：50毫秒
	暂停时间：30毫秒
	参数设置：
离子源：涡轮离子喷射
	雾化气体：12
气帘气体：8
	碰撞气体：12
离子喷射电压5000V
	温度：550℃

化合物设定：
	去簇电压：60V
聚焦电压：400V
	碰撞能量：90V

表11显示了离子和离子特异性的仪器设定。

表11
			Q1质量(amu)	Q3质量(amu)	时间(msec)
1222.8	1098.7	100
			1236.8	1112.7	100
1252.8	1128.7	100
			1252.8	1224.7	100
1270.8	1112.7	100
			1254.8	1130.7	100
1268.8	1128.7	100
			1268.8	1144.7	100
1238.8	1114.7	100
			1268.8	1240.8	100

实施例8：测量ISA247代谢物的免疫抑制活性

使用先前Fruman等(A Proc Nati Acad Sci USA，1992)和美国专利号No.6,605,593所述方法的变更测定钙依赖磷酸酶活性。评估全血溶胞产物在存在冈田酸(okadaic acid)、磷酸酶1型和2型抑制剂时对³²P-标记的19个氨基酸肽底物的去磷酸化的能力。确定背景磷酸酶2C活性(抗CsA和冈田酸活性)并从各样品中减去，测定在存在和不存在过量添加的ISA247下进行。剩余的磷酸酶活性作为钙依赖磷酸酶活性。

图58A为显示钙依赖磷酸酶抑制与添加的代谢物浓度(ng/mL)相比的图。将图58A与图58B(其显示钙依赖磷酸酶抑制与反式ISA247、顺式ISA247和CsA相比)相比可以看出，钙依赖磷酸酶抑制作为ISA247代谢物IM1-二酮-1、IM9、IM4n、IM1c和IM1浓度的函数，与反式ISA247、顺式ISA247和CsA相当。表12显示与反式ISA247和CsA相比，IM1、IM1-二酮-1、IM4n和IM9的Emax和EC50。

表12

代谢物1.D	代谢物Emax	代谢物EC5O
			IM1	47.6％	450.0ng/mL
IM1-二酮-1	23.3％	394.5ng/mL
			IM4n	71.5％	720.9ng/mL
IM9	62.9％	271.3ng/mL
			反式ISA247	107％	208ing/mL
环孢菌素A	89％	368ng/mL

本申请书所列的所有的出版物、专利和专利申请书整体通过引用并入本文，即相当于指明各单独的出版物、专利申请书或专利的公开内容明确地和单独地以其整体通过引用并入本文。

本文的反应机制(无论是化学的或酶的)是理论上的，并被提供用于明确和例证本文描述的方法。虽然认为这些机制是真实的，但是本领域技术人员能够理解将来的证据可导致对这类机制的改变。因此，申请人并非意欲使本文公开的实施方案受到这些理论机制的束缚。

本领域技术人员会容易地得到上文公开的本发明示例性实施方案的许多改变。因此，本发明应解释为包括落入附加的权利要求范围内的所有结构和方法。

权利要求书(按照条约第19条约的修改)

1.由下式代表的分离的化合物及其药学可接受盐和溶剂化物，

其中：

各R²独立地为-H或-CH₃；

各R¹⁰独立地为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO₂、-OR^a、-C(O)R^a、-OC(O)R^a、-C(O)OR^a、-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₃R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-PO₂R^aR^b、-OPO₂R^aR^b、-PO₃R^aR^b、-OPO₃R^aR^b、-N(R^aR^b)、-C(O)N(R^aR^b)、-C(O)NR^aNR^bSO₂R^c、-C(O)NR^aSO₂R^c、-C(O)NR^aCN、-SO₂N(R^aR^b)、-SO₂N(R^aR^b)、-NR^cC(O)R^a、-NR^cC(O)OR^a或-NR^cC(O)N(R^aR^b)；

