DK172037B1 - Monoklonale antistoffer med cyclosporiner, hybridomcellelinje og immunoassaykit eller -system - Google Patents

Description

DK 172037 B1

Den foreliggende opfindelse angår monoklonale antistoffer mod cyclosporiner, især monoklonale antistoffer, som er i stand til at skelne mellem cyclosporiner og deres metabo-liter, og som er egnede til anvendelse i kits til diagnos-5 tik eller assay, samt endvidere hidtil ukendte hybridom-cellelinjer der anvendes til fremstilling af de nævnte monoklonale antistoffer og kits til diagnostik eller assay omfattende nævnte monoklonale antistoffer.

Cyclosporinerne udgør en klasse af strukturelt karakteris-10 tiske, cycliske, poly-N-methylerede undecapeptider, som sædvanligvis har farmakologisk, specielt immunosuppressiv, anti-inflammatorisk og anti-parasitisk virkning. Den første cyclosporin, der blev isoleret, var den naturligt forekommende svampemetabolit Cyclosporin, også kendt som cyclo-15 sporin A, med formlen A

JieBmt-aAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Al a- (D)A1 a-MeLeu-MeLeu-MeVal—.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

A

hvor -MeBmt- betegner N-methyl-(4R)-4-but-2E-en-l-yl-4-methyl-(L)threonyl-resten med formlen B

20 CH3 x \ nCH2

HO (R) CH B

^ch^ioN^ -N-CH-CO- I (S) CH3 hvor -x-y- betegner -CH=CH- (trans).

DK 172037 B1 2

Efter den oprindelige opdagelse af Cyclosporin er der isoleret og identificeret et stort antal naturligt forekommende cyclosporiner, og mange andre ikke-naturligt forekommende cyclosporiner er blevet fremstillet ved hjælp af hel-5 eller semi-syntetiske metoder eller ved anvendelse af modificerede dyrkningsteknikker. Den klasse, der omfatter cyclosporinerne, er således på nuværende tidspunkt af anselig størrelse og omfatter fx de naturligt forekommende cyclosporiner fra A til og med Z (jfr. Kobel et al., Euro-10 pean Journal of applied Microbiology and Biotechnology 14. 1982, s. 237-240 og posterpræsentation af Traber et al., 24. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, 8-10. oktober 1984); samt forskellige ikke-naturlige eller kunstige cyclosporiner, 15 herunder dihydrocyclosporiner (i hvilke gruppen -x-y- i -MeBmt- resten (se ovenstående formel B) er mættet, jfr. fx USA-patentskrift nr. 4.108.985, 4.210,581 og 4.220.641, cyclosporiner, hvor -MeBmt- resten er til stede i isomer-form eller i N-desmethylform (jfr. europæisk patentskrift 20 nr. 0.034.567 og "Cyclosporin A", Proc. Internat. Conference on Cyclosporin A. Cambridge, Storbritannien, september 1981, Ed. D.J.G. White, Elsevier Press, 1982) - idet begge beskriver den hel-syntetiske metode til fremstilling af cyclosporiner udviklet af R. Wenger); og cyclosporiner, i 25 hvilke indsættelsen af forskellige aminosyrer i forskellige stillinger inden for peptidsekvensen er udført. Eksempler på sådanne cyclosporiner som anført i ovenstående referencer omfatter fx [Thr]2-, [Val]2-, [Nva]2- og [Nva] 2 - [Nva] 5 -

Cyclosporin (også kendt som henholdsvis cyclosporin C, D, G 30 og M) og dihydro-[Val]2-Cyclosporin (også kendt som dihy-drocyclosporin D).

[I overensstemmelse med den nu konventionelle nomenklatur for cyclosporiner defineres disse i hele den foreliggende beskrivelse med krav ved at referere til strukturen i 35 Cyclosporin (dvs. cyclosporin A). Dette gøres ved først at angive de rester i molekylet, som afviger fra dem, som er til stede i Cyclosporin, og dernæst anvende udtrykket DK 172037 Bl 3 "Cyclosporin" for at karakterisere de resterende dele, som er identiske med dem, som er til stede i Cyclosporin. Samtidig anvendes præfikset "dihydro" til betegnelse af cyclo-sporiner, hvori -MeBmt- resten er hydrogeneret (-dihydro-5 MeBmt-), dvs. hvori -x-y- i formlen B er -CH2-CH2-. Således er [Thr]2-Cyclosporin den cyclosporin, som har sekvensen vist i formlen A, men hvor -aAbu- i 2-stillingen er erstattet med -Thr-, og dihydro-[Val]2-Cyclosporin er den cyclosporin, som har sekvensen vist i formlen A, men hvor 10 -MeBmt- i 1-stillingen er hydrogeneret, og -aAbu- i 2-stil-lingen er erstattet med -Val-.

I overensstemmelse med konventionel praksis er det endvidere underforstået, at aminosyrerester, som er betegnet med forkortelse, fx -Ala-, -MeVal- etc..., har L-konfigura-15 tion, medmindre andet er angivet. Forkortelser for rester, hvor "Me" står først, fx -MeLeu-, repræsenterer N-methyle-rede rester. De enkelte rester i cyclosporinmolekylet nummereres som i den kendte teknik med uret og begynder med resten -MeBmt- (eller -dihydro-MeBmt-) i 1-stillingen. Den 20 samme numeriske rækkefølge anvendes i hele den foreliggende beskrivelse med krav.] På grund af deres enestående immunosuppressive virkning har cyclosporinerne tiltrukket sig betydelig opmærksomhed, ikke kun i medicinske og akademiske kredse, men også i den of-25 fentlige presse. Cyclosporin selv er nu kommercielt tilgængelig og ofte anvendt til forebyggelse af afstødning efter transplantation af allogene organer, fx hjerte, hjertelunge, nyrer eller knoglemarv, samt for nylig til behandling af forskellige autoimmune og beslægtede sygdomme og 30 tilstande. Både dihydro-[Val]2-Cyclosporin og [Nva]2-Cyclo-sporin undergår for tiden omfattende kliniske undersøgelser som potentielle efterfølgere for Cyclosporin.

Dosering af cyclosporiner, fx Cyclosporin, giver imidlertid specielle vanskeligheder. Eftersom de metaboliske omdannel-35 seshastigheder har tendens til at variere fra patient til DK 172037 B1 4 patient, og da det terapeutiske vindue er snævert, er en effektiv dosering yderst patientspecifik og kræver fastlæggelse af passende individuelle serumniveauer. Regelmæssig måling af cyclosporinplasmakoncentrationer er såle-5 des en væsentlig forudsætning for effektiv behandling. Til dette formål er der udviklet et antal systemer bygget på højtryksvæskechromatografi (HPLC), radioimmunoassay (RIA) og fluorescensimmunoassay (FIA). HPLC-Metoder er imidlertid, skønt de er meget specifikke, vanskelige og uhåndter-10 lige at anvende i praksis, og det for tiden kommercielt tilgængelige RIA-system, der er baseret på polyklonalt antiserum fra får, er blevet kritiseret på grund af manglende specificitet. Udvikling af monoklonale antistoffer, der er specifikke over for cyclosporin, fx Cyclosporin, og 15 som er i stand til at skelne mellem terapeutisk indgivne cyclosporiner og deres metaboliter i den menneskelige organisme, har følgelig gennem længere tid været et påtrængende praktisk og også rent videnskabeligt mål, eftersom disse ville have fordelen af at tilbyde den samme potentielle 20 specificitet som HPLC-metodologi, medens de bevarer den fordelagtige, lette anvendelse, som opnås ved hjælp af konventionelle immunoassaysystemer. Yderligere ville tilvejebringelsen af sådanne cyclosporinspecifikke monoklonale antistoffer give et vitalt, nyt forskningsmæssigt værktøj, 25 som fx ville muliggøre sammenligningsundersøgelser af cyclosporintilpasning og definition på cyclosporinreceptor-krav etc.

Siden den oprindelige opdagelse af Cyclosporin er der gjort adskillige forsøg på at fremstille monoklonale antistoffer, 30 som kan reagere med cyclosporiner. Eftersom cyclosporiner, fx Cyclosporin, i sig selv har ringe immunogen virkning, har en almindelig fremgangsmåde været at anvende et immuno-gent, fx hapten-protein-, konjugat, fx fremstillet ved kobling af immunoglobuliner via hydroxygruppen tilgængelig 35 ved -Thr^- i [Thr]2-Cyclosporin under anvendelse af konventionelle koblingsteknikker, fx med EDCI [N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid.2HCl] eller MCDI [N-cyclo- DK 172037 B1 5 hexyl-N' - [β- (N-methylmorpholino) ethyl] carbodiimid.p-toluen-sulfonat] som koblingsmiddel. Disse forsøg er imidlertid slået fejl, og i de tilfælde, hvor monoklonale antistoffer er blevet opnået, har disse vist sig at have relativt lav 5 specificitet over for Cyclosporin eller at have specificitet over for det anvendte bæreprotein eller koblingsreagens og ikke over for Cyclosporin eller at vise stor krydsreaktion med koblingsmidlet. I intet tilfælde har det vist sig muligt at fremstille monoklonale antistoffer, som kunne 10 skelne mellem fx Cyclosporin og metaboliter deraf, fx metaboliterne Cyclosporin 17 og Cyclosporin 18, som beskrives nærmere i det følgende. Sådanne forsøg har endvidere kun ført til dannelse af monoklonale antistoffer af IgM-type og således i enhver henseende stort set utilstræk-15 kelige til anvendelse i noget almindeligt, fx klinisk, assaykit. Fremstillingen af monoklonale antistoffer, som reagerer specifikt med cyclosporiner, og som er i stand til at skelne mellem enkelte cyclosporiner og deres metaboliter, fx mellem Cyclosporin og dens metaboliter i den menne-20 skelige organisme, og som er egnede til anvendelse i et assaysystem, er således stadig et overordnet mål.

Chemical abstracts bind 95 (1981) nr. 197.042 beskriver et antistof mod cyclosporin A, hvor antistoffet er fremstillet i kaniner ved anvendelse af et hemisuccinatderivat af en 25 strukturel analog til cyclosporin A som hapten.

Ifølge den foreliggende opfindelse har det nu overraskende vist sig, at monoklonale antistoffer, som reagerer med cyclosporiner, og som imødekommer de mål, der er diskuteret ovenfor, nærmere betegnet som er i stand til at skelne 30 mellem cyclosporiner og metaboliter deraf, kan fremstilles ved i det væsentlige konventionelle immuniserings/fusions/-klonings-teknikker under anvendelse af immunogene konjuga-ter, som omfatter en cyclosporin som hapten ved det første immuniseringstrin, forudsat at konjugatet er fremstillet 35 ved kobling af bæreren til cyclosporinen ved hjælp af en aktiveret koblingsgruppe, fx hvis konjugatsyntesen udføres DK 172037 B1 6 under anvendelse af en cyclosporin, som har en aktiveret koblingsgruppe, som udgangsmateriale. Specielt under anvendelse af sådanne immunogene konjugater er det muligt at opnå monoklonale antistoffer, som er i stand til at udvise 5 en forfinet skelnen mellem cyclosporiner og metaboliter deraf selv med enkelte afvigende grupperinger på de enkelte rester, fx monoklonale antistoffer som i tilfælde af Cyclosporin kan reagere med Cyclosporin og samtidig udvise lav krydsreaktion med fx dennes metaboliter Cyclosporin 17 10 og/eller Cyclosporin 18.

Den foreliggende opfindelse angår i ét aspekt et monoklo-nalt antistof, som er reaktivt med en cyclosporin og udviser lav krydsreaktivitet med mindst én metabolit deraf i den menneskelige organiske, hvilket monoklonalt antistof er 15 fremstillet som respons på et antigen, som ikke fremstilles ved omsætning af et hemisuccinatderivat af en cyclosporin med et proteinkonjugat under anvendelse af carbodiimidrea-genser.

I et andet aspekt angår opfindelsen et hybridomcellelinie, 20 som producerer et sådant monoklonalt antistof.

I et yderligere aspekt angår opfindelsen et immunoassaykit eller -system til monitorering af blodniveauer af en cyclosporin, hvilket kit eller system omfatter et monoklonalt antistof som angivet ovenfor.

