EP0000330B1 - Lipopeptide, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate - Google Patents

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EP0000330B1
EP0000330B1 EP78100149A EP78100149A EP0000330B1 EP 0000330 B1 EP0000330 B1 EP 0000330B1 EP 78100149 A EP78100149 A EP 78100149A EP 78100149 A EP78100149 A EP 78100149A EP 0000330 B1 EP0000330 B1 EP 0000330B1
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ser
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palmitoyl
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EP78100149A
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Lajos Zoltan Dr. Tarcsay
Bruno Dr. Kamber
Jaroslav Dr. Stanek
Gerhard Dr. Baschang
Albert Dr. Hartmann
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Ciba Geigy AG
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Definitions

  • the invention relates to new lipopeptides of the formula wherein R, and R 2 each represent a saturated or unsaturated, aliphatic or mixed aliphatic-cycloaliphatic, optionally also substituted by oxygen functions, hydrocarbon radical having 11-21 carbon atoms, R 3 hydrogen or the radical R 1 ⁇ CO ⁇ O ⁇ CH 2 - where R , has the same meaning, and X is a peptide-bonded natural aliphatic amino acid with free, esterified or amidated carboxyl group, or an amino acid sequence of 2-10 natural aliphatic amino acids whose terminal carboxyl group is in free, esterified or amidated form, the with * or ** designated asymmetry centers which have the absolute R or S or R configuration, and optionally mixtures of the R and S compounds which are epimeric on the C ** atoms, and optionally salts and complexes of these compounds, and methods for their synthetic production, and pharmaceutical preparations containing one or more of these lipopeptides together with one pharmaceutical carrier material and optionally together with
  • Lipopeptides have already been described as degradation fragments of lipoproteins.
  • Hantke and Braun (Eur. J. Biochem. 34, 284-296 (1973) were able to isolate lipopeptides or lipopeptide mixtures in an impure form from the murein lipoprotein of the outer cell wall of Escherichia coli by enzymatic degradation following structure or corresponding formulas with a shortened polypeptide chain, where Y "Y 2 , Y 3 represent acyl residues of various higher saturated and unsaturated fatty acids, such as those with 14-19 C atoms and others.
  • the degradation lipopeptides obtained from murein protein contain the "glycerylcysteine" underlying.
  • these fragments were not products with a well-defined composition and were obviously complicated mixtures of condensation products from the peptide portion mentioned and very different acyl derivatives of glycerylcysteine.
  • the lipopeptides of the present application now differ from the named degradation products of murein proteins in several respects: they represent lipopeptides of precisely defined, uniform chemical constitution and configuration, which are synthetically accessible and are therefore suitable for therapeutic use; the group they form includes compounds in which the rest of the erythritol takes the place of the glycerol portion in the "glycerylcysteine" and / or those in which an amino acid sequence other than that given above for the known degradation-lipopeptide mixtures in formula (11), or in its place there is also only a single amino acid, and finally also derivatives such as amides and esters of the terminal carboxyl group.
  • R i and R 2 are saturated or unsaturated, aliphatic or aliphatic-cycloaliphatic, optionally also substituted by oxygen functions, hydrocarbon radicals with 11-21 carbon atoms, ie the acyl radicals are derived from saturated or unsaturated, aliphatic or cycloaliphatic, optionally oxygenated in the hydrocarbon radical with 12-22, preferably with 14-18, carbon atoms.
  • the saturated or unsaturated fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, margaric acid, stearic acid, arachic acid, oleic acid, elaidic acid, linoleic acid, a- and ⁇ -elaostearic acid, stearolic acid, a-linolenic acid, and also among the cycloaliphatic-aliphatic, for example, are to be mentioned as such the dihydrosterculic acid, malvalic acid, hydnocarpusic acid, and chaulmoograsic acid.
  • Oxygenated acids of this type which are also suitable for the acyl radicals R, CO and R 2 CO, are, for example, those by epoxidation of the above-mentioned olefinic fatty acids and.
  • Resulting cycloaliphatic-aliphatic acids for example the ⁇ , i-epoxystearic acid, furthermore derivatives of the abovementioned acids which have, for example, one or more hydroxyl groups, such as, for example, ricinoleic acid.
  • the groups R 1 and R 2 can be identical to one another or different from one another. Preference is given to compounds in which all three or four acyl radicals are identical, and in particular those in which these represent the palmitoyl, stearoyl or oleoyl radical.
  • the peptide sequence X in the compounds of the formula (I) or in their salts is composed of a maximum of 10 natural aliphatic amino acids, preferably at least half carrying a hydrophilic group, such as, in particular, hydroxyl, amino, carboxyl, carbamide, guanidino or imidazolyl groups.
  • a hydrophilic group such as, in particular, hydroxyl, amino, carboxyl, carbamide, guanidino or imidazolyl groups.
  • aspartic and glutamic and oxyglutamic acids bearing the acidic groups are to be emphasized, and lysine, ornithine, arginine and histidine are among the basic groups bearing.
  • Amides with a neutral character are especially the amides, such as asparagine, glutamine and hydroxyl groups, primarily serine and threonine.
  • X in formula (I) represents the amino acid mentioned, it is also e.g. bearing one of said hydrophilic groups, e.g. especially serine or threonine.
  • the unsubstituted ones should be mentioned in particular, e.g. Glycine, alanine, valine, norvaline, leucine, isoleucine, but also some substituted ones that have a non-hydrophilic character, such as methionine.
  • the order of the amino acids mentioned in the peptide chain X can be arbitrary, but preference is given to those sequences in which all amino acids with hydrophilic groups are bonded directly to one another, and in turn those in which those sequences of the hydrophilic amino acids are attached to the carboxyl group of the cysteine in Triacyl-Glycerylcystein or Tetraacyl-Erythritylcystein part is bound.
  • a second group of compounds [Group II] according to the invention are compounds according to formula IV above, but in which the configuration at the C ** atom is S instead of R, and the mixtures of the R and S diastereomers, as described, for example may arise in the synthetic representation.
  • Specific types and compounds in this group also correspond to those particularly emphasized above for the "R" group (formula IV).
  • a fourth group [Group IV] of the lipopeptides according to the invention comprises compounds of the formula (I) in which R 3 represents the radical R 1 ⁇ CO ⁇ O ⁇ CH 2 -, in which the configuration on the C ** atoms is any , in particular also mixtures of diastereomers.
  • Subgroups are compounds of the formula in particular those with an R configuration on the C ** atoms, in which X has the meaning given for formula (IV).
  • the acyl radicals R, -CO- and R 2- CO- are preferably the same and especially again palmitoyl, stearoyl or oleoyl; however, they can be discussed for the other groups as above. be available in all combinations and / or variations.
  • Preferred types and compounds of this class are again those in which X has the meanings specified above.
  • X is preferably an amino acid or a sequence of 2-5 amino acids, in particular one of those designated as preferred for the other three groups of lipopeptides.
  • X can also represent one of the amino acid sequences with 6-10 amino acids described for the third group of lipopeptides of the present application, in particular those specifically mentioned for that group.
  • N-acyl-0-0-di-acyl-Cys does not mean the glycerylcysteine portion, but the erythritylcysteine residue, and which is replaced by the Serine by threonine, glutamic acid, glutamine, aspartic acid or asparagine and by lysine by glutamic acid and, if desired, simultaneously by Asn by phenylalanine compounds.
  • the terminal carboxyl group may be in amidated form.
  • amides of lower aliphatic amines with 1-7 C atoms are suitable, such as methylamine, ethylamine, propylamine, butylamine, dimethylamine, diethylamine or propyl- and isopropylamine, furthermore aromatic amines, especially monocyclic, such as aniline or toluidine, araliphatic, such as Benzylamine or heterocyclic amines, such as the aminopyridines.
  • the secondary aliphatic amines can also be ring-closed nitrogen bases, e.g. Pyrrolidine, piperidine or piperazine.
  • Specific amides are e.g. the unsubstituted or the methyl, ethyl, dimethyl or diethylamides of all of the above-mentioned specific lipopeptides according to the present invention or such amides of the compounds described in the illustrative examples.
  • the alcohol component is preferably derived from lower aliphatic alcohols with 1-7 C atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or the butyl alcohols.
  • the esterifying alcohols can also be polyvalent, such as ethylene glycol or propylene glycol or glycerin.
  • araliphatic alcohols especially monocyclic lower aliphatic with 1-7 C atoms in the aliphatic part, such as Benzyl alcohol, or heterocyclic alcohols, such as tetrahydrofuranol or tetrahydropyranol, can be used for the esterification.
  • esters of this type of lipopeptides according to the invention are e.g. the methyl, ethyl and ethylene glycol or propylene glycol esters of all of the specific lipopeptides listed above or those described in the illustrative examples.
  • the present new lipopeptides are neutral, acidic or basic compounds depending on the nature of their substituents. If there are excess acidic groups, they form salts with bases, such as ammonium salts or salts with alkali or alkaline earth metals, for example sodium, potassium, calcium or magnesium; however, if excess basic groups are present, they form acid addition salts.
