KR101006206B1 - 시클로스포린 ａ 알데히드의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구조적으로 시클로스포린 A와 유사한 시클로스포린 유사체의 이성체 혼합물에 관한 것이다. 이러한 혼합물은 개별적인 이성체들보다, 그리고 자연적으로 발생하고 현재 다른 것으로 알려진 시클로스포린 및 시클로스포린 유도체들보다 우수한 효능과 감소된 독성을 갖고 있다. 본 발명의 양태들은 ISAtx247로 언급되는 시클로스포린 A 유사체의 시스 및 트랜스-이성체들, 및 이의 유도체들에 관한 것이다. ISAtx247 이성체들 및 알킬화, 아릴화, 및 중수소화된 유도체들은 반응의 특정 조건들이 입체특이도를 결정하는 입체특이적 경로에 의하여 합성된다. 입체특이적 경로는 위티그 반응이거나, 붕소, 규소, 티타늄, 및 리튬과 같은 무기 원소들을 함유하는 유기금속 시약을 이용할 수 있다. 이러한 혼합물내의 이성체들의 비율은 혼합물 총량을 기준하여, 약 10 내지 90 중량%의 (E)-이성체 대 약 90 내지 10 중량%의 (Z)-이성체 범위 내일 수 있다.
시클로스포린, 시클로스포린 유도체, 시클로스포린 A 유사체, 시클로스포린 A 알데히드, 면역억제제

Description

시클로스포린 Ａ 알데히드의 제조 방법{METHOD FOR PREPARATION OF CYCLOSPORIN A ALDEHYDE}
본 발명은 시클로스포린 A와 관련된 시클로스포린 유사체의 이성체 혼합물에 관한 것이다. 이러한 혼합물은 개별적인 이성체와 자연적으로 발생하는 현재 알려진 다른 시클로스포린 및 시클로스포린 유도체보다 높은 효능 및/또는 감소된 독성을 갖는 것으로 예상된다.
또한, 본 발명은 시클로스포린 A 유사체의 이성체를 제조하기 위한 합성 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 특정한 반응 조건에 따라 입체특이성의 정도에 따라 변할 것이다.
관련 출원과 참고문헌
본 발명은 2001년 10월 19일에 출원된 미국 출원 제60/346,201호 및 2002년 4월 5일에 출원된 제60/370,596호의 우선권을 주장한다. 이들 각각 출원의 모든 내용은 본 명세서에서 전체적으로 참고로 편입된다.
참고자료
하기의 참고자료는 본 명세서의 해당부분에서 특허 또는 출원번호이거나 저자와 년도를 괄호 속에 표기하여 언급될 것이다:
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상기의 특허, 특허출원 및 공보의 각각의 내용도 본 명세서에서 전체적으로 참고하여 편입되었다.
발명의 배경
시클로스포린 유도체는 7개의 아미노산으로 구성된 시클릭 폴리펩티드의 일종으로서, 균류(Tolypocladium inflatum Gams)에 의하여 2차 대사물질로서 생성되는 것이다. 이들은 세포주기의 G0 또는 G1 단계에서 면역담당 림프구, 특히 T-림프구를 가역으로 억제하는 것으로 관찰되어지고 있다. 또한 시클로스포린 유도체는 림포카인의 생성과 방출을 가역으로 억제하는 것으로 관찰되어지고 있다(Granelli-Piperno et al., 1986). 비록 수많은 시클로스포린유도체가 알려졌지만, 시클로스포린 A가 가장 널리 사용되어진다. 시클로스포린 A의 억제 효과는 T-세포 매개 활성 작용의 억제와 관련되어 있다. 이러한 억제는 시클로스포린이 널리 분포된 세포내 단백질, 시클로필린과의 결합에 의하여 수행되고 있다. 바꾸어 말해, 이러한 복합물은 효소 칼시뉴린의 칼슘- 및 칼모듈린-의존 세린-트레오닌 인산가수분해효소 활성을 억제한다. 칼시뉴린의 억제는 T-세포 활성 동안에 사이토카인 유전자(IL-2, IFN-γ, IL-4 및 GM-CSF)의 유도에 필수적인 NFATp/c 및 NF-κB와 같은 전사인자의 활성을 방해한다. 또한 시클로스포린은 생체외 T-헬퍼 세포에 의해 림포카인 생성을 억제하고 융선내의 CD8 및 CD4 성숙세포의 발달을 억제한다(Granelli-Piperno et al., 1986). 시클로스포린의 다른 생체외 특성은 T-림프구와 세포독성 T-림프구(CTL)를 생성시키는 IL-2의 억제, 활성화된 T-세포에 의하여 방출되는 IL-2의 억제, 및 동종항원과 외인성 림포카인에 응답하여 휴지하는 T-림프구의 억제, 및 T-림프구를 생성시키는 IL-2의 유사분열물질 활성의 억제를 포함한다(Granelli- Piperno et al., 1986).
시클로스포린은 동종이식 거부, 지체된 과민증, 실험적 알러지 뇌척수염, 프로인드(Freund) 애주번트 관절염 및 이식편대숙주 질병과 같은 체액성 면역 및 세포-매개 면역 반응을 억제하는 것으로 알려진 잠재적인(potent) 면역억제제이다. 이는 기관 이식에 이은 기관 거부의 예방; 류마티스성 관절염의 치료; 건선의 치료; 타입 I 당뇨, 크론 병, 낭창 등을 포함하는 다른 자기면역 질병의 치료를 위하여 사용되었다.
시클로스포린의 원래의 발견에서부터, 자연적으로 발생하는 아주 다양한 시클로스포린들이 분리되어 구별되었고 많은 추가적인 비자연적 시클로스포린이 완전 - 또는 반-합성수단에 의하거나 변형된 배양기술의 응용에 의하여 제조되었다. 따라서 지금은 시클로스포린을 포함하는 분류는 상당히 많고, 예를 들어 자연적으로 발생하는 시클로스포린 A 내지 Z(예를 들면, Traber et al.(1977); Traber et al.(1982); Kobel et al.(1982); 및 Von Wartburg et al(1986))를 포함하는 외에도, 다양한 비자연적 시클로스포린 유도체 및 디히드로- 및 이소-시클로스포린을 포함하는 인위적이거나 합성한 시클로스포린; 유도된 시클로스포린(예를 들면, -MeBmt-잔기의 3'-O-원자가 아실화되거나 추가적인 잔기가 3-위치에서 사르코실 잔기의 α-탄소원자에 유도되는 것); -MeBmt-잔기가 이성체 형태(예를 들면, -MeBmt-잔기의 위치 6' 및 7'를 가로지르는 배열이 트랜스보다는 시스형태인 것)인 시클로스포린; 및 예를 들면 알. 벤게르(R. Wenger)에 의하여 개발된 시클로스포린의 생성을 위한 전합성방법[참조; Traber et al.(1977); Traber et al.(1982); Kobel et al.(1982); 미국 특허 제4,108,985호, 제4,210,581호, 제4,220,641호, 제4,288,431호, 제4,554,351 및 제4,396,542호; 유럽특허공보 제0 034 567호 및 제0 056 782호; 국제특허공보 제WO 86/02080호; Wenger(1983), Wenger(1985), Wenger(1986)]을 이용하여 단백질 서열내에서 변형 아미노산이 특정위치에서 결합되는 시클로스포린을 포함한다. 1-위치에서 변형된 아미노산을 함유하는 시클로스포린 A 유사체(analogs)는 리치 등(Rich et al., 1986)에 의하여 알려져 있다. 면역억제성, 항소염제성, 및 항기생충 시클로스포린 A 유사체는 산도스에 모두 양도된 미국특허 제4,384,996호, 제4,771,122호, 제5,284,826호, 및 제5,525,590호에 기재되어 있다. 추가적인 시클로스포린 유사체는 이소테크니카 회사에게 양도된 제WO 99/18120에 개시되어 있다. 사이클로스포린(ciclosporin), 사이클로스포린들, 시클로스포린(cyclosporine)의 용어는 시클로스포린과 같은 의미로서 사용되었다.
시클로스포린 A 치료와 관련하여 일부 알려진 신독성, 간독성, 백내장유도, 다모증, 파라파시스, 및 치은과다형성(Sketris et al,. 1995)을 포함하는 수많은 부작용이 있다. 이들 중에서, 신독성은 시클로스포린 A 투여로부터 야기되는 가장 심각한 복용과 관련된 부작용중의 하나이다. 순간-방출 시클로스포린 A 약제(예를 들면, 상표명 Neoral 및 Sandimmune)는 이들의 급속한 방출과 약제의 고혈중 농도의 흡수에 기인하여 신독성과 다른 독성 부작용을 일으킬 수 있다. 약제의 피크농도가 부작용과 관련되어 있다는 것은 자명한 사실이다(Bennett, 1998). 시클로스포린 A가 신장 손상을 일으키는 정확한 메카니즘은 알려지지 않았지만, 신장내의 혈관수축성 물질의 농도 증가가 구심성 사구체 소동맥의 수축을 이끌 수 있다고 제시 되고 있다. 이는 신장 국소빈열, 사구체 여과율의 감소, 및 장기간의 간질성 섬유조직증식을 야기할 수 있다. 복용량을 감소시키거나 다른 면역억제제로 치환하였을 때, 신장 작용이 개선된다(Valantine and Schroeder, 1995).
따라서 효과적이면서 독성이 줄어든 면역억제제가 필요하다.
1-위치에 변형된 아미노산을 함유하는 시클로스포린 유사체는 WO 99/18120에 개시되어 있고, 이는 본 출원의 양수인에게 양수되었고, 본 명세서에서 전체적으로 일체화되었다. 또한 본 출원의 양수인에게 양수된 것은 미국 분할 특허출원 제60/346,201호이며, 여기서는 출원인이 "ISAtx247"로 언급하는 특히 바람직한 시클로스포린 A 유사체가 개시되어 있다. 이러한 유사체는 1-아미노산 잔기에서 변형된 것만 제외하고 시클로스포린 A과 구조적으로 동일하다. 출원인은 ISAtx247의 시스와 트랜스- 이성체의 특정한 혼합물이 자연적으로 발생하고 현재 알려진 시클로스포린보다 높은 잠재성(또는 효능; potency)과 낮은 독성을 복합적으로 보여준다는 것을 밝혀내었다. 또한 알킬화되고, 아릴화되어 중수소처리된(deuterated) ISAtx247의 특정한 유도체도 밝혀내었다.
일반적으로 미국 분할 특허출원 제60/346,201호에서 개시된 혼합물은 약 10 내지 90 중량%의 트랜스-이성체와 약 90 내지 10 중량%의 시스-이성체의 범위내에 있는 것이며; 다른 양태로서 상기 혼합물은 약 15 내지 85 중량%의 트랜스-이성체 와 약 85 내지 15 중량%의 시스-이성체의 범위내에 있는 것이며; 다른 양태로서 상기 혼합물은 약 25 내지 75 중량%의 트랜스-이성체와 약 75 내지 25 중량%의 시스-이성체의 범위내에 있는 것이며; 다른 양태로서 상기 혼합물은 약 35 내지 65 중량%의 트랜스-이성체와 약 65 내지 35 중량%의 시스-이성체의 범위내에 있는 것이며; 다른 양태로서 상기 혼합물은 약 45 내지 55 중량%의 트랜스-이성체와 약 55 내지 45 중량%의 시스-이성체의 범위내에 있다. 또 다른 양태로서, 상기 이성체 혼합물은 약 45 내지 50 중량%의 트랜스-이성체와 약 50 내지 55 중량%의 시스- 이성체를 함유하는 ISAtx247의 혼합물이다. 다른 말로 해서, 혼합물은 65중량%의 (E)-이성체와 35중량%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있다. 다른 명명법으로 시스-이성체는 (Z)-이성체로 기재될 수 있고 트랜스-이성체는 또한 (E)-이성체로 불릴 수 있을 것이다.
따라서 본 발명에서는 ISAtx247의 이성체를 포함하여 시클로스포린 유사체(analogs)의 제조방법도 종래에 요구되었다. 개별적인 이성체가 풍부한 조성물을 제조하는 것뿐만 아니라 원하는 비율로 두 가지 이성체를 갖는 이성체들의 혼합물의 합성 경로도 필요하다. 또한 ISAtx247의 유도체의 제조 방법도 필요하다.
발명의 요약
시클로스포린 및 이의 유사체는 잠재적인 면역억제 활성을 갖는 시클릭 폴리펩티드류에 속하는 물질이다. 이러한 약제는 이들의 면역억제성, 항염증성, 및 항- 기생충 활성과 관련한 장점을 제공함에도 불구하고, 시클로스포린 A과 관련하여 신독성과 간독성을 포함하여 수많은 부작용을 일으킨다. 따라서 관련된 독성 부작용이 없이 자연적으로 발생하는 화합물 시클로스포린 A와 같은 약리학적으로 활성이 있는 신규한 면역억제제가 요구되고 있다.
본 발명의 양태는 약제학적으로 유용한 시클로스포린 A 유사체의 시스와 트랜스-이성체의 특정한 혼합물을 제공한다. 바람직한 유사체는 ISAtx247로서 언급된다. ISAtx247 이성체의 혼합물은 자연적으로 발생하고 현재 알려진 시클로스포린보다 잠재성이 우수하고 독성이 감소된 복합효과를 보여준다.
본 발명은 시클로스포린의 유사체의 특정한 이성체 혼합물이 시클로스포린 A와 관련된 부작용을 발생시키지 않고 우수한 면역억제 효과를 제공하는 발견에 부분적으로 근거하고 있다. 특히, 본 발명자들은 1-아미노산 잔기에서 변형된 시클로스포린 유사체의 약 10:90 내지 약 90:10(트랜스 대 시스)의 범위내의 이성체 혼합물(즉, 시스와 트랜스-이성체의 혼합물)이 우수한 효능과 안전성을 제공한다는 것을 우연하게 발견하였다. 이러한 유사체의 예로는 WO 99/18120에 개시되어 있고, 중수소화된 화합물 및 비-중수소화된 화합물을 포함하였다. 특히, 약 45:55 내지 약 50:50(트랜스- 대 시스-)의 범위내의 혼합물 및 약 50% 내지 약 55% 트랜스-와 약 45% 내지 50% 시스-범위내의 혼합물이 특히 효능이 있다는 것을 발견하였다. 더욱이, 이들 이성체 혼합물은 자연적으로 발생하고 현재 다른 것으로 알려진 시클로스포린과 시클로스포린 유도체보다 우수한 잠재성과 감소된 독성의 복합효과를 보여주는 것으로 밝혀졌다.
특히 바람직한 유사체(이후에는 "ISAtx247"로 명한다)는 1-아미노산 잔기에서 분자의 주변상에 있는 변형 작용기를 제외하고는 구조적으로 시클로스포린 A와 유사하다. 이러한 특정 이성체 유사체 혼합물의 구조는 시클로스포린 A의 구조와 비교하여 도 1A, 1B, 2A, 2B에 나타내었다.
이러한 이성체 혼합물은, 다른 것 중에서도 면역억제, 및 다양한 면역 장애, 질병과 상태의 치료 즉, 이들의 예방, 조절, 경감 및 치료를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 양태에 따르면, ISAtx247 이성체( 및 이의 유도체)는 이들의 선택 정도에 따라 변할 수 있는 입체특이적 경로에 의하여 합성된다. 입체특이적 경로는 (E) 및 (Z)-이성체중에 어느 하나가 풍부한 조성물을 생성하고, 이러한 조성물들은 얻어진 혼합물이 원하는 비율의 2가지 이성체를 가질 수 있도록 배합되어질 수 있다. 또한, 입체특이적 경로의 반응 조건은 제조된 혼합물에서 직접적으로 원하는 비율을 달성할 수 있도록 맞출 수 있다. 혼합물에서 하나의 이성체 또는 다른 이성체의 비율은 핵자기공명(NMR) 분광법 또는 당해분야에서 잘 알려진 기술을 사용하여 확인할 수 있다.
경로의 각 단계는 민감한 알콜 작용기에 보호기를 적용하는 과정으로 일반적으로 진행된다. 한 양태로서, 알콜은 아세테이트로서 보호되고; 다른 양태로서, 보호기는 벤조에이트 에스테르 또는 실릴 에테르이다. 비록 아세테이트 보호기는 당해분야에서 공지되어 있지만, 본 명세서의 대부분의 실시예에서 벤조에이트 에스테르 또는 실릴 에테르와 같은 보호기의 사용을 통하여 아세테이트 보호기를 포함하 는 원하지 않은 특정한 부작용을 피할 수 있다는 것을 강조하는 것이 중요하다.
이어서 보호된 화합물은 위티그 반응에서 참가제로서 인-함유 시약, 유기금속 시약의 일원으로서 무기원소를 이용하는 몇 가지 경로를 포함하는 다양한 입체특이적 합성경로를 위한 전구체로서 사용할 수 있다. 후자의 형태는 6-원 고리 전이 상태를 통하여 진행될 수 있고, 여기서 입체장애가 배열 결과를 야기하게 된다. 많은 유기금속 시약이 시판 중에 있으며, 이들은 붕소, 규소, 티타늄, 리튬 및 황과 같은 무기원소를 포함하였다. 개별적인 이성체는 단일 또는 다중 전구체로부터 제조될 수 있다.
특정한 혼합물에서 (E) 대 (Z)-이성체의 비율은, 입체특이적으로나 비입체특이적으로 제조되었더라도, 다양한 범위내에서 취할 수 있다. 예를 들면, 혼합물은 약 10 내지 90%의 (E)-이성체 대 약 90 내지 10%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있다. 다른 양태로서, 혼합물은 약 15 내지 85%의 (E)-이성체 대 약 85 내지 15%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있다. 다른 양태로서, 혼합물은 약 25 내지 75%의 (E)-이성체 대 약 75 내지 25%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있다. 다른 양태로서, 혼합물은 약 35 내지 65%의 (E)-이성체 대 약 65 내지 35%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있다. 다른 양태로서, 혼합물은 약 45 내지 55%의 (E)-이성체 대 약 55 내지 45%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있다. 다른 양태로서, 이성체 혼합물은 약 45 내지 55%의 (E)-이성체 및 약 55 내지 45%의 (Z)-이성체를 함유하는 ISAtx247 혼합물이다. 여기서 중량%는 조성물의 총량을 기준으로 하는 것이며, (E)-이성체와 (Z)-이성체의 중량%의 합은 100%이다. 다른 말로 하면, 혼합물은 65%의 (E)-이성체와 35%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있고, 그 역으로도 가능하다.
따라서 한 양태로서, 본 발명은 1-아미노산 잔기에서 변형된 시클로스포린 A 유사체의 이성체 혼합물을 제조하는 방법을 제공하는데, 여기서 합성 경로는 아세틸-η-할로시클로스포린 A를 트리알킬포스핀, 트리아릴포스핀(예를 들면, 트리페닐포스핀), 아릴알킬포스핀, 및 트리아릴포스핀과 함께 가열하여 아세틸 시클로스포린 A의 중간체 포스포늄 할로겐화물을 제조한 다음; 아세틸 시클로스포린 A의 중간체 포스포늄 할로겐화물을 할로겐화 리튬의 임의적 존재하에 포름알데히드와 함께 교반하여 아세틸-1,3-디엔의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 제조한 후; 아세틸-1,3-디엔의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 염기로 처리하여 ISAtx247의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 제조하는 단계로 이루어진다.
다른 양태로서, 본 발명은 1-아미노산 잔기에서 변형된 시클로스포린 A 유사체의 이성체 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것인데, 여기서 합성 경로는 중간체 즉, 보호된 트리메틸실릴(TMS)시클로스포린 A 알데히드 또는 아세틸 시클로스포린 A 알데히드를 할로겐화 리튬의 임의적 존재하에 위티그반응을 통하여 포스포러스 일라이드(phosphorus ylide)와 반응시켜 중간체를 아세틸-1,3-디엔의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물로 전환시킨 후; 아세틸-1,3-디엔의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 아세틸-보호기의 경우에는 염기로 처리하여, TMS-보호기의 경우에는 산으로 처리하여 ISAtx247의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 제조하는 단계를 포함하였다.
다른 양태로서, 본 발명은 1-아미노산 잔기에서 변형되고 (E)-이성체가 풍부한 시클로스포린 A 유사체의 이성체 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것인데, 여기 서 (E)-이성체가 풍부한 조성물의 입체특이적 합성 경로는 트리알킬실릴알릴 보로네이트 에스테르 및 E-γ-(트리알킬실릴알릴)디알킬보란(여기서 "γ"는 감마를 의미함)으로 구성된 군으로부터 선택된 시약과 아세틸 시클로스포린 A 알데히드와 반응시켜 β-트리알킬실릴 알콜을 형성한 다음; β-트리알킬실릴 알콜을 산으로 처리하여 아세틸-(E)-1,3-디엔을 형성한 후; 아세틸-(E)-1,3-디엔을 염기로 처리하여 ISAtx247의 (E)-이성체를 형성하는 단계를 포함하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 1-아미노산 잔기에서 변형되고 (Z)-이성체가 풍부한 시클로스포린 A 유사체의 이성체 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것인데, 여기서 (Z)-이성체가 풍부한 조성물의 입체특이적 합성 경로는 트리알킬실릴알릴 보로네이트 에스테르 및 E-γ-(트리알킬실릴알릴)디알킬보란으로 구성된 군으로부터 선택된 시약과 아세틸 시클로스포린 A 알데히드와 반응시켜 β-트리알킬실릴 알콜을 형성한 다음; β-트리알킬실릴 알콜을 염기로 처리하여 아세틸-(Z)-1,3-디엔을 형성한 후; 아세틸-(Z)-1,3-디엔을 염기로 처리하여 ISAtx247의 (Z)-이성체를 형성하는 단계를 포함하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 1-아미노산 잔기에서 변형되고 (E)-이성체가 풍부한 시클로스포린 A 유사체의 이성체 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것인데, 여기서 E-이성체가 풍부한 혼합물의 입체특이적 합성 경로는 아세틸 시클로스포린 A 알데히드와 리튬화 알릴디페닐포스핀 산화물과 반응시켜 아세틸-(E)-1,3-디엔을 형성한 후; 아세틸-(E)-1,3-디엔을 염기로 처리하여 ISAtx247의 (E)-이성체를 형성하는 단계를 포함하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 1-아미노산 잔기에서 변형되고 (Z)-이성체가 풍부한 시클로스포린 A 유사체의 이성체 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것인데, 여기서 (Z)-이성체가 풍부한 혼합물의 입체특이적 합성 경로는 아세틸 시클로스포린 A 알데히드와 [3-(디페닐포스피노-알릴]티타늄과 반응시켜 티타늄-함유 중간체를 형성한 다음; 티타늄-함유 중간체를 에리트로-α-부가물로 진행되도록 방치한 후; 에리트로-α-부가물을 이오도메탄의 처리로 β-옥시도포스포늄 염으로 전환시킨 다음; β-옥시도포스포늄 염을 아세틸-(Z)-1,3-디엔으로 전환시킨 후; 아세틸-(Z)-1,3-디엔을 염기로 처리하여 ISAtx247의 (Z)-이성체를 형성하는 단계를 포함하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 (E) 및 (Z)-이성체 혼합물을 제공하는데, 이러한 혼합물은 시클로스포린 A의 β-알콜을 보호하여 아세틸 시클로스포린 A을 형성한 다음; 아세틸 시클로스포린 A의 1-아미노-산 잔기의 측쇄의 η-탄소를 브롬화하여 제1 중간체인 아세틸-η-브로모시클로스포린 A를 제조한 후; 제1 중간체인 아세틸-η-브로모시클로스포린 A를 트리페닐 포스핀 및 트리알킬 포스핀으로 구성된 군으로부터 선택된 시약과 함께 가열하여 아세틸 시클로스포린 A의 트리페닐- 및 트리알킬 포스포늄 브로마이드로 구성된 군으로부터 선택된 제2 중간체를 생성한 다음; 아세틸 시클로스포린 A의 트리페닐- 또는 트리알킬 염(제2 중간체로서 트리페닐포스포늄 브로마이드)로부터 발생된 일라이드(ylide)를 포름알데히드와 교반하여 아세틸-1,3-디엔의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 제조한 후; 아세틸-1,3-디엔의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 염기로 처리하여 ISAtx247의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조하였다.
