HU217683B

HU217683B - Eljárás Cyclosporin A előállítására és az eljárásnál alkalmazott új mikrobafaj

Info

Publication number: HU217683B
Application number: HU9501951A
Authority: HU
Inventors: Matti Ankelo; Anja Kopio; Timo Korpela; Juhani Lundell
Original assignee: Santen Oy
Priority date: 1992-12-30
Filing date: 1993-12-29
Publication date: 2000-03-28
Also published as: ATE196655T1; WO1994016091A1; PL309613A1; HK1014035A1; JP3530531B2; FI92334C; PL177023B1; CA2152963C; US5409816A; KR960700346A; JPH08505059A; GR3035139T3; SG49072A1; RU2112807C1; PT677116E; EP0677116B1; FI92334B; DK0677116T3; CA2152963A1; HU9501951D0

Abstract

A találmány tárgya eljárás Cyclosporin A előállítására, továbbá egy újTolypocladium faj. A találmány szerint úgy járnak el, hogy újTolypocladium faj egy törzsét, amely a Tolypocladium sp. LeA3 CBS630.92, illetve ezzel azonos jellemzőket mutató törzs, megfelelőtáptalajban tenyésztik mindaddig, amíg megfelelő mennyiségűCyclosporin A-termelés történik, és kívánt esetben a terméketizolálják, valamint tisztítják. A találmány szerinti eljárássalelőállított Cyclosporin A a gyógyászatban alkalmazható. ŕ

Description

A találmány tárgya a Tolypocladium új mikrobiológiai faja, továbbá eljárás ciklosporinok, különösen Cyclosporin A előállítására a fenti fajok egy törzsének fermentációjával.

A ciklosporinok természetes, nagymértékben lipofil ciklusos-undekapeptidek, amelyek eltérő aminosavösszetételűek lehetnek. A szakirodalomban 25 eltérő ciklosporin (A-Z) forma ismert. Az A forma bizonyítottan klinikailag a legértékesebb (Rehácek and Dexiu, Process Biochem. 1991,26, 157-166).

Eredetileg a ciklosporint az 1970-es években izolálták Cylindrocarpon lucidum telepekből és Tolypocladium inflatum telepekből, amelyeket talajból az Amerikai Egyesült Államokban, illetve Norvégiában izoláltak. A Tolypocladium inflatum termelőtörzse (NRRL 8044, ATCC 34921) az első alkalommal Rifai által meghatározott Trichoderma polysporum (Link ex Pers). A fenti törzs, továbbá az ott leírt antibiotikus hatású termelt anyagok például a FI 54606 számú szabadalmi találhatók. A növekedési körülményeket, illetve a taxonómiai jellemzőket a törzsre vonatkozóan Dreyfuss és munkatársai, Eur. J. Appl. Microbiol., 1976, 3, 125 közleményben írták le.

A fent leírt Cylindrocarpon lucidum törzset (NRRL 5760) leírták a FI 52851 számú szabadalmi leírásban. Egyéb szakirodalomban leírt mikrobiológiai törzsek, amelyek ciklosporint termelnek, a Tolypocladium inflatum SF 136 törzs, amelyet a DD 298276 számú szabadalmi leírásban írtak le, és amely A ciklosporint termel, továbbá a Tolypocladium varium, amelyet a GB 2,227 489 számú szabadalmi bejelentésben írtak le, amely az A, B és C ciklosporinkeveréket termeli. A JP 826 3093 A2 számú szabadalmi bejelentésben két Fusarium törzset írtak le, amely ciklosporintermelő törzs.

Isaac és munkatársai (Antimicr. Agents Chemoter., 1990, 34, 121-127) közleményükben összefoglalóan leírták néhány ismert Tolypocladium törzs ciklosporintermelését.

Eredetileg a Cyclosporin A vegyületről kimutatták, hogy gomba ellenes antibiotikus hatású anyag. Az anyag kiváló immunoszupresszív hatását később fedezték fel (Borét és munkatársai, Immunology, 1977, 32, 1017.). A felfedezés alapján a ciklosporint jelenleg operáció után, transzplantációt követően alkalmazzák, és valójában az egyetlen olyan gyógyszerhatóanyag, amely erre a célra alkalmazható. Első alkalommal a felhasználást veseátültetéssel kapcsolatban közölték (Calne, Láncét, 1978, 2, 1323.), majd csontvelő-átültetés esetében is alkalmazták (Powles, Láncét, 1978, 2, 1327.). Ezen túlmenően a ciklosporinok az operációkon túlmenően alkalmazhatók különféle autoimmunbetegségek, mint például reumás megbetegedések és psoriasis kezelésében is.