  • Acid addition salts are particularly pharmaceutically acceptable, non-toxic acid addition salts such as those with inorganic acids, e.g. Hydrochloric, hydrobromic, nitric, sulfuric or phosphoric acids, or with organic acids such as organic carboxylic acids e.g.
  • Methanesulfonic acid ethanesulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, ethane-1,2-disulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid or naphthalene-2-sulfonic acid, as well as other acid addition salts, e.g. as intermediates, e.g. for cleaning the free compounds or in the production of other sa! zes, as well as for characterization, e.g. those with picric, picrolonic, flavian, phosphotungstic, phosphomolyde, chloroplatinic, pure corner or perchloric acid.
  • Complexes are those with metal salts, e.g. compounds formed with heavy metal salts, such as copper, zinc, iron or cobalt salts.
  • the phosphates, pyrophosphates and polyphosphates of these metal salts are preferably used to form such complexes, optionally in combination with acidic organic substances, e.g. acidic group-containing polysaccharides, such as carboxymethyl cellulose, tannic acid, polyglutamic acid or partially hydrolyzed gelatin, and also alkali metal polyphosphates such as e.g. "Calgon N", “Calgon 322", “Calgon 188" or "Plyron B 12".
  • the compounds of the present invention according to formula (1) above, their salts and complexes and mixtures have valuable pharmacological properties, in particular a pronounced immunopotentiating effect.
  • the compounds in the dose range of 0.5-320 / l g / ml stimulate the proliferation of B lymphocytes, determined in vitro by means of thymidine incorporation, 20- to 50-fold compared to non-stimulated control lymphocytes.
  • the extent of the stimulation corresponds to that which is achieved with the most effective known B cell mitogens [dextran sulfate, E. coli lipopolysaccharide, PPD (purified protein derivative)], with the new compounds of the present application also high concentrations not being lymphocytotoxic Act.
  • the new compounds of formula (1), their salts and complexes and mixtures are also able to induce the formation of antibody-producing cells in concentrations of 0.3-60 / l g / ml in spleen cell cultures of normal mice (increase in 19S- plaque-forming cells by a factor of 20 to 50 above the control value (in the absence of the stimulating substances):
  • specific antibodies against sheep erythrocytes are formed in the presence of the compounds mentioned, without adding sheep erythrocytes to the cultures for immunization.
  • the substances mentioned in the same concentration range can also increase the immunological reactivity of T cell-depleted spleen cell cultures (from congenitally athymic nu / nu mice) compared to a normally thymus-dependent antigen (sheep erythrocytes) (factor 10 to 40 compared to untreated control cultures).
  • the compounds mentioned not only directly or indirectly induce proliferation and synthesis performance of B-lymphocytes (ie of potentially antibody-forming cells) in vitro, but also effects on T-lymphocytes (which include regulatory active helper and suppressor cells and cytotoxic effector cells ), conveyed.
  • the compounds mentioned in a concentration range of 10-100 pg / ml can significantly (up to 10-fold) potentiate the reactivity of cortisone-resistant thymus cells with allogeneic irradiated stimulator lymphocytes.
  • CSA is a biological mediator that is necessary for the differentiation of bone marrow stem cells into macrophages and polymorphonuclear leucocytes.
  • the compounds mentioned thus bring about an increased replenishment of cells which are of central importance for the non-specific resistance and for the induction, amplification and expression of specific (lymphocyte-mediated) immune reactions.
  • the compounds of the formula (I), their salts or complexes or mixtures are capable of antibody production against five days in a row after intraperitoneal or subcutaneous administration of 0.03-3 mg / kg animal before or after immunization with BSA To significantly increase BSA.
  • the lipopeptides according to the present invention are also not very toxic: 5 times intraperitoneal application in a dose of 10 mg / kg / day on five consecutive days was apparently tolerated without symptoms by mice. Since the doses required for immunostimulation are very small, the therapeutic breadth of the new compound is very large.
  • the new lipopeptides according to the present invention can thus significantly increase the cellular and especially the humoral immunity, both in a mixture with the antigen itself (adjuvant effect in the narrower sense) and with a supply that is separate in time and place from the antigen injection (systemic immunopotentiation).
  • the new lipopeptides according to the present invention can thus be used as adjuvants in admixture with vaccines to improve the vaccination success and to improve the protection against infection mediated by humoral antibodies and / or cellular immunity against bacterial, viral or parasitic pathogens.
  • the compounds described, in a mixture with various antigens are suitable as adjuvants in the experimental and industrial production of antisera for therapy and diagnosis and in the induction of immunologically activated lymphocyte populations for cell transfer processes.
  • the new lipopeptides can also be used without the simultaneous supply of antigen to promote immune reactions in humans and animals that are already taking place.
  • the compounds are therefore particularly suitable for stimulating the physical defense, e.g. in chronic and acute infections or in selective (antigen-specific) immunological defects, as well as in congenital, but also in acquired general (ie non-antigen-specific) immunoligical defect states, such as those in old age, in the course of severe primary diseases and especially after therapy with ionizing radiation or with immunosuppressive hormones occur.
  • the substances mentioned can therefore preferably also be administered in combination with antibiotics, chemotherapeutic agents or other therapeutic methods in order to counteract immunological damage.
  • the substances described are also suitable for the general prophylaxis of infectious diseases in humans and animals.
  • the protective groups in the process according to variant a) are particularly known from the synthesis of peptides.
  • Protecting groups for amino groups, acyl or aralkyl groups such as formyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, benzenesulfonyl, p-toluenesulfonyl, o-nitrophenylsulfenyl, 2,4-dinitrophenylsulfenyl groups (these sulfenyl groups can also be formed by the action of nucleophilic reagents, eg sulfites, e.g.
  • sulfites are split off), optionally substituted, such as benzyl groups, or diphenyl or triphenylmethyl groups substituted by lower alkoxy groups, especially o- or p-methoxy groups, or groups derived from carbonic acid, such as optionally in the aromatic rings, e.g. by halogen atoms such as chlorine or bromine, nitro groups, lower alkyl or lower alkoxy groups or coloring groups, e.g.
  • Arylmethyloxycarbonyl groups substituted in azo groups in which the methylene group can be substituted by a further aryl radical and / or one or optionally two lower alkyl radicals, such as benzyl, benzhydryl or 2-phenyl-isopropyloxycarbonyl groups, e.g.
  • the amino groups can also be formed by formation of enamines obtained by reacting the amino group with 1,3-diketones, e.g. Benzoylacetone, acetylacetone or dimedone.
  • 1,3-diketones e.g. Benzoylacetone, acetylacetone or dimedone.
  • Carboxyl groups are protected, for example, by amide or hydrazide formation or by esterification.
  • the amide and hydrazide groups can be optionally substituted, the amide group e.g. by the 3,4-dimethoxybenzyl or bis- (p-methoxyphenyl) methyl group, the hydrazide group e.g. by the carbobenzoxy group, the trichloroethyloxycarbonyl group, the trifluoroacetyl group, the trityl group, the tert-butyloxycarbonyl group or the 2- (p-biphenylyl) isopropyloxycarbonyl group.
  • Suitable for esterification are e.g.
  • lower optionally substituted alkanols such as methanol, ethanol, cyanomethyl alcohol, benzoylmethyl alcohol or in particular tert-butanol, furthermore aralkanols such as aryl lower alkanols, e.g.
  • benzyl alcohols or benzhydrols such as benzhydrol, p-nitrobenzyl alcohol, p-methoxybenzyl alcohol, 2,4,6-trimethylbenzyl alcohol optionally substituted by lower alkyl or lower alkoxy groups or halogen atoms, phenols optionally substituted by electron-withdrawing substituents and thiophenols such as thiophenol, thiocresol, p-nitronol 4,5- and 2,4,6-trichlorophenol, pentachlorophenol, p-nitrophenol, 2,4-dinitrophenol, p-cyanophenol or p-methanesulfonylphenol, further, for example N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, N-hydroxypiperidine, 8-hydroxyquinoline.
  • the hydroxyl groups of the serine and threonine residues can e.g. be protected by esterification or etherification.
  • Suitable acyl radicals in the esterification are, in particular, radicals derived from carbonic acid, such as benzoyloxycarbonyl or ethyloxycarbonyl.
  • Groups suitable for etherification are, for example, benzyl, tetrahydropyranyl or tert-butyl radicals.
  • suitable for protecting the hydroxyl groups the in Ber. 100 (1967), 3838-3849, describes 2,2,2-trifluoro-1-tert-butyloxycarbonylamino or -1-benzyloxycarbonylaminoethyl groups (Weygand).
  • the tert-butyl ester group or the benzhydrol group is preferably used to protect the carboxyl group of the side chains and optionally the terminal carboxyl group, the tert-butyloxycarbonyl group to protect the amino groups of the side chains, for the hydroxyl groups of serine or threonine, the tert-butyl ether group, and if desired, the 2,2,2-trifluoro-1-tert-butyloxycarbonylaminoethyl group to protect the imino group of the histidine.
  • the process-related removal of the protective groups with acidic agents under mild conditions is carried out e.g. in a manner known from peptide chemistry, e.g. by treatment with trifluoroacetic acid.
