JPH02124100A - プロリルイソメラーゼの使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ペプチジルプロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソ
メラーゼ〈プロリルイソメラーゼと略す）の活性に変化
を与えるｆｍｆｆの測定方法及びそのためのキットに関
する。

〔従来の技術〕

１０リルイソメラーゼはペプチド中のプロリンのイミド
結合のｃｉｓ　−ｔｒａｎｓ配位の異性化を触媒し、細
胞中ではサイドシルに存在することから、蛋白質の合成
途中か合成終了後の早い時期にプロリンの異性化を起こ
し、蛋白質の高次構造の形成に関与するものと考えられ
る（Ｆｉｓｈｅｒ及びＢａｎｄ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　８２８．３
９−４２（１９８５）　）が、その８４３ｍの解明は行
われていない。

免疫抑制物質であるシクロスポリンＡはシクロフィリン
と称する蛋白質と結合することが知られておりＣＨａｎ
ｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ、　２２６
．５４４５４７　（１９８４））　、またシクロスポリ
ンＡの各種誘導体のシクロフィリンに対する結合親和性
とリンパ球混合培養試験により評価される免疫抑制効果
とは正に相関することが知られているＣｔ（ａｎｄｓｈ
ｕｍａｃｈｅｒ等５ｃｉｅｎｃｅ　２２６．５４４−５
４７　（１９８４＞）　、シクロフィリンの構造は解明
されている（Ｈａｒｄｉｎｇ等、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　
１３ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２６
１．８５４７−８５５５（１９８６）　、：ｌが、その
生理学的及び生化学的機能については前記のシクロスポ
リンＡとの結合以外はとんど知られていない。

〔発明の概要〕

本発明者等は、その酵素活性は解明されつつあるが構造
については解明が進んでいないプロリルイソメラーゼを
ブタの腎組織から抽出・精製し、その構造を解明した結
果、このプロリルイソメラーゼは前記シクロフィリンと
同一の物質であることを明らかにした。

さらに、このプロリルイソメラーゼ（すなわちシクロフ
ィリン）にシクロスポリンＡを結合させると、シクロス
ポリンＡの濃度に依存して該酵素のプロリン−ｃｉｓ−
ｔｒａｎｓ異性化能が阻害されるという全く新しい知見
を得た。

本発明者等により見出だされた上記の知見と、ジクロス
ポリンの種々の誘導体とシクロフィリ〉との結合親１口
１性と該誘導体の免疫抑制活性とか正の相関を示すとい
う前記の知見とを合わせ考えれば、シクロスポリンＡの
免疫抑制活性用は、シクロスポリンＡによるプロリルイ
ソメラーゼの活性阻害を介して発揮されると合理的に推
定することができる。

これらの知見３基礎として、本発明は、プロリルイソメ
ラーゼ活性に変化を与える物質を含有する試料とプロリ
ルイソメラーゼと分接触せしめ、該接触により生ずるプ
ロリルイソメラーゼ活性の変化の程度を測定すること含
特徴とするプロリルイソメラーゼ活性に変化を与える物
質の定量方法並びにプロリルイソメラーゼ活性に変化を
与えると予想される物質とプロリルイソメラーゼとを接
触せしめ、該接触により生ずるプロリルイソメラーゼ活
性の変化の有無又は変化の程度を測定することを特徴と
する、該物質のプロリルイソメラーゼ活性に変化を与え
る能力の有無又はその能力の程度を測定する方法を提供
するものである。

〔具体的な記載〕

本発明において使用する酵素プロリルイソメラーゼと結
合し、その酵素活性を阻害するシクロスポリンＡは種々
の生理作用を発揮する。すなわち、シクロスポリンＡは
免疫抑制剤として、ＨＬＡが不適合の同種異系移植片の
拒絶を防ぐ目的で’ＨＡ’；；’ｒ移植時に使用され、
又対移植片病の治療に使用されている。シクロスポリン
Ａはまた抗原生動物活性も持ち、さらにブドウ膜炎、タ
イプＩ糖尿病や脳を髄炎のような自己免疫疾患の治療に
おいても療法的な価値を持つものと期待されている（Ｓ
ｈｅｖａｃｈ、Ｅ、Ｍ、、Δｎｍ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎ
ｏ１．３．３９７−４２３（１９８５）　）。シクロス
ポリンＡは免疫系においてヘルパー下リンパ球の活性化
の初期の反応を阻止したり、エフェクターＴリンパ球や
Ｂ細胞のリンホカイン刺激による分化や増殖を阻害しな
りする（Ｐａｌａｃｉｓｓ、Ｒ，Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、
１２８．３３７−３４２（１９８２）；１３ｕｎｊｅｓ
等Ｅｕｒ、Ｊ、ｌｎｍｕｎｏ１．１１．６５７−６６１
（１９８１）；１１ｅｓｓ及びＴｕｔｓｃｂｋａ　Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２４．２６０１−２６０８（１９８
０）；　　ＭｉＢａｒｉ笠Ｎａｔｕｒｅ　　３１２．　
６４１−６４３（１９８４）：］。