25 Foruden endelig at tilvejebringe midlerne til udvikling af håndterlige monoklonale assaysystemer, fx til klinisk brug, tilvejebringer den foreliggende opfindelse også midler til yderligere oprensning af cyclosporinmetaboliter og - eftersom det kan forudses, at monoklonale antistoffer, som kan ligne 30 receptorsteder, vil kunne opnås ved anvendelse af de generelle metoder ifølge opfindelsen - til karakterisering af potentielle, endogene cyclosporin-lignende molekyler. Betydningen af den foreliggende opfindelse både fra et praktisk og fra et rent videnskabeligt synspunkt indses således let.

DK 172037 B1 7

Som anført ovenfor fremstilles de immunogene konjugater, som kræves til udøvelse af opfindelsen, ved direkte kobling af en bærer, fx et proteinmolekyle, med en cyclosporin under indvirkning af en aktiveret koblingsgruppe. Dette kan 5 udføres enten ved reaktion mellem en bærer, som har en aktiveret koblingsgruppe, og en cyclosporin, som har en passende co-reaktiv substituent, fx en hydroxy- eller aminogruppe, fx som i tilfældet med [Thr]2-Cyclosporin eller [(D)Lys]8-Cyclosporin, som er beskrevet nedenfor, 10 eller ved reaktion mellem en bærer og en cyclosporin, som har en aktiveret koblingsgruppe, fx cyclosporin, hvori én af aminosyreresterne i cyclosporinmolekylet har en sidekæde ved α-carbonatomet, der omfatter eller indeholder en aktiveret koblingsgruppe. De nævnte konjugater omfatter således 15 en cyclosporin, hapten-del, der er direkte forbundet til en bærer-del og ikke via en mellemliggende koblingsmiddelrest, hvilket er tilfældet med de i den hidtil kendte teknik anvendte immunogene konjugater, som omfatter en cyclosporin som hapten, fx med henblik på frembringelse af almindelige, 20 polyklonale antisera.

Ved udtrykket "aktiveret koblingsgruppe", som benyttes i nærværende beskrivelse og krav, skal forstås en hvilken som helst gruppe, som er i stand til at reagere direkte med en passende, co-reaktiv gruppering, fx en amino-, hydroxy-, 25 thiogruppe eller lignende, med henblik på at give en covalent binding uden behov for anvendelse af et koblingsmiddel for at muliggøre, udføre eller fremme reaktion. I tilfældet med cyclosporiner, som har en "aktiveret koblingsgruppe", kan denne således være en hvilken som helst gruppe, som er 30 i stand til at reagere direkte med et bærermolekyle, fx et proteinmolekyle, til dannelse af et covalent bundet konju-gat med nævnte bærermolekyle uden behov for anvendelse af et koblingsmiddel for at muliggøre, udføre eller fremme kobling eller reaktion med nævnte bærermolekyle.

35 Grupper, som er egnede som aktiverede koblingsgrupper, er kendte inden for teknikken og omfatter fx i) aktiverede DK 172037 B1 8 ester- eller aktiverede carboxygrupper, dvs. med den almene formel -CO-OZ, hvor Z er en carboxyaktiverende gruppe såsom o- eller p-nitrophenyl, 1-benztriazol, pentafluorphenyl eller N-succinimido; ii) aktiverede dithiogrupper, dvs. med 5 den almene formel -S-S-X, hvor X er en dithioaktiverende gruppe såsom 2-pyridyl; samt iii) epoxygrupper.

Egnede immunogene konjugat-bærermolekyler, som har en aktiveret koblingsgruppe, fx en epoxygruppe, som nævnt ovenfor, kan fremstilles ifølge den kendte teknik, fx som 10 beskrevet af Laumen et al., Tetrahedron Letters 26 (4), 1985, s. 407-410. Ifølge de generelle metoder ifølge den foreliggende opfindelse foretrækkes det imidlertid, at den aktiverede koblingsgruppe er tilvejebragt på den cyclosporin, som skal sammenkobles med bæreren fremfor omvendt.

15 Principielt kan den aktiverede koblingsgruppe være til stede i en hvilken som helst stilling i cyclosporinmolekylet.

I det omfang omdannelser i 1-stillingen har speciel betydning for cyclosporinmetabolisme, eller i det omfang større cyclosporinmetaboliter, fx i tilfælde af Cyclosporin, Cyc-20 losporin 17 og Cyclosporin 1ϋ, udviser strukturelle variationer i 1-stillingen som beskrevet nedenfor, foretrækkes det, at den aktiverede koblingsgruppe er til stede i én af stillingerne fra 2 til 11, hvorved resten i 1-stillingen er intakt, helst "demaskeret" af bæreren i det herefter opnå-25 ede immunogene konjugat, og således fri til at fremkalde specifikt antistofsvar. Det er sædvanligvis hensigtsmæssigt, hvis den aktiverede koblingsgruppe er i 2-stillingen eller i en hvilken som helst af stillingerne 3, 5-8 eller 10, specielt 5-8 inklusive, idet 2- og 8-stillingerne spe-30 cielt foretrækkes.

Med hensyn til Cyclosporin er hovedparten af de metaboliske omdannelser, som forekommer i den menneskelige organisme, følgende: DK 172037 B1 9

I) Terminal hydroxylering af -MeLeu9-, hvilket giver resten med formlen E

CH3 CO- I / H0-C(CH3)-CH2-CH(L)

^ E

N(CH3).

5

II) terminal hydroxylering af -MeBmt1-, hvilket giver resten med formlen F

C0-

HO-CH2.CH«CH-CH2-CH(CH3)-CH(OH)-CHU) F

(TRANS) (R) (R) N(CH3)- 10 III) des-N-methylering af -MeLeu4-, hvilket giver -Leu-; IV) terminal hydroxylering af -MeLeu4-, hvilket giver resten med ovennævnte formel E; V) terminal hydroxylering af -MeLeu6-, hvilket giver 15 resten med ovennævnte formel E?

VI) terminal hydroxylering og ringslutning i -MeBmt1-, hvilket giver resten med formlen G

CO- / H0-CH2-CH2-CH-CH2-CH(CH3)-CH-CH(S) I \ -o-1 xn(ch3)- 20 DK 172037 B1 10

Kendte metaboliter af Cyclosporin (identificeret som Cyclosporin 1, Cyclosporin 8, etc.) udviser således følgende metaboliske variationer.

Cyclosporin 1:1. Cyclosporin 8 : I + II. Cyclosporin 9 : 5 I + III + V. Cyclosporin 10 : I + IV. Cyclosporin 16 : I + V. Cyclosporin 17 : II. Cyclosporin 18 : VI. Cyclosporin 21 : III.

[Jfr. G. Maurer et al., Drug Metab. Disposit 12. 1984, s. 120-126].

10 Til fremstilling af monoklonale antistoffer, som kan skelne mellem Cyclosporin og metaboliter deraf i den menneskelige organisme, vil det således være hensigtsmæssigt, at den aktiverede koblingsgruppe i den cyclosporin, der anvendes til dannelsen af immunogent konjugat, er i en anden stil-15 ling end 1-, 4-, 6- eller 9 - stillingen, og at der ikke er tale om l-stillingen i de tilfælde, hvor Cyclosporin 17 og 18 udgør betydningsfulde metaboliter. Således foretrækkes især 2- og 8-stillingen, når der er tale om Cyclosporin.

Cyclosporiner med en aktiveret koblingsgruppe som beskrevet 20 ovenfor kan fremstilles enten ved: i) aktivering af en hensigtsmæssig allerede eksisterende precursorgruppe (dvs. koblingsgruppe i ikke-aktiveret form), fx omdannelse af carboxygruppen i en cyclosporin med en carboxysubstitueret α-aminosyrerest (dvs. a-aminosyre- 25 rest med en sidekæde ved det α-carbonatom, der omfatter eller bærer en carboxygruppe), fx i 2- eller 8-stillingen, til en aktiveret carboxygruppe ved omsætning med et car-boxyaktiverende middel; eller ved ii) acylering eller etherificering af en Cyclosporin med en 30 amino- eller hydroxysubstitueret α-aminosyrerest (dvs.

α-aminosyrerest med en sidekæde ved det α-carbonatom, som omfatter eller bærer en hydroxy- eller aminogruppe), fx

DK 172037 BT

11 hydroxysubstitueret α-aminosyrerest i 2-stillingen eller amino- eller hydroxysubstitueret α-aminosyrerest i 8-stil-lingen, med et acylerings- eller alkyleringsmiddel, der bærer en aktiveret koblingsgruppe.

5 Ovennævnte trin i) i fremgangsmåden kan udføres ifølge den kendte teknik, fx med hensyn til aktiveringen af carboxy-grupper ved reaktion med et almindeligt carboxyaktiverende middel såsom o- eller p-nitrophenol, 1-hydroxybenztriazol, pentafluorphenol eller N-hydroxysuccinimid. Reaktionen 10 udføres med fordel i nærværelse af et kondensationsmiddel såsom EDCI.

Trin ii) i fremgangsmåden kan også udføres ifølge stort set kendte teknikker. Således kan amino- eller hydroxygrupper acyleres på passende måde ved reaktion med et derivat af en 15 carboxylsyre, i hvilket carboxygruppen er aktiveret, og som yderligere har en aktiveret koblingsgruppe, der ikke reagerer med amino- eller hydroxygrupper alt efter omstændighederne, fx N-[(2-pyridyl)dithiopropion-l-yl]succinimid, [hvor (2-pyridyl)dithio-delen bidrager med den aktiverede 20 koblingsgruppe (ikke-reaktiv - i dette tilfælde - hverken med amino- eller hydroxygrupper), og hvor -COO-succinimido-delen bidrager med den aktiverede carboxygruppe til opnåelse af acylering]. Reaktionen udføres hensigtsmæssigt i et inert opløsningsmiddel eller fortyndingsmiddel såsom 25 dichlormethan fx ved omgivelsestemperatur. Alternativt kan hydroxygrupper etherificeres fx for at indføre en epoxyhol-

dig del med formlen O

/ v -ch2-ch-ch2 (epoxydelen tilvejebringer den aktiverede koblingsgruppe), 30 under anvendelse af et hvilket som helst af de forskellige midler, der i den kendte teknik anvendes til formålet, såsom epichlorhydrin eller epibromhydrin, fx ifølge de generelle fremgangsmåder beskrevet af Laumen et al., Loc. cit.

Cyclosporin-udgangsmaterialer til trin i) i ovennævnte 35 fremgangsmåde kan fremstilles analogt med trin ii) i frem- DK 172037 Bl 12 gangsmåden, fx til fremstilling af en cyclosporin med en carboxysubstitueret a-aminosyrerest fx i 2- eller 8-stil-1ingen: iii) ved reaktion mellem en cyclosporin med en amino- eller 5 hydroxysubstitueret α-aminosyrerest, fx hydroxysubstitueret α-aminosyrerest i 2-stillingen eller amino- eller hydroxysubstitueret α-aminosyrerest i 8-stillingen, og enten a) en dicarboxylsyre, hvor én af de tilstedeværende carboxygrup-per er i beskyttet form, eller b) et dicarboxylsyreanhy-10 drid, fx ravsyreanhydrid, idet reaktionen i tilfælde a) efterfølges af afbeskyttelse af carboxygruppen i cyclo-sporinproduktet.

Reaktionstrin iii) kan også udføres under anvendelse af stort set konventionelle fremgangsmåder, fx i nærværelse af 15 et syrebindende middel såsom 4-dimethylaminopyridin, i et inert organisk opløsnings- eller fortyndingsmiddel ved omgivelses- eller let forhøjet temperatur. I de tilfælde, fx som nævnt under a) ovenfor, hvor der anvendes carboxybe-skyttelsesgrupper, kan disse være helt konventionelle, og 20 de kan fjernes ved hjælp af helt konventionelle teknikker.

