JPH08509368A - 組換えアラニンラセマーゼおよびトリポクラジウム・ニベウムからのｇａｐｄｈ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アラニンラセマーゼ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列、およびこれらの配列を用いるアラニンラセマーゼの製造方法に関するものである。本発明はまた、シクロスポリンおよびシクロスポリン誘導体の製造方法に関するものである。さらに、本発明は、トリポクラジウム・ニベウムからのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に関する一部または全体を有する遺伝子、そのプロモーターおよび終止領域を有する新規ＤＮＡフラグメント、並びにその用途に関するものである。別の態様において、本発明はまた、新規ベクターおよびこれらのベクターにより形質転換された細胞に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えアラニンラセマーゼおよびトリポクラジウム・ ニベウムからのＧＡＰＤＨ 本発明は、アラニンラセマーゼ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配 列、およびこれらの配列を用いるアラニンラセマーゼの製造方法に関するもので ある。本発明はまた、サイクロスポリン（cyclosporin）およびサイクロスポリ ン誘導体の製造方法に関するものである。さらに本発明は、トリポクラジウム・ ニベウムからのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ ）に関する部分または全体遺伝子を有する新規ＤＮＡフラグメント、そのプロモ ーターおよび終止領域、並びにその用途に関するものである。別の態様において 、本発明はまた、新規ベクター、およびこれらのベクターにより形質転換された 細胞に関するものである。 トリポクラジウム・ニベウム菌は、微生物学的には不完全菌類に分類されるべ きであり、特にサイクロスポリン形成能力をもつが故にバイオテクノロジー的興 味の対象となっている（ドレフュス等、１９７６）。サイクロスポリン類は、環 状ウンデカペプチド類として定義され、疎水性脂肪族アミノ酸により構成される 。これらの物質は多様な生物学的効果を有する。すなわち、その免疫抑制活性故 に、主要代謝物サイクロスポリンＡは、移植後の臓器拒絶予防における最も重要 な医薬として使用されている。 従って、サイクロスポリン類を製造、またはサイクロスポリン製造に影響を及 ぼす上記および関連生物体の遺伝子操作に関する適当な技術の開発は、極めて有 意義である。それらの技術は、既知サイクロスポリン類の生産性を高めるだけで なく、新規活性材料または他の物質の製造にも貢献し得る。特に、周知の通り、 ＧＡＰＤＨ遺伝子の調節領域、例えばプロモーター領域は、様々な遺伝子の有効 な転写に使用され得るため、その強力な発現に関して重要である。 近年における遺伝子工学技術の進展にともない、組換えＤＮＡ手段による多数 のポリペプチドの生物工学的製造が可能となった。これに関する先行条件のうち の２つは、一つにはその生成物が製造される対応遺伝子であり、もう一つは遺伝 子を対応する宿主細胞へ可能な限り有効に発現させる際に助けとなる適当なＤＮ Ａ構築物である。 サイクロスポリン類の生合成は、他のペプチド抗生物質に関しても報告されて いるとおり、非リボソームチオ鋳型機構により実施される（クラインカウフおよ びフォン・ドーレン、１９９０）。注目されることは、生合成全体が、単一ポリ ペプチド鎖により構成され、サイクロスポリン・シンテターゼと呼ばれるマルチ 酵素により制御されることである。この酵素は、精製され、生化学的に特性確認 された（シュミット等、１９９２）。 サイクロスポリンＡは、３種の非タンパク質生成性アミノ酸、すなわち８位に Ｄ−アラニン、３位にα−アミノ酪酸および１位に非通常アミノ酸（４Ｒ−４− ［（Ｅ）−２−ブテニル］−４−メチル−Ｌ−トレオニン（Ｂｍｔ）を含む。上 記の非タンパク質生成性アミノ酸は、ペプチド抗生物質の特徴的成分である。Ｄ −アミノ酸の組み込みに関して言えば、Ｌ−アミノ酸が酵素により活性化される 、すなわちチオエステルとして結合され、次いで酵素で直接エピメル化されるこ とが、以前に研究されたペプチドシンテターゼにおいて確立された。 これとは対照的に、サイクロスポリン・シンテターゼは、完全なエピメラーゼ 機能をもたない（クラインカウフおよびフォン・ドーレン、１９９０）。前記の ものは、生合成用の１単位としてＤ−アラニンにより供給されなければならない 。従って、トリポクラジウム・ニベウムは、その配列にアラニンラセマーゼをも たなければならない。サイクロスポリンの生合成は、Ｄ−アラニンの活性化によ り８位から始まるため（ラーベン等、１９９２）、このラセマーゼは生合成過程 における基本的機能を保持している。インビトロでサイクロスポリン・シンテタ ーゼはあらゆる位置において８位にある他のアミノ酸も受け入れるため（ラーベ ン等、１９８９）、ラセマーゼ活性の阻止またはインビボでの特異性の変化によ り、８位に変化が加えられたサイクロスポリン類に対する新規発酵方法が開発さ れ得る。 また、前記のアラニンラセマーゼは全て原核生物に由来するものであることも 注目すべきである。原核生物アラニンラセマーゼの主たる機能は、細胞壁合成用 にＤ−アラニンを製造することにある。従って、抗生物質原理としてこれらの酵 素の阻害については非常に徹底的に研究された（ソーンベリイ等、１９８７）。 トリポクラジウム・ニベウム由来のアラニンラセマーゼは、真核生物体から分離 されたこの種では初めての酵素である。 別の態様において、本発明は、アラニンラセマーゼ活性を有する真核生物酵素 をコードする単離ヌクレオチド配列またはそのフラグメントに関するものである 。本明細書の記載において、アラニンラセマーゼ活性を有する酵素とは、Ｄ−ア ラニンまたはＬ−アラニンを両光学対掌体の混合物に変換する酵素である。 ヌクレオチド配列は、好ましくはトリポクラジウム・ニベウムＡＴＣＣ34921 由来のアラニンラセマーゼまたはアラニンラセマーゼ活性を有し、それと少なく とも７０％（例えば少なくとも８０、９０または９５％）の相同性を示す酵素を コードする。これは当然それおよび図５に示されたヌクレオチド配列を意味して おり、本発明はまた、本質的に類似した活性および／または機能を有するタンパ ク質をコードするものを包含し、この場合、アミノ酸配列はそれらのアミノ酸、 例えば図５に示されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列の少な くとも７０％（例えば少なくとも８０、９０または９５％）を含み、１つまたは 他の位置でアミノ酸は保存的に交換され得る。例えば次の保存的交換が可能であ る。 （i） アラニン、セリンおよびトレオニン、 （ii） グルタミン酸およびアスパラギン酸、 （iii）アルギニンおよびリジン、 （iv） アスパラギンおよびグルタミン、 （v） イソロイシン、ロイシン、バリンおよびメチオニン、 （vi） フェニルアラニン、ピロシンおよびトリプトファン。 ｍＲＮＡに関して言えば、下記のコドンは同義である、すなわちそれらは各々 同じまたは保存的に交換可能なアミノ酸をコードする。 i） ＵＵＵ、ＵＵＣ、ＵＡＵおよびＵＣＧ、 ii） ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧ、ＡＵＵ、ＡＵＣ、Ａ ＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡおよびＧＵＧ、 iii） ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＡＧＵ、ＡＧＣ、ＡＣＵ、ＡＣＣ、Ａ ＣＡ、ＡＣＧ、ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＣＧＡおよびＧＣＧ、 iv） ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡおよびＣＣＧ v） ＵＡＡ、ＵＡＧおよびＵＧＡ vi） ＣＡＵおよびＣＡＣ、 vii） ＣＡＡ、ＣＡＧ、ＡＡＵおよびＡＡＣ、 viii）ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧ 、 ix） ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＡおよびＧＡＧ、 x） ＵＧＵおよびＵＧＣ、 xi） ＡＧＵおよびＡＧＣ、 xii） ＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡおよびＧＧＧ。 対応するＤＮＡ配列に関して述べると、上記の個々の箇所に示されているコド ンも同様に同義である。図５に示された構造遺伝子をコードし、上記の同義コド ンが均等なものとして含まれるヌクレオチド配列も同様に本発明に包含される。 すなわち、本記載は、一態様において、トリポクラジウム・ニベウム由来のア ラニンラセマーゼに関する一部または全体遺伝子、そのプロモーターおよび終止 領域を伴う新規ＤＮＡフラグメント、並びにまた株改良を目的とするその用途に 関するものである。別の態様において、本発明はまた、新規ヌクレオチド分子、 ベクターおよびこれらのベクターにより形質転換された細胞に関するものである 。また、８位にＤ−アラニン以外のアミノ酸を含む修飾サイクロスポリン類の製 造方法に特に適した株の構築についても記載されている。別の態様において、本 発明はトリポクラジウム・ニベウムからの全ＧＡＰＤＨ遺伝子の一部に関するも のであり、この場合、「一部」とは、それと少なくとも７０％（例えば、少なく とも８０、９０または９５％）の相同性を示すＤＮＡ配列であるものと理解され 、上記アラニンラセマーゼの場合の記載と同様に同義コドン、さらにそのプロモ ーターおよび終止領域を含み得、相同性ＤＮＡ配列に関する同じ情報が適用され 、その用途も本発明に含まれる。さらに、本発明はまた、遺伝子産物が本質的に 類似した機能または効力を有する場合、これらの遺伝子産物が各々本発明遺伝子 によりコードされるタンパク質の全体または一部に対する抗体により結合または 免 疫沈降する遺伝子を包含する。さらに、本発明はまた、本発明によるヌクレオチ ド配列に類似したヌクレオチド配列を包含する。「類似した」とは、本発明配列 の１つに対して各々ハイブリダイズし得る検定配列を意味する。２本鎖配列の場 合、検定配列および本発明配列は、約１５℃以下のＴＭ差異を有し得る。ハイブ リダイゼーションはストリンジェントな条件下で行われ、この場合、検定配列ま たは本発明配列の１つを担体に適用する。すなわち、変性検定配列または本発明 配列の１つのいずれかをまず担体に結合させた後、ハイブリダイゼーションは、 適度な時間および０.１％ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣ緩衝液中約３５−７０℃の温 度で他の各配列に対して行われる。続いて、担体を同温度で換算ＳＳＣ濃度の緩 衝液により洗浄する。所望のストリンジェンシーおよび配列の相同性の度合いに よって異なるが、上記緩衝液は、一般に各々０.１ＳＤＳを含む、単一強度、半 強度または１／１０強度を有する（１×ＳＳＣ、０.５ｘＳＳＣまたは０.１×Ｓ ＳＣ）ＳＳＣ緩衝液である。最高の類似性を有する配列は、ハイブリダイゼーシ ョンが換算濃度の緩衝液による洗浄によって殆ど影響されない配列である。好ま しくは、検定配列および本発明配列は非常に類似しているため、ハイブリダイゼ ーションは０.１×ＳＳＣ緩衝液（０.１％ＳＤＳ）を用いた洗浄またはインキュ ベーションによって本質的に影響されないままである。また、１つまたは幾つか のコドンに関して本発明配列に修飾が加えられた組換えヌクレオチド配列も本発 明に含まれる。修飾は、対応するアミノ酸の改変コドンを、組換えヌクレオチド 配列が導入される生物体において翻訳するのに好適に使用するという方法で行わ れる。上記生物体における修飾ＤＮＡの発現の結果、本質的に類似したタンパク 質、例えば組換えヌクレオチド配列のタンパク質暗号化成分が内在性である生物 体において非修飾組換えヌクレオチド配列が生成される。 本発明遺伝子の発現は、例えば（i）異種遺伝子からの非暗号化領域５'の突然 変異によるＲＮＡポリメラーゼ結合性の増強、（ii）ステムが同一または別の供 給源、例えばＧＡＰＤＨ遺伝子に由来する、幾つかのプロモーター領域を有する 構築物の使用、（iii）ゲノムへの強力なプロモーターの導入（好ましくは非ラ ンダム）によるオートロガスまたは異種遺伝子の発現の誘導により改良される。 トリポクラジウム・ニベウムの例には、トリポクラジウム・ニベウムＡＴＣＣ 34921およびそこから誘導された株がある。 トリポクラジウム・ニベウム由来のアラニンラセマーゼについては、これまで に文献に記載されたことはない。この酵素の入手方法を見いだすためには、まず 活性のプルーフを示すことが必要だった。出発点は、原核生物ラセマーゼについ て文献に報告された（バデット等、１９８４）ＮＡＤＨ方法であった。形成され たＤ−アラニンは、それをＤ−アミノ酸オキシダーゼでピルベートに酸化するこ とにより証明される。今度はピルベートをＮＡＤＨの消費によりラクテートに還 元する。ＮＡＤＨの消費は、形成されたＤ−アラニンと均等であり、３４０nmで のＵＶ−吸収における還元により測定される。この文献では、この検定法はその 「共役」形態で記載されており、前記反応は全て（アラニンの、ピルベートへの 酸化およびラクテートへの還元）同時に行われることを意味する。この方法では 、トリポクラジウム・ニベウム由来の粗くしか濃縮されていない酵素抽出物にお いて信頼できない測定量しか得られなかった。この理由のため、反応は脱共役状 態であった。第一部セクションでは、Ｌ−アラニンからＤ−アラニンへのエピマ ー化が行われ、酵素の加熱不活化後、形成されたＤ−アラニンは第二部セクショ ンで反応し、ピルベートおよびラクテートが生成した。また、この脱共役は、エ ピマー化反応に関する最適条件が、次の反応により影響されること無く決定され 得るという利点を有する。