シクロスポリンＡはインターロイキン−１（ＩＬ−１）
に対するヘルパー−インデューサーＴリンパ球の応答性
を低下させるＣ　Ｄｕｎ　ｊｅｓ等、Ｅｕｒ　。

ｌｎｍｕｎｏｌ、ＩＬ　６５７−６６１（１９８１））
。シクロスポリンＡＩｉまた同種抗原やレクチンによっ
て刺激されたＴ−リンパ球によるインターロイキン−２
（ＩＬ２）の産生を抑えたり、前駆体細胞溶解性Ｔ−リ
ンパ球によるＩ＞２レセプターの発現を妨げたりする〔
Δｎｄｒｕｓ及びＬａｆｆｅｒｔｙ　５ｃａｎｄ、Ｊ、
Ｉｍ＋ｎｕｎｏｌ。

５、４４９−４５８（１９８１）；　Ｐａ１ａｃｉｏｕ
ｓ及びＨｏｆｔｅｒ　Ｎａｔｕｒｅ翻立、　７９２−７
９４　（１９８１））。加えて、シクロスポリンＡはリ
ンパ球によるγ−インターフェロンの産生を阻害したり
、マクロファージの挙動に影響を与えるリンフ才力イン
の産生を阻害したりすることも報告されている（：Ｋａ
ｌｍａｎ及びＫｌｉｍｐｅｌ　Ｃｅ１ｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、７８．　１２２−１２９（１９８３）
；Ｊｂｏｎｓｏｎ等１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４８、２９１
（１９８３））　　。さらに、シクロスポリンＡはＢ細
胞増殖因子や丁Ｌ−３の産生または分泌も阻害する。一
方、レニンの放出やプロラクチンの分泌を刺激するなど
の報告もある［　Ｂａｘｔｅｒ等Ｒｅｓ　。

Ｃｏｍｍｕｎ、Ｃｈｅｍ、Ｐａｔｌ＋ｏ１．ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ、４３．４１７−４２３（１９８４）；　Ｃａ
ｒｄｏｎ等Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｌ＋ｙｓ、Ｒｅｓ
、Ｃｍｍｕｎ。

１２０、６１４−６１８（１９８４）、：ｌ。

これらの各種の作用は、前記のごとくプロリルイソメラ
ーゼの酵素活性の阻害を介して発揮されるものと推定さ
れる。そうであれば、シクロスポリンＡのみならず、前
記の酵素活性を阻害する物質であれば前記の種々の生物
学的作用を発揮するものと期待される。従って、プロリ
ルイソメラーゼ活性を阻害する活性を探索すれば前記の
ごとく有用な生物学的作用を発揮する物質をスクリーニ
ングすることがてきる。従って本発明は、免疫抑制物質
のスクリーニング；ブドウ膜炎、タイプＩ糖尿病や脳を
髄炎のような自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング；
・インターロイキン−２、γインターフェロン、インタ
ーロイキン−３、又はＢ細胞増殖因子の産生もしくは分
泌を阻害する物コのスクリーニング；レニンの放出やプ
ロラクチンの分泌を刺激するｆｍ　質のスクリーニング
；住血吸虫症の治療薬のスクリーニング等、−ｍにプロ
リルイソメラーゼ活性に変化を与える物質の同定及びス
クリーニング、のために用いることができる。

強力な免疫抑制作用を発揮するシクロスポリンＡの直接
の標的分子がシクロフィリンであり、このジクロフィリ
ンが実はタンパク質分子中のプロリンのｃｉｓ−ｔｒａ
ｎｓ異性化を触媒するプロリルイソメラーゼと同一の物
質であり、なおかつシクロスポリンＡの結合によりプロ
リルイソメラーゼの酵素活性がｍ著に阻害されるという
事実は、プロリルイソメラーゼそのものが免疫系細胞内
で行われるシグナル伝達において重要な役割を果たして
いることを示している。また、シクロスポリンＡ結合を
指標としたシクロフィリン活性は下等真核生物である酵
母菌以上の生物の細胞中に見いだされており、さらに少
なくとも高等動物では脳、胸腺、ひ臓、肝臓などの様々
な器官で検出されており、またプロリルイソメラーゼも
同様進ｆヒ起源上異なる生物種間にあまねく存在し、種
々の組織中に普遍的にその活性が見いだされている。こ
れらの事実は、プロリルイソメラーゼの細胞内でのΩき
には大きく分けて２種顕あり、一つはＶ遍的かつ基本的
な生化学的反応を触媒する作用と、もう一方は特殊な細
胞系における細胞分化や増殖に重要な反応に対する特異
的作用であることを示している。

