FI94419C - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen membraaniankkuri-vaikuttava-ainekonjugaatin valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen membraaniankkuri-vaikuttava-ainekonjugaatin valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI94419C
FI94419C FI862631A FI862631A FI94419C FI 94419 C FI94419 C FI 94419C FI 862631 A FI862631 A FI 862631A FI 862631 A FI862631 A FI 862631A FI 94419 C FI94419 C FI 94419C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
membrane anchor
peptide
pam3cys
active ingredient
mmol
Prior art date
Application number
FI862631A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI862631A0 (fi
FI94419B (fi
FI862631A (fi
Inventor
Guenther Jung
Karl-Heinz Wiesmueller
Joerg Metzger
Hans-Joerg Buehring
Gerhard Becker
Wolfgang Bessler
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of FI862631A0 publication Critical patent/FI862631A0/fi
Publication of FI862631A publication Critical patent/FI862631A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI94419B publication Critical patent/FI94419B/fi
Publication of FI94419C publication Critical patent/FI94419C/fi

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

1 94419
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen membraaniankku-ri-vaikuttava-ainekonjugaatin vaImistamiseksi
Keksintö koskee menetelmää membraaniankkuri-vaikut-5 tava-ainekonjugaatien valmistamiseksi, joissa on vähintään yksi kovalenttisesti membraaniankkuriyhdisteeseen tai -yhdisteisiin sidottu vaikuttava aine, menetelmää niiden valmistamiseksi ja niiden käyttöä.
Membraaniankkuriyhdisteet ovat yhdisteitä, jotka 10 ovat suljettavissa biologisiin ja keinotekoisiin membraa-neihin.
Tällaiset membraaniankkuriyhdisteet voivat olla esimerkiksi luonnollisia merabraanilipoproteiineja, joita on jo eristetty Escherichia colin ulkomembraanista ja nyt 15 jo syntetisoitukin. E. colin membraaniankkuriyhdiste koostuu N-terminaalialueella kolmesta rasvahaposta, jotka liittyvät S-glyseryyli-L-kysteiiniin (G. Jung et ai., "Peptides, Structure and Function", V. J. Hruby and D. H.
Rich, sivut 179-182, Pierce Chem. Co., Rockford, Illinois, 20 1983) .
Mallina biologisten membraanien tutkimuksista on jo kuvattu konformaatiostabiloituja α-heliksipolypeptidejä, viitattakoon mm alametisiiniin, α-helikaaliseen amfifiili-seen eikosapeptidi-antibioottiin, joka muodostaa lipidi-25 membraaniin jännityksestä riippuvia ioneja johtavia sys teemejä (Boheim, G., Hanke, W., Jung, G., Biophys. Struct.
Mech. 9, sivut 181-191 (1983); Schmitt, H. ja Jung, G., Liebigs Ann. Chem., sivut 321-344 ja 345-364 (1985)).
EP-hakemusjulkaisussa 330 on kuvattu, että lipopep-30 tidit, jotka ovat jo vuodesta 1973 tunnetun E. colin lipo-proteiinin analogeja, ovat immuunipotensoivia. Myöhempi EP-hakemusjulkaisu 114 787 käsittelee tämänkaltaisten li-popeptidien kykyä aktivoida in vitro rotta- ja hiirialveo-laarimakrofageja siten, että nämä 24 tunnin inkuboinnin 35 jälkeen substanssin kanssa voivat eliminoida kasvainsoluja • · 2 £4419 ja varsinkin lisäävät merkitsevästi vasta-aineiden tuotantoa esimerkiksi sianseerumialbumiinia vastaan.
EP-hakemusjulkaisussa 114 787 ehdotetaan näiden li-poproteiinijohdannaisten käyttöä immunoinnin adjuvanttei-5 na, siis E. colin membraaniproteiinin lipoproteiinijohdannaisten käyttämistä seoksena antigeenien kanssa immuunivasteen parantamiseksi.
Immuunivastetta stimuloivien ja vahvistavien aineiden tarve on suuri, varsinkin kun puhdistettuja antigeene-10 jä on usein saatavissa vain erittäin vähäisiä määriä; lisäksi käytettäessä uusia antigeenieriä on aina mahdollista, että mukaan joutuu uusia epäpuhtauksia tai hajoamistuotteita .
Lisäksi on toivottua, ettei koe-eläintä tarvitsisi 15 rokottaa usein, vaan että mahdollisuuksien mukaan yksi ainoa immunogeenisen materiaalin anto aiheuttaisi halutun immuunivasteen.
Esillä olevassa keksinnössä on siten tehtävänä pyrkiä korottamaan vasta-ainemuodostusta antigeenejä tai hap-20 teeneja vastaan ja siten saada spesifinen immuunipotensoi-va vaikutus.
Tämän tehtävän ratkaisuna on keksinnön mukaisesti valmistettu uusi membraaniankkurivaikuttava-ainekonjugaat-ti, jossa on ainakin yksi membraaniankkuriyhdiste ja aina-• 25 kin yksi kovalenttisesti membraaniankkuriyhdisteeseen tai -yhdisteisiin sidottu vaikuttava-aine.
FI-patenttijulkaisussa 66878 on esitetty antigeenin ja adjuvantin (muramyylipeptidijohdannaisen) konjugaatti. Mainittu adjuvantti ei kuitenkaan ole membraaniankkuri.
30 FI-patenttijulkaisu 83527 ja FI-patenttihakemukset 781241 : ja 781933 koskevat E. colin kuoriproteiinin lipoproteiini- johdannaisten käyttöä adjuvantteina tai vastaavasti immu-nostimulantteina; esitettyjen tietojen perusteella ei kuitenkaan ole pääteltävissä, että nämä yhdisteet voisivat 35 olla membraaniankkuri-vaikuttava-ainekonjugaatin rakenne osana.
> · i 3 94419
Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetut uudet membraaniankkuri-vaikuttava-ainekonjugaatit johtavat uuteen vaikutusperiaatteeseen, joka - yksinkertaistetusti esitettynä - perustuu siihen, että organismi on membraani-5 ankkurin vaikutuksesta pidemmän ajan alttiina tietylle antigeenille, mikä johtaa vasta-aineiden spesifiseen muodostumiseen.
Keksinnön kohteena on siten menetelmä membraaniank-kuriyhdisteiden valmistamiseksi, jolle menetelmälle on 10 tunnusomaista, että peptidi, jonka ne funktiot on sinänsä tunnetulla tavalla suojattu suojaryhmillä, joissa ei saa tapahtua minkäänlaista reaktiota, syntetisoidaan tunnetulla kytkentämenetelmällä kiinteälle tai liukenevalle kantajalle, kuten polymeerille (esim. Merrifield-hartsi), että 15 täten syntetisoitu, kantajaan sidottu peptidi sidotaan peptidin N-päätteen tai sivufunktion välityksellä kova-lenttisesti membraaniankkuri-vaikuttava-ainekonjugaa-tiksi, jonka yleinen kaava on jokin seuraavista: R -C0-0-CH R -0-CH, R - 0-CO-CH, I | z I 2 20 R'-C0-0-CH* R *-0-CH* R'- O-CO-CH·
i i I
(CH,) (CH,) (CH,) n l 2 n | 2 n i 2 n
A A A
(ch,) (ch,j (ch,) I 2 Π* | 2 H» I 2 n
R”-C0-NH-CH*-C0-X R“-C0-NH-CH*-C0-X R"-C0-NH-CH«-C0-X
25 I. II. III.
R -NH-C0-^H2 R- co-nh-ch2 R *-NH-CO-CH* R‘-CO-NH-CH* (CH,) (CH,) ? I 2 n l 2 n i A f ? (CH,) (CH-) _ (CH,) -- i 2 a 2 m | 2 m
JU R* *-CO-NH-CH1·-CO-X R* •-C0-NH-CH--C0-X R-NH-C0-CH*-CC-X
IV. V. VI.
RrCH2 R,-CH*
4 I
TR (CH,)
Jo I 2 n
A
(CH,) ., I 2 ra
R-C0-NH-CH»-C0-X
VII.
4 54419 joissa A on rikki, happi, disulfidi (-S-5-), metyleeni (CH2-) tai -NH-; B on ryhmä -S (CH2)n-( substituoitu alkyyli) , jossa substituoitu alkyyli on mikä tahansa kaavoissa I - V esiintyvä ryhmään -(CH2)„- liittyvä substituoitu alkyyli; n 5 = 0 - 5; m on 1 tai 2; C* on asymmetrinen hiiliatomi, jon ka konfiguraatio on R tai S; R, R', R" ovat samoja tai erilaisia ja tarkoittavat vetyatomia tai 7-25 hiiliatomia sisältävää alkyyli-, alkenyyli- tai alkynyyliryhmää, jossa voi olla substituentteina hydroksi-, amino-, okso-, 10 asyyli-, alkyyli- tai sykloalkyyliryhmiä, ja R, ja R2 ovat samoja tai erilaisia ja voivat merkitä samaa kuin R, R' tai R" tai ryhmiä -OR, -OCOR, -COOR, -NHCOR, -CONHR, ja X on vaikuttava-aine tai spacer-vaikuttava-aineryhmä, lukuunottamatta yhdisteitä, joissa X on aminohapposekvenssi, 15 jossa on 2 - 10 luonnon aminohappoa, että täten valmistettu peptidikonjugaatti eristetään poistamalla sinänsä tunnetulla tavalla suojaryhmät ja peptidi/kantaja-sidos, jolloin saadaan membraani-ankkuripeptidi tai membraaniankku-ri-vaikuttava-ainekonjugaatti, jolloin vaikuttava aine on 20 antigeeni, kuten esimerkiksi proteiinin tai proteidin, esimerkiksi glykoproteiinin, virusvaippaproteiinin, bak-teerisoluseinämäproteiinin tai prototsoaproteiinin alempi-molekyylipainoinen osasekvenssi (antigeenindeterminantti, epitooppi), bakteerimembraanin ainesosa, kuten muramyyli-25 dipeptidi, lipopolysakkaridi, luonnollinen tai synteettinen hapteeni, antibiootti, hormoni, nukleosidi, nukleotidi, nukleiinihappo, entsyymi, entsyymisubstraatti, entsyymi-inhibiittori, biotiini, avidiini, polyetyleeniglykoli, peptidi-vaikuttava-aine, kuten tuftsiini, polylysiini, 30 fluoresenssimerkkaaja, FITC, RITC, dansyyli, luminoli tai ··. kumariini, bioluminisenssimerkkaaja, spinmerkkiaine, alka loidi, steroidi, biogeeninen amiini, vitamiini, toksiini, kuten esimerkiksi digoksiini, falloidiini, amanitiini, tetrodoksiini tms, kompleksinmuodostaja tai lääkeaine.
• · 5 94419
Keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdisteitä voidaan käyttää konventionaalisten ja monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi in vivo ja in vitro; niitä voidaan kuitenkin myös edullisesti käyttää geeniteknologiassa 5 solufuusion helpottamiseen, synteettisten rokotteiden valmistukseen, fluoresenssimerkkiaineilla, spinmerkkiaineil-la, radioaktiivisilla merkkiaineilla ym merkkiaineilla varustettujen solumerkitsijoiden valmistukseen, affiniteet-tikromatografiässä, varsinkin affiniteettipatsaisiin, li-10 posomipreparaatteihin, lisänä ihmisten ja eläinten ravinto- ja rehuaineisiin sekä lisänä mikroorganismien viljely-väliaineisiin ja yleisesti soluviljelmiin. Keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdisteitä voidaan tällöin mahdollisesti käyttää ihmisten ja eläinten lääketarkoituksiin 15 yhdessä sinänsä tunnettujen kantajien kanssa liuoksissa, voiteissa, adsorboituina kiinteille kantajille, emulsioissa tai suihkevalmisteissa.
Membraanivaikuttava-ainekonjugaattina voidaan edullisesti käyttää myös yhdistettä, jolla on yleinen kaava 20 R4 R3-NH-CH-CO-X (VIII) . jossa Rj on 7 - 25 hiiliatomia sisältävä, edullisesti 10 - 25 20 hiiliatomia sisältävä ja erityisen edullisesti 14 - 18 hiiliatomia sisältävä α-asyylirasvahappotähde; a-alkyyli-β-hydroksirasvahappotähde tai sen β-hydroksiesteri, jolloin esteriryhmittymä on edullisesti suoraketjuinen tai haarautunut ja sisältää enemmän kuin 8 hiiliatomia, edul-30 lisesti 10 - 20 hiiliatomia ja erityisen edullisesti 14 -18 hiiliatomia; edullisesti kaavan VIII mukainen yhdiste on vaikuttava-ainekonjugaatti, jossa ankkuriyhdisteenä on jokin seuraavista: Ν,Ν'-diasyylialysiini; N,N'-diasyyli- ornitiini; glutamiinihappo-di(monoalkyyli)amidi tai -es-35 teri; asparagiinihappo-di(monoalkyyli)amidi tai -esteri; 6 · 54419 seriinin, homoseriinin tai treoniinin N,O-diasyylijohdannainen tai kysteiinin tai homokysteiinin N,S-diasyylijohdannainen seriini tai homoseriini; R4 on aminohapon sivu-ketju tai vetyatomi; ja X on vaikuttava-aine tai spacer-5 vaikuttavaaineryhmä, jolloin, kun R4 on lysiinin, ornitii-nin, glutamiinihapon, asparagiinihapon tai näiden johdannaisen sivuketju, se voi liittyä a- tai ω-asemaan sekä esteri-että amidisidoksella samaan R4:n molekyyliin.
Peptidin ja membraaniankkuriyhdisteen yhteenliittä-10 minen voidaan suorittaa kondensaatio-, additio-, substituutio- tai hapetusreaktiolla (esim. disul£idimuodostus). Membraaniankkuriyhdisteinä käytetään edullisesti konfor-maatiostabiloivia α-alkyyliaminohappoheliksejä, joiden aminohapposekvenssit vuorottelevat, jolloin α-heliksi ei 15 saa destabiloitua muiden aminohappojen vaikutuksesta, kuten tyyppiä X-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)n-Y olevia, jossa n = 2 tai 4 ja X ja Y ovat sinänsä tunnettuja suojaryhmiä tai -H, -OH tai -NH2.
Saattaa olla edullista, että vaikuttava-aine on ko-20 valenttisesti sidottu kahteen, mahdollisesti erilaiseen membraaniankkuriyhdisteeseen.
Lisäksi vaikuttava-aine voi myös olla kovalentti-sesti sidottu sinänsä tunnettuun immunointitarkoituksiin käytettyyn adjuvanttiin, kuten esim. muramyylidipeptidiin 25 ja/tai lipopolysakkaridiin.
Vaikuttavan aineen laadusta riippuen saadaan keksinnön mukaisesti valmistettujen aineiden täysin uusia käyttöalueita.
Saattaa olla myös hyödyllistä verkkouttaa keskenään 30 useampia membraaniankkuri-vaikuttava-ainekonjugaattiyh- disteitä lipidi- ja/tai vaikuttava-aineosassa.
Membraaniankkuriyhdisteet ja vaikuttava-aine voivat liittyä toisiinsa myös verkkoutusaineen välityksellä, minkä seurauksena vaikuttava aine on kauempana membraanista, 35 johon se on membraaniankkurin välityksellä kiinnitetty.
• « 7 £4419
Verkkoutusaineiksi sopivat esimerkiksi dikarboksyylihapot tai dikarboksyylihappojohdannaiset, diolit, diamiinit, po-lyetyleeniglykolit, epoksidit, maleiinihappojohdannaiset ym.
5 Keksinnön mukaisesti valmistetaan siten yksiselit teisesti määritelty, alempimolekyylipainoinen konjugaatti, joka sopii mm immunointiin, ja joka liittää kovalenttises-ti yhteen kantaja-antigeeni-adjuvantti-periaatteet. Kantaja ja adjuvantti voivat olla mitogeenisesti vaikuttavia 10 lipopeptidejä, kuten esim. tripalmitoyyli-S-glyseryyli- kysteiini (Pam3Cys) , tai niiden analogeja, tai myös lipo-fiilisia konformaatiostabiloituja α-heliksejä sekä näiden yhdistelmiä, kuten Pam3Cys-antigeeniheliksi, a-heliksi-an-tigeeniheliksi tai myös vain Pam3Cys-antigeeni tai antigee-15 ni- Pam3Cys (N- tai C-terminaaliliittyminen) sekä antigee-niheliksi tai heliksi-antigeeni (N- tai C-terminaali tai liittyminen heliksin Glu, Lys tms sivuketjuun). Siten uudet yhdisteet eroavat olennaisissa kohdissa kaikista tähän mennessä käytetyistä antigeenien korkeampimolekyyli-20 painoisista konjugaateista, joissa on korkeampimolekyyli- painoiset kantaja-aineet, esimerkiksi proteiini kuten see-rumialbumiini, globuliini tai polylysiini, tai yleisesti määritelty korkeampimolekyylipainoinen, lineaarinen tai verkkoutettu polymeeri.
25 Erityisesti uudet yhdisteet eroavat kuitenkin myös kaikista tähän asti tunnetuista adjuvanteista, jotka ainoastaan sekoitetaan eivätkä siten mahdollista antigeenin suunnattua esiintymistä solun pinnalla. Tähän asti tunnettuja adjuvantteja käytettäessä tarvittiin huomattavasti 30 useampi immunointi, ja eläinkokeissa saatiin myös tuleh-" dusreaktioita. Keksinnön erityisenä etuna on mahdollisuus valmistaa toisinnettavasti pyrogeenivapaita, puhtaita, kemiallisesti yksiselitteisesti määriteltyjä yhdisteitä, joita käyttäen - päinvastoin kuin käytettäessä tavanomai-35 siä yhdisteitä tai erilaisten aineiden seoksia - saadaan 8 . $4419 myös vasta-ainemuodostuksen parempi toisinnettavuus. Siten keksinnön mukaisesti valmistetuille yhdisteille avautuu erityisiä käyttöalueita vasta-ainemuodostuksen, geeniteknologian, synteettisten rokotteiden, eläin- ja ihmislääke-5 tieteen, diagnostiikan ja terapian aloilla, koska uusilla konjugaateilla ensimmäisen kerran on saatu spesifisen immuunivasteen stimuloiva vaikutus, kun tähän asti käytetyt adjuvantit stimuloivat pelkästään epäspesif isesti immuunivastetta. Yllättäen keksinnön mukaisesti valmistettujen 10 yhdisteiden vaikutuksesta myös heikosti immunogeeniset yhdisteet voidaan muuttaa vahvasti immunogeenisiksi. Siten keksinnöllä on erityistä merkitystä siinä, että sen avulla on mahdollista säästää eläinkokeissa sekä vasta-aineiden valmistuskustannuksissa, koska uudet immunogeenit ovat 15 suuraktiivisia myös in vitro. Kun immunointimenetelmä ei aiheuta tulehduksia, eläintä voidaan myös käyttää useita kertoja erilaisten vasta-aineiden muodostamiseen.
Uusilla immunogeeneilla voidaan lisäksi valmistaa myös monitehorokotteita, so raembraaniankkurin sivuketjui-20 hin voidaan liittää useita antigeenejä tai hapteeneja siten, että immunoitaessa voidaan valmistaa useita erilaisia aktiivisia vasta-aineita.
Vesiliukoinen, mitogeeninen lipidiankkuriryhmä on esimerkiksi Pam3Cys-Ser (Lys)n-0H, joka sopii varsinkin 25 uusien immunogeenien valmistukseen, mutta myös fluoresoivien, radioaktiivisten ja biologisesti aktiivisten solu-merkitsijöiden valmistukseen. Keksinnön mukaisesti valmistettujen membraaniankkurivaikuttava-ainekonjugaattien erityisen toivottu ominaisuus on niiden amfifiilisyys, so.
30 osittainen vesiliukoisuus, koska biologiset eläinkokeet ja elävillä soluilla suoritetut tutkimukset voidaan tällöin suorittaa olennaisesti yksinkertaisemmin. Myös keinotekoiset lipidikaksoiskerrosmembraanit, liposomit ja vesikke-lit, joita joissakin kokeissa tarvitaan, voidaan valmistaa 35 (ja ovat stabiileja) vain vesipitoisissa väliaineissa.
• « 9 . 94419
Sopiva axnfifiilinen, biologisesti aktiivinen mem-braaniankkuri on esim. Pam3Cys-Ser (Lys)n-CH. Pam3Cys-ket juun liittynyt seriinitähde suosii immunogeenisia ominaisuuksia ja lysiinitähteen polaariset, protonoidut £-aminoryhmät 5 muodostavat molekyylin hydrofiilisen osan. Tämä yhdiste-tyyppi omaa useampikertaisten varaustensa johdosta myös muita mielenkiintoisia ominaisuuksia. Sitä voidaan solu-vuorovaikutuksen induktion avulla käyttää fuusioaktivaat-torina hybridoomasolujen valmistuksessa, varsinkin, kun 10 kyseessä on pitkä lysiiniketju, polyetyleeniglykoliin kytkentään tai biotiini/avidiini-systeemin kovalenttiseen liittämiseen.
Edelleen keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdisteitä voidaan edullisesti käyttää uudenlaisten liposomien 15 valmistukseen verkkouttamalla, joka verkkoutus tapahtuu joko rasvahappo- tai peptidiosassa.
Membraaniankkurit (Pam3Cys ja analogit sekä helik-sit) sopivat lisäksi solun/soluvuorovaikutuksen vahvistamiseen, kun ne yhdistetään kovalenttisesti esimerkiksi 20 biotiini/avidiinisysteeroin kanssa. Lisäksi keksinnön mu kaisesti valmistettujen yhdisteiden edullisiin ominaisuuksiin kuuluu niiden kyky helpottaa solufuusioita, joita esimerkiksi tarvitaan geeniteknologian töissä. Tällöin uusia immunogeeneja voidaan käyttää myös ELISA-, RIA- ja 25 bioluminisenssikokeissa.
