FI93965C - Monoklonaalisia vasta-aineita syklosporiineille - Google Patents
Monoklonaalisia vasta-aineita syklosporiineille Download PDFInfo
- Publication number
- FI93965C FI93965C FI862370A FI862370A FI93965C FI 93965 C FI93965 C FI 93965C FI 862370 A FI862370 A FI 862370A FI 862370 A FI862370 A FI 862370A FI 93965 C FI93965 C FI 93965C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- cyclosporin
- group
- monoclonal antibody
- cyclosporins
- residue
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
- C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
Description
93965
MONOKLONAALISIÄ VASTA-AINEITA SYKLOSPORIINEILLE -MONOKLONALA ANTIKROPPAR MOT CYCLOSPORINER
Esillä oleva keksintö koskee monoklonaalisia 5 vasta-aineita syklosporiineille, erityisesti monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat erotuskyky!siä syk-losporiinien ja niiden metaboliittien välillä ja sopivia käytettäväksi diagnostisissa/koevälineissä, samaten kuin uusia hybridoomasolulinjoja, joita käytetään mono-10 klonaalisten vasta-aineiden ja diagnostisten/koeväli-neiden valmistuksessa, joihin kuuluu monoklonaalisia vasta-aineita. Lisäksi keksintö koskee uusia syklospo-riineja ja näitä sisältäviä immunogeenisiä konjugaatte-ja, joita käytetään monoklonaalisten vasta-aineiden 15 kehittämiseksi ja jotka ovat käyttökelpoisia myös kehitettäessä tavanomaisia polyklonaalisia antiseerumeita, jotka ovat sopivia käytettäväksi dignostisissa/koeväli-neissä samaten kuin tuottamaan antiseerumeita ja vasta-aineita ja näitä sisältäviä diagnostisia/koevälinei-20 tä. Keksintö koskee lisäksi uusien syklosporiinien merkittyjä johdannaisia, jotka ovat soveliaita käytettäväksi diagnostisissa/koevälineissä, sekä samaten näitä sisältäviä diagnostisia/koevälineitä.
Syklosporiineihin kuuluu ryhmä rakenteellises-25 ti erotettavia, syklisiä, poly-N-metyloituja undekapep-tidejä, joilla on yleisesti farmakologista, erityisesti immunosupressiivista, tulehdusta vastustavaa ja antipa-rasiittista aktiivisuutta. Ensimmäinen eristetty syklo-sporiini oli luonnossa esiintyvä sienimetaboliittisyk-30 losporiini, tunnetaan myös nimellä syklosporiini A, jolla on kaava (A) pMe&nt-aA&u-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-iDjAla-MeLeu-MeLeu-MeVal— 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 (A) 35 L__ jossa MeBmt tarkoittaa N-metyyli-(4R)-4-but-2E-en-l-yy 2 93965 li-4-metyyli-(L)treonyylitähdettä, jolla on kaava (B) ch3
5 I
x y\ \h2 10 I (B)
HO (R) CH
^ch^rjN:^ -N-CH-CO- 15 I (S) ch3 20 jossa -x-y- on -CH=CH- (trans-muoto).
Syklosporiinin löytymisen jälkeen on eristetty ja tunnistettu suuri joukko luonnossa esiintyviä syklo-sporiineja, ja lisäksi monia luonnossa ei-esiintyviä syklosporiineja on valmistettu totaali- tai semisyn-25 teettisin menetelmin tai soveltaen muunnellun kasvatuksen tekniikkaa. Syklosporiinien luokka on täten nykyisin merkittävä ja siihen kuuluu esim. luonnossa esiintyvät syklosporiinit A - Z [ks. Kobel et ai. European Journal of applied Microbiology ans Biotechnology 14, 30 237 - 240 (1982) ja esitelmä Traber et ai., 24th. In- . terscience conference on Antimicrobial Agents and Che motherapy, Washington, October 8 - 10, (1984)]; sekä samaten erilaisia luonnossa ei-esiintyviä tai keinotekoisia syklosporiineja, johin kuuluu dihydro-syklospo-35 riineja (joissa -MeBmt-tähteen -x-y-ryhmä (ks. kaava B yllä) on tyydytetty, esim. kuten on kuvattu patenttijulkaisussa US 4 108 985, US 4 210 581 ja US 4 220 641, 3 93965 syklosporiineja, joissa -MeBmt-tähde on läsnä isomeeri-sessä tai N-desmetyylimuodossa [patenttijulkaisu EP 0 034 567 ja "Cyclosporin A", Proc. Internet. Conference on Cyclosporin A, Cambridge (U.K.) September 1981, Ed.
5 D.J.G. White, Elsevier Press (1982), jotka molemmat julkaisut kuvaavat R.Wenger'n kehittämää kokonaissyn-teettistä menetelmää syklosporiinien valmistamiseksi], ja syklosporiineja, joissa erilaisten aminohappojen liittyminen on tapahtunut tietyissä asemissa peptidi-10 sekvenssien sisäpuolella. Esimerkkejä yllä kuvatuissa viitejulkaisuissa esitetyistä syklosporiineista ovat esim. [Thr]2-, [Vai]2-, [Nva]2- ja [Nva]2-[Nva]5syklospo-riini (tunnetaan myös syklosporiineina C, D, G ja vast.
M) ja dihydro-(Val]2-syklosporiini (tunnetaan myös 15 syklosporiinina D).
[Yleisen käytännön mukaisesti syklosporiinien kohdalla nämä määritellään tässä patenttiselityksessä ja -vaatimuksissa viitaten syklosporiinin (so. syklo-sporiinin A) rakenteeseen. Tämä on tehty ilmoittamalla 20 ensin ne tähteet molekyylissä, jotka eroavat syklospo-riinissa olevista tähteistä ja sitten käyttäen termiä "syklosporiini" karakterisoimaan jäljellä olevia tähteitä, jotka ovat identtisiä syklosporiinissa olevien tähteiden kanssa. Samanaikaisesti etuliitettä "dihydro" . 25 käytetään tarkoitettaessa syklosporiineja, joissa -MeBmt-tähde on hydrattu (-dihydro-MeBmt-), so. jolloin -x-y- kaavassa B on -CH2-CH2~. Täten [Thr]2-syklosporiini on syklosporiini, jolla on kaavassa A esitetty sekvenssi, mutta jossa -aAbu- 2-asemassa on korvattu ryhmällä 30 -Thr-, ja dihydro[Vai]2-syklosporiini on syklosporiini, jolla on kaavassa A esitetty sekvenssi, mutta jossa « -MeBmt- 1-asemassa on hydrattu ja -aAbu- 2-asemassa on korvattu ryhmällä -Vai-.
Lisäksi aminohappotähteet, joita tarkoitetaan 35 lyhennyksellä, esim. -Ala-, -MeVal- jne., ovat yleisen käytännön mukaisesti sellaisia, joilla on (L)muoto, ellei toisin ole ilmoitettu. Tähdelyhennykset, joita 4 93965 edeltää "Me", kuten -MeLeu-, tarkoittavat N-metyloituja tähteitä. Syklosporiinimolekyylin yksittäiset tähteet on numeroitu, kuten alalla yleensä myötäpäivään ja lähtien tähteestä -MeBmt- (tai dihydro-MeBmt-) 1-asemas-5 sa. Samaa numeerista järjestelmää käytetään kaikkialla esillä olevassa patenttiselityksessä ja vaatimuksissa.] Ainutlaatuisen immunosupressiivisen aktiivisuutensa vuoksi sylkosporiinit ovat herättäneet hyvin laajaa huomiota ei ainoastaan lääketieteellisissä ja 10 akateemisissa piireissä vaan myös maallikkolehdistös-sä. Sylkosporiini itse on nykyisin kaupallisesti saatavissa ja yleisesti käytetty estämään vieraan elimen siirrosta aiheutuvaa hylkimistä, esim. sydämen-, sydänkeuhkon, munuaisen ja luuytimen siirto, samaten kuin 15 viime aikoina erilaisten autoimmuunisten ja tähän liittyvien sairauksien ja tilojen hoidossa. Sekä dihydro-[ Vai ]2-syklosporiini että [Nva]2-syklosporiini ovat intensiivisen kliinisen tutkimuksen alaisia potentiaalisina seuraajina syklosporiinille.
20 Syklosporiinien, esim. syklosporiinin annoste lu aiheuttaa kuitenkin erityisiä vaikeuksia. Koska metaboliset muuntumisnopeudet pyrkivät olemaan potilaskohtaisesti spesifisiä ja terapeuttinen väli kapea, tehokas annostelu on erittäin yksilöspesifinen ja edel-• 25 lyttää sopivien yksilöllisten seerumitasojen määrittä mistä. Syklosporiiniplasman konsentraatioiden säännöllinen tarkkailu on täten olennainen edellytys tehokkaalle hoidolle. Tätä varten on kehitetty joukko kor-keapainenestekromatografia- (HPLC), radioimmunomääri-30 tys- (RIA) ja fluori-immunomääritys- (FIA) järjestelmiä. Kuitenkin HPLC-menetelmät, jotka tosin ovat erittäin spesifisiä, ovat vaikeita ja vaivalloisia toteuttaa käytännössä, ja nykyisin kaupallisesti saatavilla oleva RIA-järjestelmä, joka perustuu lampaan polyklo-35 naaliseen antiseerumiin, on joutunut kritiikin kohteeksi sen huonon spesifisyyden johdosta. Syklosporiinien, esim. Syklosporiinin kehitys, spesifiset monoklonaali- 5 93965 set vasta-aineet, jotka ovat terapeuttisesti annosteltuina erotuskykyisiä syklosporiinien ja niiden metabo-liittien välillä ihmisessä, on siten pitkän aikaa ollut kiirellisenä käytännöllisenä samaten kuin tieteellisenä 5 päämääränä, koska niillä saavutetaan sama potentiaalinen spesifisyys kuin HPLC-menetelmillä, mutta säilytetään tavanomaisiin immunomääritysjärjestelmiin liittyvä helppokäyttöisyys. Lisäksi tällaisten syklosporiini-spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden kehittämi-10 nen toisi mukanaan vitaalisen uuden tutkimustyökalun sallien esim. syklosporiinin rakenteen ja syklosporii-nireseptorin edellytysten jne. määritysten vertailevan tutkimuksen.
Syklosporiinin löytämisen jälkeen lukuisia 15 yrityksiä on tehty monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka ovat reaktiivisia syklosporii-neihin nähden. Koska syklosporiinit, esim. Syklosporii-ni, itsessään omaavat vähän immunogeenistä aktiivisuutta, yleinen lähestyminen on täytynyt tehdä käyttäen 20 immunogeenistä, esim. hapteeniproteiini, konjugaattia, joka on saatu esim. liittämällä immunoglobuliineja hydroksiryhmän kautta, joka on läsnä ryhmässä -Th'r2-[Thr]2-syklosporiinissa, käyttäen tavanomaista liitos-tekniikkaa, esim. EDCI [N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminop-25 ropyyli)karbodi-imidi.2HC1] tai MCDI [N-sykloheksyyli-N'-[β-(N-metyyli-morfolino)etyyli]-karbodi- imidi.p.to-lueenisulfonaatti] kanssa liitosaineena. Tällaiset yritykset ovat kuitenkin epäonnistuneet, ja kun mono-klonaalisia vasta-aineita on saatu, näiden on todettu 30 omaavan suhteellisen alhaisen spesifisyyden Syklospo-riiniin tai niiden on todettu olevan spesifisiä kantajaproteiinille tai käytettylle liitosreagenssille pikemminkin kuin Syklosporiinille, tai niiden on todettu olevan aivan liian reaktiivisia muodostamaan ristisi-35 doksia liitosaineen kanssa. Missään tapauksessa ei ole osoittautunut mahdolliseksi muodostaa monoklonaalisia vasta-aineita, jotka kykenisivät omaamaan erotuskykyä 6 93965 esim. Syklosporiinin ja sen metaboliittien välillä, esim. metaboliittien syklosporiini 11_ ja syklosporiini 18 välillä, joita on kuvattu tämän jälkeen yksityiskohtaisesti. Lisäksi nämä pyrkimykset ovat johtaneet syk-5 losporiinin monoklonaalisten vasta-aineiden valmistukseen, jotka ovat vain tyyppiä IgM ja täten kaikissa tapauksissa olennaisesti sopimattomia käytettäväksi missään säännöllisessä muodossa esim. kliinisinä koevä-lineinä. Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus, 10 joilla on spesifistä reaktiivisuutta syklosporiinien kanssa ja jotka ovat erotuskykyisiä yksittäisten syklosporiinien ja niiden metaboliittien välillä, esim. Syklosporiinin ja sen ihmisessä esiintyvien metaboliittien välillä, ja sopivia käytettäväksi koejärjestelmäs-15 sä, on täten jäänyt tärkeimmäksi päämääräksi.
Keksinnölle tunnusomaisten seikkojen osalta viitataan patenttivaatimuksiin.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti, nyt on yllättäen havaittu, että syklosporiinien suhteen reak-20 tiivisia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka toteuttavat yllä esitetyt eri tavoitteet ja ovat erityisesti erotuskykyisiä syklosporiinien ja niiden metaboliittien välillä, voidaan valmistaa olennaisesti tavanomaisella immunointi/fuusio/kloonaustekniikalla käyttäen immuno-* 25 geenisiä konjugaatteja, joihin kuuluu syklosporiini hapteenina immunoinnin alkuvaiheessa, jos konjugaatti valmistetaan liittämällä kantaja syklosporiiniin aktivoidun liitosryhmän avulla, esim. jos konjugaattisyn-teesi suoritetaan käyttäen lähtöaineena syklosporiinia, 30 jossa on aktivoitu liitosryhmä. Erityisesti käytettäes-, sä tällaisia immunogeenisia konjugaatteja on mahdollis ta saada monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat käyttökelpoisia hienoerotuksessa syklosporiinien ja niiden metaboliittien välillä jopa silloin, kun metabo-35 liitit eroavat vain yksittäisten tähteiden vaihtelevien ryhmien osalta, jolloin esim. Syklosporiinin tapauksessa ovat reaktiivisia syklosporiinin kanssa ja osoitta- 7 93965 vat samanaikaisesti alhaista ristireaktiivisuutta esim. sen metaboliittien syklosporiini 17 ja/tai syklosporii-ni _18 kanssa.
Sen lisäksi, että esillä oleva keksintö mah-5 dollistaa keinon monoklonaalisten koejärjestelmien kehittämiseksi, esim. käytettäväksi kliinisesti, esillä oleva keksintö tuo esiin myös keinon syklosporiinin metaboliittien puhdistamiseksi edelleen ja, koska keksinnön mukaisia yleisiä menetelmiä käyttäen voidaan 10 mitä ilmeisemmin saada sellaisia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka voivat jäljitellä reseptoripaikkoja, potentiaalisten syklosporiinin kaltaisten molekyylien karakterisoimiseksi. Esillä olevan keksinnön merkitys käytännölliseltä ja puhtaasti tieteelliseltä kannalta 15 on täten suuri.
Kuten yllä on todettu, keksinnön toteutuksessa tarvittavat immunogeeniset konjugaatit valmistetaan suoraan liittämällä kantaja, esim. proteiinimolekyyli, syklosporiiniin aktivoidun liitosryhmän avulla. Tämä 20 voidaan toteuttaa joko aktivoidun liitosryhmän omaavan kantaja-aineen reaktiolla sopivan reaktiivisen substituent in, esim. hydroksi- tai aminoryhmän, omaavan syklosporiinin kanssa, esim. kuten [Thr]2-syklosporiinin tai [ (D)Lys]e-syklosporiinin kyseessä ollessa, jota on 25 kuvattu alla, tai kantaja-aineen reaktion avulla syklosporiinin kanssa, jossa on aktivoitu liitosryhmä, esim. syklosporiini, jossa yhdellä syklosporiiniraole-kyylissä läsnä olevista aminohappotähteistä on sivu-ketju a-hiiliatomissa, johon kuuluu tai jossa on akti-30 voitu liitosryhmä. Mainittuihin konjugaatteihin kuuluu täten syklosporiini, hapteeniryhmä, liittyneenä suoraan kantaja-yksikköön, väliintulevan liitosaineen tähteen kautta tapahtuvan liitoksen sijasta, mitä on käytetty aiemmin alalla immunogeenisten konjugaattien tapaukses-35 sa, joihin kuuluu syklosporiini hapteenina, esim. tavallisen polyklonaalisen vastaseerumin kohottamiseksi.