これらのプロリルイソメラーゼのいずれの作用が関係す
るとしても、それらの生化学的な反応はプロリルイソメ
ラーゼの活性を調節することにより効率よく制御するこ
とができるであろう。すなわち、プロリルイソメラーゼ
の活性を調節することにより制御されている反応のすべ
てはプロリルイソメラーゼの活性を人為的に調節するこ
とにより制御することができるものと考えられる。従っ
て、これらの反応を制御するために効果的にプロリルイ
ソメラーゼ活性を調節する物質をスクリーニングするこ
とにより、前記のごとき種々の有用物質をスクリーニン
グすることが可能となるのである。

本発明によればさらに、プロリルイソメラーゼの阻害を
介して前記のいずれかの生物学的活性を発揮することが
知られている物質について、プロリルイソメラーゼの阻
害の程度を測定することにより、それらの物質の効能又
は活性を測定することとができる。

本発明によればさらに、プロリルイソメラーゼの阻害を
介してその活性が発揮されることが知られている鞠貰に
ついて、それをプロリルイソメラーゼと接角虫せしめ、
そＪしによるプロリルイソメラーゼの活性の変化を測定
することにより、その物質を定量することができる。

プロリルイソメラーゼ活性の測定は次の原理により行う
ことができる。

プロテアーゼであるキモトリプシンはペプチド鎖または
タンパク質中の芳香族アミノ酸のカルボキシル基側を切
断するが、その芳香族アミノ酸のアミン基側にプロリン
残基が位置する場合そのプロリン残基とさらにそのアミ
ン基側に位置するアミノ酸残基の間をつなぐペプチド結
合がトランス型の配位をとっている場合にだけ相手のペ
プチド鎖またはタンパク質に作用してこれを分解すると
いう高い立体配位特異性を有する。プロリルイソメラー
ゼの活性測定はキモトリプシンのこの付置を利用して行
うことができる。

キモトリプシンに対する合成基質Ｎ−５ｕｃｃｉｎｙ八
１ａ−＾１ａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−４−ｍｅｔｈｙｌ−ｃ
ｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅを用いた場合、ΔＩａ−
Ｐｒｏ結合の約１２％はシス型で存在するため、キモト
リプシンが大量に存在する条件下では、まずトランス型
の＾１ａＰｒｏ結合を持つものだけが即座に分解を受け
、その後の分解はシス型のＡｌａ−Ｐｒｏ結合が平衡反
応によってトランス型に移行するにつれて起こることに
なる。この合成基質のキモトリプシンによる分解によっ
て生じる４−ｍｅｔｈｙｌ−ｃｏｕｍａｒｙＩ−７−ａ
ｍｉｄｅ（ＭＣＡ）の蛍光または可視光吸収を測定する
ことによって上記の反応をモニターすることかできる。

最初に存在したトランス型の分解は、非常に早い速度で
起こり、キモＩ・リブシンを加えた反応開始の時点から
数秒間で終了するが、シス型からトランス型への変換に
伴う反応の速度は遅く終了まで約２分間を要する。

上記の反応系にプロリルイソメラーゼを加えると、へ１
ａ−Ｐｒｏ結合のシス型からトランス型への移行に伴う
遅い反応が触媒されその反応速度が加速されることにな
り、この速度の変化量を計算すれば酵素活性の定量化が
可能となる。またさらにこの反応系にある物質を加えて
プロリンの異性化反応に与える影響を調べることにより
プロリルイソメラーゼに作用してその酵素活性を変化さ
せる物Ｈの同定またはスクリーニングが可能となる。

火パパ上ユ　プロリルイソメラーゼ　　の攪拌子を入れ
た１ｃｍ四方、高さ４．５ｃｍの石英セルに２．０ｍｌ
の５ｍＭ　　２−メルカブトエクノール分含む０．０３
５Ｍ　　）Ｉｅｐｅｓ　緩衝Ｈ（ｐ）１７．８＞　’ｉ
：加え、分光光度計試料室内の温度調節可能なセルホー
ルダーに設置した。セルホールダーの温度を２５°Ｃに
設定し、１０分間放置することによりセル内の緩衝液の
温度を２５℃に到達させこの温度を一定に保った。ここ
で使用した分光光度計は、試料室内の温度コントローラ
ー５ＰＲ−７を装備した日立製Ｕ−３２１０である。次
に、０．２７μｇ／μＩのプロリルイソメラーゼ分加え
、必要に応じてさらに３０秒後にプロリルイソメラーゼ
活性の阻害効果を調べるための物質を含む１〜１００μ
Ｉの溶液（エタノールまたは上記ｌ１ｅｐｅｓ　ｔＬ街
液に溶解させたもの）を混ぜ、１分間攪拌した。そして
、５０μｍのＮ５ｕｃｃｉｎｙｌ−へ１ａ−八Ｉａ−Ｐ
ｒｏ−１”ｈｅ−ＭＣＡ　　（５，４Ｂを上記１１ｅｐ
ｅｓ　）［１１５ｍ１に溶解させたもの）を加え、正確
に３０秒後に２０μｍのキモトリプシン（１００ｍｇ３
５ｍｌの上記ＩＩ　ｅ　ｐ　ｅ　ｓ緩衝液に溶解させた
もの）を加え反応を開始させた。反応は、この場合３６
０ｎｍの吸光度によってモニターした。