Pam3Cys-johdannaiset ovat lipidi- ja vesiliukoisia ja in vivo ja in vitro vahvasti mitogeenisesti vaikuttavia. Ne soveltuvat myös sangen hyvin solujen merkitsemiseen FITC:llä ja muilla merkitsijöillä, kuten RITCrllä, 30 dansyylillä ja kumariinilla. Varsinkin niitä voidaan myös käyttää fluoresenssimikroskopiassa ja FACSissä (Fluorescence Activated Cell Sorting).
Hinnaltaan edullinen membraaniankkuri, joka on vaikutukseltaan analoginen Pam3Cys:in kanssa, on S-(l,2-diok-35 tadekyylioksikarbonyylietyyli)kysteiini, jonka valmistus kuvataan tarkemmin esimerkeissä.
• < ίο £4419
Mitogeenisesti vaikuttavien lipidiankkurien spesifinen kytkentä antigeeneihin voi tapahtua myös verkkoutus-aineen välityksellä, kuten esimerkiksi dikarboksyylihappo-monohydratsidijohdannaisen välityksellä, jonka yleinen 5 kaava on:
X-NH-NH-CO-A-CO-B-Y
tai myös X-NH-NH-CO-A-COOH, 10 joissa kaavoissa A ja B ovat aminohappoja tai (CH2)n, ja X ja Y ovat sinänsä tunnettuja suojaryhmiä.
Uusien aineiden valmistuksessa voidaan käyttää myös mitä tahansa muuta sopivaa verkkoutusainetta tai spacer-ainetta, jolloin periaate (alhaismolekyylipainoinen kanta-15 ja ja adjuvantti)-(antigeeni) edustaa keksinnön erityisen edullista muotoa edellytyksellä, että se sisältää lipopep-tidirakenteita, joilla on lipidimembraanifunktio ja/tai konformaatiostabiloituja heliksejä.
Erityisen edullisia vaikutuksia keksinnön mukaises-20 ti valmistettujen yhdisteiden käytöllä saadaan affiniteet-tikromatografiässä, johon soveltuvat varsinkin lipopepti-di-antigeeni-(hapteeni)-konjugaatit. Nämä soveltuvat huomattavan hyvin saatavissa olevien käänteisfaasi-HPLC-pyl-väiden (tai myös preparatiivisten käänteisfaasi-pylväiden) 25 täyttöön, jolloin esimerkiksi orgaanis-vesipitoisen systeemin sisältämä tripalmitoyyliyhdiste ankkuroituu apolaa-riseen alkyylikerrokseen. Antigeeni jää liikkuvaan vesi-faasiin solujen pinnoille ja on siten valmiina adsorboimaan vasta-aineet. Siten laimennetusta seerumista voidaan 30 vasta-aineet suoraan rikastaa tai eristää tällaiseen affi-niteettipylvääseen. Vasta-aineiden eluutio tapahtuu kuten muista affiniteettipylväistä, esimerkiksi säätämällä pH-arvo.
i · t
Seuraavassa valaistaan keksintöä lähemmin esimer- 35 kein, jolloin tässä käytetyt lyhenteiden merkitykset ovat seuraavat: 11 £4419
Aib = 2-metyylialaniini TFE = trifluorietikkahappo EGF R = epidemiaa li sen kasvutekijän reseptori Pam = palmitoyylitähde 5 DOC = disykloheksyylikarbodi-imidi DMF = dimetyyliformamidi FITC = fluoreskeiini-isotiosyanaatti Fmoc = fluorenyylimetoksikarbonyyli Bu‘ = tert-butyyliryhmä 10 PS-DVB = styreeni-divinyylibentseeni-kopolymeeri, jossa on 4-(hydroksimetyyli)fenoksimetyyli-ankkuriryhmiä HOBt = 1-hydroksibentsotriatsoli RITC = rodamiini-isotiosyanaatti
Hu IFN-(Ly) 11-20 = ihmisen interferonin antigeenideter-15 minantti DCH = Ν,Ν'-disykloheksyyliurea EE = etyyliasetaatti
Liitteenä olevat kuviot, jotka valaisevat keksintöä, esittävät: 20 Kuvio 1:
Pam-Cys (C18) 2-Ser-Ser-Asn-Ala-OH: n valmistuskaavio Kuvio 2: 13C-NMR-spektrien taulukko Kuvio 3: 25 Pam3Cys-Ser-(Lys)4-0H x 3 TFA: n I3C-NMR-spektri CDCl3:ssa
Kuvio 4:
Pam-Cys (Pam)-OBu*: n 13C-NMR-spektri CDCl3:ssa Kuvio 5:
Pam-Cys (Pam)-OH:n 13C-NMR-spektri CDCl3/CD3OD: ssä 1:1 . 30 Kuvio 6: : Pam(a-Pam)Cys-OBu‘:n 13C-NMR-spektri (J-moduloitu spin-echo- spektri)
Kuvio 7: α-heliksin 13C-NMR-spektri (100 MHz) i2 94419
Kuvio 8:
HuIFN- (ot-Ly) -11-20:n α-heliksin CD-spektri Kuvio 9:
Vasta-aineiden valmistus Pam3Cys-Ser-EFG-R(516-529):n avulla 5 Kuvio 10:
In vivo suoritettu immunointikoe Kuvio 11:
In vivo/in vitro suoritettujen immunointikokeiden vertailu Kuvio 12: 10 Balb/c-hiiren pernasolujen mitogeeninen aktivointi Pam3Cys-
Ser- (Lys)4FITC: llä.
Seuraavassa kuvataan aluksi joitakin keksinnön mukaisten aineiden ja näiden esiasteiden valmistusmenetelmiä.
15 I. Pam3Cys-EGF-R(516-529):n valmistus
Tavanomaisella vaiheittaisella rakennusmenetelmällä (Merrif ield-synteesi, typpisuojakaasu, aFmoc/(Bu‘) suojaus, DCC/HOBt ja symmetriset anhydridit) koottiin EGF-R-seg-mentti (526-529) ja viimeisenä aminohappona liitettiin 20 Fmoc-Ser (Bul)-OH. Fmoc-ryhmän lohkaisemisen jälkeen (pipe- ridiini/DMF 1:1, 15 min) hartsiin sidottu pentadekapeptidi EGF-RH: Ser (Bul) -Asn-Leu-Leu-Glu- (OBu*) -Gly-Glu (OBu1) -Pro-Arg-(H+) -Glu(OBu') -Phe-Val-Glu (OBu*) -Asn-Ser (Bu‘) -O-p-alkoksi-bentsyylikopoly(divinyyli-bentseenistyreeni) (1 g, panos 2 5 0,5 mmol/g) liitettiin yhteen Pam-Cys-(CH2-CH (OPam) CH2- (0Pam):in (2 mmol, DMF/CH2C12, 1:1) ja DCC/HOBt:in (2 mmol, 0 °C, 20 min esiaktivoitu) kanssa (16 h), sitten jälkikyt-kentä (4 h). Lipoheksadekapeptidi lohkaistiin 2 h aikana trifluorietikkahapolla (5 ml) käyttäen lisänä tioanisolia : 30 (0,25 ml).
Saanto: 960 mg (76 %) Pam-Cys(CH2-CH(OPam)CH2(OPam) )Ser-
Asn-Leu-Leu-Glu-Gly-Glu-Pro-Arg-Glu-Phe-Val-Glu-Asn-Ser-OH x CF3COOH (oikea aminohappoanalyysi, ei rasemoitumista).
• < 94419 13 II. S-(1,2-dioktadekyylioksikarbonyylietyyli)-N-pal-mitoyyli-L(tai D)-kysteiini-tert-butyyliesterin valmistus
Maleiinihappodioktadekyyliesteriä saadaan maleiini-5 hapon yleisillä esteröintimenetelmillä (H. Klostergaard, J. Org. Chem. 23 (1958), 108).
13C-NMR-spektri:
Katso kuvio 2.
1,2 mmol (500 mg) N-palmitoyyli-L-kysteiini-tert-10 butyyliesteriä ja 1,2 mmol (745 mg) maleiinihappodioktadekyy lies teriä liuotetaan 20 ml:aan THF. Lisätään 20 mmol (3 ml) Ν,Ν,Ν1,N’-tetrametyleenidiamiinia ja sekoitetaan typpiilmakehässä palautusjäähdyttäen 12 h. Lisätään 100 ml metanolia ja 5 ml vettä, väritön sakka imusuodatetaan, 15 pestään vedellä ja metanolilla ja kuivataan vakuumissa P205:n yllä.
Saanto: 1 g (83 %). Sulamispiste: 51 °C.
Ohutkerroskromatografia:
Rf = 0,80 (liuotin: CHCl3/etyyliasetaatti 14:1) 20 13C-NMR: Katso kuvio 2. Molekyylipaino: C63H113N07S (1035,7).
Alkuaineanalyysi:
Laskettu: C 72,99, H 11,76, N 1,35, S 3,09 %
Saatu: C 73,08, H 11,92, N 1,27, S 3,27 % • 25 III. S-(1,2-dioktadekyylioksikarbonyylietyyli)-N- palmitoyyli-kysteiinin valmistus 0,48 mmol (500 mg) kohdassa II kuvattua tert-butyy-liesteriä ja 65,3 mmol (7,45 g, 5 ml) trifluorietikkahap-poa sekoitetaan huoneen lämpötilassa suljetussa astiassa 1 ,30 h. Seos haihdutetaan kiertohaihduttimessa suurvakuumissa, jäännös liuotetaan 1 ml:aan kloroformia, tuote saostetaan lisäämällä 50 ml petrolieetteriä -20 “C:ssa ja kuivataan vakuumissa P205:n yllä.
Saanto: 420 mg (89 %). Sulamispiste: 64 °C.
35 Ohutkerroskromatografia silikageelilevyillä:
Rf = 0,73 (liuotin: CHCl3/Me0H/H20 * 65:25:4).
i4 . £4419 ,3C-NMR: Katso taulukko 1. Molekyylipaino: C59Hn3N07S (980,6) Alkuaineanalyysi:
Laskettu: C 72,27, H 11,62, N 1,43, S 3,27 %
Saatu: C 72,46, H 11,75, N 1,36, S 3,50 % 5 Uusi kysteiinijohdannainen ja sen tert-butyylieste- ri voidaan erottaa diastereomeereiksi silikageelillä ja käänteisfaasikromatografiällä. Näin voidaan valmistaa L-ja D-kysteiinijohdannaisen molemmat diastereomeeriparit.
IV. S-(1,2-dioktadekyylioksikarbonyylietyyli)-N-pal-10 mitoyyli-Cys-Ser (Bul)-Ser(Bul)-Asn-Ala-OBu‘: n valmistus 0,2 mmol (196 mg) S-(l,2-dioktadekyylioksikarbonyy-lietyyli)-N-palmitoyyli-kysteiiniä liuotetaan 5 ml:aan di-kloorimetaania ja esiaktivoidaan HOBt:llä (0,2 mmol , 27 mg) 0,5 ml:ssa DMF ja DCC:llä (0,2 mmol, 41 mg) sekoittaen 15 0 °C:ssa 3 0 min. Lisätään 0,2 mmol (109 mg) H-Ser (Bu*) Ser- (Bu‘)-Asn-Ala-OBu‘ 3 ml:ssa dikloorimetaania ja sekoitetaan 12 h huoneen lämpötilassa. Reaktioseokseen lisätään ilman lisäkäsittelyä 40 ml metanolia. 3 h kuluttua imusuodate-taan väritön tuote. Se liuotetaan pieneen määrään dikloo-20 rimetaania ja saostetaan uudelleen metanolilla, sakka pestään metanolilla ja kuivataan vakuumissa P205:n yllä.
Saanto: 260 mg (86 %). Sulamispiste: 194 °C.
Ohutkerroskromatograf ia: RP = 0,95 (liuotin: CHCl3/MeOH/H20 = 65:25:4) 25 RF = 0,70 (liuotin: CHCl3/MeOH/jääetikka = 90:10:1) 13C-NMR: Katso kuvio 2. Molekyylipaino: CMH15gN6014S (1508,3). Alkuaineanalyysi:
Laskettu: C 66,89, H 10,56, N 5,57 %
Saatu: C 67,10, H 10,41, N 5,52 % . 30 V. S-(1,2-dioktadekyylioksikarbonyylietyyli)-N-pal- :· mitoyyli-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala:n valmistus
Suojattua lipopeptidiä (IV) (53 jitmol, 80 mg) sekoitetaan trifluorietikkahapon (13 mmol, 1,5 g, 1 ml) kanssa suljetussa astiassa huoneen lämpötilassa 1 h. Seos haihdu-35 tetaan suurvakuumissa ja jäännös liuotetaan dikloorimetaa-
Il , li U I alli 1 l i.BI , i • < £4419 15 niin (10 ml) ja haihdutetaan kiertohaihduttimessa, sama toistetaan. Jäännös liuotetaan kloroformiin (3 ml) ja tuote saostetaan metanolilla (5 ml) 4 °C:ssa 12 h kuluessa.
Tuote imusuodatetaan, pestään metanolilla ja kuivataan 5 eksikkaattorissa P205:n yllä.
Saanto: 63 mg (87 %). Sulamispiste: 208 °C (hajoaa). Ohutkerroskromatograf ia:
Rf = 0,63 (liuotin: CHCl3/MeOH/jääetikka/H20 = 64:25:3:4)
Rf = 0,55 (liuotin CHCl3/Me0H/H20 = 64:25:4) 10 RF = 0,06 (liuotin: CHCl3/MeOH/jääetikka = 90:10:1) Aminohappoanalyysi:
Kysteiinihappo 0,6; asparagiinihappo 0,93; seriini 1,8; alaniini 1,0.
Molekyylipaino: C72H134N6014S (1340) 15 VI. Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH:n valmistus
Pam3Cys-Serp(Lys)4-OH koottiin kiintofaasimenetel-mällä (Merrifield) p-alkoksibentsyylialkoholi-PS-DVB (1 %)-kopolymeerille N-Fmoc-aminohappoja ja happolabiilia si-vuketjusuojausta (seriinille tBu ja lysiinille Boc) käyt-20 täen. Käytettiin Fmoc-aminohappojen symmetrisiä anhydride-jä. Kytkentä Pam3Cys-OH:hon suoritettiin DCC/HOBt-menetel-mällä ja toistettiin mahdollisimman kvantitatiivisen reaktion saamiseksi. Lipopeptidin lohkaisemiseksi kantajahart-silta ja sivuketjusuojauksen poistamiseksi hartsia käsi-25 teltiin 2 kertaa 1,5 h trifluorietikkahapolla, joka sitten poistettiin kiertohaihduttimessa suurvakuumissa. Tuote kiteytettiin uudelleen asetonista.
Alkuaineanalyysi sekä myös l3C-NMR-spektri osoittaa, että lipopeptidi on trifluoriasetaattina. Olettaen, että : 30 Pam3Cys-Ser-(Lys)4-0H on kahtaisionina, jäljellä on vielä kolme α-aminoryhmää, jotka 3 trifluorietikkahappomolekyy-liä voivat protonoidä.
Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH x 3TFE:n I3CNMR-spektri osoittaa että yhdiste on trif luoriasetaattina (CF3-ryhmän kvar-35 tetti 110-120 ppm:ssä sekä karbonyylisignaali 161-162
• I
16 S4419 ppxn:ssä) . Polaarisen molekyyliosan aggregaation vaikutuksesta Lys- ja Ser-C-atomien viivat levenevät vahvasti. Kohdassa 206,9 ppm oleva karbonyylisignaali johtuu tuotteeseen liittyvästä asetonista, jota käytettiin uudelleen-5 kiteytyksessä.
Molekyylipaino: 1510,4.
Alkuaineanalyysi:
Laskettu: C 56,40, H 8,70, N 7,56, S 1,73 %
Saatu: C 55,58, H 9,33, N 6,54, S 2,61 % 10 Aminohappoanalyysi:
Aminohappoanalyysi osoitti seriinin ja lysiinin suhteeksi 1:4,2. S-glyseryyli-kysteiinin hydrolyysissä (6-xn HC1, 110 °C, 18 h) syntyviä tyypillisiä hajoamistuotteita oli läsnä (vertailu tunnettuun standardiin). Pepti-15 diosan laskettiin olevan 83 %. 3 TFE-molekyyliä lipopepti- diä kohti vastaa 80,2 %:n peptidiosaa, joka vastaa hyvin analyysitulosta.
VII. Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH x 3TFE:n valmistus VII.1. Fmoc-Lys(Boc)-OH:n kytkeminen kantajahart-20 siin
Fmoc-Lys(Boc)-OH:hon (4,5 g, 9,6 mmol) 15-20 ml:ssa DMF/CH2Cl2-seosta (1:1, v/v) lisätään 0 °C:ssa DCC:tä (0,99 g, 4,8 mmol). 30 min kuluttua saostunut urea suodatetaan ja suodos kerätään suoraan ravistuslaitteeseen, jossa on 25 p-bentsyylioksibentsyylialkoholihartsia (2,5 g, 1,6 mmol OH-ryhmiä). Lisätään pyridiiniä (0,39 ml, 4,8 mmol) ja ravistetaan 18 h huoneen lämpötilassa. Liuotin erotetaan suodattamalla ja hartsi pestään DMF/CH2C12:11a (3 x 20 ml). Hartsiin lisätään 20 ml CH2Cl2:a, sitten pyridiiniä (28,8 30 mmol, 6 ekv) ja sitten bentsoyylikloridia (28,8 mmol, 6 ·1 ekv). Ravistetaan huoneen lämpötilassa 1 h. Liuotin pois tetaan suodattamalla ja hartsi pestään CH2Cl2:lla (3 x 20 ml), DMF:llä (3 x 20 ml), isopropanolilla (3 x 20 ml) ja PE-30/50:llä (3 x 20 ml).
17 - 94419 VII.2. Symmetrinen Fmoc-aminohappoanhydridi
Fmoc-Lys(Boc)-OH (4,5 g, 9,6 mmol, 3 ekv) liuotetaan 15 ml:aan CH2Cl2/DMF-seosta, ja liuokseen lisätään 0° C:ssa DCC:tä (4,8 mmol, 1,5 ekv). 30 min kuluttua 0 °C:ssa 5 urea suodatetaan ja suodos kerätään suoraan reaktoriin, jossa sen jatkokäsittely tapahtuu seuraavan taulukon mukaisesti.
Seuraava ohje koskee 1/5 käytetystä hartsimäärästä (0,5 g, 0,32 mmol OH-ryhmiä).
10 Fmoc-O-butyyli-seriini (0,74 g, 1,92 mmol) liuote taan 4 mitään CH2Cl2/DMF-seosta ja liuokseen lisätään 0°
Ctssa DCCttä (0,96 mmol).
• Λ 1 « ie 94419
Taulukko
Peptidin sekvenssin kokoaminen symmetrisistä Fmorc-aminohappoanhydride i stä
Toimenpide Reagenssi Aika Suoritus- _(min)_ten luku 1 CH2C12 2 2 2 DMF 2 2 3 55 % piperidiini/DMF 5 1 (v/v) 4 55 % piperidiini/DMF 10 1 (v/v) 5 DMF 2 3 6 Isopropanoli 5 2 7 DMF 2 3 8 CH2C12 2 3 9 DMF 2 2 10 Kytkentä symmetr. 90 1
Fmoc-aminohappoanhyd- ridiin (3 ekv) DMF/ CH2Cl2:ssa (1:1, v/v); 15 min kuluttua NMM-lisäys (3 ekv) 11 DMF 2 3 12 CH2C12 2 3 13 Kytkennän täydellisyyden kokeileminen (Kai- ‘ ser-koe); tarvittaessa toistetaan vaiheet 10-12 14 Asetylointi: 2 ekv 15 1
Ac20 ja 0,5 ekv NMM
20 ml:ssa CH2C12 15 CH2C12 2 3 16 Isopropanoli 2 3 17 CH2C12 2 3 • « « 130 min kuluttua urea suodatetaan pois 0 °C:ssa, suodos lasketaan suoraan reaktoriin, ja jatkokäsitellään tavanomaiseen tapaan.
19 · 94419 VII.3. Kytkentä Pam3Cys-OH:hon
Pam3Cys-OH (0,58 g, 0,64 mmol) liuotetaan 5 ml:aan CH2Cl2/DMF-seosta (1:1, v/v) ja liuokseen lisätään 0 °C:ssa HOBt:a (93 mg, 0,64 mmol) ja DCC:tä (0,64 mmol). 30 min 5 kuluttua 0 °C:ssa seos viedään suoraan reaktoriin. 16 h ravistelun jälkeen suoritetaan jälkikytkentä 4 h samalla moolisuhteella. Liuotin erotetaan suodattamalla ja hartsi pestään DMF/CH2Cl2-seoksella (3 x 20 ml) .
VII. 4. Heksapeptidin lohkaiseminen polymeeristä 10 Kohdassa VII.3 valmistettu Boc-suojattu peptidipo- lymeerihartsiyhdiste (noin 1 g) pestään hyvin CH2Cl2:lla ja ravistellaan 2 x 1,5 h TFE:n (5 ml) ja anisolin (0,5 ml) seoksen kanssa. Suodos haihdutetaan vakuumissa ja jäännös liuotetaan 5 ml:aan CHCl3:a. Pam3Cys-Ser(Lys)4-OH x 3TFE 15 kiteytyy lisättäessä 50 ml asetonia -20 °C:ssa, se lingo-taan ja kuivataan suurvakuumissa.
Saanto: 0,41 g (85 %). Sulamispiste: 205 °C (hajoaa). Ohutkerroskromatografia silikageelilevyillä:
Rp = 0,42 (liuotin: n-Bu0H/pyridiini/H20/jääetikka = 20 4:1:1:2)
Rf = 0,82 (liuotin: n-Bu0H/Me0H/H20/jääetikka = 10:4:10:6) Aminohappoanalyysi: Ser 0,95 (1), Lys 4 (4)
Molekyylipaino: C87H159N10O19SF9 (1852,6).
‘ 25 Alkuaineanalyysi:
Laskettu: C 56,40, H 8,70, S 1,73 %
Saatu: C 55,58, H 9,33, N 6,94, S 2,61 % VIII. Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH-FITC x 2 TFE:n valmistus
Fluoreskeiini-isotiosyanaatti (3,9 mg, 10 μιηοΐ) 30 liuotetaan 2 ml:aan kloroformia ja liuos lisätään Pam3Cys-Ser-(Lys)4-0H x 3TFE:n (18,5 mg, 10 μιηοΐ) liuokseen 2 ml:ssa kloroformia. Lisätään 4-metyylimorfoliinia (10 μΐ, 10 μιηοΐ) ja sekoitetaan 1 h, sitten liuotin haihdutetaan kiertohaihduttimessa Jäännös liuotetaan 10 ml:aan kloro-35 formi/asetoniseosta 1:1. -20 °C:ssa saostuu paksu keltai- • « » - 94419 20 nen sakka, joka erotetaan linkoamalla ja kuivataan suurva-kuumissa.
Saanto: 16 mg puhdistamisen jälkeen Sephadex LH20:llä.
Tuote on trifluoriasetaattina ja fluoresoi erittäin 5 vahvasti UV-herätteellä aaltopituus 366 nm. Lähtöaineesta se eroaa siten, että yksi ε-aminoryhmä on kovalenttisesti liittynyt FITC:hen. Tästä seuraa bruttokaava Pam3Cys-Ser-(Lys)4-CH-FITC x 2TFE, jolloin edellytetään, että kahtais-ionirakenne on säilynyt.
10 Molekyylipaino: C106H,69NnO22S2F6 (2127,68).
Ohutkerroskromatografia silikageelilevyi1lä: RF = 0,72 (liuotin: n-butanoli/pyridiini/vesi/jääetikka = 4:1:1:2)
Rf = 0,73 (liuotin: n-butanoli/muurahaishappo/vesi = 7:4:2) 15 Aminohappoanalyysi: Ser 1,11 (1,00), Lys 4,00 (4,00) Glyseryylikysteiinin hydrolyysituotteita on läsnä.
IX. Pam3Cys-Ser-(Lys) 4-0H x 3HCl:n valmistus Pam3Cys-Ser-(Lys)4-0H x 3TFE (185,2 mg, 0,1 mmol) liuotetaan sellaiseen määrään kloroformia, johon se juuri 20 liukenee, ja liuokseen lisätään sama tilavuusmäärä HC1-eetteriliuosta. Ravistellaan hyvin, jolloin osa tuotteesta saostuu, mutta suurin osa jää liuokseen. Seos haihdutetaan kuiviin kiertohaihduttimessa ja jäännökseen lisätään jälleen HCl-eetteriliuosta. Sama toistetaan useita kertoja, 25 sitten jäännös liuotetaan pieneen määrään kloroformia, ja liuokseen lisätään asetonia, kunnes sameneminen alkaa.
Tuote kiteytyy värittömänä jauheena -20 °C:ssa, se imusuo-datetaan ja kuivataan suurvakuumissa.
Saanto: 153 mg. Molekyylipaino: CgiH159N,0O,3SCl3 (1619,63).
30 Alkuaineanalyysi:
Laskettu: C 60,07, H 9,89, N 8,65 %
Saatu: C 57,64, H '11,20, N 8,39 %
Tuotteessa on jäljellä ylimääräistä HCl:ää. Kenttädesorptio-massaspektrometria: 35 M+-piikki on kohdassa m/e 1510 sekä kohdissa M++l ja
11 1 10.:1 aim iti UI I
21 - 94419 M++2. Tyypillisiä ovat protonoidut fragmentit Pam3Cys-NH (908,5) kohdissa m/e 909, 910, 911 ja 912.
X. N,S-dipalmitoyyli-kysteiini-tert-butyyliesteri Palmitiinihappoa (2,5 g, 9,6 mmol), dimetyyliami- 5 nopyridiiniä (130 mg, 0,9 mmol) ja disykloheksyylikarbodi-imidiä (9,6 mmol) liuotetaan 100 ml:aan kloroformia. Liuosta sekoitetaan 0,5 h ja siihen lisätään tipoittain N-palmitoyylikysteiini-tert butyyliesterin (2 g, 4,8 mmol) etukäteen valmistettu liuos 50 ml:ssa kloroformia. 1,5 h 10 kuluttua liuotin haihdutetaan kiertohaihduttimessa ja jäännös liuotetaan 100 ml:aan kloroformi/metanoliseosta 1:5. Tuote saostuu paksuna sakkana -20 °C:ssa. Se imusuo-datetaan ja kuivataan suurvakuumissa.
Saanto: 2,3 g (73 %). Molekyylipaino: (massaspektrometri) 15 C39H75N04S (655,20).
Alkuaineanalyysi:
Laskettu: C 71,48, H 11,71, N 2,13, S 4,89 %
Saatu: C 71,72, H 12,14, N 2,12, S 4,77 %