  • a special protective group for carboxyl groups which can be split off under neutral conditions is the group of the general formula described, for example, in German Offenlegungsschrift 27 06 490 where R 1 , R 2 and R 3 each represent a hydrocarbon radical, where the radicals can also be linked to one another by a simple CC bond, in particular alkyl radicals having 1-5 C atoms.
  • Protecting groups of this type are, for example, the 2- (dimethyl-tert-butylsilyl) ethyl, the 2- (dibutyl-methyl-silyl) ethyl and especially the 2- (trimethylsilyl) ethyl group.
  • protective groups can also be split off under basic conditions, their splittability under neutral conditions is of particular interest, namely by the action of a salt of hydrofluoric acid.
  • the protective group is advantageously removed in an aprotic organic solvent; the presence of solvents which are able to solvate the fluoride anion, such as water or lower aliphatic alcohols, is preferably avoided.
  • the condensation according to variant b) of the compound of formula (VII) with the compound of formula (VIII) takes place e.g. in such a way that the compound (VII) is reacted with (VIII) in the form of the activated carboxylic acid, or in that the acid (VII) is reacted with the compound (VIII), the amino group of which is present in activated form.
  • the compounds (VII) or (VIII) are used for the condensation in the form of their salts.
  • the carboxyl group of the compound (VII) can be converted, for example, into an acid azide, anhydride, imidazolide, isoxazolide or an activated ester, such as cyanomethyl ester, carboxymethyl ester, thiophenyl ester, p-nitrothiophenyl ester, thiocresyl ester, p-methanesulfonylphenyl ester, p-nitro , 4-dinitrophenyl ester, 2,4,5- or 2,4,6-trichlorophenyl ester, pentachlorophenyl ester, N-hydroxysuccinimide ester, N-hydroxyphthalimide ester, 8-hydroxyquinoline ester, 2-hydroxy-1,2-dihydro-1-carbäthoxy-quinoline- esters, N-hydroxypiperidine esters or an enol ester obtained with N-ethyl-5-phenyl-isoxazolium-3-sulfonate [Wo
  • the amino group of the compound (VIII) can be activated, for example, by reaction with a phosphite.
  • condensations can be carried out using the Merrifield method.
  • the free hydroxyl groups in the glyceryl or erythrityl radical are acylated in compounds of the formula (IX) which may not contain any free hydroxyl groups in part Z Z.
  • This acylation can be carried out in a manner known per se, for example by reaction with a reactive functional derivative of the acid corresponding to the radical to be introduced, such as the anhydride or an acid halide, preferably in the presence of a tertiary base such as pyridine or collidine.
  • This process is particularly suitable for the production of process products according to formula I in which the acyl residues in the glyceryl or. Erythrityl residue and the cysteine residue are different.
  • This variant is used for compounds of the formula (IX) in which, in part Z 2, the terminal carboxyl group is protected by other protective groups, in addition to being protected by an amide or ester radical, as provided for X, and / or one or more of the existing hydrophilic groups in a protected form, as described above, there are also starting compounds for variant a) above.
  • lipopeptides according to formula I obtained by any of the described process variants, in which a free terminal carboxyl group is present in part X, the same can be used in a manner known per se, e.g. be converted into the amide or ester group by one of the methods customary in peptide chemistry.
  • the 1-0-tosyl-2 (R) -O, 3-0-isopropylidene glycerol thus obtained is condensed with N-acyl- (R) -cysteine in the presence of a basic agent, for example potassium carbonate, and the N-acyl- S- [2 (R), 3-isopropylenedioxy-propyll- (R) -cysteine, which is acidified, for example with acetic acid.
  • a basic agent for example potassium carbonate
  • N-acyl-S- [2 (R), 3-dihydroxypropyll- (R) -cysteine thus obtained can, if desired, be in the 2- and 3-position of the glycerol portion, preferably with temporary protection of the carboxyl group, for example by means of the Trimethylsilylethyl group described above, or preferably the benzhydryl ester group, can be further acylated.
  • amino acids or peptides to be used for the production of the new lipopeptides according to the process are known or can be prepared by methods known per se.
  • the lipopeptides obtained can be converted into their salts in a manner known per se, e.g. by reacting acidic compounds obtained with alkali or alkaline earth metal hydroxides or basic compounds obtained with acids.
  • the corresponding salts are to be understood in the preceding and following as appropriate and expediently, if appropriate, the corresponding salts.
  • Isomer mixtures obtained can be separated in a known manner on the basis of the physico-chemical differences in the constituents, for example by chromatography and / or fractional crystallization. The more effective of the isomers is advantageously isolated.
  • the methods described above are e.g. carried out according to methods known per se, in the absence or preferably in the presence of diluents or solvents, if necessary, with cooling or heating, under elevated pressure and / or in an inert gas, such as a nitrogen atmosphere.
  • an inert gas such as a nitrogen atmosphere.
  • the invention also relates to those embodiments of the process in which one starts from a compound obtainable as an intermediate at any stage of the process and carries out the missing process steps, or terminates the process at any stage, or forms a source material under the reaction conditions or in the form of a reaction capable derivative or salt used.
  • the starting materials used are preferably those which, according to the process, lead to the compounds described above as being particularly valuable.
  • the present invention also relates to pharmaceutical preparations which contain the described new lipopeptides according to the invention, both those of the formula (I) and those of the formula (VII), their mixtures, salts or complexes.
  • Table preparations are those for enteral, such as oral or rectal, as well as parenteral administration to warm-blooded animals, which contain the pharmacologically active substance alone or together with a pharmaceutically usable carrier material.
  • the dosage of the active ingredient depends on the warm-blooded species, the age and the individual condition, as well as on the mode of administration.
  • the new pharmaceutical preparations contain from about 10% to about 95%, preferably from about 20% to about 90% of the active ingredient.
  • Pharmaceutical preparations according to the invention can e.g. in unit dose form, such as coated tablets, tablets, capsules, suppositories or ampoules.
  • the pharmaceutical preparations of the present invention are manufactured in a manner known per se, e.g. manufactured using conventional mixing, granulating, coating, solution or lyophilization processes.
  • Suitable carriers are in particular fillers such as sugar, e.g. Lactose, sucrose, mannitol or sorbitol, cellulose preparations and / or calcium phosphates, e.g. Tricalcium phosphate or calcium hydrogen phosphate, further binders such as starch paste using e.g.
  • ком ⁇ онентs such as the above-mentioned starches, also carboxymethyl starch, cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, Alginic acid or a salt thereof, such as sodium alginate, are primarily flow regulators and lubricants, for example Silicic acid, talc, stearic acid or salts thereof, such as magnesium or calcium stearate, and / or polyethylene glycol.
  • Dragee cores are provided with suitable, possibly enteric coatings, whereby one of the things Concentrated sugar solutions, which may contain arabic gum, talc, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol and / or titanium dioxide, lacquer solutions in suitable organic solvents or solvent mixtures or, for the production of gastric juice-resistant coatings, solutions of suitable cellulose preparations, such as acetyl cellulose phthalate or hydroxypropylmethyl cellulose phthalate. Colorants or pigments, e.g. for identification or for labeling different doses of active ingredient.
  • Concentrated sugar solutions which may contain arabic gum, talc, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol and / or titanium dioxide, lacquer solutions in suitable organic solvents or solvent mixtures or, for the production of gastric juice-resistant coatings, solutions of suitable cellulose preparations, such as acetyl cellulose phthalate or hydroxypropylmethyl cellulose phthalate.
  • Colorants or pigments e.g. for
  • the lipopeptide [N-palmitoyl-S-2 (R), 3-dipalmitoyloxypropyl) -Cys-Ser (Bu t ) -Ser (Bu t ) -Asn-OBu t shows in the system chloroform-methanol (9: 1) on silica gel an Rf value of 0.75.
  • the mixtures of di- and mono-palmitoyl-cysteine are dissolved in methanolic solution with the addition of an aqueous solution of 12 g sodium sulfide with 2 ml conc. Sodium hydroxide solution treated for 15 minutes at room temperature. After evaporating off the methanol and acidifying the residue with 2N Hydrochloric acid gives the remaining N-palmitoyl-cysteine by chloroform extraction, which is also recrystallized from gasoline.
  • the ethyl acetate solution is evaporated and the foam left is the Z-Ala-Glu (OBu t ) 2 with the Rf value 0.60 (in chloroform-methanol 95: 5), which is directly processed further: 8.5 g are made in 60 ml of methanol dissolved and after adding 0.8 mg of Pd carbon (10%) hydrogenated at 20 ° for 2 hours.
  • the catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated.
  • the H-Ala-Glu (OBu t ) 2 is obtained as a white foam which has the Rf 0.36 in chloroform-methanol 9: 1.
  • the N is obtained by reacting the N-palmitoyl-2- [2 (R, S), 3-dihydroxypropyl] - (R) -cysteine with diphenyldiazomethane, as indicated above for the R compound S, and subsequent palmitoylation, as also stated above -Palmitoyl-S- [2 (R, S), 3-dipalmitoyloxypropyl] - (R) -cysteine-benzhydryl ester: colorless crystals of mp 84-85 °.
  • N-Palmitoyl-S-2 (R), 3 (R), 4-trihydroxybutyl- (R) -cysteine is obtained in the following way.