본 발명은 또한 아세틸 시클로스포린 A의 트리페닐- 및 트리알킬 포스포늄 브로마이드를 포함하는 물질의 조성물에 관한 것으로서, 이러한 생성물은 시클로스포린 A의 β-알콜을 보호한 다음; 시클로스포린 A의 1-아미노-산 잔기의 측쇄의 η-탄소를 브롬화하여 제1 중간체인 아세틸-η-브로모시클로스포린 A를 제조한 후; 제1 중간체인 아세틸-η-브로모시클로스포린 A를 트리페닐포스핀 및 트리알킬포스핀으로 구성된 군으로부터 선택된 시약과 함께 가열하여 아세틸 시클로스포린 A의 트리페닐- 및 트리알킬 포스포늄 브로마이드로 구성된 군으로부터 선택된 아세틸 시클로스포린 A의 브로마이드를 제조하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된다. 또한, 아세틸 시클로스포린 A의 트리페닐- 및 트리알킬 포스포늄 브로마이드 유도체를 함유하는 조성물 및 아세틸 시클로스포린 A의 β-트리메틸실릴알콜 유도체를 함유하는 조성물을 제공한다.
추가적인 양태로서, 본 발명은 아세틸 시클로스포린 A 또는 트리메틸실릴(TMS) 시클로스포린 A를 형성하여 시클로스포린 A의 β-알콜을 보호한 다음; 아세틸 시클로스포린 A 또는 트리메틸실릴(TMS) 시클로스포린 A를 환원제와 함께 사용되는 산화제로서 오존으로 산화시키는 단계를 포함하는 시클로스포린 A 알데히드의 선택적 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가적인 양태로서, 본 발명은 1-아미노산 잔기에서 변형된 시클로스포린 A 유사체의 이성체 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것인데, 여기서 합성 경 로는 중간제인 아세틸 시클로스포린 A 알데히드를 할로겐화 리튬의 임의적 존재하에 위티그반응을 통하여 트리부틸알릴포스포늄 할로겐아이드로부터 제조된 포스포러스 일라이드와 반응시켜 중간체를 아세틸-1,3-디엔의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물로 전환시킨 후; 아세틸-1,3-디엔의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 염기로 처리하여 ISAtx247의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 제조하는 단계를 포함하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 트리메틸실릴(TMS) 시클로스포린 A 알데히드를 트리알킬실릴알릴보란과 반응시켜 β-트리알킬실릴 알콜을 형성한 다음; β-트리알킬실릴 알콜을 처리하여 ISAtx247의 (E)-이성체를 직접 형성하는 단계를 포함하는 ISAtx247의 (E)-이성체의 입체특이적 합성 방법을 제공한다.
추가적인 다른 양태로서, 본 발명은 트리메틸실릴(TMS) 시클로스포린 A 알데히드를 트리알킬실릴알릴보란과 반응시켜 β-트리알킬실릴 알콜을 형성한 다음; β-트리알킬실릴 알콜을 염기로 처리하여 TMS-1,3-디엔을 형성한 후; TMS-1,3-디엔을 탈보호화하여 ISAtx247의 (Z)-이성체를 형성하는 단계를 포함하는 ISAtx247의 (Z)-이성체의 입체특이적 합성 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 1-아미노산 잔기에서 변형된 시클로스포린 A 유사체의 이성체 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것인데, 이러한 방법은 (E)-이성체 및 (Z)-이성체가 예정된 비율로 혼합물내에 존재하도록 ISAtx247의 (E)-이성체와 (Z)-이성체를 제조하는 합성 경로를 포함하는데, 여기서 합성 경로는 시클로스포린 A의 β-알콜을 보호한 다음; 보호된 시클로스포린 A를 산화시켜 제2 중간체인 보호된 시클로스포린 A 알데히드를 생성시킨 다음; 제2 중간체인 보호된 시클로스포린 A 알데히드 를 할로겐화 리튬의 임의적 존재하에 위티그반응을 통하여 포스포러스 일라이드와 반응시켜 제2 중간체를 보호된 1,3-디엔의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물로 전환시킨 후; 보호된 1,3-디엔을 탈보호화하여 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 제조하는 단계를 포함하였다.
또한 본 발명에 의해 제공되는 이러한 혼합물을 제조하는 다른 방법은 또한 1-아미노산 잔기에서 변형된 시클로스포린 A 유사체의 이성체 혼합물을 제조하는 방법을 포함하는데, 이러한 방법은 (E)-이성체 및 (Z)-이성체가 예정된 비율로 혼합물내에 존재하도록 ISAtx247의 (E)-이성체와 (Z)-이성체를 제조하는 합성 경로를 포함하는데, 여기서 혼합물내의 이성체 비율은 혼합물의 총중량을 기준하여 45 내지 55 중량%의 (E)-이성체 대 약 55 내지 약 45 중량%의 (Z)-이성체의 범위내에 있게 된다.
본 발명은 또한 1-아미노산 잔기에서 변형된 시클로스포린 A 유사체의 예정된 이성체 혼합물을 제조하는 방법을 제공하는데, 이러한 방법은 ISAtx247의 (E)-이성체가 풍부한 제1 물질을 제조한 다음; ISAtx247의 (Z)-이성체가 풍부한 제2 물질을 제조한 후; 제1 물질과 제2 물질을 예정된 비율로 혼합하여 원하는 이성체 조성물을 얻는 단계를 포함하였다.
본 발명에 의하여 제조된 시클로스포린 유사체는 다른 것 중에서도 면역억제, 및 다양한 면역 장애, 질병과 상태의 치료 즉, 이들의 예방, 조절, 경감 및 치 료를 위하여 사용될 수 있다.
합성
시클로스포린 및 이의 유사체는 잠재적인 면역억제 활성을 갖는 시클릭 폴리펩티드의 한 부류에 속하는 물질이다. 이러한 약제는 이들의 면역억제성, 항염증성, 및 항-기생충 활성과 관련한 장점을 제공함에도 불구하고, 시클로스포린 A과 관련하여 신독성과 간독성을 포함하여 수많은 부작용을 일으킨다. 따라서 관련된 독성 부작용이 없이 자연적으로 발생하는 화합물 시클로스포린 A와 같은 약리학적으로 활성이 있는 신규한 면역억제제가 요구되고 있다.
출원인은 "ISAtx247"로 언급되는 시클로스포린 A 유사체를 과거에 공개한 바가 있다. 이러한 유사체는 1-아미노산 잔기에서 변형된 것만 제외하고 시클로스포린 A와 구조적으로 유사하다. 출원인은 ISAtx247의 시스- 및 트랜스- 이성체의 특정 혼합물이 자연적으로 발생하고 현재 알려진 시클로스포린보다 우수한 잠재력과 감소된 독성의 복합효과를 보여준다는 사실을 밝혀내었다.
본 발명의 한 태양에 따르면, ISAtx247 이성체(및 이의 유도체)는 입체특이도에 따라 변할 수 있는 입체특이적 경로에 의하여 합성된다. 입체특이적 경로는 (E) 및 (Z)-이성체중에 어느 하나가 풍부한 조성물을 생성하고, 이러한 조성물들은 얻어진 혼합물이 원하는 비율의 2가지 이성체를 가질 수 있도록 배합되어질 수 있다. 선택적으로는, 입체특이적 경로의 반응 조건을 맞추어 직접 원하는 비율의 혼 합물을 제조할 수 있다.
ISAtx247로 명명되는 본 발명의 면역억제 시클로스포린 유사체의 화학명은 시클로 {{(E, Z)- (2S, 3R, 4R)-3- 히드록시-4-메틸-2-(메틸아미노)-6, 8-노나디에노일}- L-2-아미노부티릴- N-메틸-그릴실- N-메틸-L-류실- L-발릴- N-메틸-L-류실- L-알라닐- D-알라닐- N-메틸-L-류실- N-메틸- L-류실- N-메틸-L-발릴}로 화학적으로 기재된다. 이의 실험식은 C63H111N11O12이고, 분자량은 약 1214.85이다. 용어 "ISAtx247"은 이러한 약제학적 활성 화합물을 나타내기 위하여 상표명이다.
ISAtx247의 구조는 우선 핵자기공명(NMR) 분광법을 통하여 입증되었다. 1H 및 13C 스펙트럼은 일련의 1차 및 2차 NMR 실험을 이용하여, 시클로스포린 A의 알려진 NMR 수치와 비교하여 정하여졌다. ISAtx247의 (E)와 (Z)-이성체의 절대적 수치는 핵 오버하우서 효과(Nuclear Overhauser Effect ; NOE)실험에 의하여 확인되었다. 추가적인 지지 증거는 분자량을 확인하는 질량스펙트럼분석에 의해서, 시클로스포린 A와 매우 유사한 것으로 밝혀진 적외 분광법에 의하여 제공된다. 후자의 결과는 두개의 화합물간의 유사성을 보여주는 것으로 기대된다.
시클로스포린 A의 구조는 도 1A에 예시하였다. 이러한 구조는 분자의 시클릭 펩티드 고리를 포함하는 11개의 아미노산 잔기의 특징부를 포함하였다. 이러한 11개의 아미노산 잔기는 고리의 중앙 최상부에 있는 아미노산(이후에는 "1-아미노산"이라 한다)부터 시작하여 시계방향으로 숫자를 증가시키면서 표기한다. 첫 번째 아미노산은 선명하게 보이기 위하여 점선 상자에 표시한다. 1-아미노산 잔기의 측쇄 는 여기서 합성 반응이 일어나는 일반적인 위치이기 때문에 화학적으로 관심대상이 되어진다. 통상적으로, 아미노산의 카르보닐기에 인접한 탄소는, 펩티드 고리로부터 떨어져서, 사슬의 하부방향에 있는 인접 탄소를 표기하기 위하여 사용된 그리스 알파벳의 문자 순서대로 하여, α-탄소로 표기된다. 시클로스포린 A의 경우에, 도 1A에서 보여주는 바와 같이, 측쇄의 β-탄소는 히드록실기에 결합되어 있고, 측쇄의 ε-탄소와 ζ-탄소사이에 트랜스-배향된 이중결합이 있다.
시클로스포린 A 구조의 다른 구조는 도 1B에 나타내었고, 여기서 분자의 다른 부분은 점선 상자 내에 에워싸여 있다. 이 도면은 본 명세서에서 사용되어진 명명법을 정의하는 것이며, 용어 "CsA"는 상자내에 에워싸여 있는 시클로스포린 A의 부분을 나타낸다. 본 발명의 명명법은 반응을 기술할 때마다 해당분자를 상기시키지 않고, 본 명세서에서 기술된 합성 반응이 일어나는(즉, 1-아미노산 잔기의 측쇄로서, 도 1B의 점선상자 외부에 나타낸 부분) 위치를 표시하기 위한 약식 수단을 제공한다. 당업계의 숙련가에게는 측쇄의 α와 β-탄소간의 결합은 통상적인 길이이고, 용어 "CsA"의 정의와 보조를 맞추기 위하여 도면에서 과장하여 나타내었다.
상술한 바와 같이, 특히 바람직한 시클로스포린 A 유사체는 ISAtx247로 명하며, 이들 두개의 입체이성체 E(또는 트랜스)와 Z(또는 시스)는 각각 도 2A 및 2B에 나타내었다. 이들 입체이성체의 시스 또는 트랜스 특성은 측쇄의 ε-탄소와 ζ-탄소사이에 이중결합(즉 사슬의 말단에 있는 이중결합과 마주보는 것과 같이 펩티드에 더욱 가까운 이중결합)의 배열에 의한 것이다.
특정 용어가 입체화학적 명명법과 관련하여 정의되어야 한다. 본 명세서에서 시스 및 (Z)의 용어는 호환적으로 사용될 것이며, 트랜스 및 (E)의 용어도 호환적으로 사용될 것이다. 용어 "에리트로(erythro)" 및 "트레오(threo)"의 사용은 이들 의미와 관련하여 문헌에서의 외형상 혼동 때문에 최소로 유지될 것이다[참고 문헌; R. W. Hoffmann and H. -J Zei in "Stereoselective synthesis of Alcohols. 8. Diastereoselective Synthesis of β - Methylhomoallyl Alcohols via Crotylboronates", J. Org. Chem., Vol. 46, pp. 1309-1314 (1981) ; A. Streitwieser and C. H. Heathcock, Introduction to Organic Chemistry, 2nd ed.(Macmillan, New York, 1981), pp. 845-846; and M. B. Smith and J. March, March's Advanced Organic Chemistry (Wiley, New York, 2001), pp. 144-147]. 본 명세서에서 트레오/에리트로 용어를 사용한 몇몇의 경우에, 스트레이트바이져와 핼스콕(Streitwieser and Heathcock)의 약정에 따라, "에리트로" 이성체는 (R, S) 및 (S, R) 배열을 의미하고, "트레오" 이성체는 (R, R) 및 (S, S) 배열을 의미한다.
명명법과 관련한 마지막 설명은 도 2A 및 2B에서 보여주는 말단 탄소-탄소 이중결합에 관한 것이다. 반복되는 숫자 도식에서, 1-아미노산 잔기의 측쇄내의 탄소는 말단(θ)에서 시작하여 펩티드 고리를 향하여 역산하면서 넘버링할 수 있다. 이러한 체계에서, ISAtx247 이성체는 유기화학에서 통상적인 명명법에 따르면 1,3-디엔으로 생각될 수 있으며, 여기서 각각의 이중결합은 가장 낮은 숫자의 탄소에 의하여 식별된다.
이후에는 도 3 내지 8에 예시한 합성 경로를 설명할 것이다. 본 발명의 양태 에 따르면, 이성체 혼합물은 직접 제조될 수 있으며, 여기서는 특정한 합성 경로의 조건을 맞추어 혼합물내의 이성체의 원하는 비율을 달성할 수 있다. 다른 방법으로는, 시클로스포린 A 유사체의 2개의 기하학적 이성체중에서 어느 하나가 풍부한 조성물들을 제조한 다음, 예정된 비율로 조성물들을 배합하여 원하는 혼합물을 얻을 수 있다.
본 발명의 양태에 따른 합성 경로의 조감도는 도 3에 나타내었고, 여기서, 특히 강조할 것은 화학 및 입체특이도에 따라 반응경로를 그룹화한다는 것이다. 도 3과 관련하여, 위티그 반응을 이용하는 합성경로는 참고번호(31)로 표시된 것과 같은 도표의 우측상에 일반적으로 나타내는 반면에, 6-원 고리 전이 상태를 형성하는 것으로 생각되는 유기금속 시약을 이용하는 경로(32 및 33)은 도표의 중앙과 좌측에 나타낸다. 어느 합성경로일지라도 이성체의 혼합물을 얻을 수 있거나, 2개의 이성체 중 어느 하나가 풍부한 조성물들을 제조할 수 있다.
본 발명의 양태는 이성체의 원하는 혼합물에 도달할 수 있는 다양한 방법을 제공한다. 본 명세서에서 개시된 합성 전략의 융통성과 다양성은 도 3의 대칭과 비대칭에 의하여 부분적으로 반영될 수 있다. 각각의 경로에서 일반적인 반응은 시클로스포린 A(34)내의 작용기의 보호에 있으며; 이의 예시적 양태로서 해당 반응은 시클로스포린 A(34)를 아세틸 시클로스포린 A(35)로 전환하는 것이다. 도 3내의 비대칭은 모든 티타늄과 리튬 유기금속 시약 경로이지만, 몇 개의 인-함유 위티그반응 경로를 위한 전구체로서 아세틸 시클로스포린 A 알데히드 화합물(51)의 사용에 있다.
일반적으로, 반응 조건을 원하는 비율의 이성체를 갖는 혼합물을 제조할 수 있도록 조정할 수 있는 도 3의 합성 경로는 위티그 반응에서 반응물로서 인-함유 시약을 이용할 수 있다. 다른 입체특이적 경로는, 무기원소를 이용할 뿐만 아니라, 입체장애가 배열결과를 야기하는 6원 고리 전이 상태를 통하여 진행하는 유기금속 시약의 물질을 이용할 수 있다. 붕소, 규소, 티타늄, 리튬, 및 황과 같은 무기원소의 특징이 있는 것을 포함하여, 과도한 유기금속 시약들을 본 발명에서 사용할 수 있다.
2개의 이성체 중에서 어느 하나 또는 다른 것이 풍부한 조성물은 단일 전구체로부터 제조될 수 있으며; 대안으로서, 다른 전구체로부터 2개의 조성물을 제조할 수도 있다. 도 3의 입체특이적 경로의 하나(경로 32)에서, 단일의 전구체는 선택된 반응 조건에 따라 ISAtx247의 2개의 이성체 모두를 이끌 수 있다. 다른 입체특이적 경로(경로 33)에서, 어느 하나의 이성체가 풍부한 각각의 조성물을 제조하기 위해서는 2개의 다른 전구체가 필요하다.
이후에는 도 3의 반응에 대하여 자세히 설명할 것이다. 각각의 경로에서 일반적인 반응은 1-아미노산 잔기의 β-위치에 있는 알콜의 보호에 있다. 이러한 보호 반응식은 유기 합성에서 일반적으로 부닥치는 문제이며, 여기서 제1 작용기는 분자 상으 다른 곳에 위치하는 제2 작용기(유사하고/하거나 동일함)를 위해 의도하는 반응에 의하여 의도하지 않게 변형된다. 상기의 도식의 반응식을 수행하기 위해서는 제1 작용기가 보호기와 반응되고, 제2 작용기상에 원하는 반응이 수행되어야 하며, 그런 다음 보호기가 제1 작용기로부터 제거되어야 한다.
보호기는 유기합성 분야에서 잘 알려져 있고, 문헌(J. R. Hanson in Chapter 2, "The Protection of Alcohols," of the publication Protecting Groups in Organic Synthesis (Sheffield Academic Press, Sheffield, England, 1999), pp. 24-25)에 기재되어 있다. 핸슨은 히드록실기를 에스테르 또는 에테르로 전화하여 어떻게 보호할 것인가에 대하여 가르치고 있다. 아마도 아세테이트 에스테르가 히드록실기를 보호하기 위하여 화학에서 가장 일반적으로 사용되는 형태이다. 아세테이트기를 도입하기 위하여 사용될 수 있는 다양한 범위의 조건들이 있다. 이들 시약 및 용매는 아세트 무수물 및 피리딘; 아세트 무수화물, 피리딘과 디메틸아미노피리딘(DMAP); 아세트 무수화물 및 아세트산 나트륨; 아세트 무수화물과 톨루엔-p-술폰산, 염화아세틸, 피리딘 및 DMAP; 및 케톤을 포함하였다. DMAP가 무수화물로부터 높은 반응성 N-아실피리디늄의 형성 때문에 유용한 아실화 촉매이다.
본 발명의 한 양태에서, 시클로스포린 A(34)의 β-알콜은 화합물(34)와 아세틸 클로라이드, 에틸 아세테이트, 또는 이의 배합물과 반응시켜, 아세틸 시클로스포린 A(35) 화합물을 형성하여 아세테이트로서 보호된다. 다른 양태로서, β-알콜은 아세트 무수화물에 친핵 첨가반응을 일으켜 아세틸 시클로스포린 A (35) 및 아세트산을 형성한다. 이러한 반응은 과량의 아세트 무수화물이 용매로서 작용하는 디메틸아미노피리딘(DMAP)의 존재하에서 수행될 수 있다. 이들의 경우에 접두사 "아세틸"은 합성경로를 통한 명명법에서 또는 아세틸기가 제거될 때까지 사용될 수 있다. 예를 들면, β-탄소에서 아세틸기를 갖는 하나의 경로에서 최후의 중간체는 "아세틸-(E)-1,3-디엔"으로 불리게 된다.
비록 아세틸 시클로스포린 A의 제조가 문헌에 잘 정립되었다하더라도, 아세테이트 에스테르이외의 보호기를 사용하여 시클로스포린 A(34)의 1-아미노산 잔기의 β-알콜을 보호하는데 사용될 수 있다는 것을 당해분야의 숙련가는 이해할 것이다. 이러한 보호기는 벤조에이트 에스테르, 치환된 벤조에이트 에스테르, 에테르, 및 실릴 에테르를 포함할 수 있다. 특정한 반응 조건하에서, 아세테이트 보호기는 제거와 가수분해와 같은 바람직하지 못한 부반응을 일으키는 경향이 있다. 벤조에이트 에스테르, 에테르, 및 실릴 에테르가 이들과 동일한 반응 조건하에서 이러한 부반응에 종종 더욱 내성이 있기 때문에, 아세테이트 대신에 이러한 보호기를 사용하는 것이 종종 유리하다. 아세틸기 또는 특정한 다른 보호기에 의하여 보호되어지는 시클로스포린 또는 시클로스포린 유도체는 "보호-시클로스포린 A"로 언급될 것이다. 마찬가지로, 상기에서 언급한 예시 경로에서 긍극적인 중간체는 "아세틸-(E)-1,3-디엔"대신에 "보호-아세틸-(E)-1,3-디엔"으로 언급될 것이다. 선택된 보호기의 특징은 연속 반응에서 추가적 단계의 원하는 경로에 영향을 줄 수 있다.
도 3에서 언급한 아세틸 시클로스포린 A(35)은 예시한 경로에서 보호 β-알콜을 가지며, 이러한 화합물은 수개의 합성 경로에서ISAtx247 이성체의 합성을 위한 전구체로서 작용한다. 우선 위티그 반응경로를 설명할 것이다.
위티그 반응을 통한 ISAtx247의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물의 합성
여기서 예시된 위티그 반응 경로는 도 3에서 참고번호(31)에 의하여 확인된다. 방법 1은 브롬 중간체인 아세틸-η-브로모시클로스포린(41)을 통하여 진행되는 반면에, 방법 2는 출발점에서 아세틸 시클로스포린 A 알데히드(51)를 이용한다. 하기에서 기술한 예시 방법은 입체 화학적 배열의 혼합물에 알켄 작용성을 도입하기 위하여 위티그 반응을 이용한다.
ISAtx247의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 합성하기 위하여 본 명세서에 개시된 예시 양태에서 사용된 위티그 반응은 할로겐화 리튬의 존재하에서 선택적으로 수행될 수 있다. 위티그 반응에서 할로겐화 리튬의 존재는 생성된 기하학 이성체의 비율에 영향을 준다고 잘 알려져 있으므로, 이러한 화합물의 첨가는ISAtx247의 (E) 및 (Z)-이성체의 원하는 혼합물을 제조하는데 도움을 줄 수 있다.