Ohutkerroskromatografia silikageelilevyillä: 20 RF = 0,67 (liuotin: kloroformi/etyyliasetaatti 95:5)
Rf = 0,73 (liuotin: kloroformi/sykloheksaani/MeOH 10:7:1) l3C-NMR: Katso kuvio 4.
XI. N-(a-tetradekyyli-S-hydroksioktadekanoyyli)-kys-teiini-tert-butyyliesteri 25 N-(a-palmitoyylipalmitoyyli)-kysteiini-tert-butyy- liesteri (1,5 g, 2,3 mmol) liuotetaan 10 ml:aan isopropanolia ja liuokseen lisätään 1,5-kertainen moolimäärä nat-riumboorihydridiä. Sekoitetaan 2 h ja reaktion päätyttyä seokseen lisätään N2-kyllästettyä 1-m kloorivetyhappoa, 30 kunnes vedynkehitys lakkaa. Tällöin tuote saostuu paksuna : sakkana. Se imusuodatetaan, pestään useita kertoja ^-kyl lästetyllä vedellä ja kuivataan suurvakuumissa.
Saanto: 1,4 g (93 %) . Molekyylipaino (massaspektrimääri-tys) : 35 = 656,11.
22 94419
Ohutkerroskromatografia silikageelilevyillä:
Rp = 0,84 (liuotin: kloroformi/etyyliasetaatti 95:5). Alkuaineanalyysi:
Laskettu: C 71,39, H 11,83, N 2,13, S 4,89 % 5 Saatu: C 71,32, H 12,39, N 2,04, S 5,33 % XII. N-(a-tetradekyy1i-β-hydroksioktadekanoyy1i)-kysteiini N- (a-tetradekyyli-fi-hydroksioktadekanoyyli) kysteii-ni-tert-butyyliesteriä (1 g, 1,5 mmol) käsitellään 0,5 h 10 vedettömällä trifluorietikkahapolla, sitten TFE poistetaan välittömästi kiertohaihduttimessa suurvakuumissa. Jäännös liuotetaan tert-butanoliin ja lyofilisoidaan.
Saanto: 0,7 g (78 %) . Molekyylipaino (massaspektrimääri-tys) : C35H69N04S = 600,0.
15 Alkuaineanalyysi:
Laskettu: C 70,06, H 10,92, N 2,33, S 5,34 %
Saatu: C 70,36, H 10,44, N 2,45, S 5,01 %
Ohutkerroskromatograf ia s i1ikageelilevyi1lä: RF = 0,43 (liuotin: kloroformi/metanoli/vesi 65:25:4) 20 XIII. N,S-dipalmitoyyli-kysteiini N,S-dipalmitoyyli-kysteiini-tert-butyyliesteriä (1 g, 1,5 mmol) käsitellään 1 h vedettömällä trifluorietikkahapolla. TFE poistetaan kiertohaihduttimessa suurvakuumissa, jäännös liuotetaan tert-butanoliin ja lyofilisoidaan.
* 25 Saanto: 0,8 g (39 %) . Molekyylipaino (massaspektrimääri- tys) : C35H67N04S (598,00).
Alkuaineanalyysi:
Laskettu: C 70,18, H 11,44, N 2,34, S 5,34 %
Saatu: C 69,97, H 11,31, N 2,50, S 5,17 % 3 0 Ohutkerroskromatograf ia: RF = 0,30 (liuotin: kloroformi/metanoli/jääetikka 90:10:1) RF = 0,75 (liuotin: kloroformi/metanoli/vesi 65:25:4)
Rf = 0,81 (liuotin: kloroformi/metanoli/ammoniakki (25 %)/ vesi 65:25:3:4).
35 ,3C-NMR: Katso kuvio 5.
23 9 4 4 1 9 XIV. N-(α-palmitoyyli-palmitoyyli)-N7-palmitoyyli-kysteiini-di-tert-butyyliesteri
Palmitoyylikloridi (8 g, 30 mmol) liuotetaan 40 ml:aan N2-kyllästettyä dimetyyliformamidia ja liuokseen li-5 sätään trietyyliaroiinia (60 ml, 60 mmol). Seosta keitetään typpikehässä palautusjäähdyttäen 3 h, jolloin tetradekyy-liketeeni-diraeerin muodostuessa syntyvä trietyyliammonium-kloridi saostuu värittömänä suolana. Palautusjäähdytin korvataan sitten tiputussuppilolla ja seokseen tiputetaan 10 hitaasti kysteiini-di-tert-butyyliesterin (4,9 g, 15 mmol) liuos 20 ml:ssa dimetyyliformamidia. 6 h kuluttua liuotin poistetaan kiertohaihduttimessa, jäännös liuotetaan kloroformiin ja pestään 5-%:isella kaliumvetysulfaattiliuoksel-la (2 x 100 ml) ja vedellä (1 x 1200 ml) . Orgaaninen faasi 15 kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla ja liuotin poistetaan jälleen. -20 °C:ssa kiteytyy N-(a-palmitoyyli-pal-mitoyyli)-N'-palmitoyyli-kysteiini-tert-butyyliesterin ja N,N7-dipalmitoyyli-kysteiini-di-ter-butyyliesterin seos, joka jaetaan geelisuodatuksella Sephadex LH-20:llä kloro-20 formi/metanoliseoksessa 1:1.
Saanto: 6,4 g (40 %). Molekyylipaino (massaspektri): C62H„8N207S (1067,76).
. Ohutkerroskromatografia silikageelilevyillä: RF = 0,69 (liuotin: kloroformi/etyyliasetaatti 91:5).
25 XV. N-(α-palmitoyyli-palmitoyyli)-kysteiini-tertbu- tyyliesteri N-(a-palmitoyyli-palmitoyyli) -N7 -palmitoyyli-kys-teiini-di-tert-butyyliesteri (3,2 g, 3 mmol) liuotetaan pieneen määrään metyleenikloridia ja liuokseen lisätään 30 100 ml 9,1-m HCl-metanoliliuosta. Liuos siirretään elekt- : rolyysikennoon, jonka anodina on hopeaelektrodi ja katodi na elohopea, ja pelkistetään siinä vakiojännitteellä -1,1 V. Virranvoimakkuus laskee sähkökemiallisen pelkistyksen lopussa noin 200 mA:sta lähes 0:aan. Tämän jälkeen liuotin 35 poistetaan kiertohaihduttimessa ja N-(a-palmitoyylipalmi- • 24 944 1 9 toyyli)-kysteiini-tert-butyyliesterin ja N-palmitoyylikys-teiini-tert-butyyliesterin muodostama tuoteseos saostetaan metanolista -20 °C:ssa. Nämä molemmat yhdisteet erotetaan geelisuodatuksella Sephadex LH-20:llä kloroformi/metanoli-5 seoksessa 1:1.
Saanto: 1,5 g (76 %) . Molekyylipaino (massaspektrimääri-tys) C39H75N04S (654,09).
Ohutkerroskromatograf ia s i1ikagee1ilevy i1lä:
Rf = 0,75 (liuotin: kloroformi/etyyliasetaatti 95:5) 10 Alkuaineanalyysi:
Laskettu: C 71,48, H 11,71, N 2,13, S 4,89 %
Saatu: C 71,16, H 11,31, N 2,00, S 4,65 % XVI. Boc-Asn-Arg(N02)-Arg(N02)-OH:n valmistus XVI. 1. Boc-Arg(N02) -OMe 15 Boc-Arg (N02)-OMe:n (15,97 g, 50 mmol) , HOBt:n (6,6 g, 50 mmol) ja DMF:n (100 ml) seos lisätään -10 °C:ssa HC1 x H-Arg (N02) -OMe: n (13,49 g, 50 mmol), NMM:n (5,5 ml, 50 mmol) ja CH2Cl2:n (12 ml) seokseen, seosta sekoitetaan -10 °C:ssa 30 min, 0 °C:ssa 1 h ja huoneen lämpötilassa 3 h.
20 Sitten reaktio pysäytetään lisäämällä joitakin tippoja jääetikkaa. Saostunut DCH suodatetaan ja suodoksesta haihdutetaan liuotin suurvakuumissa. Öljymäinen jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin, johon on lisätty jonkin verran . n-butanolia. Orgaaninen faasi pestään 5-%:isella KHS04- 25 liuoksella, 5-%:isella KHC03-liuoksella ja kyllästetyllä NaCl-liuoksella, kuivataan Na2S04:llä, ja tuote saostetaan kylmässä lisäämällä petrolieetteriä (30-50).
Saanto: 2,30 g (76 %). Sulamispiste: 130 °C (hajoaa). Ohutkerroskromatograf ia: 30 RF (I) = 0,69 RF (II) = 0,87 RF (III) = 0,81 Rf (IV) = 0,32 Rf (V) = 0,42 35 Molekyylipainomääritys: C18H54N10O9 (534,5) f il IU 1 1 11: I I I u : 25 - 94419
Alkuaineanalyysi:
Laskettu: C 40,45, H 6,41, N 26,20 %
Saatu: C 40,39, H 6,55, N 26,11 % XVI. 2. HCl x H-Arg (N02) -Arg (N02) -OMe 5 Boc-Arg-(N02) -Arg(N02) -OMe:hen (20,00 g, 37,42 mmol) lisättiin 1,2-m HCl/etikkahapposeosta (110 ml) ja seos kaadettiin 30 minuutin kuluttua sekoittaen eetteriin (600 ml) . Tällöin saostui ohutkerroskromatografisesti puhdas HCl x H-Arg (N02) -Arg (N02) -OMe.
10 Saanto: 17,3 g (98 %).
Ohutkerroskromatograf ia si1ikagee1ilevyi1lä:
Rf (I) = 0,37 Rf (II) = 0,29 RF (III) = 0,44 15 RP (IV) =0,07 RF (V) =0,10 XVI. 3 . Boc-Asn-Arg (N02) -Arg (N02) -OMe
Boc-Asn-OH (8,39 g, 36,10 mmol) ja HOBt (4,89 g, 36,10 mmol) DMF:ssä (75 ml) lisätään -10 °C:ssa HCl x H-20 Arg(N02) -Arg(N02) -OMe:n (17,00 g, 36,10 mmol) ja NMM:n (3,98 mmol) liuokseen DMF:ssä (75 ml). Lisätään DCC:tä (7,35 g, 36,50 mmol) CH2Cl2:ssa (10 ml) ja seosta sekoitetaan 30 min -10 °C:ssa, 1 h 0 °C:ssa ja 3 h huoneen lämpö-. tilassa. Reaktio pysäytetään lisäämällä joitakin tippoja 25 jääetikkaa, liuotin haihdutetaan vakuumissa ja jäännös liuotetaan pieneen määrään metanolia. Liuos tiputetaan sekoittaen vedettömään eetteriin. Sakka suodatetaan ja liuotetaan metanoliin. Kylmässä saostuu puhdas tuote.
Saanto: 18,25 g (78 %). Sulamispiste: 170°C.
3 0 Ohutkerroskromatogra f i a: RF (I) = 0,59 RP (II) = 0,67 Rf (III) = 0,66 RF (IV) =0,45 35 RF (V) =0,65 26 9 4 4 1 9
Aminohappoanalyysi:
Asn 1,00 (1), Arg 1,85 (2)
Molekyylipainomääritys C22H4oN120, (648,6)
Alkuaineanalyysi: 5 Laskettu: C 40,74, H 6,22, N 25,91 %
Saatu: C 40,70, H 6,40, N 25,79 %
XVI. 4 . Boc-Asn-Arg (N02) -Arg (N02) -OH
Boc-Asn-Arg (N02)-OMe (18,00 g, 27,75 mmol) saippuoidaan metanolissa (180 ml) 1-m NaOH:lla (80 ml) huoneen 10 lämpötilassa. 2 h kuluttua neutraloidaan laimealla HCl:llä ja metanoli haihdutetaan vakuumissa. Tuote uutetaan tyhjentävästi pH-arvossa 3 etyyliasetaatilla. Orgaaniset faasit pestään pienellä määrällä kyllästettyä NaCl-liuosta, kuivataan Na2S04:llä ja tuote kiteytetään metanoliliuokses-15 ta -20 °C:ssa.
Saanto: 15,84 (90 %). Sulamispiste: 228 °C (hajoaa). Ohutkerroskromatograf ia: RF (I) = 0,49; Rf (II) = 0,21; RF (III) = 0,26; RF (IV) = 0,05; Rf (V) = 0,21 20 Koemateriaalit ja menetelmät
Kemikaalit
Liuottimet pro analyysi toimitti firma Merck, muuten liuottimet kuivattiin ja tislattiin tavallisella tavalla. N-metyylimorfOliini (Merck) tislattiin ninhydriinin 25 kanssa sek.amiinien poistamiseksi. 1-hydroksibentsotriat- soli ja disykloheksyylikarbodi-imidi saatiin myös Merck-iltä. Kaikki L-aminohappojohdannaiset toimitti firma Bachem. Boc-Aib-OH ja H-Aib-OMe x HC1 syntetisoitiin kirjallisuuden ohjeiden mukaan.
3 0 Ohutkerroskromatogra f ia: : Käytettiin valmiita silikageelilevyjä 60 F254 (Merck) ja seuraavia liuottimia.