Termillä "aktivoitu liitosryhmä", kuten on 8 93965 käytetty tässä ja oheisissa vaatimuksissa, tarkoitetaan mitä tahansa ryhmää, joka voi reagoida suoraan sopivan reaktiivisen ryhmän kanssa, esim. amino-, hydroksi-, tio-ryhmän tai muun sellaisen, muodostaen kovalenttisen 5 sidoksen ilman tarvetta käyttää liitosainetta reaktion mahdollistamiseksi, tehostamiseksi tai edistämiseksi. Täten syklosporiinen omatessa "aktivoidun liitosryh-män", tämä voi olla mikä tahansa ryhmä, joka kykenee reagoimaan suoraan kantajamolekyylin, esim. proteiini-10 molekyylin, kanssa muodostaen kovalenttisesti sidotun konjugaatin mainitun kantajamolekyylin kanssa ilman tarvetta käyttää liitosreagenssia liitoksen tai reaktion mahdollistamiseksi, tehostamiseksi tai edistämiseksi mainitun kantajamolekyylin kanssa.
15 Ryhmiä, jotka ovat soveliaita käytettäväksi aktivoituina liitosryhminä, tunnetaan alalla, ja niihin kuuluu esim. (i) aktivoituja esteri- tai aktivoituja karboksiryhmiä, so. joilla on kaava -CO-OZ, jossa Z on karboksiaktivoitu ryhmä, kuten o- tai p-nitrofenyyli, 20 1-bentstriatsoli, pentafluorifenyyli tai N-sukkini-imi-do; (ii) aktivoituja ditioryhmiä, so. ryhmiä, joilla on kaava -S-S-X-, jossa X on ditio-aktivoitu ryhmä, kuten 2-pyridyyli; ja (lii) epoksiryhmiä.
Sopivia immunogeenisiä konjugaattikantajamole-25 kyylejä, jotka omaavat aktivoidun liitosryhmän, esim. epoksiryhmä, kuten mainittu edellä, voidaan valmistaa tunnetulla tekniikalla, esim. kuten on kuvannut Laumen et ai., Tetrahedron Letters, 26 (4), 407 - 410 ( 1985). Esillä olevan keksinnön yleisten menetelmien mukaan on 30 kuitenkin edullista, jos aktivoitu liitosryhmä on liitetty syklosporiiniin, joka on tarkoitus liittää kantajaan, mieluummin kuin päinvastoin. Periaatteessa aktivoitu liitosryhmä voi olla läsnä missä asemassa tahansa syklosporiinimolekyylin ympärillä. Kun trans-35 formaatiot 1-asemassa ovat erityisen tärkeitä syklospo-riinin metabolismissa tai kun pääasiallisesti syklospo-riinimetaboliitit, esim. Syklosporiinin tapauksessa 9 93965 syklosporiinit ja 1J3, osoittavat rakenteellista vaihtelua 1-asemassa, kuten on kuvattu alla, on edullista, että aktivoitu liitosryhmä on läsnä yhdessä tai joissakin asemista 2-11, jolloin myöhemmin saatavassa 5 immunogeenisessa konjugaatissa tähde 1-asemassa jää koskemattomaksi, edullisesti kantajan "naamioimatta", ja täten vapaaksi aikaansaamaan spesifisen vasta-aine-vasteen. Yleensä on edullista, jos aktivoitu liitosryhmä on 2-asemassa tai missä tahansa asemista 3, 5 - 8 10 tai 10, erityisesti 5-8, jolloin 2 ja 8 asemat ovat erityisen edullisia.
Syklosporiinin tapauksessa tärkeimmät metabo-liset muuntumiset, joita ihmisessä tapahtuu, ovat: I -MeLeu9- terminaalinen hydroksylointi, joka antaa 15 kaavan (E) tähteen; CH3 C0- HO-C(CH3)-CH2-CH(L) (E); 20 \ N(CH3).
II -MeBmt1-terminaalinen hydroksylointi, joka antaa kaavan (F) tähteen; 25 C0- H0-CH2-CH»CH-CH2-CH(CH3)-CH(OH)-CH(S) (F).
(TRANS) (R) (R) N(CH3)- 30 III MeLeu*-:n des-N-metylointi, joka antaa Leu-; IV -MeLeu*-:n terminaalinen hydroksylointi, joka antaa kaavan (E) tähteen; 35 V -MeLeu6-:n terminaalinen hydroksylointi, joka antaa kaavan (E) tähteen; VI terminaalinen hydroksylointi ja renkaan sulkeminen 10 93965 -MeBmt1-, joka antaa kaavan (G) tähteen CO- / HO-CH2-CH2-CH-CH2-CH(CH3)-CH-CH(S) (G) 5 I I \ -o -1 ' N (CH3) - Täten tunnetut syklosporiinin metaboliitit 10 (indentifioitu syklosporiini _1, syklosporiini £ jne) osoittavat seuraavia metabolisia muunnelmia.
Syklosporiini JL : I. Syklosporiini (J : I + 11. Syklosporiini 9:1+ III + V. Syklosporiini 10: I + IV. Syklosporiini lj> : I + V. Syklosporiini : II.
15 Syklosporiini _18 : VI. Syklosporiini Tl : III.
[Kts. G. Maurer et ai, "Drug Metab. Disposit" 12, 120 - 126 (1984)].
Täten, monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka ovat erotuskykyisiä syklosporiinin ja 20 sen metaboliittien välillä ihmisessä, on edullista, jos aktivoitu liitosryhmä syklosporiinissa, jota käytetään immunogeenisen konjugaatin muodostukseen, sijaitsee muussa asemassa kuin 1-, 4-, 6- tai 9-asemassa, ja syklosporiinin Γ7 ja ljJ edustaessa pääosaa metabolii-25 teista, ainakin yhdessä muussa asemassa kuin 1-asemas-sa. Täten jälleen erityisesti Syklosporiinin ollessa kyseessä, 2- ja 8-asema on erityisen edullinen.
Syklosporiineja, joissa on yllä kuvattu aktivoitu liitosryhmä, voidaan valmistaa esim. joko: 30 (i) aktivoimalla sopiva olemassaoleva prekursoriryhmä (so. liitosryhmä ei-aktivoidussa muodossa), esim. konvertoimalla syklosporiinin, jossa on karboksi-substitu-oitu a-aminohappotähde (so. α-aminohappotähde, jossa on sivuketju α-atomissa, joka koostuu karboksiryhmistä tai 35 sisältää karboksiryhmän) karboksiryhmä, esim. 2- tai 8-asemassa, aktivoiduksi karboksiryhmäksi reaktiolla karboksiaktivoivan aineen kanssa; tai 11 93965 (ii) asyloimalla tai eetteröimällä syklosporiini, jossa on amino- tai hydroksi-substituoitu a-aminohappotähde (so. α-aminohappotähde, jossa on sivuketju a-atomissa, joka koostuu hydroksi- tai aminoryhmästä tai joka si-5 sältää hydroksi- tai aminoryhmän), esim. hydroksisubs-tituoitu a-aminohappotähde 2-asemassa tai amino- tai hydroksisubstituoitu α-aminohappotähde 8-asemassa, asy-lointi- tai alkylointiaineen kanssa, joka omaa aktivoidun liitosryhmän.
10 Prosessivaihe (i) yllä voidaan toteuttaa tun netulla tekniikalla, esim. karboksiryhmien aktivoimiseksi reaktiolla tavanomaisen karboksiaktivointiaineen, kuten o- tai p-nitrofenolin, 1-hydroksibentstriatsolin, pentafluorifenolin tai N-hydroksi-sukkini-imidin kans-15 sa. Reaktio toteutetaan sopivasti kondensoivan aineen, kuten EDCI läsnäollessa.
Prosessivaihe (ii) voidaan toteuttaa myös olennaisesti konventionaalisella tekniikalla. Täten amino- tai hydroksiryhmät voidaan sopivasti asyloida 20 reaktiolla karboksyylihapon johdannaisen kanssa, jossa karboksiryhmä on aktivoitu ja sisältää lisäksi aktivoidun liitosryhmän, joka on ei-reaktiivinen amino- tai hydroksiryhmän kanssa tapauksen mukaan, esim. N-[(2-py-ridyyli)-ditio-propion-l-yyli]-sukkini-imidin, [(2-py-25 ridyyli)-ditio-ryhmä muodostaa aktivoidun liitosryhmän (ei-reaktiivinen, tässä tapauksessa, sekä amino- että hydroksiryhmien kanssa) ja -COO-sukkini-imido-yksikkö muodostaa aktivoidun karboksiryhmän asyloinnin aikaansaamiseksi]. Reaktio toteutetaan sopivasti inertissä 30 liuottimessa tai laimennusaineessa, kuten dikloorime-taanissa, esim. tavanomaisessa lämpötilassa. Vaihtoehtoisesti hydroksiryhmät voidaan eetteröidä esim. epok-sin sisältävän yksikön muodostamiseksi, jolla on kaava O
35 / \ -CH2-CH-CH2 [epoksiryhmä muodostaa aktivoidun liitosryhmän], käyttäen mitä tahansa eri aineista, joita tunne 12 93965 taan alalla tätä tarkoitusta varten, kuten epikloori-hydriiniä tai epibromihydriiniä, esim. yleisten menetelmien mukaan,jotka on kuvattu julkaisussa, Laumen et ai. Loc. cit.
5 Syklosporiinin lähtöaineet prosessivaihetta (i) varten voidaan valmistaa analogisesti prosessivaiheen (ii) kanssa, esim. syklosporiinin valmistamiseksi, jossa on karboksisubstituoitu α-aminohappotähde, esim.
2- tai 8-asemassa: 10 (lii) syklosporiinin reaktiolla, jossa on a- tai hyd-roksisubstituoitu α-aminohappotähde, esim. hydroksi-substituoitu α-aminohappotähde 2-asemassa tai amino-tai hydroksisubstituoitu α-aminohappotähde 8-asemassa, joko (a) dikarboksyylihapon kanssa, jossa yksi karbok-15 siryhmistä on suojatussa muodossa, tai (b) dikarboksyy-lihappoanhydridin kanssa, esim. sukkinianhydriini, jolloin reaktiota kohdassa (a) seuraa karboksyyliryhmän suojauksen poisto tuotteena saatavassa syklosporiinis-sa.
20 Reaktiovaihe (iii) voidaan suorittaa myös käyttäen olennaisesti tavanomaisia menetelmiä, esim. happoa sitovan aineen läsnäollessa, kuten 4-dimetyyli-aminopyridiinin, inertissä orgaanisessa liuottimessa tai laimennusaineessa, normaalissa tai hiukan kohote-25 tussa lämpötilassa. Käytettäessä karboksia suojaavia ryhmiä vaihtoehdossa (a) nämä voivat olla kokonaan tavanomaisia ja ne voidaan poistaa tavanomaisella tekniikalla.
Syklosporiinin lähtöaineisiin prosessivaiheita 30 (ii) ja (iii) varten, joissa on hydroksi-substituoitu a-aminohappotähde, kuuluu tunnetut syklosporiinit: [Thr ]2-syklosporiini ja [ (D)Ser]8-syklosporiini, jolloin jälkimmäinen on kuvattu ja esitetty patenttivaatimuksissa esim. patenttijulkaisussa EP 0 056 782, yhdessä menetel-35 mien kanssa sen valmistamiseksi yleisellä tekniikalla kokonaissynteettisellä menetelmällä yllä mainittujen syklosporiinien valmistamiseksi tai fermentointiteknii- 13 93965 kalla. Muita syklosporiineita, joissa on hydroksisubsti-tuoitu α-aminohappotähde, esim. 8-asemassa, voidaan valmistaa tai saada analogisesti ja vielä erilaisia muita syklosporiineja, joihin kuuluu [ (D)Thr]esyklosporiini, 5 [Nva]2-[ (D)Ser]e-syklosporiini ja [Thr]2-[ (D)Ser]e-syklo- sporiini, on kuvattu ja ne on esitetty patenttivaatimuksissa patenttihakemuksessa US 713 259 (19.3.1985)/ vastaa DE P 3 509 809.0 (19.3.1985), vastaa FR 8 404 172 (19.3.1985), vastaa AU 40 272/85 (22.3.1985), vas-10 taa GB 8 507 270 (20.3.1985), vastaa NZ 211 526 (21.3. 1985), vastaa SA 85/2195 (22.3.1985).
Ensisijaisia syklosporiineja, joissa on a-sub-stituoitu a-aminohappotähde, ovat sellaiset, joissa mainittu aminohappotähde on 8-asemassa, syklosporiinit, 15 joissa tähde 8-asemassa on -(D)Lys- ovat erityisen edullisia. Tällaisia syklosporiineja voidaan valmistaa myös tunnetulla tekniikalla kokonaissynteesimenetel-mällä syklosporiinien valmistamiseksi, jonka on kehittänyt R. Wenger, esim.
20 (iv) poistamalla suojaus syklosporiinista, jossa on amino-substituoitu α-aminohappotähde 8-asemassa, joka syklosporiini on suojatussa muodossa, esim. poistamalla syklosporiinin suojaus, jolloin tähde 8-asemassa on -(D)Lys- N-e-suojatussa muodossa; tai 25 (v) syklisoimalla suora undekapeptidiketju, jossa on tuotesyklosporiinin sekvenssi, joka undekapeptidi on vapaassa tai suojatussa muodossa esim. undekapeptidi, johon kuluu -(D)Lys-tähde vapaassa tai N-E-suojatussa muodossa asemassa vastaten 8-asemaa tuotesyklosporii-30 nissa, jolloin tarvittaessa toteutetaan prosessivaihe (iv).
Prosessivaiheet (iv) ja (v) voidaan erityisesti toteuttaa alla esimerkissä 1 kuvatulla yleisellä menetelmällä.
35 Kuten nähdään prosessivaiheiden (i), (ii) ja (iii) kuvauksesta, vaiheiden (i) tai (ii) tuotteet sisältävät yleisesti syklosporiineja, joissa on asyyli- 14 93965 amino, asyylioksi- tai alkoksi-substituoitu «-aminohappotähde, (so. α-aminohappotähde, jossa on sivuketju α-atomissa käsittäen tai sisältäen asyyliamino-, asyylioksi- tai a1koksiryhmän), esim. sylkosporiini, jossa 5 on asyylioksi- tai alkoksi-substituoitu «-aminohappotähde 2-asemassa tai asyyliamino-, asyylioksi- tai alkoksi-substituoitu «-aminohappotähde 8-asemassa, jossa aktivoitu liitosryhmä on läsnä asyyli-/alkyyli-ryhmässä.
10 Tämä voidaan havaita helpommin viittaamalla seuraaviin reaktiokaavioihin, jotka esittävät syklospo-riinien erityisryhmien valmistusta prosessivaiheiden (i) - (v) yleisten menetelmien mukaisesti:
Seuraavissa kaavoissa Ia - Id, Ha - Ild ja 15 III, C tarkoittaa sekvenssiä -Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala, 3 4 5 6 7 ja E tarkoittaa sekvenssiä -MeLeu-MeLeu-MeVal-.
9 10 11
Reaktiovaihe (i) 20 .) |_A>-B>>-C-D‘-E-| (Ia) jossa 25 A1 = -MeBmt-, =-(0-asyyli)-Thr-, jossa asyyliyksikössä on liitos-ryhmä ei-aktivoidussa muodossa, esim. vapaa karboksi-ryhmä, esim. -(O-hydroksisukkinyylij-Thr-, ja D1 = -(D)Ala-: 30 Aktivointi, esim. reaktion avulla karboksi-akti voidun aineen kanssa sopivasti liitosaineen, ku ten EDCI, läsnäollessa: —A:-B 1-C-D1-E— 35 * (Ha) jossa 40 A1 ja D1 tarkoittavat samaa kuin yllä, ja B^ = -(O-asyyli)-Thr-, jossa asyyliyksikössä on aktivoitu liitosryhmä, esim. aktivoitu karboksiryhmä, esim.
15 93965 -(O-asyyli)-Thr-, jossa asyyliyksiköllä on kaava ZO-CO--(CH2)2-CO-, jossa Z on karboksi-aktivoitu ryhmä.
S b) pA!-B!-C-D.2-E-| (Ib) jossa 10 A2 = -MeBmt- ja B2 = -aAbu- tai -Nva-, tai A2 = dihydro-MeBmt- ja B2 = -Vai- ja
Da2 = asyyliamino-substituoitu (D)a-aminohappotähde, esim. -(N-e-asyyli)-(D)-Lys-, jossa asyyliyksikössä on liitosryhmä ei-aktivoidussa muodossa, esim. vapaa kar-15 boksiryhmä, esim.-(N-e-hydroksisukkinyyli)-(D)Lys-:
Aktivointi, esim. reaktion avulla karboksi-aktivoidun aineen kanssa, esim. N-hydroksisukkini-imi-din, sopivasti liitosaineen, kuten EOCI, läsnäol-▼ lessa: 20 2 2 2 pA-H-C-Ι^-Εη (IIb) 25 .
jossa A2 ja B2 tarkoittavat samaa kuin yllä, ja Dfa2 = asyyliamino-substituoitu (D)a-aminohappotähde, esim. -(N-€-asyyli)-(D)Lys-, jossa asyyliyksikössä on 30 aktivoitu liitosryhmä, esim. aktivoitu karboksiryhmä, esim. -(N-e-asyyli)-(D)Lys-, jossa asyyliyksiköllä on kaava ZO-CO-(CH2)2-CO-, jossa Z tarkoittaa samaa kuin yllä.