방법 1
본 발명의 한 양태에서, ISAtx247의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물은 도 4에 나타낸 바와 같이 제조된다. 도 4에 파동선의 사용(특히 화합물(43)과 (44) 참조)은 예시된 연속 반응이 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 생성시킨다는 것을 표시하기 위한 것이다. 한 양태에서, 생성된 (E) 대 (Z)-이성체의 백분율은 약 10 내지 90%의 (E)-이성체 대 약 90 내지 10%의 (Z)-이성체의 범위 내일 수 있지만, 이러한 범위는 단지 예시에 불과하고, 많은 다른 범위가 가능하다. 예를 들면, 혼합물은 약 15 내지 85%의 (E)-이성체 대 약 85 내지 15%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있다. 다른 양태로서, 혼합물은 약 25 내지 75%의 (E)-이성체 대 약 75 내지 25%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있다. 다른 양태로서, 혼합물은 약 35 내지 65%의 (E)-이성체 대 약 65 내지 35%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있다. 다른 양태로서, 혼합물은 약 45 내지 55%의 (E)-이성체 대 약 55 내지 45%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있다. 또 다른 양태로서, 이성체 혼합물은 약 45 내지 55%의 (E)-이성체 및 약 55 내지 45%의 (Z)-이성체를 함유하는 ISAtx247 혼합물이다. 여기서 중량%는 조성물의 총량을 기준으로 하는 것이며, (E)-이성체와 (Z)-이성체의 중량%의 합은 100%이다. 다른 말로 하면, 혼합물은 65%의 (E)-이성체와 35%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있고, 그 역으로도 가능하다.
도 4에서, 아세틸-시클로스포린 A의 1-아미노산 잔기의 측쇄의 말단 η-탄소는 아세틸-시클로스포린 A(35)를 N-브로모숙신이미드 및 아조-비스-이소부티로니트릴과 함께 사염화탄소과 같은 용매의 존재하에서 환류하여, 중간체인 아세틸-η-브로모시클로포린 A(41)을 제조하므로써 반응의 다음 단계에서 브롬화된다. N-브로모숙신이미드는 알릴 수소를 브롬으로 치환하는데 종종 사용하는 시약으로서, 이는 자유라디칼 메카니즘에 의하여 그렇게 진행된다고 믿고 있다. 중간체(41)의 제조는 다음 문헌(M. K. Eberle and F. Nuninger in "Synthesis of the Main Metabolite (OL-17) of Cyclosporin A," J. Org. Chem., Vol. 57, pp. 2689-2691 (1992))에 실질적으로 기재되어 있다.
신규한 중간체인 아세틸 시클로스포린 A의 트리페닐포스포늄 브로마이드(42)는 아세틸-η-브로모시클로스포린 A(41)로부터 제조될 수 있는데, 이러한 화합물을 톨루엔과 같은 용매의 존재하에서 트리페닐포스핀과 함께 가열하여 제조될 수 있다.
신규한 중간체(42), 및 이와 유사한 다른 것들도, 1-아미노산 잔기내에 짝 디엔계(conjugated diene system)를 함유하는 다수의 시클로스포린 A 유사체의 합성에서 중요한 중간체로 간주되고 있다. 예를 들면, 트리페닐포스핀외에도, 트리아릴포스핀, 트리알킬포스핀, 아릴알킬포스핀, 및 트리아릴아르신과 같은 화합물은 아세틸-η-브로모시클로스포린 A(41)과 반응하여 화합물(42)과 유사한 다른 활성화합물을 제조할 수 있다.
도 4에서, 아세틸 1,3-디엔의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물(43)은 아세틸 시클로스포린 A의 트리페닐포스포늄 브로마이드(42)를 실온에서 톨루엔중의 과량의 포름알데히드와 함께 교반하여 제조될 수 있다. 포름알데히드의 첨가에 이어서, 수산화나트륨과 같은 염기를 적가하여 디엔의 이성체 혼합물을 에틸 아세테이트로서 추출하였다.
수많은 유기화학 책에 위티그 반응에 관하여 기술되어 있다. 특히 언급하는 것은 다음 책(J. McMurry, Oganic Chemisty, 5th Ed. (Brooks/Cole, Pacific Grove, 2000), pp. 780-783)이다. 위티그 반응은 케톤 또는 알데히드를 알켄으로 전환시키기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 반응에서, 포스포러스 일라이드(phosphorus ylide) 또는 포스포란이라고 불리는 것은 케톤 또는 알데히드와 반응하여 베타인으로 불리는 이중극성 중간체를 얻을 수 있다. 일반적으로 베타인 중간체는 분리되지 않기 보다는, 오히려, 4-원 고리를 통하여 자발적으로 분해되어 알켄과 트리페닐포스핀 옥사이드를 생성하는 것이다. 정미적 결과는 원래 인에 결합된 R2C=기에 의하여 카르보닐 산소 원자의 치환이다.
당해 분야의 숙련가는 상기에서 인용된 예시적인 위티그 반응 시약대신에 아주 다양한 시약을 대체할 수 있다는 것은 이해할 것이다. 예를 들면, 수많은 알킬, 아릴, 알데히드, 및 케톤 화합물을 포름알데히드대신에 사용하여 매우 많은 시클로스포린 유도체를 제조할 수 있다. 출원인은 포름알데히드로 상기 합성을 수행하였으며, 포름알데히드 대신에, 아세트알데히드, 중수소화 포름알데히드, 중수소화 아세트알데히드, 2-클로로 벤즈알데히드, 및 부티르알데히드와 같은 화합물을 사용하였다. 이러한 위티그 반응은 트리페닐포스포늄 유도체외에도, 트리아릴포스핀, 트리알킬포스핀, 아릴알킬포스핀 및 트리아릴아르신과 같은 화합물과 함께 수행될 수 있다. 수산화나트륨을 사용하는 대신에, 탄산나트륨, 부틸리튬, 헥실리튬, 나트륨 아미드, 리튬 디이소프로필아미드와 같은 리튬 장애 염기, 및 알칼리금속 알콕시드와 같은 다양한 다른 염기를 사용할 수 있다. 이러한 시약을 변화시키는 외에도, 반응은 다양한 염, 특히 할로겐화 리튬의 존재하에서, 다양한 온도에서 여러 가지 유기용매 또는 유기용매와 물의 혼합물 하에서 수행될 수 있다. 상술한 모든 인자들은 형성된 이중결합의 입체화학에 바람직한 효과, 즉 시스 내지 트랜스-이성체의 비율에 바람직한 효과를 주는 방향에서 당해분야의 숙련가에 의하여 적당하게 선택되어질 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 위티그 반응은 테트라히드로푸란 및 톨루엔으로 구성된 군으로부터 선택된 용매의 존재하에서 수행되며, 이러한 용매는 부틸리튬, 나트륨 저급 알콕사이드, 칼슘 저급 알콕사이드, 및 탄산염을 포함하는 군으로부터 선택된 화합물의 존재하에서 약 -80℃ 내지 110℃ 범위의 온도에서 사용되었다. 칼륨 저급 산화물은 칼륨-t-부톡사이드이다. 더욱이, 칼륨-t-부톡사이드의 존재하에 약 -70℃ 내지 -100℃ 범위의 온도에서 사용되는 용매는 테트라히드로푸란이다.
이러한 합성의 마지막 단계에서, β-탄소상의 보호기는 다음의 방법을 사용하여 제거된다. 아세틸-(E)-1,3-디엔 및 아세틸-(Z)-1,3-디엔의 혼합물(43)을 메탄올에 용해시킨 다음, 물을 첨가하였다. 탄산칼륨과 같은 염기를 첨가하고, 실온에서 반응혼합물을 교반하였다. 사용될 수 있는 탄산칼륨이외의 염기는 수산화나트륨, 탄산나트륨, 나트륨 알콕사이드, 및 칼륨 알콕사이드를 포함하였다. 이어서 에틸 아세테이트를 사용하여 ISAtx247의 (E) 및 (Z)-이성체의 최종 혼합물(44)을 추출하였다.
방법 2
위티그 반응 전략에 의하여 ISAtx247의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 합성하기 위한 다른 반응 경로에 따르면, 다음과 같은 4단계의 합성 경로를 사용할 수 있다: 1) 방법 1에서와 같은 3-알콜의 보호; 2) 제1 단계로부터 제조된 아세틸-시클로스포린 A를 산화시켜 알데히드의 제조; 3) 위티그 반응; 및 4) 위티그 반응 생성물의 탈아세틸화(de-acetylation) 또는 동등하게, 아세테이트 에스테르의 가수분해로 알콜의 회수. 이러한 반응 과정은 도 5에 나타내었다.
이러한 합성 경로는 제 1단계를 아세테이트 에스테르기로 β-알콜을 보호하는 도 4의 위티드 반응 경로와 유사한 방법으로 시작하였다. 그러나 방법 2의 다음 단계는 아세틸-시클로스포린 A(35)를 알데히드, 아세틸-시클로스포린 A 알데히 드(51)로 전환시킨다는 점에서 두 경로는 차이가 있다. 이 반응은 충분하게 강한 산화제를 사용하여 C=C 결합을 절단하여 2개의 물질을 생성한다. 알켄의 절단은 당해 분야에서 알려져 있다. 오존은 아마도 이중결합 절단 시약으로 가장 일반적으로 사용되는 것이지만, 과망간산칼륨(KMnO4) 또는 사산화오스뮴과 같은 다른 산화제도 마찬가지로 이중결합을 절단시킬 수 있다.
본 발명의 한 태양에 따르면, 아세틸-시클로스포린 A는 산화제로서 오존으로 알데히드로 전환된 다음, 환원제로 처리하여 아세틸 시클로스포린 A 알데히드를 형성한다. 오존 분해단계는 약 -80℃ 내지 0℃의 범위내에서 수행된다. 오존 분해과정에서 사용되는 용매는 메탄올과 같은 저급 알콜이다. 환원제는 트리부틸포스핀, 트리아릴포스핀과 같은 트리알킬포스핀, 트리에틸아민과 같은 트리알킬아민, 알킬아릴 설파이드, 티오설페이트 또는 디메틸설파이드와 같은 디알킬설파이드일 수 있다. 환원제로서 트리부틸포스핀을 사용할 경우, 당해 분야의 숙련가들은 해당 반응을 사용량으로 조절할 수 있음을 알 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 시클로스포린 A의 β 알콜은 트리메틸실릴 (TMS)기에 의하여 보호되며 산화제로서 오존을 사용하여 산화시킨 다음 환원제로 처리하면 TMS 시클로스포린 A 알데히드를 얻게 되었다. 오존분해 단계는 약 -80℃ 내지 0℃의 범위내에서 수행된다. 오존분해 동안에 사용되는 용매는 저급 알콜과 디클로로메탄의 혼합물일 수 있다. 환원제는 트리부틸포스핀, 트리아릴포스핀과 같은 트리알킬포스핀, 트리에틸아민과 같은 트리알킬아민, 알킬아릴 설파이드, 티오 설페이트 또는 디메틸설파이드와 같은 디알킬설파이드일 수 있다. 환원제로서 트리부틸포스핀을 사용할 경우, 당해 분야의 숙련가들은 해당 반응을 사용량으로 조절할 수 있음을 알 것이다.
또한, 시클로스포린 A 알데히드는 아세틸 시클로스포린 A를 형성한 다음, 아세틸 시클로스포린 A를, 아세톡시아테톤 또는 디아세톡시아세톤과 같은 케톤의 존재하에서 모노퍼설페이드, 바람직하게는 오존으로 아세틸 시클로스포린 A 에폭사이드로 전환시킴으로써 시클로스포린 A의 β-알콜을 보호하여 제조될 수 있다. 이러한 단계는 아세토니트릴과 물과 같은 반응 조건하에서 불활성인 유기용매의 존재하에서 수행된다. 에틸렌디아민테르라-아세트산 이나트륨염을 가하여 존재할 수도 있는 특정한 중금속 이온을 포획한다. 에폭시화반응은 7이상의 pH에서 수행하는 것이 바람직하다. 이러한 에폭시화반응에 이어서 산성 조건하에서 과요오드산 또는 과요오드산염(periodate)으로 에폭사이드의 산화적 절단을 행하였다. 임의적으로, 산화 및 산화적 절단 과정을 추가 절차(workup)으로 결합시킬 수 있다. 이러한 반응들은 다음 문헌(Dan Yang, et al. , in "A C2 Symmetric Chiral Ketone for Catalytic Asymmetric Epoxidation of Unfunctionalized Olefins," J. Am. Chem. Soc., Vol. 118, pp. 491-492 (1996), and "Novel Cyclic Ketones for Catalytic Oxidation Reactions," J. Org. Chem., Vol. 63, pp. 9888-9894 (1998))에 논의되어 있다.
레테늄 기재 산화제의 사용은 다음 문헌(H. J. Carlsen et al. in "A Greatly Improved Procedure for Ruthenium Tetroxide Catalyzed Oxidations of Organic Compounds," J. Org. Chem., Vol. 46, No. 19, pp 3736-3738 (1981))에 논의되어 있다. 칼센 등은 역사적으로, 루테늄 금속의 비용은 촉매 작용의 발달을 위하여 자극이 되었고, 여기서 가장 인기있는 것은 화학양론적 산화제로서 과요오드산염(periodate) 또는 하이포클로라이트를 사용하는 것이라고 가르치고 있다. 이들 개발자들은 루테늄의 통상적 사용에 의하여 반응과정동안에 촉매활성의 손실을 발견하였는데, 이들은 이를 카르복실산의 존재에 기인하기 때문에 자명하다고 생각하였다. 반응혼합물에 니트릴, 특히 아세토니트릴의 첨가는 CCl4/H2O/IO4 - 시스템내에서 알켄의 산화적 절단의 속도와 정도를 상당하게 높인다는 것을 밝혀내었다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 아세틸 시클로스포린 A 알데히드(51)는 아세틸 시클로스포린 A(35)를 아세토니트릴과 물의 혼합물에 용해시킨 다음, 우선 과요오드산 나트륨에 이어서 염화 루테늄 수화물을 첨가하여 아세틸 시클로스포린 A(35)로부터 제조될 수 있다. 알데히드(51)는 에틸 아세테이트에 의하여 추출될 수 있다. 이러한 산화적 절단 전략에 의한 알데히드(51)의 합성은 하기에서 논의될 많은 입체특이적 경로에서 중요하다는 것을 주지하여야만 하며, 따라서 이 부분에 대해서는 후술하는 내용을 참고
따라서 시클로스포린 A 알데히드는 아세틸 시클로스포린 A를 형성한 다음, 아세틸 시클로스포린 A를 케톤의 존재하에, 바람직하게는 아세톡시아테톤 또는 디아세톡시아세톤과 같은 활성화된 케톤의 존재하에서 모노퍼설페이드, 바람직하게는 오존으로 아세틸 시클로스포린 A 에폭사이드로 전환시킴으로써 시클로스포린 A 의 β-알콜을 보호하여 제조될 수 있다. 이러한 단계는 아세토니트릴과 물과 같은 반응 조건하에서 불활성인 유기용매의 존재하에서 수행된다. 에틸렌디아민테르라-아세트산 이나트륨염을 가하여 존재할 수도 있는 특정한 중금속 이온을 포획한다. 에폭시화반응은 7이상의 pH에서 수행하는 것이 바람직하다. 이러한 에폭시화반응에 이어서 산성 조건하에서 과요오드산 또는 과요오드산염(periodate)으로 에폭사이드의 산화적 절단을 행하였다. 산화 및 산화적 절단 과정을 추가 절차로 결합시킬 수 있다. 이러한 반응들은 다음 문헌(Dan Yang, et al. , in "A C2 Symmetric Chiral Ketone for Catalytic Asymmetric Epoxidation of Unfunctionalized Olefins," J. Am. Chem. Soc., Vol. 118, pp. 491-492 (1996), and "Novel Cyclic Ketones for Catalytic Oxidation Reactions," J. Org. Chem., Vol. 63, pp. 9888-9894 (1998))에 논의되어 있다.
방법 2의 세 번째 단계는 알데히드(51)를 방법 1과 유사한 방법에 의하여 위티그 반응을 통하여 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물로 전화하는 과정을 포함하였다. 방법 1에서와 같이, 포스포러스 일라이드를 알데히드에 첨가하여 베타인(분리되지 않은 것)을 얻는데, 정미의 결과는 알데히드의 카르보닐 산소원자가 원래 인에 결합된 R2C=기에 의하여 대체된 것이다. 다시, 위티그 반응은 트리페닐포스포늄 유도체외에도, 트리아릴포스핀, 트리알킬포스핀, 아릴알킬포스핀 및 트리아릴아르신과 같은 인-함유 화합물과 함께 다양한 온도에서 수행될 수 있으며, 다양한 염기성 용액과 용매의 사용 또한 다양한 무기염의 첨가는 새롭게 형성된 이중결합의 입체화 학에 영향을 미치게 될 것이다.
한 양태에서, 아세틸 시클로스포린 A 알데히드(51)는 톨루엔에 용해된 다음, 여기에 수산화나트륨 수용액과 같은 염기를 가하였다. 이어서 알릴 트리페닐포스포늄 브로마이드(52)을 첨가한 다음, 몇 시간동안 반응을 교반하였다. 아세틸 (E) 및 (Z)-1,3-디엔의 생성 혼합물(53)의 추가 절차(workup)은 헥산 및/또는 에틸 아세테이트로 추출하는 과정을 포함하며, 여기서 '추가 절차'의 용어는 반응물, 생성물, 용매 등의 혼합물로부터 반응 생성물을 추출하고/하거나 분리하는 과정을 의미하는 것으로 사용한다.
방법 2의 마지막 단계에서, 방법 1의 마지막 단계와 유사하게, β-탄소 위치에 있는 알콜을 보호하는 아세테이트 에스테르기는 탄산칼륨으로 제거되어, ISAtx247의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물(54)을 수득한다. 보호기를 제거하기 위하여 사용되는 탄산칼륨이외 염기는 수산화나트륨, 탄산나트륨, 나트륨 알콕시드, 및 칼륨 알콕시드를 포함하였다.
유기금속 경로를 통한 ISAtx247(E) 및 (Z)-이성체 중 어느 하나가 풍부한 조성물의 합성
본 발명의 양태에 따르면, 입체특이적 합성 경로는 규소, 붕소, 티타늄, 황, 인 및/또는 리튬과 같은 원소를 함유하는 무기 시약의 사용에 의할 수 있다. 이러한 경로는 고리의 구성원소중의 하나가 유기금속 시약으로부터 온 무기 원소인 6-원 고리 전이 상태를 통하여 진행될 수 있다. 몇 가지 양태에서, 전이 상태와 관련 되는 입체 장애 효과는 반응의 입체화학 결과에 영향을 줄 수 있다.
2가지의 예시적 입체특이적 경로가 본 명세서에서 논의될 것이다. 첫 번째 입체특이적 경로(방법 3, 또한 도 3의 경로 32에서 보여준 것)에서, 규소-함유 화합물은 제거 반응이 진행되어 (E) 또는 (Z)-이성체가 형성되는데, 이는 제거 반응을 산성 또는 염기성 조건하에서 수행하였느냐에 좌우될 것이다. 이는 페터슨 올레핀반응의 한 예이다. 두 번째 입체특이적 경로(방법 4, 또한 도 3의 경로 33에서 보여준 것)에서, 이성체 중의 어느 하나는 다른 전구체로부터 제조된다. (Z)-이성체는 티타늄과 인-함유 중간체로부터 제조되는 반면에, (E)-이성체는 티타늄-함유 중간체로부터 제조된다.
방법 3
이러한 경로는 아세틸 시클로스포린 A 알데히드(51)를 통하여 진행된다.
유사한 반응 경로는 일반적으로 다음 문헌(D. J. S. Tsai and D. S. Matteson in "A Stereocontroller Synthesis of (Z) and (E) Terminal Dienes from Pinacol (E) - L-Trimethylsilyl-1-Propene-3-Boronate," Tetrahedron Letters, Vol. 22, No. 29, pp. 2751- 2752 (1981))에 논의되어 있다. 이러한 방법은 도 6에 나타내었다. 일반적으로, 합성은 트리메틸실릴알릴보로네이트 에스테르 시약(62)을 제조한 다음, 아세틸 시클로스포린 A 알데히드(51)를 시약(62)으로 처리하여 β-트리메틸실릴알콜(64)를 형성한다. 이러한 알콜은 붕소-함유 전이 상태(63)를 통하여 형성되는 것으로 믿어지고 있다. 보로네이트 에스테르는 알릴보레이션 (allylboration) 반응에서 서서히 반응하기 때문에, E-γ-트리메틸실릴 디에틸보란 또는 9-(E-γ-트리메틸실릴알릴)-9-BBN과 같은 더 빠른 반응 보란 시약을 사용하는 것이 유리하다는 것은 당해분야의 숙련가는 이해할 것이다. 이어서 β-트리메틸실릴 알콜(64)에 페터슨(peterson) 올레핀화 과정을 행하여 알켄, 이 경우에는 디엔(65) 또는 디엔(67)을 제조하였다.
알켄의 형성은 제거반응(올레핀화과정)을 산성 또는 염기성 조건하에서 수행하느냐에 따라 2개의 구별된 경로중의 어느 하나에 따를 것이다. 산성의 조건하에서 반-제거과정(anti-elimination)을 수행하면 (E)-이성체를 형성하는 반면에, 염기성의 조건하에서 시스-제거과정을 수행하면 (Z)-이성체를 형성한다. 이러한 합성 경로를 이용하여, 동일한 전구체로부터 어느 이성체라도 제조할 수 있다는 것을 당해분야의 숙련가는 이해할 것이다. 각각의 제거 반응의 생성물은 2개의 이성체 중에서 어느 하나가 풍부한 조성물을 함유한다. 한 양태에서, 풍부하다는 것은 조성물이 약 75중량% 이상의 하나의 이성체를 함유한다는 것을 의미한다. 다른 양태에서, 풍부한 조성물은 이성체 중에서 어느 하나를 80, 85, 및 90중량%를 함유할 수 있다. 이어서 하나의 이성체가 풍부한 조성물을 도 10에 예시한 바와 같이 원하는 혼합물에 도달하도록 예정된 비율로 배합시킬 수 있다.
이후에는 도 6의 반응을, 붕소-함유 시약(62)의 제조부터 시작하여 상세하게 설명할 것이다. 탄소-탄소 결합 형성 반응의 합성에서 규소 시약의 사용에 대한 일반적인 연구는 다음 문헌(E. Ehlinger and P. Magnus in "Silicon in Synthesis. 10. The (Trimethylsilyl) allyl Anion: A β-Acyl Anion Equivalent for the Conversion of Aldehydes and Ketones into γ-Lactones," Am. Chem. Soc., Vol. 102, No. 15, pp. 5004-5011 (1980))에 논의되어 있다. 특히, 이들 연구자들은 (트리메틸실릴)알릴 음이온과 알데히드간의 반응에 대하여 가르치고 있다. 음이온은 1 당량의 테트라메틸에틸렌디아민(TMEDA)을 함유하는 -76℃의 테트라히드로푸란중의 s-부틸리튬으로 알릴트리메틸시란을 탈양성자화(deprotonating)하여 제조될 수 있다.
알릴트리메틸시란의 탈양성자화(도 6에는 도시되어 있지 않음)에 대해서는 다음 문헌(J.-F. Biellmann and J.-B. Ducep in "Allylic and Benzylic Carbanions Substituted by Heteroatoms, Organic Reactions, Vol. 27 (Wiley, New York, 1982), p. 9)에 논의되어 있다. 치환된 알릴계내의 이형원자상의 양성자 알파는 높은 염기성제로 제거될 수 있다. 이러한 염기성제는 매우 다양하게 시판되고 있으며, 아마도 n-부틸리튬이 가장 일반적인 것이다. n-부틸리튬은 테트라히드로푸란(THF)의 용액중에서 금속화되는 화합물과 함께 화학양론적 양으로 사용되었다. 온도는 n-부틸리튬이 중합체 성질 때문에 낮은 반응성을 갖는 보통 0℃이하(종종 -76℃ 미만)로 유지된다. N, N, N', N'-트리메틸렌에틸렌디아민 (TMEDA)와 같은 킬레이팅제의 첨가는 중합체를 분해시키게 된다. 그러나 TMEDA의 부재하에서 조차도, 반응을 실온에서 행할 수 있다.