(I) 1-butanoli/jääetikka/vesi 3:1:1 (II) kloroformi/metanoli/jääetikka/vesi 65:25:3:4 35 (III) kloroformi/metanoli/väkevä ammoniakki/vesi 65:35:3:4 27 944':9 (IV) kloroformi/metanoli/vesi 65:25:4 (V) kloroformi/roetanoli 1:1
Sumutusreagensseina käytettiin seuraavia: ninhyd- riinireagenssi, kloori/4,4'-bis(dimetyyliamino)difenyyli-5 metaani (TDM-reagenssi) ja Sakaguchi-reagenssi. Vertailuna oli disykloheksyyliurea, jonka arvot olivat seuraavat:
Rf (I) 0,91, RF (II) 0,82, RP (III) 0,92, RF (IV) 0,81, RF
(V) 0,83.
Aminohappoanalyysit: 10 Välituotteiden tunnistamiseksi suojattu peptidi (noin 200 hydrolysoitiin 6-m HCl:ssä 24 h 110 °C:ssa.
Heksapeptidisegmentin välituotteet ja loppusekvenssi, jotka sisältävät Leu-Leu-sidoksen hydrolysoitiin muuten samoissa olosuhteissa 72 h. Aminohappoanalyysit suoritettiin 15 Biotronik-aminohappoanalysaattorilla LC 6000 E käyttäen standardiohj elmointia.
Rasemaattimääritys:
Hydrolysoidut aminohapot muutettiin pentafluoripro-pionyyliaminohappo-n-propyyliesterijohdannaisiksi, ja 20 enantiomeerit erotettiin kaasukromatografialla lasikapil- laaripylväissä Chirasil-Val:illa. Ilmoitettuja D-aminohap-pojen %-osuuksia ei ole korjattu hydrolyysin aiheuttaman rasemoitumisen suhteen.
Alkuaineanalyysit: 25 C,H,N-yksittäismääritykset suoritettiin Elemental-
Analyzer mallilla 1104 (Carlo Erba, Milano).
Sulamispisteet:
Sulamispisteet määritettiin Tottoli-laitteella ja ne ovat korjaamattomia.
30 Spektrimääritykset: 13C-NMR-spektrit: 30 mg suojattua eikosapeptidiä liuotettiin 400 phaan l2C2HCl3/l2C2H302H-seosta (1:1) (Merck) ja mittaus suoritettiin NMR-spektrometrillä WM 400 (Firma Bruker) 12 h 30 °C:ssa. Sirkulaaridikroismispektrit: va-35 paan eikosapeptidin (c = 1-1,7 mg/ml) liuokset etanolissa, 28 - 94419 trifluorietanolissa, metanolissa, 1,1,1,3,3,3-heksafluori-propanoli-(2):ssa, vedessä sekä etanoli/vesiseoksissa mitattiin Dichrograph II:lla (firma Jouhan-Roussel).
Kromatografinen puhdistus: 5 Suojatut peptidi-välituotteet liuotettiin kytken- täreaktion päättymisen ja liuottimen poistamisen (öljy-pumppu vakuumi) jälkeen yhtä suureen tilavuusmäärään CHC13/ MeOH-seosta (1:1), disykloheksyyliurea erotettiin linkoamalla ja liuos kromatografoitiin Sephadex LH 20:llä: pyl-10 väs 3 x 115 cm; eluentti CHCl3/MeOH 1:1; lisäysmäärä 35 ml; virtausnopeus 8,40 ml/10 min; 3 ml:n fraktiot tutkittiin ohutkerroskromatografiällä systeemissä II (TDM-reagenssi). Peptidit ilmaantuivat eluointitilavuudessa 165-190 ml. Fraktiot yhdistettiin, liuotin haihdutettiin vakuumissa, 15 ja jäännös kuivattiin P205:n yllä. Aminohappoanalyysillä saatiin odotetut arvot ja peptidipitoisuus 92-96 %.
Immunointikokeet:
Ensin B-solu-mitogeeni, joka on samanaikaisesti erinomainen kantaja ja vahvasti vaikuttava adjuvantti, 20 kytkettiin kovalenttisesti synteettisiin antigeenisiin determinantteihin. Tähän käytettiin mm synteettistä lipopep-tidiä S-(2,3-bis(palmitoyylioksi)propyyli)-N-palmitoyyli-kysteinyyli-seriiniä (Pam3Cys-Ser), joka vastaa Escherichia colin ulomman membraanin lipoproteiinin N-termiiniä. Kova-25 lenttisesta liittymisestä antigeeniin johtuvat erityisen selvät amfifiiliset ominaisuudet takaavat toisaalta kolme rasvahappotähdettä sisältävän S-glyseryyliyhdisteen stabiilin ankkuroitumisen solumembraanin lipidikerrokseen. Toisaalta se herkistää etukäteen membraanin ulomman hydro-30 fiilisen kerroksen polaarisimman antigeenin (tai haptee-nin) . Koska lipoproteiinin aktivoiva vaikutus määräytyy pelkästään sen N-terminaaliosan mukaan, säilyy immunosti-muloiva vaikutus kaikissa konjugaateissa, jotka sisältävät Pam3Cys-Ser-ryhmän tai sen analogin.
29 - 94419
Esimerkkinä tästä käytöstä esitetään kuviossa 9 spesifisten vasta-aineiden tuottaminen epidermistä kasvutekijä-reseptoria (GF-R) vastaan. Tällöin tietokoneelle suoritetulla epitooppietsinnällä valittiin ekstrasytoplas-5 ma-alue 516-529, koottiin Merrifield-synteesillä ja lopuksi siihen liitettiin Fmoc-Ser (Bu‘)-OH ja sitten Pam3Cys-OH. Hartsista irrottamisen jälkeen analyyttisesti yhtenäiseksi todettua konjugaattia annettiin ilman muita lisäaineita yhtenä ainoana annoksena hiirille i.p. ELISA-kokeilla to-10 dettiin jo 2 viikon kuluttua korkea spesifisten vasta-aineiden titteri tetradekapeptidiä vastaan. Olennaista on, että kontrollikokeissa ei ilmeisen heikosti immunogeeninen tetradekapeptidi aiheuttanut lainkaan vasta-aineiden muodostumista.
15 Koska Pam3Cys-konjugaatit ovat myös soluviljelmissä vahvasti immunogeenisiä, voidaan in vitro immunoinnilla saada nopeasti ja elegantisti tavanomaisia ja monoklonaa-lisia vasta-aineita myös heikosti immunogeenisiä yhdisteitä vastaan.
20 Tämän suunnitelman etuja sitä käytettäessä soluvil jelmillä ovat: kemiallisesti yksiselitteisesti määritellyn antigeeni-adjuvantti-konjugaatin yksinkertainen valmistus mielivaltaisina määrinä; päinvastoin kuin muita konjugaat-teja käytettäessä yksi ainoa antokerta ilman useampiker-25 täistä tehosteen antamista; korkea teho in vivo ja in vitro. On selvää, että näin saadaan huomattava koe-eläinten säästö - usein niitä ei lainkaan tarvita in vivo immunoin-tiin - ja huomattava ajansäästö varsinkin geeniteknologian töissä. Kokeet voidaan suorittaa myös ihmisen soluviljel-30 mäsysteemeissä.
Esimerkki in vivo immunoinnista 6-10 viikon ikäiset Balb/c-hiiret immunoitiin antamalla kerran i.p. 50 μg ja 500 μq (0,2 ml kovalenttisesti antigeeniin kytketyn adjuvantin lO^-lO^-m liuosta) Pam3-35 Cys-Ser-(EGF-R 515-529). Kontrollina oli antigeeni, adju- 30 94419 vantti ja antigeenin ja adjuvantin seos, joita annettiin jokaista vertailukelpoinen moolimäärä, sekä väliaine. 2 viikon kuluttua injektion antamisesta hiiristä otettiin silmäkuopantakaisesta laskimopunoksesta verta seerumin 5 saamiseksi vasta-ainetiitterin määritykseen ELISA-kokeel-la.
Analogisesti immunointi voidaan myös suorittaa muita antotapoja käyttäen, kuten i.v., oraalinen, rektaali- Π6Ωg x·m·f S♦O· 10 Tutkittiin myös spesifisten vasta-aineiden muodos tuminen ilman Freundin adjuvanttia tetradekapeptidiä EGF-R 516-529 vastaan in vivo immunoinnin jälkeen.
Balb/c-hiiret (katso kuvio 10) immunoitiin I. konjugaatilla Pam3Cys-Ser (EGF-R 516-526) 15 II. pelkällä vapaalla tetradekapeptidillä, (EGF-R 516-529) III. pelkällä Pam3Cys-Ser: llä IV. vapaalla tetradekapeptidillä, (EGF-R 516-529) seoksena Pam3Cys-Ser:in kanssa; kerran i.p. 0,2 μιηοοίίΐΐβ konjugaattia. Vasta-ainetiitteri 20 määritettiin ELISA-kokeella (ordinaatta OD kohdassa 405 nm) (kuvio 10).
14 vrk immunoinnin jälkeen hiirien silmälaskimosta otettiin verta ja saatu seerumi tutkittiin ELISA-kokeessa.
Arvot saadaan PEP 14-BSA-konjugaatin ja BSA:n ELISA-arvo-25 jen erotuksen keskiarvosta (3-5 hiirtä) (kuvio 10).
Voidaan todeta, että vain käyttämällä keksinnön mukaisesti valmistettua membraaniankkuri-vaikuttava-aine-konjugaattia saadaan dramaattisesti kohonneet vasta-aine-konsenteraatiot, jotka ylittävät tähänastisilla menetel-30 millä saadut tehokkuudeltaan moninkertaisesti.
Esimerkki in vitro immunoinnista
Hiirien pernasöluja viljeltiin konjugaatin Pam3Cys-Ser-(EGF-R 515-529), adjuvantin Pam3Cys-Ser, tetradekapep-tidin EGF-R 516-529 ja antigeenin ja adjuvantin seoksen 35 läsnäollessa 5 vrk.
3i . 94419
Lymfosyyttejä (solutiheys 2,5 x 106/ml) viljeltiin 48 h, 0,2 ml:ssa RPMl-1640-väliainetta, johon oli lisätty 10 % kuumassa inaktivoitua FCS:ää, glutamiinia (2 mmol), penisilliiniä (100 yks/ml), sterptomysiiniä (100 pg/ml) ja 5 2-merkaptoetanolia (5 x 10 mol).
Kunkin kokeen päällä olevasta nesteestä tutkittiin spesifinen vasta-ainemuodostus ELISA-kokeella.
Hiiren pernasolujen mitogeeninen aktivointi
Balb/c-pernasolujen mitogeeninen aktivoituminen 10 Pam3Cys-Ser-(Lys)4-FITC:n (ympyrät), Pam3Cys-Ser-(Lys)4-0H x 3HCl:n (kolmiot) ja Pam3Cys-Ser-(Lys)4-0H x 2TFE:n (neliöt) vaikutuksesta nähdään kuviossa 12. Soluviljelyolo-suhteet on kuvattu (Z. Immunoforsch. 153, 1977, s 11 ff ja Eur. J. Biochem. 115, 1981). Piirroksessa on esitetty or-15 dinaatalla 3H-tymidiinin DNA:hän liittämisen stimulaati-oindeksi (inkorporaation cpm-arvo/ilman mitogeenia olevan kontrollin cpm-arvo) käytetyn vaikuttavan aineen konsent-raation funktiona.
Vertailu in vivo/in vitro 20 Kuviossa 11 on vertailtu edellä esitettyä in vivo koetta ja in vitro koetta:
In vitro koe suoritettiin mikrotiitterilevyillä: solutiheys: 2,5 x 106 solua/ml; substanssikonsentraatio: 5 x 10"7 mmolaarinen; inkubaatio-olosuhteet: 37 °C, 5 % C02 25 5 vrk.
Kuviossa 11 käytetyillä lyhenteillä on seuraavat merkitykset:
Conj .: Konjugaatti Pam3Cys-Ser-(EGF-R 515-529)
Pep: tetradekapeptidi EGF-R 516-529 30 Adj. Pam3Cys-Ser
Mix: vapaan tetradekapeptidin EGF-R 516-529:n ja Pam3Cys-Ser:in seos.
Myös in vitro saadaan melkoinen vasta-ainekonsent-raation kohoaminen, mikä laajentaa huomattavasti soluvil-35 jelmien käyttömahdollisuutta varsinkin vasta-aineiden val mistuksessa.
♦