A Cyclosporin A előállítási eljárása során a szakirodalomban leírt mikrobiológiai törzsek néhány esetben nehézséget jelentenek, mivel hosszú fermentációs idejűek és alacsony termelést eredményeznek, még akkor is, amennyiben igen magas termelés történik, a

Cyclosporin A relatív mennyisége alacsony marad. Azt is kimutatták, hogy a kis termelésű törzsek viszonylag magas arányú Cyclosporin A termelésére alkalmasak [De-xu és munkatársai, Fólia Microbiol., 1991, 36(6) 549-556],

Kísérleteink során egy olyan termelőtörzs kiválasztását tűztük ki célul, amely rövid fermentációs időn belül gazdaságos körülmények között maximális termelést biztosít.

A lehetséges termelőtörzsek vizsgálata során egy különösen gyors termelést hozó Tolypocladium törzset találtunk, amely jelentős mennyiségű Cyclosporin A-t termel, és emellett viszonylag kis mennyiségű egyéb ciklosporinformákat eredményez. Ez a törzs lehetővé teszi a Cyclosporin A megfelelő tisztítását. A törzset Oroszországból, Moszkva közeléből nyert talajból izoláltuk.

A felfedezett törzset Hollandiában dr. W. Gams vizsgálta (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baam, Holland), és kimutatta, hogy a mikroba egy új Tolypocladium egyed. A törzsnek a Tolypocladium sp. LeA3 nevet adtuk, és a Budapesti Egyezménynek megfelelően a törzset letétbe helyeztük 1992. december 7-én CBS 630.92 szám alatt a Centraalbureau voor Schimmelcultures, Holland központban.

A találmány tárgya tehát a Tolypocladium bizonyos új fajtái, amelyek gyorsan, igen nagy termeléssel Cyclosporin A termelésére képesek, és így a klinikailag fontos Cyclosporin A termelésére alkalmazható.

A Tolypocladium nemzetséget először 1971-ben W. Gams írta le (W. Gams, Persoonia, 1971, vol. 6,2, 185-191). A közleményben három faj Tolypocladium anyagot vizsgáltak, amelyek a T. inflatum, a T. geodes és a T. cylindrosporum. Általában a Tolypocladium fajok lassú növekedésűek, és fehér pelyhes kolóniákat, valamint igen nagy mennyiségű spórát termelnek.

A találmány szerinti Tolypocladium sp. LeA3 törzset összehasonlítottuk a fent említett fajokkal, és az összehasonlítás nyilvánvalóan mutatta, hogy azok sokkal kisebb spóraképző készséggel, duzzadt sejtvonalakkal és sötétebb kolóniákkal rendelkeznek, és barnás-szürkés pigmentet képező tendenciát mutatnak. Ebből eredően a Tolypocladium találmány szerinti törzset mint egy új Tolypocladium fajt azonosítottuk.

A találmány szerinti Tolypocladium sp. LeA3 törzset az alábbiak szerint írhatjuk le: hétnapos malátaextraktum/élesztő táptalajon tenyésztett lemez körülbelül 10 mm átmérőjű, és szürkés micéliummal fedett, amely néhány spórát tartalmaz. Szabálytalan conidia mutatkozik, továbbá a törzsre tipikusak a duzzadt sejtvonalak. A Tolypocladium inflantum törzzsel szemben a találmány szerinti törzs nem használ fel raffmózt, azonban képes galaktóz felhasználására. A Tolypocladium sp. LeA3 törzs növekedési jellemzőit a Tolypocladium inflatum törzzsel és a Cylindrocarpon lucidum törzzsel összehasonlítva az I. táblázatban adjuk meg.

HU 217 683 Β

I. táblázat

Mikrobatörzsek szénforrás-felhasználása

	Törzs
Szénforrás	25A	51	52
Glükóz	+	+	+
Glicerol	+	+	+
2KG	+	+	+
L-arabinóz	+	+	+
D-xilóz	+	+	+
Adonitol	+	+	-
Xilitol	+	+	-
Galaktóz		-
Inozitol	+	+	+
Szorbitol	+	+	+
MDG	-	-	+
NAG	+	+	+
Cellobióz		+	+
Laktóz	-	-	+
Maltóz	+	+	+
Szukróz	+	+	+
Trehalóz	+	+	+
MeLeZitóz	+	+	+
Raffinóz	-

Az alkalmazott rövidítések:

2K.G=2-keto-D-glükonát,

MDG=a-metil-D-glükozid,

N AG=N-acetil-D-glükóz-amin

A tenyésztés ideje 4 nap.