Reaktiovaihe (11) 35 a) I-A^B 3-C-D:-E—r ,, % | I (le) 40 jossa • * ·' A1 ja D1 tarkoittavat samaa kuin yllä ja B 3 = -Thr-: O-alkylointi alkyyliyksikön viemiseksi, jossa on aktivoitu liitosryhmä, esim. epoksiryhmä, esim. 45 reaktion avulla epikloorihydridin tai epibromihyd- φ ridin kanssa: 16 93965 r—A*-B 3-C-D1-E— b (He) 5 .
jossa A1 ja D1 tarkoittavat samaa kuin yllä, ja Bb3 = -(O-alkyyli)-Thr-, jossa alkyyliyksikössä on aktivoitu liitosryhmä, esim. epoksiryhmä, esim. -(O-epoksi-10 metyyli)-Thr-.
b) j-a’-b’-c-u.'-e-, (ld) 15 '-' jossa A2 ja B2 tarkoittavat samaa kuin yllä ja oJ = amino-substituoitu (D)a-aminohappotähde, esim.
20 -(D)Lys-: N-e-asylointi käyttäen asylointiainetta, jossa on aktivoitu liitosryhmä ei-reaktiivinen -NHZ kanssa, esim. asylointiainetta, jolla on kaava ZO-CO-(CH2)j-Y, jossa Z tarkoittaa samaa kuin 25 yllä ja Y on aktivoitu liitosryhmä ei-reaktii vinen -NH2 kanssa, esim. 2-pyridyyli-ditioryh-* mä: 30 pA;-B;-C-Db]-E-| (IId) jossa 35 A2 ja B2 tarkoittavat samaa kuin yllä ja
Db3 55 asyyliamino-substituoitu (D) a-aminohappotähde, esim. -(N-e-asyyli)-(D)Lys-, jossa asyyliyksikössä on aktivoitu liitostähde, esim. -[N-e-(3-(2-pyridyyli)-(di-tiopropioni-l-yyli)]-(D)Lys-.
40
Reaktiovaihe (iii) a) Syklosporiini, jolla on kaava Ie, kuten määritelty alla: I Asylointi, esim. reaktiolla sukkinianhydridin 45 I kanssa:
Syklosporiini, jolla on kaava Ia, kuten määritelty yllä.
b) Syklosporiini, jolla on kaava Id, kuten määritely 17 93965 yllä:
Asylointi, esim. reaktiolla sukkinianhydridin i kanssa:
Syklosporiini, jolla on kaava Ib, kuten määritelty yllä.
5
Reaktlovaihe (iv) —A2-B2-C-D 4-E—r /T .
ίο Γ · 1 (Ie) jossa A2 ja B2 tarkoittavat samaa kuin yllä ja 15 Da* = aminosubstituoitu (D)a-aminohappotähde, esim.
-(D)-Lys-, suojatussa muodossa: Ί» Suojauksen poisto:
Syklosporiini, jolla on kaava Id, kuten määritelty yllä. 20 Reaktlovaihe (v) H-Da5-E-A2-B2-C-OH (III) jossa 25 A2 ja B2 tarkottavat samaa kuin yllä ja
Da5 = amino-substituoitu (D) α-aminohappotähde, esim.
(D)Lys-, vapaassa tai -Ν-Σ-suojatussa muodossa: i Syklisointi menetelmän Wenger mukaan:
Syklosporiini, jolla on kaava Id tai Ie, kuten määritel-30 ty yllä.
Tässä vaiheessa on syytä huomata, että hydrok-siryhmä 3'-asemassa ryhmissä -MeBmt- ja -dihydro-MeBmt-omaa suhteellisen alhaisen reaktiivisuuden. Täten sil-. loin, kun yllä kuvatut menetelmät edellyttävät syklospo- 35 riinien reaktiota, joilla on hydroksisubstituoitu a-ami-nohappotähde jossakin 2 - 11-asemista, esim. -Thr- 2-asemassa, reaktio mainitun tähteen hydroksiryhmän kanssa on ensisijainen reaktioon hydroksiryhmän kanssa ryhmissä -MeBmt- tai -dihydro-MeBmt- nähden, jolloin ei-toivottu 40 sivureaktio jälkimmäisen kanssa on täten helposti väl- 18 93965 tettävissä.
Kaavoissa Ib, Hb, Id, Ie ja III yllä A2 ja B2 tarkoittavat edullisesti -MeBmt- ja vast. α-Abu-.
Kun esillä olevassa selityksessä on viitattu 5 syklosporiineihin, joissa on erityinen tähde 8-asemassa, mutta mainitun tähteen rakennetta ei ole selvitetty, tällöin (D)-konfiguraatio on ensisijainen.
Syklosporiinit, joissa on yllä kuvattu aktivoitu liitosryhmä, samaten kuin syklosporiinit, joissa 10 on amino-substituoitu α-aminohappotähde 8-asemassa, jolloin aminosubstituentti on vapaassa tai suojatussa muodossa, tai muulla tavoin muodostettu johdannainen, esim. asyloitu, ovat uusia, ja ne muodostavat osan esillä olevaa keksintöä. Esillä oleva keksintö tuo täten esiin: 15 1.1. Syklosporiini, jossa on α-aminohappotähde, jossa on aktivoitu liitosryhmä.
1.2. Kohdan 1.1. mukainen syklosporiini, jolloin a-ami-nohappotähde on jossakin 2 - 11-asemista.
1.3 Kohdan 1.2. mukainen syklosporiini, jolloin a-ami-20 nohappotähde on asyyliamino, asyylioksi- tai alkokosi— substituoitu a-aminohappotähde, jossa aktivoitu liitos-ryhmä on asyyliamino-, asyylioksi- tai alkoksi-substi-tuentissa.
1.4. Jonkin kohdista 1.1. - 1.3. mukainen syklosporii-25 ni, jolloin aktivoitu ryhmä on aktivoitu esteri, aktivoitu ditio- tai epoksiryhmä.
1.5. Kohdan 1.3. mukainen syklosporiini, jolloin a-ami-nohappotähde on: asyyliamino-substituoitu a- aminohappotähde, jossa asyyliaminosubstituentti on substituoitu 30 sen asyyliyksikössä aktivoidulla karboksi- tai aktivoidulla ditioryhmällä; asyylioksi-substituoitu a-amino-happotähde, jolloin asyylioksi-substituentti on substituoitu sen asyyliyksikössä aktivoidulla karboksiryh-mällä; tai alkoksi-substituoitu α-aminohappotähde, jol-35 loin alkoksi-substiuentti on substituoitu epoksiryhmäl-lä.
1.6. Jonkin kohdista 1.3. - 1.5. mukainen syklosporii- 19 93965 ni, jolloin α-aminohappotähde on (O-asyyli)-treonyyli-tähde 2-asemassa.
1.7. Kohdan 1.6. mukainen syklosporiini, jolloin asyy-liyksiköllä on kaava ZO-CO-CH2-CH2-CO-/ jossa z on kar- 5 boksi-aktivoitu ryhmä.
1.8. Kohdan 1.2. mukainen syklosporiini, jolloin a-ami-nohappotähde on 5-, 6-, 7- tai 8-asemassa.
1.9. Kohdan 1.8. mukainen syklosporiini, jolloin a-ami-nohappotähde on (D)a-aminohappotähde 8-asemassa.
10 1.10. Kohdan 1.9. mukainen syklosporiini, jolloin a-aminohappotähde on asyyliamino-subsituoitu (D)a-ami-nohappotähde, jossa aktivoitu ryhmä on asyyliaminosubs-tituentissa.
1.11. Kohdan 1.10. mukainen syklosporiini, jolloin 15 aktivoitu liitosryhmä on aktivoitu karboksi- tai aktivoitu ditioryhmä.
1.12. Syklosporiini, jossa on amino-substituoitu (D)a-aminohappotähde 8-asemassa aminosubstituentin ollessa vapaassa tai suojatussa muodossa.
20 1.13. Syklosporiini, jossa on asyyliamino-substituoitu (D)a-aminohappotähde 8-asemassa, jolloin asyyliamino-substituentti on substituoitu sen asyyliyksikössä vapaalla karboksiryhmällä.
1.14. Jonkin kohdista 1.10. - 1.13. mukainen syklospo-25 riini, jolla on kaava
NH-X
(CH2) 4
30 I
·. -NH-CH-C0- (0) jossa X on vety, aminoa suojaava ryhmä tai asyyliryhmä, joka on substituoitu vapaalla karboksiryhmällä tai akti- 35 voidulla liitosryhmällä, esim. aktivoidulla karboksi- tai ditioryhmällä, esim. asyyliryhmä, jolla on kaava Y-CH-CH-CO-2 2 20 93965 jolloin Y on karboksi, aktivoitu karboksiryhmä tai aktivoitu ditioryhmä.
1.15 Kaavojen Ha, Ib, Hb, Ile, Id, Ild tai Ie mukainen syklosporiini, kuten on määritelty edellä.
5 Kuten edellä on selvitetty, keksinnön mukaan on nyt yllättäen havaittu, että immunogeeniset konjugaa-tit, joissa on kantaja ja syklosporiini aktivoidun lii-tosryhmän liittämänä, erityisesti, jotka on saatu käyttäen syklosporiineja, joissa on aktivoitu liitosryhmä, 10 kuten on kuvattu yllä, esim. kuten on määritelty kohdissa 1.1. - 1.11, 1.14 - 1.15, mahdollistavat ensimmäistä kertaa sellaisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistuksen, jotka ovat erotuskykyisiä syklosporiinien ja niiden metaboliittien välillä. Täten immunogeeniset 15 konjugaatit, joihin kuuluu yllä mainitun kaltaisten syklosporiinien reaktiotuotteita, hapteenikomponenttina, ovat kykeneviä aikaansaamaan vasta-ainevasteen altistetuissa esim. niille rokotetuissa eläimissä, siten että näistä eläimistä saatuja vasta-ainetta muodostavia solu-20 ja, esim. perna- tai imusolmusoluja voidaan käyttää hybridoomalinjojen valmistamiseksi muodostamaan monoklo-naalisia vasta-aineita, jotka ovat erotuskykyisiä terapeuttisesti annosteltavien syklosporiinien, esim. Syklo-sporiinin, ja niiden metaboliittien, erityisesti ihmi-25 sessä esiintyvien metaboliittien, esim. syklosporiinin 17 ja syklosporiinin 18, välillä. Tällaisten antigeenisten konjugaattien ollessa tähän asti tuntemattomia, esillä oleva keksintö tuo edelleen esille: 2.1. Immunogeenisen konjugaatti, johon kuuluu kantaja 30 liittyneenä syklosporiiniin aktivoidun liitosryhmän avulla, esim. käsittäen kantajan liittyneenä syklosporiiniin, jossa on α-aminohappotähde, jossa on aktivoitu liitosryhmä, esim. kuten on kuvattu alla, erityisesti syklosporiinin, kuten on määritelty jossakin kohdista 35 1.1. - 1.11, 1.14 tai 1.15 (kaavat Ha, Hb, Ile tai Ild) yllä.
2.2. Immunogeeninen konjugaatti, joka on saatu tai 21 93965 saatavissa liittämällä syklosporiiniin, jossa on «-aminohappotähde, jossa on aktivoitu liitosryhmä, esim. kuten on kuvattu edellä, erityisesti syklosporiiniin, kuten on määritelty edellä jossakin kohdista 1.1 - 1.11, 5 1.14 tai 1.15 (kaavat Ha, Hb, Ile tai Ild) yllä.
2.3. Immunogeeninen konjugaatti, esim. kuten on määritelty kohdissa 2.1 tai 2.2,, joka on käyttökelpoinen monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, jolla on erotuskykyä syklosporiinin ja sen metaboliitin välillä, 10 esim. monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, kuten on määritelty alla ja erityisesti alla jossakin kohdista 3.1 - 3.10.
Sopivia kantajia keksinnön mukaisia immunogee-nisiä konjugaatteja varten ovat kaikki tunnetut ja ylei-15 sesti alalla käytetyt kantajat, erityisesti suuren mole-kyylipainon omaavat polypeptidit, varsinkin proteiinit, kuten seerumialbumiinit, esim. naudan seerumin albumiini ja kananpojan ovalbumiini, immunoglobuliinit erityisesti luokassa IgG, kuten kananpojan tai marsun IgG, ja syn-20 teettiset polymeerit, kuten polyglutamiinihappo.
Lisäksi esillä oleva keksintö tuo esille menetelmän yllä määriteltyjen immunogeenisten konjugaattien valmistamiseksi, jossa menetelmässä: (vi) Liitetään kantaja, esim. yllä kuvattu, jossa on 25 aktivoitu liitosryhmä, syklosporiiniin, jossa on «-aminohappotähde, jossa on sopiva ko-reaktiivinen ryhmä, esim. hydroksi tai amino, esim. [Thr]2-syklosporiiniin tai [(D)Lys]8-syklosporiiniin, tai liitetäänn kantaja, esim. kuten on kuvattu yllä, syklosporiiniin, jossa on 30 α-aminohappotähde, jossa on aktivoitu liitosryhmä, esim. kuten on kuvattu edellä, erityisesti syklosporiiniin, kuten on määritelty edellä kohdissa 1.1 - 1.11, 1.14 tai 1.15 (kaavat Ha, Hb, Ile tai Ild) yllä.
Yllä mainittu menetelmä voidaan toteuttaa 35 syklosporiinikomponenttien suoran reaktion avulla, so. käyttämättä liittävää ainetta. Reaktio voidaan sopivasti toteuttaa lisäämällä syklosporiinikomponentti liuotettu- 22 93965 na sopivaan inerttiin laimentimeen tai kantajaan, kuten dimetyyliformamidiin, puskuroituun kantaja-ainevalmis-teeseen, esim. kanta japroteiinin bikarbonaattipuskurili-uokseen tai -suspensioon, normaalissa lämpötilassa.
5 Saatu immunogeeninen konjugaatti puhdistetaan sopivasti dialyysin avulla, esim. vasten fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta.
Yllä kuvatut immunogeeniset konjugaatit, esim. kuten on määritelty kohdissa 2.1 - 2.3, voidaan käyttää 10 monoklonaalisten vasta-aineiden valmistukseen olennaisesti tunnetulla tekniikalla, esim. vaiheittaisella menetelmällä, johon kuuluu: (a) immunogeenisen konju-gaatin annostelu, esim. kuten on määritelty jossakin kohdista 2.1 - 2.3 yllä, sopiviin eläinyksilöihin; (b) 15 vasta-ainetta tuottavien immunogeenisille konjugaatille herkistettyjen solujen, esim. perna- tai imusolmukesolu-jen talteenotto; (c) talteenotettujen solujen immorta-lisoiminen esim. fuusioimalla sopivan myeloma-solulinjan kanssa hybridoomalinjojen muodostamiseksi; ja (d) immor-20 talisoidun solun esim. hybridoomalinjan valinta, joka muodostaa haluttuja monoklonaalisia vasta-aineita.
Vaihe (a) toteutetaan sopivasti käyttäen rottia ja hiiriä, esim. °+ Balb/c hiiriä vastaanottajana ja annostellen immunogeeninen konjugaatti s.c. tai i.p.
25 ruiskeella määrin noin 50 - 200, esim. 100 μς, tehostus-ruiskeiden seuraamana, i.p., s.c. tai i.m., 14 - 21 pv myöhemmin. Hiirille, jotka osoittavat sopivan isotyyp-pijakauman omaavan korkeapitoisen antiseerumin, esim. määriteltynä tavallisella RIA ja/tai ELISA tekniikalla, 30 annetaan vielä tehostusruiskeita, esim. erityisten menetelmien mukaan, kuten on kuvattu esimerkissä 9, ja vasta-aineita muodostavat, esim. pernasolut, kerätään [vaihe (b)]. Vaihe (c) voidaan toteutaan millä tahansa menetelmällä, jota on käytetty alalla, esim. käyttäen mene-35 telmää, jota on kuvannut S. Fazekas et ai., "J. Immunol. Methods" 35, 1-32 ( 1980), ensisijaisen myelooma-linjan ollessa (Balb/C) hiirilinja. Vaiheessa (d) kasva- 23 93965 vat myeloomalinjat seulotaan syklosporiinille vasta-ai-netuoton suhteen esim. tavallisella RIA-järjestelmällä käyttäen sen radiomerkittyä johdannaista tai tavallisella ELISA-järjestelmällä, esim. kuten on kuvattu alla 5 esimerkissä 9.