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Description

  • Die Erfindung betrifft neue Lipopeptide der Formel
    Figure imgb0001
    worin R, und R2 je einen gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen oder gemischt aliphatischcycloaliphatischen, gegebenenfalls auch durch Sauerstoffunktionen substituierten, Kohlenwasserstoffrest mit 11-21 C-Atomen, R3 Wasserstoff oder den Rest R1―CO―O―CH2― wo R, die gleiche Bedeutung hat, und X eine peptidisch gebundene natürliche aliphatische Aminosäure mit freier, veresterter oder amidierter Carboxylgruppe, oder eine Aminosäurensequenz von 2-10 natürlichen aliphatischen Aminosäuren, deren terminale Carboxylgruppe in freier, veresterter oder amidierter Form vorliegt, bedeuten, wobei die mit * bzw. ** bezeichneten Asymmetrie-Zentren die absolute R- bzw. S- oder R-Konfiguration besitzen, und gegebenenfalls Gemische der an den C**-Atomen epimeren R- und S-Verbindungen, und gegebenenfalls Salze und Komplexe dieser Verbindungen, sowie Verfahren zu ihrer synthetischen Herstellung, und pharmazeutische Präparate enthaltend einen oder mehrere dieser Lipopeptide zusammen mit einem pharmazeutischen Trägermaterial und gegebenenfalls zusammen mit anderen pharmazeutischen Verbindungen.
  • Lipopeptide sind als Abbau-Fragmente von Lipoproteinen bereits beschrieben worden. So haben z.B. Hantke und Braun (Eur. J. Biochem. 34, 284-296 (1973) aus dem Murein-Lipoprotein der äusseren Zellwand von Escherichia coli durch enzymatische Degradation Lipopeptide bzw. Lipopeptidgemische in unreiner Form isolieren können, denen gemäss ihren Untersuchungen die folgende Struktur
    Figure imgb0002
    oder entsprechende Formeln mit verkürzter Polypeptid-Kette zukommen dürfte, wobei Y" Y2, Y3 Acylreste verschiedener höherer gesättigter und ungesättigter Fettsäuren, wie etwa solcher mit 14-19 C-Atomen und anderer, darstellen. Dieselbe Struktur liegt auch dem Murein-Protein als solchem zugrunde (loc.cit.), wobei die absolute Konfiguration an den beiden asymmetrischen Kohlenstoffatomen der obigen Formel nicht untersucht wurde. Sowohl das Murein-Lipoprotein wie seine genannten Abbauprodukte zeigen in vitro eine mitogene Wirkung gegenüber Mäuse-Lymphocyten. [Vgl. auch Z. Immun.-Forschung, Vol. 153, pp. 11-22 (1977)].
  • Wie ersichtlich, liegt den aus Mureinprotein erhaltenen Abbau-Lipopeptiden das "Glyzerylcystein"
    Figure imgb0003
    zugrunde. Als Produkte einer enzymatischen Spaltung von Naturprodukten waren diese Fragmente keine in ihrer Zusammensetzung wohl definierten Produkte und stellten offensichtlich komplizierte Gemische von Kondensationsprodukten aus dem genannten Peptidanteil und sehr verschiedenen Acylderivaten des Glyzerylcysteins dar.
  • Die Lipopeptide der vorliegenden Anmeldung unterscheiden sich nun von den genannten Abbauprodukten von Murein-Proteinen in mancherlei Hinsicht: sie stellen Lipopeptide von genau definierter einheitlicher chemischer Konstitution und Konfiguration dar, die synthetisch zugänglich sind und sich daher für eine therapeutische Anwendung eignen; die von ihnen gebildete Gruppe umfasst Verbindungen, in denen anstelle des Glyzerinanteils im "Glyzerylcystein" der Rest des Erythrits tritt und/oder solche, in denen eine andere Aminosäurensequenz als die oben für die bekannten Degradations-Lipopeptide-Gemische in Formel (11) angegebene, oder an deren Stelle auch nur eine einzige Aminosäure vorhanden ist, und schliesslich auch Derivate, wie Amide und Ester der terminalen Carboxylgruppe.
  • In den Acylresten R,CO, R2C0 in den Verbindungen der Formel und ihren Derivaten sind Ri und R2 gesättigte oder ungesättigte, aliphatische oder aliphatisch-cycloaliphatische, gegebenenfalls auch durch Sauerstoffunktionen substituierte, Kohlenwasserstoffreste mit 11-21 C-Atomen, d.h. die Acylreste leiten sich von gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen oder cycloaliphatischen, gegebenenfalls im Kohlenwasserstoffrest oxygenierten Carbonsäuren mit 12-22, vorzugsweise mit 14-18, C-Atomen ab. Als solche sind die gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren zu nennen, wie Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Margarinsäure, Stearinsäure, Arachinsäure, Oelsäure, Elaidinsäure, Linolsäure, a- und ß-Eläostearinsäure, Stearolsäure, a-Linolensäure, ferner unter den cycloaliphatisch-aliphatischen z.B. die Dihydrosterkulsäure, Malvalsäure, Hydnocarpussäure, und Chaulmoograsäure. Oxygenierte Säuren dieses Typus, welche ebenfalls für die Acylreste R,CO und R2CO in Betracht kommen, sind z.B. die durch Epoxydierung der oben genannten olefinischen Fettsäuren und. cycloaliphatisch-aliphatischen Säuren sich ergebenden, z.B. die δ,i-Epoxystearinsäure, ferner Derivate der oben genannten Säuren, die z.B. eine oder mehrere Hydroxygruppen aufweisen, wie z.B. die Ricinolsäure.
  • In den Verbindungen der Formel (I) bzw. ihren Diastereomeren-Gemischen und ihren Salzen oder Komplexen können die Gruppen R, und R2 miteinander identisch oder voneinander verschieden sein. Bevorzugt sind Verbindungen, in denen alle drei bzw. vier Acylreste gleich sind und unter diesen insbesondere solche, in denen diese den Palmitoyl-, Stearoyl- oder Oleoylrest bedeuten.
  • Die Peptidsequenz X in den Verbindungen der Formel (I) bzw. in deren Salzen setzt sich aus maximal 10 natürlichen aliphatischen Aminosäuren zusammen, wobei vorzugsweise mindestens die Hälfte eine hydrophile Gruppe tragen, wie insbesondere Hydroxy-, Amino, Carboxyl-, Carbamid-, Guanidino-oder Imidazolylgruppen. Von den ionischen Aminosäuren dieser Kategorie seien unter den saure Gruppen tragenden insbesondere die Asparagin- und Glutamin- und die Oxyglutaminsäure hervorgehoben, unter den basische Gruppen tragenden das Lysin, das Ornithin, das Arginin und das Histidin. Aminosäuren mit neutralem Charakter sind besonders die Amide, wie das Asparagin, das Glutamin.und die Hydroxygruppen tragenden, in erster Linie Serin und Threonin.
  • Stellt X in Formel (I) die genannte Aminosäure dar, so ist sie ebenfalls z.B. eine der genannten hydrophile Gruppen tragenden, z.B. insbesondere Serin oder Threonin.
  • Unter den Aminosäuren, die in die obige Sequenz eingehen können und die keine hydrophilen Gruppen tragen, sind vor allem die unsubstituierten zu erwähnen, wie z.B. Glycin, Alanin, Valin, Norvalin, Leucin, Isoleucin, sodann aber auch einige substituierte, die nicht-hydrophilen Charakter haben, wie Methionin.
  • Die Reihenfolge der genannten Aminosäuren in der Peptidkette X kann beiliebig sein, jedoch sind solche Sequenzen bevorzugt, in denen sämtliche Aminosäuren mit hydrophilen Gruppen direkt aneinander gebunden sind, und unter diesen wiederum diejenigen, in welchen diese Sequenz der hydrophilen Aminosäuren an die Carboxylgruppe des Cysteins im Triacyl-Glyzerylcystein bzw. Tetraacyl-Erythritylcystein-Teil gebunden ist.
  • Eine wichtige Gruppe [Gruppe I] von Lipopeptiden gemäss der vorliegenden Erfindung sind solche, in denen die Peptidkette X aus maximal 5 Aminosäuren besteht. Unter diesen sind insbesondere solche der Formel
    Figure imgb0004
    worin R,, R2 die gleichen Bedeutungen besitzen und X die für Formel (I) gegebene Bedeutung hat, aber im Falle der Aminosäurensequenz 2-5 Aminosäuren aufweist, in welcher vorzugsweise mindestens die Hälfte eine hydrophile Gruppe tragen, sowie ihre Salze und Komplexe. Unter diesen Lipopeptiden seien jene hervorgehoben, deren Aminosäurensequenz in der Gruppe X derjenigen der obengenannten durch Abbau von Murein-Lipoprotein erhaltenen Lipopeptide d.h. solcher der Formel (II), oder einer sich davon ableitenden verkürzten Kette entspricht. Es seien insbesondere folgende Lipopeptid-Typen erwähnt.