第一部セクションにおいて反応パラメーター（pＨ最 適値、Ｔ最適値、コファクター必要条件、酸化保護）を注意深く最適化すること により、すなわち高感度の検出方法が、トリポクラジウム・ニベウム由来のアラ ニンラセマーゼに関して確立され得、その原理（部分反応の脱共役）はまた他の 生物体由来のアラニンラセマーゼにも適用され得る。ＩＵＰＡＣ命名法によると 、酵素単位は、１分当たり１マイクロモルのＬ−アラニンをＤ−アラニンにエピ マー化するタンパク質の量として定義される。酵素の精製は慣用的方法により行 われる。細胞解離は、湿潤または凍結乾燥細胞から行われ得る。細胞が湿潤形態 で存在する場合、加圧解離は、例えばマントン・ガウリン装置またはフレンチ・ プレスにより行われ得るか、または解離はガラスボールミルで行われ得る。他方 、凍結乾燥 細胞は、好都合には液体窒素下乳鉢中で粉砕することにより解離される。アラニ ンラセマーゼの場合、菌糸体は湿潤状態で大量に存するため、マントン・ガウリ ン装置による加圧解離が最も好都合な方法であった。 解離の後、平均速度（約１００００ｇ）での遠心分離手段により粗抽出物を概 ね清澄化し、核酸の沈降によりさらに清澄化段階を行った。あらゆる慣用的試薬 、例えばポリエチレンイミンまたはプロタミンスルフェートが核酸の沈降に使用 され得る。適当な濃度は各作業について再評価されるべきである。アラニンラセ マーゼの場合、０.１％ポリエチレンイミンの最終濃度を使用した。 慣用的なタンパク質精製方法を用いることにより、アラニンラセマーゼは、こ の方法で清澄化された粗抽出物から濃縮され得る。好適な第一段階は硫酸アンモ ニウムによる塩析であり、その方法によると、菌糸体抽出後に得られる通常非常 に大量のタンパク質溶液が同時に濃縮され得るためである。この後、あらゆる慣 用的クロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル透過 クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、色素セファロースによ る偽アフィニティークロマトグラフィー、無機担体材料、例えば水酸化リン灰石 によるクロマトグラフィーなどがアラニンラセマーゼの精製に使用され得る。ア ラニンラセマーゼの場合、硫酸アンモニウム沈降後、第一段階は、Ｓ−セファロ ースおよびホスホセルロースから成るカラムの組み合わせによるイオン交換であ った。同緩衝液条件下では、両材料ともカチオン交換型ではあるが、酵素がＳ− セファロースを通り、ホスホセルロースに結合するため、この組み合わせは好適 であった。この性質の結果として、非常に選択的な精製効果が得られる。次の段 階は、セファクリルＳ３００−ＨＲによるゲル透過クロマトグラフィーであった 。モノ−Ｑによるアニオン交換クロマトグラフィーは、最終段階として特に好ま しいものであることがわかった。それはこのカラムではタンパク質の高度分離が 達成され得るためであり、ゲル透過クロマトグラフィー後、非常に希釈された試 料でも高度に濃縮される。この段階後、ラセマーゼ比活性を粗抽出物と比べて約 １００倍濃縮した。色素セファロースまたは疎水性材料を用いた場合、アラニン ラセマーゼの更なる精製は多大な喪失無くしては達成され得ない。しかしながら 、 モノ−Ｑを用いた場合、酵素製品は既に充分清澄であるため、対応するタンパク 質バンドを酵素活性に相関させることができる。最初の相関関係が得られ、その 場合モノ−Ｑから連続して溶離する分画における酵素活性の経過は、ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥにおける個々のタンパク質バンドの出現と相関関係を示す。アラニンラセ マーゼの例と同様にかかる相関関係は多くの場合に得られるが、タンパク質バン ドを直接それらの活性により同定する試みが為されるならばそれは有益である。 アラニンラセマーゼの場合、放射性酵素特異的標識技術をこれに使用した。ア ミノ酸ラセマーゼは必須コファクターとしてピリドキサルリン酸を必要とするこ とが知られている。適切な酵素基質が存在しない場合、このピリドキサルリン酸 をシッフ塩基により酵素の活性中心におけるリジンのイプシロン−アミノ基に結 合する。ＮａＢＨ₄で還元することにより、このシッフ塩基を第２級アミン、お よびすなわち酵素およびコファクター間の共有結合に還元する。三重水素化Ｎａ ＢＨ₄をこの反応にしようする場合、酵素に対し同時に放射性標識が行われ、Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルの乾燥後、オートラジオグラフィーにより可視化され 得る。この方法によると、ピリドキサル含有酵素は全て、若干のラセマーゼにつ いて既に報告されているとおり（ロイゼ等、１９８４、バデット等、１９８４、 エサキおよびワルシュ、１９８６）、粗抽出物からの適当な濃縮後に明確に同定 され得る。実施例３に記載されているとおり、この方法はまたトリポクラジウム ・ニベウム由来のアラニンラセマーゼでも使用され得、３９０００のＭrをもつ タンパク質バンドが同定される。本発明で開発された精製方法によると、約１０ ％酵素製品が得られ、ラセマーゼは明確に同定され得る。この方法を用いると、 約５kgの発酵塊から４mgの総タンパク質が抽出され得る。従って、ラセマーゼの 比率は約４００μg（２.５酵素単位）である。この製品の品質は、実施されるあ らゆる重要な蛋白化学試験、例えばアミノ酸配列決定に充分なものである。 アラニンラセマーゼをさらに特性検定するため、天然酵素の総体モル質量を測 定した。約１０００００のＭrをゲル透過クロマトグラフィーにより測定した。 周知のとおり、分子ふるいに対するタンパク質の反応は、その大きさだけでなく 、その（未知）形状、その疎水性およびゲルマトリックスとの非特異的相互作用 によっ ても異なるため、上記分析により得られた値は単にガイドラインとしてみなされ るべきである。３９０００の変性タンパク質のＭrと組み合わせた場合、一連の 他のラセマーゼに関して記載されているのと同様に（イナガキ等、１９８６、イ ナガキ等、１９８７、ワングおよびワルシュ、１９７８）、アラニンラセマーゼ がホモ２量体として存在する可能性は非常に高い。 アミノ酸配列決定は、慣用的方法により実施され得る。アラニンラセマーゼの 場合と同様、酵素が均一形態で存在しない場合、タンパク質を好都合にはまず第 一にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、タンパク質結合膜にブロットする。最初に 、Ｎ−末端配列決定を試みる。アラニンラセマーゼの場合と同様に、Ｎ−末端が 遮断されている場合、または内部配列決定情報を得るために、タンパク質は膜に おいて直接開裂され得る。フラグメントを膜から溶離し、ＨＰＬＣにより分離し 、通過させて気相配列決定を行う。ＧＡＰＤＨ遺伝子に関して述べると、ＤＮＡ をトリポクラジウム・ニベウムの染色体からクローン化したところ、このＤＮＡ は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、すなわち解糖の中心代 謝経路の酵素に関する遺伝子を含む。遺伝子の構造をその調節領域と一緒に分析 すると、プロモーター領域は、例えばトリポクラジウム・ニベウムに関する強力 な発現ベクター構築用の宿主株として使用され得ることが示された。 現在までのところ、個々の下級真核生物のＧＡＰＤＨに関する若干の遺伝子、 例えばサッカロマイシス・セレビシエ（ホーランドおよびホーランド、１９８０ ）、アスペルギルス・ニデュランス（プント等、１９８８）またはセファロスポ リウム・アクレモニウム（キムラ等、１９９１）が、クローン化および分析され ている。トリポクラジウム・ニベウムからのＧＡＰＤＨ遺伝子およびこれまたは 他の生物体での遺伝子操作技術におけるその使用については、以前に報告された ことがない。 ＧＡＰＤＨ構造遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子の翻訳開始部位、プロモーター活性 部分および転写終止領域は、トリポクラジウム・ニベウムの細胞から分離され得 る。トリポクラジウム・ニベウムの例には、トリポクラジウム・ニベウムＡＴＣ Ｃ34921およびそこから誘導された株がある。 アラニンラセマーゼ遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子に関するＤＮＡは、トリポ クラジウム・ニベウムの染色体ＤＮＡから抽出され得る。次に、染色体ＤＮＡは 、先行技術における様々な方法、例えばキュック等（１９８９）による解離細胞 から直接または同様の方法により分離され得る。別の方法は原形質体により開始 される。この場合、菌細胞は、公知方法、例えばペバーデイ（１９９１）により 要約された方法または対応する修飾法により原形質体化される。トリポクラジウ ム・ニベウムに関して実施例１８に記載された最適化変異体は、非常に適してい る。原形質体の溶解後、ＤＮＡをクライア等の方法（１９７５）または対応する 修飾法（実施例６）に従い単離および精製する。 染色体ＤＮＡのアラニンラセマーゼ遺伝子領域を含むＤＮＡ、またはＧＡＰＤ Ｈ遺伝子領域を含むＤＮＡを検出し、最後にそれをクローンするためには、アラ ニンラセマーゼ遺伝子またはＧＡＰＤＨ遺伝子の存在を確認するものであれば、 いかなる方法でも使用され得る。例えば、原則として、宿主株において対応する 欠陥にアラニンラセマーゼ遺伝子またはＧＡＰＤＨ遺伝子を補足するのに基づい た方法が使用され得る。別の方法でも、一部または全体既知アラニンラセマーゼ 遺伝子または別の生物体からのＧＡＰＤＨ遺伝子とのハイブリダイゼーションに より遺伝子が検出される。アラニンラセマーゼ遺伝子に関する他の可能な微生物 には、例えばサルモネラ・ティフィムリウム（ワッセルマン等、１９８４（dad Ｂ）、ガラクトス等、１９８６（alr））、バシルス・ステアロテルモフィルス （イナガキ等、１９８６、タニザワ等、１９８８）またはバシルス・スブチリス （フェラーリ等、１９８５）がある。しかしながら、これらは原核生物遺伝子に 関するものであって、この場合顕著な相同性は期待され得ないため、まずトリポ クラジウム・ニベウム由来のアラニンラセマーゼタンパク質のアミノ酸部分配列 を決定し、次いでそこから適当な特異的オリゴヌクレオチドプローブを誘導およ び製造することが不可欠である。ＧＡＰＤＨ遺伝子に関する他の適当な微生物は 、例えばサッカロマイシス・セレビシエまたはアスペルギルス・ニデュランスで ある。特殊な場合、ペニシリウム・クリソゲヌム由来のＧＡＰＤＨ遺伝子の部分 が試料として使用され得る。通常、エシェリヒア・コリがクローニング用宿主株 として使用されるが、勿論、他の生物体も使用され得る。１つの好ましい株は、 市販されてい るエシェリヒア・コリＳＲＢ（ストラタジーン）である。使用されるクローニン グベクターは、原則としてエシェリヒア・コリに移入され得るものであればいか なるベクターでもよい。主として、プラスミドベクター、例えばｐＢＲ３２２、 ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣＢＭ２０、ｐＢluescriptII ＳＫ＋など、また はラムダバクテリオファージ、例えばラムダＥＭＢＬ３またはラムダＤＡＳＨII に基づくベクターが使用される。より大きなＤＮＡフラグメントをクローン化す るため、コスミド、例えばベクターのスーパーコス１（ストラタジーン）が使用 され得る。 単離した染色体ＤＮＡのフラグメントをベクターに挿入するために、染色体Ｄ ＮＡは、適当な制限酵素により部分または全体開裂され得る。同様に、選択され たベクターは、同じ制限酵素または同じ結果を生じるものにより開裂され得る。 ラムダまたはコスミドベクターの場合、２つのエッジフラグメントが公知方法に よって生成され得ることにより、クローニング効率は高められる。次いで、ＤＮ ＡフラグメントおよびベクターがＤＮＡリガーゼ手段によって連結され得ること により、対応する組換えＤＮＡ分子が得られる。 次いで、組換えＤＮＡをエシェリヒア・コリに挿入する。プラスミドベクター の場合、これは「形質転換能細胞」（サムブルック等、１９８９）手段または電 気形質転換により行われ得る。ラムダおよびコスミド分予は、ラムダファージの エンベロープバクテリオファージにおけるインビトロ封入、それに続く対応する 宿主株の感染手段によりエシェリヒア・コリに挿入される。市販されているリゼ イトが、インビトロ封入用に使用され得る（例、ギガパックII、ストラタジーン から）。 組換えクローンのうち、アラニンラセマーゼ遺伝子を伴うものまたはＧＡＰＤ Ｈ遺伝子を伴うものを検出するために、ラムダクローンの場合プラークハイブリ ダイゼーションまたはプラスミドおよびコスミドクローンの場合コロニーハイブ リダイゼーションを、両方とも標準方法（サムブルック等、１９８９）に従って 行う。ここで、使用に供されるアラニンラセマーゼ遺伝子に関するプローブはオ リゴヌクレオチド混合物であり、上記の通りアラニンラセマーゼタンパク質のア ミ ノ酸部分配列から誘導されたものである。ここで、予備試験では、まず第一に適 当な混合物を選択し、対応するハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを サザーン実験で充分に最適化しなければならない。プラークハイブリダイゼーシ ョンを数回反復することにより、トリポクラジウム・ニベウムからのアラニンラ セマーゼ遺伝子を含む対応するＤＮＡは、純粋形態で単離され得る。ペニシリウ ムクリソゲヌム由来のＧＡＰＤＨ遺伝子の一部は、ＧＡＰＤＨ遺伝子用のプロー ブとして使用に供され得、この際それに応じてストリンジェンシーを修正しなけ ればならない。この技術を数回反復することにより、トリポクラジウム・ニベウ ム由来のＧＡＰＤＨ遺伝子を含む対応するＤＮＡが純粋形態で単離され得る。 対応するＤＮＡの制限分析後、個々のフラグメントは、標準技術を用いてプラ スミドまたはバクテリオファージＭ１３ベクターにサブクローン化され得る。ア ラニンラセマーゼ遺伝子またはＧＡＰＤＨ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列決 定方法（例、マキサム・ギルバートによる（マキサムおよびギルバート、１９８ ０）またはジデスオキシ方法（サンガー等、１９７７）または適当な修飾法）に より決定され得る。