R⁵独立地为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO₂、-OR^a、-C(O)R^a、-OC(O)R^a、-C(O)OR^a、-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₃R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-PO₂R^aR^b、-OPO₂R^aR^b、-PO₃R^aR^b、-OPO₃R^aR^b、-N(R^aR^b)、-C(O)N(R^aR^b)、-C(O)NR^aNR^bSO₂R^c、-C(O)NR^aSO₂R^c、-C(O)NR^aCN、-SO₂N(R^aR^b)、-SO₂N(R^aR^b)、-NR^cC(O)R^a、-NR^cC(O)OR^a或-NR^cC(O)N(R^aR^b)；

R⁶、R⁷、R⁸和R⁹独立地为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO₂、-OR^a、-C(O)R^a、-OC(O)R^a、-C(O)OR^a、-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₃R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-PO₂R^aR^b、-OPO₂R^aR^b、-PO₃R^aR^b、-OPO₃R^aR^b、-N(R^aR^b)、-C(O)N(R^aR^b)、-C(O)NR^aNR^bSO₂R^c、-C(O)NR^aSO₂R^c、-C(O)NR^aCN、-SO₂N(R^aR^b)、-SO₂N(R^aR^b)、-NR^cC(O)R^a、-NR^cC(O)OR^a或-NR^cC(O)N(R^aR^b)；或R⁶和R⁷一起为-O-；或R⁵和R⁶一起或R⁷和R⁸一起，为独立的-O-；或R⁸和R⁹一起为-O-；或R⁵、与其结合的碳一起为-C(＝O)R^a、-CO₂R^a、-CH₂OR^a、-CH₂OC(O)R^a，-CH(OR^a)₂、-C(O)N(R^aR^b)、-C(＝NR^b)R^a、-C(＝NOR^b)R^a或-C(＝NNR^b)R^a；并且R⁵和R⁶、R⁶和R⁷或R⁷和R⁸中一对为碳-碳键，并且其余并非全为-H；和

R^a、R^b和R^c各自独立为-H或任选的取代的脂肪族、环脂肪族、苯基或芳香基，或与-N(R^aR^b)一起为任选被取代的杂环基团，或与-CH(OR^a)₂一起为环缩醛基团；

并且，如果R²是CH₃、R⁵是OR^a、R⁶和R¹⁰是-H，且R⁹是OAc，那么R⁷和R⁸不形成碳-碳双键。

2.如权利要求1所述的分离的化合物，其中该化合物由下式代表：

其中：

各R²独立地为-H或-CH₃；

各R¹⁰独立地为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-OR^a、-OC(O)R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-OPO₂R^aR^b或-OPO₃R^aR^b；

R⁵独立地为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-OR^a、-OC(O)R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-OPO₂R^aR^b或-OPO₃R^aR^b；

R⁶、R⁷、R⁸和R⁹独立地为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-OR^a、-OC(O)R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-OPO₂R^aR^b或-OPO₃R^aR^b；或R⁶和R⁷一起为-O-；或R⁵和R⁶一起，或R⁷和R⁸一起独立地为-O-；或R⁸和R⁹一起为-O-；或R⁵与其结合的碳一起为-C(＝O)R^a、-CO₂R^a、-CH₂OR^a、-CH₂OC(O)R^a、-CH(OR^a)₂、-C(O)N(R^aR^b)、-C(＝NR^b)R^a、-C(＝NOR^b)R^a或-C(＝NNR^b)R^a；并且R⁵和R⁶、R⁶和R⁷或R⁷和R⁸中一对为碳-碳键，并且其余并非全为-H；和

R^a、R^b和R^c各自独立地为-H或任选的取代的脂肪族、环脂肪族、苯基或芳香基，或与-N(R^aR^b)一起为任选被取代的杂环基团，或与-CH(OR^a)₂一起为环缩醛基团；