발생하는 음이온은 인접 이중결합과의 콘쥬케이션을 통해서 뿐만 아니라, 이웃하는 실릴기에 의해서도 안정화되기 때문에 알릴실란은 쉽게 탈양성자화 된다. 음이온은 α-탄소 또는 γ-탄소(여기서 "γ"는 감마를 의미함)를 통하여 친핵물질 과 반응할 수 있다. 이러한 반응들의 부위화학(regiochemical) 및 입체화학 결과는 여러 가지 요인들에 의하여 좌우될 것이며, 이들 중에 가장 중요한 것은 상대이온의 일치일 것이다. 알릴실란의 논의는 다음 문헌(S. E. Thomas in Organic Synthesis: The Roles of Boron and Silicon (Oxford University Press, New York, 1991), pp. 84-87)을 참조하면 된다.
이러한 반응식에서, 탈양성자화된 알릴시란에 트리메틸보레이트에 의하여 전자친핵 포획 과정(electrophilic capture)을 행하여 중간체를 생성한 다음, 피나콜과 반응시켜, 트랜스-(트리메틸실릴)보로네이트 화합물(62)을 얻었다. 보로네이트 화합물(62)은 또한 "알릴보란"(알릴보로네이트 에스테르)로 불릴 수도 있다. 다른 방안으로는, 만일 9-메톡시-9-디알킬보란을 전자친핵 포획물내에서 사용한다면, 붕소 트리플루오라이드 시약(예컨대 BF3Et2O)을 사용하여 탈메톡실화하여 상응하는 9-(γ-트랜스-트리메틸실릴알릴)-9-디알킬보란을 발생시킬 수 있는 보로네이트 착물로 이끌 수 있을 것이다.
알릴보란에 알데히드의 첨가반응은 상기 참고 문헌내의 34-35쪽에 에스. 이. 토마스에 의하여 논의되어졌다. 알릴보란이 탄소-탄소 이중결합의 말단(여기서 "말단"은 붕소 원자로부터 가장 멀리 떨어져 있다는 것을 의미함)에서 비대칭적으로 치환되는 알릴보란에 알데히드의 첨가반응은 2개의 인접하는 키랄 센터를 함유하는 호모알릴 알콜을 생성한다. (E)-알릴보란은 트레오-부분입체이성체를 이끌게 되는 반면에, (Z)-알릴보란은 에리트로-부분입체이성체를 이끌게 된다. (E)-알릴보 란(62)과 시클로스포린 A 알데히드(51)과의 반응예는 도 6에 나타내었고, 여기서 붕소 중간체(63)는 THF 용액 중에서 수일 동안 반응물을 교반한 후 형성된다.
붕소 중간체(63)내의 참고 번호(69)는 붕소의 위치에서 특정 개수의 구조가 가능하다는 것을 보여주기 위한 것이다. 예를 들면, 보로네이트 시약(62)이 트리알킬실릴알릴 보로네이트 에스테르일 경우에, (69)에서의 구조는 2개의 산소원자를 함유하는 5-원 고리를 포함할 수 있다는 것이다. (62)에서 사용된 보로네이트 또는 보란 시약상의 치환은 (63)내의 구조내에서 존재할 것이다.
알킬보란과 알데히드를 포함하는 반응에서 달성되는 입체특이성은, 도 6에서 나타낸 바와 같이, 붕소 중간체(63)에 의하여 예시된 6-원 고리 사슬형 전이 상태에 기인할 수 있다고 당연히 간주되고 있다. 알데히드의 2개의 카르보닐 원자(이중결합을 하는 탄소와 산소)만이 6-원 고리 전이의 구성물이 되며; 알데히드의 나머지는 고리 밖으로 연장된다. 6-원 고리의 외부로 연장된 알데히드의 CsA 부분은 고리와 관련하여 축 위치보다는 적도 위치에서 존재하는 것으로 간주되는데, 그 이유는 축 배열이 알릴보란(62)의 치환기와 산소원자 간의 바람직하지 못한 입체 장애를 일으키기 때문이다. (트리에틸실릴)알릴 음이온으로부터의 SiMe3기의 위치는 이의 예시물이 알릴보란의 (E)-부분입체이성체로 출발하였기 때문에 도 6에서 적도 위치를 차지할 것이라고 당해분야의 숙련가는 이해할 것이다. 이에 반하여, 출발 물질 알릴보란이 (Z)-부분입체이성체일 경우에는 SiMe3기는 축 위치에 차지할 수 있을 것이다.
다시 말해, 에리트로-실릴 알콜을 제조하는 경우, 상술한 제거 반응과 반대의 방법으로 산 제거는 시스-이성체를 야기하고 염기 제거는 트래스-이성체를 야기할 수 있다고 예상된다.
전이 상태 생성물(63)을 트리에탄올아민로 처리하여 트리메틸실릴 알콜(64)을 얻었다. 반대로, (트리메틸실릴알릴)디알킬 보란의 알릴보레이션 생성물은 NaOH/H202를 사용한 산화 또는 수성 추가 절차에 의하여 실릴 알콜(64)을 얻었다. 도 6에 나타낸 알콜(64)는, 전이 상태 알릴보란(63)이 (E)-배열이기 때문에, 트레오-부분 입체이성체이지만, 만일 Z-알릴보란 시약으로부터 출발하면 다른 부분 입체이성체가 제조될 수 있다는 것을 당해분야의 숙련가는 이해할 것이다. 새롭게 형성된 키랄 세터내의 부분 입체특이성은 합성의 나중 단계에서 이들 키랄 센터의 제거 때문에 이 단계에서 종결되지 않는다. 도 6에서 보여준 β-트리메틸실릴 알콜(64)의 구조는 분광 기술을 사용하여 출원인에 의하여 확인된 바 있다.
페터슨 올레핀과정으로 알려진 알켄 합성법에서, β-트리메틸실릴 알콜(64)로부터 트리알킬실릴기 및 히드록시기의 제거는 알켄으로 이끌 수 있고; 이 경우에 사슬의 2개의 말단 탄소사이에 이미 존재하는 이중결합에 의하여 디엔으로 될 것이다. β-히드록시실란을 알켄으로 전환하는 과정은 에스. 이. 토마스 참고문헌 제68-69페이지에 논의되어 있다. 이러한 반응의 추가적인 논의는 다음 문헌(P. F. Hurdlik and D. Peterson in "Stereospecific Olefin-Forming Elimination Reactions of β-Hydroxysilanes," J. Am. Chem. Soc. Vol. 97, No. 6, pp. 1464- 1468 (1975))에 있다.
도 6에서, 알콜(64)을 디엔으로 전환시키는 제거 반응은 반응이 산성 또는 염기성 조건하에서 수행되느냐에 따라 좌우되는 2개의 구별된 메카니즘 경로중의 하나를 따를 것이다. 하나의 경로는 디엔(65)으로 이끌 것이고, 다른 경로는 디엔(67)으로 이끌 것이다. 산성 조건하에서는, 반-제거(anti-elimination)가 일어날 것이고, 염기성 조건하에서는 합성-제거(syn-elimination)가 일어난다. 다른 말로 하면, β-히드록시실란의 제거 반응은 입체특이성이 있으나, 산성- 및 염기성-촉진 반응은 반대의 입체화학 과정을 취한다. 산성- 및 염기성-촉진 반응을 위한 전형적인 산은 아세트산, 황산 및 다양한 루이스산을 포함할 수 있으나, 전형적인 염기는 수소화나트륨 및 수소화칼륨 또는 칼륨 t-부톡사이드를 포함하였다. THF중의 수소화나트륨을 사용한 제거반응은 실온에서 서서히 일어나는 반면에, 수소화칼륨을 사용한 제거반응은 더욱 용이하게 일어나는 경우가 될 것이다.
산성 조건하에서 제거반응은 앤티페리플레너(antiperiplanar) 관계에 있는 트리메틸실릴 및 히드록시기를 요구하기 때문에, 이러한 반응경로의 단계에서는 입체특이성이 일어난다. 반면에, 염기성 조건하의 제거반응은 트리메틸실릴 및 히드록시기가 신페리플레너(synperiplanar) 관계를 이루도록 요구한다. 후자의 조건은 강한 규소-산소 결합의 형성 및 4-원 고리 중간체에 이용되며, 이들은 위티드 반응의 마지막 단계와 유사한 방법으로 절단된다. 강한 규소-산소 결합은 약한 규소-산소 결합으로 대체가 가능하므로, 강한 규소-산소 결합을 약한 규소-산소 결합으로의 대체 과정을 무시하는 것은 당해분야의 숙련가는 이해할 것이다.
따라서 β-히드록시 알킬실란의 입체특이성 제거 생성물은 아세틸-(E)-1,3-디엔 화합물(67)과 아세틸-(Z)-1,3-디엔 화합물(65)이다. 전 방법에서와 같이, 지금은 메탄올과 물중의 K2CO3 로 처리하여 이들 디엔의 각각으로부터 보호기를 제거할 수 있다. 이는 1-아미노산 잔기의 β-탄소에 결합된 아세테이트기를 제거하는 것이며, 이들 탄소상의 작용기를 알콜로 환원시키는 것이다. 보호기를 제거하는데 사용될 수 있는 탄산칼륨이외의 염기는 수산화나트륨, 탄산나트륨, 나트륨 알콕시드 및 칼륨 알콕시드를 포함하였다.
이러한 제조 단계에서 합성은 실질적으로 완결된다. 이성체들 중 어느 하나 또는 다른 하나가 풍부한 조성물을 혼합하여 혼합물내의 이성체의 원하는 비율을 달성할 수 있다. "풍부하다"는 의미는 약 75중량%이상의 하나의 이성체를 함유하는 생성물을 뜻하며, 다른 말로 하면, 이러한 생성물은 25중량%미만의 원하지 않은 이성체를 함유할 수 있다. 혼합물을 계획하여 원하는 약리학적 결과를 달성하였다.
방법 4
이 경로 또한 아세틸 시클로스포린 A 알데히드(51)을 통하여 진행된다.
입체특이적 이성체의 제조를 위한 다른 반응도식은 도 7-8에 나타내었다. 이러한 합성경로는 1)ISAtx247의 (E)-이성체를 제조하기 위한 합성경로가 (Z)-이성체를 위한 경로와 다른 중간체를 통하여 진행되고; 2) 이들 합성경로는 티타늄 및 리튬-함유 시약 및/또는 중간체를 이용한다는 점에서 전에 논의하였던 경로와 구별된 다.
티타늄 시약은 유기 합성에서 특히 유용하다고 알려져 있는데, 그 이유는 이들이 알데히드와 케톤과의 반응에서 위치- 및 입체특이성을 갖기 때문이다. 입체특이적 화학에서 티타늄의 일반적 특성은 다음 문헌(M. T. Reetz in Organotitanium Reagents in Organic Synthesis (Springer-Verlag, Berlin, 1986), pp. VII, 148-149, and 164-165)에서 논의되어 있다. 이러한 문헌에서는 이러한 시약의 전자적 및 입체적 동일성이 조작될 수 있으며, 많은 C-C 결합 형성 반응의 입체화학적 결과가 예견될 수 있으므로 티타늄 리간드의 성질은 변화될 수 있다고 주장하고 있다. 이러한 화학이론에 따르면, 아키랄 분자의 2개의 프로키랄 중심의 결합이 키랄성의 2개의 중심을 형성한다. 입체특이적 결과를 지배하는 일반적인 법칙은 Z-배열 에놀레이드(enolates) 또는 크로틸(crotyl) 금속 화합물은 바람직하게 합성-부가물(syn-adducts)을 형성하는 반면에, E-배열 시약은 안티-부분입체이성체에 적당하다는 것이다. 이러한 경향은 의자 기하학 형상을 갖는 6-원 고리 전이 상태에 의하여 설명될 수 있다.
이러한 형태의 입체특이적 합성의 특정예는 다음 문헌(Y. Ikeda et al. in "Stereoselective Synthesis of (Z)-and (E)-1,3-Alkadienes from Aldehydes Using Organotitanium and Lithium Reagents, " Tetrahedron, Vol. 43, No. 4, pp. 723-730 (1987))에서 논의되어 있다. 이러한 참고 문헌에는 알릴디페닐포스핀을 사용하여 [3-(디페닐포스피노)알릴]티타늄 시약을 생성할 수 있으며, 이어서 이는 알데히드와 축합된 다음 포스포늄염 형성을 행하면 높은 위치- 및 입체특이적 경로에 의 해 (Z)-1,3-알카디엔을 얻을 수 있다고 개시되어 있다. 반면에, 리튬화(lithiated) 알릴디페닐포스핀 산화물은 알데히드와 축합되어 다시 원하는 입체특이성을 가지고 직접적으로 (E)-1,3-알카디엔을 얻을 수 있다.
도 7에서,ISAtx247의 (Z)-이성체의 합성은, 이전의 반응식에서와 같이, 시클로스포린 A(34)로부터 아세틸 시클로스포린 A 알데히드(51)를 발생시킴으로써 진행된다. [3-(디페닐포스피노)알릴]티타늄 시약(72)은 알릴디페닐포스핀(71)을 t-BuLi와 같은 염기에 의하여 탈양성자화한 다음, 생성물을 티타늄 테트라이소프로폭사이드와 반응시켜 제조된다. 전이 상태(73)는 이론적으로 에리트로-α-부가물(74)로 이어진다고 제안되며, 이는 부가물(74)을 이오도메탄(MeI)으로 처리하여 β-옥사이드포스포늄 염(75)으로 전환될 수 있다. 전이 상태(73)의 존재가 적어도 부분적으로 이러한 합성 경로의 입체특이성에 책임이 있는 것으로 간주되고 있다.
앞에서 개시된 예시 방법에 따라, 유기금속 시약의 금속 위치가 위치선택성을 조절하는 본질일 수 있다(Ikeda, p. 725). 이는 도 7의 알데히드(51)가 α-위치에서 디페닐포스피노 화합물(72)과 반응하여 상응하는 α-부가물(74)을 얻게된다는 것을 의미하며, 그 이유는 디페닐포스피노기의 γ-탄소는 금속(이 경우에는 티타늄이다)과 배위결합하기 때문이다. 디엔 생성물의 관찰되는 Z 선택성은 6-원 전이 상태(73)를 고려하여 설명된다. 알데히드(35)의 벌크성 시클로스포린 A 측쇄 및 디페닐포스피노기는 모두 전이 상태에서 적도상 위치를 점하는 것으로 당연히 간주되기 때문에, 에리트로 α-부가물(74)은 선택적으로 형성되어 (Z)-1,3-디엔(76)을 야기한다.
ISAtx247의 (Z)-이성체가 티타늄 전이 상태를 통하여 생성되는 도 7에 나타낸 반응 경로와 대조적으로, (E)-이성체는 이러한 방법에 의하여 쉽게 생성되지 않는다. 대신에, 도 8에서 보여주는 바와 같이, 리티오 유도체(82)가 알데히드(51)와 반응하여 리튬 함유 전이 상태(83)를 생성시킬 수 있으며, 이는 E/Z비율이 약 75:25이상의 범위내인 1,3-디엔을 형성한다. 도 7에서와 같이, 반응 생성물의 높은 입체특이성은 전이 상태(83)에 기인할 가능성이 있으며, 여기서, 리튬 시약(82)의 비닐기 및 알데히드(51)의 시클로스포린 A 측쇄는 적도상에 위치할 것이 자명하므로, 입체특이적 방법으로 (E)-1,3-디엔을 생성한다. 상술한 바와 같이, 아세테이트 보호기를 포함하는 특정한 바람직하지 못한 부반응은 벤조에이트 에스테르 또는 실릴 에테르와 같은 보호기의 사용을 통하여 모든 입체특이적 합성에서 피할 수 있을 것이다.
혼합물의 제조
상술한 바와 같이, ISAtx247의 시스와 트랜스-이성체의 혼합물은 자연적으로 발생하고 현재 알려진 시클로스포린보다 높은 잠재력 및/또는 감소된 독성의 복합성을 보여준다는 것을 밝혀내었다.
본 발명의 양태에 따르면, ISAtx247 이성체(및 이의 유도체)는 입체특이도에 따라 변할 수 있는 입체특이적 경로에 의하여 합성된다. 입체특이적 경로는 제1 물질 또는 (E)-이성체가 풍부한 조성물을 제조하고, 제2 물질 또는 (Z)-이성체가 풍부한 조성물을 제조한 다음, 이들 물질은 얻어진 혼합물이 원하는 비율의 두 이성 체를 갖도록 혼합되어질 수 있다. 다른 방법으로는, 제1 물질을 반응생성물로부터 분리하여 (E)-이성체가 풍부하게 만들 수 있으며, 제2 물질을 반응생성물로부터 분리하여 (Z)-이성체가 풍부하게 만들 수 있다는 것을 이해할 것이다. 다른 양태로서, 입체특이적 경로의 반응조건을 조절하여 제조된 혼합물내에 직접 원하는 비율을 맞출 수 있다.
이들 원리는 도 9A 내지 C, 및 도 10에 나타내었다. 도 9A 내지 C에서, 3개의 가상적 합성 반응은 (E) 대 (Z)-이성체의 비율이 각각 약 65:35중량%, 50:50중량%, 및 35:65중량%가 되도록 제조되는 것을 보여주는 것이다. 물론, 이들 비율은 단지 예시 목적으로 제시한 것이며, 특정한 가상의 숫자 조합도 선택가능할 것이다. 도 9A에 나타낸 비율을 달성하는데 사용되는 반응조건은 생성 혼합물내의 이성체의 다른 비율을 달성하기 위하여 도 9B와 9C의 반응조건과 다를 수 있다는 것은 당해업계의 숙련가는 당연히 이해할 것이다. 각각의 반응조건을 맞추어 각각의 경우에 대한 2개의 이성체의 특정 비율을 얻을 수 있었다.
이성체의 혼합물이 생성되는 몇 개의 합성경로와 대조적으로, 이성체들을 우선 개별적으로 제조한 다음, 예정된 비율로 혼합하여 원하는 비율을 달성할 수도 있다. 이러한 개념은 도 10에 나타내었는데, 여기서 하나의 입체특이적 경로의 생성물은 약 75중량%이상의 (E)-이성체를 포함하도록 하나의 이성체만이 풍부한 것이고, 다른 입체특이적 경로의 생성물은 약 75중량%이상의 (Z)-이성체를 포함하도록 다른 이성체가 풍부한 것이다. 이들 숫자도 역시 예시를 위한 것이며, 입체특이적 경로로부터 얻어진 원하는 이성체의 순도는 한 양태로서 약 75중량% 이상일 수 있 다. 다른 양태로서, 원하는 이성체는 각각 약 80, 85, 및 95중량%이상일 수 있다.
개별적으로 이성체를 합성한 후, 이들을 혼합하여 도 10에 예시한 바와 같이, 원하는 비율을 달성할 수 있다. 예시적 목적을 위하여, 도 9A 내지 9C에 사용된 바와 같이 도 10에서도 동일한 가상적 비율을 선택하였다. 도 10에서, (E) 및 (Z)-이성체를 혼합하여 (E) 대 (Z)-이성체의 비율이 각각 약 65:35중량%, 50:50중량%, 및 35:65중량%인 3개의 다른 혼합물을 얻었다.
또 다른 양태에서, ISAtx247의 (E) 대 (Z)-이성체의 혼합물은 혼합물이 하나의 이성체가 다른 이성체보다 풍부하게 되도록 분리될 수도 있다. 예를 들면, 디엘-알더 반응을 이용하여 시스-이성체를 알켄과 반응시켜 이를 폐환 화합물로 전환시킬 수 있다. 만일 알켄이 분리될 수 있는(즉, 여과될 수 있는) 기질과 결합되면, 시스- 이성체를 혼합물로부터 실질적으로 제거하여, 트랜스-이성체가 풍부한 조성물을 얻을 수 있다. 시스-이성체는 열을 가하여 폐환 화합물로부터 재치환하여 시스-이성체가 풍부한 조성물을 얻을 수 있다. 따라서 이러한 방법으로, 시스 및 트랜스- 이성체를 분리할 수 있다.
실제로, 특정한 혼합물내의 (E) 대 (Z)-이성체의 비율은, 제조되어지는 방법의 입체특이도에 무관하게, 넓은 범위의 수치를 택할 수 있다. 예를 들면, 혼합물은 약 10 내지 90%의 (E)-이성체 대 약 90 내지 10%의 (Z)-이성체를 포함할 수 있다. 다른 양태로서, 혼합물은 약 15 내지 85%의 (E)-이성체 대 약 85 내지 15%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있거나; 약 25 내지 75%의 (E)-이성체 대 약 75 내지 25%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있거나; 약 35 내지 65%의 (E)-이성체 대 약 65 내지 35%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있거나; 약 45 내지 55%의 (E)-이성체 대 약 55 내지 45%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있다. 또 다른 양태로서, 이성체 혼합물은 약 45 내지 55%의 (E)-이성체 및 약 55 내지 45%의 (Z)-이성체를 함유하는 ISAtx247 혼합물이다. 여기서 중량%는 조성물의 총량을 기준으로 하는 것이며, (E)-이성체와 (Z)-이성체의 중량%의 합은 100%이다. 다른 말로 하면, 혼합물은 65%의 (E)-이성체와 35%의 (Z)-이성체를 함유할 수 있고, 그 역으로도 가능하다.
혼합물내의 하나의 이성체 또는 다른 이성체의 %는 핵자기공명(NMR), 당해분야에서 잘 알려진 다른 기술에 의하여 확인될 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명은 활성 성분으로서 본 발명의 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물의 투여를 포함하는 면역억제가 필요한 환자를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 관심이 대상이 되는 적응 질병은 예를 들면, 하기의 치료(질병인자 또는 증상의 개선, 감소, 제거 또는 치료)이거나 방지(실질적이거나 완전한 억제, 예방 또는 회피)를 위해 특히 자기면역과 소염 상태 및 이식 거부와 관련되거나 무관한 상태를 포함한다:
(a) 예를 들면, 심장, 폐, 병합된 심장-폐, 간, 신장, 췌장, 피부, 장, 또는 각막 이식의 수용자의 치료, 특히 다음의 뼈 골수 이식과 같은 이식편대숙주 질병 뿐만 아니라, T-세포 매개 거부의 예방 및/또는 치료와 관련한 급성 기관 또는 조직 이식 거부.
(b) 이식된 기관의 만성적 거부, 특히 예를 들면 편근육세포 증식과 연관된 효과에 기인한 내막농후의 결과로서 조직이식의 동맥 협착에 의하여 특징 지워지는 이식혈관 질병의 예방.
(c) 기관공급자가 수용자와 다른 종일 경우에 발생하는 급성, 초급성 또는 만성 거부를 포함하는 이종이식 거부, 가장 특히 B-세포 또는 항체-매개 거부에 의하여 매개된 거부.