Claims (9)

32 94419
1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen mem-braaniankkuri-vaikuttava-ainekonjugaatin valmistamiseksi, 5 joka konjugaatti sisältää ainakin yhden membraaniankkuri-yhdisteen ja ainakin yhden kovalenttisesti membraaniankku-riyhdisteeseen tai -yhdisteisiin sidotun vaikuttavan aineen, tunnettu siitä, että peptidi, jonka ne funktiot on sinänsä tunnetulla tavalla suojattu suojaryh- '10 millä, joissa ei saa tapahtua minkäänlaista reaktiota, syntetisoidaan tunnetulla kytkentämenetelmällä kiinteälle tai liukenevalle kantajalle, kuten polymeerille (esim. Merrifield-hartsi), että täten syntetisoitu, kantajaan sidottu peptidi sidotaan peptidin N-päätteen tai sivufunk-15 tion välityksellä kovalenttisesti membraaniankkurivaikut-tava-ainekonjugaatiksi, jonka yleinen kaava on jokin seu-raavista: R -CO-O-CH R -0-CH, R - O-CO-CH- I | * I z R'-CO-O-CH* R'-O-CH* R'- O-CO-CH* I i i on IcH,)n (CH.) (CH,) n
20 I 2 n i 2 n , 2 n A A A (CH.) (CH,) (CH,) I l m , 2 m i 2 n R"-C0-NH-CH*-C0-X R "-C0-NH-CH*-C0-X R'e-C0-NH-CH*-C0-X I. II. III. '· 25 R -NH-C0-^H2 R- co-nh-ch2 R'-NH-CO-CH* R'-CO-NH-CH* ‘4H2>n "fH2'n ? * f f «jV. R·1-C0-NH-CH"-C0-X R··-CO-NH-CH’-CO-X R-NH-CO-CH*-CC-X 30 IV. v. VI. Rl-CH2 R,-CH* iCHj) I 2 n A (CH,) I 2 n R-C0-NH-CH*-C0-X » VII. 33 94419 joissa A on rikki, happi, disulfidi (-S-S-), metyleeni (CH2-) tai -NH-; B on ryhmä -S (CH2)D-(substituoitu alkyyli), jossa substituoitu alkyyli on mikä tahansa kaavoissa I - V esiintyvä ryhmään -(CH2)n- liittyvä substituoitu alkyyli; n 5 = 0 - 5; m on 1 tai 2; C* on asymmetrinen hiiliatomi, jon ka konfiguraatio on R tai S; R, R', R" ovat samoja tai erilaisia ja tarkoittavat vetyatomia tai 7-25 hiiliatomia sisältävää alkyyli-, alkenyyli- tai alkynyyliryhmää, jossa voi olla substituentteina hydroksi-, amino-, okso-, 10 asyyli-, alkyyli- tai sykloalkyyliryhmiä, ja Rj ja R2 ovat samoja tai erilaisia ja voivat merkitä samaa kuin R, R' tai R" tai ryhmiä -OR, -OCOR, -COOR, -NHCOR, -CONHR, ja X on vaikuttava-aine tai spacer-vaikuttava-aineryhmä, lukuunottamatta yhdisteitä, joissa X on aminohapposekvenssi, 15 jossa on 2 - 10 luonnon aminohappoa, että täten valmistettu peptidikonjugaatti eristetään poistamalla sinänsä tunnetulla tavalla suojaryhmät ja peptidi/kantaja-sidos, jolloin saadaan membraaniankkuripeptidi tai membraaniankkuri-vaikuttava-ainekonjugaatti, jolloin vaikuttava aine on -20 antigeeni, kuten esimerkiksi proteiinin tai proteidin, esimerkiksi glykoproteiinin, virusvaippaproteiinin, bak-teerisoluseinämäproteiinin tai prototsoaproteiinin alem-pimolekyylipainoinen osasekvenssi (antigeenindeterminant-ti, epitooppi), bakteerimembraanin ainesosa, kuten mura- 25 myylidipeptidi, lipopolysakkaridi, luonnollinen tai syn teettinen hapteeni, antibiootti, hormoni, nukleosidi, nukleotidi, nukleiinihappo, entsyymi, entsyymisubstraatti, entsyymi-inhibiittori, biotiini, avidiini, polyetyleeni-glykoli, peptidi-vaikuttava-aine, kuten tuftsiini, polyly-30 siini, fluoresenssimerkkaaja, FITC, RITC, dansyyli, lumi- noli tai kumariini, bioluminisenssimerkkaaja, spinmerkki-aine, alkaloidi, steroidi, biogeeninen amiini, vitamiini, toksiini, kuten esimerkiksi digoksiini, falloidiini, ama-nitiini, tetrodoksiini tms, kompleksinmuodostaja tai lää-35 keaine. 34 94419
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että membraaniankkuriyhdiste on Pam3Cys tai Pam3Cys-Ser tai 1-10 aminohappoa sisältävä Pam3Cys-peptidi.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että membraaniankkuriyhdiste on PamCys(Pam)-0H tai Pam(a-Pam)-Cys[Pam(a-Pam)]-OH.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että membraaniankkuriyhdiste on 10 a-alkyyli- β-hydroksiasyylipeptidi (mykolyylipeptidi), jonka peptidiketjussa on 1 - 10 aminohappoa.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että membraaniankkuriyhdiste on S-(1,2-dioktadekyylioksikarbonyylietyyli)-kysteiini tai tä- 15 män yhdisteen homologi.
6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaikuttava aine on kovalenttisesti sitoutunut kahteen, mahdollisesti erilaiseen membraaniankkuriyhdisteeseen.
7. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai nen menetelmä, tunnettu siitä, että vaikuttava aine on lisäksi kovalenttisesti sitoutunut sinänsä tunnettuun immunointitarkoituksiin käytettyyn adjuvanttiin, esim. muramyylidipeptidiin ja/tai lipopolysakkaridiin. i ‘25
8. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai nen menetelmä, tunnettu siitä, että useat mem-braaniankkuri-vaikuttava-ainekonjugaattiyhdisteet ovat verkkoutuneet toistensa kanssa lipidi- ja/tai vaikuttava-aineosassa.
9. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai nen menetelmä, tunnettu siitä, että membraaniankkuriyhdiste ja vaikuttava-aine sidotaan toisiinsa kovalenttisesti verkkoutusaineen välityksellä, esimerkiksi di-karboksyylihappojohdannaisen, diolin, diamiinin, polyety- 35 leeniglykolin, epoksidin, maleiinihappojohdannaisen tms välityksellä. t 35 94419
FI862631A 1985-06-24 1986-06-19 Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen membraaniankkuri-vaikuttava-ainekonjugaatin valmistamiseksi FI94419C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3522512 1985-06-24
DE3522512 1985-06-24
DE19853546150 DE3546150A1 (de) 1985-06-24 1985-12-27 Membrananker-wirkstoffkonjugat, seine herstellung sowie seine verwendung
DE3546150 1985-12-27