并且，如果R²是CH₃、R⁵是OR^a、R⁶和R¹⁰是-H，且R⁹是OAc，那么R⁷和R⁸不形成碳-碳双键。

3.如权利要求1所述的分离的化合物，其中该化合物由下式代表：

其中：

R¹选自下组：

各R²独立选自-CH₃和-H；

各R³独立选自-CH₂CH(CH₃)₂和-CH₂C(CH₃)₂OH；和

各R⁴独立选自-CH(CH₃)₂和-C(CH₃)₂OH。

4.环{{(E)-和(Z)-(2S，3R，4R)-3-羟基-4-甲基-2-(甲氨基)-6，8-壬二烯基}-L-2-氨基丁酰-N-甲基-甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-丙胺酰-D-丙胺酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-缬氨酰}(ISA247)的分离的代谢物及其药学可接受盐和溶剂合物，其中与ISA247相比，分离的代谢物包含一种或多种选自以下的化学修饰：羟基化、N-脱甲基化、形成二醇、形成环氧化物、分子内环化、磷酸化、硫酸化、形成葡糖苷酸和糖基化。

5.如权利要求4所述的分离的代谢物，其中所述分离的代谢物包含至少一种选自以下的化学修饰：

氨基酸-1侧链上的环氧化物；

氨基酸1侧链上的二醇；

氨基酸-1侧链上的环醚；

氨基酸-1、3、4、6、9、10或11上的脱甲基化氨基氮；

氨基酸4、6、9或10侧链上γ碳上的-OH；和

氨基酸5或11侧链上β碳上的-OH。

6.如权利要求4所述的分离的代谢物，其中所述分离的代谢物选自IM1-e-1、IM1-e-2、IM1-e-3、IM1-d-1、IM1-d-2、IM1-d-3、IM1-d-4、IM1-c-1和IM1-c-2。

7.如权利要求4所述的分离的代谢物，其中与ISA247相比，所述分离的代谢物包含选自以下的化学修饰：

至少两个-OH基团；

至少两个去甲基化的氨基酸氮；

至少一个-OH基团和至少一个去甲基化的氨基酸氮；

至少一个二醇基团和至少一个-OH基团；

至少一个二醇基团和至少一个去甲基化的氨基酸氮；

至少一个环醚和至少一个-OH基团；

至少一个环醚和至少一个去甲基化的氨基酸氮；

至少一个-OH基团和磷酸酯、硫酸酯、葡糖苷酸或糖基化残基；和

至少一个二醇和磷酸酯、硫酸酯、葡糖苷酸或糖基化残基。

8.体外制备ISA247代谢物的方法，包括步骤：

a)均质化哺乳动物细胞以形成匀浆；

b)离心匀浆以形成微粒体沉淀，所述微粒体沉淀包含至少一种药物代谢酶；和

c)在引起产生至少一种ISA247代谢物的条件下，制备含有ISA247、微粒体沉淀、能量来源和电子供体种类的反应混合物。

9.如权利要求8所述的方法，其中哺乳动物细胞为选自灵长类、大鼠、犬和兔的哺乳动物肝细胞。

10.如权利要求8所述的方法，其中药物代谢酶为细胞色素P-450酶。

11.如权利要求8所述的方法，其中电子供体种类选自NADH和NADHP。

12.如权利要求8所述的方法，其中能量来源选自葡萄糖-6-磷酸和异柠檬酸盐。

13.如权利要求12所述的方法，其中反应混合物还包含选自葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的酶。

14.如权利要求8所述的方法，其还包括如下步骤：使用高效液相色谱分离ISA247代谢物。

15.制造羟基化的ISA247代谢物的方法，所述方法包括如下步骤：

a)保护ISA2471-氨基酸残基上的β-醇，形成受保护的ISA247化合物；

b)用卤化剂在至少4、6或9-氨基酸残基之一侧链上的γ-碳上卤化受保护的ISA-247化合物，从而形成卤化的产物；

c)在存在乙酸盐试剂时加热步骤b)的卤化产物形成带有乙酸基的含乙酸基产物；和

d)进行酯交换，将步骤c)的含乙酸基产物中乙酸基部分与醇部分交换，从而形成ISA247的羟基化代谢物。

16.如权利要求15所述的方法，其中卤化剂为N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，而乙酸盐试剂为乙酸四丁基铵。