De til fremgangsmådetrin ii) og iii) anvendte cyclosporin-udgangsxnaterialer med en hydroxysubstitueret a-aminosyrerest omfatter de kendte cyclosporiner: [Thr]2-Cyclosporin og [(D)Ser]8-Cyclosporin, idet sidstnævnte fx er beskrevet 25 i europæisk patentskrift nr. 0 056 782, tillige med til fremstilling deraf ifølge de generelle teknikker med den total-syntetiske metode til fremstilling af de cyclosporiner, som er anført ovenfor, eller ved hjælp af fermentationsteknik. Andre cyclosporiner med en hydroxysubstitueret 30 α-aminosyrerest, fx i 8-stillingen, kan fremstilles eller opnås på analog måde, og flere sådanne Cyclosporiner, herunder [(D)Thr]8-Cyclosporin, [Nva]2-[(D)Ser]8-Cyclosporin og [Thr]2-[(D)Ser]8-Cyclosporin, er beskrevet i US patentansøgning nr. 713.259 (indleveret 19. marts 1985) = DE 35 patentansøgning nr. P 35 09 809.0 (indleveret 19. marts DK 172037 B1 13 1985) = FR patentansøgning nr. 8 404 172 (indleveret 19. marts 1985) * AU patentansøgning nr. 40.272/85 (indleveret 22. marts 1985) * GB patentansøgning nr. 8507270 (indleveret 20. marts 1985) * NZ patentansøgning nr. 211.526 (ind-5 leveret 21. marts 1985) m ZA patentansøgning nr. 85/2195 (indleveret 22. marts 1985).

Af cyclosporiner med en aminosubstitueret a-aminosyrerest foretrækkes specielt dem, der har aminosyreresten i 8* stilling, idet især cyclosporiner, hvor resten i 8-stil-10 lingen er -(D)Lys-, foretrækkes. Sådanne cyclosporiner kan også fremstilles ifølge de generelle teknikker med den total-syntetiske metode til fremstilling af cyclosporiner, hvilke teknikker er udviklet af R. Wenger, fx iv) ved afbeskyttelse af en cyclosporin med en aminosubsti-15 tueret α-aminosyrerest i 8-stillingen, idet denne cyclosporin er i beskyttet form, fx ved afbeskyttelse af en cyclosporin, i hvilken resten i 8-stillingen er -(D)Lys- i N-e-beskyttet form; eller v) cyclisering af et ligekædet undecapeptid med sekvensen 20 af cyclosporinproduktet, således at nævnte undecapeptid er i fri eller beskyttet form, fx et undecapeptid, som indeholder en -(D) Lys-rest i fri eller N-«-beskyttet form i den stilling, der svarer til 8-stillingen i cyclosporinproduktet, samt efter behov at udføre trin iv) i fremgangs -2 5 måden.

Fremgangsmådetrin iv) og v) kan specielt udføres ifølge den generelle procedure, som beskrives i det følgende eksempel l.

Som det ses af ovenstående beskrivelse af fremgangsmådetrin 30 i), ii) og iii), vil produkterne fra trin i) eller ii) almindeligvis omfatte cyclosporiner med en acylamino-, acyl-oxy- eller alkoxysubstitueret α-aminosyrerest (dvs. en a-aminosyrerest med en sidekæde ved det α-carbonatom, der DK 172037 B1 14 omfatter eller bærer en acylamino-, acyloxy- eller alkoxy-gruppe), fx cyclosporin med en acyloxy- eller alkoxysubsti-tueret α-aminosyrerest i 2-stillingen eller en acylamino-, acyloxy- eller alkoxysubstitueret α-aminosyrerest i 8-5 stillingen, hvori den aktiverede koblingsgruppe er til stede på acyl/alkyl-delen.

Dette forstås lettere under henvisning til de følgende reaktionsskemaer, som illustrerer fremstillingen af specielle cyclosporingrupper ifølge de generelle metoder i 10 ovennævnte fremgangsmådetrin i)-v): I de følgende formler Ia-Id, Ila-IId og III gælder, at C repræsenterer sekvensen -Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-, og 3 4 5 6 7 E repræsenterer sekvensen -MeLeu-MeLeu-MeVal-.

15 9 10 11

Reaktionstrin i) a) pA1-Ba1-C-D1-Ei la i hvilken A2 = -MeBmt-, 20 Bg1 = -(O-acyl)-Thr-, hvor acyldelen bærer en koblingsgruppe i ikke-aktiveret form, fx en fri carboxygruppe, fx -(O-hydroxysuc-cinyl)-Thr-, og D1 = -(D) Ala-: 25 Aktivering, fx ved omsætning med et carboxy-aktiverende middel, hensigtsmæssigt i nærværelse af et koblingsmiddel såsom EDCI: p A1-Bb1-C-D1-E-| Ila 30 i hvilken DK 172037 B1 15 A1 og D1 har den ovennævnte betydning, og

Bb1 = -(0-acyl)-Thr-, hvor acyldelen bærer en aktiveret koblingsgruppe, fx en aktiveret carboxygruppe, fx -(0-acyl)-Thr-, 5 hvor acyldelen har den almene formel Z0-C0-(CH2)2“CO-, hvor Z er en carboxy-aktiverende gruppe.

b) p A2—B2-C-Da2-E-j Ib i hvilken 10 A2 = -MeBint-, og B2 = -aAbu- eller -Nva-, eller A2 = -dihydro-MeBmt-, og B2 = -Val-, og Da2 = en acylaminosubstitueret (D)a-amino- syrerest, fx -(N-e-acyl)-(D)Lys-, hvor 15 acyldelen bærer en koblingsgruppe i ikke-aktiveret form, fx en fri carboxygruppe, fx -(N-c-hydroxysuccinyl)- (D)Lys-:

Aktivering, fx ved omsætning med et car-20 boxyaktiverende middel, fx N-hydroxy- succinimid, hensigtsmæssigt i nærværelse af et koblingsmiddel såsom ECDI: Ψ p A2-B2-C-Db2-E-| Ilb hvilken 25 A2 og B2 har den ovenfor anførte betydning, og 2

Dj)2 = en acylaminosubstitueret (D)a-amino- syrerest, fx -(N-e-acyl)-(D)Lys-, hvor acyldelen bærer en aktiveret koblings-30 gruppe, fx en aktiveret carboxygruppe, fx -(N-e-acyl)-(D)Lys-, hvor acyldelen har den almene formel Z0-C0-(CH2)2“C0-, DK 172037 B1 16 hvor Z har den ovenfor anførte betydning.

Reaktionstrin ii) a) {· A1-Ba3-C-D-L-Ej} le 5 i hvilken A1 og D1 har den ovenfor anførte betydning, og

Ba3 = -Thr-: O-alkylering til indføring af en alkyl-10 del med en aktiveret koblingsgruppe, fx en epoxygruppe, fx ved omsætning med epichlorhydrin eller epibrorahydrin:

V

p A1-Bb3-C-D1-E"| Ile i hvilken 15 A1 og D1 har den ovenfor anførte betydning, og

Bjj3 = - (O-alkyl)-Thr, hvor alkyldelen bærer en aktiveret koblingsgruppe, fx en epoxygruppe, fx -(O-epoxymethyl)-Thr-.

20 b) pA2-B2-C-Da3-E-| Id i hvilken A2 og B2 har den ovenfor anførte betydning, og

Da3 = en aminosubstitueret (D)a-aminosyrerest, 25 fx -(D)Lys-: N-e-acylering under anvendelse af et acyleringsmiddel som har en aktiverende koblingsgruppe, der er ikke-reaktiv med -NH2, fx et acyleringsmiddel med den 17 DK Ί72037 Bl almene formel ZO-CO-(CH2)hvor Z har den ovenfor anførte betydning, og Y er en aktiveret koblingsgruppe, som er ikke-reaktiv med -NH2, fx en 2-pyridyl-5 ψ dithiogruppe: p A2-B2-C-Db3-E η Ild i hvilken A2 og B2 har den ovenfor anførte betydning, og 10 Dj,3 = en acylaminosubstitueret (D)a-amino- syrerest, fx -(N-«-acyl)-(D)Lys-, hvor acyIdelen bærer en aktiveret koblingsgruppe, fx -[N-c-(3-(2-pyridyl)dithio-propion-l-yl)]-(D) Lys-.

15 Reaktionstrin iii) a) En cyclosporin med den almene formel Ic som defineret ovenfor:

Acylering, fx ved omsætning med ravsyre-,, f anhydr id: 20 En cyclosporin med den almene formel la som defi neret ovenfor.

b) En cyclosporin med den almene formel Id som defineret ovenfor:

Acylering, fx ved omsætning med ravsyre-25 ^ anhydrid:

En cyclosporin med den almene formel Ib som defineret ovenfor.

Reaktionstrin iv) rA2-B2-C-Da4-E·) le DK 172037 B1 18 i hvilken A2 og B2 har den ovenfor anførte betydning, og

Da4 = en aminosubstitueret (D)a-aminosyrerest, 5 fx -(D)Lys-, i beskyttet form:

Afbeskyttelse:

\K

En cyclosporin med den almene formel Id som defineret ovenfor.

Reaktionstrin v)

10 H—Da5-E-A2-B2-C—OH III

i hvilken A2 og B2 har den ovenfor anførte betydning, og

Da5 = en aminosubstitueret (D)a-aminosyrerest, 15 fx -(D)Lys-, i fri eller -N-e-beskyttet form:

Cyclisering ifølge R. Wenger's metode:

En cyclosporin med den almene formel Id eller le som defineret ovenfor.

20 Det skal på dette sted bemærkes, at hydroxygruppen i 3'-stillingen i -MeBmt- og -dihydro-MeBmt- har relativt lav reaktivitet. I de tilfælde, hvor de ovenfor beskrevne fremgangsmåder involverer reaktion med cyclosporiner, som har en hydroxysubstitueret α-aminosyrerest i en hvilken som 25 helst af stillingerne 2-11, fx -Thr- i 2-stillingen, er reaktion med hydroxygruppen i denne rest således at foretrække fremfor reaktion med hydroxygruppen i -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-, idet uønsket sidereaktion med sidstnævnte således let undgås.

DK 172037 B1 19 I de ovenfor anførte almene formler Ib, Ilb, Id, Ild, le og III betegner A2 og B2 fortrinsvis henholdsvis -MeBmt- og -a-Abu-- I hele den foregående beskrivelse, hvor cyclosporiner med 5 en specifik rest i 8-stillingen er omtalt, men hvor konfigurationen af denne rest ikke er nævnt, er (D)-konfigurationen den foretrukne.

Cyclosporiner med en aktiveret koblingsgruppe som beskrevet ovenfor såvel som cyclosporiner med en aminosubstitueret a-10 aminosyrerest i 8-stillingen, i hvilken aminosubstituenten er i fri eller beskyttet form eller på anden måde afledt, fx acyleret, er hidtil ukendte og udgør en del af den foreliggende opfindelse. Der beskrives således følgende: 1.1 Cyclosporin med en a-aminosyrerest med en aktiveret 15 koblingsgruppe.

1.2 Cyclosporin ifølge punkt 1.1, hvor nævnte a-aminosyrerest er til stede i én af stillingerne 2-11 inklusive.

1.3 Cyclosporin ifølge punkt 1.2, hvor nævnte a-amino- 20 syrerest omfatter en acylamino-, acyloxy- eller alkoxysubstitueret a-aminosyrerest, i hvilken den aktiverede koblingsgruppe er til stede på acylamino-, acyloxy- eller alkoxysubstituenten.

1.4 Cyclosporin ifølge et hvilket som helst af punkterne 25 1.1-1.3, hvor den aktiverede koblingsgruppe er en aktiveret ester-, aktiveret dithio- eller epoxygruppe.

1.5 Cyclosporin ifølge punkt 1.3, hvor nævnte a-amino-syrerest omfatter: en acylaminosubstitueret a-amino- 30 syrerest, hvor acylaminosubstituenten er substitueret i dennes acyldel med en aktiveret carboxy- eller ak- DK 172037 Bl 20 tiveret dithiogruppe; en acyloxysubstitueret a-amino-syrerest, hvor acyloxysubstituenten er substitueret i dennes acyldel med en aktiveret carboxygruppe; eller en alkoxysubstitueret α-aminosyrerest, hvor alkoxy-5 substituenten er substitueret med en epoxygruppe.

1.6 Cyclosporin ifølge et hvilket som helst af punkterne 1.3-1.5, hvor nævnte α-aminosyrerest er en (0-acyl)-threonylrest i 2-stillingen.

1.7 Cyclosporin ifølge punkt 1.6, hvor acyldelen har den 10 almene formel Z0-C0-CH2-CH2-C0-, hvor Z er en car- boxyaktiverende gruppe.