25A=Tolypocladium sp. LeA3 (CBS 630.92) =Tolypocladium inflatum Gams (ATCC 34921)

52=Cylindrocarpon lucidum Booth

A találmány szerinti ciklosporin-előállítási eljárásban különösen a Cyclosporin A előállításában az új Tolypocladium fajok törzsét alkalmazzuk, amely a Tolypocladium sp. LeA3 CBS 630.92 törzs, illetve az olyan törzsek, amelyek az LeA3 CBS 630.92 törzsnek megfelelő jellemzőjűek, és ezeket aerob körülmények között 20-30 °C hőmérsékleten táptalajban tenyésztjük, amely táptalaj szénforrást, nitrogénforrást és ásványisóforrást tartalmaz és kívánt esetben a nyert ciklosporinvegyületeket izoláljuk és tisztítjuk.

A találmány szerinti előnyös eljárásban Tolypocladium sp. LeA3 CBS 630.92 törzset alkalmazunk. A törzs alkalmazása a találmány céljára különösen előnyös, mivel néhány nap tenyésztést követően már igen nagy mennyiségű ciklosporint termel. Ezen túlmenően ez a törzs igen nagy mennyiségű Cyclosporin A termelésére alkalmas. A törzs ugyan egyéb ciklosporinformákat (B, C, D és G) is termel, azonban ezek mennyisége sokkal kisebb, mint a már a szakirodalomban ismert törzsek által termelt mennyiség (lásd Isaac és munkatársai fent idézett közleményét). A találmány szerinti törzs a C formát csak 10%-ban, a B formát 4%ban és a D és G formákat összesen 2%-ban termeli. Ezzel szemben ugyanez a törzs az A formát magas, akár 1,5 g/liter koncentrációban termeli.

A találmány szerinti fenti törzs ezen túlmenően abból a szempontból is előnyös, hogy igen gyorsan növekszik és igen gazdaságos táptalajban képes növekedésre. A törzs például alkalmas arra, hogy glükózt, szacharózt, arabinózt, xilózt és galaktózt (lásd I. táblázat) használjon szénforrásként, valamint számos szerves és szervetlen nitrogénforrást, mint például peptont, szójaalapot, halalapot, gyapotmagalapot és (NH₄)₂SO₄ komponenst használjon fel.

Ezen túlmenően a táptalaj továbbá rendszerint tartalmaz ásványi sókat, mint például magnézium-szulfátot vagy kálium-dihidrogén-foszfátot.

Előnyösen a viszonylag olcsó melasz is alkalmazható szénforrásként, továbbá szójapreparátum alkalmazható nitrogénforrásként.

A találmány szerinti előnyös eljárás során spóra- és micéliuminokulumot inokulálunk egy előtenyésztett táptalajba, amely inokulum úgy nyerhető, hogy vízben egy Tolypocladium sp. LeA3 tenyészetből vett spatulányi mintát oltunk. A tenyészetet 2-4 napon át előtenyésztjük, majd a tenyésztő táptalajt inokuláljuk az előtenyésztett táptalajjal. A tenyészetet ezt követően körülbelül 20-30 °C, előnyösen 25-30 °C, különösen előnyösen 25 °C hőmérsékleten fermentáljuk 5-7 napon át (azaz 120-168 órán át). A fermentálás közben a táptalaj pH-értékét 3-8, előnyösen 4-7 érték között tartjuk 1 m NaOH vagy 1 m HC1 adagolásával.

Az aerob körülményeket úgy biztosítjuk, hogy például 1 térf./perc (a levegő térfogata a tenyészet térfogatára vonatkoztatott percenként) adagolásával és a tenyészet keverésével (200-350 ford./perc érték mellett) biztosítjuk.

A fermentáció során a ciklosporin mennyiségét nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) analízis segítségével követjük, amely eljárást például Isaac és munkatársai fent idézett szakirodalomban leírtak. A fermentációt a maximális mennyiségű ciklosporin eléréséig végezzük. A találmány szerinti törzs Cyclosporin A-t termel 6 napon belül körülbelül 1500 mg/liter mennyiségben, és a Cyclosporin A viszonylagos aránya akár 84% is lehet.