Ｘ立匠Ｉエ　シクロスポリンＡによるプロＩルイ活性阻
害効果を調べるための物質として、一定濃度のシクロス
ポリンＡ（７０μｇ／１ｍｌエタノール中）を、各々１
μ＋（０，０７μｇ）、２．５μ＋（０，１７５μ８）
、５μｌ（０，３５μｇ）、及び１０μ＋　（０，７μ
ｇ）を上記の方法により加え、それぞれの試料について
プロリルイソメラーゼの活性を測定した。この結果、こ
の酵素反応系においては３Ｘ１０−’Ｍ程度の濃度のシ
クロスポリンＡによってプロリルイソメラーゼ活性がほ
ぼ完全に阻害されることが明らかになった。

この結果を第１図に示す、この図において、横軸はシク
ロスポリンＡを加えてからの反応時間（単位は分）を、
縮軸は３６０ｒ＋ｍにおける吸光度ひ示す。座標内の数
字は反応系に加えられたシクロスポリンＡの濃度を示す
。「＋プロリルイソメラーゼ」はシクロスポリンＡが共
存しない条件下での酵素活性を示し、「プロリルイソメ
ラーゼ士エタノール」はシクロスポリンＡを溶解させる
のに用いたエタノールのプロリルイソメラーゼ活性に与
える影響の有無を調べるために１０μｍのエタノールを
酵素反応系に加えてプロリルイソメラーゼ活性を測定し
た場合の結果を示す。

また、「−プロリルイソメラーゼ」はプロリルイソメラ
ーゼを添加しない場合の結果を示す。シクロスポリンＡ
の添加量が増加するに従って、図中の曲線が「−プロリ
ルイソメラーゼ」の場合のそれに近づき、シクロスポリ
ンＡの添加量に依存してプロリルイソメラーゼが阻害さ
れることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図はシクロスポリンＡによりプロリルイソメラーゼ
が阻害される様子を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ペプチジルプロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラー
   ゼ（プロリルイソメラーゼ）活性に変化を与える物質を
   含有する試料とプロリルイソメラーゼとを接触せしめ、
   該接触により生ずるプロリルイソメラーゼ活性の変化の
   程度を測定することを特徴とするプロリルイソメラーゼ
   活性に変化を与える物質の定量方法。 ２、前記プロリルイソメラーゼ活性に変化を与える物質
   がシクロスポリンＡ又はその誘導体である請求項１に記
   載の方法。 ３、前記プロリルイソメラーゼ活性に変化を与える物質
   が免疫抑制物質である請求項１に記載の方法。 ４、プロリルイソメラーゼ活性に変化を与えると予想さ
   れる物質とプロリルイソメラーゼとを接触せしめ、該接
   触により生ずるプロリルイソメラーゼ活性の変化の有無
   又は変化の程度を測定することを特徴とする、該物質の
   プロリルイソメラーゼ活性に変化を与える能力の有無又
   はその能力の程度を測定する方法。 ５、免疫抑制物質の免疫抑制能の測定方法又は免疫抑制
   物質のスクリーニング方法である、請求項４に記載の方
   法。 ６、シクロスポリン誘導体の免疫抑制能の測定方法又は
   シクロスポリン誘導体のスクリーニング方法である、請
   求項４に記載の方法。 ７、自己免疫疾患の治療薬の効能測定法又はスクリーニ
   ング方法である、請求項４に記載の方法。 ８、インターロイキン２、γ−インターフェロン、イン
   ターロイキン−３又はＢ細胞増殖因子の産生又は分泌を
   阻害する物質の活性測定法又はスクリーニング方法であ
   る、請求項４に記載の方法。 ９、レニンの放出又はプロラクチンの分泌を刺激する物
   質の活性測定法又はスクリーニング方法である、請求項
   ４に記載の方法。 １０、住血吸虫症の治療薬の効能測定法又はスクリーニ
   ング方法である、請求項４に記載の方法。 １１、プロリルイソメラーゼ酵素を含んで成る、請求項
   １〜１０のいずれか１項に記載の方法を実施するための
   キット。