1.8 Cyclosporin ifølge punkt 1.2, hvor nævnte a-amino-syrerest er til stede i 5-, 6-, 7- eller 8-stillin-gen.

15 1.9 Cyclosporin ifølge punkt 1.8, hvor nævnte a-amino- syrerest er en (D)α-aminosyrerest i 8-stillingen.

1.10 Cyclosporin ifølge punkt 1.9, hvor nævnte a-amino-syrerest er en acylaminosubstitueret (D) a-aminosyre-rest, i hvilken den aktiverede koblingsgruppe er til 20 stede på acylaminosubstituenten.

1.11 Cyclosporin ifølge punkt 1.10, hvor den aktiverede koblingsgruppe er en aktiveret carboxy- eller aktiveret dithiogruppe.

1.12 Cyclosporin med en aminosubstitueret (D) a-aminosyre- 25 rest i 8-stillingen, idet aminosubstituenten er i fri eller beskyttet form.

1.13 Cyclosporin med en acylaminosubstitueret (D) cr-amino-syrerest i 8-stillingen, idet acylaminosubstituenten er substitueret i dennes acyldel med en fri carboxy- 30 gruppe.

DK 172037 B1 21

1.14 Cyclosporin ifølge et hvilket som helst af punkterne 1.10-1.13 med den almene formel D

NH-X

I D

(CH2)4 -NH-CH-CO- 5 hvor X er hydrogen, en aminobeskyttelsesgruppe eller en acylgruppe substitueret med en fri car-boxygruppe eller en aktiveret koblingsgruppe, fx en aktiveret carboxy- eller dithiogruppe, 10 fx en acylgruppe med den almene formel Y-CH2-CH2-co- hvor Y er carboxy, en aktiveret carboxygruppe eller en aktiveret dithiogruppe.

1.15 Cyclosporin med den almene formel Ila, Ib, Ilb, Ile, 15 Id, Ild eller le som defineret ovenfor.

Som diskuteret ovenfor har det nu ifølge den foreliggende opfindelse overraskende vist sig, at immunogene konjugater med en bærer og en cyclosporin koblet under indvirkning af en aktiveret koblingsgruppe, specielt opnået under anven-20 delse af cyclosporiner med en aktiveret koblingsgruppe som ovenfor beskrevet, fx som defineret under 1.1-1.11, 1.14 eller 1.15, for første gang gør det muligt at fremstille monoklonale antistoffer, som kan skelne mellem cyclosporiner og metaboliter deraf. Immunogene konjugater med de 25 nævnte cyclosporin-reaktionsprodukter som hapten-bestanddel er således i stand til at fremkalde et antistofsvar i de dyr, der er blevet immuniseret, fx ved hjælp af inokula-tion, således at antistofproducerende celler, fx celler fra DK 172037 B1 22 milt eller lymfeknude, derefter kan opnås derfra og benyttes til fremstilling af hybridomcellelinjer, som kan tilvejebringe monoklonale antistoffer med evne til at skelne mellem terapeutisk indgivne cyclosporiner, fx Cyclosporin, 5 og metaboliter deraf, specielt metaboliter i den menneskelige organisme, fx Cyclosporin 17 og Cyclosporin 18. Idet sådanne antigene konjugater er hidtil ukendte, tilvejebringes herved yderligere: 2.1 Immunogent konjugat med en bærer koblet til en cyclo- 10 sporin under indvirkning af en aktiveret koblings- gruppe, fx en bærer koblet til en cyclosporin med en a-aminosyrerest, som bærer en aktiveret koblings-gruppe, fx som ovenfor beskrevet, især en cyclosporin som tidligere defineret under et hvilket som helst af 15 de ovennævnte punkter 1.1-1.11, 1.14 eller 1.15 (de almene formler Ila, Ilb, Ile eller Ild).

2.2 Immunogent konjugat, der er opnået eller kan opnås ved kobling af en cyclosporin med en a-aminosyrerest, som bærer en aktiveret koblingsgruppe, fx som tid- 20 ligere beskrevet, især en cyclosporin som tidligere defineret under et hvilket som helst af de ovennævnte punkter 1.1-1.11, 1.14 eller 1.15 (de almene formler Ila, Ilb, Ile eller Ild).

2.3 Immunogent konjugat, fx som defineret under 2.1 eller 25 2.2, som kan anvendes til fremstilling af et monoklo- nalt antistof, der kan skelne mellem en cyclosporin og en metabolit deraf, fx et monoklonalt antistof som beskrevet i det følgende og især som defineret i det følgende under punkt 3.1-3.10.

30 Egnede bærere for de immunogene konjugater ifølge opfindelsen omfatter en hvilken som helst af dem, der er kendte og almindeligvis anvendes i teknikken, specielt polypeptider med høj molekylvægt, især proteiner såsom serumalbuminer, fx bovint serumalbumin og hønseovalbumin, immunoglobuliner, DK 172037 Bl 23 specielt fra IgG-klassen såsom hønse- eller marsvine-IgG samt syntetiske polymerer såsom polyglutaminsyre.

Desuden tilvejebringes der en fremgangsmåde til fremstilling af et immunogent konjugat som defineret ovenfor, 5 hvilken fremgangsmåde omfatter: vi) kobling af en bærer, fx som beskrevet ovenfor, der bærer en aktiveret koblingsgruppe, til en cyclosporin med en α-aminosyrerest indeholdende en passende co-reaktiv gruppe, fx en hydroxy- eller aminogruppe, fx 10 [Thr]2-Cyclosporin eller [(D)Lys]Cyclosporin, eller kobling af en bærer, fx som beskrevet ovenfor, til en cyclosporin med en α-aminosyrerest indeholdende en aktiveret koblingsgruppe, fx som ovenfor beskrevet, især en cyclosporin som ovenfor defineret under et 15 hvilket som helst af punkterne 1.1-1.11, 1.14 eller 1.15 (de almene formler Ila, Ilb, Ile eller Ild).

Det ovennævnte trin i fremgangsmåden udføres ved direkte reaktion med cyclosporinbestanddelen, dvs. uden anvendelse af et koblingsmiddel. Reaktionen udføres fortrinsvis ved 20 tilsætning af cyclosporinbestanddelen opløst i et passende inert fortyndingsmiddel eller en bærer såsom dimethylformamid til en bufret præparation af bæreren, fx bærerprotein, fx opløsning eller suspension i hydrogencarbonatbuffer ved omgivelsestemperatur. Det opnåede immunogene konjugat op-25 renses hensigtsmæssigt ved dialyse, fx over for phosphat-bufret saltvand.

De ovenfor beskrevne immunogene konjugater, fx som defineret under 2.1-2.3, kan anvendes til fremstilling af monoklonale antistoffer ved i det væsentlige standardtek-30 nikker, fx via en trinvis procedure, som omfatter: a) indgift af et immunogent konjugat, fx som defineret under et hvilket som helst af punkterne 2.1-2.3 ovenfor, til en passende dyreart; b) isolering af antistofproducerende celler, fx milt- eller lymfeknudeceller, som er sensibili- DK 172037 B1 24 seret over for det immunogene konjugat; c) udødeliggørelse af de isolerede celler, fx ved fusion med en passende mye-lomcellelinje til fremstilling af hybridomcellelinjer; og d) udvælgelse af en udødeliggjort cellelinje, fx hybridom-5 cellelinje, som producerer de ønskede monoklonale antistoffer.

Trin a) udføres hensigtsmæssigt under anvendelse af rotter eller mus, fx med Balb/c-hunmus som recipienter, og indgift af det immunogene konjugat ved subcutan eller intraperito-10 neal injektion i mængder på fra ca. 50 til 200 μg, fx 100 μg, efterfulgt af booster-injektioner intraperitonealt, subcutant eller intramuskulært 14-21 dage senere. Mus, som giver høj-titrede antisera med passende isotype-fordeling, fx som bestemt ved hjælp af almindelig RIA- og/eller ELISA-15 teknik, gives yderligere booster-injektioner fx i overensstemmelse med de specielle procedurer, der beskrives nedenfor i eksempel 9, og antistofproducerende celler, fx milt-celler, indsamles [trin b)]. Trin c) kan udføres ifølge en hvilken som helst af de kendte teknikker, fx under anven-20 delse af den metode, der er beskrevet af S. Fazekas et al·., is. Immunol. Methods 35. 1980, s. 1-32, hvor en fore-trukken myelomlinje er en muse-(BALB/C)-linje. I trin d) screenes voksende myelomlinjer for antistofproduktion mod en cyclosporin, fx ved hjælp af et almindeligt RIA-system, 25 hvor der benyttes et radioaktivt mærket derivat, eller ved hjælp af et almindeligt ELISA-system, fx som beskrevet nedenfor i eksempel 9.

Ved anvendelse af de ovenfor beskrevne procedurer, hvori der indgår de specielle immunogene konjugater ifølge op-30 findelsen, er det muligt at opnå monoklonale antistoffer, som udviser en sådan grad af specificitet, at de er i stand til at skelne mellem enkelte cyclosporiner, som kun adskiller sig fra hinanden ved mindre strukturelle elementer, fx ved tilstedeværelse af en enkelt hydroxygruppe i stedet for 35 et hydrogenatom. Af større vigtighed er det, at den foreliggende opfindelse for første gang muliggør opnåelse af DK 172037 B1 25 monoklonale antistoffer, som kan skelne mellem cyclospori-ner, fx Cyclosporin, og metaboliter deraf, specielt metabo-liter deraf i den menneskelige organisme. Monoklonale antistoffer opnået ved fremgangsmåden ifølge den forelig-5 gende opfindelse har således vist sig at reagere med cyclo-sporiner, fx Cyclosporin, medens de udviser relativt lav krydsreaktion med metaboliter deraf. Endvidere muliggør den foreliggende opfindelse under anvendelse af de immunogene konjugater ifølge opfindelsen, fx som defineret ovenfor 10 under 2.1-2.3, hvor cyclosporin-hapten-bestanddelen svarer til en valgt "mål-cyclosporin", opnåelse af monoklonale antistoffer, som kan skelne mellem "mål-cyclosporinen" og strukturmæssigt nært beslægtede metaboliter deraf, fx humane metaboliter. Ved således at gå ud fra et immunogent 15 konjugat, som er opnået ved kobling af en bærer til en cyclosporin med en aktiveret koblingsgruppe i 2-stillingen, fx som defineret ovenfor under 1.6, og i hvilken a-amino-syreresterne i de øvrige stillinger 1 og 3-11 er de samme som i Cyclosporin, er det muligt at fremstille monoklonale 20 antistoffer, der kan reagere med Cyclosporin som "mål- cyclosporin" fremfor metaboliter deraf i den menneskelige organisme, fx Cyclosporinerne 1, 8, £, 10, 16, 17, og/eller 21, specielt 17 og/eller lå og især 17. På lignende måde er det muligt - ved at gå ud fra immunogene konju-25 gater opnået ved kobling af en bærer til en cyclosporin med en aktiveret koblingsgruppe i 5-, 6-, 7- eller 8-stil-lingen, fx som defineret under 1.8 ovenfor, specielt i 8-stillingen, fx som defineret ovenfor under et hvilket som helst af punkterne 1.9, 1.11, 1.14 eller 1.15 (de almene 30 formler Ilb eller Ild), og hvor resterne i de øvrige stillinger, fx 1-7 og 9-11, svarer til dem i Cyclosporin, dihydro-[Val]2-Cyclosporin eller [Nva]2-Cyclosporin - at fremstille monoklonale antistoffer, som reagerer med Cyclosporin, dihydro-[Val]2-Cyclosporin eller [Nva]2-Cyclosporin 35 som "mål-cyclosporin", fremfor metaboliter deraf, fx metaboliter deraf i den menneskelige organisme, såsom i tilfælde af Cyclosporin de umiddelbart ovenfor beskrevne.

