CS277472B6

CS277472B6 - Způsob výroby derivátů cyklosporinu A

Info

Publication number: CS277472B6
Application number: CS896499A
Authority: CS
Inventors: Alexandr Rndr Csc Jegorov; Vladimir Ing Csc Matha; Vladimir Rndr Drsc Landa; Milan Ing Csc Polievka; Josef Ing Stuchlik; Zdenek Rndr Malinka; Pavel Ing Harazim
Original assignee: Alexandr Rndr Csc Jegorov; Vladimir Ing Csc Matha; Vladimir Rndr Drsc Landa; Polievka Milan; Stuchlik Josef; Malinka Zdenek; Harazim Pavel
Priority date: 1989-11-16
Filing date: 1989-11-16
Publication date: 1993-03-17
Also published as: CS649989A3

Abstract

Řeší se způsob výroby látek vhodných pro cílené směrování imunosupresních léčiv. Způsob výroby derivátů cyklosporinu A spočívá v tom, že se na roztok cyklosporinu A v organickém rozpouštědle s výhodou toluenu, za přídavku katalyzátoru na bázi sloučenin kobaltu nebo rhodia působí směsí oxidu uhelnatého a vodíku o objemovém poměru s výhodou 1:1, za celkového tlaku 0.1 až 30 MPa a teploty 25 až 200 °C po dobu 10 min až 4 hodin.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy derivátů cyklosporinu A s účinkem imunosupresním, v jejichž struktuře je na prvou aminokyselinu cyklického skeletu cyklosporinu zavedena funkční skupina aldehydická.

Cyklosporin A je cyklický undekapeptid, jehož struktura je popsána vzorcem:

- MeBmt-a-Abu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-i , 1 23456 7 89 10 11 kde MeBmt je HOOC-CH(NHCH₃)-CH(OH)-CH(CH₃)-CH₂-CH=CH-CH₃, 1 2 3 4 5 6 7 8 tj. (2S,3R,4R,6E)-3-hydroxy-4-methyl-2-methylamino-6-oktenová kyselina.

Vedle cyklosporinu A byla isolována řada B až Z cyklosporinů, které jsou odvozeny od cyklosporinu A substitucí jednotlivých aminokyselin v cyklu (Helvetica Chimica Acta 70./ 13, 1987). Tyto cyklosporiny jsou přirozeným metabolitem některých druhů deuteromycet a jsou průmyslově produkovány kultivací vysokoprodukčních kmenů, například Tolypocladium iňflatum NRRL 8044 (Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 14, 237, 1982), Tolypocladium terricola CCEB 2-201 M (čs. autorské osvědčení č. 2624 a 2625) nebo Cylindrocarpon lucidum NRRL 5760 (U.S, Patent č. 4117118). Alternativním, avšak náročnějším, způsobem přípravy je totální syntéta, pomocí níž byly připraveny i některé další deriváty cyklosporinů (Evropský patent č. 34567 a 194972).

Cyklosporin A je v humánní medicíně používán jako imunosupresivum při transplantacích, mimoto cyklosporiny vykazují účinky antiarythmické, antiparasitické a napomáhají při léčbě autoimunitních onemocnění. Vedle léčebného působení vykazují cyklosporiny i nepříznivé vedlejší účinky, zejména nefrotoxicitu (například Kidney Dis. 1986, 383 , 423), které by bylo možno odstranit cíleným směrováním léčiv sestávajících ze selektivního makromolekulárního nosiče a navázaného cyklosporinu. Nevýhodou cyklosporinů A až Z však je, že nemají aktivní skupinu, která by mohla být použita k takovéto vazbě na nosič, vyjma -OH skupiny, jejíž chemická vazba však vede ke ztrátě aktivity derivátů.

Odstranění této nevýhody je dosahováno způsobem podle vynálezu, jehož podstatou je, že se na roztok cyklosporinu A v organickém rozpouštědle a za přídavku katalyzátoru na bázi sloučenin kobaltu nebo rhodia . působí směsí oxidu uhelnatého a vodíku o objemovém poměru s výhodou 1:1, za celkového tlaku 0,1 až 30 MPa a teploty 25 až 200 °C po dobu 10 min až 4 h, přičemž vznikají deriváty cyklosporinu A v jejichž struktuře je zavedena aldehydická skupina.

Výhoda uvedeného způsobu je zejména, že pro přípravu derivátů je využíváno semisyntetického postupu vycházejícího z přírodního cyklosporinu A, jenž je uvedeným způsobem modifikován na deriváty nesoucí reaktivní aldehydickou skupinu.