17.由权利要求15所述的方法制造的分离的ISA247的羟基化代谢物。

18.如权利要求17所述的分离的羟基化代谢物，其中羟基化代谢物选自IM9、IM4、IM6、IM46、IM69和IM49。

19.用于体外制造ISA247环氧化物代谢物的方法，所述方法包括如下步骤：用氧化剂氧化分离的ISA2471-氨基酸残基侧链的烯部分，从而形成ISA247的环氧化物代谢物。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述氧化步骤为Prilezhaev反应。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述氧化剂选自m-氯过苯甲酸(MCPBA)、过氧乙酸、三氟过氧乙酸、过苯甲酸、3，5-双氮过苯甲酸、过氧化氢、烷基过氧化物和氧。

22.由权利要求19所述的方法制备的分离的ISA247环氧化物代谢物。

23.如权利要求22所述的分离的环氧化物代谢物，其中所述代谢物选自IM1-e-1、IM1-e-2和IM1-e-3。

24.体外制备ISA247二醇代谢物的方法，包括步骤：

a)用氧化剂处理ISA247的1-氨基酸残基侧链，以形成ISA247的环氧化物代谢物；和

b)从分离的所述ISA247环氧化物代谢物形成分离的ISA247的二醇代谢物。

25.如权利要求24所述的方法，其中步骤a)为Prilezhaev反应。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述氧化剂选自m-氯过苯甲酸(MCPBA)、过氧乙酸、三氟过氧乙酸、过苯甲酸、3，5-双氮过苯甲酸、过氧化氢、烷基过氧化物和氧。

27.如权利要求24所述的方法，其中步骤b)包括水解ISA247的环氧化物代谢物。

28.如权利要求27所述的方法，其中步骤b)中的水解用酸或碱催化。

29.如权利要求27所述的方法，其中步骤b)包括：用高氯酸或Nafion-H催化的水解；在二甲基亚砜中的碱水解；或微粒体环氧化物水解酶催化的水解。

30.由权利要求24所述方法制备的分离的ISA247二醇代谢物。

31.如权利要求30所述的分离的二醇代谢物，其中分离的二醇代谢物选自IM1-d-1、IM1-d-2、IM1-d-3和IM1-d-4。

32.制备ISA247二醇代谢物的方法，包括步骤：将分离的ISA247与选自四氧化锇、碱性高锰酸钾、过氧化氢、单过琥珀酸和叔丁基过氧化氢的试剂反应，从而形成ISA247的二醇代谢物。

33.如权利要求32所述的方法，其中ISA247与催化数量的四氧化锇反应。

34.如权利要求32所述的方法，其中ISA247与选自过氧化氢/甲酸和单过琥珀酸的试剂反应。

35.制造ISA247二醇代谢物的方法，所述方法包括如下步骤：

a)用选自碘/苯甲酸银和乙酸银的试剂处理ISA247，形成ISA247二酯；和

b)卤化ISA247二酯，从而形成ISA247二醇代谢物。

36.由权利要求35所述方法制备的分离的ISA247二醇代谢物。

37.如权利要求36所述的分离的二醇代谢物，其中所述分离的二醇代谢物选自IM1-d-1和IM1-d-2。

38.制备ISA247二醇代谢物的方法，所述方法包括如下步骤：

a)将ISA247与选自四乙酸铅和乙酸亚铊的试剂反应，形成ISA247二醇二乙酸酯；和

b)水解ISA247二醇二乙酸酯从而形成ISA247二醇代谢物。

39.由权利要求38所述的方法制备的分离的ISA247二醇代谢物。

40.如权利要求39所述的分离的二醇代谢物，其中所述分离的二醇代谢物选自IM1-d-1和IM1-d-2。

41.药学组合物，其含有药学可接受的载体与权利要求1所述的分离的化合物。

42.药学组合物，其含有药学可接受的载体与权利要求2所述的分离的化合物。

Claims (42)