DK 172037 B1 26

Monoklonale antistoffer, som kan opnås ved fremgangsmåderne ifølge opfindelsen, er især i stand til at skelne mellem "mål-cyclosporiner" og deres metaboliter, som udviser strukturel omdannelse af α-aminosyreresten i 1-stillingen, 5 fx metaboliter, der adskiller sig fra den ikke-metabolise-rede cyclosporin, hvorfra de er afledt, ved substituerende eller anden kemisk modifikation af -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-resten i 1-stillingen, især de, der udviser strukturel omdannelse ved en terminal stilling i resten i 1-stil-10 lingen, fx omfattende hydroxylering ved den terminale (C9)-MeBmt-methylgruppe, som i tilfældet med monoklonale antistoffer beskrevet i eksempel 9, idet disse kan reagere med Cyclosporin, medens de har relativt lav krydsreaktion med dens metabolit Cyclosporin 17. For så vidt som en sådan 15 metabolisk omdannelse af cyclosporin er af speciel betydning, fx som det er karakteristisk for større metaboliter i den menneskelige organisme, som i tilfældet med Cyclosporin 17 og 18, må specielt bemærkes evnen hos de monoklonale antistoffer, der kan opnås ved fremgangsmåden ifølge opfin-20 delsen, til at skelne mellem cyclosporiner og metaboliter deraf, som udviser en sådan omdannelse.

Krydsreaktion med metaboliter, fx som beskrevet ovenfor, er fortrinsvis ca. 5% eller mindre, snarere ca. 3% eller mindre, oftest ca. 2% eller mindre, af reaktionen med den 25 ikke-metaboliserede cyclosporin, fx målt ved RIA- eller ELISA-teknik, såsom kompetitiv ELISA- teknik, hensigtsmæssigt under anvendelse af en buffer fx med pH ca. 6-8, især 7-8, og som endvidere hensigtsmæssigt indeholder en mindre mængde, fx 0,01-0,1%, især 0,01-0,05%, af et non-30 ionisk overfladeaktivt middel eller detergent såsom Tween®, fx phosphatbufret saltvand med pH 7,5 indeholdende 0,03% overfladeaktivt middel, fx Tween® 20. Monoklonale antistoffer, som fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og som er reaktive med Cyclosporin, udviser således en forskel 35 i IC50-værdi for Cyclosporin 17 sammenlignet med Cylosporin i størrelsesordenen 35 gange eller derover, når der måles DK 172037 B1 27 ved hjælp af en kompetitiv ELISA-teknik under de ovenfor anførte omstændigheder.

Monoklonale antistoffer, som fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er endvidere karakteristiske ved høj affinitet 5 for "mål-cyclosporinen", fx Cyclosporin. Foretrukne monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen har således en affinitetskonstant (ligevægtsdissociationskonstant) med hensyn til "mål-cyclosporinen", fx Cyclosporin, i størrelsesordenen 10mol pr. liter eller mindre, fortrinsvis 10mol 10 pr. liter eller mindre, fx ved normale RIA-temperaturer (ca. 4-37°C) , bestemt ved standardmetoder, fx ved den af Muller et al. i Methods in Enzymology 92. 1983, s. 589-601 beskrevne metode.

Den foreliggende opfindelse gør det endvidere muligt let at 15 opnå monoklonale antistoffer af IgG-klassen, fx subklassen IgG]^. Disse antistoffer foretrækkes i de tilfælde, hvor de er specielt egnede til anvendelse i kits til diagnostik eller assay som fx beskrevet nedenfor.

Monoklonale antistoffer som ovenfor beskrevet såvel som de 20 hybridomcellelinjer, der fremstiller dem, er hidtil ukendte, og som det fremgår af den foregående beskrivelse af deres generelle og specielle egenskaber, er de velegnede til anvendelse i kits til diagnostik- eller assay-systemer, fx til at følge blodplasmakoncentrationer af cyclo-25 sporin-lægemidler hos patienter, som er i behandling med cyclosporin. Den foreliggende opfindelse angår således: 3.1 Monoklonalt antistof, som kan skelne mellem en cyclosporin, fx en forudbestemt cyclosporin, og en metabo-lit deraf, især mindst én metabolit deraf i den men- 30 neskelige organisme, specielt mindst én større meta bolit deraf i den menneskelige organisme.

3.2 Monoklonalt antistof ifølge punkt 3.1, som kan reagere med en cyclosporin, fx en forudbestemt cyclospo- DK 172037 B1 28 rin, og som udviser relativt lav krydsreaktion med en metabolit deraf, især mindst én metabolit deraf i den menneskelige organisme, specielt mindst én større metabolit i den menneskelige organisme.

5 3.3 Monoklonalt antistof ifølge punkt 3.1 eller 3.2, hvor cyclosporinen er Cyclosporin, dihydro-[Val]2-Cyclosporin eller [Nva]2-Cyclosporin, især Cyclosporin.

3.4 Monoklonalt antistof ifølge et hvilket som helst af 10 punkterne 3.1-3.3, hvor metaboliten er en metabolit, som udviser strukturel omdannelse af a-aminosyrere-sten i l-stillingen, især ved en terminal stilling på resten i l-stillingen, fx som udviser terminal hy-droxylering af α-aminosyreresten -MeBmt- i 1-stil-15 lingen.

3.5 Monoklonalt antistof ifølge punkt 3.4, hvor cyclosporinen er Cyclosporin, og metaboliten er Cyclosporin 1, .8/ 9., 10, 1£, 17, 18 eller 23., især Cyclosporin 17 eller 18, fortrinsvis Cyclosporin 17.

20 3.6 Monoklonalt antistof ifølge et hvilket som helst af punkterne 3.2-3.5, hvor krydsreaktion med metaboliten er af størrelsesordenen ca. 5% eller mindre, fortrinsvis 3% eller mindre, især 2% eller mindre, fx som målt ved RIA- eller ELISA-teknik, fx under om-25 stændigheder som beskrevet ovenfor.

3.7 Monoklonalt antistof ifølge et hvilket som helst af punkterne 3.1-3.6, hvor affinitetskonstanten med hensyn til den (forudbestemte) cyclosporin, fx Cyclosporin, er af størrelsesordenen 10"9 mol/liter eller 30 mindre, fortrinsvis 10'10 mol/liter eller mindre, fx som målt under omstændigheder som beskrevet ovenfor.

DK 172037 B1 29 3.8 Monoklonalt antistof ifølge et hvilket som helst af punkterne 3.1-3.7 af IgG-klassen.

3.9 Monoklonalt antistof, fx ifølge et hvilket som helst af punkterne 3.1-3.8, der er opnået eller kan opnås 5 ved: a) kobling af en cyclosporin, der bærer en a-amino-syrerest, som bærer en aktiveret koblingsgruppe, fx som ovenfor beskrevet, især som ovenfor defineret under et hvilket som helst af punkterne 10 1.1-1.11, 1.14 eller 1.15 (de almene formler Ila,

Ilb, Ile eller Ild), til en bærer for at opnå et immunogent konjugat; b) indgift af det immunogene konjugat til en egnet dyreart for at udvirke stimulering med immunogen, 15 og isolering af antistof-producerende celler, som er sensibiliserede over for konjugatet; c) udødeliggørelse af disse antistof-producerende celler, fx ved fusion med en passende myelom-cellelinje; og 20 d) isolering af monoklonalt antistof fra en selek teret, udødeliggjort cellelinje, fx hybridom-cellelinje, som således er etableret.

3.10 Monoklonalt antistof, fx ifølge et hvilket som helst af punkterne 3.1-3.8, der er opnået eller kan opnås 25 ved: a) isolering af antistof-producerende celler, som er sensibiliseret over for et immunogent konjugat ifølge et hvilket som helst af punkterne 2.1-2.3 ovenfor; DK 172037 B1 30 b) udødeliggørelse af de antistof-producerende celler, fx ved fusion med en passende myelomcelle-linje; og c) isolering af det ønskede monoklonale antistof fra 5 en selekteret, udødeliggjort cellelinje, fx hybridomcellelinje, som således er etableret.

4.1 Hybridomcellelinje, som danner et monoklonalt antistof ifølge et hvilket som helst af punkterne 3.1-3.8 ovenfor.

10 4.2 Hybridomcellelinje opnået eller opnåelig ifølge trin a) til c) i 3.9 ovenfor eller trin a) og b) i 3.10 ovenfor.

Det fremgår, at monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan skelne mellem en hvilken som helst cyclosporin, fx 15 Cyclosporin, og et flertal af dens metaboliter, idet de fx udviser lav krydsreaktion med hensyn til mere end én af dens metaboliter.

Opfindelsen angår endvidere: vii) Fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt 20 antistof som defineret under et hvilket som helst af punkterne 3.1-3.8 ovenfor, hvilken fremgangsmåde omfatter dyrkning af en hybridomcellelinje, som producerer et sådant antistof, og opnåelse af det således producerede antistof; og 25 viii) fremgangsmåde til fremstilling af en hybridomcellelinje, som producerer et monoklonalt antistof som defineret under et hvilket som helst af punkterne 3.1-3.8 ovenfor, hvilken fremgangsmåde omfatter udødeliggørelse af en antistof-producerende celle, 30 fx milt- eller lymfeknudecelle, som producerer et DK 172037 B1 31 sådant antistof, fx ved fusion med en passende myelomcellelinj e.

De ovenfor anførte fremgangsmådetrin kan udføres ifølge standardteknikker, fx som ovenfor beskrevet, eller som 5 beskrevet i nedenstående eksempler, idet de foretrukne myelomcellelinjer til anvendelse i fremgangsmådetrin viii) er en muse-(Balb/C)-myelomcellelinje.

Det har nu endvidere overraskende vist sig, at cyclospori-ner med en -(D)Lys- rest i 8-stillingen, dvs. som defineret 10 under 1.14 eller 1.15 (den almene formel Id) ovenfor, såvel som derivater, hvor N-e-atomet er yderligere omdannet, fx udviser cellebindende egenskaber, som på en overraskende og bemærkelsesværdig måde minder om egenskaberne hos den tilsvarende "forældre"-cyclosporin (fx den tilsvarende cyclo-15 sporin med -(D)Ala- i 8-stillingen). Dette fund har speciel betydning, eftersom N-c-nitrogenatomet i -(D) Lys- giver en ideel stilling, hvori mærkning kan udføres, fx hvori markør- eller tracergrupper kan indføres. Sådanne mærkede cyclosporiner giver endnu et centralt værktøj til under-20 søgelse af virkningsmekanismen af "forældre"-cyclosporiner (fx i tilfældet med [(D)Lys]8-Cyclosporin af Cyclosporin) og/eller til identifikation af bindingssteder i "forældre"- cyclosporinen, fx i in vitro vævskultur-præparationer.

125

Radioaktivt mærkede derivater, fx I-mærkede derivater, 25 er således nyttige til hurtig autoradiografi af væv, fx som i nyre-mikroautoradiografi.

Mærkede derivater, fx mærket med radioaktivitet eller fluorescens, som er opnået fra cyclosporiner med en -(D)Lysrest i 8-stillingen, giver desuden ideelle bestanddele til 30 anvendelse fx i RIA- og FIA- diagnostiske kits. ((D)Lys]®-Cyclosporiner giver således et middel til let opnåelse af mærkede analoger til "forældre"-cyclosporinen med ækvivalente bindingsegenskaber, fx med hensyn til monoklonale antistoffer mod "forældre"-cyclosporinen, fx som opnået 35 ifølge opfindelsen eller som beskrevet ovenfor, og er så- DK 172037 B1 32 ledes yderst anvendelige som bestanddele eller cobestand-dele i kits til diagnostik eller assay.

Der tilvejebringes således endvidere: 5.1 Mærket derivat af en cyclosporin, hvor resten i 8- 5 stillingen er -(D) Lys-; især 5.2 mærket derivat af en cyclosporin med den almene formel Id som defineret ovenfor.