    • (AcGCT=Acyl-Glyzerylcystein-Teil gemäss Formel IV):
    • AcGCT-Ser-Ser-Asn-Ala-Lys-OH
    • AcGCT-Ser-Ser-Asn-Ala-OH
    • AcGCT-Ser-Ser-Asn-OH
    • AcGCT-Ser-Ser-OH,

    sodann die entsprechenden Typen, in welchen Threonin, Glutamin oder Asparagin das Serin ersetzen; ferner die Verbindungstypen der Art:
    • AcGCT-Ser-Ser-Asn-Ala-G lu-OH
    • AcGCT-Ser-Ser-Phe-Ala-Glu-OH
    • AcGCT-Ser-Ser-Phe-Ala-OH
    • AcGCT-Ser-Ser-Phe-OH

    und die entsprechenden mit Threonin, Glutamin oder Asparagin als Austauschaminosäuren für Serin, und die Amide und Carbonsäureester mit terminaler Carbamid- bzw. Estergruppe, wobei in erster Linie die Verbindungen in Betracht zu ziehen sind, in denen die Acylreste R,-CO, R2―CO im Acyl-Glyzerylcystein-Teil gleich sind und Palmitoyl, Stearoyl oder Oleoyl darstellen, und alle diejenigen, in denen R,-CO und R2―CO verschieden sind und z.B. Palmitoyl, Stearoyl oder Oleoyl bedeuten, und diese Reste in beliebiger Kombination und/oder Variation vorkommen, wie die in der folgenden Tabelle angeführten, wobei der Glyzerylcystein-teil entsprechend den N- und O-Acylsubstituenten als N-Acyl-0-0-di-Acyl-Cys abgekürzt geschrieben ist:
    • N-Palmitoyl-O.O-di-Palmitoyl-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Lys-OH
    • N-Palmitoyl-0.0-di-Palmitoyl-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-OH
    • N-Palmitoyl-0.0-di-Palmitoyl-Cys-Ser-Ser-Asn-OH
    • N-Palmitoyl-0.0-di-Palmitoyl-Cys-Ser-Ser-OH
    • N-Palmitoyl-0.0-di-Palmitoyl-Cys-Ser-OH
    • N-Stearoyl-O.O-di-Stearoyl-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Lys-OH
    • N-Stearoyl-O.O-di-Stearoyl-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-OH
    • N-Stearoyl-O.O-di-Stearoyl-Cys-Ser-Ser-Asn-OH
    • N-Stearoyl-0.0-di-Stearoyl-Cys-Ser-Ser-OH
    • N-Stearoyl-O.O-di-Stearoyl-Cys-Ser-OH
    • N-Oleoyl-O.O-di-Oleoyl-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Lys-OH
    • N-Oleoyl-O.O-di-Oleoyl-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-OH
    • N-Oleoyl-O.O-di-Oleoyl-Cys-Ser-Ser-Asn-OH
    • N-Oleoyl-0.0-di-Oleoyl-Cys-Ser-Ser-OH
    • N-Oleoyl-O.O-di-Oleoyl-Cys-Ser-OH
    • N-Lauroyl-0.0-di-Lauroyl-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Lys-OH
    • N-Lauroyl-0.0-di-Lauroyl-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-OH
    • N-Lauroyl-O.O-di-Lauroyl-Cys-Ser-Ser-Asn-OH
    • N- Lauroyl-O.O-di-Lauroyl-Cys-Ser-Ser-OH
    • N-Lauroyl-O.O-di-Lauroyl-Cys-Ser-OH

    ferner die Verbindungen, die sich aus der Substitution des Serins durch Threonin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin, aus der Substitution des Lysins durch Glutaminsäure, und solche, die sich aus der gleichzeitigen Substitution von Lysin durch Glutaminsäure und Asparagin durch Phenylalanin ergeben.
  • Unter den Verbindungen mit verschiedenen Acylresten an N- und O-Atomen im glyzerylcystein-Rest, sind die folgenden hervorzugheben:
    • N-Myristoyl-O.O-di-Palmitoyl-Cys-Phe-Phe-Asn-Ala-Lys-OH
    • N-Lauroyl-O.O-di-Palmotoyl-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Glu-OH
    • N-Stearoyl-O.O-di-Palmitoyl-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Ala-OH

    und die sich durch Ersatz von Ser durch Phe oder von Phe durch Ser ergebenden Verbindungen.
  • Eine zweite Gruppe von Verbindungen [Gruppe II] gemäss der Erfindung sind Verbindungen entsprechend der obigen Formel IV, in denen jedoch die Konfiguration am C**-Atom S statt R ist, und die Gemische der R- und S-Diastereomeren, wie sie z.B. bei der synthetischen Darstellung anfallen können. Spezifische Typen und Verbindungen entsprechen auch in dieser Gruppe den oben für die "R"-Gruppe (Formel IV) besonders hervorgehobenen.
  • Eine dritte Gruppe [Gruppe III] der neuen Lipopeptide umfasst die Verbindungen gemäss Formel (IV), in denen jedoch X eine Aminosäurensequenz mit 6-10 Aminosäuren darstellt, wobei die ersten 5 vorzugsweise die oben bereits hervorgehobenen Sequenzen darstellen. Die Aminosäuren 6-10 können beliebige der oben erwähnten natürlichen sein, wie insbesondere Serin, Asparagin, Alanin, Glutaminsäure, Lysin, Phenylalanin, und etwa in folgenden Sequenzen vorkommen:
    • lle-Asp-Glu-OH
    • Asp-Glu-OH
    • Spezifische Verbindungen sind z.B.
    • N-Stearoyl-S-[2(R),3-Dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Glu-lle-Asp-Glu-OH
    • N-Palmitoyl-S-[2(R),3-Dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ser-Ser-Asn-A)a-Glu-Ile-Asp-Glu-OH
    • N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Lys-Ile-Asp-Glu-OH.

    Es können erfindungsgemäss auch entsprechende Verbindungen dieses Typs mit der S-Konfiguration am C**-Atom hergestellt werden, sowie Diastereomerengemische von S- und R-Verbindungen.
  • Eine vierte Gruppe [Gruppe IV] der Lipopeptide gemäss der Erfindung umfasst Verbindungen der Formel (I) worin R3 den Rest R1―CO―O―CH2― darstellt, in welchen die Konfiguration an den C**- Atomen eine beliebige ist, insbesondere auch Diastereomerengemische. Untergruppen sind Verbindungen der Formel
    Figure imgb0005
    insbesondere solche mit R-Konfiguration an den C**-Atomen, worin X die für Formel (IV) angegebene Bedeutung besitzt. Die Acylreste R,-CO- und R2-CO- sind vorzugsweise dieselben und vor allem wiederum Palmitoyl, Stearoyl oder Oleoyl; sie können aber wie oben für die anderen Gruppen besprochen. in allen Kombinationen und/oder Variationen vorhanden sein.
  • Bevorzugte Typen und Verbindungen dieser Klasse sind wiederum solche, in denen X die oben spezifizierten Bedeutungen haben.
  • Auch für diese Gruppe ist vorzugsweise X eine Aminosäure oder eine Sequenz von 2-5 Aminosäuren, insbesondere eine der oben für die anderen drei Gruppen von Lipopeptiden als bevorzugt bezeichneten. X kann aber auch eine der für die dritte Gruppe der Lipopeptide der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Aminosäurensequenzen mit 6-10 Aminosäuren, insbesondere die für jene Gruppe spezifisch erwähnten, darstellen.
  • Spezifische Verbindungen sind z.B. die sich aus der obigen für spezifische Verbindungen der Gruppe I zusammengestellte Tabelle ergebenden, wenn in ihnen N-Acyl-0-0-di-Acyl-Cys nicht wie dort den Glyzerylcysteinanteil, sondern den Erythritylcystein-Rest bedeutet, und die sich durch Substitution des Serins durch Threonin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin und von Lysin durch Glutaminsäure und, wenn erwünscht, gleichzeitig von Asn durch Phenylalanin ergebenden Verbindungen.
  • Eine fünfte Gruppe von Lipopeptiden gemäss der vorliegenden Erfindung wird von jenen Verbin- dungen gemäss Formel (I) gebildet, in denen X eine Peptidkette bedeutet, in welchen die Sequenz der ersten 5 Aminosäuren von denjenigen, die in den bekannten Murein - Lipoprotein - Abbau - Lipopeptiden vorhandenen verschieden ist, und insbesondere solche worin R3 Wasserstoff bedeutet, also der obigen Formel (IV) entsprechen, wobei R,-CO und R2-CO die vorzugsweise im vorangegangenen oder im folgenden besonders hervorgehobenen Acylreste in den angeführten Kombinationen bedeuten, sowie ihre Salze und Komplexe. Es seien z.B die folgenden Lipopeptid - Typen erwähnt (AcGCT = Acyl-Glyzerylcystein-Teil gemäss Formel (IV)
    • AcGCT-Phe-Ile-Ile-Phe-Ala-OH
    • AcGCT-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH

    und ihre Amide und Ester, insbesondere die im nachfolgend besonders hervorgehobenen.