1.由下式代表的分离的化合物及其药学可接受盐和溶剂化物，

其中：

各R²独立地为-H或-CH₃；

各R¹⁰独立地为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO₂、-OR^a、-C(O)R^a、-OC(O)R^a、-C(O)OR^a、-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₃R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-PO₂R^aR^b、-OPO₂R^aR^b、-PO₃R^aR^b、-OPO₃R^aR^b、-N(R^aR^b)、-C(O)N(R^aR^b)、-C(O)NR^aNR^bSO₂R^c、-C(O)NR^aSO₂R^c、-C(O)NR^aCN、-SO₂N(R^aR^b)、-SO₂N(R^aR^b)、-NR^cC(O)R^a、-NR^cC(O)OR^a或-NR^cC(O)N(R^aR^b)；

R⁵、R⁶、R⁷、R⁸和R⁹独立地为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO₂、-OR^a、-C(O)R^a、-OC(O)R^a、-C(O)OR^a、-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₃R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-PO₂R^aR^b、-OPO₂R^aR^b、-PO₃R^aR^b、-OPO₃R^aR^b、-N(R^aR^b)、-C(O)N(R^aR^b)、-C(O)NR^aNR^bSO₂R^c、-C(O)NR^aSO₂R^c、-C(O)NR^aCN、-SO₂N(R^aR^b)、-SO₂N(R^aR^b)、-NR^cC(O)R^a、-NR^cC(O)OR^a或-NR^cC(O)N(R^aR^b)；或R⁶和R⁷一起为-O-；或R⁵和R⁶一起或R⁷和R⁸一起，为独立的-O-；或R⁸和R⁹一起为-O-；或R⁵、与其结合的碳一起为-C(＝O)R^a、-CO₂R^a、-CH₂OR^a、-CH₂OC(O)R^a，-CH(OR^a)₂、-C(O)N(R^aR^b)、-C(＝NR^b)R^a、-C(＝NOR^b)R^a或-C(＝NNR^b)R^a；并且R⁵和R⁶、R⁶和R⁷或R⁷和R⁸中一对为碳-碳键，并且其余并非全为-H；和

R^a、R^b和R^c各自独立为-H或任选的取代的脂肪族、环脂肪族、苯基或芳香基，或与-N(R^aR^b)一起为任选被取代的杂环基团，或与-CH(OR^a)₂一起为环缩醛基团。

2.如权利要求1所述的分离的化合物，其中该化合物由下式代表：

其中：

各R²独立地为-H或-CH₃；

各R¹⁰独立地为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-OR^a、-OC(O)R^a、-O8O₂R^a、-OSO₃R^a、-OPO₂R^aR^b或-OPO₃R^aR^b；

R⁵、R⁶、R⁷、R⁸和R⁹独立地为-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-OR^a、-OC(O)R^a、-OSO₂R^a、-OSO₃R^a、-OPO₂R^aR^b或-OPO₃R^aR^b；或R⁶和R⁷一起为-O-；或R⁵和R⁶一起，或R⁷和R⁸一起独立地为-O-；或R⁸和R⁹一起为-O-；或R⁵与其结合的碳一起为-C(＝O)R^a、-CO₂R^a、-CH₂OR^a、-CH₂OC(O)R^a、-CH(OR^a)₂、-C(O)N(R^aR^b)、-C(＝NR^b)R^a、-C(＝NOR^b)R^a或-C(＝NNR^b)R^a；并且R⁵和R⁶、R⁶和R⁷或R⁷和R⁸中一对为碳-碳键，并且其余并非全为-H；和

R^a、R^b和R^c各自独立地为-H或任选的取代的脂肪族、环脂肪族、苯基或芳香基，或与-N(R^aR^b)一起为任选被取代的杂环基团，或与-CH(OR^a)₂一起为环缩醛基团。