(d) 자기면역 질병 및 염증 상태, 특히 관절염 (예를 들면, 류마티스성 관절염, 만성 경과 관절염 및 변형 관절염) 및 기타 류마티스성 질병과 같은 면역학적 또는 자기면역 성분을 포함하는 질병원인학의 염증 상태. 본 발명의 상승 작용적인 배합을 사용할 수 있는 특정한 자기면역 질병은, 자기면역의 혈액장애(예를 들면, 용혈성 빈혈, 형성불능성 빈혈, 순적혈구 빈혈 및 특발성 혈소판감소증), 조직 낭창홍반, 다발연골염, 경질섬유종, 전신성혈관염(Wegener granulomatosis), 피부근염, 만성활성간염, 근무력증, 건선, 스티브-존슨 증상(Steven-Johnson syndrome), 특발성 장흡수부전증, (자기면역) 소염 장질병(예를 들면, 괘양성 재장염과 Crohn 질병의 포함), 내분비선 안염, 그래브 질병, 유사육종증, 다경화증, 주담즙 경변증, 초생 당뇨병(당뇨병 제1형), 포도막염(전방 및 후방), 각결막염과 초생 각결막염, 간질성 폐섬유증, 건선성 관절염, 사구체 신염(신절개 증상의 포함되거나 포함되지 않은, 예를 들면, 특발성 신결석 증상 또는 최소변화 신증을 포함함) 및 초생 피부근염을 포함하였다. 또한 본 발명의 상승 적용적인 배합을 사용하여 피부의 자기면역 및 소염증 상태도 치료 및 예방에 적용할 수 있으며, 피부의 자기면역 및 염증 상태는 건선, 접촉성 피부염, 아토피 피부염, 원형탈모증, 홍반, 포진상 피부염, 경질섬유종, 백반증, 과민성 혈관종, 두드러기, 수포성 천포창, 홍반성 낭창, 천포창, 표피수포증, 및 피부의 다른 염증성 또는 알러지성 상태를 포함하고, 천식, 알러지 및 진폐증을 포함하는 폐 및 기도의 염증 상태를 포함하였다.
본 발명의 이성체 유사체 혼합물은 필요한 혼혈동물에게 단독으로나 약제학적 캐리어와 함께 투여될 수 있다. 약제학적 캐리어는 고체이거나 액체일 수 있다. 본 발명의 혼합물은 통상적인 비독성 약제학적 허용 캐리어, 보조제, 및 부형제를 함유하는 1일 단위로 경구적으로, 국부적으로, 비경구적으로, 흡입스프레이에 의하여 또는 직장으로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "비경구"란 피하주사, 정맥내, 근육내, 자궁내 주사 또는 주입 기술을 포함하였다.
본 발명의 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물은 경구투여를 위해서는, 예를 들면, 정제, 트로키, 로젠지(합당정제), 수성이거나 유성 현탁액, 분산가능한 분제 또는 입제, 유탁액, 경질이거나 연질 캡슐, 또는 시럽이거나 엑시르가 적당한 형태이다. 경구 투여를 위한 조성물은 약제학적 조성물의 제조를 위해 당해 분야에서 알려진 방법에 따라 제조될 수 있으며 이러한 조성물은 세련되고 입에 맞는 제제를 제공하기 위해 감미제, 향미제, 색소제 및 방부제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 부가제를 함유할 수 있다. 약제학적으로 비독성의 허용 부형제와 혼합된 활성성분을 함유하는 정제는 또한 공지된 방법에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 부형제는 예를 들면, (1) 탄산칼슘, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨과 같은 불활성 희석제; (2) 옥수수 전분 또는 알긴산과 같은 입제 및 분해제; (3) 전분, 겔 라틴 또는 아카시아와 같은 결합제; 및 (4) 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 또는 활석과 같은 윤활제일 수 있다. 이러한 정제는 피복되지 않거나 또는 위장경로에서 분해 및 흡수를 지연시키기 위해 알려진 기술에 의하여 피복될 수 있으며 피복될 경우 장기간동안 지속적 작용을 제공한다. 예를 들면, 글리세릴 모노스테아레이드 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연물질이 사용될 수 있다. 또한 제한된 방출을 위하여 삼투성 치료정제를 제조하기 위하여, 미국 특허 제4,256,108호; 제4,160,452호; 및 제4, 265,874호에 기재된 기술에 의하여 피복될 수 있다.
몇 가지의 경우에, 경구 투여를 위한 제형은 활성 성분이 예를 들면 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 같은 불활성 고형 희석제와 혼합한 경질 젤라틴 캡슐의 형태일 수 있다. 또한 이들은 활성 성분이 물이나 예를 들면 땅콩 유, 액상 파라핀 또는 올리브유와 같은 유성 매질과 혼합한 연질 젤라틴 캡슐의 형태일 수 있다.
수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조를 위해 적당한 부형제와 혼합된 활성 물질을 일반적으로 함유한다. 이러한 부형제는 다음 물질을 포함할 수 있다: (1) 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 검 트라가칸스 및 검 아카시아와 같은 현탁제; 또는 (2) 렉시틴과 같은 자연적으로 발생하는 포스파타이드, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 스테아레이트와 같은 알킬렌옥사이드와 지방산과의 축합물, 예를 들면 헵타데카에틸렌옥시세탄올과 같은 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알콜과의 축합물, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트와 같은 에틸렌 옥사이드와 지 방산과 엑시톨로부터 유도된 부분 에스테르와의 축합물, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트와 같은 에틸렌 옥사이드와 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르와의 축합물일 수 있는 분산제 또는 습윤제.
수성 현탁액도 또한, 예를 들면, 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트와 같은 하나 이상의 방부제; 하나 이상의 색소제; 하나 이상의 향미제; 슈크로스, 아스파르탐 또는 사카린과 같은 하나 이상의 감미제를 포함할 수 있다.
유성 현탁액은 예를 들면 아라키스유, 올리스유, 참깨유 또는 코코넛유와 같은 식물성 오일, 오메가 3 지방산을 함유하는 생선 오일, 또는 액상 파라핀과 같은 무기 오일에 활성 성분을 현탁하여 제형될 수 있다. 이러한 유성 현탁액은 예를 들면 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜과 같은 농후제를 함유할 수 있다. 감미제 및 향미제는 입맛에 맞는 경구 제제을 제공하기 위하여 첨가될 수 있다. 이러한 조성물은 아스코스산과 같은 산화방지제의 첨가로 방부처리될 수 있다.
분산성 분제 및 입제는 수성 현탁액의 제조를 위하여 적당한다. 이들은 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 방부제와 혼합된 활성 성분을 제공한다. 적당한 분산제 또는 습윤제는 이미 상기에서 언급한 것으로 예시된다. 부가적인 부형제, 예를 들면, 상술한 감미제, 향미제, 및 색소제도 존재할 수 있다.
또한 본 발명의 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물은 수중유(oil-in-water) 유탁액의 형태일 수 있다. 이러한 유상은 아라키스유와 올리스유와 같은 식물성 오일 또는 액상 파라핀과 같은 무기 오일 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적당한 유탁제는 (1) 검 아카시아와 검 트라가칸쓰와 같은 자연적으로 발생하는 검; (2) 콩 과 렉시틴과 같은 자연적으로 발생하는 포스파타이드; (3) 예를 들면 소르비탄 모노올레에이트와 같은 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르 30; (4) 예를 들면 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트와 같은 상기의 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합물일 수 있다. 또한 이러한 유탁액도 감미제 및 향미제를 함유할 수 있다.
시럽과 엑시르는 예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 아스파르탐 또는 슈크로스와 같은 감미제와 함께 제형될 수 있다. 이러한 제형제는 또한 완화제, 방부제, 향미제 및 색소제를 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 무균의 주사 가능한 수성 또는 유성의 현탁액의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 상술한 바와 같은 적당한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 알려진 방법에 따라 제형될 수 있다. 또한 무균의 주사 가능한 제제는 비독성 비경구투여가 가능한 희석제 또는 용매, 예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액과 같이 무균의 주사 가능한 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 허용 가능한 부형제와 물중에서, 사용할 수 있는 용매는 물, 링게르액 및 등장 염화나트륨액이 있다. 또한, 무균의 불휘발성유(고정유)도 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 합성의 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하는 입에 맞는 특정한 고정유도 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산도 주사액에 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 혼합물은 약제의 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수도 있다. 이러한 조성물은 보통의 온도에서는 고체이지만 직장의 온도에서는 액체 이므로 직장내에서 용해되어 약제를 방출하는 적당한 비자극성 부형제와 약제를 혼합하여 제조될 수 있다. 이러한 부형제는 코코넛 버터 및 폴리에틸렌 글리콜이다.
국부적 사용을 위하여, 개시된 시클로스포린을 함유하는 크림, 연고, 젤리, 용액 또는 현탁액 등을 사용할 수 있다.
특히 바람직한 양태에서, 비활성 성분으로서 계면활성제, 에탄올, 지방친화성 및/또는 양쪽친화성(ampiphilic) 용매를 함유하는 용액을 사용한다. 특히, 이성체 유사체 혼합물 및 다음의 비약제 성분: d-알파-토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 1000 숙신네이트(비타민 E TPGS), 중쇄 트리글리세라이드(MCT)유, 트윈(Tween) 40, 및 에탄올을 함유하는 경구 다중 유탁액 제형을 사용한다. 또한 경구액으로 이성체 유사체 혼합물 및 상기와 동일한 비약제 성분을 함유하는 연질 젤라틴 캡슐(젤라틴, 글리세린, 물 및 소르비톨을 함유)도 바람직하게 사용될 수 있다.
투여량은 1일당 체중 1kg당 약 0.05mg 내지 약 50mg의 범위내에서 상술한 상태의 치료를 위하여 사용될 수 있다. 투여량과 투여계획은 사용된 특정한 이성체 혼합물, 치료될 상태, 및 나이와 같은 부가적인 요인과 대상자의 상태에 따라 변할 수 있다. 바람직한 투여량은 약 0.5 내지 약 10mg/kg/day 및 약 0.1 내지 약 10mg/kg/day이다. 바람직한 양태로서 약 2 내지 약 6mg/kg/day가 1일 2회로(b. i. d.) 경구적으로 투여되었다. 특히 바람직한 양태로서는, 약 0.5 내지 약 3mg/kg/day가 1일 2회로 경구적으로 투여되었다.
단일 복용 형태를 제조하기 위한 캐리어와 함께 결합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상자와 특정의 투여형태에 따라 변할 것이다. 예를 들면, 인간에게 경구 투여를 위하여 제조된 제형은 전체 조성물의 약 5 내지 약 95%내에서 변할 수 있는 적당하고 통상적인 양의 케리어와 함께 2.5mg 내지 2.5g의 활성 성분을 함유할 수 있다. 단위 복용 형태는 일반적으로 약 5 내지 약 500mg의 활성 성분을 함유할 것이다. 바람직한 양태로는, 약 50mg 이성체 혼합물을 함유하는 개별적인 캡슐이 경구 투여를 위하여 사용되었다. 다른 바람직한 양태로는, 약 50mg/ml 이성체 혼합물을 함유하는 경구액이 경구 투여를 위하여 사용되었다.
그러나 특정 환자의 특정한 투여량은 사용되는 특정한 화합물의 활성, 나이, 체중, 일반적 건강상태, 성별, 음식물, 투여시간, 투여경로, 배설속도, 배합약제 및 특정 질병 또는 진행되는 치료 상태의 성질과 심각성을 포함하는 여러 가지 인자에 좌우될 것이다.
방법학
균류(Tolypocladium inflatum Grams)에 의하여 발생된 시클릭 폴리펩티드의 한 부류인 시클로스포린 유도체는 T-세포 매개 반응에 대한 바람직한 효과에 기인하여 면역억제 치료에서 사용이 증가하고 있다. 시클로스포린 유도체는 림포카인의 생성과 방출을 억제할 뿐만 아니라 면역담당 림프구, 특히 T-림프구를 가역적으로 억제하는 것으로 관찰되어지고 있다. 이러한 작용은 세포내의 세포질에서 발견되는 포스파타제 효소인 칼시뉴린의 시클로스포린 A-유발 억제를 통하여 1차적으로 매개되는 것이다(Schreiber and Crabtree, 1992). 시클로스포린 A 또는 시클로스포린 A 유도체의 효능에 대한 지표는 칼시뉴린의 포스파타제 활성을 억제하는 이의 능력인 것이다. 칼시뉴린 억제 분석은 이의 작용 부위에서 약제의 활성을 측정하는 것이며, 예를 들면, 시클로스포린 A 유사체의 잠재성의 가장 정밀하고 직접적인 생체외 평가인 것이다(Fruman et al., 1992).
ISAtx247은, 분자의 아미노산 1 잔기상에 작용기의 신규한 변형만을 제외하고는, 시클로스포린 A과 유사한 시클로스포린 A 유사체이다. 본 발명자들은 ISAtx247이 생체외 칼시뉴린 억제 분석에서 시클로스포린 A보다 3배 까지 높은 잠재성을 보여준다는 것을 밝혀내었다.
약역학 연구(생체내 및 생체외)는 ISAtx247이 다른 현존하는 시클로스포린 화합물보다 우수한 잠재성을 갖는 것을 보여준다. 면역억제제(시클로스포린 A에 대비하여)로서, 약 10:90 내지 약 90:10(트랜스 대 시스) 범위내의 시클로스포린 유사체의 이성체 혼합물, 특히 50-55% Z-이성체 및 45-50% E-이성체를 갖는 ISAtx247의 효능은 생체외 칼신뉴린 활성 분석, 쥐 심장 이식 모델, 아일렛(islet)세포 타가이식술 마우스 모델, 마우스내의 콜라겐-유발 관절염 모델, 및/또는 토끼내의 항원-유발 관절염 모델에서 보여준다. 이러한 자료는 이러한 이성체 혼합물이 시클로스포린 A보다 우수한 잠재성이 있으므로, 면역조절 질병의 치료를 위하여 유용하다는 것을 보여준다.
시클로스포린 A 치료와 관련하여 일부 알려진 신독성, 간독성, 백내장유도, 다모증, 파라파시스, 및 치은과다형성을 포함하는 수많은 부작용이 있다(Sketris et al,. 1995). 이들 중에서, 신독성은 시클로스포린 A 투여로부터 야기되는 더욱 심각한 투여와 관련된 부작용중의 하나이다. 시클로스포린 A가 신장 손상을 야기하 는 정확한 메카니즘은 알려져 있지 않다. 그러나 신장내의 혈관수축성 물질의 농도 증가가 구심성 사구체 소동맥의 국소적 수축을 이끌 수 있다고 제시되고 있다. 이는 신장 국소빈열, 사구체 여과율의 감소, 및 장기간의 간질성 섬유조직증식을 야기할 수 있다.
ISAtx247의 비임상적 안전성은 수많은 동물종에서 평가되어 왔다. 쥐, 개, 및 영장류에서 반복-투여 경구 독성 실험에서 ISAtx247은 잘 견딜 수 있으며 면역억제와 일치하는 효과를 발생시킨다는 것을 보여준다. 모든 종에서 감지되는 단지 독물학적 효과는 설사/물렁물렁한 배설물이었다.
ISAtx247은 생체외 박테리아 가역 돌연변이 및 염색체 이상 분석에서, 그리고 쥐 생체내 소핵 분석에서 보여준 바와 같이 돌연변이유도원 활성을 나타내지 않았다. 발암성에 대한 연구는 지금까지 완결되지 않았다. ISAtx247에 의한 반복적인 독성 연구는 임신한 쥐와 토끼에서 종결하였다. 어떤 치료-관련 기형 또는 변화가 없었다. 임산부 독성을 야기하는 투여량에서, 상응하는 태아독성이 관찰되었다.
실시예
실시예 1: 시클로스포린 A의 아세틸화
아세트산 무수물(140ml)을 시클로스포린 A(50.0g, 41.6mmol)에 첨가하고, 혼합물을 실온 및 질소 대기하에서 모든 시클로스포린 A가 용해될 때까지 교반하였다. 디메틸아미노피리딘(7.62g, 62.4mmol)을 첨가하고 반응물을 실온 및 질소 대기 하에서 3시간 동안 또는 반응이 완결될 때까지 교반하였다. 반응혼합물을 5℃까지 냉각한 다음 여과하였다. 수거된 고체를 헥산으로 세척하고 부가적인 아세트산 무수물을 없앴다. 얻어진 페스트성 고체를 격렬히 교반하는 5% 중탄산나트륨 수용액(1.5 리터)에 서서히 옮겼다. 투명한 슬러리가 얻어지고 이산화탄소의 발생이 멈출 때까지 얻어진 현탁액을 교반하였다. 고체를 여과하여 수거한 다음 여과액이 중성 pH가 될 때까지 물로 세척하였다. 고체 생성물을 밤새동안(55℃)에서 진공 하에서 건조시키면 무색 고체로서 44.0g(85%)의 생성물을 얻게 되었다.
실시예 2: 실시예 1로부터 제조된 생성물의 산화
아세토니트릴(320ml)과 물(80ml)을 아세틸 시클로스포린 A(42.97g, 34.54mmol)에 첨가하고, 모든 물질이 녹을 때까지 혼합물을 교반하였다. 과요오드산 나트륨(14.77g, 69.08mmol)을 가하고, 염화루테늄 수화물(0.358g, 1.73mmol)을 가한 다음, 실온 및 질소 대기 하에서 3시간 동안 반응물을 교반하였다. 물을 가하고 혼합물을 분리 깔때기로 옮겼다. 혼합물을 에틸 아세테이트(300ml에 이은 250ml)로 2회 추출하였다. 흑색의 에틸 아세테이트 추출물을 배합하여 250ml의 물에 이어서 250ml 소금물로 세척하였다. 이어서 유기 용액을 황산마그네슘 상에서 건조한 다음 용매를 증발시키면 녹색-흑색 고체를 얻게 되었다. 조악한 생성물을 용리액(eluent)으로서 40% 아세톤/60% 헥산을 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그라피를 행하면 무색 고체로서 생성물(29.1g, 68%)을 얻게 되었다.
실시예 3: 아세틸 ISAtx247의 제조
i) 일라이드의 동일 위치내 발생:
아세틸 시클로스포린 A 알데히드(31.84g, 25.84mmol)를 340ml의 톨루엔에 가하고 혼합물을 모든 물질이 완전히 녹을 때까지 교반하였다. 얻어진 용액에 340ml의 1노르말 수산화나트륨 수용액을 가하였다. 얻어진 혼합물을 격렬하게 교반한 다음 알릴 트리페닐포스포늄 브로마이드(58.22g, 151.90mmol)를 가하였다. 반응을 실온에서 24시간 동안 교반한 다음 추가적인 알릴 트리페닐포스포늄 브로마이드(16.64g, 43.42mmol)를 가한 후, 추가적인 24시간 동안 교반을 계속하였다. 혼합물을 분리 깔때기로 옮긴 다음 톨루엔 상을 분리하였다. 수성 상을 추가적인 200ml 톨루엔으로 추출하였다. 2개의 톨루엔 추출물을 배합하여 순차적으로 200ml의 탈이온수 및 200ml의 염화나트륨 포화수용액으로 세척하였다. 이어서 용액을 황산마그네슘 상에서 건조한 다음 톨루엔을 증발시키면 매우 점성이 있는 겔을 얻게 되었다. 얻어진 물질을 142ml의 에틸 아세테이트로 처리하고 투명한 슬러리가 얻어질 때까지 교반하였다. 급속히 교반하면서 헥산(570ml)을 서서히 가하였다. 30분 동안 교반을 계속한 다음 얻어진 현탁액을 여과하고 수거된 고체를 160ml의 5:1 헥산/에틸 아세테이트로서 세척하였다. 배합된 여과액을 회전식 증발기에서 농축하여 점성의 반고체 상태를 얻었다. 얻어진 물질을 75ml의 에틸 아세테이트로 처리하고 투명한 슬러리가 얻어질 때까지 교반하였다. 급속하게 교반하면서 헥산(225ml)을 서서히 가하였다. 교반을 30분동안 계속한 다음 얻어진 현탁액을 여과하여 수거한 고체를 100ml의 헥산/에틸 아세테이트로서 세척하였다. 여과액을 회전식 증발기에서 농축하여 담황색 고체를 얻었다. 조악한 생성물을 용리액(eluent)으로서 40% 아세톤 /60% 헥산을 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그라피를 행하면 무색 고체로서 생성물(14.09g)을 얻게 되었다.
ii) LiBr의 존재 하에서 예비-형성된 일라이드 발생 및 반응:
0℃까지 냉각된 THF(20ml)중의 알릴 트리페닐포스포늄 브로마이드(7.67g, 20mmol)의 교반된 현탁액에 테트라히드로푸란중의 KOBut의 용액(20ml, 20mmol, 1 M 용액)을 가하였다. 이러한 온도에서 30분 동안 교반을 계속하고 THF 중의 LiBr의 용액(10ml, 10mmol, 1 M 용액)을 가하였다. 이어서 반응혼합물을 30분 동안 교반하고 THF(10ml) 중의 아세틸 CsA-알데히드의 용액(4.93g, 4mmol)을 깔때기를 통하여 가하였다. 실온에서 15분 동안 교반한 후, 반응혼합물을 포화 염화암모늄 용액(25ml)에 냉각시켰다. 상술한 추가 절차 및 크로마토그라피를 행하면 무색 고체(3.5g)로서 아세틸 ISAtx247를 얻게 되었다.
실시예 4: ISAtx247의 제조
아세틸 ISAtx247(14.6g, 11.62mmol)를 340ml의 메탄올에 용해시킨 다음 135ml의 탈이온수를 가하였다. 탄산칼륨(13.36g, 96.66mmol)을 가하고 혼합물을 실온에서 24 내지 48시간 동안 또는 반응이 완결될 때까지 교반하였다. 대부분의 메탄올을 증발시키고 나면 250ml의 에틸 아세테이트를 교반하면서 가하였다. 10%의 시트르산 수용액(120ml)을 서서히 가한 다음, 에틸 아세테이트 상을 분리하였다. 수성 상을 추가적인 200ml의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 배합된 에틸 아세테이 트 추출물을 순차적으로 150ml의 탈이온수, 100ml의 10% 시트르산 수용액 및 150ml의 염화 나트륨 수용액으로 세척한 다음 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 에틸 아세테이트를 증발시켜 담황색 고체를 얻었다. 조악한 생성물을 용리액으로서 40% 아세톤/60% 헥산을 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그라피를 행하면 무색 고체로서ISAtx247(10.51g, 75%)을 얻게 되었다. ISAtx247은 45-50%의 E-이성체 및 50-55%의 Z-이성체를 함유한다.
실시예 1 내지 4의 생성물을 질량분석법 및/또는 핵자기공명 분광법에 의하여 특정하였다.
실시예 5: 아세틸-η-브로모시클로스포린 A의 제조
실시예 1에서 제조된 아세틸 시클로스포린 A(41.48g, 33.3mmol), N-브로모숙신이미드(10.39g, 58. 4mmol) 및 아조-비스-이소부티로니트릴(1.09g, 6. 67mmol)을 250ml의 사염화탄소에 용해시키고 얻어진 혼합물을 가열하여 2.5시간 동안 환류 하였다. 혼합물을 냉각하고 용매를 증발시켰다. 잔유물을 350ml의 디에틸 에테르로 처리하고 여과하여 불용성 물질을 제거하였다. 여과액을 순차적으로 150ml의 물과 150ml의 소금물로 세척한 다음, 황산마그네슘 상에서 건조한 다음 용매를 증발시켰다. 조악한 생성물을 용리액으로서 아세톤/헥산(2:3)을 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그라피를 행하면 황색 고체로서 아세틸-γ-브로모시클로스포린 A를 얻게 되었다.