Ved udtrykket "mærket derivat", som anvendes her, skal forstås et derivat, som bærer et atom eller en gruppe med en 10 tracer eller en markør, hvilket fx muliggør eller letter kvantitativ bestemmelse eller lokalisering af det nævnte derivat. Sådanne derivater omfatter derivater, hvor fx ét eller flere atomer i -(D)Lys-resten fungerer som tracer-eller markøratom, fx et radioaktivt atom, såvel som der-15 ivater, hvor en tracer- eller markørgruppe er bundet til N-é-atomet i -(D)Lys-resten, enten ved direkte binding af tracer- eller markørgruppen til N-t-atomet eller ved binding af tracer- eller markørgruppen til Ν-ί-atomet via et mellemliggende forbindelsesled. Eksempler på mærkede der-20 ivater omfatter radioaktivt mærkede derivater, fluorescerende eller kemiluminiscerende derivater samt derivater, som er egnede til fotoaffinitetsmærkning, dvs. som er forsynet med en substituent, der kan reagere med et protein, hvortil cyclosporinen bindes, ved belysning. De omtalte 25 radioaktivt mærkede derivater omfatter derivater, hvori N- e-atomet i -(D)Lys-resten i 8-stillingen binder til fx en 125 I-mærket p-OH-phenylpropionylrest. De nævnte fluorescerende og kemiluminiscerende derivater omfatter derivater, hvor N-e-atomet i -(D)Lys-resten i 8-stillingen binder til 30 en fluorescerende gruppe såsom en dansyl- eller rhodamin-gruppe eller en kemiluminiscerende gruppe såsom en acridi-niumestergruppe, fx som beskrevet i Clin. Chem. 29. 8, 1983, s. 1474-1479. En speciel gruppe cyclosporiner som defineret under 5.1 og 5.2 ovenfor er således DK 172037 B1 33

5.3 cyclosporiner, hvor resten i 8-stillingen er en rest med den almene formel D

NH-Q

(<L2)4 D

-NH-CH-CO- 5 hvor Q er eller omfatter en tracer- eller markørgruppe, især en radioaktivt mærket, fluorescerende eller kemilumi-niscerende gruppe, fx som nærmere beskrevet ovenfor.

Mærkede derivater kan fremstilles analogt med fremgangs-10 mådetrin iv) og v) ovenfor, fx under anvendelse af udgangsmaterialer, hvor -(D) Lys-resten i 8-stillingen i forvejen er mærket. Alternativt kan de fremstilles ved indførelse af en passende mærkende substituent, fx ved N-e-atomet i -(D)Lys-resten i 8-stillingen. Fluorescensmærkede derivater 15 kan således fremstilles ved kobling af en fluorescerende del til N-e-atomet, fx ved N-e-dansylering. På tilsvarende måde kan radioaktivt mærkede derivater fremstilles ved kob- 125 ling af en radioaktivt mærket substituent, fx I-mærket p-OH-phenylpropionyl, til N-e-atomet. I sidstnævnte til- 20 fælde kan substituenten enten være i mærket form forud for indførelse, eller den kan mærkes efter indførelsen. Fx kan N-e-atomet i lysinresten i 8-stillingen enten omsættes 125 direkte med I-mærket p-OH-phenylpropionsyre eller med umærket p-OH-phenylpropionsyre, og det opnåede N-e-amid kan 125 25 herefter mærkes med I i p-OH-phenyIdelen. Kobling kan udføres ifølge kendte standardteknikker, fx ved omsætning med p-OH-phenylpropionsyre (mærket eller umærket) i form af dens N-hydroxysuccinimidester.

125 I-Mærket p-OH-phenylpropionsyre kan fremstilles ved 30 chloramin T-metoden (Hunter og Greenwood, Nature 194. 1962, s. 495). Hvis mærkning udføres efter kobling, kan den udfø- DK 172037 B1 34 res under anvendelse af chloramin T-metoden eller iodogen- metoden (Good, >L_ Clin.-Chem. Clin. Biochem. 19. 1981, s.

1051). Derivater af cyclosporinerne ifølge opfindelsen, som er modtagelige for mærkning, fx som ovenfor beskrevet, fx 5 derivater, hvor N-e-atomet i -(D)Lys- i 8-stillingen er substitueret med en gruppe såsom p-OH-phenylpropionyl, som 125 er modtagelig for lodering, er umiddelbare precursorer for de mærkede derivater ifølge opfindelsen og er også hidtil ukendte.

10 Yderligere specifikke udførelsesformer ifølge den foreliggende opfindelse er: 2.4 Immunogent konjugat, som omfatter en bærer koblet til en cyclosporin med en aktiveret koblingsgruppe som defineret ovenfor under et hvilket som helst af 15 punkterne 1.8-1.11, 1.14 eller 1.15 (de almene form ler Ilb og Ild).

3.11 Monoklonalt antistof ifølge 3.9 ovenfor karakteriseret ved, at den i trin a) anvendte cyclosporin er en cyclosporin som defineret under punkt 2.4 ovenfor.

20 3.12 Monoklonalt antistof, som kan reagere med en cyclo sporin (herunder polyklonalt antiserum indeholdende antistoffer, som kan reagere med en cyclosporin), og som er dannet som svar på et immunogent konjugat som defineret ovenfor under et hvilket som helst af punk-25 terne 2.4-2.6.

3.13 Monoklonalt antistof ifølge punkt 3.12, som kan reagere med Cyclosporin, dihydro-[Val]2-Cyclosporin eller [Nva]2-Cyclosporin, især Cyclosporin.

Immunogene konjugater som defineret under punkt 2.4 kan 30 fremstilles ifølge metoderne i fremgangsmådetrin vi) oven for.

DK 172037 B1 35

Som tidligere anført er de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen alle af speciel betydning som komponenter i kits til diagnostik eller assay, fx immunoassay-kits.

Den foreliggende opfindelse angår således endvidere: 5 7. Immunoassay-kit eller -system, fx RIA- eller FIA-kit eller -system, til cyclosporin-bestemmelse, fx til bestemmelse af en cyclosporin, fx Cyclosporin, hos patienter, som er i behandling med cyclosporin, fx Cyclosporin, således at det nævnte kit eller system 10 omfatter: A) Monoklonalt antistof eller antiserum som defineret ovenfor under et hvilket som helst af punkterne 3.1-3.13, især et monoklonalt antistof som defineret ovenfor under et hvilket som helst 15 af punkterne 3.1-3.11, som bestanddel i det nævnte kit eller system.

Kits som defineret under punkt 7 er nyttige til diagnostiske formål, fx til bestemmelse af cyclosporinmængder i blod, blodplasma eller urin, fx som middel til at etablere 20 et passende doseringssystem til patienter, som er i cyclo-sporinbehandling. Sådanne kits giver et middel til at bestemme cyclosporiner, fx Cyclosporin, med hidtil ukendt sensitivitet.

Kits, fx RIA- eller FIA-kits, ifølge opfindelsen kan være 25 af helt sædvanlig type til anvendelse ifølge sædvanlige RIA- og FIA-assay-teknikker. RIA-Kits omfatter således hensigtsmæssigt foruden antistof, fx A) ovenfor, B) et passende mærket cyclosporinderivat, fx som defineret under et hvilket som helst af punkterne 5.1-5.3 ovenfor, og C) 30 cyclosporinstandard. Det mærkede cyclosporinderivat er komplementært til den cyclosporin, der skal bestemmes. Der anvendes fortrinsvis et mærket derivat af [(D)Lys]®-Cyclospo- DK 172037 B1 36 rin, hvis Cyclosporin skal bestemmes. Det kan imidlertid også være en anden mærket, komplementær cyclosporin, fx tritieret Cyclosporin, hvis Cyclosporin skal bestemmes. Cyclosporinstandarden C) vil sædvanligvis være en opløsning 5 eller lignende, som indeholder en kendt mængde af den cyclosporin, der skal bestemmes.

Ved anvendelsen opløses det fx frysetørrede antistof og inkuberes sammen med fx komponent B) samt enten med den prøve, der skal bestemmes, eller komponent C). Inkubation 10 udføres fortrinsvis under afkøling, fx ved 4°C. pH i inkubationsblandingen holdes fortrinsvis i området ca. 5-8, fx pH ca. 7-8, fortrinsvis ved hjælp af et buffersystem såsom citrat- eller trisbuffer.

Det er hensigtsmæssigt, at inkubationen varer mindst 2 15 timer, fx fra ca. 6 til ca. 12 timer. Efter inkubation separeres fraktionen med fx komponent B) bundet til antistoffet fra den ubundne fraktion, fx ved brug af trækul såsom dextran-overtrukket trækul. Den ubundne fraktion adsorberes til trækullet og kan dernæst separeres ved fil-20 trering eller ved centrifugering. Mængden af radioaktivitet i én fraktion måles dernæst ved hjælp af standardteknikker, fx ved væske-scintillationstælling efter tilsætning af et sekundært opløst produkt. Den mængde af komponent B), der er bundet til antistoffet, er omvendt proportional med 25 mængden af cyclosporin i den ukendte plasmaprøve. Til kvantitativ analyse fremstilles sædvanligvis en standard-kalibrerings -kurve ved at analysere opløsninger, som indeholder kendte koncentrationer af cyclosporinen.

FIA-Kits ifølge opfindelsen kan fx være af den type, hvor 30 antistoffer bindes til en lys-scavenger, og som bygger på konkurrence mellem en fluorescerende cyclosporin (fx et derivat ifølge opfindelsen, som er mærket med fluorescens) og antistoffet.

DK 172037 B1 37

Alternativt kan assay-kits/systemer som defineret ovenfor under punkt 7 være baseret på en hvilken som helst af de sædvanlige ELISA-systemer i den kendte teknik.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler.

5 EKSEMPEL 1

Fremstilling af [(D)Lys]®-Cyclosporin a) En opløsning af 6,4 g H-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBzl-maleinat i CH2C12 (200 ml) og H20 (100 ml) justeres til pH 8 under anvendelse af fast K2C03· Efter ekstraktion 2 gange, hver 10 gang med CH2C12 (200 ml), tørres den organiske fase over Na2S04, filtreres og inddampes til tørhed, hvilket giver fri H-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBzl som en krystallinsk remanens.

b) (N-€-B0C)-FMOC-(D)Lys (6,25 g) opløses i CHC13 (100 ml), og N-methylmorpholin (2,95 g) tilsættes under omrøring.

15 Efter afkøling af opløsningen til -20°C tilsættes piva-loylchlorid (1,75 g) dråbevis, og reaktionsblandingen omrøres i 6 timer ved -20°C. En opløsning af H-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBzl (6,34 g) i CHCI3 (20 ml) sættes dråbevis til anhydridopløsningen og omrøres i 17 timer ved -20°C for at 20 fuldende reaktionen. Efter fortynding af CHC13-opløsningen med yderligere CHCI3 (200 ml) rystes blandingen med en mættet NaHCC^-opløsning (100 ml). Den organiske fase tørres over Na2S04 og filtreres, og opløsningsmidlet afdampes til tørhed.

25 Den vundne olieagtige remanens oprenses chromatografisk under anvendelse af 25 gange mængden af silicagel (partikelstørrelse 0,063-0,20 mm) og methylenchlorid med yderli- 20 gere 3% methanol som elueringsmiddel: [<*] q = -114,2° (c = 1,0 i CHCI3).