配列の分析および翻訳された配列と同定されたアラニンラセ マーゼのアミノ酸部分配列との比較後、これがアラニンラセマーゼ遺伝子である ことが証明され得、また遺伝子の配向並びにＤＮＡにおけるそのプロモーターお よび終止領域が決定され得る。アラニンラセマーゼ遺伝子またはＧＡＰＤＨ遺伝 子の対応する部分フラグメントのノーザン・ハイブリダイゼーションを用いると 、ハイブリダイズした遺伝子の発現が確認され得る。 対応する配列の分析後、アラニンラセマーゼ遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の 両場合とも、構造遺伝子の位置、プロモーターおよび終止領域が決定され得る。 ゲノムＤＮＡフラグメントと共に、同じくｃＤＮＡ形態の対応するＲＮＡを実験 用に使用する場合、これは実質的に確認され得る。さらに、イントロン領域およ び転写開始点の位置の決定もまた簡易化される。このため、まず第一に、菌細胞 からの全ＲＮＡは、キャサラ等（１９８３）により記載された方法または類似の 方法により単離される。ポリＡ−ＲＮＡは、多くの標準的方法の１つによりそこ から精製される。例えば、ｃ−ＤＮＡにおける転写は、ＰＣＲ増幅技術により実 施 され得る。それに続いて、ＲＡＣＥ（「ｃＤＮＡ末端の急速な増幅」）の手段に より、市販されているシステム（例、ギブコＢＲＬ、クローンテク社から）を用 い、遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いると、すなわち転写の 開始（５'−ＲＡＣＥ）および末端（３'−ＲＡＣＥ）の両方および同じく内部遺 伝子領域（イントロンに関する検定）が分離され、直接配列決定または対応する クローン構築後の配列決定に利用し易くされ得る。この方法は、アラニンラセマ ーゼ遺伝子の特性確認に関する実施例２７で説明されており、この際、正確な転 写開始、転写の決定およびイントロン領域の位置決定をした。別の可能性は、適 当なリンカーまたはアダプターを用いて、ポリ−ＲＮＡの転写後に得られるｃＤ ＮＡを、プラスミドまたはラムダベクターに組み込む方法である。陽性クローン の探索および精製は、プラークまたはコロニーハイブリダイゼーション手段によ って上記と同様に行われ、この際トリポクラジウム・ニベウム由来のＧＡＰＤＨ 遺伝子の一部もまた好都合に使用され得る。こうして検査されたクローンの総数 との比較における陽性クローンの位置により、対応条件下での所望の遺伝子の発 現の強度に関する基準点が得られる。実施例１３と同様ＧＡＰＤＨ遺伝子の場合 、約２.５−３％での陽性クローンの比率が非常に高かった。ＧＡＰＤＨ遺伝子 の適当なｃＤＮＡフラグメントの配列決定後、イントロンの位置並びにプロモー ターおよび終止領域は、ゲノム配列と比較することにより正確に位置決定され得 る。図１５には、実施例１２、１３および１４に従いトリポクラジウム・ニベウ ムから単離されたＧＡＰＤＨ遺伝子のヌクレオチド配列が図示されている。図１ ５の６７３位にあるＡＴＧコドンは、翻訳開始コドン、実際の構造遺伝子の始ま りである。転写出発点上部の非翻訳領域では、構造成分、例えば他の菌プロモー ターにおいて同様の形態で既に見いだされているものが見いだされ得る。これは 、仮想的ＴＡＴＡボックスで終結する、仮定された転写開始点上部の約６０bp長 ＣＴ領域と一致する。いわゆるＣＡＡＴボックスは、約６０bp上方でさらに位置 決定され得る（グル等、１９８７）。 このプロモーター領域を含む対応するＤＮＡフラグメントは、ＧＡＰＤＨ遺伝 子プロモーターの制御下にあるべき遺伝子との個々の融合体の構築に現在使用さ れ得る。ＧＡＰＤＨ遺伝子プロモーターとハイグロマイシン耐性遺伝子との融合 体が含まれるベクターを構築するため、配列決定された領域のある部分を実施例 ２０および２６に従い使用した。しかしながら、これらは上記構築物の単に個々 の可能性であるに過ぎない。例えば、ＤＮＡの一部はまた、領域の５'末端およ び３'−末端の両方で欠失され得る。また、プロモーター部分のみ（実施例２５ と同様）、例えば転写開始点上の部分のみの使用も可能である。他方、構造遺伝 子のさらに大きい部分はまた上記融合体に使用され得る。勿論、同じ反応は、遺 伝子の終止領域から使用されるフラグメントによっても行われる。さらに、プロ モーターおよびターミネーターフラグメントの小部分はまた、恐らくは特殊目的 用に修飾され、例えば発現をさらに増強させ得る。上記ＤＮＡフラグメントの助 けにより、発現される遺伝子を組み合わせて融合構築物を形成することができる 。これらの遺伝子の例は、実施例２０および２５における記載と同様に対応する 生物体における選択マークとして有用なもの、または特殊酵素をコードする任意 の他の遺伝子であり得る。一般に、この遺伝子は、ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡ から形成されたｃＤＮＡの両方から化学的に合成または半合成的に製造され得る 。 トリポクラジウム・ニベウムの特異的修飾に不可欠な前提条件は、対応するプ ロトプラスト化および形質転換方法である。個々の遺伝子構築物に関して使用さ れる宿主株は、トリポクラジウム・ニベウムの種類に属する株であればよいが、 他の菌類に属するものでもあり得る。これらの遺伝子構築物をトリポクラジウム ・ニベウムに移入させる方法は、原形質体の形質転換（実施例１９に記載）に加 えて、別の方法（例、原形質体またはスフェロプラスト化した菌糸体の電気形質 転換など）でもあり得る。形質転換は直接実施され得、この際遺伝子構築は適当 な選択マークと共にベクター−ＤＮＡに配置されるが、または共形質転換により 実施され得る。ここで、適当なベクター−ＤＮＡと共に、別のＤＮＡに存在する 遺伝子構築物もまた形質転換バッチに加えられる。対応する形質転換体に対し、 様々なハイブリダイゼーション技術を用いた分子分析が行われ得る。 従って、上記によると、アラニンラセマーゼに関する遺伝子をもつか、または ＧＡＰＤＨ遺伝子またはその一部をもつＤＮＡによりトリポクラジウム・ニベウ ムを形質転換することが可能である。サザン・ハイブリダイゼーションでは、ア ラニンラセマーゼ遺伝子のいくつかの追加コピーを含む株が見いだされ得る。し かしながら、組み込みの位置および改変された調節機構は重大な影響を及ぼすた め、コピー数だけでは株の追加生産が行われているという納得できる結論には到 達できない。試験発酵では、これらの株が検査され得、次いでさらにサイクロス ポリンＡを形成するものが見いだされ得る。 アラニンラセマーゼ遺伝子の一部をもつ（活性酵素を開発するほど充分ではな い）プラスミドベクターによるトリポクラジウム・ニベウムの形質転換を通して 、相同組換え手法によりプラスミドベクターがゲノムアラニンラセマーゼ遺伝子 に組み込まれた株が生産され得、この際遺伝子は分解されてしまう。試験発酵で は、これらの株がサイクロスポリンＡをもはや形成しないということが示され得 る。これはまた、クローン化された遺伝子が事実上、サイクロスポリンの生合成 に不可欠な酵素アラニンラセマーゼに関する遺伝子であるというさらなる証拠で ある。サイクロスポリンの生合成は８位から、すなわちＤ−アラニンの活性化に より始まるため、アラニンラセマーゼ遺伝子がすでに崩壊されている株は、サイ クロスポリン分子の８位における「外来」アミノ酸の組み込みに関して特に興味 深い。特に、図５に与えられた配列と比べた場合２３１８位にＧ（グアノシン） の代わりにＡ（アデノシン）を有する、すなわち２３１７、２３１８および２３ １９位の３文字がグリシンではなくアスパラギン酸をコードするヌクレオチド配 列により、サイクロスポリンの８位にＤ−アラニンではなくＤ−セリンが組み込 まれることが見いだされた。大量の「外来」アミノ酸を発酵培地に加えることに より、かなりの量の修飾サイクロスポリンを形成し得る株が見いだされ得る。 ８位にＤ−アラニン以外のアミノ酸をもち、本発明に従い製造され得るサイク ロスポリン類は、例えばアメリカ合衆国特許５２８４８２６に開示および引用さ れており、その内容をここに引用して説明の一部とする。これらの修飾サイクロ スポリン類は、そこに開示および引用された使用分野における医薬として使用さ れ、そこに指示および引用された方式および方法並びにそこに指示および引用さ れた用量で使用され得る。 以下、実施例および図によって本発明を説明するが、それらは本発明を制限す るものではない。図１、２、３、４、６、７、１０、１２、１７、１８および１ ９に示された制限地図は、ＤＮＡ分子における制限開裂点の部分的なおおよその 再現にすぎない。図示された距離は実際の距離に比例するが、後者は異なる場合 もあり得る。全ての制限開裂点が再現されているわけではない。さらに別の開裂 点が終始存在することも可能である。 図１：ラムダＲＡＣ４におけるトリポクラジウム・ニベウムのゲノムＤＮＡの 約１５.２kb部分の制限地図（白色バンド）。暗色バンドは約１１００bp ＰstＩ 制限フラグメントを示し、それはハイブリダイゼーションプローブ（オリゴヌク レオチド混合物Ｒ１４）により陽性シグナルを与え、ｐＲＰ１でクローン化され たものである。斜線をいれた２つのバンドはｐＲＰ６またはｐＲＰ９でサブクロ ーン化された隣接フラグメントを説明している。 図２：プラスミドｐＲＰ１の制限地図。暗色バンドは約１１００bp ＰstＩ制 限フラグメントを表し、それはハイブリダイゼーションプローブ（オリゴヌクレ オチド混合物Ｒ１４）により陽性シグナルを与えた。薄色部分は、使用されたプ ラスミドベクターｐＵＣＢＭ２０の領域を説明している。 図３：プラスミドｐＲＰ６の制限地図。暗色バンドは、ラムダＲＡＣ４からの 約１.９ｋｂのＥcoＲＩ−SalＩ制限フラグメントを表す。薄色部分は、使用され たプラスミドベクターｐＵＣＢＭ２０の領域を説明している。 図４：プラスミドｐＲＰ９の制限地図。暗色バンドは、ラムダＲＡＣ４からの 約６５０ｂｐのＨind III−ＰstＩ制限フラグメントを表す。薄色部分は、使用 されたプラスミドベクタ−ｐＢluescriptII ＳＫ＋の領域を示す。 図５：ｐＲＰ１における約１.１kb ＰstＩ挿入体、ｐＲＰ６からの約１.９kb ＥcoＲＩ−ＳalＩフラグメント、ｐＲＰ９からの約６５０ｂｐ ＰstＩ−Ｈind IIIフラグメント、および追加として３９７３ヌクレオチドに及ぶＨindIII部位 を連結する５１１bpのヌクレオチド配列（図１９も参照）。制限エンドヌクレア ーゼに関する個々の認識部位が示されている。 図６：図５から配列決定された部分領域の制限地図。発見されたアミノ酸部分 配列（実施例１２）の位置が示されている。 図７：プラスミドｐＲＰ１２の制限地図。暗色バンドは、ｐＲＰ１からの約８ ３５ｂｐのＥcoＲＩ−ＰstＩ制限フラグメントを表す。薄色部分は、使用された プラスミドベクターｐＵＣＢＭ２０の領域を示す。 図８：プラスミドｐＧＴ２４の制限地図。プラスミドは、ｐＧＴ１４から誘導 され、ハイグロマイシン耐性遺伝子をもつＢamＨＩフラグメント（白色）を含み 、その方向は付点した矢印により特徴が示されている。 図９：プラスミドｐＧＴ１の制限地図。暗色バンドは、実施例１２で単離され たトリポクラジウム・ニベウムからのＧＡＰＤＨ遺伝子をもつＳacＩフラグメン トを表す。薄色部分は、使用されたプラスミドベクターｐＵＣ１８の領域を示し ている。 図１０：ｐＧＴ１からの２２７１bp ＳacＩフラグメントのヌクレオチド配列 。 図１１：プラスミドｐＧＴ４の制限地図。暗色領域は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のク ローン化ｃＤＮＡ（gpdＡ）（実施例１３）を表す。薄色領域は、プラスミドベ クタ−ｐＵＣＢＭ２０の部分を示している。 図１２：ｐＧＴ４における１３４７bp ｃＤＮＡ挿入体のヌクレオチド配列。 １−１４および１３３４−１３４７位（下線部）は、クローニングに使用される アダプター分子に対応し、制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）お よびＮotＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）に関する認識部位を含む。 図１３：ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター（実施例１４）を含む、gpdcos１か らの１２７８bp ＸhoＩ−ＳalＩフラグメントのヌクレオチド配列。ＳacＩ認識 部位は、図１１における１−６位のそれに対応する。 図１４：ゲノムヌクレオチド配列（上）とｃＤＮＡ（下）の場合との比較（実 施例１４）。個々の制限開裂点の特性が示されている。２つのイントロン領域は 線により示されている。翻訳開始コドンＡＴＧおよび翻訳停止コドンＴＡＡには 下線が付されている。それらは、トリポクラジウム・ニベウムからの実際のＧＡ ＰＤＨ構造遺伝子の位置を指定している。 図１５：誘導されたＧＡＰＤＨのアミノ酸配列。 図１６：プラスミドｐＧＴ１２（実施例２０）の制限地図。灰色の矢印は、ト リポクラジウム・ニベウムからのＧＡＰＤＨ遺伝子の選択されたプロモーターフ ラグメントの領域および方向を示している。薄色領域は、使用されたプラスミド ベクターｐＢluescriptII ＳＫ＋の部分に対応する。 図１７：プラスミドｐＧＴ１４（実施例２０）の制限地図。灰色領域は、使用 されたプロモーターフラグメント（矢印）およびトリポクラジウム・ニベウムか らのＧＡＰＤＨ遺伝子のターミネーター領域からのフラグメントを特定している 。 図１８：プラスミドｐＧＴ３０（実施例２６）の制限地図。灰色の矢印は、ト リポクラジウム・ニベウムからのＧＡＰＤＨ遺伝子の選択されたプロモーターフ ラグメントの領域および方向を示している。白色バンドにより示されたフラグメ ントはハイグロマイシン耐性遺伝子を含み、その方向は点の付された矢印により 特定されている。プラスミドの残りは、ｐＣＳＮ４４（スタベン等、１９８９） に対応する。 図１９：ヌクレオチド配列から誘導されたトリポクラジウム・ニベウムからの アラニンラセマーゼのアミノ酸配列。 図２０：３９７３bpアラニンラセマーゼ遺伝子領域のヌクレオチド配列。構造 遺伝子の暗号化領域は、アミノ酸配列の図示により特定されている。