3.如权利要求1所述的分离的化合物，其中该化合物由下式代表：

其中：

R¹选自下组：

各R²独立选自-CH₃和-H；

各R³独立选自-CH₂CH(CH₃)₂和-CH₂C(CH₃)₂OH；和

各R⁴独立选自-CH(CH₃)₂和-C(CH₃)₂OH。

4.环{{(E)-和(Z)-(2S，3R，4R)-3-羟基-4-甲基-2-(甲氨基)-6，8-壬二烯基}-L-2-氨基丁酰-N-甲基-甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-丙胺酰-D-丙胺酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-缬氨酰}(ISA247)的分离的代谢物及其药学可接受盐和溶剂合物，其中与ISA247相比，分离的代谢物包含至少一种选自以下的化学修饰：羟基化、N-脱甲基化、形成二醇、形成环氧化物、分子内环化、磷酸化、硫酸化、形成葡糖苷酸和糖基化。

5.如权利要求4所述的分离的代谢物，其中所述分离的代谢物包含至少一种选自以下的化学修饰：

氨基酸-1侧链上的环氧化物；

氨基酸1侧链上的二醇；

氨基酸-1侧链上的环醚；

氨基酸-1、3、4、6、9、10或11上的脱甲基化氨基氮；

氨基酸4、6、9或10侧链上γ碳上的-OH；和

氨基酸5或11侧链上β碳上的-OH。

6.如权利要求4所述的分离的代谢物，其中所述分离的代谢物选自IM1-e-1、IM1-e-2、IM1-e-3、IM1-d-1、IM1-d-2、IM1-d-3、IM1-d-4、IM1-c-1和IM1-c-2。

7.如权利要求4所述的分离的代谢物，其中与ISA247相比，所述分离的代谢物包含选自以下的化学修饰：

至少两个-OH基团；

至少两个去甲基化的氨基酸氮；

至少一个-OH基团和至少一个去甲基化的氨基酸氮；

至少一个二醇基团和至少一个-OH基团；

至少一个二醇基团和至少一个去甲基化的氨基酸氮；

至少一个环醚和至少一个-OH基团；

至少一个环醚和至少一个去甲基化的氨基酸氮；

至少一个-OH基团和磷酸酯、硫酸酯、葡糖苷酸或糖基化残基；和

至少一个二醇和磷酸酯、硫酸酯、葡糖苷酸或糖基化残基。

8.体外制备ISA247代谢物的方法，包括步骤：

a)均质化哺乳动物细胞以形成匀浆；

b)离心匀浆以形成微粒体沉淀，所述微粒体沉淀包含至少一种药物代谢酶；和

c)在引起产生至少一种ISA247代谢物的条件下，制备含有ISA247、微粒体沉淀、能量来源和电子供体种类的反应混合物。

9.如权利要求8所述的方法，其中哺乳动物细胞为选自灵长类、大鼠、犬和兔的哺乳动物肝细胞。

10.如权利要求8所述的方法，其中药物代谢酶为细胞色素P-450酶。

11.如权利要求8所述的方法，其中电子供体种类选自NADH和NADHP。

12.如权利要求8所述的方法，其中能量来源选自葡萄糖-6-磷酸和异柠檬酸盐。

13.如权利要求12所述的方法，其中反应混合物还包含选自葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的酶。

14.如权利要求8所述的方法，其还包括如下步骤：使用高效液相色谱分离ISA247代谢物。

15.制造羟基化的ISA247代谢物的方法，所述方法包括如下步骤：

a)保护ISA2471-氨基酸残基上的β-醇，形成受保护的ISA247化合物；

b)用卤化剂在至少4、6或9-氨基酸残基之一侧链上的γ-碳上卤化受保护的ISA-247化合物，从而形成卤化的产物；

c)在存在乙酸盐试剂时加热步骤b)的卤化产物形成带有乙酸基的含乙酸基产物；和

d)进行酯交换，将步骤c)的含乙酸基产物中乙酸基部分与醇部分交换，从而形成ISA247的羟基化代谢物。

16.如权利要求15所述的方法，其中卤化剂为N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，而乙酸盐试剂为乙酸四丁基铵。