Sovellettaessa yllä esitettyjä menetelmiä käyttäen esillä olevan keksinnön mukaisia erityisiä im-munogeenisia konjugaatteja, on mahdollista saada mono-klonaalisia vasta-aineita, joilla on sellainen spesifi-10 syyden aste, että ne ovat erotuskykyisiä yksittäisten syklosporiinien välillä, jotka eroavat toisistaan vain pienten rakenteellisten elementtien osalta, esim. siten, että hydroksiryhmä on vetyatomin paikalla. Vielä merkittävämmin esillä oleva keksintö mahdollistaa ensim-15 mäisen kerran monoklonaalisten vasta-aineiden aikaansaamisen, joilla on erotuskyky syklosporiinien, esim. Syklosporiinin, ja sen metaboliittien välillä, erityisesti sen ihmisessä esiintyvien metaboliittien välillä. Täten keksinnön mukaisella menetelmällä saatavat monok-20 lonaaliset vasta-aineet todetaan reaktiivisiksi syklosporiinien, esim. Syklosporiinin, kanssa, niiden osoittaessa samanaikaisesti suhteellisen alhaista ristireak-tiivisuutta niiden metaboliittien kanssa. Lisäksi käytettäessä keksinnön mukaisia immunogeenisiä konjugaatte-25 ja, esim. kuten on kuvattu kohdissa 2.1 - 2.2 yllä, joissa syklosporiinin hapteenikomponentti vastaa valittua "kohde"syklosporiinia, esillä oleva keksintö mahdollistaa monoklonaalisten vasta-aineiden saamisen, jotka ovat erotuskykyisiä "kohde"-syklosporiinin ja sen ra-30 kenteellisesti läheisten sukulaismetaboliittien esim. sen ihmisessä esiintyvien metaboliittien välillä. Täten lähdettäessä immunogeenisista konjugaateista, jotka on saatu liittämällä kantaja syklosporiiniin, jossa on aktivoitu liitosryhmä 2-asemassa, esim. kuten on määri-35 telty kohdassa 1.6 yllä, ja jossa cr-aminohappotähteet jäljellä olevissa 1- ja 3 - 11-asemissa ovat siis samat kuin Syklosporiinissa, on mahdollista valmistaa mono- 24 93965 klonaalisia vasta-aineita, jotka ovat ensisijaisesti reaktiivisia niiden "kohde" syklosporiinina olevalle syklosporiinille sen ihmisessä esiintyviin metabolii-tteihin nähden, esim. syklosporiineihin S, 9, 1J), 16, 5 Γ7, JJJ ja/tai 21_, erityisesti 1T_ ja/tai 1J3 ja varsinkin 17 nähden. Samoin, lähdettäessä imunologeenisista konju-gaateista, jotka on saatu liittämällä kantaja syklospo-riiniin, jossa on aktivoitu liitosryhmä 5-, 6-, 7- tai 8-asemassa, esim. kuten on määritelty kohdassa 1.8 edel-10 lä, erityisesti 8-asemassa, esim. kuten on määritelty jossakin kohdista 1.9, 1.11, 1.14 tai 1.15 (kaavat Hb tai Ild) edellä, ja jolloin tähteet jäljellä olevissa asemissa, esim. 1 - 7 ja 9 - 11, vastaavat tähteitä Syklosporiinissa, dihydro-[Val]2syklosporiinissa tai 15 [Nva]2-syklosporiinissa, voidaan valmistaa monoklonaali-sia vasta-aineita, jotka ovat ensisijaisesti reaktiivisia Syklosporiinille, dihydro-[Val]2-syklosporiinille tai [Nva]2-syklosporiinille "kohde"-syklosporiinina, niiden metaboliitteihin nähden, esim. ihmisessä esiintyviin 20 metaboliitteihin, kuten, Syklosporiinin ollessa kyseessä, välittömästi edellä mainittuihin nähden.
Keksinnön mukaisilla menetelmillä saatavat monoklonaaliset vasta-aineet ovat, erityisesti, erotus-kykyisiä "kohde"-syklosporiinien ja niiden metaboliit-25 tien välillä, jotka osoittavat 1-asemassa olevan «-aminohappotähteen rakenteellista transformaatiota, esim. metaboliittien välillä, jotka eroavat ei-metaboliitti-sista syklosporiineista, joista ne ovat muuntuneet 1-asemassa olevan -MeBmt- tai -dihydro-MeBmt-tähteen subs-30 tituution tai muun kemiallisen modifikaation toimesta, erityisesti osoittavat rakenteellista transformaatiota 1-asemassa olevan tähteen terminaaliasemassa, esim. käsittäen terminaalisen (C9)-MeBmt-metyyliryhmän hydrok-syloinnin, kuten esimerkin 9 yhteydessä kuvattujen mono-35 klonaalisten vastaaineiden ollessa kyseessä, jotka ovat reaktiivisia Syklosporiinin kanssa, omaten samanaikaisesti suhteellisen alhaisen ristisidosaktiivisuuden sen 25 93965 metaboliittisyklosporiinin (Γ7) kanssa. Kun syklosporii-nin tällaiselle metaboliittiselle transformaatiolle on erityistä merkitystä, esim. se on tunnusomaista ihmisen pääasiallisille metaboliitteille, kuten syklosporiinille 5 17 ja 1J5, keksinnön mukaisilla menetelmillä saatavien monoklonaalisten vasta-aineiden kyky erottaa syklospo-riini ja sen näin transformoituneet metaboliitit, on erityisen huomionarvoista.
Ristireaktiivisuus metaboliittien kanssa, 10 esim. kuten on kuvattu yllä, on edullisesti noin 5 % tai vähemmän, vielä edullisemmin noin 3 % tai vähemmän, vielä edullisemmin noin 2 % tai-vähemmän, reaktiivisuudesta ei-metabolisoidun syklosporiinin kanssa, esim. mitattuna RIA tai ELISA, esim. kilpaileva ELISA-teknii-15 kalla, sopivasti käyttäen puskuria, esim. noin pH 6 - 8, erityisesti 7 - 8, ja sopivasti sisältäen myös pienen määrän esim. 0,01 - 0,1 %, esim. 0,01 - 0,05 % ei-ionis-ta pinta-aktiivista ainetta tai tensidiä, kuten Tween, esim. fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, pH 7,5 ja si-20 sältäen 0,03 % pinta-aktiivista ainetta, esim. Tween 20. Täten keksinnön mukaisilla menetelmillä saatavat monoklonaaliset vasta-aineet, jotka ovat reaktiivisia Syklosporiinin kanssa, osoittavat syklosporiiniin 17 erotuskykyä IC50 -suhteen suuruusluokkaa 35-kertainen tai ·. 25 suurempi Syklosporiiniin verrattuna, mitattaessa kil pailevalla ELISA tekniikalla edellä esitetyissä olosuhteissa.
Keksinnön mukaisilla menetelmillä saataville monoklonaalisille vasta-aineille on ominaista myös kor-30 kea affiniteetti "kohde"-syklosporiiniin, esim. Syklos-* poriiniin. Täten keksinnön mukaiset ensisijaiset mono klonaaliset vasta-aineet osoittavat affiniteettia, joka on vakio [dissosiaatiotasapainovakio] "kohde"- syklosporiiniin esim. syklosporiiniin nähden, ja kertaluokkaa 35 10'9 mol/L tai vähemmän, edullisesti 10"10 mol/L tai vä hemmän, esim. normaaleissa RIA lämpötiloissa (noin 4 -37 °C), määriteltynä standardimenetelmin, esim. Muller 26 93965 et ai, Methods in Enzymology, 92, 589 - 601 (1983) kuvaaman menetelmän mukaan.
Esillä oleva keksintö mahdollistaa vielä luokan IgG, esim. sivuluokan IgG1, monoklonaalisten vasta-5 aineiden muodostuksen. Koska tällaiset vasta-aineet ovat erityisen sopivia käytettäväksi diagnostisissa/koejär-jestelmissä, esim. kuten on kuvattu alla, ne ovat ensisijaisia.
Edellä kuvatut monoklonaaliset vasta-aineet, 10 samaten kuin niitä muodostavat hybridoomalinjat, ovat kokonaan uusia, ja, kuten ilmenee niiden yleisten ja erityisten ominaisuuksien kuvauksesta edellä, täysin sopivia käytettäväksi diagnostisissa/koejärjestelmissä, esim. seurattaessa syklosporiinilääkkeen plasma-veri-15 tasoja potilailla, jotka saavat syklosporiinihoitoa.
Esillä oleva keksintö tuo täten esiin: 3.1. Monoklonaalinen vasta-aine, joka on erotuskykyinen syklosporiinin, esim. etukäteen määrätyn syklosporiinin ja sen metaboliitin välillä, edullisesti ainakin sen 20 yhden ihmisessä esiintyvän metaboliitiin välillä, erityisesti ainakin yhden sen ihmisessä esiintyvän tärkeimmän metaboliitin välillä.
3.2. Kohdan 3.1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, joka on reaktiivinen syklosporiinin kanssa, esim. etu- 25 käteen määritellyn syklosporiinin kanssa, ja osoittaa suhteellisen alhaista ristisidosaktiivisuutta sen metaboliitin kanssa, edullisesti sen ainakin yhden ihmisessä olevan metaboliitin kanssa, erityisesti sen ainakin yhden ihmisessä olevan tärkeimmän päämetaboliitin kanssa.
30 3.3. Kohdan 3.1 tai 3.2 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, jolloin syklosporiini on Syklosporiini, dihy-dro-[Val]2-syklosporiini tai [Nva]2-syklosporiini, erityisesti Syklosporiini.
3.4. Jonkin kohdista 3.1 - 3.3 mukainen monoklonaalinen 35 vasta-aine, jolloin metaboliitti osoittaa 1-asemassa olevan α-aminohappotähteen rakenteellista transformaatiota, erityisesti 1-asemassa olevan tähteen terminaa- 27 93965 liasemassa, esim. osoittaen α-aminohappojen tähteen -MeBmt- terminaalista hydroksylaatiota 1-asemassa.
3.5. Kohdan 3.4 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, jolloin syklosporiini on syklosporiini ja metaboliitti 5 on syklosporiini 1, 9, 10, 16, 17_, IjJ tai 21_, erityi sesti syklosporiini 1J_ tai JJJ, vielä edullisemmin syklosporiini 17.
3.6. Jonkin kohdista 3.2 - 3.5 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, jolloin ristireaktiivisuus metaboliitin 10 kanssa on suurusluokkaa noin 5 % tai vähemmän, edulli-sesi 3 % tai vähemmän, vielä edullisemmin 2 % tai vähemmän esim. mitattuna RIA- tai ELISA-tekniikalla esim. alla esitetyissä olosuhteissa.
3.7. Jonkin kohdista 3.5 - 3.6 mukainen monoklonaalinen 15 vasta-aine, jolloin affiniteettivakio (etukäteen määrätyn) syklosporiinin, esim. syklosporiinin, suhteen on suuruusluokkaa 10'9 mol/1 tai vähemmän, edullisesti 10~10 mol/1 tai vähemmän, esim. mitattuna alla esitetyissä olosuhteissa.
20 3.8. Jonkin kohdista 3.1 - 3.7 mukainen luokan IgG
monoklonaalinen vasta-aine.
3.9. Jonkin kohdista 3.1 - 3.8 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, joka on saatu tai saatavissa: (a) liittämällä syklosporiini, jossa on a-aminohappo-25 tähde, jossa on aktivoitu liitosryhmä, esim. kuten on kuvattu edellä, erityisesti määritelty edellä jossakin kohdista 1.1 - 1.11, 1.14 tai 1.15 (kaavat Ha, Hb, Ile tai Ild), kantajaan immunogeenisen konjugaatin muodostamiseksi .
30 (b) annostelemalla mainittu immunogeeninen konjugaatti sopivalle eläinlajille immunogeenisen altistumisen aikaansaamiseksi, ja ottamalla talteen vasta-ainetta muodostavien mainittuun konjugaatille herkistyneet solut; (c) immortalisoimalla vasta-aineita muodostavat solut, 35 esim. fuusion avulla sopivan myelomasolulinjan kanssa; ja (d) ottamalla talteen monoklonaalinen vasta-aine väli- 28 93965 tusta inunortaaliksi tehdystä solulinjasta, esim. hybridoomasolulinja täten määrättynä.
3.10. Monokonaalinen vasta-aine, esim. jonkin kohdista 3.1 - 3.8 mukainen, ja on saatu tai saatavissa: 5 (a) ottamalla talteen vasta-ainetta muodostavia soluja, jotka ovat herkistyneet jonkin kohdista 2.1 - 2.3 mukaiselle immunogeeniselle konjugaatille.
(b) immortalisoimalla mainittua vasta-ainetta muodostavat solut, esim. fuusioimalla sopivan myeloomasolulinjan 10 kanssa, ja (c) ottamalla talteen tarvittava monoklonaalinen vasta-aine valitusta inunortaaliksi tehdystä solulinjasta, esim. näin muodostetusta hybridoomasolulinjasta.
4.1. Hybridoomasolulinja muodostaen jonkin kohdista 3.1 15 - 3.8 mukaista monoklonaalista vasta-ainetta.
4.2. Hybridoomasolulinja, joka on saatu tai saatavissa vaiheiden (a) - (c) kohdassa 3.9 mukaisesti yllä tai vaiheilla (a) ja (b) kohdassa 3.10 yllä.
Kuten voidaan havaita, keksinnön mukaiset 20 monoklonaaliset vasta-aineet ovat erotuskykyisiä annetun syklosporiinin, esim. Syklosporiini, ja joukon sen meta-boliittien kesken, esim. osoittaen alhaista ristisidos-aktiivisuutta useamman kuin yhden sen metaboliittien kanssa.
25 Lisäksi esillä oleva keksintö tuo esiin: (vii) Menetelmän monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, kuten on määritelty kohdissa 3.1 - 3.8 edellä, johon menetelmään kuuluu hybridoomasolulinjan kasvatus, joka muodostaa tällaista vasta-ainetta, ja täten muodos- 30 tetun vasta-aineen talteenotto; ja (viii) Menetelmä hybridoomasolulinjan valmistamiseksi, joka muodostaa monoklonaalista vasta-ainetta, kuten on määritelty kohdissa 3.1 - 3.8 edellä, johon menetelmään kuuluu vasta-ainetta tuottavan solun, esim. perna- tai 35 imunestesolun, joka muodostaa tällaista vasta-ainetta, immortalisoiminen, esim. fuusion avulla sopivan myeloomasolulinjan kanssa.
29 93965
Edellä esitetyt prosessivaiheet voidaan toteuttaa nykyisin standarditekniikalla, esim. kuten on kuvattu edellä, tai kuten kuvataan oheisissa esimerkeissä, jolloin ensisijainen myeloomasolulinja käytettäväksi 5 prosessissa (viii), on hiiren (Balb/C) myeloomasolulinja.
Esillä olevan keksinnön vielä erään sovellutuksen mukaan on yllättäen todettu, että syklosporiinit, joissa on -(D)Lys-tähde 8-asemassa, so. kuten on määri-10 telty kohdissa 1.14 tai 1.15 (kaava Id) edellä, samaten kuin johdannaiset, joissa niiden N-e-atomi on edelleen muodostettu johdannaiseksi, osoittavat esim. yhdenmukaisia solua sitovia ominaisuuksia kuin "kanta" ("parent" )-syklosporiini (esim. vastaavat syklosporiinit, 15 joissa on -(D)Ala- 8-asemassa) yllättävässä ja huomattavassa määrin. Tämä havainto on erityisen merkittävä, koska N-e-typpi-atomi ryhmässä -(D)Lys- muodostaa ideaalisen aseman, johon leimaus voidaan toteuttaa esim. johon leima- tai merkkiryhmiä voidaan tuoda. Tällaiset 20 leimatut syklosporiinit muodostavat edelleen avaintyöka-lun "kanta"-syklosporiinien toiminnanmekanismin tutkimiseksi (esim. syklosporiinin [ (D)Lys]8-syklosporiinin kyseessä ollessa) ja/tai "kanta"-syklosporiinin sidos-paikkojen identifioimiseksi, esim. in vitro kudosviljel-25 mävalmisteissa. Täten radioaktiivisesti leimatut johdannaiset, esim. 125I-merkityt johdannaiset, ovat hyödyllisiä kudosten nopeata autoradiografiaa varten, esim. munuaisten mikro-autoradiografiässä.