イントロン の位置が示されている。 図２１：アラニンラセマーゼ遺伝子の３２ ５'−ＲＡＣＥクローンの配列決定 の結果。開始ヌクレオチドは各々示された大きなＡである。同一の配列決定領域 はダッシュにより示されている。位置の数字は翻訳開始コドンのＡを指す。 図２２：アラニンラセマーゼ遺伝子の１２ ３'−ＲＡＣＥクローンの配列決定 の結果。個々のＤＮＡの末端上部に、ゲノム配列が基準点としてイタリック体で 示されている。位置の数字は翻訳開始コドンのＡを指す。「／」の後の数は、停 止コドンのあとの３'−領域の長さを示す。 実施例１ アラニンラセマーゼ活性の分析的測定。 第１段階：ラセマーゼ反応： 約１mＵのラセマーゼを、４８℃で１時間３０mＭのＬ−アラニン、５０μＭの ピリドキサルリン酸（ベーリンガー・マンハイム）、２０mＭのＤＴＴおよび１ ００mＭのトリシン（ｐＨ８.５）の存在下１２０μlの総容量中でインキュベー ションする。その後、タンパク質溶液を８０℃で５分間加熱することにより不活 化する。変性タンパク質をエッペンドルフ遠心分離器で遠心分離する。 第２段階：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＯ）および乳酸デヒドロゲナーゼ （ＬＤＨ）（両酵素ともベーリンガー・マンハイムから）との反応により形成さ れたＤ−アラニンの検出。 加熱不活化ラセマーゼ反応からの１００μlの上清を、２００μＭのＮＡＤＨ （ベーリンガー・マンハイム）、０.３単位のＤＡＯ、１単位のＬＤＨおよび１ ００mＭのトリシンの存在下ｐＨ８.５、３０℃で５００μlの総容量で測定する 。 この反応は、５００μl石英キュッベト（石英ガラスのスプラジルマイクロキ ュベット）中で行われ、ＮＡＤＨ消費により誘発された吸光度の低下を、３４０ nmで２０分間測定する。 酵素単位の測定：ＩＵＰＡＣ命名法に従い、１ラセマーゼ単位を、１分間に形 成される１マイクロモルのＤ−アラニンとして定義する。Ｄ−アラニンの形成は 、ＮＡＤＨの消費に対して当モルである。 実施例２ アラニンラセマーゼの濃縮： 次の方法を用いて、約４mgの総タンパク質を１kgの湿潤菌糸体（遠心分離後に 湿潤、下記の通り）から抽出すると、アラニンラセマーゼはこの総タンパク質の 約１０％（約０.４mg）の比率を有する。これらの０.４mgのアラニンラセマーゼ は、２.５酵素単位の活性を有し、粗抽出物に基づくと酵素活性の１０００倍濃 縮に相当する。 全ての段階は０℃〜４℃で行われる。カラム・クロマトグラフィーにより行わ れる分離は全て、ＦＰＬＣ装置（ファルマシアから）で実施された。 第１段階： 菌糸体の採取および解離： ４−５ｋｇの発酵パルプを、１６０００ｇで１０分間遠心分離した。５mＭの ＥＤＴＡを加えながら、パルプを２.５リットルの生理学的塩化ナトリウム溶液 で２回洗浄した。こうして得られた湿潤バイオマス１kgを、２.５リットルの緩 衝液Ａ（０.２５モルのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.５、０.４モルのＫＣｌ、５ミリモ ルのＥＤＴＡ、２０wv％のグリセリン、１０ミリモルのＤＴＴ）に懸濁し、ウル トラツラックスの助けをかりてホモジネートした。上清を、マントン・ガウリン ・ラボ６０において３回各々６００バールで（流速６０リットル／時）解離した 。温度を終始４℃に再調整した。細胞片を、１６０００ｇで１０分間中速度設定 遠心分離器で遠心分離した。上清を粗抽出物として定義した。 第２段階： 粗抽出物からの核酸の除去。 核酸を、ポリエチレンイミン溶液（水中１２％、透析により低分子量成分を除 去）を加えることにより沈澱させて０.１％の最終濃度にした。沈澱物を１７０ ００ｇで１０分間遠心分離により除去した。この清澄化粗抽出物を、ポリエチレ ンイミン上清として定義した。 第３段階： 硫酸アンモニウムによるタンパク質沈澱： ポリエチレンイミン上清を、緩衝液Ｂ（０.１モルのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.５、 ４ミリモルのＥＤＴＡ、１５wv％グリセリン、４ミリモルのＤＴＴ）中１００％ 飽和硫酸アンモニウム溶液を滴下することにより硫酸アンモニウムに対し４０％ 飽和に調節した。この滴下後、攪拌を３０分間行った。タンパク質沈澱物を３２ ０００ｇで３０分間遠心分離した後、緩衝液Ｂ中５００mlに溶かし、１２時間５ リットルの緩衝液Ｂに対し透析した。第４段階の前に、透析物を緩衝液Ｂにより その２倍容量に希釈し、８μグラスファイバーフィルターを通して濾過した。こ うして得られた試料を、硫酸アンモニウム分画として定義した。 第４段階： 陽イオン交換体Ｓ−セファロースおよびホスホセルロースＰ１１ による組み合わせクロマトグラフィー： タンパク質を適用したとき、それらがまずＳ−セファロースにより濾過され、 次いでホスホセルロースに結合される形となるように、２つのカラム（Ｓ−セフ ァロースのファースト・フローはファルマシアから：２.６×７.８cm、およびホ スホセルロースＰ１１はホワットマンから入手：５×７.９cm）を縦に接続した 。ク ロマトグラフィーのこの部分は、緩衝液Ｂ中１０ml／分の流速で行われた。吸光 度が基本線に戻るまで、共役カラムを緩衝液Ｂで洗浄した。その後、Ｓ−セファ ロースは脱共役状態であり、ホスホセルロースは塩勾配：緩衝液Ｃ（＝１モルＮ ａＣｌを含む緩衝液Ｂ）での７００ml中勾配で溶離した。流速：５ml／分。活性 分画をプールし、０.８μ膜フィルターで濾過した。この試料をＰ１１プールと して定義した。 第５段階： 限外濾過によるＰ１１プールの濃縮： ３００００のＭｒでの分離限界を有する膜（アミコンからのＹＭ３０）により 、Ｐ１１プールを１０mlに濃縮した。条件：アミコンからの限外濾過セル、Ｎ２ 気体下、最大５バール、４℃。 第６段階： セファクリルＳ３００−ＨＲによるゲル透過クロマトグラフィー ： セファクリルＳ３００−ＨＲはファルマシアから入手、２.６×９.５cm。カラ ムを、０.２モルのＮａＣｌを加えながら、緩衝液Ｄ（５０ミリモルのトリス／ ＨＣｌ ｐＨ８.２、１ミリモルのＥＤＴＡ、１０wv％のグルセリン、４ミリモ ルのＤＴＴ）中で平衡状態にした。バイオラドＧＰＣ標準により同緩衝液条件下 で較正を行った。クロマトグラフィー：流速１ml／分。活性は２６８−３０２ml の容量で溶離。こうして得られた試料をＳ３００プールとして定義した。 第７段階： モノ−Ｑによるアニオン交換クロマトグラフィー。 モノ−ＱカラムＨＲ５／５をファルマシアから入手し、緩衝液Ｄ中で平衡状態 にした。Ｓ３００プールを２分量でモノ−Ｑにより精製した。緩衝液Ｄに対して 透析後、試料を各々０.５ml／分の流速で適用した。結合タンパク質の溶離は、 ０.２ml／分の流速で、２ml中０〜２０％緩衝液Ｅ（＝１モルＮａＣｌを含む緩 衝液Ｄ）、１５ml中２０〜７０％Ｅおよびさらに３ml中７０〜１００％Ｅの勾配 により行われた。ラセマーゼ活性の主要ピークは、０.３２〜０.３６モルＮａＣ ｌであった。 実施例３ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質バンドの同定： ラセマーゼ活性と相関関係を示すタンパク質バンドを正確に同定するため、放 射性酵素特異的標識技術を使用した。モノ−Ｑによる最終精製段階後、ラセマー ゼ含有タンパク質溶液（２００μl中０.２mg総タンパク質）を、標識前に約１０ 時間２０ミリモルのＫＨ₂ＰＯ₄緩衝液ｐＨ７に対して透析した。２μlの０.２％ ＮａＯＨ中１０mg／mlのＮａＢＨ₄溶液および同じく０.２％ＮａＯＨ中３.７Ｍ Ｂq［３Ｈ］−ＮａＢＨ₄（比活性：３３１ＧＢq／ミリモル、ＮＥＮから）を含 む３００μlの総容量中室温で３時間還元した。その後、緩衝液を数回交換しな がら、バッチを１００ミリモルのＮＨ₄ＨＣＯ₃に対して透析し、真空中濃縮乾固 した。沈澱物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の５０μl試料緩衝液中にとり、５分間煮沸 した。レムリ（レムリ、１９７０）に従い１０％ゲルで電気泳動を行い、続いて クーマシーブルー染色を行った。次いで、ゲルを３０分間固定し（２５％イソプ ロパノール、１０％酢酸、２％グリセリン中）、続いて増幅溶液（アマーシャム から、２％グリセリンを加える）中で１５分間洗浄した。ゲルを乾燥し、２〜４ 週間−７０℃でハイパーフィルム（商標）−ＭＰ（アマーシャム）で暴露した。 この方法によると、ラセマーゼ活性と３９０００のＭrを有するタンパク質バン ドとの相関関係が明確に示され得る。 実施例４ アラニンラセマーゼの分子量分析： ＨＰＬＣ装置において、ＴＳＫ−ＳＷＧ２１.５×７５mm予備カラムを伴うＴ ＳＫ−３０００−ＳＷＧ２１.５×６００mmでＭr分析を行った。緩衝液：０.２ モルのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７.５、流速：５ml／分。標準タンパク質アルドラ ーゼ（Ｍr１６００００）、ＩgＧ（１５００００）、アルカリ性ホスファターゼ （１４００００）、ＢＳＡ（６８０００）、卵アルブミン（４５０００）、カル ボアンヒドラーゼ（３００００）およびミオグロブリン（１８８００）により、 ゲル酸の較正を行った。約１０００００のＭrが測定された。 実施例５ アラニンラセマーゼのアミノ酸配列： タンパク質試料に対し、ミニ・プロテアンII電気泳動システム（バイオ・ラド ） においてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）を行った。電気泳動後、ゲルを５分間トラ ンスファー緩衝液（１０ミリモルのＣＡＰＳ、（３−（シクロヘキシルアミノ） −１−プロパンスルホン酸、フルカ）、１０％メタノール、水酸化ナトリウム溶 液で調節してｐＨ１１.０）中で平衡状態にした。ＰＶＤＦ（ポリビニリデン− ジフルオリド）膜（インモビロン、ミリポア）を５秒間メタノールに浸し、次い で同様にトランスファー緩衝液中で平衡状態にした。その後、２００mＡで１時 間かけてミニ・トランス−ブロットセル（バイオ・ラド）において、タンパク質 をゲルから膜に移した。移した後、膜を５分間水で洗浄し、次いで２分間５０％ メタノール中クーマシー・ブルーＲ−２５０（セルバ）の０.１％溶液で染色し 、タンパク質バンドが明確に同定され得るまで５０％メタノール、１０％酢酸で 脱色した。それに続いて、膜を水で洗浄し、アラニン−ラセマーゼ−含有バンド が開裂され（染色の結果、アラニンラセマーゼの推定量は２５μgである）、約 １mm横長の四角に切断し、１００％メタノール中０.２％ＰＶＰ−４０（ポリビ ニルピロリドン）（シグマ）溶液１mlに加えた。３７℃で１時間インキュベーシ ョンし、水で洗浄後、膜片を１００ミリモルのトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８.１ に加えた。 ２μgのプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ（ベーリンガー・マンハイム）を加えた後、 ３７℃でインキュベーションを行った。２０時間インキュベーション後、６モル の最終濃度に到達するまで固体グアニジン・ＨＣｌを加えた。３００μgのＤＴ Ｔを加え、アルゴン下３７℃で９０分間インキュベーションすることにより、タ ンパク質は還元され、それに続いて暗所中室温で３０分間アルゴン下ＤＴＴに対 し３倍モル過剰のヨードアセトアミドを加えることによりアルキル化された。Ｌ ｙｓ−Ｃによる分解により生成する還元およびアルキル化されたペプチド混合物 を、２.１×３０mm逆相カラム（アクアポアＲＰ−３００、７μm、ブラウンリー ）に加え、アプライド・バイオシステムズからのモデル１３０Ａ ＨＰＬＣシス テムで分離した。７０％アセトニトリル（０.０７５％トリフルオロ酢酸含有） に対する水中０.１％トリフルオロ酢酸の勾配によるカラムの溶離により、ペプ チドが分離され、この際、勾配は、２０分で０％〜６０％およびさらに１０分で ６０％〜１００％であった。溶離ペプチドを集め、それらのアミノ酸配列を、製 造者の指 示に従い気相シーケネーター４７０Ａ（アプライド・バイオシステムズ）で測定 した。 aa1750:ＡＷＡＤＥＱＥＩＡＩＨＩＤＧＡＲＩＷ aa1751:ＳＴＬＤＴＡＡＱＨＲ aa1753:ＡＧＨＷＧＤＰＴＬＴＧＳ aa1758:ＥＡＡＬＦＶＶＳＧＴＭＡＮＱＩＡＬＧＡＬ 実施例６ トリポクラジウム・ニベウムからの高分子量ゲノムＤＮＡの分離。 プロトプラスト、例えば実施例１８記載のものを製造した。約１０⁹プロトプ ラストを２mlのＴＥ（１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、１ミリモルのＥＤＴＡ、 ｐＨ８.０）に注意深く溶かした。０.１mg／mlのリボヌクレアーゼＡを加え、イ ンキュベーションを３７℃で２０分間行った。０.５％のＳＤＳおよび０.１mg／ mlプロテイナーゼＫを加えた後、インキュベーションを５５℃でさらに４０分間 行った。バッチを非常に注意深く２回、各回ともＴＥ−飽和フェノール、フェノ ール／クロロホルム（１：１）およびクロロホルム／イソアミルアルコール（２ ４：１）（マニアチス等、１９８２）により抽出した。水性の微粘ちゅう性上清 を、その容量の１０分の１の３モル酢酸ナトリウム（ｐＨ５.２）と混合し、そ の２.５倍容量の無水エタノール（−２０℃）により被覆し、ガラス棒を用いる と相中間面でＤＮＡが微細糸形態で巻かれた状態になった。ＤＮＡを少なくとも ２０時間３mlのＴＥに溶かした。プロトプラストの質によって異なるが、約５０ ０μg／mlのＤＮＡが得られた。ＦＩＧＥ（０.８％アガロース、０.５×ＴＢＥ （マニアチス等、１９８２）、６Ｖ／cm、フォワードパルス０.２〜３秒、パル ス比３.０、稼動時間５時間）により分析すると、１５０kbを越える大きさが得 られた。 実施例７ トリポクラジウム・ニベウムからのゲノムラムダ遺伝子バンクの構築 実施例６からの約１００μgのＤＮＡの２つのバッチを、１mlの緩衝液（トリ ス−酢酸３３ミリモル、酢酸マグネシウム１０ミリモル、酢酸カリウム６６ミリ モル、ＤＴＴ０.５ミリモル、ｐＨ７.９）中１時間３７℃で各々９および１８単 位の制限酵素ＮdeII（ベーリンガー・マンハイムから）により開裂した。