DK 172037 B1 38 c) (N-c-BOC) -FMOC- (D)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBzl (8,8 g) opløst i absolut ethanol (400 ml) hydrogeneres med 10%'s palladium/C-katalysator (0,6 g) i en Gastar-hydrogenator, indtil den teoretiske H2-mængde er optaget (214 ml). Efter 5 afdampning af opløsningsmidlet oprenses remanensen chroma- tografisk under anvendelse af 50 gange mængden af silicagel (0,063-0,20 mm) og methylenchlorid plus 7% methanol som o n elueringsmiddel: [a] q = -129,1° (c = 1,0 i CHCI3).

d) (N-é-BOC)-FMOC-(D)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-OH (7,1 g) og 10 H-MeBmt-aAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl (7,4 g) opløses i methylenchlorid (100 ml), og N-methylmorpholin (1,72 g) og

Castro- reagens (Bt-OP(NMe2)3PF5) (5,6 g) tilsættes ved omgivelsestemperatur (25°C). Reaktionsblandingen omrøres 3 dage ved omgivelsestemperatur, hvorefter opløsningen for- 15 tyndes med methylenchlorid (200 ml) og rystes med mættet

NaHC03-opløsning (100 ml). Den organiske fase tørres over

Na2S04, filtreres og inddampes til tørhed. Den vundne olieagtige remanens oprenses chromatografisk på silicagel (500 g) (0,06-0,20 mm) under anvendelse af methylenchlorid 20 20 plus 3% methanol som elueringsmiddel: [<*] ^ = -143,8° (c = 1,0 i CHCI3).

e) (N-e-BOC) -FMOC- (D) Lys - MeLeu - MeLeu - MeVal - MeBmt - aAbu - Sar -MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl (5,54 g) omrøres i 4 timer ved omgivelsestemperatur i en opløsning af methylenchlorid 25 (50 ml) og piperidin (10 ml). Opløsningsmidlet afdampes, og den vundne olie chromatograferes på Sephadex® LH20 (300 g) under anvendelse af methylenchlorid plus 3% methanol som o fi elueringsmiddel: M d = -165,2° (c = 1,0 i CHCI3).

f) 0,2N NaOH (24 ml) sættes til (N-t-BOC)-H-(D)Lys-MeLeu-30 MeLeu- MeVal-MeBmt-aAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl (6,48 g), som er opløst i ethanol (75 ml). Efter 7 timer justeres opløsningen til pH 4 ved dråbevis tilsætning af 2N HC1 under afkøling. Efter afdampning af opløsningsmidlet rystes den vundne remanens med CH2C12 (200 ml) og mættet 35 NaHC03-opløsning (200 ml). Efter to ganges ekstraktion af DK 172037 Bl 39 den vandige fase, hver gang under anvendelse af methylen-chlorid (200 ml), tørres den organiske fase over Na2SC>4, filtreres og inddampes. Produktet oprenses chromatografisk på silicagel (300 g) (0,06-0,20 mm) under anvendelse af 5 methylenchlorid plus 20% methanol som elueringsmiddel: [a]2D = -169,9° (C = 1,0 i CHCI3) .

g) [Fremgangsmådetrin v) ]

Dimethylaminopyridin (147 mg) sættes under omrøring til (N- e-BOC)- H- (D) Lys - MeLeu - MeLeu - MeVal - MeBmt - aAbu - Sar - MeLeu - 10 Val-MeLeu- Ala-OH (413 mg) opløst i methylenchlorid (2000 ml). Propanphosphonsyreanhydrid [(0,19 g) 50%'s opløsning i CH2CI2] tilsættes, og reaktionsblandingen omrøres i 24 timer ved 25°C. Den vundne opløsning vaskes med mættet

NaHC03- opløsning (200 ml), den organiske fase tørres over 15 NaS04, filtreres, inddampes og oprenses chromatografisk på silicagel (300 g) (0,062-0,20 mm) under anvendelse af methylenchlorid plus 5% methanol som elueringsmiddel: 20 [o] d * -198,3° (c = 1,0 i CHCI3) .

h) [Fremgangsmådetrin iv) ]

20 [ (N-e-BOC)-(D)Lys]8-Cyclosporin (842 mg) afkøles til -20°C

med trifluoreddikesyre (25 ml) og omrøres sammen i 4 timer ved -20°C. Reaktionsopløsningen blandes med is og mættet K2CO3 (10 ml) og ekstraheres tre gange med methylenchlorid (200 ml) . Den organiske fase tørres over Na2SC>4 og filtre-25 res og opløsningsmidlet afdampes. Det vundne råprodukt chromatograferes på Sephadex® LH20 (200 g) under anvendelse af methylenchlorid plus 1% methanol som elueringsmiddel, hvilket giver titelforbindelsen [(D)Lys]8-Cyclosporin: [a]2D = -204,3° (C = 1,0 i CHCI3) .

30 Den dannede forbindelse kan også omdannes til saltform ifølge standardteknikker. Typiske salte omfatter [(D) Lys]8- . 20

Cyclosporin-hydrochlond: [a] p = -203° (c = 1,0 i CHCI3) , DK 172037 B1 40 ft ΟΛ og [ (D)Lys]8-Cyclosporin- trifluoracetat: [a] □ = -203° (c = 1,0 i CHC13).

EKSEMPEL 2

Fremstilling af [ (N-e-hydroxysuccinyl)-(D)Lys]8-Cyclosporin 5 [fremgangsmådetrin iii)] 255 mg [(D)Lys]8-Cyclosporin fremstillet ifølge eksempel 1 opløses i 20 ml pyridin, og 36 mg ravsyreanhydrid tilsæt tes. Den vundne opløsning omrøres i ca. 14 timer ved omgivelsestemperatur, og pyridinet afdampes fuldstændigt 10 under vakuum ved maksimalt 40°C. Den vundne olieagtige remanens chromatograferes på 55 g Sephadex® LH20 under anvendelse af methylenchlorid plus 2% methanol og opsamles i 10 ml's fraktioner. Den rene titelforbindelse fås i fraktionerne 15-23.

15 NMR-Spektroskopi viser succinylprotoner ved 2,50 og 2,70 ppm (brede signaler) og et signal for -CH2-NH-COCH2CH2COOH ved 3,25 ppm.

EKSEMPEL 3

Fremstilling af [(O-hydroxysuccinyl)-Thr]2-Cyclosporin 20 [fremgangsmådetrin iii)] 6,05 g [Thr]2-cyclosporin opløses i 20 ml pyridin, og 3,66 g 4-dimethylaminopyridin og 1,5 g ravsyreanhydrid tilsættes ved 75°C. Reaktionsblandingen omrøres i 4 timer ved 75°C og fortyndes derefter med 500 ml CH2CI2, vaskes 25 fem gange, hver gang med 50 ml 2N HC1, og én gang med 150 ml H2O. Den organiske fase ekstraheres, tørres over Na2S04 og inddampes og oprenses chromatografisk under anvendelse af 250 g silicagel (0,040-0,062 mm) med eddikesyre som elueringsmiddel.

DK 172037 B1 41 EKSEMPEL 4

Fremstilling af [(N-f-succinimidooxysuccinyl)-(D)Lys]8-Cyclosporin [fremgangsmådetrin i)) 50 mg [(N-e-hydroxysuccinyl)-(D)Lys]8-Cyclosporin frem-5 stillet ifølge eksempel 2, 14 mg N-ethyl-N'-(dimethylamino-propyl)carbodiimid-HCl, 23,8 mg N-hydroxysuccinimid og 24,6 mg triethylamin omrøres i 2 timer ved omgivelsestemperatur i 2 ml methylenchlorid, hvilket giver en klar, farveløs opløsning. Den vundne opløsning fortyndes med 10 50 ml methylenchlorid, og 10 ml H20 og IN HCl tilsættes dråbevis, indtil pH er 6. Der fremkommer en tofaset blanding, og denne rystes grundigt mellem hver tilsætning af HCl. Den organiske fase rystes endelig med 10 ml fortyndet NaHC03-opløsning og tørres over Na2S04 og filtreres, og 15 opløsningsmidlet afdampes, hvorved titelforbindelsen vin des.

NMR-Spektret viser succinylprotoner ved 2,50 og 2,75 ppm (J = 5Hz) og N-succinimidoprotoner ved 2,18 og 2,19 ppm (2S). Resten i 8-stillingen har følgende struktur: 20 -CO C0-CH2 (D) \h-(CH2)4-NH-CO-(CH2)2-COON^ I -NH^ \o-CH2 EKSEMPEL 5

Fremstilling af [(0-succinimidooxysuccinyl)-Thr]2-Cyclo-sporin [fremgangsmådetrin i)] 25 54 mg triethylamin, 98 mg N-hydroxysuccinimid og 102 mg N- ethyl-N#-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid sættes til en DK 172037 B1 42 opløsning af 200 mg [(O-hydroxysuccinyl)-Thr]2-Cyclosporin, fremstillet ifølge eksempel 3, i 10 ml methylenchlorid, idet tilsætningen udføres ved 20°C under streng udelukkelse af fugt. Reaktionsblandingen omrøres i 6 timer ved omgivel-5 sestemperatur, fortyndes med 200 ml methylenchlorid og rystes med 50 ml H20. Den vandige fase justeres til pH 5-6 ved dråbevis tilsætning af IN HC1 og rystes. Den vandige fase ekstraheres med 100 ml methylenchlorid, og de organiske faser vaskes med 0,1N NaHC(>3, tørres over Na2S04, filtreres 10 og inddampes. Remanensen oprenses chromatografisk under anvendelse af 110 g silicagel med ethylacetat som elue-ringsmiddel, hvilket giver titelforbindelsen: [«] D = -178° (c = 1,0 i CHCI3) . ^-H-NMR i CDCI3 viser succinimido-protoner ved 2,80 som en singlet og succinylprotoner ved 15 2,60 ppm som en multiplet. Resten i 2-stillingen har føl gende struktur: -CO^ /C0-CH2 ^CH-CH(CH3)-0-CH2-CH2-C00N I -NH \o-CH2 EKSEMPEL 6 20 Fremstilling af [(N-(3-(2-pyridyl)dithio)propion-l-yl)- (D)Lys]8-Cyclosporin [fremgangsmådetrin ii)] 35 mg succinyl-3-[(2-pyridyl)dithio]propionat sættes til en opløsning af 126 mg [(D)Lys]8-Cyclosporin i 10 ml methylenchlorid ved 20°C og under streng udelukkelse af fugt. Reak-25 tionsblandingen omrøres i 6 timer ved omgivelsestemperatur, fortyndes med 200 ml methylenchlorid og rystes med 50 ml mættet NaHC03. Den vandige fase ekstraheres med 150 ml methylenchlorid, de organiske faser vaskes med H20, tørres over Na2SC>4, filtreres og inddampes. Den amorfe remanens 30 oprenses chromatografisk under anvendelse af 100 g silicagel med methylenchlorid/methanol (95:5) som elueringsmid- DK 172037 B1 43 20 del, hvilket giver den rene titel forbindelse: [a] p * -165“ (c = 1,0 i CHC13).

Resten i 8-stillingen har formlen "C°\ N-\ (D^CH-iCHaU-NH-CO-C^-CHa-S-s/ \ -NH \=y 5 EKSEMPEL 7

Fremstilling af immunogene cyclosporin-bærer-konjugater som defineret ovenfor under punkt 2.1 [fremgangsmådetrin vi)] 7.1 Konjugat med γ-globulin fra høns 10 10 mg [(N-€-succinimidooxysuccinyl)-(D)Lys]8-Cyclosporin, fremstillet ved fremgangsmåden ifølge eksempel 4, i 0,2 ml dimethylformamid sættes til 100 mg hønse-7-globulin i 4 ml NaHC03 (1,5% w/v, pH 8,1). Reaktionsblandingen omrøres i ca. 2 timer ved omgivelsestemperatur, og det vundne konju-15 gat oprenses ved dialyse over for phosphatbufret saltvand.

7.2 Konjugat med hønse-ovalbumin 10,7 mg [(O-succinimidooxysuccinyl)-Thr]2-Cyclosporin, fremstillet ifølge eksempel 5 og yderligere indeholdende 10% ditritieret materiale (1-2 μα/mq - opnået analogt med 20 eksempel 5, men under anvendelse af tritieret [Thr]^Cyclosporin som udgangsmateriale) i 100 μΐ dimethylformamid sættes under kraftig omrøring til 30,45 mg hønse-ovalbumin i 2 ml l,5%#s NaHC03-buffer (molært overskud cyclosporin/-ovalbumin = 10,68). Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer 25 ved omgivelsestemperatur, og det vundne konjugat oprenses ved dialyse tre gange mod phosphatbufret saltvand i 18 timer ved 4“C. I det fremstillede konjugat findes 55,7% af DK 172037 B1 44 den tilførte radioaktivitet at være bundet til ovalbumin, hvilket viser et bindingsforhold for cyclosporin/ovalbumin på 5,95.

Covalent binding af cyclosporin til ovalbumin blev bedømt 5 ved acetoneudfældning af 3 konjugat-alikvoter. 39,5% af radioaktiviteten svarende til ikke-covalent bundet cyclosporin findes i acetonesupernatanten, hvilket giver et endeligt covalent koblingsforhold for cyclosporin/ovalbumin på 3,6. Det vundne konjugat blev alikvoteret og opbevaret 10 ved -20°C.

Lignende konjugater kan fremstilles analogt med eksemplerne 7.1 og 7.2 ovenfor, men under anvendelse af produktet ifølge eksempel 6 som cyclosporinudgangsmateriale.