Příprava derivátů se provádí hydroformylací cyklosporinu A za katalýzy sloučeninami kovů VIII. vedlejší skupiny. Uvedenou reakcí je z celého skeletu cyklosporinu A modifikována pouze dvojná vazba prvé aminokyseliny cyklického skeletu cyklosporinu A, přičemž vznikají deriváty obecného vzorce:

— Q-a-Abu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal i,

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 kde Q znamená bud

HOOC-CH(NHCH₃)-CH(OH)-CH(CH₃)-CH₂-CH₂-CH(CH₃)-CHO, 1 2 3 4 5 6 7 8 tj. (2S,3R,4R)-3-hydroxy-4,7-dimethyl-2-methylamino-8-oxo-oktanová kyselina (dále jen Q^), nebo

HOOC-CH(NHCHo)-CH(OH)-CH(CH₃)-CH?-CH₂-CH₂-CH₉-CHO, tj. (2S,3R,4R)-3-hydroxy-4-methyl-2-methylamino-9-oxo-nonanová kyselina (dále jen Q₂).

Uvedené deriváty mají sumární vzorec ^C63H₁₁₃O₁₃.

Hydroformylace se provádí rozpuštěním cyklosporinu A v organickém rozpouštědle, například v benzenu, toluenu, xylenu, tetrahydrofuranu, acetonu, propanolu, methanolu, s výhodou v toluenu, přidáním katalyzátoru na bázi kovů VIII. vedlejší skupiny, s výhodou na bázi sloučenin rhodia nebo kobaltu, a působením směsi oxidu uhelnatého a vodíku o objemovém poměru s výhodou 1:1, za celkového tlaku 0,1 až 30 MPa a teploty 25 až 200 °C po dobu obvykle 10 min až 4 h. Způsobem podle vynálezu je dosahováno konverze 70 až 90 % selektivity 60 až 80 %.

Při použití sloučenin rhodia jako katalyzátoru, jimiž mohou být například RhCl₃ . 3 H₂0, Rh₂(SO₄)₃, RhCl(CO)(PPh₃)₂, RhH(CO)(PPh₃)₃, RhCl₃ zmobilizovaný na silikagelu nebo s výhodou komplexy rhodia neobsahující fosfiny, například Rh(CO)₂Cl/2 nebo Rh₄(CO)₁₂, je výchozí 3-hydroxy-4-methyl-2-methylamino-6-oktenová kyselina v cyklosporinu A modifikována v převážné míře v poloze 7, přičemž vzniká derivát cyklosporinu A v němž je namísto této kyseliny Q-^.

Při použití sloučenin kobaltu jako katalyzátoru, jimiž mohou být například chlorid kobaltnatý, síran kobaltnatý, octan kobaltnatý, naftenát kobaltnatý nebo s výhodou Co₂(CO)₈, podléhá výchozí 3-hydroxy-4-methyl-2-methylamino-6-oktenová kyselina v cyklosporinu . A nejprve izomeraci in situ na 3-hydroxy-4-methyl-2-methylamino-7-oktenovou kyselinu, která je hydroformylována v převážné míře v poloze 8, přičemž vzniká derivát cyklosporinu A, v němž je namísto výchozí kyseliny Q₂.

Po ukončení reakce se katalyzátor odděluje od produktů reakce a nezreagovaného cyklosporinu A buď mechanicky, tj. filtrací nerozpustného katalyzátoru ve formě například Rhg(CO)₁₆, nebo heterogenního katalyzátoru, extrakcí do vodné fáze nebo chromatograf icky. Extrakce katalyzátoru do vodné fáze se provádí například zředěnými kyselinami, které převádějí kovy do vodné fáze ve formě anorganických solí nebo se extrakce provádí ligandy, které převádějí kovy do vodné fáze ve formě koordinačních sloučenin, jimiž mohou být například ve vodě rozpustné fosfiny, jejichž použití je popsáno v čs. autorském osvědčení č. 246734. Karbonyly kobaltu se s výhodou oddělují chromatografií na silikagelu, kde jsou eluovány v čisté formě jako první frakce například chloroformem, zatímco deriváty cyklosporinů jsou eluovány jako další frakce například směsí chloroform/methanol 95:5 % obj.