制限体 のアリコートをＦＩＧＥにより試験すると、得られたフラグメントについて各々 約２５および１０kbの最大値が得られた。勾配ミキサーを用いると、超遠心分離 マイクロチューブにおいて３ミリモルＥＤＴＡ ｐＨ８.０中３０％〜５％の線形 ＮａＣｌ密度勾配が生じ、ＤＮＡが適用された。３７０００rpmおよび２５℃で ５時間遠心分離後（ベックマンＬ７−６５超遠心分離器、ローターＳＷ４１）、 勾配を５００μl分画で採取した。１２kbを越え２５kb未満のＤＮＡを含む分画 のみを、ＴＥ（トリス−ＨＣｌ １０ミリモル、ＥＤＴＡ１ml、ｐＨ８.０）に対 して２時間３回透析し、エタノールで沈澱したものを各々５０μlのＴＥに溶か した。ラムダＤＡＳＨII（ストラタジーンから）をクローニングベクターとして 使用した。ＢamＨＩおよびＨindIIIによるベクターの制限後、サムブルック等（ １９８９）による指示に従い２本のベクターアームを製造した。これら１μgを 、１２℃で１６時間１６単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイ ムから）により２０μlのライゲーション混合物（トリス−ＨＣｌ ６６ミリモル 、ＭｇＣｌ₂ ５ミリモル、ＤＴＥ１ミリモル、ＡＴＰ１ミリモル、ｐＨ７.５） 中約５００ngのＤＮＡフラグメントと連結させた。４μｌ分量のバッチを、封入 抽出物（ギガパックII、ストラタジーンから）と共にラムダファージエンベロー プ中に封入した。エシェリヒア・コリＳＲＢ（ストラタジーンから）を感染用宿 主株として使用し、サムブルック等（１９８９）に従いバクテリオファージラム ダ−形質転換能細胞を製造した。感染後、バッチを、１０ミリモルＭｇＳＯ₄を 伴うＬＢ培地（マニアチス等、１９８２）においてアリコートに分けて培養した 。エシェリヒア・コリＳＲＢを指標株として再び使用した。組換えクローン体は 細菌ソードにおけるプラークとして認識され得た。約５００００プラークをＳＭ 緩衝液（５.８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏおよび５０ミリ モルのトリス−Ｃｌ ｐＨ７.５）で洗浄し、得られた遺伝子バンクをアリコート に分けて４℃で貯蔵した。力価測定では約１×１０⁸ｐfu／mlが得られた。 ３０の無作為に選ばれたクローンに関するそこに含まれるラムダ−ＤＮＡの単 離および制限による分析は、全てのクローンが組換えラムダファージを含むこと を示した。平均挿入サイズは１５kbであった。 実施例８ トリポクラジウム・ニベウムのゲノムコスミド遺伝子バンクの構築 実施例６からの約１３５μgのＤＮＡの２つのバッチを、実施例７における記 載と同様、各々７.５および１５単位の制限酵素ＮdeIIにより開裂した。制限体 のアリコートを試験すると、得られたフラグメントについて各々約４５および３ ０kbの最大値が得られた。 勾配ミキサーを用いると、超遠心分離マイクロチューブにおいて３ミリモルＥ ＤＴＡ ｐＨ８.０中３０％〜５％の線形ＮａＣｌ密度勾配が生じ、ＤＮＡが適用 された。遠心分離後、勾配を５００μl分画で採取した。３０kbを越え５０kb未 満のＤＮＡを含む分画のみを、ＴＥに対して２時間３回透析し、エタノールで沈 澱したものを各々５０μlのＴＥに溶かした。 ｓＣosｌ（ストラタジーンから）をクローニングベクターとして使用した。エ バンス等（１９８９）による記載に従い、ＢamＨＩおよびＸbaｌにより開裂した ベクターアームを製造し、修飾した。これら１μgを約５００ngのＤＮＡフラグ メントと連結させ、ラムダファージエンベロープ中に封入した。エシェリヒア・ コリＳＲＢ（ストラタジーンから）を感染用宿主株として使用した。感染後、バ ッチを、７５μg／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地においてアリコートに分け て培養した。組換えクローン体は、３７℃で２０時間後コロニーとして認識され 得た。合計で、約５００００のコロニーが得られ、次いでそれらを０.９％Ｎａ Ｃｌ／２０％グリセリンに懸濁し、−７０℃で貯蔵した。４０の無作為に選ばれ たクローンに関するそこに含まれるコスミドの単離および制限による分析は、全 てのクローンが組換えコスミドを含むことを示した。平均挿入サイズは３６kbで あった。 実施例９ 適当なオリゴヌクレオチド混合物の選択および試験 ハイブリダイゼーションプローブを製造するため、下記のＤＮＡ配列を、一般 的遺伝子コードを用いて逆翻訳によりアラニンラセマーゼのアミノ酸部分配列ａ ａ１７５０（実施例５）から誘導した。 ３つのオリゴヌクレオチド混合物をそこから合成した結果、非暗号化鎖（下線 領域）の配列のある部分と対応していた。 これらのオリゴヌクレオチド混合物各々約１０ピコモルを、５０μＣiガンマ −３２Ｐ−ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ミリモル）および８単位のＴ４−ポリヌクレ オチドキナーゼ（ベーリンガー・マンハイムから）を含む２０μlの緩衝液（５ ０ミリモルのトリス−Ｃｌ ｐＨ７.６、１０ミリモルのＭｇＣｌ₂、５ミリモル のジチオトレイトール、０.１ミリモルのスペルミジンＨＣｌ、０.１ミリモルの ＥＤＴＡ（ｐＨ８））中３７℃で４５分間放射性標識した。８０％を越える割合 の放射能がオリゴヌクレオチドに取り込まれた。ハイブリダイゼーションを試験 するため、トリポクラジウム・ニベウムからのゲノムＤＮＡ（実施例６）各１０ μgを、ＳalＩ、ＥcoＲＩおよびＨindIIIにより開裂し、サザーン・ハイブリダ イゼーション で調べた。０.８％アガロースゲルを、真空ブロッティング手段（バキュブロッ ト、ファルマシアから）によりナイロン膜（デユラロン−ＵＶ、ストラタジーン から）に移した。５ml／１００cm² ６×ＳＳＰＥ（マニアチス等、１９８２）、 ５×デンハーツ溶液（マニアチス等、１９８２）、０.５％ＳＤＳ、１００μg／ ml加熱変性ニシン精液ＤＮＡ、０.１ミリモルＡＴＰ中３７℃で１６時間プレハ イブリダイゼーションを行った。対応する³²Ｐ−標識オリゴヌクレオチド混合物 を加える前、温度を６５℃に高め、次いで５５℃、４５℃および最後には３７℃ に各々１.５時間調節した。３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った 。 膜を４℃で５分および３０分間６×ＳＳＣ（マニアチス等、１９８２）中で洗 浄した。それに続いて、膜を室温で５分間テトラメチルアンモニウムクロリド（ ＴＭＡＣ）洗浄溶液（３.００モルのＴＭＡＣ、５０ミリモルのトリス（ｐＨ８. ０）２ミリモルのＥＤＴＡ、０.１％ＳＤＳ）（ウッド等、１９８５）で洗浄し た。最後に、ＴＭＡＣ洗浄溶液中で４０分間５６℃の精密温度で洗浄を２回行っ た。膜をフィルムに包み、−７０℃で１４日間コダック強化フィルムを用いてＸ 線フィルムに暴露した。 オリゴヌクレオチド混合物Ｒ１３およびＲ１５とのハイブリダイゼーションで は、シグナルは検出され得ず、Ｒ１４の場合のみ陽性であった。制限体において 、バンドは各々認識され得、ＳalＩによる制限の場合これは約２.９kbに局在し 、ＥcoＲＩおよびＨindIIIの場合サイズは６kbを越えていた。 実施例１０ アラニンラセマーゼ特異的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするラムダク ローンの単離 実施例７からのラムダバンクのアリコートを、適当な希釈率で１０ミリモルの ＭｇＳＯ₄を含むＬＢ培地（マニアチス等、１９８２）に適用することにより、 １プレート当たり約２５００プラークの力価に達した。合計約２００００プラー クを検査した。製造者の勧告に従いナイロン膜（デユラロン−ＵＶ、ストラタジ ーンから）へ移した。実施例８における記載と同じハイブリダイゼーションおよ び洗浄条件下で遺伝子バンクのスクリーニングを行った。 ４つの陽性シグナルがＸ線フィルムから見いだされた。プレートのアガロース 層の対応領域を打ち抜き、ＳＭ緩衝液（５.８ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌのＭ ｇＳＯ₄ｘ７Ｈ₂Ｏおよび５０ミリモルのトリス−Ｃｌ、ｐＨ７.５）に再懸濁し た。適当な希釈物を、１０ミリモルのＭｇＳＯ₄を含むＬＢ培地においてエシェ リヒア・コリＳＲＢと共に再投与し、次いでプラークを膜に移した。更新ハイブ リダイゼーションにより、それに続き第３回目の同様に実施されるハイブリダイ ゼーションにより、陽性クローンを精製した。 ４つのラムダクローン、ラムダＲＡＣ１〜ラムダＲＡＣ４のＤＮＡを単離し、 制限分析手段およびそれに続く放射性標識オリゴヌクレオチド混合物Ｒ１４（実 施例９）とのハイブリダイゼーションにより検査した。特に、約１.１kbのＰstI 制限フラグメントが陽性シグナルを与えることが示された。図１は、上記ラムダ クローン（＝ラムダＲＡＣ４）のトリポクラジウム・ニベウム部分の制限地図を 示す。 実施例１１ ラムダＲＡＣ４からのサブフラグメントのクローニング 約１.１kbのＰstIフラグメント（実施例１０）をクローンするため、約１０μ gのラムダＲＡＣ４をＰstＩで完全に開裂し、１.０％アガロースゲル（ジーンク リーンII、バイオ１０１から）から約１.１kbのＰstＩフラグメントを溶離した 。プラスミドベクターｐＵＣＢＭ２０（ベーリンガー・マンハイムから）を、同 様にＰstＩで制限し、製造者の使用説明書に従いウシの腸からのアルカリ性ホス ファターゼ（ベーリンガー・マンハイムから）で処理した。ラムダＲＡＣ４から の精製ＰstＩフラグメントおよびｐＵＣＢＭ２１各々約２００ngを、１単位のＴ ４ ＤＮＡリガーゼとライゲーションした。エシェリヒア・コリＸＬ１ブルー（ ストラタジーンから）において形質転換後、対応するプラスミドを単離した。そ れをｐＲＰ１と命名し、制限分析により特性検定した。制限地図は図２に示され ている。 それと同様に、ラムダＲＡＣ４（図１）からの約１.９kb ＥcoＲＩ-ＳalＩフ ラグメントも、相応じて開裂したプラスミドベクターｐＵＣＢＭ２０（ベーリン ガー・マンハイムから）へクローンした。生成したプラスミドはｐＲＰ６と命名 さ れ、図３に示されている。さらに別のフラグメントとして、ラムダＲＡＣ４（図 １）からの約６５０bp ＨindIII-ＰstＩフラグメントを、同様に開裂したプラス ミドベクタ−ｐＢluescript II ＳＫ＋（ストラタジーンから）へ組み込んだ。 生成したプラスミドはｐＲＰ９と定義され、図４に示されている。これら最後の ２つの構築物の場合、Ｒ１４とのハイブリダイゼーションにおいて陽性ＰstＩフ ラグメントに隣接した領域も示された。 実施例１２ トリポクラジウム・ニベウムからのＧＡＰＤＨ遺伝子の単離 実施例８からのコスミドバンクのアリコートを、適当な希釈物中７０μg／ml のアンピシリンを含むＬＢ培地に適用することにより、１プレート当たり約２０ ０コロニーの力価に達した。製造者の勧告に従いナイロン膜へ移し、コロニーを 溶解した。ハイブリダイゼーションプローブを製造するため、ペニシリウム・ク リソゲヌムからのＧＡＰＤＨ遺伝子（フィツネル、１９８８）の一部を含む約２ ０μｇのプラスミドｐＡＰ２１を、制限酵素ＳalＩで完全に開裂した。約４kbの ＳalＩフラグメントを、０.８％アガロースゲル（ジーンクリーンII、バイオ１ ０１から）から溶離し、ニック翻訳手段（サムブルック等、１９８９）によりア ルファー３２Ｐ−ｄＡＴＰで放射性標識した。 ハイブリダイゼーションを試験するため、トリポクラジウム・ニベウムからの ゲノムＤＮＡ（実施例６）１０μgをＳacＩおよびＨindIIIにより開裂し、サザ ーン・ハイブリダイゼーションで検査した。０.８％アガロースゲルを、真空ブ ロッティング（バキュブロット、ファルマシアから）によりナイロン膜へ移した 。７時間４２℃で膜１００cm²当たり１０mlの容量で５×ＳＳＣ、４０％ホルム アルデヒド、５×デンハルツ（マニアチス等、１９８２）、０.１％ＳＤＳ、０. ２５mg／ml変性ニシン精液ＤＮＡ、２５ミリモルのＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ６.５にお いてプレハイブリダイゼーションを行った。標識プローブを加えた後、インキュ ベーションを４２℃で１６時間続行した。ブロットを２回洗浄した。Ｘ線フィル ム（キソマチックＡＲ、コダックから）でのコダック強化フィルムによるオート ラジオグラフィー後、１制限消化当たり１つのバンドしか認識できなかった（Ｓ acＩの場 合約２.２kbフラグメント、ＨindIIIの場合約３.３kbフラグメント）。 同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下でコスミドバンクのスクリーニ ングを行った。約６００の試験コロニー当たり１つの陽性コロニーが見いだされ た。コロニーを精製し、コスミドＤＮＡをそこから単離した。得られたコスミド をgpdcos１と命名した。制限消化を用いて、約３.６kbの挿入されたゲノムのト リポクラジウム・ニベウムＤＮＡを測定した。スクリーニングプローブとのサザ ーン・ブロッツのハイブリダイゼーションにより、ＧＡＰＤＨ構造遺伝子の部分 を含む制限フラグメントが同定された。約２.２kb ＳacＩ制限フラグメントは、 明確なシグナルを発した。これは、ゲノムＤＮＡとのサザーン・ハイブリダイゼ ーションにおけるフラグメントの大きさに対応する。フラグメントを、プラスミ ドベクターｐＵＣ１８（ベーリンガー・マンハイムから）へ再クローンした。 この目的のため、約１０μgのgpdcos１ＤＮＡを、ＳacＩにより完全に開裂し 、２.２kb ＳacＩフラグメントを０.７％アガロースゲルから溶離した。同様に して、プラスミドベクターｐＵＣ１８をＳacＩにより制限し、製造者の使用説明 書に従いウシ腸からのアルカリ性ホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイムか ら）で処理した。gpdcosからの精製ＳacＩフラグメントおよびｐＵＣ１８各々約 ２００ngを、１単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼとライゲーションした。エシェリヒ ア・コリＨＢ１０１における形質転換後、対応するプラスミドを分離した。