실시예 6: 아세틸 시클로스포린 A의 트리페닐포스포늄 브로마이드의 제조
아세틸-γ-브로모시클로스포린 A(28.55g, 21.6mmol) 및 트리페닐포스핀 (7.55g, 28.8mmol)을 210ml의 톨루엔에 용해시키고 얻어진 용액을 100℃까지 21시간 동안 가열하였다. 얻어진 용액을 냉각하고 톨루엔을 증발시켰다. 얻어진 유성의 반고체를 250ml의 헥산과 에테르(1:4)로 처리하고, 철저하게 혼합한 다음 용매를 가만히 따라 없앴다. 이러한 과정을 150ml의 에테르로 3회 반복하였다. 이어서 잔류물을 50ml 에틸 아세테이트내에 용해시키고 220ml 헥산으로 침전시켰다. 얻어진 고체를 여과 수거하여 황갈색 고체로서 아세틸 시클로스포린 A의 트리페닐포스포늄 브로마이드 22.5g(66%)을 얻었다.
실시예 7: 위티그 반응(Wittig Reaction)
아세틸 시클로스포린의 트리페닐포스포늄 브로마이드(100mg, 0.06mmol), 과량의 37% 포름알데히드(0.25ml) 및 톨루엔(2ml)을 실온에서 급격하게 교반하였다. 수산화나트륨 1N 수용액(2ml)을 적가하고 3.5시간동안 교반을 계속하였다. 반응혼합물을 에틸 아세테이트(20ml)와 물(10ml)로 희석하였다. 에틸 아세테이트 상을 분리하여, 순차적으로 물(10ml)과 소금물(10ml)로 세척한 다음, 황산마그네슘 상에서 건조한 다음 용매를 증발시켰다. 조악한 생성물을 용리액으로서 아세톤/헥산(2:3)을 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그라피를 행하면 무색 고체로서 아세틸 ISAtx247의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물(70mg, 88%)을 얻게 되었다.
실시예 8: 위티그 반응 생성물의 탈-아세틸화
실시예 7에서 얻어진 이성체들의 혼합물(70mg, 0.056mmol)을 메탄올(5ml)에 용해시킨 다음 물(1ml)을 가하였다. 탄산칼륨(75mg)을 가하고 반응물을 실온에서 19시간 동안 교반시켰다. 대부분의 메탄올을 증발시키고 15ml의 에틸 아세테이트를 잔류물에 가한 후, 10ml의 10%시트르산을 가하였다. 에틸 아세테이트 상을 분리하고, 수성 상을 추가적인 10ml의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 배합된 에틸 아세테이트 추출물을 순차적으로 물(10ml), 10ml의 10%시트르산과 소금물(10ml)로 세척한 다음, 황산마그네슘 상에서 건조한 다음 용매를 증발시켰다. 조악한 생성물을 아세톤/헥산(2:3)을 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그라피를 행하면 무색 고체로서 약 85% (E)-이성체와 약 15% (Z)-이성체를 함유하는ISAtx247의 혼합물(37mg, 54%)을 얻게 되었다.
실시예 5-8의 생성물을 질량분석법 및/또는 핵자기공명 분광법에 의하여 특정하였다.
실시예 9: ISAtx247의 기하학 이성체의 제조
ISAtx247의 시스- 및 트랜스-이성체들을 다음의 반응식을 사용하여 독립적으로 합성할 수 있다. 반응 순서는 알려진 알릴트리메틸실란의 메탈레이션 (metalation), 트리메틸보레이트에 의한 전자친핵물질의 포획과정, 가수분해에 이어서 트랜스에스테스화반응을 포함하며, 이 과정을 통하여 중간체인 트랜스-(트리메틸실릴)알릴보로네이트 에스테르를 발생시켰다. 시클로스포린 알데히드의 알릴보 레이션은 붕소 중간체를 제공하며, 이는 격리(sequestration)에 의하여 원하는 β-트리메틸실릴 알콜로 전환되었다. 새로운 키랄 센터에 발생한 부분 입체특이성은 후 단계에서 이들 센터의 제거 때문에 이 단계에서는 측정되지 않는다. β-트리메틸실릴 알콜내의 2개의 센터의 상대적 입체화학은 기대와 일치하게 안티(anti)이고 트랜스-(트리메틸실릴) 보로네이트 전구체내의 트랜스 이중결합에 기인하는 것이라는 것을 이해하여야 할 것이다.
β-트리메틸실릴 알콜의 염기-촉진-제거(Hudrlick et al., 1975)는 아세틸-(Z)-1,3-디엔이 풍부한 조성물을 제공하는 반면에 산-촉진-제거는 아세틸-(E)-1,3-디엔이 풍부한 조성물을 제공한다. 탈보호화과정은 각각 디엔 알콜, 즉 ISAtx247의 (Z) 및 (E)-이성체로 안내할 것이다.
디엔으로의 다른 접근 과정은 알릴포스포란을 이용하는 것이다. 알릴디페닐포스핀의 메탈레이션에 이은 Ti(OPri)4과의 트랜스메탈레이션(transmetalation)은 티타늄 중간체를 제공한다. 알릴티타늄화과정에 이은 입체특이성 제거과정은 (Z)-디엔이 풍부한 조성물을 제공할 것이다.
반면에, 알릴디페닐포스핀 옥사이드에 유사한 순서(도 8)를 적용하면, (E)-이성체가 압도적으로 많은(75%) 조성물이 발생한다.
i) 아세틸 CsA-CHO의 알릴보레이션 :
(E)-1-트리메틸실릴-1-프로펜-3-보로네이트를 앞에서 기술한 방법(Ikeda et al., 1987)에 따라 제조하였다. THF(3ml)중의 (E)-1-트리메틸실릴-1-프로펜-3-보로 네이트(0.2 g, 0.832mmol)의 교반 용액에 질소하에서 아세틸 시클로스포린 A 알데히드(1.026g, 0.832mmol)를 가하였다. 반응혼합물을 고성능 액체크로마토그라피(C-8 column, reverse phase)에 의하여 관찰하면서 총 7일 동안 교반하였다. 이어서 트리에탄올아민(0.196g, 1.3mmol)을 가하고 추가적인 4일 동안 교반하였다. 실리카겔 컬럼상에서 정제하여 β-트리메틸실릴 알콜을 얻었다. MS(ES) m/z 1368.9 (M + Na+).
무수 THF(1ml)중의 KH의 현탁액(3.5 mg, 26.4 μumol, 무수 헥산으로 세척된 30% 무기 오일 분산액)에 β-트리메틸실릴 알콜(10 mg, 7.4 micromole)을 가하고 실온에서 10분동안 교반하였다. 반응혼합물을 디에틸 에테르(10ml)로 희석한 다음 포화된 NaHCO3용액 (2 x 5 mL)으로 세척하였다. 건조(Na2SO4)하고 용매를 제거하여 풍부한 (Z)-아세틸-1,3-디엔을 얻었다. MS (ES) m/z 1294.8 (M+K+).
ii) 아세틸 CsA-CHO의 알릴티타네이션(Allyltitanation):
무수 THF(8ml) 중의 알릴디페닐포스핀의 교반되고 냉각(-78℃)된 용액(0.54 g, 2.4 mmol)에 t-BuLi(1.42 ml. 2.4 mmol, 펜탄중의 1.7 M 용액)을 가하였다. 붉은 벽돌빛색의 용액을 이 온도에서 15분 동안, 그리고 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서 다시 -78℃까지 냉각하고 Ti(OPri)4(0.71 ml, 2.4 mmol)을 가하였다. 갈색의 용액을 이 온도에서 15분 동안 교반하고, 이어서 깔때기를 통하여 무수 THF(10 ml)중의 아세틸 CsA-CHO (2.5 g, 2 mmol)의 용액을 가하였다. 담황색 용액 을 추가로 30분 동안 교반하고, 이어서 실온까지 밤새동안 가온한다. 얻어진 반응혼합물에 0℃에서 MeI(0.15 ml, 2.4 mmol)을 가하였다. 이 온도에서 1시간 동안 교반을 계속하고 실온에서 2시간 동안 계속하였다. 반응혼합물을 빙냉의 1% HCl(100 ml)에 부었다. 수성 층을 EtOAc (3 x 50 mL)로 추출하였다. 배합된 유기 추출물을 물(2 x 25 ml) 및 소금물(25 ml)로 세척하였다. 용매를 제거하고, 실리카겔 상에서 크로마토그라피를 행하면 황색 고체를 얻었다. 용리액으로서 아세톤/헥산 혼합물(1:3)을 사용하여 용리시키면 (E)-이성체가 풍부한 아세틸 ISAtx247을 얻게 되었다. 실시예 4에서와 같이 탈보호화하면 (Z)-이성체가 풍부한 아세틸 ISAtx247( Z/E 비, 75: 25)을 얻게 되었다.
실시예 10: (E)-이성체가 풍부한 ISAtx247이성체 혼합물의 제조
테트라히드로푸란(5ml) 중의 알릴디페닐포스핀 옥사이드(1mmol) 및 헥사메틸포스포르아미드(2mmol)의 용액에 -78℃에서 n-부틸리튬(1mmol, 헥산에 용해된 것)을 가하였다. 혼합물을 -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 테트라히드로푸란(7ml) 중의 아세틸 시클로스포린 A 알데히드의 용액(0.8mmol)을 가하였다. 이어서 반응혼합물을 점차적으로 실온까지 올라가도록 방치한 다음 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 빙냉의 1% HCl(50 ml)에 붓고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 물로 세척하고 황산마그네슘 상에서 건조한 다음 용매를 제거하였다. 잔유물을 용리액으로서 25% 아세톤/75% 헥산 혼합물을 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그라피를 행하면 아세틸 ISAtx247의 (E) 및 (Z)-이성체의 혼합물을 얻게 되었다. 실 시예 4에서와 같이 아세틸-보호기를 제거하면 (Z)-이성체가 풍부한 아세틸 ISAtx247을 얻게 되었다. 양성자 NMR 분광법에 의하여 혼합물은 ISAtx247의 75%의 (E) 및 25%의 (Z)-이성체를 포함하고 있다는 것을 확인하였다. 또한 이러한 반응을 쉬로저의 변형과정(R. Liu, M. Schlosser, Synlett, 1996,1195)에 다라 수행하였다. THF(20ml) 중의 알릴디페닐포스핀 옥사이드의 교반되고 냉각(-78℃)된 용액(1.21 g, 5 mmol)에 n-BuLi(2 ml, 5 mmol, 헥산 중의 2.5 M 용액)을 가하였다. 적색의 용액을 -78℃의 온도에서 40분 동안 교반하였다. 이어서 무수 THF (12 ml)중의 아세틸 CsA-CHO (1.25 g, 1.02 mmol)의 용액을 깔때기를 통하여 15분 동안 가하였다. 반응혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기와 같은 추가 절차와 크로마토그라피를 행하여 아세틸 ISAtx247( Z/E 비, 1H NMR 분석에 의하여 40 : 60 )을 얻게 되었다.
실시예 11: 벤조일-보호 시클로스포린 A의 제조
시클로스포린 A(6.01mg, 5mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(305mg, 2.5mmol)을 피리딘(5ml)에 용해시켰다. 벤조익 무수물(3.4g, 15mmol)을 가하고 혼합물을 50℃에서 19시간동안 교반하였다. 추가적인 벤조익 무수물(1.7g, 7.5mmol)과 DMAP(305mg, 2.5mmol)을 가하고 50℃에서 추가로 24시간동안 교반하였다. 벤조익 무수물(0.85g, 3.8mmol)을 가하고 반응물을 추가로 23시간 동안 교반하였다. 이어서 반응혼합물을 교반하면서 물에 서서히 부었다. 침전된 시클로스포린 A 벤조에이 트를 여과한 후 물로 세척하였다. 수거된 케이크를 최소량의 메탄올에 용해시키고 10% 시트르산 용액에 가하고 1시간 동안 교반하였다. 침전된 생성물을 여과로 수거하고 여과물의 pH가 물의 pH에 도달할 때까지 물로 세척하였다. 시클로스포린 A 벤조에이트를 50℃에서 진공하에 건조하여 무색의 고체를 얻었다.
실시예 12: 트리에틸실릴 에테르-보호 시클로스포린 A의 제조
시클로스포린 A(3.606g, 3mmol)를 건조 피리딘(8ml)에 용해시키고 DMAP (122mg, 1mmol)을 가하였다. 반응혼합물을 0℃까지 냉각한 다음 트리에틸실릴 트리플루오로메탄술포네이드(3.6mmol)를 적가 한다. 혼합물을 실온까지 가온하고 밤새동안 교반하였다. 이어서, 반응혼합물을 교반하면서 물에 서서히 부었다. 침전된 트리에틸실릴 에테르를 여과한 후 물로 세척하였다. 수거된 케이크를 최소량의 메탄올에 용해시키고 5% 시트르산 용액에 가하고 30분 동안 교반하였다. 침전된 생성물을 여과로 수거하고 여과물의 pH가 물의 pH에 도달할 때까지 물로 세척하였다. 고체의 트리에틸실릴 에테르를 50℃에서 진공하에 건조하여 무색의 고체를 얻었다. 또한 트리이소프로필실릴 및 t-부틸메틸실릴 보호기는 유사한 절차에 의하여 도입되었다.
실시예13: 칼시뉴린 억제 분석을 이용한 면역억제 활성
시클로스포린 A 또는 시클로스포린 A 유도체의 효능에 대한 지표는 칼시뉴린의 인산가수분해효소(phosphatase)의 활성을 억제시킬 수 있는 능력으로 판단하였 다. 칼시뉴린 억제 분석은 작용 부위에서 약제의 활성을 측정하는 것이며 마찬가지로 시클로스포린 A 유사체의 잠재성의 직접적인 생체외 평가이기도 하였다(Fruman et al, 1992).
시클로스포린 A에 대한 ISAtx247(45-50%의 E-이성체와 50-55%의 Z-이성체)의 면역억제 활성은 칼시뉴린(CN) 억제 분석을 이용하여 평가되었다. 이러한 평가의 결과는 ISAtx247(45-50%의 E-이성체와 50-55%의 Z-이성체)의 칼시뉴린 인산가수분해효소 활성의 억제는 시클로스포린 A에 대한 것과 비교하여 3-배까지의 높은 잠재성(IC50에 의해 측정)을 보여주었다(도 11 참조).
시클로스포린 A에 대한 다양한 중수소화되고 비-중수소화된 이성체 유사체 혼합물의 면역억제 활성도 칼시뉴린(CN) 억제 분석을 이용하여 평가하였다. 이러한 유사체의 구조 및 이성체 조성물은 도 12에 나타내었다. 도 12에서, 명칭 "I4"는 ISAtx247의 구조에 상응한다. I4-M2는 실시예 5-8에 기술된 방법에 의하여 제조된 ISAtx247을 의미한다(도면에서는 방법 2로 표시). I4-D4는 실시예 1-4에 기술된 방법에 의하여 제조된 중수소화된 ISAtx247을 의미한다. I4-D2는 실시예 5-8에 기술된 방법에 의하여 제조된 중수소화된 ISAtx247을 의미한다. 다른 이성체 혼합물은 도면에 표시한 바와 같다.
이러한 평가의 결과는 이들 이성체 유사체 혼합물에 의한 칼시뉴린 인산가수분해효소 활성의 억제는 시클로스포린 A에 대한 것과 비교하여 적어도 이와 유사한 잠재성(IC50에 의한 측정)을 보여주었다(도 13 참조). 여기서 CsA는 시클로스포린 A 이다; Isocyclo4는 실시예 1-4에서 기술된 방법에 의하여 생성된 ISAtx247을 의미한다. Isocyclo5는 도 12의 I5-M1에 상응한다. Isocyclo4-d4는 도 12의 I4-D4에 상응한다. Isocyclo5-d5는 도 12의 I5-D5에 상응한다. Isocyclo4-d2는 도 12의 I4-D2에 상응한다. Isocyclo4-M2는 도 12의 I4-M2에 상응한다. Isocyclo5-M2는 도 12의 I5-M5에 상응한다.
실시예 14: 쥐 심장 이식모델을 사용한 면역억제 활성
쥐(rat)의 다른 계통(strains)간에 이식된 심장의 거부 작용을 방지하기 위한 ISAtx247 (45-50% E-이성체 및 50-55% Z-이성체)의 효능은 시클로스포린 A의 것과 비교하여 평가되었다. 쥐 심장 이식모델은, 면역 거부로 이러한 모델에서 이식조직(graft) 생존을 연장하는 것이 어렵기 때문에 새로운 면역억제 약제의 생체내 잠재성(효능)을 평가하는데 가장 자주 사용되는 방법이다.
이러한 과정은 위스타 퍼쓰(Wistar Furth) 쥐에서부터 루이스 쥐로 심장의 이형접합체 이식(복부 대동맥 및 하부 대정맥에 이식)을 포함하였다. 이식전 3일 전에 출발하여 이식 후 30일 동안 계속하여 시클로스포린 A 또는 이성체 유사체 혼합물 중의 어느 하나의 복강내 주사를 투여하였다. 이식후-30일 동안 이식조직의 기능장애가 관찰되면 해당 동물을 희생시켰다. 만일 동물이 이식후-30일 이상 생존하면, 시험 및 대조 제품을 중단하고 이식조직의 기능장애 전 또는 이식후 100일 까지 동물을 계속하여 방치하였다.
수혜 동물의 각각의 군에 대한 평균 생존율은 표 1에 요약하였다. 이들 결과 는 ISAtx247(45-50% E-이성체 및 50-55% Z-이성체)이 1.75 mg/kg/day의 최적 투여량에서 시클로스포린 A보다 약 3배의 생존기간을 증가시켰다는 것을 보여준다. ISAtx247을 수혜 받은 수많은 쥐들은 이식후-100일 동안(70일 후에는 투여가 중단됨)에도 이식조직이 작동하였다. 이러한 자료는 이식조직 거부를 방지하는데 이러한 이성체 유사체 혼합물의 자기면역억제 활성을 보여준다.
[이식된 쥐 심장의 평균생존 기간에 대한 복강내 투여에 의한 ISAtx247과 시클로스포린 A의 효과(2개의 분리 연구로부터 평균치, n=13)]
투여량(mg/kg/day) 평균생존 기간(조작 후 일수), 평균±SEM(주사전자현미경)
대조 부형제 시클로스포린 A ISAtx247
0 9±1
0.5 13a ± 4 11b ± 2
1.75 18b ± 7 57b ± 32
3 50c ± 8 55c ± 12
상첨자 a,c: 유의적 차이가 없음
상첨자 b: 유의적 차이가 있음(p<0.01)
또한, 쥐의 다른 계통(strains)간에 인식된 심장의 거부 작용을 방지하기 위한 다양한 중수소화되고 비-중수소화된 이성체 유사체 혼합물(도 12에 나타낸 구조)의 효능은 시클로스포린 A의 것과 비교하여 평가되었다. 투여량은 30일 동안 1.75 mg/kg/day이었다. 결과는 표 2에 요약하였다. 이들 결과는 이성체 혼합물이 1.75 mg/kg/day의 투여량에서 적어도 시클로스포린 A만큼의 생존기간을 증가시켰다는 것을 보여주고 이식조직 거부를 방지하는데 이러한 이성체 유사체 혼합물의 면역억제 활성을 보여준다.
(1.75 mg/kg/day의 투여량에서, 이식된 쥐 심장의 평균생존 기간에 대한 복강내 투여에 의한 다양한 이성체 유사체 혼합물과 시클로스포린 A의 효과)
시험 화합물 평균생존 기간(조작 후 일수)
대조 부형제 9
시클로스포린 A 20
I5-M1 20
I4-M2 20+
I4-D2 30
실시예 15: 아일렛(Islet) 세포 동종타가이식에서의 면역억제 활성
마우스 모델내의 이식된 아일렛 세포의 생존을 연장시키기 위한 시클로스포린 A에 대한 ISAtx247(45-50% E-이성체 및 50-55% Z-이성체)의 효능은 CBA/J 마우스로부터 당뇨 Balb/c 마우스 수혜자의 신장 캡슐까지의 500 아일렛의 이식을 포함하는 연구에서 조사되었다.
이식에 이어서, ISAtx247 또는 시클로스포린 A를 총 30일 동안 부형제(0), 1.75, 10, 20, 또는 25 mg/kg/day의 투여량으로 복강내 주사에 의하여 투여하였다. 연속적인 2일 동안 혈당이 17mmol/L을 초과하는 것으로 정의되는 이식 실패의 기간까지 매일 혈당을 검사하였다.
그 결과는 ISAtx247은 20 mg/kg/day의 투여량에서 40%까지 이식조직 생존 기간을 증가시켰다는 것을 보여준다(표 3). 이는 또한 ISAtx247이 투여량을 증가시키더라도 시클로스포린 A보다 독성이 감소되었다는 것을 보여준다. 이는 특히 25mg/kg/day 투여량에서 명백하다.
(1.75, 10, 20, 또는 25 mg/kg/day의 투여량으로 복강내 주사에 의하여 ISAtx247 또는 시클로스포린 A를 투여한 당뇨 쥐의 마우스 아일렛 동종 이식조직의 생존율)
투여량
(mg/kg/day)		 처리 N 메디안 생존 평균 생존
0 부형제 7 17 16.8
1.75 CsA 9 17 17.4
1.75 ISA 9 18 18.7
10 CsA 6 21 25.3
10 ISA 5 18 19.2
0 부형제 12 16 15.9
20 CsA 9 19 20.2
20 ISA 9 >28 >28
0 부형제 5 21 21.1
25 CsA 10 ND ND
25 ISA 8 50 46.4
ND: 이러한 군에서는 10 마리 동물 중 7마리가 CsA 독성에 의하여 죽었다. 따라서 이 군에서는 단지 3마리 동물만이 완결하여 통계치가 없다.
실시예 16: 관절염에 대한 면역억제 활성
지난 30년을 지나오면서, 인간의 루마티스성 관절염의 3가지 동물 모델은 신규한 항-루마티스제를 위하여 광범위하게 조사되어 왔고 임상전의 검사 및 개발에 널리 사용되어져 왔다. 이들 3가지는 애쥬번트-유발, 콜라겐-유발, 및 항체-유발 관절염 모델이다. 다음의 연구는 마우스에 대한 콜라겐-유발 관절염 모델 및 토끼에 대한 항체-유발 관절염 모델에서 ISAtx247(45-50% E-이성체 및 50-55% Z-이성체)의 항-염증 효능을 평가하기 위하여 설정되었다. 이들 2가지 모델에서 관찰되는 조직병리학 및 면역병리학은 인간의 질병에서 발견되는 것과 유사하다. 두 가지 모델에서, 관절염의 발병을 예방(예방 실험) 및 관절염을 치료(치료 실험)을 위한 ISAtx247의 효능을 검사하였다. 이러한 연구 결과는 청구하는 이성체 유사체 혼합물의 면역억제 작용을 지지하는 것이다.
A. 콜라겐-유발 관절염
비루스 항체 자유(free) 조건하에서 유지되는 수컷쥐(Male DBA/1 Lac J mice)를 8-10주 자란 시점에서, 프로인드 완전 애주번트(Freund's complete adjuvant)에 유화되어진, 100μg의 칙타입(chick type) II 콜라겐으로 피하주입에 의하여 면역성부여를 행하였다. ISAtx247, 시클로스포린 A, 또는 부형제(Chremophor EL/ethanol 72:28, v/v)을, 스탁약제(stock drug; 0.25, 0.5, 또는 1 mg/ml)를 소금물 중에서 1-내지 50-배 희석하여 0(부형제); ISAtx247는 125, 250, 또는 500μg/mouse; 및 시클로스포린 A는 250 또는 500μg/mouse의 농도가 되게 하여 복강내주사에 의하여 매일 투여하였다. 예방실험에 할당된 동물(12/군)은 콜라겐으로 면역성부여일(0 day)로 시작하여 40 day에 희생될 때가지 투여하였다. 치료실험에 할당된 동물(12/군)은 질병발병일(~ 28 day)로 시작하여 80 day에 희생될 때가지 투여하였다.