Lisäksi leimatut, esim. radioaktiivisesti tai 30 fluoresenssisesti leimatut, johdannaiset, jotka ovat * saatavissa syklosporiineista, joissa on -(D)Lys-tähde 8-asemassa, muodostavat ideaalisia komponentteja käytettäväksi esim. RIA- ja FIA-diagnostisissa järjestelmissä. [ (D)Lys]8-syklosporiinin muodostavat täten keinon 35 "kanta"-syklosporiini-merkityn analogin muodostamiseksi, jolla on "kanta"-syklosporiinille ekvivalenttiset si-dosominaisuudet, esim. monoklonaalisten vasta-aineiden 30 93965 suhteen, esim. kuten saadaan esillä olevan keksinnön mukaan tai kuten edellä on määritelty, ja ovat täten hyödyllisiä diagnostisina/koejärjestelmäkomponentteina tai -lisäkomponentteina.
5 Esillä oleva keksintö liittyy siten: 5.1. Syklosporiinin leimattuun johdannaiseen, jossa tähde 8-asemassa on -(D)Lys-; erityisesti 5.2. Kaavan Id mukaiseen syklosporiinin leimattuun johdannaiseen, kuten on määritelty edellä.
10 Termillä "leimattu johdannainen", kuten tässä on käytetty, tarkoitetaan johdannaista, jossa on merkki-tai markkeriatomi tai -ryhmä, joka esim. mahdollistaa tai helpottaa johdannaisen kvantitatiivista määrittämistä tai paikantamista. Tällaisiin johdannaisiin kuuluu 15 johdannaisia, esim. joissa -(D)Lys-tähteen yksi tai useampia atomeja toimii merkki- tai markkeriatomina, esim. radioaktiivinen atomi, samaten kuin johdannaiset, jossa merkki- tai markkeriryhmä on kiinnitetty -(D)Lys-tähteen N-e-atomiin joko suoraan merkki- tai markkeri-20 ryhmän sidoksella mainittuun N-e-atomiin tai merkki- tai markkeriryhmän sidoksella mainittuun N-e-atomiin välissä olevan liitosryhmän välityksellä. Esimerkkejä leimatuista johdannaisista, joihin kuuluu radioaktiivisesti leimattuja johdannaisia, fluoresenssi- ja kemiluminesenssi-25 johdannaisia ja fotoaffiniteettileimaukseen sopivia johdannaisia, so. muodostettu substituentin kanssa, joka reagoi valaisten proteiinin kanssa, johon syklosporiini on liitetty. Radioaktiivisesti leimattuihin johdannaisiin kuuluu, kuten edellä on esitetty, johdannaisia, 30 joissa -(D)Lys-tähteen N-e-atomi 8-asemassa kiinnittyy esim. I-leimattuun p-OH-fenyyli-propionyylitähteen. F-luoresenssi- ja kemiluminenssijohdannaisiin kuuluu, kuten edellä on todettu, johdannaisia, joissa -(D)Lys-tähteen N-e-atomi 8-asemassa kiinnittyy fluoresenssiryh-35 mään, kuten dansyyli- tai rodamiiniryhmään, tai kemiluminenssi ryhmään, kuten akridiniumiesteriryhmään, esim-. kuten on kuvattu artikkelissa elin. Chem. 29, 8, pp 31 93965 1474 - 1479 (1983). Syklosporiinien erääseen erityiseen ryhmään, kuten on määritelty kohdissa 5.1 ja 5.2 edellä, kuuluu siten 5.3 syklosporiinit, joissa tähde 8-asemassa on tähde, 5 jolla on kaava NH-q (CH2)4 10 | -NH-CH-CO- (D) jossa Q on tai jossa siihen kuuluu merkki- tai markkeri-ryhmä, erityisesti radioaktiivisesta leimattu ryhmä, 15 fluoresenssi- tai kemiluminenssiryhmä, esim. kuten on kuvattu spesifisesti edellä.
Leimattuja johdannaisia voidaan, kuten edellä on todettu, valmistaa analogisesti prosessivaiheiden (iv) ja (v) kanssa, esim. käyttäen lähtöaineita, joissa 20 -(D)Lys-tähde 8-asemassa on esileimattu. Vaihtoehtoisesti niitä voidaan valmistaa tuomalla sopiva leimaus-substituentti, esim. -(D)Lys-tähteen N-e-atomissa 8-ase-maan. Täten fluoresenssisesti leimattuja johdannaisia voidaan valmistaa liittämällä fluoresenssiryhmä N-e-ato-. 25 miin esim. N-e-dansyloimalla. Samalla tavoin radioaktii visesta leimattuja johdannaisia voidaan valmistaa liittämällä radioaktiivisesti leimattu substiuentti, esim. I-leimattu p-OH-fenyylipropionyyli, N-e- atomiin. Jälkimmäisessä tapauksessa substituentti voi olla 30 leimatussa muodossa ennen sen liittämistä tai se voidaan . leimata liittämisen jälkeen. Esim. lysiinitähteen N-e- atomi 8-asemassa voi olla reagoinut suoraan 125I-leimatun p-OH-fenyylipropionihapon kanssa tai ei-leimatun p-OH-fenyylipropionihapon kanssa, ja saatu N-e-amidi leima-35 taan sen jälkeen p-OH-fenyyliryhmässä leimausaineella 12SI. Liittämistä voidaan tehostaa tunnetun tekniikan mukaisesti, kuten on tunnettua alalla, esim. reaktion 32 93965 avulla p-OH-fenyylipropionihapon (leimattu tai leimaama-ton) kanssa sen N-hydroksi-sukkini-imidiesterin muodossa .
125I-leimattu p-OH-fenyylipropionihappo itse 5 voidaan valmistaa kloramiini-T-menetelmällä [Hunter and Greenwood, Nature, 194, 495 (1962)]. Kun leimaus toteutetaan liittämisen jälkeen, se voidaan suorittaa käyttäen kloramiini-T-menetelmää tai jodogeeni-menetelmää [Good, J.Clin.-Chem.Clin.Biochem., 19, 1051 (1981)].
10 Keksinnön mukaisten syklosporiinien johdannaisia, jotka ovat mahdollisia leimaukseen, esim., kuten on kuvattu yllä, esim. johdannaiset, joissa ryhmän -(D)Lys- N-e-atomi 8-asemassa on substituoitu ryhmällä, kuten p-OH— fenyylipropionyyli, joka voidaan jodata, ovat keksin-15 nön mukaisten leimattujen johdannaisten välittömiä esiasteita, ja ne katsotaan myös kuuluvan esillä olevan keksinnön piiriin.
Edellä esitetyn mukaan keksintö liittyy näin ollen myös: 20 (ix) Menetelmään leimatun johdannaisen valmistamiseksi, kuten on määritelty jossakin kohdista 5.1 - 5.3 edellä, vapaassa tai suojatussa muodossa, johon menetelmään kuuluu vastaavan ei-leimatun vapaan tai suojatun syklo-sporiinin leimaus esim. liittämällä leimasubstituentti, 25 esim. kuten on kuvattu edellä, -(D)Lys-tähteen N-e-ato-miin 8-asemassa, ja tarvittaessa suorittamalla prosessi-vaihe (iv).
On lisäksi huomattava, että syklosporiineilla, ' joilla on vapaa aminoryhmä, kuten on määritelty kohdassa 30 1.12 edellä, esim. yhdiste [ (D)Lys ]8-syklosporiini, omaavat myös farmaseuttista, erityisesti immunosupres-siivista, tulehdusta vastustavaa ja antiparasiittista (esim. malarian vastaista ja kokkidioosin vastaista) aktiivisuutta, kuten on todettu tavallisissa kokeissa in 35 vivo ja in vitro, esim. eri koemenetelmissä, joita on kuvattu patenttijulkaisussa EP 0 056 782.
Keksinnön yhteydessä on vielä yleisesti todet- 33 93965 tu, että immunogeeniset konjugaatit, joissa kantajamole-kyyli on liittynyt hapteenina toimivaan syklosporiiniin 5-/ 6-, 7- tai e-asemassa, erityisesti 8-asemassa olevan tähteen välityksellä, käsittäen kohdissa 2.1 - 2.3 edel-5 lä määritellyt konjugaatit samaten kuin konjugaatit, jotka saadaan liittämällä syklosporiini, jossa on aminohappo, jossa on reaktiivinen ryhmä jossakin näistä asemista, joka on muu kuin aktivoitu liitosryhmä, kantajaan liitosaineen avulla, ovat kykeneviä kehittämään taval-10 lista polyklonaalista antiseerumia, jolla on korkeampi spesifisyys kuin tähän asti on ollut mahdollista saada esim. konjugaatit, jotka on saatu liittämällä kantaja (Thr)2-syklosporiinin ryhmään -(Thr)2-.
(Termillä "reaktiivinen ryhmä", kuten käytetty 15 edellä, tarkoitetaan mitä tahansa ryhmää, joka sallii tai mahdollistaa liittymisen kantajan kanssa, esim. po-lypeptidiin tai muuhun sopivaan makromolekyyliin. Yleisesti termi tarkoittaa täten edellä määriteltyjä aktivoituja liitosryhmiä, samaten kuin muita ryhmiä, jotka 20 ovat kykeneviä reaktioon, esim. vapaita amino-, karbok-si- tai hydroksiryhmiä).
Immunogeeniset konjugaatit, joissa hapteenina on syklosporiini, liittyneenä kantajaan 5-, 6-, 7- tai 8 asemassa olevan α-aminohappotähteen välityksellä, ovat [ 25 uusia sellaisenaan. Ensisijaisia syklosporiineja, jotka muodostavat tällaisten konjugaattien hapteeniyksikön, ovat erityisesti ne, joissa on aktivoitu liitosryhmä, kuten on määritelty kohdissa 1.8 - 1.11, 1.14 ja 1.15 (kaavat Hb ja Ild) edellä.
30 Esillä olevan keksinnön yhteydessä tuodaan . vielä yleisesti esiin: 2.4 Immunogeeninen konjugaatti, johon kuuluu kantaja liittyneenä syklosporiiniin syklosporiinin 5-, 6-, 7-tai 8-asemassa olevan α-aminihappotähteen välityksellä. 35 2.5 Immunogeeninen konjugaatti, johon kuuluu kantaja liittyneenä syklosporiiniin, jossa on aktivoitu liitos-ryhmä, kuten on määritelty jossakin kohdista 1.8 - 1.11, 34 93965 1.14 tai 1.15 (kaavat Ilb ja Ild) edellä.
2.6 Immunogeeninen konjugaatti, johon kuuluu kantaja liittyneenä syklosporiiniin, jossa on vapaa amino- tai karboksiryhmä, kuten on määritelty jossakin kohdista 5 1.12-1.14 tai 1.15 (kaavat Ib ja Id) edellä, erityi sesti syklosporiini, kuten on määritelty kohdassa 1.14 edellä, tai jolla on kaava Id, kuten määritelty edellä.
3.11 Kohdan 3.9 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, jolloin vaiheessa (a) käytetty syklosporiini on kohdassa 10 2.5 määritelty syklosporiini.
6.1 Vasta-aine (sisälten polyklonaalisen antiseerumin, jossa on vasta-aineita, jotka ovat reaktiivisia syklos-poriinin kanssa), ja joka on reaktiivinen syklosporiinin kanssa, joka on kehittynyt vasteena immunogeeniselle 15 konjugaatille, kuten on määritelty jossakin kohdista 2.4 - 2.6.
6.2 Kohdan 6.1 mukainen vasta-aine, joka on reaktiivinen Syklosporiinin, dihydro-[Val]2-syklosporiinin tai [Nva]2-syklosporiinin, erityisesti syklosporiinin kanssa.
20 Kohdassa 2.5 määriteltyjä immunogeenisiä kon- jugaatteja voidaan valmistaa prosessivaiheen (vi) menetelmillä. Esim. kohdassa 2.6 määriteltyjä immunogeenisiä konjugaatteja voidaan valmistaa edellä kuvatuin menetelmin tai menetelmällä, jossa: 25 (x) Liitetään kantaja syklosporiiniin, jossa on a-ami- nohappotähde, jossa on reaktiivinen ryhmä (so. α-ami-nohappotähde, jossa on sivuketju-a-hiiliatomissa käsittäen tai sisältäen reaktiivisen ryhmän), esim. syklosporiinin, jossa on vapaa amino- tai karboksiryhmä, kuten 30 määritelty yllä jossakin kohdista 1.12 - 1.14 ja 1.15 (kaavat Ib ja Id).
Edellä esitetty prosessi voidaan toteuttaa sinänsä tunnetulla tekniikalla sidostamalla kantaja syklosporiiniin liitosreagenssin välimuodon kautta. Tä-35 ten syklosporiinien, joissa on -(D)Lys-tähde 8-asemassa, ollessa kyseessä, konjugaatteja voidaan saada sidostamalla kantaja, esim. polypeptidi, esim. immunoglobulii- 35 93965 ni, -(D)Lys-(N-€-atomiin, käyttäen karbodi-imidimene-telmää [Kellie et al., "Steroid Immunology", ed. Cameron et al., Alpha. Omega, Cardiff, 1975] tai Mannichreaktion avulla käyttäen formaldehydiä liitosaineena.
5 Sopivia kantajia ovat sellaiset, joihin on jo viitattu konjugaattien valmistuksen yhteydessä monoklo-naalisten vasta-aineiden valmistamiseksi, erityisesti korkean molekyyli painon omaavat polypeptidit, erityisesti proteiinit, kuten seerumialbumiinit, immunoglobulii-10 nit ja synteettiset polymeerit, kuten polyglutamiinihap-po.
Tavalliset polyklonaaliset antiseerumit, kuten on määritelty kohdassa 6.1, joista puuttuu edellä kuvattu ja määritelty monoklonaalisten vasta-aineiden hienos-15 pesifisyys, ovat myös hyödyllisiä, esim. diagnostisen/ koejärjestelmän komponentteina, erityisesti, koska sillä on parantunut spesifisyys syklosporiinien suhteen verrattuna tunnettuihin antiseerumeihin. Niitä voidaan valmistaa käyttäen olennaisesti konventionaalista tek-20 nilkkaa, esim. menetelmällä, jossa: (xi) Muodostetaan immuunivaste sopivassa eläinlajissa antaen jossakin kohdista 2.4 - 2.6 määriteltyä immuno-geenistä konjugaattia ja ottaen talteen tällöin kehittyneet antiseerumit.
25 Edellä määritelty prosessivaihe (xi) voidaan toteuttaa esim. annostamalla immunogeenistä konjugaattia esim. hiirelle, lampaalle tai kananpojalle, esim. ruiskeena. Sopivan inkubointiajän jälkeen antiseerumi otetaan talteen ja lyofilisoidaan sopivasti, esim. myöhem-30 pää käyttöä varten kokeissa, esim. joita on kuvattu alla. Inkubointiaika valitaan sopivasti niin, että se antaa antaa antiseerumititterin, joka on suurempi kuin 1:2000, esim. välillä noin 1:7000 - 1:10000, esim. tavallista RIA-menetelmää käyttäen.
35 Kuten edellä on todettu, keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet ja polyklonaaliset anti-seerumit, samaten kuin merktityt syklosporiinit, ovat 36 93965 kaikki erityisen hyödyllisiä diagnostisten koejärjestelmien, esim. immunokoejärjestelmien komponentteina.
Täten, esillä olevan keksinnön vielä eräs sovellutus tuo esiin: 5 7. Immunokoevälineet tai -järjestelmän, esim. RIA-tai FIA-välineet tai -järjestelmän, syklosporiinikoetta varten, esim. syklosporiini-, esim. Syklosporiini-, koetta varten kohteissa, jotka saavat syklosporiinihoitoa, esim. Syklosporiinihoitoa, joihin välineisiin tai jär-10 jestelmään kuuluu: (A) Vasta-aine tai antiseerumi, kuten on määritelty jossakin kohdista 3.1 - 3.11 tai 6.1 - 6.2 yllä, erityisesti monoklonaalinen vasta-aine, kuten määritelty jossakin kohdista 3.1 - 3.11, ja/tai 15 (B) Jossakin kohdissa 5.1 - 5.3 määritellyn syklospo- riinin merkitty johdannainen, mainittujen välineiden tai järjestelmän komponenttina.
Kohdassa 7 määritellyt välineet ovat hyödyllisiä diagnostisia tarkoituksia varten, esim. määritet-20 täessä veressä, veriplasmassa tai ureassa olevan syklo-sporiinin määriä, esim. keinona määrittää sopiva annostus potilaille, jotka vastaanottavat syklosporiinihoitoa. Tällaiset välineet mahdollistavat syklosporiinien, esim. Syklosporiinin määritysmenetelmän, jolla on tähän 25 asti saavuttamaton herkkyys.