それ をｐＧＴ１と命名し、制限分析により特性検定した。制限地図は図９に示されて いる。さらに、サンガー等の方法（サンガー等、１９７７）に従い、シーケナー ゼ（ＵＳＢから）手段によりＳacＩフラグメント全体の完全なヌクレオチド配列 を測定した。この配列は図１０に示されており、２２７１ヌクレオチドを含む。 実施例１３ トリポクラジウム・ニベウムからのＧＡＰＤＨ遺伝子のｃＤＮＡクローンの分 離 ｃＤＮＡバンクを構築するため、まず第１に実施例１７の記載に従い粗ＲＮＡ を単離した。マニアチス等の記載（１９８２）に従い、ポリ（Ａ⁺）−ＲＮＡの 濃縮を、オリゴ（ｄＴ）−セルロース−アフィニティ・クロマトグラフィー手段 により 行った。このため、遠心分離および乾燥後、粗ＲＮＡを水に溶かした。クロマト グラフィー後、ポリ（Ａ⁺）−ＲＮＡを含む分画をエタノールにより再沈澱させ 、−７０℃で貯蔵した。ホルムアルデヒドの存在下ゲル電気泳動により、ＲＮＡ の完全さをチェックし、ＵＶ吸収により濃度を測定した。５μgのポリ（Ａ⁺）− ＲＮＡを、４種のデスオキシヌクレオシド３リン酸の存在下逆転写酵素およびオ リゴ（ｄＴ）−プライマーと反応させ、相補的１本鎖ＤＮＡを得た。酵素リボヌ クレアーゼＨおよびＤＮＡ−ポリメラーゼ手段（サムブルック等、１９８９）に より、２本鎖分子をそこから合成した。適当なＥcoＲＩアダプターを酵素的に付 加した後（この場合、ポリヌクレオチドキナーゼおよびＴ４−ＤＮＡリガーゼを 使用した）、線形２本鎖ｃＤＮＡが得られ、これらはクローニングベクターへ組 み込まれ得る。これらの反応には、必要な酵素およびアダプターオリゴヌクレオ チドを含むｃＤＮＡ合成キット（ファルマシアから）を使用した。この反応は、 製造者の使用説明書に従い行われた。合成されたｃＤＮＡをベクターλgt１０（ サムブルック等、１９８９）へクローン化した。それをするため、８０μlのｃ ＤＮＡ製品を、予めＥcoＲＩで開裂し、アルカリ性ホスファターゼで処理してお いた１６μlのλgt１０−ＤＮＡ（８μg）と混合した。３μlの３モル酢酸ナト リウム（ｐＨ５.２）を加えた後、ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。次いで、 このＤＮＡを、１６℃で１６時間３０ミリモルのトリス−Ｃｌ ｐＨ７.５、１０ ミリモルのＭｇＣｌ₂、１０ミリモルのＤＴＥ、２.５ミリモルのＡＴＰ中でライ ゲーションした後、０.５Ｕ Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ濃度５００μg／ml ）を加えた。ライゲーション混合物を、タンパク質抽出物の助けによりインビト ロで封入した。生成したλ−リゼイトを、エシェリヒア・コリＣ６００hfl（プ ロメガ社から）により滴定した。約４.５×１０⁵pfuが得られた。 プラスミドｐＧＴ１（実施例１２参照）からの６６５bp ＨindIII-ＨindII制 限フラグメントを、スクリーニング用プローブとして使用した。このため、ｐＧ Ｔ１からのＤＮＡ１０μgを、製造者の使用説明書に従い制限酵素ＨindIIIおよ びＨindII（ベーリンガー・マンハイム）により開裂し、対応する制限フラグメ ントを０.８％アガロースゲルから分離した。ランダム−プライマー重合（スト ラタジ ーンから）手段によりアルファ−³²Ｐ−ｄＡＴＰで標識後、フラグメントをハイ ブリダイゼーションに使用した。プレハイブリダイゼーションを２０時間、４２ ℃で１８時間６×ＳＳＣ、５０％ホルムアルデヒド、１％ＳＤＳ、５０μg／ml ニシン精液ＤＮＡ中でハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、２５℃ で２×１０分間２×ＳＳＣ／０.５％ＳＤＳ中および６０℃で２×４５分間１× ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で洗浄した。膜を１４時間Ｘ線フィルム（キソマチッ クＡＲ、コダックから）で暴露した。全プラークの２.５％〜３.５％が、強いシ グナルを示した。 これらの陽性プラークの各々を有する領域をプレートから打ち抜き、１回目と 同様の方法によりさらに希釈した平板培養物とのさらに２回のハイブリダイゼー ションにより精製した。ラムダＤＮＡを標準的方法（サムブルック等、１９８９ ）により単離した。２つの相異なるクローンからの約１.３kb ｃＤＮＡ挿入体は 、標準的方法に従いＥcoＲＩフラグメントとしてプラスミドｐＵＣＢＭ２０（ベ ーリンガー・マンハイムから）およびファージベクターＭ１３mp１８（ベーリン ガー・マンハイムから）へ組み込まれた。生成した構築物を各々ｐＧＴ４および ｐＧＴ５またはＭ１３ＧＴ４およびＭ１３ＧＴ５と名付けた。Ｍ１３クローンの 助けにより、１本鎖ＤＮＡを製造し、サンガーによるジデスオキシヌクレオチド 方法（サンガー等、１９７７）を用いることにより両端から配列決定した。クロ ーンＭ１３ＧＴ４の挿入体は３３bpポリＡ領域を有し、クローンＭ１３ＧＴ５の 場合には、ポリＡ領域と同様に、５'−末端から２bpおよび３'−末端から２０bp が欠落していることが示された。 明らかに完全なｃＤＮＡクローンｐＧＴ４の制限地図は、図１１に示されてい る。ｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列を測定した。それは、アダプター分子を伴わ ず１３３３ヌクレオチドを含んでおり、図１２に描かれている。ゲノムおよびｃ ＤＮＡ配列の比較により、２つのイントロンの位置が示され、この際、図１４か ら明らかなとおり、１つはＳacＩフラグメントの出発点に位置していた。このこ とから、ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター領域は、ｐＧＴ１からのゲノムＳacＩ フラグメント（実施例１２参照）に含まれていないことが明確であった。 実施例１４ トリポクラジウム・ニベウムからのＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター領域の単 離 コスミドクローンgpdcos１（実施例１２参照）のＤＮＡ２０μgを、制限酵素 ＸhoＩおよびＳalＩにより開裂した。ｐＧＴ１からの６６５bp ＨindIII-ＨindI Iフラグメントとのサザーン・ハイブリダイゼーションを用いることにより、約 １２５０bpフラグメントが同定された。これは０.８％アガロースゲルから製造 され、標準的方法（サムブルック等、１９８９）によりＳalＩ開裂および脱リン 酸化プラスミドベクターｐＢluescriptII ＳＫ＋（ストラタジーンから）および 同様に処理したファージベクターＭ１３mp１８に組み込まれた。挿入体の完全ヌ クレオチド配列を、サンガーによる方法（サンガー等、１９７７）を用いて測定 した。それは図１３に示されており、図１４におけるbp１〜１２７８の配列決定 領域に対応する。全ての存在するプロモーターおよび構造遺伝子領域のゲノム配 列とｃＤＮＡ配列とを比較したところ、２つのイントロンの位置が示された（図 １４）。１番目のは５５０〜６６４位（１１５bp）の５'−非翻訳領域にあり、 ２番目の実質的に長いイントロンは実際の構造遺伝予に存在し、８０２〜１２１ ８位（４１７bp）に位置する。ｃＤＮＡ配列の翻訳から、３３８アミノ酸長のト リポクラジウム・ニベウムからのＧＡＰＤＨの主要配列が得られ、誘導された相 対モル質量は３６１２１であった。 実施例１５ アラニンラセマーゼ遺伝子の部分配列の決定 ｐＲＰ１における約１.１kb ＰstＩ挿入体、ｐＲＰ６からの約１.９kb ＥcoＲ Ｉ−ＳalＩフラグメント、ｐＲＰ９からの約６５０bp ＰstＩ−ＨindIIIフラグ メント、およびＨindIII位の後に続くさらに５１１bpを合わせたヌクレオチド配 列は、図５に示されており、３９７３ヌクレオチドを含む。 製造者の使用説明書に従いシーケナーゼ（ユナイテッド・ステーツ・バイオケ ミカルから）を用いる修飾ジデスオキシヌクレオチド方法により配列決定を行っ た。 実施例１６ 誘導されたアミノ酸配列の比較 実施例１５からのヌクレオチド配列が翻訳される場合、図５の２５５７位〜２ ６１０位、すなわちスクリーニングプローブの誘導にも使用されるアミノ酸部分 配列ａａ１７５０の領域が再び見いだされる。 さらに、次のさらに別の部分配列が見いだされる。 測定された配列決定領域において発見されたアミノ酸部分配列の位置は、図６ 実施例１７ トリポクラジウム・ニベウムの菌糸体からのＲＮＡの単離およびノーザン・ハ イブリダイゼーション １００mlの培地４（ドレヒュス等、１９７６）を入れた１リットルのエルレン マ イヤーフラスコに、トリポクラジウム・ニベウムＡＴＣＣ３４９２１の胞子懸濁 液（約１×１０⁷胞子／ml）を接種し、２５０rpmおよび２５℃で９６時間激しく ゆすった。１００mlの培地５（ドレヒュス等、１９７６）を入れた１リットルの エルレンマイヤーフラスコに、１０mlの前培養物を接種し、２５℃および２５０ rpmで７日間激しくゆすった。サイクロスポリンＡ濃度を測定した（ドレヒュス 等、１９７６）。１００μg／mlが達成された。約６ｇの湿った菌糸体塊からＲ ＮＡを単離するが、そのために菌糸体を遠心分離し、４０mlのＴＥ（１０ミリモ ルのトリス−Ｃｌ、１ミリモルのＥＤＴＡ、ｐＨ７.５）で洗浄し、液体窒素下 乳鉢中で微細粉末に粉砕した。チョムツィンスキおよびサッチ（１９８７）の僅 かに修正した方法により、ＲＮＡ単離を行った。このために、湿った菌糸体各々 １ｇを、製造者の指示に従い２０mlのＲＮＡゾール（バイオメディカから）で後 処理した。湿った菌糸体１ｇ当たり約０.７mgのＲＮＡが得られ、エタノール沈 澱後−２０℃で貯蔵した。サムブルック等により記載された方法（１９８９）に より、０.６モルのホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルから１０μgのＲ ＮＡが分離された。試料を２分間９５℃に加熱し、２.５時間にわたって一定の ７０Ｖで分離した。ゲルを２×ＳＳＣ中で２０分間３回激しく揺すり、デュラロ ンＵＶ膜（ストラタジーンから）に真空ブロットし、ＵＶ処理により固定した。 プラスミドｐＲＰ１（実施例１１）からの１０７８bp ＰstＩ制限フラグメン トをハイブリダイゼーションプローブとして使用し、ＧＡＰＤＨ遺伝子について は、プラスミドｐＧＴ１（実施例１２）からの６６５bp ＨindIII−ＨindII制限 フラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして使用した。この目的のた め、プラスミドからのＤＮＡ約１０μgを、製造者の指示に従って対応する制限 酵素（ベーリンガー・マンハイムから）により開裂すると、対応する制限フラグ メントが、ガラス「ビーズ」（ジーンクレアンII、バイオ１０１から）への吸着 により０.８％アガロースゲルから分離された。ランダム−プライマー重合（ス トラタジーンから）の方法によりアルファ−３２Ｐ−ｄＡＴＰで標識した後、フ ラグメントをハイブリダイゼーションに用いた。 プレハイブリダイゼーションを２０時間、ハイブリダイゼーションを１８時間 ４２℃で膜１００cm²当たり１０mlの容量において６×ＳＳＣ、５０％ホルムア ルデヒド、５×デンハルツ（マニアチス等、１９８２）、０.１％ＳＤＳ、０.２ ５mg／ml変性ニシン精液ＤＮＡ、２５ミリモルのＮａＨ2ＰＯ4 ｐＨ６.５中で行 った。−７０℃で約４８−９６時間Ｘ線フィルム（キソマチックＡＲ、コダック から）へのコダック強化フィルムによるオートラジオグラフィー後、アラニンラ セマーゼ遺伝子の場合およびＧＡＰＤＨ遺伝子の場合の両方で、バンドがＸ線フ ィルム上で認識できた。 実施例１８ トリポクラジウム・ニベウムのプロトプラスト化 エルレンマイヤーフラスコ中２００mlの培地１（マルトース（１水和物）５０ ｇ／ｌ、カゼインペプトン、ただしトリプシン（フルカ７０１６９）１０ｇ／ｌ で消化、ＫＨ₂ＰＯ₄ ５ｇ／ｌ、ＫＣｌ ２.５ｇ／ｌ ｐＨ５.６）にトリポクラ ジウム・ニベウムＡＴＣＣ３４９２１の１０⁹胞子を接種し、約７０時間２７℃ 、２５０rpmでインキュベーションした。２００μlの（０.１％）β−メルカプ トエタノールを加え、さらに１６時間インキュベーションを続けた。菌糸体を、 遠心分離（ベックマンＪ２−２１遠心分離器、ローターＪＡ１４、８０００rpm 、２０℃、５分）により採取し、４０mlのＴＰＳ（ＮａＣｌ ０.６モル、ＫＨ₂ ＰＯ₄／ＮａＨ₂ＰＯ₄ ６６ミリモルｐＨ６.２）で洗浄し、２０００ｇでの較正 マイクロチューブ（ベックマンＧＰＲ遠心分離器、ＧＨ３.７ローター、３００ ０rpm、５分）における遠心分離により沈澱物容量を測定した。菌糸体をＴＰＳ （沈澱物容量各々１ml当たり３mlのＴＰＳを使用した）に懸濁し、同じ容量のプ ロトプラスト化溶液を加えた（ノボザイム２３４ １０mg／ml（ノボ・インダス トリ、バッチＰＰＭ−２４１５）、サイトヘリカーゼ５mg／ml（ＩＢＦから）、 ジモルヤーゼ２０Ｔ１mg／ml（生化学工業から、バッチ番号１２０４９１）ＴＰ Ｓ中）。懸濁液を、約６０分間８０rpm２７℃でインキュベーションした。プロ トプラストを牛乳フィルターで濾過し、遠心分離し（７００ｇ、１０分）、合計 ４mlのＴＰＳ中にとった。この懸濁液各々１mlを、３５％サッカロース溶液によ り４mlにし、６００ｇ、２０℃で２０分間遠心分離した。相界面におけるプロト プラストバンドを引き出し、各々ＴＰ Ｓで１０mlに希釈し、遠心分離し、注意深く２００μl分量のＴＰＳに再懸濁し 、懸濁液を合わせた。出発菌糸体（上記参照）の沈澱容量各々１mlに関し、約２ ×１０⁸プロトプラストが得られた。 実施例１９ トリポクラジウム・ニベウムの形質転換 実施例１８からのプロトプラスト懸濁液を遠心分離にかけ（７００ｇ、１０分 ）、１×１０⁸の密度で１モルのソルビトール、５０ミリモルのＣａＣｌ₂に懸濁 した。この懸濁液９０μl分量を、形質転換されるベクターＤＮＡ１０μl（１− １０μｇをトリス−ＨＣｌ １０ミリモル、ＥＤＴＡ１ミリモル、ｐＨ８.０に溶 解）と合わせ、２５μlのＰＥＧ６０００溶液を加えた（２５％ＰＥＧ６０００ 、５０ミリモルのＣａＣｌ₂、１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、貯蔵 溶液から新たに製造：６０％ＰＥＧ６０００（ＢＤＨから）、２５０ミリモルの トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、２５０ミリモルのＣａＣｌ₂）。