Po oddělení katalyzátoru se organická fáze obsahující cyklosporiny zahustí odpařením a deriváty cyklosporinu A se od nezreagovaného cyklosporinu A a vedlejších produktů oddělují chromatograficky. Chromatografická separace se provádí s výhodou na reversní fázi, protože žádané deriváty jsou na reversní fázi eluovány dříve než nezreagovaný cyklosporin A a vedlejší produkty reakce.

Separace na reversní fázi se s výhodou provádí na silikagelu modifikovaném oktadecyltrichlorsilanem (C-18 fáze), přičemž se používá obvykle směs methanol/voda 78:22 % obj. jako eluční činidlo. Z chromatografických frakcí se odpaří methanol, přičemž se deriváty cyklosporinu A vylučují jako bílé krystalické sraženiny nerozpustné ve vodě. Sraženina se mechanicky oddělí od vodné fáze například filtrací nebo centrifugací a čisté deriváty se získávají vysušením sraženiny na vzduchu nebo s pomocí vakua.

Na připojeném chromatografu je znázorněn konkrétní příklad chromatografické separace produktů hydroformylace cyklosporinu A, katalyzované komplexy rhodia. Tento příklad ovšem nevyčerpává všechny možnosti provedení chromatografické separace ani nijak neomezuje způsob podle vynálezu ve smyslu dosažené specifity a výtěžku derivátů cyklosporinu A. Chromatogram představuje chromatografickou analýzu katalytické směsi po ukončení hydroformylace, jenž je používána ke kontrole výtěžku uvedené reakce. Chromatografická analýza se provádí na koloně 250 x 4 mm plněné silikagelem C-18, 7 μm, Separon SGX C-18 (výrobce Tessek Československo), s použitím eluční směsi 78:22 % obj. methanol/voda při průtoku 1 ml/min a při teplotě 50 °C, detekce 214 nm. Z kolony jsou postupně eluovány benzen 1, katalyzátor 2, derivát cyklosporinu A, kde prvá aminokyselina je Q-]_ 3, vedlejší produkty reakce 4 a 6. a nezreagovaný cyklosporin A 5.

Vynález je dále objasněn na příkladech provedení, jimiž ovšem není jeho rozsah omezen ani vyčerpán.

Příklad 1

Do 50 ml nerezového autoklávu se skleněnou vložnou nádobou bylo naváženo 240 mg cyklosporinu A, 12,3 mg Rh₄(CO)₁₂ a rozpuštěno ve 2 ml benzenu. Autokláv byl natlakován na 5,5 MPa směsí oxidu uhelnatého a vodíku o objemovém poměru 1:1 a vložen do ole jové lázně o teplotě 60 °C. Hydroformylace byla prováděna 60 min za míchání magnetickým míchadlem. Autokláv byl ochlazen a odtlakován a výsledná směs byla odpařena dosucha. Chromatografie byla prováděna na koloně 250 x 25 mm naplněné silikagelem C-18, 7 μm, eluce byla prováděna směsí 78:22 % ob j . methanol/voda. Derivát cyklosporinu A výše uvedeného vzorce, kde prvá aminokyselina je Q_lř byl jímán jako první cyklosporinová frakce, zatímco nezreagovaný cyklosporin A byl spolu s vedlejšími produkty eluován v dalších frakcích. Odpařením methanolu se uvedený derivát vyloučil v podobě bílé sraženiny, která byla odfiltrována a vysušena ve vakuu. Kapalinovou chromatografií byla analyticky stanovena konverze 70 %, selektivita 60 % a preparativní chromatografií bylo získáno 82 mg čistého derivátu, tj. 78 % z množství nalezeného analyticky. Identifikace derivátu byla provedena spektry nukleární magnetické rezonance, v nichž je přítomnost aldehydické skupiny jednoznačně charakterizována signálem dvou doubletů při 9,6 ppm, náležejících R a S konfiguracím aldehydické skupiny na uhlíku C7 aminokyseliny Q-j..