Välineet, esim. RIA- ja FIA-välineet, voivat keksinnön mukaan olla täysin tavanomaista tyyppiä käytettäväksi tavanomaisella RIA- ja FIA-koetekniikalla. Täten RIA-välineisiin kuluu sopivasti antiseerumin tai 30 vasta-aineen lisäksi, esim. (A), sopiva leimattu syklosporiini johdannainen, esim. (B), ja (C) syklosporii-nistandardi. Leimattu syklosporiini johdannainen on komplementaarinen määritettävälle syklosporiinille. Se on sopivasti leimattu johdannainen, kuten on määritelty 35 kohdassa (B), esim. silloin, kun Syklosporiini on tarkoitus määrittää, se on sopivasti [ (D)Lys]8-Syklosporiinin leimattu johdannainen. Kuitenkin se voi olla myös 37 93965 muulla tavoin leimattu komplementaarinen syklosporiini, esim. silloin kun Syklosporiini on analysoitavana, tri-tiatoitu Syklosporiini. Syklosporiinistandardi (C) on yleensä liuos tai sen tapainen, ja siihen kuuluu tunnet-5 tu määrä määritettävää syklosporiinia.
Käytössä, esim. lyofilisoitu antiseerumi/vas-ta-aine liuotetaan ja inkuboidaan yhdessä esim. komponentin (C) kanssa ja joko määritettävän näytteen tai komponentin (C) kanssa. Inkubointi toteutetaan ensisi-10 jaisesti jäähdyttäen esim. lämpötilassa 4 °C. Inkuboin-tiseoksen pH pidetään edullisesti välillä 5-8, esim. noin 7 tai 8, edullisesti puskurointiaineen avulla, kuten sitraatti- tai tris-puskurilla.
Inkubointi kestää sopivasti ainakin 2 h, esim.
15 2 - 12 h. Inkuboinnin jälkeen vasta-aineeseen sitoutunut esim. komponentin (B) fraktio erotetaan ei-sitoutuneesta fraktiosta, esim. käyttäen hiiltä, kuten dekstraanikäsi-teltyä hiiltä. Ei-sitoutunut fraktio adsorboituu hiilen pinnalle ja voidaan sitten erottaa suodattamalla tai 20 sentrifugoimalla. Radioaktiivisuuden määrä fraktiossa mitataan sitten tavanomaisella tekniikalla, esim. nes-tetuikelaskennalla sekundäärisen liuoksen lisäyksen jälkeen. Vasta-aineeseen sitoutuneen komponentin (B) suhde on kääntäen verrannollinen syklosporiinin määrään * 25 tuntemattomassa plasmanäytteessä. Kvantitatiivista ana lyysiä varten on edullista valmistaa standardiksiibroin-tikäyrä syklosporiinin analysointiliuosten kanssa, joilla on tunnettu konsentraatio.
Keksinnön mukaan FIA-välineet voivat olla 30 esim. sellaisia, joissa vasta-aineet ovat sitoutuneena valoa puhdistavaan lisäaineeseen, joka riippuu kilpailusta fluoresoivan syklosporiinin (esim. keksinnön mukainen fluoresenssimerkitty johdannainen) ja vasta-aineen välillä.
35 Vaihtoehtoisesti koevälineet/järjestelmät, kuten on kuvattu kohdassa 7, voivat perustua johonkin konventionaaliseen alalla tunnettuun ELISA-järjestel- 93965 38 mään.
Seuraavassa keksintöä valaistaan esimerkein.
Esimerkki 1: Γ (D)Lys81-Syklosporiinin valmistus (a) Liuoksessa sisältäen 6.4 g H-MeLeu-MeLeu-5 -MeVal-OBzl-maleinaattia, CH2C12 (200 ml) H20 (100 ml) säädetään pH 8 käyttäen kiinteää K2C03. Uuton jälkeen, 2 x, kummallakin kertaa CH2C12 (200 ml), orgaaninen faasi kuivataan Na2S04 päällä, suodatetaan ja haihdutetaan kuiviin, jolloin saadaan vapaa H-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBzl 10 kiteisenä tähteenä.
(b) (N-e-BOC)-FMOC-(D)Lys (6,25 g) liuotetaan CHC13 (100 ml) ja N-metyylimorfoliinia (2,95 g) lisätään sekoittaen. Liuoksen jäähdytyksen jälkeen -20° lisätään pivaloyylikloridia (175 g) tipoittain ja reaktioseosta 15 hämmennetään 6 h ajan lämpötilassa -20 °C. Liuos sisältäen H-MeLeu-MeLeu-MeVal-OBz1 (6,34 g) ja CHC13 (20 ml) lisätään anhydridiliuokseen tipoittain ja sekoitetaan 17 h ajan lämpötilassa -20 °C reaktion saattamiseksi loppuun. CHCl3-liuoksen laimennuksen jälkeen CHC13 (200 ml) 20 kanssa seosta ravistetaan kyllästetyllä NaHC03liuoksella (100 ml). Orgaaninen faasi kuivataan Na2S04 avulla, suodatetaan ja liuotin haihdutetaan kuiviin.
Saatu öljyinen tähde puhdistetaan kromatogra-fisesti käyttäen 25 kertaista määrää silikageeliä (par-25 tikkelikoko 0,063 - 0,20 mm) ja metyleenikloridia 3 % metanolin kanssa eluenttina: [a)2D° = -114,2° (c = 1,0, CHC13) (c) (N-e-BOC)-FMOC-(D)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal--OBzl (8,8 g) liuotettuna absoluuttiseen etanoliin (400 30 ml) hydrataan 10 % palladium/C-katalyytillä (0,6 g) Gastarhydrauslaitteessa, kunnes teoreettinen määrä H2 on kulunut (214 ml). Liuottimen haihdutuksen jälkeen tähde puhdistetaan kromatografisesti käyttäen 50 kertaista määrää silikageeliä (0,063 - 0,20 mm) ja metyleeniklo-35 ridia sekä 7 % metanolia eluenttina: [cr]2D° * -129.1° (c = 1,0, CHC13).
(d) (N-e-BOC)-FMOC-(D)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal— 39 93965 OH (7.1 g) ja H-MeBmt-aAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl (7,4 g) liuotetaan metyleenikloridiin (100 ml), ja N-me-tyylimorfolinia (1,72 g) ja Castro-reagenssia (Bt-OP(N-Me2)*3PF'6) (5,6 g) lisätään huoneenlämpötilassa (25 °).
5 Reaktioseosta hämmennetään 3 pv huoneenlämpötilassa, sitten liuos laimennetaan metyleenikloridilla (200 ml) ja ravistetaan kyllästetyn NaHC03-liuoksen (100 ml) kanssa. Orgaaninen faasi kuivataan Na2S04 avulla, suodatetaan ja haihdutetaan kuiviin. Saatu öljyinen tähde puhdis-10 tetaan kromatografisesti silikageelillä (500 g) (0,06 -0,20) käyttäen metyleenikloridia ja 3 % metanolia elu-enttina: [cr]2D° = -143,8° (c = 1,0, CHC13).
(e) (N-e-BOC)-FMOC-(D)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal--MeBmt-aAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl (5,54 g) se- 15 koitetaan yhteensä 4 h ajan huoneenlämpötilassa liuoksessa, jossa on metyleenikloridia (50 ml) ja piperi-diiniä (10 ml). Liuos haihdutetaan kuiviin ja saatu öljy puhdistetaan kromatografisesti, Sephadex-LH20 (300 g) käyttäen metyleenikloridia ja 3 % metanolia eluentti-20 na: [or]2D° * -165,2° (c = 1,0, CHC13) .
(f) 0,2N NaOH (24 ml) lisätään (N-e-BOC)-H-- (D)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-ctAbu-Sar-MeLeu-Val-Me-Leu-Ala—OBzl (6,48 g) liuotettuna etanoliin (75 ml). 7 h jälkeen säädetään liuoksen pH 8 lisäten tipoittain 2N
25 HC1 jäähdyttäen. Liuoksen haihdutuksen jälkeen saatua tähdettä ravistetaan CH2C12 (200 ml) ja kyllästetyn NaHC03 liuoksessa (200 ml). Vesifaasin kahdesti uuton jälkeen, käyttäen kummallakin kertaa metyleenikloridia (200 ml), orgaaninen faasi kuivataan Na2S04 avulla, 30 suodatetaan ja haihdutetaan. Tuote puhdistetaan kromato-gafisesti silikageelillä (300 g) (0,06 - 0.20 mm) käyttäen metyleenikloridia ja 20 % metanolia eluentti- na: [a]2D° - -169,9° (c = 1,0, CHC13).
(g) ΓProsessivaihe (v)l 35 Dimetyyliaminopyridiniä (147 g) lisätään sekoittaen (N-e-BOC)-H-(D)Lys-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-aAbu-Sar-Me-Leu-Val-MeLeu-Ala-OH (413 mg) liuotettuna metyleeniklo- 40 93965 ridiin (2000 ml). Lisätään propaanifosfonihappoanhyd-ridiä [(0,19 g) 50 % CH2Cl2-liuoksessa], ja reaktioseosta sekoitetaan 24 h ajan lämpötilassa 25°. Saatu liuos pestään kyllästetyllä NaHC03-liuoksella (200 ml), orgaa-5 nlnen faasi kuivataan NaS04 avulla, suodatetaan ja haihdutetaan sekä puhdistetaan kromatografisesti silikagee-lillä (300 g) (0,062 - 0,20) käyttäen metyleenikloridia ja 5 % metanolia eluenttina: [a]zD° = -198,3 (c = 1,0, CHCI3).
10 (h) [Prosessivaihe (lv)1 [ (N-e-BOC)-(D)Lys]e-Syklosporiini (842 mg) jäähdytetään lämpötilaan -20° trifluorietikkahapon kanssa (25 ml) ja sekoitetaan yhdessä 4 h ajan lämpötilassa -20°. Reak-tioliuos sekoitetaan jäähän, kyllästetyn K2C03 (10 ml) 15 kanssa ja uutetaan 3 kertaa metyleenikloridilla (200 ml). Orgaaninen faasi kuivataan Na2S04 avulla, suodatetaan ja liuos haihdutetaan. Saatu orgaaninen raakatuote puhdistetaan kromatografisesti Sephadex LH20 (200 g) avulla käyttäen metyleenikloridia ja 1 % metanolia elu-20 enttina, jolloin saadaan otsakkeen mukainen tuote [(D) Lys]8-syklosporiini: [a]zD° = -204,3° (c = 1,0, CHC13) .
Tuotteena saatava yhdiste voidaan muuttaa myös suolamuotoon tunnetulla tekniikalla. Tyypillisiä suoloja ovat [ (D)Lys]8-Syklosporiinihydrokloridi: [a]zD° = -203° 25 (c = 1,0, CHC13) ja [ (D)Lys]e-Syklosporiinitrifluori- asetaatti: [a]zD° = -203° (c = 1,0, CHC13) .
Esimerkki 2; rN-e-hydroksisukklnyyll)-(D)Lys18 -Syklosporiinin valmistus: Γprosessivaihe (iii)) 255 mg [ (D)Lys ]8-Syklosporiinia, joka valmis-30 tetaan esimerkin 1 mukaan, liuotetaan 20 ml pyridiiniin, ja 36 mg sukkinianhydridiä lisätään. Saatua liuosta sekoitetaan noin 14 h huoneenlämpötilassa, ja pyridini haihdutetaan täysin alipaineessa maksimilämpötilassa 40 °C. Saatu öljyinen tähde puhdistetaan kromatografisesti, 35 55 g Sephadex LH 20, käyttäen metyleenikloridia ja 2 % metanolia ja kerätään 100 ml fraktioina. Puhdas otsakkeen mukainen tuote saadaan fraktioista 15 - 23.
41 93965 NMR-spektroskopia osoittaa sukkinyyliprotonit 2,50 ja ja 2,70 ppm (leveät signaali) ja -CH2~NH--COCH2CH2COOH signaalin 0,25 ppm.
Esimerkki 3; f (O-hydroksisukkinyyli) -Thr )2-Syk-5 losporiinln valmistus; (prosessivaihe (lii)) 6,5 [Thr]2-Syklosporiinia liuotetaan 20 ml pyridiniin, ja 3,66 g 4-dimetyyliaminopyridiiniä sekä 1,5 g sukkinianhydridiä lisätään lämpötilassa 75 °C. Reaktioseosta sekoitetaan 4 h ajan lämpötilassa 75 °C ja 10 laimennetaan sitten 500 ml CH2C12, pestään 5 kertaa, joka kerta 50 ml 2N HC1 käyttäen ja 1 kerran 150 ml H20 käyttäen. Orgaaninen faasi uutetaan, kuivataan Na2S04 avulla ja haihdutetaan sekä puhdistetaan kromatografisesti käyttäen 250 g silikageeliä (0,040 -0,062 mm) etikkaha-15 pon kanssa eluenttina.
Esimerkki 4: f(N-e-sukklnl-lmldo-okslsukkl-nyyll)-(D)LysT8-Syklosporllnin valmistus: Γprosessivaihe im 50 mg [N-e-hydroksisukkinyyli)-(D)Lys]8-Syklo-20 sporiinia, joka valmistetaan esimerkin 2 mukaan, 14 mg N-etyyli-N'-dimetyyliaminopropyyli)-karbodi-imidi HC1, 23,8 mg N-hydroksisukkini-imidiä ja 24,6 mg trietyyli-amiinia sekoitetaan 2 h ajan huoneen lämpötilassa 2 ml metyleenikloridissa, jolloin saadaan puhdas väritön 25 liuos. Saatu liuos laimennetaan 50 ml metyleenkloridilla ja 10 ml H20, ja IN HC1 lisätään tipoittain, kunnes pH on 6. Muodostuu 2-faasinen seos, ja tätä ravistetaan perusteellisesti kunkin HCl-lisäyksen välillä. Orgaaninen faasi ravistetaan lopuksi 10 ml laimean NaHC03~liuoksen 30 kanssa ja kuivataan Na2S04 yläpuolella, suodatetaan, ja *4 liuotin haihdutetaan, jolloin saadaan otsakkeen mukainen tuote.
NMR-spektri osoittaa sukkinyyliprotonit 2,50 ja 2,75 ppm (J = 5 cps) ja N-sukkini-imidoprotonit 2,18 35 ja 2,19 ppm (2S). Tähteellä 8-asemassa on seuraava rakenne : 42 93965 -CO CO-CH2 (D) \h-(CH2)4-NH-CO-(CH2)2-COON^ I -NH^ \o-CH2 5 Esimerkki 5: f(O-sukkini-imido-oksisukkinyy- li)-Thr 12Syklosporiinin valmistus; fprosessivaihe (i)l 54 mg trietyyliamiinia, 98 mg N-hydroksisukki-ni-imidiä ja 102 mg N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopro-pyyli)-karbodi-imidiä lisätään 200 mg [(O-hydroksisuk-10 kinyyli)-Thr ]2-Syklosporiiniin, joka valmistetaan esimerkin 3 mukaan, 10 ml metyleenikloridissa. Lisäystä tehostetaan lämpötilassa 20 °C pitäen kosteus tarkoin poissa. Reaktioseosta sekoitetaan 6 h ajan huoneenlämpötilassa, laimennetaan 200 ml metyleenikloridilla ja 15 ravistetaan 50 ml H20. Vedellisen faasin pH säädetään 5 - 6 lisäten tipoittain IN HC1 ja ravistetaan. Vedellinen faasi uutetaan 100 ml metyleenikloridilla, ja orgaaniset faasit pestään 0,1N NaHC03, kuivataan Na2S04 avulla, suodatetaan ja haihdutetaan. Tähde puhdistetaan kromato-20 grafisesti käyttäen 100 g silikageeliä, etyyliasetaatti eluenttina, jolloin saadaan otsakkeen mukainen tuote: [a]zD° = -178° (c = 1,0, CHC13). ^-NMR, CDC13, osoittaa sukkini-imidoprotonit, 280 ppm singletti ja suk-kinyyliprotonit 2,60 ppm multipletti. Tähteellä 2-ase-25 massa on seuraava rakenne.