  • Eine weitere Untergruppe besteht aus Verbindungen gemäss Formel (IV), in denen X aber die besagte "unnatürliche" Sequenz von Aminosäuren im Vergleich zu den Murein-Lipoprotein-Degradationsprodukten darstellt. und aber 6-10 Aminosäuren vorhanden sind. Die ersten fünf Aminosäuren haben z.B. die oben angegebene Sequenz oder eine beliebige andere; es seien z.B. die folgenden Lipopeptide genannt, wo AcGCT die obige Bedeutung besitzt:
    • AcGCT-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-PRo-OH
    • AcGCT-Ser-Ser-Asn-Ala-Glu-Ile-Asp-Glu-OH

    und ihre Amide und Ester, insbesondere die im nachfolgenden hervorgehobenen.
  • Vorzugsweise werden Verbindungen dieses Typs hergestellt, in denen die Konfiguration am C**- Atom des AcGCT R ist, oder Gemische von R- und S-Epimeren.
  • In den oben besprochenen neuen Lipopeptiden gemäss der vorliegenden Erfindung kann die terminale Carboxylgruppe in amidierter Form vorliegen. Ausser dem unsubstituierten Amid kommen auch solche in Betracht, die sich von einem primären oder sekundären Amin ableiten. Insbesondere kommen Amide von niederen aliphatischen Aminen mit 1-7 C-Atomen in Betracht, wie Methylamin, Ethylamin, Propylamin, Butylamin, Dimethylamin, Diäthylamin oder Propyl- und Isopropylamin, ferner aromatische Amine, insbesondere monocyclische, wie Anilin oder Toluidin, araliphatische, wie Benzylamin oder heterocyclische Amine, wie z.B. die Aminopyridine. Bei den sekundären aliphatischen Aminen kann es sich auch um ringgeschlossene Stickstoffbasen handeln, wie z.B. Pyrrolidin, Piperidin oder Piperazin. Spezifische Amide sind z.B. die unsubstituierten oder die Methyl-, Aethyl-, Dimethyl- oder Diäthylamide sämtlicher oben angeführter spezifischer Lipopeptide gemäss der vorliegenden Erfindung oder solche Amide der in der illustrativen Beispielen beschriebenen Verbindungen.
  • In den veresterten terminalen Carboxylgruppen der neuen Lipopeptide leitet sich die Alkoholkomponente vorzugsweise von niederen aliphatischen Alkoholen mit 1-7 C-Atomen, wie Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl- oder den Butylalkoholen ab. Die veresternden Alkohole können aber auch mehrwertige sein, wie Aethylenglykol oder Propylenglykol oder Glyzerin. Auch araliphatische Alkohole, insbesondere monocyclische niederaliphatische mit 1-7 C-Atomen im aliphatischen Teil, wie z.B. Benzylalkohol, oder heterocyclische Alkohole, wie Tetrahydrofuranol oder Tetrahydropyranol können für die Veresterung verwendet werden. Als spezifische Ester dieses Typs der Lipopeptide gemäss der Erfindung seien z.B. die Methyl-, Aethyl- und die Aethylenglykol- oder Propylenglykol-Ester sämtlicher oben angeführter spezifischer Lipopeptide oder derjenigen, die in den illustrativen Beispielen beschrieben sind, erwähnt.
  • Die vorliegenden neuen Lipopeptide sind je nach der Art ihrer Substituenten neutrale, saure oder basische Verbindungen. Falls überschüssige saure Gruppen vorhanden sind, bilden sie Salze mit Basen, wie Ammoniumsalze oder Salze mit Alkali- oder Erdalkalimetallen, z.B. Natrium, Kalium, Calcium oder Magnesium; sind jedoch überschüssige basische Gruppen vorhanden, bilden sie Säureadditionssalze.
  • Säureadditionssalze sind besonders pharmazeutisch verwendbare, nichttoxische Säureadditionssalze, wie solche mit anorganischen Säuren, z.B. Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Salpeter-, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder mit organischen Säuren, wie organischen Carbonsäuren, z.B. Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Methylmaleinsäure, Fumarsäure, Aepfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Amino-salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxy-benzoesäure, Embonsäure, Nicotinsäure oder Isonicotinsäure, oder organischen Sulfonsäuren, z.B. Methansulfonsäure, Aethansulfonsäure, 2-Hydroxy-äthansulfonsäure, Aethan-1,2-disulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure oder Naphthalin-2-sulfonsäure, ferner auch andere Säureadditionssalz, die z.B. als Zwischenprodukte, z.B. zur Reinigung der freien Verbindungen oder in der Herstellung von anderen Sa!zen, sowie zur Charakterisierung verwendet werden können, wie z.B. solche mit Pikrin-, Pikrolon-, Flavian-, Phosphorwolfram-, Phosphormolyddän-, Chlorplatin-, Reinecke- oder Perchlorsäure.
  • Komplexe sind die mit Metallsalzen, z.B. mit Schwermetallsalzen, wie Kupfer, Zink, Eisen oder Kobaltsalzen entstehenden Verbindungen. Zur Bildung solcher Komplexe werden vorzugsweise die Phosphate, Pyrophosphate und Polyphosphate dieser Metallsalze verwendet, gegebenenfalls in Kombination mit sauren organischen Stoffen, z.B. saure Gruppen enthaltenden Polysacchariden, wie Carboxymethylcellulose, Gerbsäure, Polyglutaminsäure oder teilweise hydrolysierte Gelatine, ferner Alkalimetallpolyphosphate wie z.B. "Calgon N", "Calgon 322", "Calgon 188" oder "Plyron B 12".
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung gemäss der obigen Formel (1), ihre Salze und Komplexe und Gemische weisen wertvolle pharmakologische Eigenschaften, insbesondere eine ausgeprägte immunpotenzierende Wirking auf. So stimulieren die Verbindungen im Dosisbereich von 0,5-320 /lg/ml die in vitro an Hand der Thymidininkorporation bestimmte Proliferation von B-Lymphocyten 20- bis 50-fach im Vergleich zu nicht stimulierten Kontroll-Lymphocyten. Das Ausmass der Stimulation entspricht demjenigen, das mit den wirksamsten bekannten B-Zell-Mitogenen [Dextran-sulfat, E. coli Lipopolysaccharid, PPD (purified protein derivative)] erreicht wird, wobei bei den neuen Verbindungen der vorliegenden Anmeldung auch hohe Konzentrationen nicht lymphocytotoxisch wirken.
  • Die neuen Verbindungen der Formel (1), ihre Salze und Komplexe und Gemische sind ausserdem in der Lage, in Konzentrationen von 0,3-60 /lg/ml in Milzzellkulturen von normalen Mäusen die Bildung antikörperproduzierender Zellen zu induzieren (Vermehrung der 19S-plaquebildenden Zellen um einen Faktor 20 bis 50 über den Kontrollwert (in Abwesenheit der stimulierenden Substanzen)): So werden in Anwesenheit der genannten Verbindungen z.B. spezifische Antikörper gegen Schaferythrocyten gebildet, ohne dass den Kulturen Schaferythrocyten zur Immunisierung zugesetzt werden. Andererseits vermögen die genannten Substanzen im selben Konzentrationsbereich auch die immunologische Reaktivität von T-zellverarmten Milzzellkulturen (von kongenital athymischen nu/nu Mäusen) gegenüber einem normalerweise thymusabhängigen Antigen (Schaferythrocyten) zu steigern (faktor 10 bis 40 gegenüber unbehandelten Kontrollkulturen). Durch die genannten Verbindungen werden aber in vitro direkt oder indirekt nicht nur Proliferations- und Syntheseleistungen von B-Lymphocyten (d. h. von potentiell antikörperbildenden Zellen) induziert, sondern auch Effekte auf T-Lymphocyten (zu denen regulatorisch aktive Helfer- und Suppressorzellen sowie cytotoxische Effektorzellen gehören), vermittelt. So vermögen z.B. die erwähnten Verbindungen in einem Konzentrationsbereich von 10-100 p.g/ml die Reaktivität von cortisonresistenten Thymuszellen gegenüber allogenen bestrahlten Stimulatorlymphocyten erheblich (bis zu 10-fach) zu potenzieren.
  • Die oben erwähnten wirkungen kommen wahrscheinlich indirekt dadurch zustande, dass die Lipopeptide Makrophagen aktivieren, die ihrerseits die Reaktivität von T- und B-Lymphocyten fördern. Tatsächlich kann man zeigen, dass die genannten Verbindungen bereits in äusserst geringen Konzentrationen (0,01―10µg/ml) grosse Mengen "colony stimulating activity" (CSA) aus Maus-Makrophagen freisetzen (Induktion von bis zu 150-200 Kolonien innert 7 Tagen aus 105 MäuseKnochenmarkzellen, nach Zugabe von 20% Ueberstand aus während 24 Stunden mit Substanz inkubierten Makrophagenkulturen, im Vergleich zu 0-5 Kolonien bei Zugabe von Ueberständen unbehandelter Makrophagenkulturen). CSA ist ein biologischer Mediator, der für die Differenzierung von Knochenmark-Stammzellen zu Makrophagen und polymorphkernigen Leucocyten notwendig ist. Damit bewirken die genannten Verbindungen einen erhöhten Nachschub von Zellen, die für die unspezifische Resistenz und für die Induktion, Amplifikation und Expression spezifischer (lymphocytenvermittelter) Immunreaktionen von zentraler Bedeutung sind.