A ciklosporin fonnák elegyét szokásos eljárással izolálhatjuk és tisztíthatjuk. A micéliumot a táptalajtól szűréssel vagy centrifugálással választhatjuk el. A ciklosporinvegyületeket a micéliumból kis szénatomszámú alkanol, például metanol, etanol vagy izopropanol, előnyösen metanol oldószer segítségével, extrakcióval választhatjuk el. Az extraktumot ezt követően bepároljuk, majd a kapott párlatot vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, mint például butil-acetáttal vagy etil-acetáttal, előnyösen etil-acetáttal extraháljuk. Az extraktumot bepároljuk, majd a kapott maradékot alkalmas szerves oldószerben, például toluolban oldjuk. A Cyclosporin A terméket ezután oszlopkromatográfia segítségével, például szilikagéloszlop alkalmazásával elválasztjuk. A kívánt Cyclosporin A terméket tartalmazó frakciókat vékonyréteg-kromatográfiás analízissel analizáljuk és

HU 217 683 Β egyesítjük. A megfelelő frakciókat bepároljuk, és a Cyclosporin A terméket alkalmas oldószerből vagy oldószerkeverékből, például éter-hexán oldószerelegyből átkristályosítjuk.

Végül a nyert terméket például olvadáspontja, illetve optikai forgatóképessége alapján azonosítjuk.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk.

1. példa

Tolypocladium sp. LeA3 (CBS 630.92) törzsből kenetét veszünk, és spóra-, valamint micéliuminokulumot készítünk úgy, hogy a kenetet 5 ml steril vízben szusz-

pendáljuk. A szuszpenzióból 1 ml-t alkamazunk 50 ml		eljárásnak megfelelően állítjuk elő. A szuszpenzió 1 ml
táptalaj (El) inokulálására 250 ml-es Erlenmeyer-	15	térfogatával 50 ml táptalajt (E2) inokulálunk 200 ml-es
lombikban.			Erlenmeyer-lombikban.
Az előtenyésztési táptalaj összetétele (El) az alábbi:		Az E2 előtenyésztési táptalaj összetétele az alábbi:
glükóz	30 g		maltóz	40 g
szója tápanyag	15 g		ammónium-szulfát	5 g
kálium-dihidrogén-foszfát	1 mg	20	gyapotmagkészítmény	10g
magnézium-szulfát	0,5 g		kálium-dihidrogén-foszfát	1 g
ammónium-szulfát	5 g		magnézium-szulfát	0,5 g
H₂O	1 literre kiegészítő		H₂O	1 literre kiegészítő
	mennyiség			mennyiség
Az elegyet 20 percen át 121	°C hőmérsékleten sterili-	25	Az elegyet 20 percen át 121	°C hőmérsékleten sterili-
záljuk.			záljuk.
A tenyészetet 25 °C hőmérsékleten rázóedényben		A tenyészetet 25 °C hőmérsékleten rázóedényben
(340 ford./perc) 2 napon át inkubáljuk, majd ezt köve-		(230 ford./perc) 2 napon át inkubáljuk, majd az előte-
tően az előtenyésztési táptalajt (50 ml) steril körülmé-		nyésztett oldatot (50 ml) steril körülmények között 5 li-
nyek között 5 liter termelő táptalajba (TI) visszük át	30	ter termelő táptalajba (T2) visszük 10 liter térfogatú
10 literes fermentoredénybe.			fermentorba.
A TI termelő táptalaj összetétele az alábbi:		A T2 termelő táptalaj összetétele az alábbi:
melasz	150 g		glükóz	10g
szója tápanyag	17g		maltóz	10g
ammónium-szulfát	5 g	35	szukróz	60 g
kálium-dihidrogén-foszfát	1 g		gyapotmagkészítmény	10 g
magnézium-szulfát	0,5 g		gyapotmagolaj	5g
H₂O	1 literre kiegészítő		ammónium-szulfát	5g
	mennyiség		kálium-dihidrogén-foszfát	1 g
Az elegyet 20 percen át 121	°C hőmérsékleten sterili-	40	magnézium-szulfát	0,5 g
záljuk.			H₂O	1 literre kiegészítő

A fermentálást 25 °C hőmérsékleten 1 térf./perc levegőztetés mellett 200 ford./perc keverés közben végezzük. A tenyészetben található ciklosporinmennyiséget a fermentálás során HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfía) (Isaac és munkatársai, lásd fent) segítségével követjük. A fermentációt 6 napon át (144 óra) folytatjuk, miközben a Cyclosporin A koncentrációja 1500 mg/liter értékre növekszik. Az egyéb formák koncentrációja az alábbi: C: 155 mg/liter, B: 62 mg/liter, D: 25 mg/liter és G: 29 mg/liter.