Příklad 2

Do 750 ml nerezového autoklávu s teflonovou vložnou nádobou bylo naváženo 12 g cyklosporinu A, 542 mg Rh(acac)(co)₂, acacH = acetylaceton, a rozpuštěno ve 150 ml toluenu. Autokláv byl natlakován na* 7 MPa směsí oxidu uhelnatého a vodíku o objemovém poměru 1:1 a vložen do vyhřívaného pouzdra o teplotě 50 °C. Hydroformylace byla prováděna 3 hodiny za míchání magnetickým míchadlem. Autokláv byl ochlazen a odtlakován a filtrací bylo odděleno 106 mg Rh₆(CO)₁₆, který se vyloučil po ochlazení o odtlakování autoklávu. Za účelem separace katalyzátoru bylo k filtrátu přidáno 1,8 g PhP(CH₂COOH)₂ ve 20 ml ethanolu a vzniklá směs byla zahřátá na 60 ’C, 15 minut. Rhodium, které bylo tímto způsobem převedeno do formy komplexů s fenylfosfindioctovou kyselinou bylo extrahováno 150 ml roztoku uhličitanu sodného o koncentraci 0,1 molu na litr vodné fáze. Organická fáze byla oddělena a zahuštěna odpařením na vakuové odparce a dále byla po částech přibližně 200 mg chromatografována na koloně 250 x 25 mm naplněné silikagelem C-18, 7 μm, eluce byla prováděna směsí 78:22 % obj. methanol/ voda. Derivát cyklosporinu A výše uvedeného vzorce, kde prvá aminokyselina je Q_lz byl jímán jako první cyklosporinová frakce, zatímco nezreagovaný cyklosporin A byl spolu s vedlejšími produkty eluován v dalších frakcích. Odpařením methanolu se uvedený derivát vyloučil v podobě bílé sraženiny, která byla odfiltrována a vysušena ve vakuu. Kapalinovou chromatografií byla analyticky stanovena konverze 88 %, selektivita 63 % a preparativní chromatografií bylo získáno 4,3 g čistého derivátu, tj. 64 % z množství nalezeného analyticky. Identifikace produktu byla provedena jako v Příkladu 1.

Příklad 3

Do 100 ml nerezového autoklávu byl navážen 1 g cyklosporinu A, 0,1 g Co₂(CO)₈ a 2 g p-xylenu. Autokláv byl natlakován na 5 MPa směsí oxidu uhelnatého a vodíku 1:1 objemově a vložen do ole5

B6 jové lázně o teplotě 10 0 .L směsi C0/H₂ zvýšen na 15 hodiny bez míchání. Autokl roztok byl chromatografc katalyzátoru. Chromatogra f .i. plněné silikagelem o zrně ... jako první frakce chlorofc / 95:5 % obj. chloroform/met prováděna rechromatografií .. biižně 200 mg na koloně 25 7 μm, eluce byla prováděna vát cyklosporinu A výše uvu. je Q₂/ byl jímán jako prvn zreagovaný cyklosporin A by), v dalších frakcích. Odpařenu čil v podobě bílé sraženiny ve vakuu. Kapalinovou chrc konverze 82 %, selektivita lo získáno 420 mg čistého cA ho analyticky. Identifikace nukleární magnetické rezonar aldehydické skupiny jednozn 9,74 ppm, triplet 1,8 Hz (C~

Vynález je určen zej mé vhodných pro cílené směre k přípravě derivátů, které například pro imunizace a z?í A nebo k. izolaci cyklosporin semperování autoklávu byl tlak iroformylace byla prováděna 4 :1a zen a odtlakován a výsledný silikagelu za účelem oddělení cováděna na koloně 300 x 30 mm

100 μm, CO₂(CO)₈ byl eluován klosporiny byly eluovány směsí izolace čistého derivátu byla cínové frakce po částech přinm naplněné silikagelem C-18, 5:22 obj. methanol/voda. Deri•zorce, kde prvá aminokyselina sporinová frakce, zatímco nes vedlejšími produkty eluován .olu se uvedený derivát vyloubyla odfiltrována a vysušena :ií byla analyticky stanovena .eparativní chromatografií bytj. 64 % z množství nalezenéátu byla provedena spektry ichž je přítomnost terminální 'rakterizována signálem 5(H)

Tavě derivátů cyklosporinů mpresních léčiv a dále /ázání na nosič upotřebit jtilátek proti cyklosporinu .i proteinů.

Claims

1. Způsob výroby derivátů c se na roztok cyklosporin dou toluenu, za přídavku . tu nebo rhodia působí s.

movém poměru s výhodou a teploty 25 až 200 °C

2. Způsob výroby derivátů cí se tím, že jako k tetrarhodia, oktakarb dikarbonylrhodný.

.nu A, vyznačující se tím, že ganickém rozpouštědle s výhotoru na bázi sloučenin kobalu uhelnatého a vodíku o objeelkového tlaku 0,1 až 30 MPa min až 4 h.

nu A podle bodu 1, vyznačujíse použije dodekakarbonylitu nebo acetylacetonátCS 277472 B6

Kon.ec, dokumentu