  • Die immunpotenzierende Wirking der neuen Verbindungen der Formel (1), ihrer Salze oder Komplexe oder Gemische, kann auch in vivo nachgewiesen werden: So führt die Injektion eines Lipopeptids gemäss der Erfindung innert 3-9 Stunden zu einem hohen Anstieg der CSA-Konzentration im Serum (bis zu 120 Kolonien pro 105 Mäuseknochenmarkzellen nach Zugabe von Chloroform extrahiertem Serum [5% Endkonzentration] im Vergleich zu 0-5 Kolonien bei unbehandelten Tieren). Dementsprechend wird durch Verabreichung derselben Verbindungen in vivo die Antikörperbildungsfähigkeit von Mäusen erheblich potenziert:
    • NMRI Mäuse werden dirch intraperitoneale Injektion von 10 µg präzipitatfreiem BSA am Tag 0 immunisiert. 9,15 und 29 Tage später werden Serumproben entnommen und auf ihren Gehalt an anti-BSA-Antikörpern mit einer passiven Haemagglutinationstechnik untersucht. In der verwendeten Dosis ist lösliches BSA für die Empfängertiere subimmunogen, d.h. es vermag keine oder nur eine ganz geringfügige Produktion von Antikörpern auszulösen. Zusätzliche Behandlung der Mäuse mit gewissen immunpotenzierenden Stoffen vor oder nach der Antigengabe führt zu einem Anstieg der Antikörpertiter im Serum. Der Effekt der Behandlung wird durch den erreichten Scorewert, d.h. durch die Summe der log2 Titerdifferenzen an den drei Blutungstagen ausgedrückt.
  • In diesem Test sind die Verbindungen der Formel (I), ihre Salze oder Komplexe oder Gemische in der Lage bei intraperitonealer oder subkutaner Applikation von 0,03-3 mg/kg Tier an fünf aufeinander folgenden Tagen vor oder nach Immunisierung mit BSA die Antikörperproduktion gegen BSA signifikant zu steigern.
  • Auch Manifestationen der zellvermittelten Immunität können durch die genannten Verbindungen in vivo potenziert werden:
    • Während Sensibilisierung von Meerschweinchen mit BSA in inkomplettem Freund'schen Adjuvans nur zu humoraler Antikörperbildung führt, induziert die Beimischung der Lipopeptide gemäss der vorliegenden Erfindung in einem Dosisbereich von 1-15 pg zur wässerigen Phase der Antigen-Oelemulsion Spättyp-Ueberempfindlichkeit gegenüber BSA: 3 Wochen nach Immunisierung führt die intrakutane Injektion von BSA bei diesen Tieren zu einer lokalen Entzündungsreaktion mit Erythem und Verdickung der Haut, die innert 24 bis 48 Stunden ihr Maximum erreicht. Diese Spättyp-Reaktionen entsprechen quantitativ und qualitativ denjenigen, die üblicherweise durch Immunisierung mit BSA in komplettem Freund' schem Adjuvans (d.h. mit Zusatz von Mykobakterien) erhalten werden. Die EDso-Werte (benötigte µg/Tier zur Induktion einer Differenz des Reaktionsvolumens (Erythemfläche x Hautdickenzunahme) bei behandelten und unbehandelten Tieren von 200 pi, 24 Stunden nach Auslösung) betragen 2-3 ug.
  • Die Lipopeptide gemäss der vorliegenden Erfindung sind zudem wenig toxisch: Auch 5-Malige intraperitoneale Applikation in einer Dosis von 10 mg/kg/Tag an fünf aufeinanderfolgenden Tagen wurde von Mäuse anscheinend symptomlos vertragen. Da die für die Immunstimulation benötigten Dosen sehr gering sind, ist die therapeutische Breite der neuen Verbindung sehr gross.
  • Die neuen Lipopeptide gemäss der vorliegenden Erfindung können somit die zelluläre und besonders die humorale Immunität erheblich steigern, und zwar sowohl in Mischung mit dem Antigen selber (Adjuvanseffekt im engeren Sinne) als auch bei zeitlich und örtlich von der Antigeninjektion getrennter Zufuhr (systemische Immunpotenzierung).
  • Die neuen Lipopeptide gemäss der vorliegenden Erfindung können somit als Adjuvantien in Mischung mit Impfstoffen dazu benützt werden, den Impferfolg zu verbessern und den durch humorale Antikörper und/oder zelluläre Immunität vermittelten Infektionsschutz gegenüber bakteriellen, viralen oder parasitären Erregern zu verbessern.
  • Schliesslich eignen sich die beschriebenen Verbindungen in Mischung mit verschiedenen Antigenen als Adjuvantien bei der experimentellen und industriellen Herstellung von Antiseren für Therapie und Diagnostik und bei der Induktion von immunologisch aktivierten Lymphocyten-populationen für Zelltransferverfahren.
  • Darüberhinaus können die neuen Lipopeptide auch ohne gleichzeitige Antigenzufuhr dazu benützt werden, bereits unterschwellig ablaufende Immunreaktionen bei Mensch und Tier zu fördern. Die Verbindungen eignen sich demnach besonders für die Stimulation der körperlichen Abwehr, z.B. bei chronischen und akuten Infektionen oder bei selektiven (antigenspezifischen) immunologischen Defekten, sowie bei angeborenen, aber auch bei erworbenen allgemeinen (d.h. nicht antigenspezifischen) immunoligischen Defektzuständen, wie sie im Alter, im Verlauf schwerer Primärerkrankungen und vor allem nach Therapie mit ionisierenden Strahlen oder mit immunosuppressiv wirkenden Hormonen auftreten. Die genannten Stoffe können somit vorzugsweise auch in Kombination mit Antibiotika, Chemotherapeutika oder anderen Heilverfahren verabreicht werden, um immunologischen Schädigungen entgegenzuwirken. Schliesslich sind die beschriebenen Stoffe auch zur allgemeinen Prophylaxe von Infektionskrankheiten bei Mensch und tier geeignet.
  • Die neuen Lipopeptide können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden. Nach einem bevorzugten Verfahren werden die Verbindungen der Formel (I), ihre diastereomeren Gemische und ihre Salze und Komplexe dadurch hergestellt,
    • a) dass man in einer Verbindung der Formel
      Figure imgb0006
      worin R1, R2 und R3 die für Formel (I) angegebene Bedeutung haben und Y eine X in der Formel (I) entsprechende Aminosäure oder Aminosäurensequenz darstellt, worin jedoch mindestens eine der die Aminosäuren substituierenden hydrophilen Gruppen und/oder die terminale Carboxylgruppe durch eine unter neutralen oder milden sauren Bedingungen abspaltbare Schutzgruppe geschützt ist, oder in einem Salz einer solchen Verbindung, die Schutzgruppe(n) abspaltet, oder
    • b) dass man eine Verbindung der Formel
      Figure imgb0007
      worin R1, R2 und R3 die für Formel (I) angegebene Bedeutung haben und W = OH oder eine Aminosäure oder eine unvollständige Sequenz von Aminosäuren gemäss X in Formel (I) darstellt, mit einer Verbindung der Formel
      Figure imgb0008
      wo Z1 eine der Gruppe X in Formel (I) entsprechende Gruppe bzw. eine zur genannten Aminosäure oder unvollständigen Sequenz von Aminosäuren gemäss X komplementären Aminosäuresequenz bzw. Aminosäure bedeutet, in welchen Sequenzen jedoch keine freien Aminogruppen vorhanden sind, oder einem Salz derselben, umsetzt, oder
    • c) eine Verbindung der Formel
      Figure imgb0009
      , worin R2 die für Formel (I) Angegebene Bedeutung besitzt und R3 Wasserstoff oder die Gruppe HQ-CH2 darstellt, und Z2 eine X in Formel (I) entsprechende Gruppe darstellt, worin jedoch keine freien Hydroxygruppen vorhanden sing, oder ein Salz dieser Verbindung, in an sich bekannter Weise acyliert, und, wenn erwünscht, in erhaltenen Verbindungen mit freier terminaler Carboxylgruppe dieselbe in eine Amidgruppe oder Estergruppe überführt, und/oder die Verbindungen in ihre Salze oder Komplexe überführt.
  • Die Schutzgruppen im Verfahren gemäss Variante a) sind besonders die von der Synthese von Peptiden her bekannten.
  • So sind z.B. Schutzgruppen für Aminogruppen Acyl- oder Aralkylgruppen wie Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, Benzolsulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, 2,4-Dinitrophenylsulfenylgruppen (diese Sulfenylgruppen können auch durch Einwirking nucleophiler Reagenzien, z.B. Sulfite, Thiosulfate, abgespalten werden), gegebenenfalls substituierte, wie z.B. durch Niederalkoxygruppen, besonders o- oder p-Methoxygruppen substituierte Benzyl-, oder Diphenyl- oder Triphenylmethylgruppen oder von der Kohlensäure sich ableitende Gruppen, wie gegebenenfalls in den aromatischen Ringen, z.B. durch Halogenatome wie Chlor oder Brom, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder farbgebende Gruppen, z.B. Azogruppen substituierte Arylmethyloxycarbonylgruppen, in denen die Methylengruppe durch einen weiteren Arylrest und/oder einen oder gegebenenfalls zwei niedere Alkylreste substituiert sein kann, wie Benzyl-, Benzhydryl- oder 2-Phenyl-isopropyloxycarbonylgruppen, z.B. Carbobenzoxy, p-Brom- oder p-Chlorcarbobenzoxy, p-Nitrocarbobenzoxy oder p-Methoxycarbobenzoxy, p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonyl, 2-Tolyl-isopropyloxycarbonyl und insbesondere 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl, sowie aliphatische Oxycarbonylgruppen wie Adamantyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Trichlor- äthyloxycarbonyl, tert. Amyloxycarbonyl oder vor allem tert.-Butyloxycarbonyl.