A ciklosporinformák keletkezett elegyét izoláljuk, majd az alábbiak szerint tisztítjuk: 4,5 liter fermentációs táptalajt leszűrünk, majd a tenyészetet kétszer 1 liter metanollal extraháljuk. Az extraktumokat egyesítjük, majd vákuumban bepároljuk. A maradékból a ciklosporinvegyületeket kétszer 300 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos oldatokat egyesítjük, majd nátrium-szulfáton megszárítjuk. Az oldatot ezt követően bepároljuk, majd a maradékot 100 ml toluolban oldjuk. Az oldatot cmx40 cm méretű oszlopra, amely 200 g szilikagélt tartalmaz (Merck, 0,063-0,2 mm) visszük. Az oszlopot 4:1 toluol/aceton eluenssel eluáljuk. A tiszta Cyclosporin A tartalmú frakciókat egyesítjük és tovább kezel5 jük (VRK analízis, Kieselgel 60 F 254, eluens: hexán/aceton 1:1, indikálás jódgőzzel). Az egyesített frakciókat bepároljuk, majd a Cyclosporin A terméket éter/hexán oldószerelegyből kristályosítjuk. A termelés 4,5 g. Olvadáspont Cyclosporin A esetében: 139-140 °C és optikai forgatóképesség -189° (0,5 MeOH).

2. példa

A spóra és micéliuminokulumot az 1. példa szerinti mennyiség

Az elegyet 20 percen át 121 °C hőmérsékleten sterilizáljuk.

A fermentálást 24 °C hőmérsékleten 1 térf./perc levegőztetéssel 200 ford./perc keverés közben végezzük. A fermentációt 5 napon (120 órán) át folytatjuk, miközben a Cyclosporin A koncentrációja 1410 mg/liter értékre növekszik. A tenyészetben a ciklosporin menynyiségét a tenyésztés során HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia) segítségével követjük (Isaac és munkatársai, lásd fent). Az egyéb ciklosporinformák koncentrációja az alábbi: C: 135 mg/liter, B: 50 mg/liter, G és D: 30 mg/liter.

A Cyclosporin A formát az 1. példa szerinti eljárásnak megfelelően tisztítjuk.

Összehasonlító példák

Összehasonlító példákat végeztünk abból a célból, hogy a Cyclosporin A-termelést összehasonlítsuk egyéb

HU 217 683 Β

Tolypocladium inflatum Gams (ATCC 34921) és Tolypocladium sp. LeA3 (CBS 630.92) találmány szerinti törzsek esetével.

A) példa

A tenyésztést Agathos, S. N. és munkatársai (J. Industrial Microbiology 1, 39-48, 1986) közleménye szerinti eljárással végeztük SSM-közegben 3% szorbóz (tömeg/térfogat) alkalmazásával. Az előtenyésztés ideje a referencia szerint 3 nap, a termelés tenyésztési ideje 10 nap.

A kapott eredmények az alábbiak:

Tolypocladium inflatum Gams

Cyclosporin A mennyiség	Száraztömeg g/litcr
-	11,75
-	11,30
-	9,25

A növekedés megfelelő volt, azonban a termelt Cyclosporin A mennyisége nehezen detektálható maradt.

Tolypocladium sp. LeA3

Cyclosporin A mennyiség	Száraztömeg g/liter	Specifikus termelés mg/g
212,5	8,35	25,45
214,0	7,80	27,44
249,5	6,80	36,69

A specifikus termelés átlagértéke 29,8 mg/g.

B) példa

Második tenyésztést végeztünk Margaritis A. és munkatársai [Biotech. Letters 11(11), 765-768, 1989] közleményében leírt eljárás szerint 3%-os fruktóz táptalajban. A referenciairodalomnak megfelelően a törzseket 3 + 2 napon át előtenyésztettük, és a termelési tenyésztést 8 napon át pH-szabályozás mellett végeztük.