평가인자는 사망률, 혈청 크레아티닌, 조직구조, 및 임상 점수(시각적), 후방 발 증대(swelling), 조직구조 점수, 진무름(Erosion) 점수 및 면역조직화학과 같은 결과 평가를 포함하였다.
진무름 점수는 진무름(염증 조직으로 채워진 연골 또는 경골내의 한정된 결함으로 정의)의 존재 또는 부존재에 대한 중간 손가락의 기부의 지골적(PIP) 접합부(관절)의 시상부위를 조사하여 맹목적인 방법(blinded manner)으로 행하였다. 이러한 접근은 동일한 접합부의 비교를 위해서도 허용되었다. 이전의 연구는 이러한 접합부에서 비처리된 관절염 동물의 >90%내에서 진무름을 보여준다.
이러한 결과는 ISAtx247 고-투여 처리군(500 μg/mouse)내의 음성 진무름 점수가 부형제 처리군(p<0.05)의 음성 진무름 점수보다 상당히 높게 나타남을 보여준다. 중-투여 ISAtx247(250 μm/mouse) 및 고-투여 시클로스포린 A(500 μg/mouse) 처리군은 모두 부형제 처리군(p<0.1)의 음성 진무름 점수보다 더 높게 나타남을 보여준다. 더욱이, 저-투여 ISAtx247(125 μm/mouse) 및 중-투여 시클로스포린 A(250 μg/mouse) 처리군은, 비록 통계적으로 특이한 점은 없지만, 부형제 처리군과 비교하여 더 높은 음진무름 점수를 가진다는 것을 보여준다.
접합부 진무름의 발전을 유의적으로 예방할 수 있는 처리는 500 μg/mouse에서 ISAtx247 뿐이었다. 대조 부형제군 마우스에 비교하여 ISAtx247-처리 마우스내의 진무름 변화를 보여주는 PIP 접합부의 비율에서 이러한 상당한 감소는 ISAtx247이 질병-개선 성질을 갖고 있다는 것을 보여주고 있다.
B. 안티겐(항원)-유발 관절염
특정 병원균 자유 조건하에서 유지되는 뉴질랜드산 화이트 토끼를 프로인드 완전 애주번트(Freund's complete adjuvant)에 유화되어진 소금물내의 10 mg의 오발부민(ovalbumin)으로 목덜미내의 수개의 부위내로 근육내 및 피하주입에 의하여 면역성부여를 행하였다. 14일 후에, 모든 동물들은 소금물 중의 5mg의 오발부민과 65ng의 인간 재조합 변형 성장인자 2(TGF-2)를 2일간 관절내 주사로 투여하면서 시작하였다.
ISAtx247, 시클로스포린 A, 또는 부형제(Chremophor EL/ethanol 72: 28, v/v)을, 소금물 중에 스탁약제(in vehicle)를 1-내지 4-배 희석하여 0(부형제); ISAtx247는 2.5, 5.0, 또는 10 mg/mouse; 및 시클로스포린 A는 5.0, 10, 또는 15 mg/kg/day의 농도가 되도록 하여 매일 피하주사하였다. 예방실험에 할당된 동물(8/군)은 오발부민으로 면역성부여일(0 day)에 시작하여 42 day에 희생될 때가지 투여하였다. 치료실험에 할당된 동물(8/군)은 질병발병일(~ 28 day)에 시작하여 40 day에 희생될 때가지 투여하였다.
평가인자는 사망률, 체중, 혈청 크레아티닌, 조직구조, 및 무릎 접합부 증대, 활액유체 카운트(synovial fluid counts), 총 사체해부 분석, 및 조직구조와 같은 결과 평가를 포함하였다.
활액 조직병리학 점수에서의 상당한 감소는 대조 부형제동물과 비교하여 치료(예방 실험) 28일 후 ISAtx247(P 0.05) 및 시클로스포린 A(P 0.05)동물에서 관찰되었다. 이는 활액유체 카운트(ISAtx247, P 0.05; 시클로스포린 A, P 0.05)에서 상당한 감소에 의하여 달성된 것이었다. 확정된 관절염을 갖는 동물의 활액 조직병리학 점수에서의 상당한 개선은 또한 대조 부형제동물(치료 실험)과 비교하여 ISAtx247(P 0.05) 및 시클로스포린 A(P 0.05)에 의한 치료 14후에도 입증되었다. 거시적 관절염 점수에서의 상당한 감소는 ISAtx247(P=0.01)에서 입증되었지만, 시클로스포린 A 치료 동물에서는 입증되지 않았다. 치료는 혈청 크레아티닌 또는 시체해부 조직구조의 분석에 의하면 뚜렷한 독성이 없이 충분한 내성을 갖고 있었다.
이러한 자료는 ISAtx247이 토끼에서 안티겐-유발 관절염 모델에서 루마티스성 관절염의 치료와 예방에서 시클로스포린 A와 대등하거나 이보다 우수한 잠재성을 보여준다.
실시예 17: 약물동력학 및 독성역학 성질
ISAtx247(45-50% E-이성체 및 50-55% Z-이성체) 및 시클로스포린 A의 약물동력학 및 독성역학 인자는 토끼 모델에서 시험되었다. 또한 토끼는 시클로스포린 A 신장독성에 대한 모델로서 사용될 수 있지만, 쥐보다는 훨씬 덜 사용되었다. 연구에 의하면, 토끼에 투여된 시클로스포린 A는 다른 동물 모델에서 예전에 보고된 것보다 낮은 투여량에서 뿐만 아니라, 인간에게 투여하는 치료범위의 적어도 상한 수준 내에서도 구조적 및 기능적 변화를 일으킨다는 것을 발견하였다(Thliveris et al., 1991,1994). 또한, 간질성 섬유증 및 동맥질병의 발견은, 세관내의 세포학적 변화 외에도, 토끼가 신장독성을 연구하는데 더욱 적당한 모델임을 암시하고 있는데, 그 이유는 이들의 구조적 실체가 인간에서 관찰되는 신장독성의 검증서이기 때문이다. ISAtx247은 다음 계획에 따라 처음 7일 동안은 정맥내(i.v.)로, 추가의 23일 동안은 피하내(s.c.)로 투여되었다.
(토끼 모델에서 ISAtx247의 약물동력학 및 독성역학 성질의 조사를 위한 투여 계획)
처리군 1-7일:
정맥내투여
(mg/kg)		 8-30일:
피하내투여
(mg/kg)		 동물의 수
수컷 암컷
1. 대조 부형제 0 0 4 4
2. 시클로스포린 A 대조 10 10 6 6
3. 저-투여 5 5 0 2
4. 중-투여 10 10 4 4
5. 고-투여 15 15 4 4
병원체 자유(즉, 병원체가 없는) 토끼(SPF)는 관찰되는 어떤 신장 변화가 ISAtx247의 효과에 기인한 것이지 병원체에 기인한 것이 아니라는 것을 확인하는데 사용되었다. 1일과 7일에서, 약 투여 전 및 투여 후 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 및 24시간에서 혈액시료를 체취하여, 약물동력학 프로파일을 발생시켰다. 다른 평가 인자는 임상적 관찰, 체중, 음식소비, 혈액학, 임상화학, 총 병리학, 및 선택된 조직/기관의 조직병리학 조사를 포함하였다.
혈액시료를 고성능 액체크로마토그라피와 짝을 이루는 질량분광계(LCMS)로 분석하였다. 하기 표 5는 10mg/kg의 시클로스포린 A 또는 ISAtx247을 투여한 토끼에서 평균 약물동력학 인자를 요약한 것이다.
(10mg/kg/day의 시클로스포린 A 또는 ISAtx247을 정맥내로 투여한 수컷 토끼에서 평균 약물동력학 인자. 결과는 평균±SD로 표현함)
측정 인자 시클로스포린 A ISAtx247
1일 7일 1일 7일
tmax(hrs) 0.5 0.5 0.5 0.5
Cmax(μg/L) 1954±320 2171±612 1915±149 1959±470
t1/2(hrs) 7.4±2.8 9.0±4.0 7.4±1.7 9.2±1.1
곡선하의 면적
(μg · hr/L)		 6697±1717 6685±1247 5659±1309 5697±1373
10mg/kg/day의 시클로스포린 A 또는 ISAtx247을 정맥내로 투여한 수컷 토끼에서 평균 약물동력학 인자 간에 통계적으로 특이할 만한 차이는 없었다. 동일한 양으로 ISAtx247을 투여한 암컷 토끼에서 약물동력학 인자는 수컷 토끼에서 관찰되는 것과 특이할 만한 차이는 없었고, 다만 7일에서의 최고 농도에서는 제외한다.
특별한 변화는 대조 부형제, 시클로스포린 A, 또는 ISAtx247를 투여한 토끼의 혈액학 인자에서 발견되지는 않았다. 하기의 표 6에서 보는 바와 같이, 연구과정동안에 다양한 군에서 크레아티닌 수준에서 차이가 별견되었다. 이러한 차이는 시클로스포린 A가 대조 부형제 또는 ISAtx247중 어느 하나보다 신장에서 상당히 큰 음성 효과를 갖는 것을 가리켰다. 10mg/kg/day의 시클로스포린 A와 비교하여, 50% 더 높은 투여량, 즉 15mg/kg/day에서 조차도, ISAtx247은 혈청 크레아티닌 수준에서 어떤 특별한 증가를 야기하지 않았다는 것을 주지하여야 한다.
(30일 동안 부형제, 시클로스포린 A, 또는 ISAtx247을 투여한 수컷 토끼에서 기준상에서 혈청 크레아티닌 수준의 변화율)
처리군 15일 30일
부형제 +6% -3%
시클로스포린 A
(10mg/kg)		 +22% +33%
ISAtx247(10mg/kg) +1% +10%
ISAtx247(15mg/kg) -19% -11%
대조 부형제, 10mg/kg의 시클로스포린 A, 5mg/kg의 ISAtx247, 또는 10mg/kg의 ISAtx247을 투여한 모든 토끼에서 기관을 조사한 결과, 특이한 이상은 나타나지 않았다. 이는 신장에 대하여 특히 사실이며, 여기서 시클로스포린 A-치료 동물(Thliveris et al., 1991,1994)에서 일반적으로 보여지는 동물 긴질성 섬유증의 증거는 없었다. 15mg/kg의 ISAtx247을 투여한 수컷 토끼에서 정자발생의 감소가 감지되었다. 15mg/kg의 ISAtx247을 투여하여 조사를 종결한 3마리의 암컷 토끼에서 어떤 변화도 감지되지 않았다.
실시예 18: ISAtx247의 면역억제 효과
사이노몰구스 원숭이(n=4)로부터 채취한 미가공한 혈액을 ISAtx247과 시클로스포린으로 배양하고 배지내에서 다른 마이토젠(분열유발인자)으로 자극시켰다. 림프구 증식은 트리튬-라벨 티미딘 흡수 및 SG2M 상(phase)에서 세포상에서 증식하는 세포핵 항체(PCNA)의 발현(expression)의 플로우-사이토메터(flow-cytometric) 분석에 의하여 평가하였다. 또한 플로우-사이토메터는 T세포에 의한 세포내적 사이토카인의 생성 및 T 림프구 활성 항체의 발현을 평가하는데 사용되었다. EC50(최대 효과의 50%를 얻는데 필요한 약제의 농도)은 차후에 위놀린(WinNonlinTM) 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 이러한 결과는 림프구 증식, 사이토카인 생성, 및 T 세포 표면 항체의 발현이, 하기 표 7에서 EC50(ng/ml로 표시)에 의하여 나타낸 바와 같이, 시클로스포린에 의한 것보다 ISAtx247에 의한 것이 더욱 잠재적으로 억제되었다는 것을 보여준다.
인자 ISAtx247 시클로스포린
3H-티미딘 흡수 160.54 565.52
PCNA 발현 197.72 453.88
IL-2 생성 103.35 504.80
IFN-생성 102.67 465.65
TNF-생성 90.58 508.29
CD 71 발현 149.84 486.82
CD 25 발현 121.00 431.53
CD 11a 발현 204.4 598.90
CD 95 발현 129.98 392.97
CD 154 발현 160.87 975.10
따라서 엑스비보(ex vivo) 미가공(whole) 혈액 분석을 사용하여, 본 발명자들은 ISAtx247은 시클로스포린보다 2.3-6배의 높은 잠재력(효능)을 가지고 다양한 면역작용을 억제한다는 것을 발견하였다.
실시예 19: 트리부틸 알릴 포스포늄 브로마이드를 사용한 위티그 반응
칼륨 t-부톡사이드(0.31 g, 2.8 mmol)를 20ml의 테트라히드로푸란에 용해시켰다. 약 -40℃에서 3ml의 테트라히드로푸란에 용해시킨 트리부틸 알릴 포스포늄 브로마이드(0. 99g, 3.1 mmol)를 서서히 가하였다. 얻어진 황색 혼합물을 약 -40℃에서 약 10분 동안 교반한 후 6ml의 테트라히드로푸란에 용해시킨 아세틸 시클로스포린 A 알데히드(1.5 g, 1.2 mmol)의 용액을 서서히 가하였다. 황색 반응혼합물을 1.5시간 동안 교반한 후, 반응을 완결하였다. 냉각시키기 위하여 반응혼합물을 수성 인산(1.2 g, 1.0 mmol)에 옮겼다. 얻어진 수성 용액을 100ml의 톨루엔에 이어서 50ml의 톨루엔으로 추출하였다. 배합된 유기 층을 물로 세척하고 감압 하에 농축하여 건조시켰다. 생성물 즉, 아세틸화 ISAtx247은 약간 황색 고체로서 대략 90%의 수율로서 얻어졌다. 이성체 비율은 약 87% E-이성체과 약 13% Z-이성체(1H-NMR 분광기에 의하여 측정)이었다.
실시예 20: 트리부틸 알릴 포스포늄 브로마이드 및 리튬 염기를 사용한 위티그 반응
트리부틸 알릴 포스포늄 브로마이드(1.38 g, 4.3 mmol)를 20ml의 톨루엔과 3 ml의 테트라히드로푸란에 용해시켰다. 약 -78℃에서 부틸리튬(헥산 중의 1.6M, 2.43 ml, 3.9 mmol)을 서서히 가하였다. 얻어진 황색 혼합물을 약 -78℃에서 약 10분 동안 교반한 후 6ml의 톨루엔에 용해시킨 아세틸 시클로스포린 A 알데히드(1.5 g, 1.2 mmol)의 용액을 서서히 가하였다. 황색-오렌지 반응혼합물을 3.5시간 동안 교반한 후, 반응혼합물을 50ml의 톨루엔과 수성 인산(0.25 g, 2.2 mmol)의 혼합물상에 옮겨서 냉각 하였다. 얻어진 2상의 혼합물을 대기온도로 가온되도록 방치한 다음 2개의 층으로 분리하였다. 톨루엔 층을 20ml의 물로 세척하고 감압 하에 농축하여 건조시켰다. 생성물 즉, 아세틸화 ISAtx247은 약간 황색 고체로서 대략 80%의 수율로서 얻어졌다. 이성체 비율은 약 70% E-이성체과 약 30% Z-이성체(1H-NMR 분광기에 의하여 측정)이었다.
실시예 21: 트리부틸 알릴 포스포늄 브로마이드 및 리튬 염기를 사용한 위티그 반응
상술한 바와 같이 SAP018를 수행하지만, 약 -40℃에서 수행하는 것만 차이가 있다. 실시예 20의 실험 조건을 반복하는데, 본 실시예에서는 약 -40℃의 반응 온도를 사용한다. 이러한 조건하에서 분리된 생성물, 아세틸화 ISAtx247의 이성체 비율은 약 74% E-이성체과 약 26% Z-이성체(1H-NMR 분광기에 의하여 측정)이었다.
실시예 22: 트리부틸 알릴 포스포늄 브로마이드를 사용한 위티그 반응
15ml의 테트라히드로푸란에 용해된 아세틸 시클로스포린 A 알데히드(1.5 g, 1.2 mmol) 및 트리부틸 알릴 포스포늄 브로마이드(0.99 g, 3.1 mmol)를 약 -80℃까지 냉각하였다. 9ml의 테트라히드로푸란에 용해시킨 칼륨 t-부톡사이드(0.19 g, 1.7 mmol)를 서서히 가하였다. 얻어진 황색 혼합물을 약 -80℃에서 1시간 동안 교반하여 반응을 완결한 다음, 6ml의 테트라히드로푸란의 용액을 서서히 가하였다. 얻어진 황색-오렌지 혼합물을 약 1.5시간 동안 교반한 후 반응을 완결시켰다. 냉각하기 위하여 반응혼합물에 수성 인산(1.5 g, 1.3 mmol)에 가하였다. 얻어진 혼합물을 농축하고 잔류물을 5ml의 메탄올에 용해시켰다. 이어서 혼합물을 5ml의 물에 서서히 가였다. 얻어진 침전물을 여과하고, 4ml의 메탄올/물(1/1)로 세척한 다음, 진공 하에 건조시켰다. 생성물 즉, 아세틸화 ISAtx247은 무색 고체로서 대략 90%의 수율로서 얻어졌다. 이성체 비율은 약 91% E-이성체과 약 9% Z-이성체(1H-NMR 분광기에 의하여 측정)이었다.
실시예 23: 아세틸 CsA의 오존분해
200ml의 메탄올중의 아세틸 시클로스포린 A (15 g, 12.1 mmol)의 용액을, 약 1.1 바에서 300 L O2/hr의 유동으로 발생하는 산더(Sander) 오존 발생기를 사용하여 반응이 완결될 때까지(약 5분 동안), -78℃에서 오존화시켰다. 용액을 통해 아르곤 기체를 발생시키고(gassed), 메탄올에 용해된 디메틸술파이드로 냉각하였다. 환원과정을 완결한 후, 혼합물을 실온에서 밤새 동안 교반하였다. 약 50ml까지 농축한 다음, 용액을 500ml의 물에 서서히 가하였다. 얻어진 침전물을 여과하고, 60ml의 물로 세척한 다음, 진공 하에 건조시켰다. 생성물 즉, 아세틸화 CaA는 무색 고체로서 대략 95%의 수율 및 약 98%의 순도(HPLC에 의하여 측정)로서 얻어졌다.
실시예 24: 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A의 제조
시클로스포린 A(40 g, 1 당량)를 30℃에서 디클로로메탄(100 ml)에 용해시켰다. N, N-비스-(트리메틸실릴) 우레아(1.1 당량)를 가하였다. 5분 후 30℃에서 교반하고, p-톨루엔술폰산(0.02 당량)을 가하였다. 반응이 완결될 때, 즉 박막 크로마토그라피(TLC), 고압이거나 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC) 또는 질량 분광법(MS)에 의하여 측정한 바에 따라, 반응혼합물을 환류하면서 가열한 다음, 실온까지 냉각하였다. 반포화 중탄산나트륨 수용액(100ml)을 첨가하였다. 수성 상을 분리하여 디클로로메탄으로 재추출하였다. 배합된 유기 상들을 무수 황산나트륨 상에서 건조하여 여과하였다. 용매를 감압하게 제거하여 조악한 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A를 얻었다.
실시예 25: 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 알데히드의 제조
트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A (5 g, 1 당량)를 디클로로메탄(50 ml)에 용해시켰다. 용액을 약 -78℃의 온도까지 냉각한 다음, 청색을 띌 때까지 용액을 통하여 오존을 버블링하였다. 이어서 과량의 오존을 제거하여 무색되도록 무색의 용액이 얻어질 때까지 용액을 통하여 아르곤을 버블링하였다; 이 단계는 과량의 오존을 제거하기 위하여 수행하였다. 트리에틸아민(5 당량)을 가하고 실온에서 17시간 동안 반응혼합물을 교반하였다. 수성의 추가 절차를 행한 후 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 알데히드의 제조하였다.
실시예 26: 위티그 반응을 통한 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 디엔의 Z 대 E 이중결합 이성체들의 3:1 혼합물의 제조
사전에 60분 동안 교반되어 톨루엔(10ml)에 녹아있는 칼륨 t-부톡사이드(3당량) 및 알릴트리페닐포스포늄 브로마이드(2 당량)의 혼합물에 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 알데히드(1 g, 1 당량)를 가하였다. 실온에서 1시간 후 반응혼합물에 추가절차를 행하여 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 디엔의 Z 대 E 이중결합 이성체들의 3:1 혼합물(NMR에 의해 확인)을 얻었다.
실시예 27: 위티그 반응을 통한 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 디엔의 Z 대 E 이중결합 이성체들의 1:1 혼합물의 제조
트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 알데히드(2.5g)를 25ml의 톨루엔에 용해시키고 1 N 수산화나트륨 수용액(10 당량)으로 처리하였다. 반응혼합물을 격렬하게 교반하고 알릴트리페닐포스포늄 브로마이드(7.5 당량, 조금씩)를 가하였다. 실온에서 수 시간 후 반응혼합물에 추가절차를 행하여 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 디엔의 Z 대 E 이중결합 이성체들의 약 1:1 혼합물(NMR에 의해 확인)을 얻었다.
실시예 28: 위티그 반응을 통한 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 디엔의 Z 대 E 이중결합 이성체들의 1:2 혼합물의 제조
트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 알데히드(1 g)를 탄산칼륨(1.5 당량)과 알릴트리페닐포스포늄 브로마이드(1.5 당량)와 함께 5ml의 톨루엔에 용해시켰다. 환류하에 격렬한 교반하에 4시간의 반응 후에, 반응혼합물에 추가절차를 행하여 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 디엔의 Z 대 E 이중결합 이성체들의 약 1:2 혼합물(NMR에 의해 확인)을 얻었다.
실시예 29: 위티그 반응을 통한 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 디엔의 Z 대 E 이중결합 이성체들의 1:3 혼합물의 제조
알릴트리부틸포스포늄 브로마이드(3 당량, 알릴브로마이드와 트리부틸포스핀으로부터 제조됨)를 THF(3.5 ml)에 용해시켰다. 톨루엔(7.5 ml)을 가한 다음 칼륨 t-부톡사이드(4당량)를 가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 용액을 약 -30℃까지 냉각하였다. 톨루엔(5ml) 중의 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 알데히드의 용액(1g, 1 당량)을 적가하였다. 약 -30℃에서 45분 후, 반응혼합물에 추가절차를 행하여 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 디엔의 Z 대 E 이중결합 이성체들의 대략 1:3 혼합물(NMR에 의해 확인)을 얻었다.
다음의 2개의 실시예, 실시예 30과 31은 알릴메탈레이션에 관한 것이다.
실시예 30: 아세틸-보호 시클로스포린 A β-트리메틸실릴알콜의 제조
THF(15ml) 중의 알릴트리메틸실란(10.1 당량)의 용액에 실온에서 부틸 리튬(헥산중에서 1.6 M, 10 당량)을 첨가하였다. 30 분 반응 후, 용액을 -75℃까지 냉각하고, 디에틸-B-메톡시보란(10.1 당량)으로 처리하였다. 1 시간 후, 보론트리플루오라이드 디에틸에테르 착물(10.1 당량)을 가하여 B-(γ-트리메틸실릴알릴)-디에틸보란 시약을 발생시켰다. 1 시간 후, THF(15ml) 중의 아세틸-보호 시클로스포린 A 알데히드의 용액(5g, 1 당량)을 적가하였다. 20분 후, 반응혼합물을 -10℃까지 가온하고 염화암모늄 포화수용액을 가하였다. 실온에서 1 시간 동안 교반한 후, 물(45ml)을 가하고 반응혼합물을 25ml의 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기 상들을 물(25ml)과 염화암모늄 포화수용액(25ml)에 의하여 세척하였다. 배합된 유기 상들을 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과한 후, 감압 하에 농축하였다. 조악한 생성물을 크로마토그라피(실리카겔, 디클로로메탄/메탄올 또는 에틸 아세테이트/헵탄)하여 아세틸-보호 시클로스포린 A β-트리메틸실릴알콜을 얻었다.