-CO O co-ch2 \ i / CH-CH (CH3) -0-C-CH2-CH2-C00N 30 / \ -NH CO-CH2
Esimerkki 6: f(N-(3-(2-pyridyyli)ditio)prop-ion-l-yyli)-(D)Lysl8-Syklosporiinin valmistus: Tprosessi-35 vaihe (ii) 1 35 mg sukkinyyli-3[(2-pyridyyli)ditio]propio-naattia lisätään liuokseen, jossa on 126 mg ((D)Lys]8--Syklosporiinin 10 ml metyleenikoridissa, lämpötilassa 43 93965 20 °C ja sulkien kosteus tarkoin pois. Reaktioseosta sekoitetaan 6 h ajan huoneen lämpötilassa, laimennetaan 200 ml metyleenikloridilla, ja ravistetaan 50 ml kyllästetyllä NaHCH3. Vedellinen faasi uutetaan 150 ml mety-5 leenikloridilla, orgaaninen faasi pestään H20, kuivataan Na2S04 avulla, ja suodatetaan sekä haihdutetaan. Amorfinen tähde puhdistetaan kromatografisesti käyttäen 100 g silikageeliä, metyleenikloridi/metanolia (95:5) eluent-tina, jolloin saadaan otsakkeen mukainen tuote puhtaa-10 na: [a]2D° = -165° (c = 1,0, CHC13). Tähteellä 8-asemassa on kaava: ’co\ Ν“Λ (D^CH- (CH2)4-NH-C0-CH2-CH2-S-S-^ Λ 15 -NH \ss/
Esimerkki 7: Kohdassa 2.1 määritellyn tyyppisten immunoqeenlsten syklosporllnlkantalakonjugaattien valmistus: fprosessivaihe (vi)) 20 7.1 Konjuqaatti kananpojan τ-qlobuliinin kans sa 10 mg [(N-e-sukkini-imido-oksisukkinyyli)-(D)-Lys ]e-syklosporiinia, joka valmistetaan esimerkin 4 menetelmän mukaan, 0,2 ml dimetyyliformamidissa lisätään 25 100 mg kananpojan r-gammaglobuliiniin 4 ml NaHC03 (1,5 %, p/til., pH 8,1). Reaktioseosta sekoitetaan noin 2 h ajan huoneenlämpötilassa, ja saatu konjugaatti puhdistetaan dialyysillä fosfaattipuskuroitua suolaliuosta vasten.
7.2 konjugaatti kananpojan ovalbumiinin kanssa 30 10,7 mg [(O-sukkini-imido-oksisukkinyyli)Thr]2- syklosporiinia, joka valmistetaan esimerkin 5 mukaan, sisältäen lisäksi 10 % ditritratoitua ainetta (1-2 yCi/mg, saatu analogisesti esimerkin 5 kanssa, mutta käyttäen tritratoitua [Thr]2 syklosporiinia lähtöaineena) 35 100 μΐ dimetyyliformamidissa, lisätään sekoittaen voi makkaasti 30,45 mg kananpojan ovalbumiiniin 2 ml, 1,5 % NaHC03 puskurissa (mooliylimäärä syklosporiini/ovalbumii- 44 93965 ni = 10,68). Reaktioseosta sekoitetaan 2 h ajan normaalissa lämpötilassa, ja saatu konjugaatti puhdistetaan dialyysin avulla 3 kertaa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta vasten 18 h ajan lämpötilassa 4 °C. Konjugaatti-5 tuotteen osalta, 55,7 % lisätystä radioaktiivisuudesta todetaan liittyneen ovalbumiiniin, joka osoittaa sidos-suhteeksi syklosporiini/ovalbumiini 5,95.
Syklosporiinin kovalenttisen sidoksen ovalbumiiniin arvioitiin olevan asetonisaostuksessa 3 konju-10 gaatin tasajaollisen luvun perusteella. 39,5 % radioaktiivisuudesta, vastaten ei-kovalenttisesti sidottua syklosporiinia, määritetään asetonin ylimäärästä, joka antaa lopulliseksi kovalenttiseksi sidossuhteeksi syklosporiini/ovalbumiini 3,6. Saatu konjugaatti saatettiin 15 liuosmuotoon ja säilytettiin lämpötilassa -20 °C.
Samanlaisia konjugaatteja voidaan valmistaa analogisesti esimerkin 7.1 ja 7.2 kanssa mutta käyttäen esimerkin 6 mukaista tuotetta syklosporiinilähtöaineena.
Esimerkki 8: Kohdissa 2.4/2.6 määritellyn 20 tyyppisten immunoqeenlsten syklosporiinlkantalakonju-qaattien valmistus; fprosessivaihe (x)T
8.1 Konjugaatti marsun IqG kanssa
Marsun IgG (30 mg) liuotetaan 0,1M bikarbo-naattipuskuriin (pH 9, 0,5 ml) ja lisätään 1 mg [(D)Lys]e 25 -Syklosporiinin, joka on saatu esimerkin 1 mukaan, vastaavaan puskuriliuokseen (0,5 ml), ja muutamia tippoja 1 % etikkahappoa lisätään. Liittämistä tehostetaan lisäten 2 annosta N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbo-di-imidihydrokloridia (jokainen lisäys 100 mg). Reak-30 tiotuote valmistetaan injektiota varten 24 h myöhemmin moninkertaisella dialyysillä vettä vasten, jota seuraa lyofilisaatio.
8.2 Konjugaatti kanin IqG kanssa [ (D)Lys]e-Syklosporiinia (10 mg), joka on 35 valmistettu esimerkin 1 menetelmän mukaisesti, liuotetaan 0,1 ml etanoli liuokseen, jossa on 6,9 pg (=0,1 mCi) tritiatoitua [ (D)Lys]e-Syklosporiinia. 0,1 ml pyridiiniä 45 93965 ja 0,1 ml 35 % formaldehydiä lisätään, ja seosta pidetään 30 min huoneen lämpötilassa. 20 mg kanin IgG 0,02M fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (1 ml) ja 0,3 ml pyridiiniä lisätään, ja reaktioseoksen annetaan seistä 5 noin 14 h ajan huoneen lämpötilassa. Saatu konjugaatti dialysoidaan 30 % pyridiiniä, 10 % pyridiiniä ja lopuksi 0,005M fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta vasten. Konju-gaatin sidostusnopeus on 1:11,4.
Esimerkki 9: Hybridoomasolulinjojen valmistus, 10 jotka tuottavat syklosporilnin kanssa reaktiivisia mono-klonaalisia vasta-aineita: fprosessivaihe (viii)1 9.1 Esimerkin 7.1 konjuqaattia käyttäen (a) Immunisaatio
Naaraspuolisille Balb/c hiirille (20 - 25 g) 15 annettiin kullekin 100 μς esimerkin 7.1 tuotteena saatavaa immuogeenistä konjugaattia 0,2 ml täydellisessä Freund'n adjuvantissa, annostelu ruiskeina i.p. 2 Viikon kuluttua annetaan tehostusruiskeena 50 μς esimerkin 7.1 tuotetta emulsioituna 0,2 ml täydelliseen Freund'n adju-20 vanttiin ruiskeena i.p. Syklosporiiniin nähden reaktiivisten vasta-aineiden läsnäolo käsiteltyjen hiirien seerumissa varmistetaan tavanomaisella RIA-kokeella, jossa käytetään tritium-merkittyä syklosporiinia merkkiaineena.
25 (b) Hybridooman muodostus
Vaiheesta (a) saatavat hiiret, jotka osoittavat maksimaalisia syklosporiinireaktiivisia vasta-aine-tittereitä, saavat tehosteruiskeen i.v., jossa on 20 μς esimerkin 3.2 tuotetta suolaliuoksessa 0,85 % p/til).
30 Hiiret tapetaan 4. päivänä, ja pernasolut eristetään ja fuusioidaan hiiren (Balb/C) myeloomasolujen kanssa menetelmillä, joita ovat kuvanneet S. Fazekas et ai., J. Immunol. Methods, 35, 1-21 (1980).
Kasvavat hybridoomat seulotaan syklosporiiniin 35 nähden reaktiivisen vasta-aineen tuoton suhteen tavallisella RIA-määritystekniikalla käyttäen tritium-leimattua syklosporiinia merkkiaineena, ja syklosporiinin 12 kans- 46 93965 sa alhaisen ristireaktiivisuuden suhteen jälleen tavallisella RIA-määritystekniikalla käyttäen tritium-leimattua Syklosporiinia merkkiaineena ja syklosporiinia 17 kilpailevana ligandina.
5 Yksi valittu hybridoomalinja todetaan, joka muodostaa monoklonaalista vasta-ainetta, joka on reaktiivinen Syklosporiinin kanssa ja jolla on alhainen ristireaktiivisuus syklosporiinin 22. kanssa. Vasta-aineelle on ominaista kuuluminen luokkaan IgG, sivuluokka 10 IgGx. Saatu IC50~arvo reaktiivisuudelle Syklosporiinin kanssa, RIA, on 6,7 ng/ml, verrattuna 280 ng/ml syklos-poriinilla 12· Ristireaktiivisuus syklosporiinin 17 kanssa on täten kertaluokkaa vain 2 %. Määritetty af-finiteettivakio syklosporiinin suhteen on kertaluokkaa 15 10'9 mol/1.
On ilmeistä, että sovellettaessa esillä olevan keksinnön mukaista tekniikkaa, kuten tässä on yleisesti selvitetty, erityisesti syklosporiinien käyttö, joissa on aktivoitu liitosryhmä, esim. kuten on määritelty 20 jossakin kohdista 1.1 - 1.11, 1.14 tai 1.15 (kaavat Ha, Hb, Ile - Ild) immunogeenisten konjugaattien valmistamiseksi, ja toimien esim. analogisesti tämän esimerkin yleisten menetelmien kanssa, hybridoomalinjoja/mono-klonaalisia vasta-aineita voidaan helposti valmistaa, 25 jotka, vaikkakaan eivät ole identtisiä tämän esimerkin erityisen hybridoomalinjan/monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, täyttävät samat olennaiset kriteeriot, esim. osoittavat ekvivalentteja tai jopa parempia ominaisuuksia, kuin mitä yllä on kuvattu. Tämä on ilmeistä seuraa-30 van esimerkin tuloksista.
9.2 Esimerkin 7.2 konjugaatin käyttö (a) Immunisointi
Hiirille (Balb/c) annettiin kullekin 100 uq esimerkin 7.2 immunogeenistä konjugaattituotetta 200 μΐ 35 fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa/Freund'n adjuvan-tissa (1:1). Ensimmäinen annostelu (täydellinen Freund*n adjuvantti) toteutettiin annostuksella s.c. jalka-antu- 47 93965 roiden ihoon, lähelle häntää ja lähelle niskaa. Kolmen viikon kuluttua seuraa toinen ja kolmas annostus (epätäydellinen Freund'n adjuvantti), joka toteutetaan annostuksella s.c. selkään ja vast, annostuksella i.m. ta-5 kajalkoihin. Verinäytteet kootaan 1 viikon kuluttua 2. ja 3. annostuksista.
Hiiret valitaan seuraavaa käyttöä varten seu-raavien mitattujen antiseerumikriteerioiden perusteella: 1. Titteri nestefaasissa RIA ja ELISA; 10 2. Ilmeinen isotyyppijakauma (vain IgGx tai IgGlt2a*2b' ELISA); 3. Suhteellinen aviditeetti, ELISA; 4. Kapasiteetti erottaa Syklosporiinin ja syklosporii-nin 17_ sekä syklosporiinin 18 välillä kilpailevassa 15 ELISA.
Valituille hiirille annetaan tehosteruiskeet päivinä -3, -2 ja -1 ennen fuusioita käyttäen 100 μg esimerkin 7.2 immunogeenistä konjugaattia 200 μΐ, 9 % NaCl, ruiskeena i.p. 50 % ja i.v. 50 % -3, ja i.p.
20 (100 %) päivinä -2 ja -1.
(b) Hybridooman muodostus 2,5 x 10'7 tai 5 x 10"7 pernasolua kustakin hiirestä yhdistetään 5 x 10"7 hiirien (Balb/c) myelooma-soluihin käyttäen PEG 4000 ja jaettuina 24 x 24 kaivoi-25 hin.
Viljelmäsupernatantit seulotaan ELISA avulla vasta-aineiden läsnäolon suhteen, jotka vasta-aineet tunnistavat naudan seerumialbumiiniin liittyneen [Thr]2-Syklosporiinin (valmistettu analogisesti esimerkin 7.2 30 kanssa) ja/tai naudan seerumialbumiiniin liittyneen [(D)Lys]*-Syklosporiinin (valmistettu analogisesti esimerkin 7.1 kanssa) vapaan naudan seerumialbumiinin ollessa läsnä negatiivisena vertailunäytteenä. Valitut igG tuottavat hybridoomalinjat kloonataan monoklonaalisuuden 35 varmistamiseksi.
Saatujen hybridoomalinjojen tuottamien mono-klonaalisten vasta-aineiden tunnistus-/erotuskyky (a) 48 93965
Syklosporiinin ja (b) syklosporiinin 17 ja syklosporii-nin 1J3 välillä testataan epäsuoralla ELISA kilpailufor-maatilla, kuten on kuvannut Quesniaux et ai./ Immunology Letters, 9, 99 - 104, (1985), erilaisissa puskurointi-5 järjestelmissä, joihin kuuluu: fosfaattipuskuroitu suolaliuos/ pH 7/5/ 0/03 % Tween 20 kanssa tai sitä ilman; ja Tris, pH 7,5, 0,03 % Tween kanssa ja ilman NaCl. Optimaaliset olosuhteet erotusta varten havaitaan yleensä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, pH 7,5, 140 mM 10 NaCl ja 0,03 % Tween 20 kanssa. Tutkituista 9 kloonilin-jasta 7 tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat erotuskykyisiä (a) Syklosporiinin ja (b) syklospo-riinien 12 ja 1J1 välillä. Kuudella IC50~suhde syklospo-riiniin 12 Syklosporiiniin verrattuna on noin 35 kertai-15 nen tai suurempi.
Esimerkki 10: Syklosporiinin kanssa reaktii
visten tavallisten polyklonaalisten antiseerumeiden valmistus: fprosessivaihe (xi)I
Lampaita immunisoitiin takajalkaan lihaksensi-20 säisillä ruiskeilla 10 kertaa noin 14 pv välein. Ruiskeet sisältävät esimerkin 8.1 immunogeenisen proteiinikon jugaattituotteen lyofilisaattia (3 mg), Alugel S (0,2 ml) ja Freund'n adjuvanttia (0,6 ml). Lopullinen titte-ri, joka on saatu vasten tritiatoitua Syklosporiinia, 25 on 1/100 000 mitattuna RIA avulla.
Löydettyjen polyklonaalisten antiseerumien todetaan osoittavan parantunutta erotuskykyä Syklosporiinin ja sen metaboliittisyklosporiinin Γ7 välillä verrattuna polyklonaalisiin antiseerumeihin, jotka on 30 saatu käyttäen tekniikan tasosta tunnettua [Thr]2-syklos-poriini-IgG-konjugaatteja, esim. joita käytetään nykyisissä Syklosporiini-RIA-koevälineissä. Esillä olevan esimerkin mukaan saatujen antiseerumeiden ristireaktii-visuus syklosporiinin 17_ kanssa on suuruusluokkaa noin 35 18 % verrattuna noin 42,0 % tunnetuilla polyklonaalisil- la antiseerumeilla.
49 93965
Esimerkki 11; Kohdassa 5.1 määriteltyjen syk-losporiinien leimattujen lohdannaisten valmistus: Γp-rosessivaihe (ix)l 11.1 f N-e-TRITC-(D)Lys 1e-Syklosporiinin val- 5 mistus [ (D)Lys]e-Syklosporiinia (15 mg), joka on valmistettu esimerkin 1 mukaan, liuotetaan metyleeniklo-ridiin (2 ml). Rodamiini-isotiosyanaattia, (TRITC) (5,3 mg) lisätään, ja reaktioseoksen annetaan seistä lämpö-10 tilassa -7 °C 17 h ajan. Intensiivisen punainen liuos kromatografoidaan välittömästi, Sephadex LH20 (20 g), metyleenikloridia ja 0,5 % metanolia käyttäen. Fraktiot kootaan 10 ml annoksina.
Otsikon mukainen tuote saadaan öljynä frakti-15 öistä 5 - 7 ja 10 - 14: UV absorptio: 300 nm/fluore-senssiemissio: 540 nm. Jännöksellä 8-asemassa on rakenne: CH3 CH-
H
S - C
4h 30 '(CH,).
- NH- CH - CO - (0) 35 11.2: ΓΝ-e-dansyyli-(D)Lys 18-Syklosporiinin valmistus [ (D)Lys ]8-Syklosporiinia (232 mg), joka on 50 93965 valmistettu esimerkin 1 mukaan, liuotetaan kloroformiin (15 ml).
Etyyli-di-isopropyyliamiinia (7,3 mg) ja dansyyliklori-dia (99,5 mg) lisätään, ja reaktioseosta sekoitetaan 2 h 5 ajan. Tuote kromatografoidaan välittömästi, Sephadex LH20 (100 g), metyleenikloridia ja 0,5 % metanolia käyttäen. Fraktiot kootaan 10 ml annoksina.
Kootut fraktiot haihdutetaan kuiviin, ja saatava tuote kromatografoidaan uudelleen käyttäen silika-10 geeliä (0,06 - 0,20 mm) (lOOg), metyleenikloridia ja 5 % metanolia. Fraktiot kootaan 15 ml annoksina.
Fraktiot 28 - 44 antavat puhtaan tuotteen: [a]2D° -183,8°, c = 1,08, CHC13.