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI862631A0 FI862631A0 (fi) 1986-06-19
FI862631A FI862631A (fi) 1986-12-25
FI94419B FI94419B (fi) 1995-05-31
FI94419C true FI94419C (fi) 1995-09-11

Family

ID=25833375

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI862631A FI94419C (fi) 1985-06-24 1986-06-19 Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen membraaniankkuri-vaikuttava-ainekonjugaatin valmistamiseksi

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0210412B1 (fi)
JP (1) JP2594259B2 (fi)
KR (1) KR930008091B1 (fi)
AT (1) ATE131491T1 (fi)
AU (1) AU611385B2 (fi)
CA (1) CA1340656C (fi)
DE (2) DE3546150A1 (fi)
DK (1) DK172399B1 (fi)
ES (1) ES8801677A1 (fi)
FI (1) FI94419C (fi)
NO (1) NO174207C (fi)
PT (1) PT82826B (fi)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6074650A (en) * 1985-06-24 2000-06-13 Hoechst Aktiengesellschaft Membrane anchor/active compound conjugate, its preparation and its uses
US6024964A (en) * 1985-06-24 2000-02-15 Hoechst Aktiengesellschaft Membrane anchor/active compound conjugate, its preparation and its uses
DE3937412A1 (de) * 1989-11-10 1991-05-16 Hoechst Ag Synthetische vakzine zur spezifischen induktion zytotoxischer t-lymphozyten
DE3813821A1 (de) * 1988-04-22 1989-11-02 Hoechst Ag Synthetische vakzine gegen die maul- und klauenseuche und verfahren zu deren herstellung
CA1331355C (en) * 1986-04-21 1994-08-09 Bioenterprises Pty. Ltd Immunopotentation
AU619443B2 (en) * 1986-04-21 1992-01-30 Bioenterprises Pty. Ltd. Immunopotentiation
JPS63107742A (ja) * 1986-05-20 1988-05-12 Wako Pure Chem Ind Ltd 新規な機能性リポソ−ム及びその製造法
DE3700173A1 (de) * 1987-01-05 1988-07-14 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von lipophilen aminosaeurederivaten sowie lipophile aminosaeurederivate
US5976839A (en) * 1987-03-13 1999-11-02 Bioenterprises Pty Limited Immunopotentiation through covalent linkage between immunogen and immunopotentiating molecules
GB2217319A (en) * 1988-04-19 1989-10-25 Synpharm Ltd Racemic and optically active fatty amino acids, their homo- abd hetero-oligomers and conjugates, the process of their production, their pharmaceutical composi
US5120829A (en) * 1989-03-20 1992-06-09 La Jolla Cancer Research Foundation Hydrophobic attachment site for adhesion peptides
EP0485563B1 (de) * 1990-05-30 1994-12-21 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Polyethersubstituierte tumormittel
DE4119856A1 (de) * 1991-06-17 1992-12-24 Hoechst Ag N-acyl-s-(2-hydroxyalkyl)-cysteine, deren herstellung sowie deren verwendung als zwischenprodukte zur herstellung von synthetischen immunadjuvantien und synthetischen impfstoffen
EP0604945A1 (en) * 1992-12-28 1994-07-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. TAN-1511, its derivatives, production and use thereof
AU666789B2 (en) * 1992-12-28 1996-02-22 Takeda Chemical Industries Ltd. 2-amino-6,7-dihydroxy-4-thiaheptanoic acid derivatives, production and use thereof
DE4325317C2 (de) * 1993-07-29 1998-05-20 Univ Dresden Tech Verfahren zur radioaktiven Markierung von Immunglobulinen
DE4329309A1 (de) * 1993-08-31 1995-03-09 Rapp Polymere Gmbh Lipopeptid-Verbindungen
EP0641776A3 (en) * 1993-09-08 1997-05-02 Takeda Chemical Industries Ltd Thioglycerol derivatives.
FR2727117A1 (fr) * 1994-11-18 1996-05-24 Geffard Michel Utilisation de conjugues de la polylysine pour la preparation de medicaments utiles dans le traitement des maladies neurodegeneratives et des affections degeneratives a caractere autoimmun
US6117940A (en) * 1997-10-17 2000-09-12 Mjalli; Adnan M. M. Amino-ketone solid support templates
NZ506839A (en) * 1998-03-09 2003-05-30 Zealand Pharma As Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis
IL125908A (en) 1998-08-24 2005-05-17 Nst Neurosurvival Technologies Peptides and pharmaceutical compositions comprising same
IL131266A0 (en) 1999-08-05 2001-01-28 N S T Neurosurvival Technologi Peptides and pharmaceutical compositions comprising same
GB9915074D0 (en) * 1999-06-28 1999-08-25 Cortecs Plc Ligand-binding composition
DE102009034779A1 (de) 2009-07-25 2011-02-03 Emc Microcollections Gmbh Synthetische Analoga bakterieller Lipopeptide und ihre Anwendung zur Therapie und Prophylaxe allergischer Erkrankungen
WO2011119759A1 (en) * 2010-03-23 2011-09-29 Irm Llc Compounds (cystein based lipopeptides) and compositions as tlr2 agonists used for treating infections, inflammations, respiratory diseases etc.
DE102011018499A1 (de) 2011-04-23 2012-10-25 Emc Microcollections Gmbh Topische Nanopartikel-Vakzine zur Immunstimulation der dendritischen Zellen in der Haut
US10766928B2 (en) 2012-10-05 2020-09-08 The University Of Kansas Targeted conformationally-constrained kinked endosomal disrupting peptides
US9701715B2 (en) * 2012-10-05 2017-07-11 The University Of Kansas Conformationally-constrained kinked endosomal-disrupting peptides
JP6458809B2 (ja) 2014-04-25 2019-01-30 味の素株式会社 免疫賦活剤
DE102016005550B4 (de) 2016-05-09 2024-09-26 Hans-Georg Rammensee Adjuvans zur lnduzierung einer zellulären lmmunantwort
RS65380B1 (sr) 2017-08-24 2024-04-30 Novo Nordisk As Glp-1 kompozicije i njihova upotreba
US20230093542A1 (en) 2020-02-18 2023-03-23 Novo Nordisk A/S Glp-1 compositions and uses thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0000330B1 (de) * 1977-06-20 1981-08-05 Ciba-Geigy Ag Lipopeptide, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate
US4125569A (en) 1977-08-25 1978-11-14 Mobil Oil Corporation Process for increasing hydrogenation rate of polymerized n-alphaolefins
EP0014815A3 (de) * 1978-12-20 1980-10-29 Ciba-Geigy Ag Peptidderivate, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte sowie pharmazeutische Präparate mit einer dieser Verbindungen
EP0114787B1 (de) 1983-01-25 1991-09-25 Ciba-Geigy Ag Neue Peptidderivate

Also Published As

Publication number Publication date
JPS6263600A (ja) 1987-03-20
DK172399B1 (da) 1998-05-18
NO862511D0 (no) 1986-06-23
PT82826A (de) 1986-07-01
ES556417A0 (es) 1988-02-16
AU611385B2 (en) 1991-06-13
EP0210412A3 (en) 1990-02-07
DK294086D0 (da) 1986-06-23
NO862511L (no) 1986-12-29
FI862631A0 (fi) 1986-06-19
NO174207C (no) 1994-03-30
AU5894386A (en) 1987-01-08
JP2594259B2 (ja) 1997-03-26
KR930008091B1 (en) 1993-08-25
DE3650448D1 (de) 1996-01-25
FI94419B (fi) 1995-05-31
FI862631A (fi) 1986-12-25
KR870000359A (ko) 1987-02-18
CA1340656C (en) 1999-07-20
ES8801677A1 (es) 1988-02-16
EP0210412A2 (de) 1987-02-04
NO174207B (no) 1993-12-20
DK294086A (da) 1986-12-25
DE3546150A1 (de) 1987-01-22
ATE131491T1 (de) 1995-12-15
EP0210412B1 (de) 1995-12-13
PT82826B (pt) 1989-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI94419C (fi) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen membraaniankkuri-vaikuttava-ainekonjugaatin valmistamiseksi
US4493795A (en) Synthetic peptide sequences useful in biological and pharmaceutical applications and methods of manufacture
EP0535155B1 (en) Libraries of modified peptides with protease resistance
US6217873B1 (en) Polyoxime compounds and their preparation
JPH03504013A (ja) Ｔ細胞ヘルパー活性を有するペプチド
US6074650A (en) Membrane anchor/active compound conjugate, its preparation and its uses
US6024964A (en) Membrane anchor/active compound conjugate, its preparation and its uses
US5869606A (en) Amino acids peptides or derivatives thereof coupled to fats
US4859765A (en) Synthetic peptide sequences useful in biological and pharmaceutical applications and methods of manufacture
EP0506748B1 (en) Amino acids, peptides or derivatives thereof coupled to fats
EP0597997B1 (en) Lanthionine bridged peptides
US5079231A (en) Immunostimulating peptides, a process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
EP0157753B1 (en) New somatostatin compounds, process for their synthesis, preparation for veterinary use containing said compound and process for the treatment of animals
JP3734828B2 (ja) ポリオキシム化合物及びそれらの調整
JP5072164B2 (ja) ペプチドと親油性ベクターとを溶液中で結合するための方法およびその使用
US6028168A (en) Lanthionine bridged peptides
IT9019914A1 (it) Composti immunogenici, il procedimento per la loro sintesi e loro impiego per la preparazione di vaccini antimalaria
GB2282813A (en) Annular antigen scaffolds comprising thioether linkages
JPH0137399B2 (fi)
WO2006035815A1 (ja) 熱帯熱マラリア原虫のエノラーゼ蛋白質の部分ペプチドの製造方法
Muller et al. Specific antibody response towards predicted epitopes of the epidermal growth factor receptor induced by a thermostable synthetic peptide adjuvant conjugate.
CN113164613B (zh) 二聚的肽-磷脂缀合物的优化方法
EP3936191A1 (en) Hemagglutinin-binding peptide
Jung et al. Potent B-lymphocyte mitogens as covalently bound carriers for the presentation of antigens and enhancement of immune response
Bessler et al. Modulation of the immune system by bacterial products: Hapten-specific humoral immune responses induced by lipopeptides conjugated to T helper cell epitopes

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
FG Patent granted

Owner name: AVENTIS PHARMA DEUTSCHLAND GMBH

PC Transfer of assignment of patent

Owner name: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH

Free format text: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH

MA Patent expired