EKSEMPEL 8 15 Fremstilling af hybridomcellelinjer, som danner monoklonale antistoffer, der reagerer med Cyclosporin [fremgangsmåde-trin viii)] 8.1 Anvendelse af konjugatet ifølge eksempel 7.1 a) Immunisering 20 Balb/C-hunmus (20-25 g) injiceres intraperitonealt med 100 μg immunogent konjugat ifølge eksempel 7.1 i 0,2 ml Freund's komplette adjuvans. Efter 2 uger indgives ved intraperitoneal injektion endnu en booster-injektion indeholdende 50 μg af produktet ifølge eksempel 7.1 emulgeret i 25 0,2 ml Freund's komplette adjuvans. Forekomsten af anti stoffer, som kan reagere med Cyclosporin, i serum fra de behandlede mus påvises ved almindelig RIA-metode under anvendelse af tritiummærket Cyclosporin som tracer.

DK 172037 B1 45 b) Hybridomdannelse

Mus ifølge trin a), som udviser de højeste antistof-titre mod Cyclosporin, indgives intravenøst en booster-injektion indeholdende 20 μg af produktet ifølge eksempel 3.2 i 5 saltvand (0,85% w/v). Musene aflives på fjerdedagen, og miltceller isoleres og fusioneres med muse(Balb/C)-myelom-celler ved de af S. Fazekas et al., i. Immunol. Methods 35. 1980, s. 1-21, beskrevne metode.

Voksende hybridomer screenes for dannelse af antistoffer, 10 som kan reagere med Cyclosporin, ved almindelig RIA-teknik under anvendelse af tritiummærket Cyclosporin som tracer, hvilke antistoffer endvidere har lav krydsreaktion med Cyclosporin 17, atter under anvendelse af almindelig RIA-teknik med tritiummærket Cyclosporin som tracer og Cyclo-15 sporin 17 som kompetitiv ligand.

Én udvalgt hybridomcellelinje findes at danne et monoklo-nalt antistof, som kan reagere med Cyclosporin, og som har lav krydsreaktion med Cyclosporin 17. Antistoffet karakteriseres som tilhørende IgG-klassen, subklassen IgGi- Den 20 opnåede ICgg-værdi for reaktion med Cyclosporin i RIA er 6,7 ng/ml, sammenlignet med 280 ng/ml for Cyclosporin 17. Krydsreaktion med Cyclosporin 12 er således kun af størrelsesordenen 2%. Den målte affinitetskonstant for Cyclosporin er af størrelsesordenen 10"^ mol/liter.

25 Det ses, at ved anvendelse af metoderne ifølge opfindelsen, især anvendelse af cyclosporiner med en aktiveret koblings-gruppe, fx som defineret under et hvilket som helst af punkterne l.l-l.ll, 1.14 eller 1.15 (de almene formler Ila, Ilb, Ile eller Ild) til fremstilling af immunogene konjuga-30 ter, og idet der fx gås frem på tilsvarende måde som i dette eksempels generelle metoder, kan der let fremstilles hybridomcellelinjer/monoklonale antistoffer, som, skønt de ikke er identiske med dette eksempels hybridomcellelinje/-monoklonale antistof, vil opfylde de samme væsentlige kri- DK 172037 B1 46 terier, fx have tilsvarende eller endog forbedrede egenskaber i forhold til dem, der er beskrevet ovenfor. Dette vil fremgå af de resultater, der belyses i det følgende eksempel.

5 8.2 Anvendelse af konjugatet ifølge eksempel 7.2 a) Immunisering

Mus (Balb/C) indgives hver 100 μg af det immunogene konju-gat ifølge eksempel 7.2 i 200 μΐ phosphatbufret saltvand/-Freund's adjuvans (1:1). Den første indgift (Freund's 10 komplette adjuvans) gives subcutant i bagbenets trædepude, nær halen og nær halsen. Efter 3 uger indgives (med Freund's ufuldstændige adjuvans) anden og tredje injektion henholdsvis subcutant på ryggen og intramuskulært på bagbenene. Blodprøver tages 1 uge efter både anden og tredje 15 indgift.

Mus udvælges til videre anvendelse på basis af følgende kriterier for de undersøgte antisera: 1. Titer i væskefase-RIA og i ELISA; 2. synlige isotype-fordeling (IgGi alene eller ^S^i+2a+2b 20 i ELISA) ; 3. relativ aviditet i ELISA; 4. evne til at skelne mellem Cyclosporin og Cyclosporin 17 og Cyclosporin 18 i kompetitivt ELISA.

Udvalgte mus indgives booster-injektioner dag -3, -2 og -1 25 forud for fusion under anvendelse af 100 μg af det immunogene konjugat ifølge eksempel 7.2 i 200 μΐ 9%'s NaCl ved intraperitoneal injektion (50%) og intravenøs injektion (50%) på dag -3 og ved intraperitoneal injektion (100%) på dag -2 og -1.

DK 172037 B1 47 b) Hybridomdannelse 2,5 x 10"7 eller 5 x 10"7 miltceller fra hver mus fusioneres med 5 x 10'7 muse(Balb/C)-myelomceller under anvendelse af PEG 4000 og fordeles i 24 x 24 brønde.

5 Kultursupernatanter screenes i ELISA for tilstedeværelse af antistoffer, som kan genkende [Thr]2-Cyclosporin koblet til bovint serumalbumin (fremstillet analogt med eksempel 7.2) og/eller [(D)Lys]®-Cyclosporin koblet til bovint serumalbumin (fremstillet analogt med eksempel 7.1) fremfor frit 10 bovint serumalbumin som negativ kontrol. Udvalgte IgG-pro-ducerende hybridomcellelinjer klones for at sikre, at cellerne er monoklonale.

Evnen hos monoklonale antistoffer, som er dannet af de vundne hybridomcellelinjer, til at skelne mellem a) Cyclo-15 sporin og b) Cyclosporin 17 og Cyclosporin 18 testes i en kompetitiv type af indirekte ELISA, jfr. Quesniaux et al.. Immunology Letters £, 1985, s. 99-104, med forskellige buffersystemer omfattende: phosphatbufret saltvand med pH

7,5, med eller uden 0,03% Tween® 20, og Tris med pH 7,5, 20 med 0,03% Tween® og uden NaCl. Optimale betingelser for denne skelnen ses sædvanligvis i phosphatbufret saltvand med pH 7,5, med 140 mM NaCl og 0,03% Tween® 20. Ud af ni undersøgte kloner producerer 7 monoklonale antistoffer, som kan skelne mellem a) Cyclosporin og b) Cyclosporin 17 og 25 l£i. Hos 6 var IC5Q-ratio for Cyclosporin 17 sammenlignet med Cyclosporin ca. 35 gange eller mere.

DK 172037 B1 48 EKSEMPEL 9

Fremstilling af mærkede derivater af cyclosporiner som defineret under punkt 5.1 ovenfor [fremgangsmådetrin ix)] 9.1 Fremstilling af [N-e-TRITC-(D)Lys]8-Cyclosporin 5 [(D)Lys]8-Cyclosporin (15 mg) fremstillet ifølge eksempel 1 opløses i methylenchlorid (2 ml). Rhodaminisothiocyanat (TRITC) (5,3 mg) tilsættes, og reaktionsblandingen lades henstå ved -7“C i 17 timer. Den stærkt rødfarvede opløsning chromatograferes direkte på Sephadex® LH20 (20 g) med me-10 thylenchlorid og 0,5% methanol. Fraktioner å 10 ml opsam les.

Titelforbindelsen udvindes som en olie fra fraktionerne 5-7 og 10-14: UV-absorption: 300 nm/fluorescensemission: 540 nm. Resten i 8-stillingen har strukturen 15 CH3 “i 3 ΐοζΎδΓ 3

N

S - C

k !CH2)4 - NH- CH - CO - (D) DK 172037 B1 49 9.2 Fremstilling af [N-e-dansyl-(D)Lys]8-cyclosporin [(D)Lys]8-Cyclosporin (232 mg) fremstillet ifølge eksempel 1 opløses i chloroform (15 ml). Ethyldiisopropylamin (7,3 mg) og dansylchlorid (99,5 mg) tilsættes, og reak-5 tionsblandingen omrøres i 2 timer. Produktet chromatogra-feres direkte på Sephadex® LH20 (100 g) med methylenchlorid og 0,5% methanol. Fraktioner å 10 ml opsamles.

De opsamlede fraktioner inddampes, og det dannede produkt rechromatograferes under anvendelse af silicagel (0,06-0,20 10 mm) (100 g) med methylenchlorid og 5% methanol. Fraktioner å 15 ml opsamles.

20

Fraktionerne 28-44 giver det rene produkt: [a] d « -183,8° (c = 1,08 i CHC13).

1 O K

9.3 Fremstilling af °iod af [(D)Lys]8-Cyclosporin 15 Titelforbindelsen fremstilles analogt med de af Bolton og Hunter i Biochem. J. 133. 1973, s. 529 beskrevne metoder ved binding af en p-OH-phenylpropionylrest til N-«-atomet i resten i 8-stillingen i [(D)Lys]8-Cyclosporin fremstillet ifølge eksempel 1. I-mærkningen bæres i phenylringen i 20 p-OH-phenylpropionylresten C0- -(CH2)2-C°-NH-(CH2)4-CH (D) NH-

Oprensning udføres ved HPLC på en 4 x 250 søjle af RP18 med en lineær gradient og under anvendelse af 10-30% n-propa-25 nol/0,2% trifluoreddikesyre i 5% eddikesyre/0,2% trifluor- eddikesyre soro væskefase.

Claims (9)

1. Monoklonalt antistof, kendetegnet ved, at det er reaktivt med en cyclosporin og udviser lav krydsreaktivitet med mindst én 5 metabolit deraf i den menneskelige organisme, hvilket monoklonalt antistof er fremstillet som respons på et antigen, som ikke fremstilles ved omsætning af et hemisuc-cinatderivat af en cyclosporin med et proteinkonjugat under anvendelse af carbodiimidreagenser.

2. Monoklonalt antistof ifølge krav l, kendetegnet ved, at det er fremstillet som respons på et immunogent konjugat, der omfatter en bærer, som er koblet til en cyclosporinhapten ved 2- eller 8-stillingen ved hjælp af en aktiveret koblingsgruppe, hvil-15 ken aktiveret koblingsgruppe er en gruppe, som er i stand til at dirigere omsætning med en egnet co-reaktiv gruppering til at tilvejebringe en covalent binding mellem haptenen og bæreren uden behov for anvendelse af en carbo-diimidreagens for at tillade, bevirke eller fremme reak-20 tion.

3. Monoklonalt antistof ifølge krav 2, kendetegnet ved, at cyclosporinhaptenen af det immunogene konjugat omfatter [(D]Lys]8-Cyclosporin koblet til bæreren ved haptenens [(D)Lys]8-rest.

4. Monoklonalt antistof ifølge krav 2, kendetegnet ved, at cyclosporinhaptenen af det immunogene konjugat omfatter [Thr]2-Cyclosporin koblet til bæreren ved haptenens [Thr]2-rest.

5. Monoklonalt antistof ifølge et hvilket som helst af 3 0 kravene 1- 4, kendetegnet ved, at antistoffet er reaktivt med Cyclosporin og udviser en krydsreaktivitet på mindre end 5% DK 172037 B1 som målt ved ELISA-assay med mindst én af følgende metabo-litter: Cyclosporin 1, 8, 10, 16, 17, 18 eller 21.

6. Monoklonalt antistof ifølge krav 5, kendetegnet ved, at metabolitten er Cyclosporin 5 17 eller 18.

7. Monoklonalt antistof ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, hvilket antistof er opnået eller kan opnås ved: a) omsætning af en cyclosporin med en α-aminosyrerest, der 10 bærer en aktiveret koblingsgruppe, med en bærer til fremstilling af et immunogent konjugat, b) administration af det immunogene konjugat til en hensigtsmæssig dyreart til udførelse af immunogen stimulering, og isolering af antistofproducerende celler, 15 der er sensibiliseret over for konjugatet, c) udødeliggørelse af de antistofproducerende celler, og d) isolering af monoklonalt antistof fra en således etableret udvalgt udødeliggjort cellelinje.

8. Hybridomcellelinie, 20 kendetegnet ved, at den producerer et monoklonalt antistof ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7.

9. Immunoassaykit eller -system til monitorering af blodniveauer af en cyclosporin, kendetegnet ved, at det omfatter et monoklonalt 25 antistof som defineret i et hvilket som helst af kravene 1-7.