Θ 125 11.3 f(D)Lys1 -Syklosporiinin jodatun joh-15 dannalsen valmistus
Otsikon mukainen tuote valmistetaan analogisesti menetelmillä, joita ovat kuvanneet Bolton ja Hunter [Biochem. J. 133, 529 (1973)], kiinnittämällä p-OH- fenyylipropionyylitähde esimerkin 1 mukaisesti 20 valmistetun [ (D)Lys]8-Syklosporiinin 8-asemassa olevan tähteen N-e-atomiin. I-merkki siirtyy tähteen CO- 25 “°·(~) -<CH2)2-C0-NH-(CH;)4-CH (D) ciSu L.
fenyylirenkaassa.
30 Puhdistus toteutetaan HPLC avulla 4 x 250 kolonnissa, RP18, lineaarisella gradientilla ja käyttäen nestefaasina 10 - 30 % n-propanoli/0,2 % trifuorietikka-happoa 5 % etikkahappo/ 0,2 % trifluorietikkahapossa.
Claims (7)
1. Monoklonaalinen vasta-aine, joka on reaktiivinen syklosporiinille, tunnettu siitä, että 5 monoklonaalisella vasta-aineella on alhainen ristireak-tiivisuus ainakin yhden syklosporiinin ihmisessä esiintyvän metaboliitin kanssa ja että monoklonaalinen vasta-aine on aikaansaatu vasteena immunogeeniselle konjugaa-tille, johon kuuluu kantaja, joka on liittynyt syklospo- 10 riinihapteenin 2- tai 8-asemaan aktivoidun liitosryhmän avulla, jolloin aktivoitu liitosryhmä on ryhmä, joka kykenee reagoimaan suoraan sopivan, sille reaktiivisen ryhmän kanssa kovalenttisen sidoksen muodostamiseksi hapteenin ja kantajan välille ilman, että tarvitaan 15 karbodi-imidireagenssia mahdollistamaan, aiheuttamaan tai edistämään tätä reaktiota.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että im-munogeenisen konjugaatin syklosporiinihapteeni koostuu 20 [ (D)Lys]8-Syklosporiinista, joka on liittynyt kantajaan hapteenin [(D) Lys ] 8-tähteestä.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että im-munogeenisen konjugaatin syklosporiinihapteeni koostuu 25 [Thr]2-Syklosporiinista, joka on liittynyt kantajaan hapteenin [Thr ]2-tähteestä.
4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine on reaktiivinen Syklosporii- 30 nille ja omaa alle 5 % ristireaktiivisuuden ELISA-määri-tyksellä määritettynä ainakin yhden metaboliitin kanssa, joka voi olla Syklosporiini 1, 8, 10, 16, 17, 18 tai 21.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että metabo- 35 liitti on Syklosporiini 17 tai 18.
6. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksista 1 -5 mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, 52 93965 tunnettu siitä, että menetelmässsä: a) syklosporiinin, jossa on aktivoidun liitosryhmän sisältävä α-aminohappotähde, annetaan reagoida kantajan 5 kanssa immunogeenisen konjugaatin muodostamiseksi, b) saatua immunogeenistä konjugaattia annetaan sopivalle eläinlajille immunogeenisen altistumisen aikaansaamiseksi, ja konjugaatille herkistetyt, vasta-ainetta tuot- 10 tavat solut otetaan talteen, c) saadut vasta-ainetta tuottavat solut tehdään immor-taaleiksi, ja 15 d) monoklonaalinen vasta-aine otetaan talteen valitusta, näin muodostetusta immortalisoidusta solulinjasta.
7. Immunomäärityskitti tai -järjestelmä syk-losporiinitasojen seuraamiseksi verestä, tunnet-t u siitä, että kitti tai järjestelmä sisältää jonkin 20 patenttivaatimuksista 1-5 mukaista monoklonaalista vasta-ainetta. 53 93965
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB848425040A GB8425040D0 (en) | 1984-10-04 | 1984-10-04 | Organic compounds |
GB8425040 | 1984-10-04 | ||
GB858515673A GB8515673D0 (en) | 1985-06-20 | 1985-06-20 | Organic compounds |
GB8515673 | 1985-06-20 | ||
PCT/EP1985/000501 WO1986002080A1 (en) | 1984-10-04 | 1985-09-27 | Monoclonal antibodies to cyclosporings |
EP8500501 | 1985-09-27 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI862370A FI862370A (fi) | 1986-06-03 |
FI862370A0 FI862370A0 (fi) | 1986-06-03 |
FI93965B FI93965B (fi) | 1995-03-15 |
FI93965C true FI93965C (fi) | 1995-06-26 |
Family
ID=26288301
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI862370A FI93965C (fi) | 1984-10-04 | 1986-06-03 | Monoklonaalisia vasta-aineita syklosporiineille |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
EP (4) | EP0314862A1 (fi) |
JP (1) | JPH074269B2 (fi) |
KR (1) | KR910002691B1 (fi) |
AT (1) | ATE92501T1 (fi) |
AU (4) | AU589917B2 (fi) |
CA (1) | CA1309671C (fi) |
CY (2) | CY1915A (fi) |
DE (2) | DE3587342T2 (fi) |
DK (1) | DK172037B1 (fi) |
ES (1) | ES8702949A1 (fi) |
FI (1) | FI93965C (fi) |
HK (2) | HK78696A (fi) |
NO (1) | NO173557C (fi) |
NZ (1) | NZ213680A (fi) |
WO (1) | WO1986002080A1 (fi) |
Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5239057A (en) * | 1987-03-27 | 1993-08-24 | Abbott Laboratories | Fluorescence polarization assay for cyclosporin a and metabolites and related immunogens and antibodies |
US5427960A (en) * | 1987-03-27 | 1995-06-27 | Abbott Laboratories | Fluorescence polarization assay for cyclosporin A and metabolites and related immunogens and antibodies |
EP0283801A3 (en) * | 1987-03-27 | 1990-05-30 | Abbott Laboratories | Fluorescence polarization assay for cyclosporin a and metabolites and related immunogens and antibodies |
US5698448A (en) * | 1988-12-02 | 1997-12-16 | Soldin; Steven J. | Immunosuppressive drug binding proteins and use |
JPH04502328A (ja) * | 1988-12-05 | 1992-04-23 | ザ・トラステイーズ・オブ・コロンビア・ユニヴアーシテイ・イン・ザ・シテイ・オブ・ニユー・ヨーク | シクロスポリンaの新規誘導体、それに対する抗体及びその使用 |
GB8916901D0 (en) | 1989-07-24 | 1989-09-06 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
ES2084069T3 (es) * | 1990-08-15 | 1996-05-01 | Abbott Lab | Reactivos de inmunoensayo y metodo para la determinacion de ciclosporina. |
CA2048302A1 (en) * | 1990-08-15 | 1992-02-16 | Victoria P. Meucci | Solubilization reagent for biological test samples |
DE69133095T2 (de) | 1990-11-20 | 2003-03-27 | Dade Behring Marburg Gmbh | Cyclosporin-Immunoassay |
GB9307491D0 (en) | 1993-04-08 | 1993-06-02 | Sandoz Ltd | Organic compounds |
USRE40596E1 (en) * | 1993-04-08 | 2008-12-02 | Novartis Ag | Rapamycin assay |
AU9203898A (en) * | 1997-08-26 | 1999-03-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Cyclosporin a conjugates and uses therefor |
US6270957B1 (en) | 1997-08-26 | 2001-08-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Non-Imuunosuppressive cyclosporins and their use in the prevention and treatment of HIV infection |
US5990274A (en) * | 1997-11-25 | 1999-11-23 | Dade Behring Inc. | Cyclosporine derivatives and uses thereof |
JP4350898B2 (ja) | 1998-07-01 | 2009-10-21 | デビオファーム・ソシエテ・アノニム | 活性の特徴が改善された新規のシクロスポリン |
US6686454B1 (en) | 1998-10-09 | 2004-02-03 | Isotechnika, Inc. | Antibodies to specific regions of cyclosporine related compounds |
AU763822B2 (en) | 1998-10-09 | 2003-07-31 | Isotechnika, Inc. | Methods for the production of antibodies to specific regions of cyclosporine and cyclosporine metabolites |
PL210795B1 (pl) | 2001-10-19 | 2012-03-30 | Isotechnika Inc | Sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (E), sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (Z), sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (E) ISATX247, sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (Z) ISATX247 i sposób wytwarzania mieszaniny izomerów ISATX247 |
JP5174898B2 (ja) | 2007-05-24 | 2013-04-03 | アボット・ラボラトリーズ | 疎水性薬物検体代謝産物との交差反応性が低下している免疫アッセイ |
TW200932240A (en) | 2007-10-25 | 2009-08-01 | Astellas Pharma Inc | Pharmaceutical composition containing lipophilic substance which inhibits IL-2 production |
CA2910133C (en) * | 2008-05-23 | 2018-02-27 | The University Of British Columbia | Modified drugs for use in liposomal nanoparticles |
WO2010088573A1 (en) | 2009-01-30 | 2010-08-05 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | Cyclosporin analogues for preventing or treating hepatitis c infection |
US8481483B2 (en) | 2009-02-19 | 2013-07-09 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | Cyclosporin analogues |
US8367053B2 (en) | 2009-07-09 | 2013-02-05 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | Cyclosporin analogues |
US8349312B2 (en) | 2009-07-09 | 2013-01-08 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | Proline substituted cyclosporin analogues |
US8685917B2 (en) | 2009-07-09 | 2014-04-01 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | Cyclosporin analogues |
US8623814B2 (en) | 2010-02-23 | 2014-01-07 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | Antiviral agents |
US9428845B1 (en) | 2010-12-28 | 2016-08-30 | Warp Drive Bio, Inc. | Identifying new therapeutic agents |
WO2012145427A1 (en) | 2011-04-18 | 2012-10-26 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods to treat cancer using cyclosporine and cyclosporine derivatives |
US8906853B2 (en) | 2012-11-28 | 2014-12-09 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | [N-Me-4-hydroxyleucine]-9-cyclosporin analogues for treatment and prevention of hepatitis C infection |
AU2014311346A1 (en) | 2013-08-26 | 2016-03-17 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | Cyclosporin analogues for preventing or treating hepatitis C |
WO2016073480A1 (en) | 2014-11-03 | 2016-05-12 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | Novel cyclosporin analogues for preventing or treating hepatitis c infection |
EP4289950A3 (en) | 2015-01-09 | 2024-01-24 | Revolution Medicines, Inc. | Macrocyclic compounds that participate in cooperative binding and medical uses thereof |
US9989535B2 (en) * | 2015-10-01 | 2018-06-05 | Warp Drive Bio, Inc. | Methods and reagents for analyzing protein-protein interfaces |
MA44680A (fr) | 2016-04-12 | 2019-02-20 | Warp Drive Bio Inc | Compositions et procédés pour la production de composés |
WO2018081592A2 (en) | 2016-10-28 | 2018-05-03 | Warp Drive Bio, Inc. | Compositions and methods for the production of compounds |
MX2022005360A (es) | 2019-11-04 | 2022-06-02 | Revolution Medicines Inc | Inhibidores de ras. |
CR20220240A (es) | 2019-11-04 | 2022-08-03 | Revolution Medicines Inc | Inhibidores de ras |
JP2022553858A (ja) | 2019-11-04 | 2022-12-26 | レボリューション メディシンズ インコーポレイテッド | Ras阻害剤 |
JP2023541916A (ja) | 2020-09-15 | 2023-10-04 | レボリューション メディシンズ インコーポレイテッド | がんの治療における、ras阻害剤としてのインドール誘導体 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB211526A (en) | 1922-09-22 | 1924-02-22 | John Fletcher Holliday | Improvements in and relating to chain grate stokers |
CH614931A5 (fi) | 1975-11-04 | 1979-12-28 | Sandoz Ag | |
US4210581A (en) | 1975-11-04 | 1980-07-01 | Sandoz Ltd. | Organic compounds |
DE2819094A1 (de) | 1977-05-10 | 1978-11-23 | Sandoz Ag | Cyclosporin-derivate, ihre verwendung und herstellung |
EP0034567B1 (en) * | 1980-02-14 | 1984-11-07 | Sandoz Ag | A method for the total synthesis of cyclosporins and novel cyclosporins |
IL62965A0 (en) | 1980-07-17 | 1981-07-31 | Scripps Miles Lab Inc | Monoclonal antibodies to drugs and theri production |
EP0056782B1 (en) | 1981-01-09 | 1984-08-01 | Sandoz Ag | Novel cyclosporins |
GB8407618D0 (en) | 1984-03-23 | 1984-05-02 | Sandoz Ltd | Organic compounds |
CH667274A5 (de) | 1984-03-23 | 1988-09-30 | Sandoz Ag | Cyclosporine, ihre herstellung und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen. |
-
1985
- 1985-09-27 DE DE88104793T patent/DE3587342T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-27 AT AT85905210T patent/ATE92501T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-09-27 EP EP88104792A patent/EP0314862A1/en not_active Withdrawn
- 1985-09-27 EP EP88104793A patent/EP0290762B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-27 EP EP85905210A patent/EP0198026B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-27 AU AU49671/85A patent/AU589917B2/en not_active Expired
- 1985-09-27 EP EP88104791A patent/EP0314861A1/en not_active Ceased
- 1985-09-27 DE DE85905210T patent/DE3587505T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-27 JP JP60504679A patent/JPH074269B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-27 WO PCT/EP1985/000501 patent/WO1986002080A1/en active IP Right Grant
- 1985-09-27 CY CY191585A patent/CY1915A/xx unknown
- 1985-10-02 CA CA000492047A patent/CA1309671C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-02 NZ NZ213680A patent/NZ213680A/xx unknown
- 1985-10-02 ES ES547495A patent/ES8702949A1/es not_active Expired
-
1986
- 1986-06-02 NO NO862177A patent/NO173557C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-06-03 KR KR1019860700333A patent/KR910002691B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-06-03 DK DK261386A patent/DK172037B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-06-03 FI FI862370A patent/FI93965C/fi not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-07-31 AU AU39141/89A patent/AU3914189A/en not_active Abandoned
- 1989-07-31 AU AU39142/89A patent/AU3914289A/en not_active Abandoned
- 1989-07-31 AU AU39143/89A patent/AU3914389A/en not_active Abandoned
-
1996
- 1996-05-02 HK HK78696A patent/HK78696A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-07-11 HK HK124696A patent/HK124696A/xx not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-05-16 CY CY192797A patent/CY1927A/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI93965C (fi) | Monoklonaalisia vasta-aineita syklosporiineille | |
US5169773A (en) | Monoclonal antibodies to cyclosporins | |
FI94419C (fi) | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen membraaniankkuri-vaikuttava-ainekonjugaatin valmistamiseksi | |
JP3433952B2 (ja) | シクロスポリン免疫アッセイ | |
KR100304201B1 (ko) | 환상의부착저해제 | |
JPH11508275A (ja) | 代謝に対する安定性および細胞膜透過性が改善されたペプチドおよびペプチド核酸の環状プロドラッグ | |
US5334702A (en) | Compositions which are immunologically crossreactive with antibodies and preparative methods therefor | |
JP4307252B2 (ja) | イムノアッセイにおいて有用なプロテアーゼインヒビターコンジュゲートおよび抗体 | |
US5712105A (en) | Monoclonal antibody to human glicentin, hybridoma for producing said antibody and assay method for human glicentin using said antibody | |
FR2482861A1 (fr) | Procede de preparation d'un antigene et d'un anticorps du glucagon intestinal | |
JPH11505804A (ja) | I型コラーゲンの架橋結合されたn−テロペプチドの合成ペプチド同族体 | |
JP3714942B2 (ja) | 生物体液中のバンコマイシンの検出および定量化用試薬および方法 | |
JP2008523011A (ja) | イムノアッセイで有用なサキナビル誘導体 | |
EP1498415B1 (en) | Ecstasy-class derivatives, immunogens, and antibodies and their use in detecting ecstasy-class drugs | |
CA1338653C (en) | Labeled derivatives of cyclosporins | |
JPH08511164A (ja) | ブレキナールおよび類縁体の検出のためのイムノアッセイ試剤および方法 | |
US6582700B1 (en) | Linear antigen supporting units | |
GB2185486A (en) | Conjugate of alpha-melanotropin with p-L-sarcolysine (melphalan) | |
Van Eldik et al. | Elucidation of a minimal immunoreactive site of vertebrate calmodulin | |
JPS59138958A (ja) | 抗血清 | |
CA2106982A1 (en) | Compositions which are immunologically crossreactive with antibodies and preparative methods therefor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB | Publication of examined application | ||
PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: NOVARTIS AG |
|
FG | Patent granted |
Owner name: NOVARTIS AG |
|
MA | Patent expired |