17.由权利要求15所述的方法制造的分离的ISA247的羟基化代谢物。

18.如权利要求17所述的分离的羟基化代谢物，其中羟基化代谢物选自IM9、IM4、IM6、IM46、IM69和IM49。

19.用于体外制造ISA247环氧化物代谢物的方法，所述方法包括如下步骤：用氧化剂氧化分离的ISA2471-氨基酸残基侧链的烯部分，从而形成ISA247的环氧化物代谢物。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述氧化步骤为Prilezhaev反应。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述氧化剂选自m-氯过苯甲酸(MCPBA)、过氧乙酸、三氟过氧乙酸、过苯甲酸、3，5-双氮过苯甲酸、过氧化氢、烷基过氧化物和氧。

22.由权利要求19所述的方法制备的分离的ISA247环氧化物代谢物。

23.如权利要求22所述的分离的环氧化物代谢物，其中所述代谢物选自IM1-e-1、IM1-e-2和IM1-e-3。

24.体外制备ISA247二醇代谢物的方法，包括步骤：

a)用氧化剂处理ISA247的1-氨基酸残基侧链，以形成ISA247的环氧化物代谢物；和

b)从分离的所述ISA247环氧化物代谢物形成分离的ISA247的二醇代谢物。

25.如权利要求24所述的方法，其中步骤a)为Prilezhaev反应。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述氧化剂选自m-氯过苯甲酸(MCPBA)、过氧乙酸、三氟过氧乙酸、过苯甲酸、3，5-双氮过苯甲酸、过氧化氢、烷基过氧化物和氧。

27.如权利要求24所述的方法，其中步骤b)包括水解ISA247的环氧化物代谢物。

28.如权利要求27所述的方法，其中步骤b)中的水解用酸或碱催化。

29.如权利要求27所述的方法，其中步骤b)包括：用高氯酸或Nafion-H催化的水解；在二甲基亚砜中的碱水解；或微粒体环氧化物水解酶催化的水解。

30.由权利要求24所述方法制备的分离的ISA247二醇代谢物。

31.如权利要求30所述的分离的二醇代谢物，其中分离的二醇代谢物选自IM1-d-1、IM1-d-2、IM1-d-3和IM1-d-4。

32.制备ISA247二醇代谢物的方法，包括步骤：将分离的ISA247与选自四氧化锇、碱性高锰酸钾、过氧化氢、单过琥珀酸和叔丁基过氧化氢的试剂反应，从而形成ISA247的二醇代谢物。

33.如权利要求32所述的方法，其中ISA247与催化数量的四氧化锇反应。

34.如权利要求32所述的方法，其中ISA247与选自过氧化氢/甲酸和单过琥珀酸的试剂反应。

35.制造ISA247二醇代谢物的方法，所述方法包括如下步骤：

a)用选自碘/苯甲酸银和乙酸银的试剂处理ISA247，形成ISA247二酯；和

b)卤化ISA247二酯，从而形成ISA247二醇代谢物。

36.由权利要求35所述方法制备的分离的ISA247二醇代谢物。

37.如权利要求36所述的分离的二醇代谢物，其中所述分离的二醇代谢物选自IM1-d-1和IM1-d-2。

38.制备ISA247二醇代谢物的方法，所述方法包括如下步骤：

a)将ISA247与选自四乙酸铅和乙酸亚铊的试剂反应，形成ISA247二醇二乙酸酯；和

b)水解ISA247二醇二乙酸酯从而形成ISA247二醇代谢物。

39.由权利要求38所述的方法制备的分离的ISA247二醇代谢物。

40.如权利要求39所述的分离的二醇代谢物，其中所述分离的二醇代谢物选自IM1-d-1和IM1-d-2。

41.药学组合物，其含有药学可接受的载体与权利要求1所述的分离的化合物。

42.药学组合物，其含有药学可接受的载体与权利要求2所述的分离的化合物。

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