실시예 31 : 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A β-트리메틸실릴알콜의 제조
THF(15ml) 중의 알릴트리메틸실란(10.1 당량)의 용액에 실온에서 부틸 리튬(헥산중에서 1.6 M, 10 당량)을 첨가하였다. 약 30 분 동안 반응을 진행시킨 후, 용액을 -65℃까지 냉각하고, 디에틸-B-메톡시보란(10.1 당량)으로 처리하였다. 1 시간 후, 보론트리플루오라이드 디에틸에테르 착물(10.1 당량)을 가하여 B-(γ-트리메틸실릴알릴)-디에틸보란 시약을 발생시켰다. 1 시간 후, THF(15ml) 중의 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 알데히드의 용액(5g, 1 당량)을 적가하였다. 15분 후, 반응혼합물을 10℃까지 가온하고 염화암모늄 포화수용액을 가하였다. 실온에서 1 시간 동안 교반한 후, 물(12.5ml) 및 포화 NaHCO3 (25ml)을 가하였다. 반응혼합물을 25ml의 메틸-t-부틸 에테르로 2회 추출하였다. 유기 상들을 연속하여 물(2 x 25ml)로 2회, 염화나트륨 포화수용액(25ml)에 의하여 1회 세척하였다. 배합된 유기 상들을 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과한 후, 감압 하에 농축하였다. 조악한 생성물을 크로마토그라피(실리카겔, 헵탄/에틸 아세테이트)하여 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A β-트리메틸실릴 알콜을 얻었다.
다음의 3개의 실시예, 실시예 32, 33 및 34는 페터슨 제거 반응에 관한 것이다.
실시예 32: E-아세틸-보호 시클로스포린 A 디엔의 제조
아세틸-보호 시클로스포린 A β-트리메틸실릴알콜(10 g, 1 당량)을 THF(50 ml)에 용해시켰다. 진한 황산(1.24 ml, 3 당량)을 가하고 반응혼합물을 실온에서 20 시간 동안 교반하였다. 물(150ml)을 가하고 반응혼합물을 메틸-t-부틸 에테르(200 ml)로 추출하였다. 수성 상을 재차 메틸-t-부틸 에테르(150 ml)로 추출하였다. 유기 상들을 물(150ml)로 세척하였다. 배합된 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과한 후, 감압 하에 농축하여, 조악한 아세틸-보호 시클로스포린 A 디엔(아세틸-보호-ISAtx247)을 얻었다. 조악한 생성물을 메틸-t-부틸 에테르/THF로부터 결정화한 후, 메틸-t-부틸 에테르/DCM으로부터 재결정화하여 99-97%의 E와 Z 이중결합 이성체들의 1-3% 혼합물(400MHz NMR, 2% 측정에러)로서 아세틸-보호 시클로스포린 A 디엔(아세틸-보호-ISAtx247)을 얻었다.
E-아세틸-보호 시클로스포린 A 디엔의 가수분해를 다음과 같이 수행하였다: 아세틸 시클로스포린 A 디엔(4g, 1 당량)을 메탄올(80ml)과 물(32ml)에 용해시켰다. 탄산칼륨(3.65g, 8.3 당량)을 가하였다. 실온에서 15시간 동안 교반한 후, 반응혼합물을 4시간 동안 40℃까지 가열하였다. 반응혼합물을 감압하에 농축하고 잔류물을 에틸아세테이트(70ml)에 용해시켰다. 15% 시트르산 수용액(30ml)을 서서히 가한 다음, 물(10ml)을 가하였다. 수성 층을 분리하고 에틸아세테이트(56ml)로 재추출하였다. 유기 층들을 물(30ml), 15% 시트르산 수용액(40ml) 및 염화나트륨 포화용액(30ml)으로 세척하였다. 유기 층들을 배합하고, Na2SP4에서 건조시키고 감압 하에 농축하여 이중결합 이성체들의 98:2 E/Z 혼합물(400MHz NMR, 약 2-3% 측정에러)로서 시클로스포린 A 디엔(ISAtx247)을 얻었다[참조: R. W. Hoffmann, Angewandte Chemie International Edition, Vol. 555 (1982); W. R. Roush, "A1lylorganometallics," Comprehensive Organic Synthesis, Pergamon Press, Vol. 2, pp. 1-53 ; 및 Y. Yamamoto, N. Asao, Chemical Reviews, p. 2307 (1993)].
실시예 33: Z-트리메틸실릴-보호-시클로스포린 A 디엔의 제조 및 Z-시클로스포린 A 디엔(ISAtx247)으로의 이의 전환
트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A β-트리메틸실릴알콜(2 g, 1 당량)을 THF (20ml)에 용해시켰다. 얻어진 용액을 0-2℃까지 냉각하고 칼륨 t-부톡사이드(4 당량)을 가하였다. 1.5 시간 반응 후, 에틸 아세테이트(20 ml)와 물(40ml)을 가하였다. 수성 상을 분리하고 에틸아세테이트(20 ml)로 재추출하였다. 유기 상들을 염화나트륨 포화수용액(20ml)로 세척하였다. 배합된 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과한 후, 감압 하에 농축하여, Z-트리메틸실릴-보호-시클로스포린 A 디엔(트리메틸실릴-보호-ISAtx247), 및 Z-시클로스포린 A 디엔(ISAtx247의 Z-이성체)의 혼합물을 얻었다. 조악한 생성 혼합물을 메탄올에 용해(용액 중의 10 중량%)하고 1 M 염산 수용액(1 당량)을 가하여 데실레이션(desilylation)을 완결하였다. 실온에서 15 분 후, 물과 에틸 아세테이트를 가하였다. 수성 층을 분리하고 에틸 아세테이트로 재추출하였다. 유기 상들을 염화나트륨 포화수용액으로 세척하였다. 배합된 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과한 후, 감압 하에 농축하여, Z 및 E 이중결합 이성체의 94:6 혼합물(NMR로 확인)로서 시클로스포린 A 디엔(ISAtx247)을 얻었다.
실시예 34: E-시클로스포린 A 디엔(ISAtx247)의 제조
트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A β-트리메틸실릴알콜(500 mg, 1 당량)을 디클로로메탄에 용해시켰다. 얻어진 용액을 약 0-2℃ 범위내로 냉각하고 보론트리플루오라이드 디에틸에테르 착물(5 당량)로 처리하였다. 1 시간 후, 물(20ml) 및 디클로로메탄(20 ml)을 가하였다. 유기 상들을 분리하고 물(20ml)로 세척한 다음, 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과한 후, 감압 하에 농축하여, E 및 Z 이중결합 이성체의 91:9 중량비의 혼합물(NMR로 확인)로서 직접적으로 시클로스포린 A 디엔(ISAtx247)을 얻었다.
실시예 35: 트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 디엔(ISAtx247)의 탈보호화
트리메틸실릴-보호 시클로스포린 A 디엔(500 mg, 1 당량)을 메탄올에 용해(용액중의 10중량 %)시켰다. 얻어진 용액을 1 M 염화수소산 수용액(1 당량)으로 처리하였다. 실온에서 15 분 후, 물과 에틸 아세테이트를 가하였다. 수성 상을 분리하고 에틸 아세테이트로 재추출하였다. 유기 상들을 염화나트륨 포화수용액으로 세척하였다. 배합된 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과한 후, 감압 하에 농축하여, 시클로스포린 A 디엔(ISAtx247)을 얻었다.
실시예 36: 아세틸 시클로스포린 A의 에폭시화
아세틸 시클로스포린 A (2.0 g, 1.61 mmol)을 아세토니트릴(30ml)에 용해시켰다. 1,3-디아세톡시-아세톤(0.14 g, 0.8 mmol)을 가한 다음, 0.0004 M 수성 에틸렌디아민테트라-아세트산 이나트륨염(20ml) 및 중탄산나트륨(0.405 g, 4.82 mmol)을 가하였다. 교반된 혼합물에 옥손(43.8% KHSO5)(2.23 g, 6.43 mmol)을 2시간 동안 조금씩 첨가하였다.
pH는 pH 스타트를 사용하여 1 N NaOH의 일정한 첨가(총 6.4ml의 양)로 8.2로 유지시켰다. 온도를 냉각수 욕조를 사용하여 가끔씩 냉각하여 22-25℃로 유지시켰다. 2.5시간 후, 반응혼합물을 몇 방울의 아황산나트륨 용액으로 냉각하였다. 물(100ml)을 가하고 혼합물을 t-부틸 메틸에테르(100ml, 이어서 75ml)로 2회 추출하였다. 유기 추출물을 묽은 수성 염화나트륨(100ml)으로 세척하고, 배합하여, 황산나트륨 상에서 건조하고, 농축하여, 백색 고체 거품로서 조악한 아세틸 시클로스포린 A 에폭사이드(1.92 g, 95% ; HPLC : 99.4% area)를 얻었다.
실시예 37: 아세틸 시클로스포린 A 알데히드의 제조
조약한 아세틸 시클로스포린 A 에폭사이드 (1.92 g, 1.52 mmol)를 아세토니트릴(25ml)에 용해시켰다. 물(20ml)을 가하고, 이어서 과요오드산 나트륨(489 mg, 2. 28 mmol) 및 0.5 M 황산(3.05 mL, 1.52 mmol)을 가하였다. 반응혼합물을 18시간 동안 40℃에서 교반한 다음, 과량의 과요오드산 나트륨에 수성 아황산 나트륨을 첨가하여 냉각하였다. 묽은 수성 염화나트륨(100ml)을 가하고 혼합물을 t-부틸 메틸 에테르(100ml)로 각각 2회 세척하였다. 유기 추출물을 묽은 수성 염화나트륨(100ml)로 세척하고, 배합하여, 황산나트륨 상에서 건조하고, 농축하여, 백색 고체 거품으로서 조악한 아세틸 시클로스포린 A 알데히드(1.74 g, 92%; HPLC : 95.7% area)를 얻었다. 조악한 생성물을 용리제로서 40% 아세톤/60% 헥산을 사용하고 실리카겔상에서 크로마토그라피를 행하여 백색 고체 거품으로서 생성물(1.41 g, 아세틸 시클로스포린 A을 기준하여 71%; HPLC : 100% area)를 얻었다.
실시예 38: 원-포트 절차를 이용한 아세틸 시클로스포린 A 알데히드의 제조
아세틸 시클로스포린 A(2.0 g, 1.61 mmol)를 아세토니트릴(30ml)에 용해시켰다. 1,3-디아세톡시-아세톤(0.084 g, 0.48 mmol)을 가한 다음, 0.0004 M 수성 에틸렌디아민테트라-아세트산 이나트륨염(20ml) 및 중탄산나트륨(0.405 g, 4.82 mmol)을 가하였다. 교반된 혼합물에 옥손(43.8% KHSO5)(1.67 g, 4.82 mmol)을 2시간 동안 조금씩 첨가하였다. pH는 pH 스타트를 사용하여 1 N NaOH의 일정한 첨가(총 3.4ml의 양)로 8.2로 유지시켰다. 온도를 20-25℃로 유지시켰다. 3.5시간 후, 반응혼합물에 0.5 M 황산(5ml, 2.5 mmol)을 가하고, 이어서 pH가 1.3에 도달할 때까지 몇 방울의 진한 황산을 가하였다. 그런 다음, 과요오드산 나트륨(516 mg, 2.41 mmol)물을 가하고, 반응혼합물을 실온에서 2시간 동안, 40℃에서 22시간 동안 교반하였다. 물(100ml)을 가하고 혼합물을 t-부틸 메틸에테르(100ml, 이어서 75ml)로 2회 추출하였다. 유기 추출물을 묽은 수성 염화나트륨(100ml)으로 세척하고, 배합하여, 황산나트륨 상에서 건조하고, 농축하여, 백색 고체 거품로서 조악한 시클로스포린 A 알데히드(1.9 g, 96%; HPLC : 83.4% area)를 얻었다. 조악한 생성물을 용리제로서 40% 아세톤/60% 헥산을 사용하고 실리카겔상에서 크로마토그라피를 행하여 백색 고체 거품으로서 생성물(1.35 g, 아세틸 시클로스포린 A을 기준하여 68%; HPLC : 100% area)를 얻었다.
실시예 39 (ISO): 아세틸 시클로스포린 A 알데히드와 3-디메틸아미노프로필트리페닐포스포릴이덴과의 위티그 반응
1,3-디엔의 입체특이적 합성은 문헌( E. J. Corey and M. C. Desai in Tetrahedron Letters, Vol. 26, No. 47, pp. 5747-8, (1985))에 기술되어 있다. 이 문헌에서는 3-(디메틸아미노)프로필트리페닐포스포란을 칼륨 헥사메틸디실라자이드로 처리하여 얻어진 일라이드에 알데히드와의 위티그 반응을 행하여 선택적으로 Z-알케닐디메틸아민을 형성하는 것에 관하여 개시되어 있다. 아민을 m-클로로퍼벤조산으로 산화하면 상응하는 N-산화물을 얻을 수 있으며, 이어서 이를 코프 제거과정(Cope elimination)으로 알려진 것처럼 가열하여 위티그 단계 동안에 형성된 올레핀의 배열이 배타적으로 Z, 또는 시스인 원하는 1,3-디엔을 형성하였다.
유사하게, ISAtx247의 Z-이성체는 아세틸 시클로스포린 A 알데히드를, 3-(디메틸아미노)프로필트리페닐포스포늄 브로마이드를 칼륨 헥사메틸디실라자이드로 처리하여 얻어진 일라이드와 반응시켜 제조될 수 있다. 얻어진 중간체에 산화과정을 수행한 다음, 코프 제거과정을 행하여 아세틸-Z-247을 얻었다. 염기를 사용하여 탈보호화시켜 ISAtx247을 얻었다. 산화제는 메타클로르퍼벤조산일 수 있다.
무수의 톨루엔(20ml)중의 3-디메틸아미노프로필트리포스포늄 브로마이드 (2.5 g, 5.83 mmol)의 교반된 현탁액에 주사기를 통하여 칼륨 헥사메틸렌디실라자이드(11.6 mL, 5.8 mmol, 톨루엔 중의 0.5M 용액)를 가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 적색 용액을 원심분리하고 상청액을 깔때기를 통하여 반응플라스크에 옮겼다. 얻어진 고체에 무수 톨루엔(10ml)을 가하고, 교반하여 원심분리하였다. 상청액을 반응플라스크에 옮긴 다음, 배합된 적색 일라이드에 OAc-CsA-CHO (1.44 g, 1.17 mmol)를 가하였다. 추가로 2시간 동안 실온에서 색이 담황색으로 변할 때까지 교반을 계속하였다. 반응혼합물을 EtOAc (50 ml)로 희석하고 이어서 NaHCO3 포화수용액(50 ml) 및 소금물(50 ml)로 세척하였다. 건조하여 용매를 제거하면 담황색 고체가 얻어졌다. 실리카겔 컬럼 상에서 크로마토그라피 및 아세톤-헥산 혼합물(변화도: 10-75% 아세톤 및 90-25% 헥산)로 용출하여 모든 인-관련 불순물을 제거하였다. 아세톤으로 추가 용출하여 무색 고체(1.28 g, 84% 수율)로서 원하는 생성물을 얻었다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) : 2.23 (s, 6H), 2.03 (s, 3H). 13C NMR (300 MHz, CDCl3) : 129.33, 126.95 ; MS m/z : 1301 (M+), 1324 (M+Na+).
N-산화물의 전환
CHCl3(3 ml)중의 위티그 반응에서 얻어진 디메틸아미노 화합물의 교반 냉각(0℃)된 용액(0.44 g, 0.34 mmol)에 CHCl3(2 ml)중의 m-CPBA(0.07 g, 0.405 mmol)의 용액을 가하였다. 30분 동안 교반한 후, 디메틸 술파이드(0.5ml)를 가한 다음, CH2CH2(50ml)를 가하였다. NaHCO3용액(25ml) 및 물(25ml)로 세척하여 추가절차를 행하고, 건조하여 용매를 제거한 다음, 고체(0.43 g)를 얻었다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) : 3.19 (s, 3H), 3.18 (s, 3H), 2.03 (s, 3H). 13C NMR (300 MHz, CDCl3) : 131.89, 124. 13 ; MS m/z : 1340 (M+Na+).
N-산화물의 코프 제거과정, 아세틸 ISAtx247의 (Z)-이성체의 제조
N-산화물(350 mg)을 적절하게 교반하고 진공하에 2시간 동안 100℃에서 가열하였다. 이어서 이를 실시카겔 컬럼에 통과시켰다. 아세톤-헥산 혼합물(변화도: 5-25% 아세톤 및 95-75% 헥산)로 용출하여 무색 고체(314 mg)를 얻었다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) : 6.49 (dt, J=16.99, 10.5 Hz, 1H) ; 13C NMR (400 MHz, CDCl3) : 132.20, 131.09, 129.70, 116.85 ; MS m/z : 1279 (M+Na+).
ISAtx247의 (Z)-이성체
메탄올(4ml)중의 (Z)-아세틸 ISAtx247(50 mg)의 용액에 물(1.5 ml) 및 K2CO3(60 mg)를 가하고 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 반응혼합물에서 용매를 증발시키고 EtOAc(20 ml)로 추출하였다. 유기 층을 물(10ml) 및 소금물(10ml)로 세척하였다. 건고하고 용매를 제거하여 무색의 고체를 얻었다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) : 6.58 (dt, J=16.99, 10. 5 Hz, 1H); MS m/z : 1236.8 (M+Na+). 얻어진 화합물은 ISAtx247의 (Z)-이성체이었다. E-이성체는 NMR에 의하여 확인한 결과 관찰되지 않았다.
비록 본 발명의 바람직한 양태만을 특정하여 개시하였고 상기에 기술하였지만, 본 발명의 다양한 변형과 변화가 상기의 기술 관점에서 본 발명의 본질과 의도하는 범위를 벗어나지 않고 첨부한 청구범위의 범위 내에서 가능하다는 것을 이해하여야 할 것이다.
도 1A는 1-아미노산 잔기의 측쇄의 구조 뿐만 아니라 분자내의 시클릭 펩티드 고리를 포함하는 11개의 아미노산 잔기를 예시하는 시클로스포린 A의 구조를 보여준다.
도 1B는 본 명세서에서 사용되는 것과 같은 용어 "CsA"의 정의를 특히 강조하기 위한 시클로스포린 A의 구조의 다른 예시이다.
도 2A는 ISAtx247라고 명명되는 시클로스포린 A 유사체의 (E)-이성체(또는 트랜스-이성체)의 구조를 보여준다.
도 2B는 ISAtx247라고 명명되는 시클로스포린 A 유사체의 (Z)-이성체(또는 시스-이성체)의 구조를 보여준다.
도 3은 반응조건에 따라 입체특이적 경로를 그룹화한 본 발명의 시클로스포린 유사체를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적인 합성 경로들의 조감도이다.
도 4는 브롬 전구체로부터 ISAtx247의 (E)-이성체와 (Z)-이성체의 혼합물을 제조하는 합성 경로를 예시한다.
도 5는 알데히드 전구체로부터 ISAtx247의 (E)-이성체와 (Z)-이성체의 혼합물을 제조하는 합성 경로를 예시한다.
도 6은 ISAtx247의 (E)-이성체 또는 (Z)-이성체 중 어느 하나의 이성체가 동일한 전구체 알콜로부터 제조될 수 있으면서, 이들 이성체들 중 어느 하나가 풍부한 조성물을 제조하는데 사용될 수 있는 예시적인 입체특이 반응도를 예시한다.
도 7은 ISAtx247의 (Z)-이성체가 풍부한 조성물의 입체특이적 합성을 위한 다른 반응도를 예시한다.
도 8은 ISAtx247의 (E)-이성체가 풍부한 조성물의 입체특이적 합성을 위한 다른 반응도를 예시한다.
도 9A 내지 9C는 각각의 반응 조건을 맞추어서 특정한 예시 비율의 2개의 ISAtx247의 (E)-이성체와 (Z)-이성체의 혼합물을 생성하는, 이들 이성체들의 혼합물을 제조하기 위한 합성 경로를 예시한다.
도 10은 2개의 ISAtx247의 (E)-이성체와 (Z)-이성체 중에서 어느 하나가 풍부한 조성물을 우선 제조한 다음, 예정된 비율로 혼합하여 원하는 비율을 달성하는, 이성체들의 혼합물을 제조하는 입체특이적 경로를 예시한다.
도 11은 ISAtx247(45-50%의 (E)-이성체와 50-55%의 (Z)-이성체)에 의한 칼시뉴린 인산가수분해효소 활성의 억제가 시클로스포린 A와 비교하여 3배까지의 높은 잠재력(IC50 으로 측정)이 미친다는 것을 보여주는 분석 결과이다.
도 12는 몇 개의 중수소화된 및 중수소화가 되지 않은(non-deuterated) 유사체 이성체 혼합물의 구조와 이성체 조성물을 보여준다.
도 13은 다양하게 중수소화된 및 중수소화가 되지 않은 유사체 이성체 혼합물에 의한 칼시뉴린 인산가수분해효소 활성의 억제가 시클로스포린 A와 비교할 경우 최소한 이와 동일한 잠재력(IC50 으로 측정)이 미친다는 것을 보여주는 분석 결과이다.

Claims (15)

  1. 삭제
  2. 시클로스포린 A 알데히드의 제조 방법으로서,
    1) 트리메틸실릴(TMS) 시클로스포린 A를 형성하여 시클로스포린 A의 β-알콜을 보호한 다음;
    2) 상기의 TMS 시클로스포린 A를 산화제로서 오존으로 산화시킨 후 환원제로 처리하는 추가절차를 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기의 오존으로 산화시키는 과정을 -80 내지 0℃의 온도 범위 내에서 수행하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기의 환원제는 트리알킬포스핀, 트리아릴포스핀 및 트리알킬아민으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기의 환원제는 알킬아릴 술파이드, 티오술페이트 및 디알킬술파이드로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기의 환원제는 디메틸 술파이드인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기의 환원제는 트리부틸 포스핀인 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기의 환원제는 트리알킬아민인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기의 환원제는 트리에틸아민인 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제2항에 있어서, 상기의 오존으로 산화시키는 과정을 위하여 사용된 용매는 디클로로메탄 및 디클로메탄과 탄소수 5 이하의 저급 알콜의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기의 탄소수 5 이하의 저급 알콜은 메탄올인 방법.
  14. 시클로스포린 A 알데히드의 제조 방법으로서,
    1) 아세틸 시클로스포린 A를 형성하여 시클로스포린 A의 β-알콜을 보호한 다음;
    2) 상기의 아세틸 시클로스포린 A를, 케톤, 활성된 케톤, 아세톡시아세톤 또는 디아세톡시아세톤의 존재하에서, 7이상의 pH에서, 모노퍼설페이트 또는 옥손(oxone)에 의하여 아세틸 시클로스포린 A 에폭사이드로 전환한 후;
    3) 상기의 에폭사이드를 산성 조건하에서 과요오드산 또는 과요오드산염으로 분열시키는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기의 단계 2)와 3)을 추가절차(work-up)에서 결합시키는 방법.
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