形質転換バッチを ２０分間氷上に置き、次いでさらに５００μlの混合ＰＥＧ６０００溶液を加え 、注意深く混合した。室温で５分後、１mlの０.９モルＮａＣｌ、５０ミリモル のＣａＣｌ₂を加え、バッチ全体を対応する選択培地の溶けた軟寒天７mlに加え 、４５℃に保ち、対応する予備加熱プレート上に投下した。 形質転換されるベクターＤＮＡがアスペルギルス・ニデュランスからのamdＳ 遺伝子を含む場合（例、プラスミドｐ３ＳＲ２（ハインズ等、１９８３））、バ ッチ全体を、７mlの溶けた軟寒天ＴＭＭＡＡＣ＋Ｎに加え、４５℃に保ち、予備 加熱したＴＭＭＡＡＣ＋ＭＮプレート上に投下した。培地ＴＭＭＡＡ＋Ｎは、グ ルコース６ｇ／ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ３ｇ／ｌ、ＫＣｌ ０.５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ₄*７ Ｈ₂Ｏ０.４ｇ／ｌ、ＣａＣｌ₂＊２Ｈ₂Ｏ ０.２ｇ／ｌ、アクリルアミド８ミリモ ル、ＣｓＣｌ ２.１ｇ／ｌ、微量元素溶液１ml／ｌ、０.６モルＮａＣｌを含む 。１５ｇ／ｌのアガー−アガー（メルク）をプレートに使用した（軟寒天につい て７ｇ／ｌ）。微量元素溶液は、１mg／mlのＦｅＳＯ₄＊７Ｈ₂Ｏ、９mg／mlのＺ ｎＳＯ₄＊７Ｈ₂Ｏ、０.４mg／mlのＣｕＳＯ₄＊５Ｈ₂Ｏ、０.１mg／mlのＭｎＳＯ₄ ＊Ｈ₂Ｏ、０.１mg／mlのＨ₃ＢＯ₃および０.１mg／mlのＮａ₂ＭｏＯ₄＊Ｈ₂Ｏを 含む。 形質転換体は、培地中窒素供給源としてアクリルアミドを利用し得たため、２５ ℃で約３週間後に弱い基底成長に対するコロニーとして同定され得た。ハイグロ マイシン耐性遺伝子により形質転換するため、バッチに７mlのＴＭ８８ ＮａＣ ｌ軟寒天（２０ｇ／ｌ麦芽抽出物、４ｇ／ｌの酵母抽出物、１０ｇ／ｌのバクト 寒天、０.６モルのＮａＣｌ、ｐＨ５.７）（４５℃）を加え、ＴＭ８８ＮａＣｌ プレート（約２０mlのＴＭ８８ ＮａＣｌ寒天、２０ｇ／ｌ麦芽抽出物、４ｇ／ ｌの酵母抽出物、３０ｇ／ｌのバクト寒天、０.６モルのＮａＣｌ、ｐＨ５.７） に投下した。２５℃で１５−２０時間後、５００μg／mlのハイグロマイシン（ ベーリンガー・マンハイム）と共に７mlのＴＭ８８ ＮａＣｌ軟寒天（４５℃） を注いだ。ハイグロマイシン耐性形質転換体が、２５℃で７日後プレートにおい てコロニーとして検出され得た。 実施例２０ ベクターｐＧＴ２４の構築 ＧＡＰＤＨ遺伝子の測定されたヌクレオチド配列（実施例１４）に基づいて、 下記のオリゴヌクレオチドが誘導および合成された。 ５−２９位のＰ３は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の図１４のヌクレオチド配列の１−２ ５位に対応し、すなわち、天然ＸhoＩ開裂点（ＣＴＣＧＡＧ）を含む。Ｐ４は、 ６７０〜６５０位の領域（ＧＡＰＤＨ遺伝子の配列に相補的）に対応する。Ｐ４ の最初の１２ヌクレオチドは、制限酵素ＮcoＩ（ＣＣＡＴＧＧ）およびＢamＨＩ （ＧＧＡＴＣＣ）に関する認識部位を含む。これらのプライマーの助けにより、 トリポクラジウム・ニベウムのゲノムＤＮＡから、プライマー間にある領域が増 幅された（３５サイクル、２分９５℃、１分２０秒５６℃、１分２０秒７２℃） 。こうして形成された約６８bpのＤＮＡフラグメントをクロロホルムで抽出し、 エタノールで沈澱させ、制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩおよびＸhoＩ（製造者 による説明に従う、ベーリンガー・マンハイム）で開裂し、標準的方法により同 様に製造 されたプラスミドベクターＤＮＡ ｐＢluescript ＳＫ＋（ストラタジーンから ）に組み込んだ。生成したプラスミドはｐＧＴ１２と命名され、図１６に示され ている。下記のオリゴヌクレオチドが、同様にＧＡＰＤＨ遺伝子のヌクレオチド 配列から誘導および合成された。 １０〜２８位のプライマーＰ８は、図１４における２３０１〜２３１９位に対 応し、４〜１１位は制限酵素ＮotＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）に関する認識部位を含 む。９〜２８位のプライマーＰ９は、図１４における２８５５〜２８３８位の相 補鎖に対応し、３〜８位は酵素ＫspＩ（ＣＣＧＣＧＧ）に関する認識部位を表す 。プライマーは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の可能な終止領域を含む。それらの助けによ り、上記と全く同様に、トリポクラジウム・ニベウムのゲノムＤＮＡからの対応 するＤＮＡフラグメントを増幅した。対応するＤＮＡフラグメントが、トリポク ラジウム・ニベウムのゲノムＤＮＡから増幅された。酵素ＮotＩおよびＫspＩ（ 製造者による説明に従う、ベーリンガー・マンハイム）によるこの増幅ＤＮＡの 制限後、フラグメントは、標準的方法により同様に製造されたベクターｐＧＴ１ ２に組み込まれた。生成したベクタープラスミドは、ｐＧＴ１４と命名され、図 １７に示されている。 プラスミドｐＭＡＴ５（モール、１９８８）のＤＮＡを、酵素ＢamＨＩ（製造 者による説明に従う、ベーリンガー・マンハイム）により完全に開裂し、電気泳 動後、アガロースゲルから約１.１kbのＤＮＡフラグメントが生成された。同様 にプラスミドｐＧＴ１４もＢamＨＩにより開裂し、ウシ腸からのアルカリ性ホス ファターゼ（製造者による説明に従う、ベーリンガー・マンハイム）を用いて処 理した。ｐＭＡＴ５からの約１.１kb ＢamＨＩフラグメントを、標準的方法によ りライゲーションし、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂlue（ストラタジーンから ）で形質転換し、若干の生成したクローンのプラスミドＤＮＡを単離した。生成 したベクタープラスミドは、ｐＧＴ２４と命名された。ｐＧＴ２４は、ＧＡＰＤ Ｈプロモー ターに対して正しい方向でハイグロマイシン耐性遺伝子を含み、図８に示されて いる。 実施例２１ トリポクラジウム・ニベウムにおけるアラニンラセマーゼ遺伝子の崩壊 ｐＲＰ１からの約８３５ｂｐのＥcoＲＩ-ＰstＩフラグメントを、実施例１１ で説明した方法と同様にプラスミドベクターｐＵＣＢＭ２０（ベーリンガー・マ ンハイムから）へ組み込んだ。構築されたプラスミドはｐＲＰ１２と命名され、 図７に示されている。使用された形質転換ベクターはプラスミドｐＧＴ２４であ り、トリポクラジウム・ニベウムＧＡＰＤＨ遺伝子の制御下でハイグロマイシン 耐性遺伝子を含む。このＤＮＡと共に、当モル量のｐＲＰ１２−ＤＮＡも同じ形 質転換バッチで使用した。これらの共形質転換は、実施例１９記載の方法により 行われ、出発株としてトリポクラジウム・ニベウムＡＴＣＣ３４９２１が使用さ れた。ハイグロマイシン耐性形質転換体からのゲノムＤＮＡを、急速な方法で単 離した。このため、対応するコロニーの約１cm²領域から得た菌糸体を除去し、 エッペンドルフホモジナイザーに移した。１mlの溶解緩衝液（５０ミリモルのＥ ＤＴＡ、０.２％ＳＤＳ）および１００mgの酸化アルミニウム（タイプＡ％、シ グマから）を加え、約５分間充分にホモジネートした。遠心分離後（５分、１１ ０００rpm）、この上清を、トリス−飽和フェノール、フェノール／クロロホル ム（１：１）およびクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で各々１ 回抽出し、標準的方法（サムブルック等、１９８９）に従いＤＮＡをイソプロパ ノールで沈澱させた。 ＤＮＡを制限酵素ＳalＩにより完全に制限し、ゲル電気泳動により分離し、サ ザーン・ハイブリダイゼーションで調べた。０.８％アガロースゲルを、真空− ブロッティング（バキュブロット、ファルマシアから）によりナイロン膜（デュ ラロン−ＵＶ、ストラタジーンから）へ移動させ、ＵＶにより固定した。 プレハイブリダイゼーションは、４２℃で約８−１６時間膜１００cm²当たり １０mlの容量で６×ＳＳＣ、５０％ホルムアルデヒド、５×デンハルツ（マニア チス等、１９８２）、０.１％ＳＤＳ、０.２５mg／ml変性ニシン精液ＤＮＡ、２ ５ミリモルのＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ６.５においてで行われた。標識プローブを加え た後、４２℃でさらに１６−２０時間インキュベーションを行った。このブロッ トを、２５℃で１０分間２×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳにより２回および６０℃で ３０分間０.５×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳにより２回洗浄した。コダック強化フィ ルムによりＸ線フィルム（キソマチックＡＲ、コダックから）へ約４８−９６時 間−７０℃でオートラジオグラフィーを行った後、Ｘ線フィルム上にバンドが認 められた。 検査されたＤＮＡの大部分は、約８３５bp ＥcoＲＩ-ＰstＩフラグメント（図 １）を含む天然の約２.９kb ＳalＩフラグメントのシグナルを示した。さらに、 ＤＮＡの約６０−７０％は追加のバンドを示すが、それらはプラスミドｐＲＰ１ ２の相同的組み込みによるものではない。これらのタイプの形質転換体ＤＮＡに 加えて、個々のＤＮＡも存在したが、それらは天然ＳalＩフラグメントのシグナ ルを発しなかった。上記株において、プラスミドｐＲＰ１２の組み込みによりア ラニンラセマーゼ遺伝子は崩壊された。 この方法で証明された株を、ドレフュス等（１９７６）による記載に従い、サ イクロスポリンＡ形成用の振盪フラスコ中での試験発酵において検査した。サイ クロスポリンＡは非形質転換および無傷の出発株トリポクラジウム・ニベウムＡ ＴＣＣ３４９２１の平行試験では形成されたが、実際的にはサイクロスポリンＡ （＜５mg／l）は、アラニンラセマーゼ遺伝子が崩壊された株による試験では検 出され得なかった。 実施例２２ ラムダＲＡＣ４との共形質転換 実施例２１と同様に形質転換ベクターｐＧＴ２４を使用した。このＤＮＡと共 に、当モル量のラムダＲＡＣ４（実施例１０）も同じ形質転換バッチにおいて使 用された。これらの共形質転換に使用される出発株は、トリポクラジウム・ニベ ウムＡＴＣＣ３４９２１であった。 実施例２１の記載と同様に、サザーン・ハイブリダイゼーションによりハイグ ロマイシン耐性形質転換体からのゲノムＤＮＡを分離し、調べた。これらのハイ ブリダイゼーション用プローブとして、遺伝子バンクベクターラムダＤＡＳＨII の制限フラグメントを、「ランダム・プライマー」標識（ストラタジーンから） によりアルファ³²Ｐ ｄＡＴＰで放射性標識した。検査されたＤＮＡのうちの数 個はハイブリダイゼーションシグナルを示し、それらはラムダＲＡＣ４の組み込 みに起因し得る。この方法で証明された形質転換株を、ドレフュス等（１９７６ ）による記載に従い、サイクロスポリンＡ形成用の振盪フラスコ中での試験発酵 において検査した。約９０−１００μg／mlのサイクロスポリンＡが非形質転換 出発株トリポクラジウム・ニベウムＡＴＣＣ３４９２１の平行試験では形成され たが、ラムダＲＡＣ４の組み込み故にアラニンラセマーゼ遺伝子の追加コピーが 存在する株による試験では、約１５０μg／mlのサイクロスポリンＡが検出され 得た。 実施例２３ アラニンラセマーゼに関する崩壊遺伝子をもつ株の使用による８−Ｄ−セリン サイクロスポリンＡの製造 アラニンラセマーゼ遺伝子がプラスミドｐＲＰ１２の組み込みにより実施例２ １記載の方法に従って崩壊された形質転換株および出発株トリポクラジウム・ニ ベウムＡＴＣＣ３４９２１を、Ｄ−セリンが培地中に存在する振盪フラスコ発酵 中で試験した。 このため、５００mlエルレンマイヤーフラスコに入れた１００mlの前培養培地 （７５ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌのペプトン、２５０mg／ｌのＫＨ₂ＰＯ₄ 、１.５ｇ／ｌのＫＣｌ、ｐＨ７.４）に、検査される株の約１０７胞子を接種し 、２７℃および２００rpmで４〜７日間インキュベーションした。この後、２０m lの主要培養培地（４０ｇ／ｌのグルコース、４０ｇ／ｌのフルクトース、１０ ｇ／ｌのペプトン、５ｇ／ｌのＫＨ₂ＰＯ₄、２ｇ／ｌのＫＣｌ、５ｇ／ｌのＤＬ −２−アミノ酪酸、４ｇ／ｌのＤ−セリン、ｐＨ５.５）に、前培養物２mlを接 種し、さらに７−２０日間同じ条件下で発酵させた。こうして形成されたサイク ロスポリンＡ（ＣｙＡ）および８−Ｄ−セリン−サイクロスポリンＡ（ＤＳＡ） を測定した。これらの条件下で出発株トリポクラジウム・ニベウムＡＴＣＣ３４ ９２１は、約５０mg／ｌのＣｙＡおよび５mg／ｌ未満のＤＳＡを形成することが 示された。対 照的に、検査された実施例２１からの「遺伝子崩壊」株は、＜５mg／１のＣｙＡ および約６０mg／ｌのＤＳＡを形成した。 実施例２４ ｐＧＴ２４によるトリポクラジウム・ニベウムの形質転換 実施例１９の記載と同様に、プラスミドｐＧＴ２４のＤＮＡを形質転換に使用 した。結果として、多数のハイグロマイシン耐性トリポクラジウム・ニベウムコ ロニーが得られた。これにより、発現ベクターｐＧＴ１４に組み込まれた遺伝子 （エシェリヒア・コリからのハイグロマイシン耐性遺伝子）は効果的に発現され ることが確認された。 上記形質転換体のＤＮＡの単離、例えばＢamＨＩによるＤＮＡの制限、電気泳 動およびナイロン膜へのブロッティング（標準的方法による、サムブルック等、 １９８９）により、１回または数回プラスミドｐＧＴ２４がゲノム中に存在する ことが、約１.１kb ＢamＨＩフラグメントとのハイブリダイゼーションにより確 認され得た。 実施例２５ ベクターｐＧＴ３０の構築 図１３で再現されたＤＮＡ配列に基づいて、下記配列を有するオリゴヌクレオ チドが合成された。 このオリゴヌクレオチドの９〜２９位は、図１３に示された配列（６５２〜６ ７２位）に相補的であった。すなわち、それは開始コドン直前にこの領域を含む 。