Az alábbi eredményeket nyertük:

Tolypocladium inflatum Gams

Cyclosporin A mennyiség mg/litcr	Száraztömeg g/liter	Specifikus termelés mg/liter
107,0	11,80	9,07
116,5	11,60	10,04
81,5	11,15	7,31

A specifikus termelés sebességének átlagértéke 8,81 mg/g. Tolypocladium sp. LeA3

Cyclosporin A mennyiség mg/litcr	Száraztömeg g/litcr	Specifikus termelés mg/g
342	10,50	32,57
329	14,95	22,01
318	17,10	18,60

A specifikus termelés sebességének átlagértéke 24,39 mg/g.

C) példa

Harmadik tenyésztési vizsgálatot végeztünk az 1. példa szerinti eljárásnak megfelelően. Az előtenyésztés ideje 2 nap volt, és a termelési tenyésztés ideje 6 nap (144 óra).

Az alábbi eredményeket tapasztaltuk: Tolypocladium inflatum Gams

Cyclosporin A mennyiség mg/litcr	Száraztömeg g/liter	Specifikus termelés mg/g
74,5	59,80	1,25
88,0	63,30	1,39
69,0	61,05	1,13

A specifikus termelési sebesség átlagértéke 1,26 mg/g. Tolypocladium sp. LeA3

Cyclosporin A mennyiség mg/liter	Száraztömeg g/liter	Specifikus termelés mg/g
1393,0	78,00	17,86
1418,0	75,75	18,72
1336,5	75,15	17,78

A specifikus termelés sebességének átlagértéke 18,12 mg/g.

Valamennyi párhuzamos tenyésztés eredményét átlagértékként 3 párhuzamos mérés alapján adtuk meg. Az eredményekből kimutatható, hogy a találmány szerinti Tolypocladium sp. LeA3 (CBS 630.92) törzs mindhárom közegben a tesztvizsgálat szerint jobb Cyclosporin A termelést mutatott a CyA/liter táptalajkoncentrációban, mint az egyéb törzsek. Különösen a harmadik tenyésztés eredményeként mutatható ki, hogy az LeA3 találmány szerinti törzs igen nagy mennyiségű Cyclosporin A termelésére képes igen rövid időn belül. A Tolypocladium inflatum törzs ugyancsak jól növekszik a tesztvizsgálatnak alávetett táptalajokban, azonban a CyA-termelés sebessége és aránya alacsony marad. Meghatároztuk a mg/g száraztömeg biomasszaértékre vonatkoztatott specifikus termelésértékeket, összehasonlítás céljából. Ez az érték nem specifikus jelentőségű, amennyiben a ciklosporintermelő törzset értékelni kívánjuk. Az LeA3 törzs valamennyi vizsgált tenyésztés során nagyobb specifikus termelési arányt mutatott, mint a T. inflatum törzsek.

Az alkalmazott mikroorganizmusok

Az alábbi mikroorganizmusokat nyújtottuk be a

Budapesti Egyezmény alapján a Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Oosterstraat 1, P.O. Box 273, NL3740 AG Baam, The Netherlands letéti egyezményt laboratóriumnak.

Mikroorganizmus Letéti szám Letéti dátum Tolypocladium sp. CBS 630.92 1992. december 7.

LeA3

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás Cyclosporin A előállítására, azzal jellemezve, hogy egy új, Tolypocladium fajba tartozó törzset, amely a Tolypocladium sp. LeA3 CBS 630.92, vagy a LeA3 CBS 630.92 összes azonosító jellemzőjével rendelkező törzs, megfelelő táptalajban tenyésztjük, addig amíg fenti Cyclosporin A termelése történik, majd kívánt esetben a termelt Cyclosporin A anyagot izoláljuk és tisztítjuk.

(Elsőbbsége: 1992. 12. 30.)

2, Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést aerob körülmények között, 20-30 °C hőmérsékleten hajtjuk végre.

(Elsőbbsége: 1992. 12. 30.)

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Tolypocladium sp.

LeA3 CBS 630.92 törzset alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1992. 12.30.)

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,

10 hogy olyan táptalajt alkalmazunk, amely szacharózt és gyapotmagkészítményt tartalmaz.

(Elsőbbsége: 1992. 12.30.)

5 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan táptalajt alkalmazunk, amely melaszt és szójakészítményt tartalmaz.

(Elsőbbsége: 1992. 12.30.)

6. A Tolypocladium sp. LeA3 CBS 630.92 törzs egy biológiailag tiszta tenyészete.