最初の８位まではＣlaＩ認識領域（ＡＴＣＧＡＴ）に対応する。２番目のオリ ゴヌクレオチドは下記の配列を有する。 これは、図１３におけるヌクレオチド配列の６２〜８２位に対応する。最初の ８ヌクレオチドは、ＳpeＩ認識領域を含む。トリポクラジウム・ニベウムからの ＤＮＡ２０ｎｇを、上記オリゴヌクレオチドにより増幅した（サムブルック等、 １９８９）：３０サイクル：１分３０秒９４℃、２分３０秒５５℃、６分７２℃ 。 約６２０bpのＤＮＡが得られた。クロロホルムで抽出後、このＤＮＡを限外濾過 （ウルトラフリーＭＣ１０００００、ミルポア）により精製し、酵素ＳpeＩおよ びＣlaＩを含む対応する緩衝液中で開裂した。このＤＮＡ５０ngを、プラスミド ｐＣＳＮ４４（スタベン等、１９８９）のＳpeＩおよびＣlaＩ−開裂ＤＮＡ５０ ngとライゲーションした。このプラスミド（ｐＧＴ３０）の制限地図は図１８に 再現されている。 実施例２６ ｐＧＴ３０によるトリポクラジウム・ニベウムの形質転換 プラスミドｐＧＴ３０は、実施例１９の記載によるトリポクラジウム・ニベウ ムの形質転換に使用され得る。上記形質転換体からのＤＮＡをＢamＨＩで開裂し 、ゲル電気泳動後、ナイロン膜へブロッティングした。ｐＧＴ３０からの０.６k bＳpeＩ-ＣlaＩフラグメントを、放射性プローブとして使用した。この方法では 、プラスミドｐＧＴ３０が１回または数回統合形態でゲノムに存在している形質 転換体が同定され得る。 実施例２７ ｃＤＮＡの配列決定および構造遺伝子の位置確認 アミノ酸部分配列の比較から推定され得る通り（実施例１６参照）、解読枠は 、イントロンを示すａａ１７５８をコードする配列間で相互作用する。すなわち 、アラニンラセマーゼ転写物（実施例１７）の存在に関するノーザン・ハイブリ ダイゼーションによりＲＮＡを分離し、試験した。アダプタープライマー（５' −ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴ（Ｔ）₁₇）（ギブコ ＢＲＬから）を用いる と、最初の鎖合成が行われ、それに続いて、対応する領域をプライマーＳ１１（ ５'-ＡＴＴＧＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＡＣＴＣＴＣ、１９９０−２００９位（図２ ０））およびＰＲＰ８／６（５'−ＡＣＣＧＣＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＧＡＣＴＴ ＧＣＣＴ、３１４５−３１２２位（図２０））により増幅し、ＤＮＡフラグメン トを精製し、プラスミドベクターｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガから）にクローン化し 、証明されたクローンのＤＮＡを同様に配列決定した。この方法では、ｃＤＮＡ からのａａ１７５３およびａａ１７５１間の完全な配列が得られた。ゲノム配列 との比較により、２ ０３５−２１１０位には７６bpのイントロンが存在することが示された。単離さ れたＲＮＡ（実施例１７参照）を使用することにより、キット（ギブコ ＢＲＬ から）を用いた５'−ＲＡＣＥ実験が行われた。使用された「アンカープライマ ー」は、オリゴヌクレオチド５'−ＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡＧＧＣＣＡＣＧＣ ＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧであった。使用さ れた遺伝子特異的プライマーは、Ｓ７（５'−ＣＴＣＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＧＣ ＣＴＴ、２５７１−２５５４位（図２０））およびＳ１０（５'−ＡＣＡＡＣＡ ＡＡＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ、２２６１−２２４３位（図２０））であった。 得られたフラグメントを、プラスミドベクターｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガから）へ クローン化し、配列決定した。合計３２の独立クローンの特性検定をした。図２ １における結果は、３つの異なる出発点が見いだされたことを示している。総数 ３２の個々のクローンを統計評価に使用すると、７５％が−８位、１６％が−１ ４位および９％が−２６位から始まる。位置は、仮定的ＡＴＧ翻訳開始コドンを 指す（下記参照）。これと同様に、転写物の末端についても、３'−ＲＡＣＥ実 験（ギブコ ＢＲＬから）により調べた。使用される遺伝子特異的プライマーは 、ＰＲＰ８／２（５'−ＡＧＧＣＡＡＧＴＣＡＡＡＧＴＣＣＴＴＴＧＣＧＧＴ、 ３１２２−３１４５位（図２１））およびＳ１３（５'−ＣＴＣＡＧＣＡＣＣＧ ＴＧＡＣＡＴＡＣＧＣ、３０１１−３０３０位（図２１））であった。総数１２ のクローンが配列決定され、その３'−末端は図２３に示されている。配列決定 されたメッセンジャーは全て、ポリＡテイルをもつ。その長さは、１６ないし４ ３ヌクレオチドである。 図２０には、アラニンラセマーゼ遺伝子領域の配列が示されている。ＯＲＦの 最初のメチオニンコドンは１９５３位にある。しかしながら、同時にこれは、既 に９コドン後の部分配列が１７５３として見いだされたことから、配列決定され た転写物おいて問題となる唯一のＭｅｔコドンである。イントロンをスプライシ ングした後、連続読み枠が得られ、それは３１７８位で終わる。それは３８３コ ドン（アミノ酸配列については図２０参照）を含む。誘導されたタンパク質の分 子量は４１００２Ｄａで算出される。 プロモーター成分に関する構造遺伝子上部の配列領域の分析により、２つの可 能性が得られた。いずれも約−１４６にある非常に目立つＴＡＴＡ領域であり、 実験により見いだされた転写開始点からの距離は幾分大きいが、終始慣用的範囲 内である。このスペーシングから、約−２００にあるＣＡＡＴ−ボックスもまた 非常によく適合する。約−６０にあるＴＡＴＡ−ボックスでこれと適合している −１２１にあるＣＡＡＴ−ボックスを伴うものの場合、転写開始点（−８、−１ ４、−２６）までの距離は、予想とよく合致している。 記載した文献リストの内容は、参考として本明細書に包含する。 使用した略語： μＣｉ マイクロキューリー μｇ マイクログラム μｌ マイクロリットル μｍ マイクロメーター μＭ マイクロモル ａｍｄＳ アセトアミダーゼ遺伝子 ＡＣＶ アミノアジピル−システニル−バリン ＡＴＣＣ アメリカンタイプカルチャーコレクション ＡＴＰ アデノシン三リン酸 ａａ アミノ酸、アミノ酸配列 ｂｐ 塩基対 ｃＤＮＡ 相補的デオキシリボ核酸 ＤＡＯ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ ＤＮＡ デオキシリボ核酸 ＤＴＥ ジチオエリスリトール ＤＴＴ ジチオスレイトール Ｅ.ｃｏｌｉ エシェリキア・コリ ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＦＩＧＥ 逆層ゲル電気泳動 ＦＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー ｇ グラム ＧＡＰＤＨ グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ ＧＢｑ ギガベクレル ｇｐｄＡ ＧＡＰＤＨの遺伝子 ｈ 時間 ＨＥＰＥＳ Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ−２−プロパン スルホン酸 ＨＰ−ＲＰＣ 高速逆相クロマトグラフィー ｋｂ キロベース；１０００ヌクレオチド ｋＤａ キロダルトン ｌ リットル ＬＤＨ 乳酸デヒドロゲナーゼ ＭＢｑ メガベクレル ｍｇ ミリグラム ｍｉｎ 分 ｍｌ ミリリットル ｍＭ ミリモル ＭＯＰＳ ３−モルホリンプロパンスルホン酸 Ｍｒ 相対的モル重量 ｍＲＮＡ メッセンジャーリボ核酸 ｍＵ ミリ単位 ＮＡＤＨ ニコチンアミド−アデニン−デヌクレオチド、還元 ｎｇ ナノグラム ｎｍ ナノメートル ＰＥＧ ポリエチレングリコール ｐｆｕ プラーク形成単位 ｐＨ ｐＨ値 ｐｏｓ 位置 ＲＮＡ リボ核酸 ｒｐｍ 分当たりの回転 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＳＤＳ−ポリアミドゲル電気泳動 ｓｅｃ 秒 ＳＳＣ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸、ｐＨ ７．０ ＳＳＰＥ １８０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウン、１ ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．７ ＴＥ １０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ ＴＭ 平均融解速度 ｔｒｉｃｉｎ Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン ｔｒｉｓ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン （ｗ／ｖ）％ 重量／容量％ ｗｖ％ 重量／容量％ Ｖ 容量 （ｖ／ｖ）％ 容量％ ℃ 摂氏 更に、制限エンドヌクレアーゼの習慣的な略語（Ｓau３Ａ、ＨindIII、ＥcoＲ Ｉ、ＨindIII、ＣlaＩ等；マニアティスら、１９８２）を使用する。ヌクレオチ ド略語Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧをＤＮＡ配列に、およびアミノ酸略語（Ａrg、Ａsn、Ａsp 、Ｃys等；またはＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ等）（サムブルークら、１９８９）をポリペプ チドに使用した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 9452−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 21/04 9452−4Ｂ 21/04 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/04 Ｃ１２Ｒ 1:645） (31)優先権主張番号 Ｐ４３１６４１９．６ (32)優先日 1993年５月17日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＳＩ，ＵＳ (72)発明者 ショーエルゲンドルフェル、クルト オーストリア国アー―6322ウンターラング カンフェン367番 (72)発明者 ヴェーバー、ゲルハルト ドイツ連邦共和国デー―83088 キーフェ ースフェルテン、エーゲルゼーベーク15番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アラニンラセマーゼ活性を有する真核生物酵素またはそのフラグメントを コードする単離または組換えヌクレオチド配列。 ２．トリポクラジウム・ニベウムＡＴＣＣ３４９２１からのアラニンラセマー ゼをコードするか、またはアラニンラセマーゼ活性を有し、それと少なくとも７ ０％相同性を示す酵素をコードする、請求項１記載の単離または組換えヌクレオ チド配列。 ３．図６に示されている制限地図を有する、請求項１または２記載の単離また は組換えヌクレオチド配列。 ４．アラニンラセマーゼ活性を有する、図５に示されている完全なヌクレオチ ド配列またはそのフラグメントを含む、請求項３記載の単離または組換えヌクレ オチド配列。 ５．請求項４記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズする、単離ヌクレオチ ド配列。 ６．請求項１〜５のいずれか１項記載の単離ヌクレオチド配列を含むヌクレオ チド分子。 ７．請求項１〜６のいずれか１項記載の単離ヌクレオチド配列を含むベクター 。 ８．プラスミド、コスミド、Ｐ１ベクターまたはＹＡＣベクターの形態である 、請求項７記載のベクター。 ９．請求項７または８のいずれか１項記載のベクターをもつ宿主細胞。 １０．請求項９記載の宿主細胞を培養し、宿主細胞を誘導してアラニンラセマ ーゼを発現させることによる、アラニンラセマーゼの製造方法。 １１．請求項１０記載の方法を用いることにより製造されたアラニンラセマー ゼ。 １２．８位にＤ−アラニン以外の選択されたアミノ酸を含むシクロスポリン誘 導体の製造方法であって、 アラニンラセマーゼをコードする、シクロスポリン生産宿主のゲノムＤＮＡの 部分を不活化し、 選択されたアミノ酸を含む、シクロスポリン生産宿主を発酵ブロスで培養し、 そして 所望によりシクロスポリン生産宿主を誘導して、シクロスポリン誘導体を製造 する ことによる方法。 １３．８位にＤ−アラニン以外の選択されたアミノ酸を含むシクロスポリン誘 導体の製造方法であって、 選択されたアミノ酸の生合成を行わせる、シクロスポリン生産宿主をベクター により形質転換し、 所望によりアラニンラセマーゼをコードする、シクロスポリン生産宿主のゲノ ムＤＮＡの部分を不活化し、 シクロスポリン生産宿主を培養し、選択されたアミノ酸およびシクロスポリン 誘導体の製造を誘導する ことによる方法。 １４．シクロスポリンの生産性を改良する方法であって、 シクロスポリン生産宿主を請求項７または８記載のベクターにより形質転換し 、および 宿主細胞を誘導してアラニンラセマーゼを発現させる ことによる方法。 １５．酵素グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードし、所 望により遺伝子のプロモーター領域および／または終止領域を含む、トリポクラ ジウム・ニベウムから単離されたＤＮＡ。 １６．下記配列（コーディング鎖）の全部または１部のみを有する、請求項１ ５記載の単離ＤＮＡ。 １７．請求項１５または１６記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子。 １８．請求項１６記載の組換えＤＮＡ分子またはそのフラグメントにより形質 転換された菌。