  • Die Aminogruppen können auch durch Bildung von Enaminen, erhalten durch Reaktion der Aminogruppe mit 1,3-Diketonen, z.B. Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon, geschützt werden.
  • Carboxylgruppen sind beispielsweise durch Amid- oder Hydrazidbildung oder durch Veresterung geschützt. Die Amid- und Hydrazidgruppen können gegebenenfalls substituiert sein, die Amidgruppe z.B. durch die 3,4-Dimethoxybenzyl- oder bis-(p-Methoxyphenyl)-methylgruppe, die Hydrazidgruppe z.B. durch die Carbobenzoxygruppe, die Trichloräthyloxycarbonylgruppe, die Trifluoracetylgruppe, die Tritylgruppe, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe oder die 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonylgruppe. Zur Veresterung geeignet sind z.B. niedere gegebenenfalls substituierte Alkanole wie Methanol, Aethanol, Cyanmethylalkohol, Benzoylmethylalkohol oder insbesondere tert.-Butanol, ferner Aralkanole wie Arylniederalkanole, z.B. gegebenenfalls durch Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Halogenatome substituierte Benzylalkohole oder Benzhydrole wie Benzhydrol, p-Nitrobenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol, 2,4,6-Trimethylbenzylalkohol, gegebenenfalls durch elektronenanziehende Substituenten substituierte Phenole und Thiophenole wie Thiophenol, Thiokresol, p-Nitrothiophenol, 2,4,5-und 2,4,6-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Cyanophenol oder p-Methansulfonylphenol, weiter z.B. N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxypiperidin, 8-Hydroxychinolin.
  • Die Hydroxygruppen der Serin- und Threoninreste können z.B. durch Veresterung oder Verätherung geschützt sein.
  • Als Acylreste bei der Veresterung sind vor allem von der Kohlensäure sich ableitende Reste wie Benzoyloxycarbonyl oder Aethyloxycarbonyl geeignet. Zur Verätherung geeignete Gruppen sind z.B. Benzyl-, Tetrahydropyranyl- oder tert.-Butylreste, Ferner eignen sich zum Schutz der Hydroxylgruppen die in Ber. 100 (1967), 3838-3849 beschriebenen 2,2,2-Trifluor-1-tert.-butyloxycarbonylamino-oder -1-benzyloxycarbonylaminoäthylgruppen (Weygand).
  • Vorzugsweise verwendet man zum Schutz der Carboxylgruppe der Seitenketten und gegebenenfalls der terminalen Carboxylgruppe die tert.-Butylestergruppe oder die Benzhydrolgruppe, zum Schutz der Aminogruppen der Seitenketten die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, für die Hydroxylgruppen von Serin oder Threonin, die tert.-Butyläthergruppe, und, wenn erwünscht, zum Schutz der Iminogruppe des Histidins die 2,2,2-Trifluor-1-tert.-butyloxycarbonylaminoäthylgruppe.
  • Die verfahrensgemässe Abspaltung der Schutzgruppen mit sauren Mitteln unter milden Bedingungen erfolgt z.B. in einer von der Peptidchemie her bekannten Weise, z.B. durch Behandlung mit Trifluoressigsäure.
  • Eine besondere Schutzgruppe für Carboxylgruppen, welche unter neutralen Bedingungen abspaltbar ist, ist die z.B. in der Deutschen Offenlegungsschrift 27 06 490 beschriebene Gruppe der allgemeinen Formel
    Figure imgb0010
    worin Rl, R2 und R3 je einen Kohlenwasserstoffrest bedeutet, wobei die Reste untereinander auch durch eine einfache C-C Bindung verknüpft sein können, insbesondere Alkylreste mit 1-5 C Atomen. Schutzgruppen dieses Typs sind z.B. die 2-(Dimethyl-tert.-butylsilyl)-äthyl-, die 2-(Dibutyl-methyl-silyl)-äthyl- und vor allem die 2-(Trimethylsilyl)-äthylgruppe. Obwohl diese Schutzgruppen auch basisch abgespalten werden können, ist besonders ihre Abspaltbarkeit unter neutralen Bedingungen, und zwar durch Einwirking eines Salzes der Fluorwasserstoffsäure, von Interesse. Die Abspaltung der Schutzgruppe wird vorteilhaft in einem aprotischen organischen Lösungsmittel vorgenommen; vorzugsweise wird dabei die Anwesenheit von solchen Lösungsmitteln vermieden, welche das Fluorid-Anion zu solvatisieren vermögen, wie Wasser oder niederaliphatische Alkohole.
  • Die Kondensation gemäss der Variante b) der Verbindung der Formel (VII) mit der Verbindung der Formel (VIII) erfolgt z.B. in der Weise, dass man die Verbindung (VII) in Form der aktivierten Carbonsäure mit (VIII) umsetzt, oder dass man die Säure (VII) mit der Verbindung (VIII), deren Aminogruppe in aktivierter Form vorliegt, umsetzt. Gegebenenfalls werden die Verbindungen (VII) bzw. (VIII) für die Kondensation in Form ihrer Salze eingesetzt.
  • Die Carboxylgruppe der Verbindung (VII) kann beispielsweise durch Ueberführung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, Thiokresylester, p-Methansulfonylphenylester, p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5- oder 2,4,6-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychinolinester, 2-Hydroxy-1,2-dihydro-1-carbäthoxy-chinolin-ester, N-Hydroxypiperidinester oder einen Enolester, der mit N-Aethyl-5-phenyl-isoxazolium-3-sulfonat gewonnen wird [Woodward Reagens], oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid) oder eines unsubstituierten oder z.B. durch Halogen, Methyl oder Methoxy substituierten 1-Hydroxybenzotriazols, 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-d1hydrobenzo[d]-1,2,3-triazins oder N,NI-Carbonyldiimidazols, aktiviert werden.
  • Die Aminogruppe der Verbindung (VIII) kann beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphit aktiviert werden.
  • Als gebräuchlichste Methoden der Kondensation sind zu nennen: die Methode nach Weygand-Wünsch (Carbodiimid in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid), die Azidmethode, die Methode der N-Carboxyanhydride oder N-Thiocarboxyanhydride, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode. Insbesondere können diese Kondensationen nach der Merrifield-Methode vollzogen werden.
  • Es ist auch möglich, die Kondensation der Verbindung (VII) nach den eben erwähnten Methoden mit einer Verbindung entsprechend der Formel (VIII) zu vollziehen, in welcher die terminale Carboxylgruppe durch eine von einer, wie für X definiert, Amid- oder Estergruppe verschiedene Schutzgruppe, wie eine der oben angegebenen, blockiert is, und/oder eine oder mehrere der vorhandenen hydrophilen Gruppen in geschützter Form, wie oben beschrieben, vorliegen. Man gelangt so zu Kondensationsprodukten, welche zur Gruppe der für die oben beschriebene Variante a) benützten Ausgangsstoffe der Formel (VI) gehören, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.
  • Gemäss der obigen Variante c) werden in Verbindungen der Formel (IX), die im Teil ZZ keine freien Hydroxygruppen enthalten dürfen, die freien Hydroxylgruppen im Glyzeryl- bzw. Erythrityl-Rest acyliert. Diese acylierung kann in an sich bekannter Weise, z.B. durch Reaktion mit einem reaktiven funktionellen Derivat der dem einzuführenden Rest entsprechenden Säure, wie dem Anhydrid oder einem Säurehalogenid, vorzugsweise in Gegenwart einer tertiären Base, wie Pyridin oder Kollidin, ausgeführt werden.
  • Dieses Verfahren ist besonders zur Herstellung von Verfahrensprodukten gemäss Formel I, in welchen die Acylreste im Glyzeryl-bzw. Erythrityl-Rest und am Cystein-rest verschieden sind, geeignet.
  • Wendet man diese Variante bei Verbindungen gemäss Formel (IX) an, bei denen jedoch im Teil Z2 die terminale Carboxylgruppe, ausser als durch Amid- oder Esterrest, wie für X vorgesehen, auch durch andere Schutzgruppen geschützt ist, und/oder eine oder mehrere der vorhandenen hydrophilen Gruppen in geschützter Form, wie oben beschrieben, vorliegen, so kommt man ebenfalls zu Ausgangsverbindungen für die obige Variante a).
  • In den nach irgend einer der beschriebenen Verfahrensvarianten erhaltenen Lipopeptiden gemäss Formel I, in welchen eine freie terminale Carboxylgruppe im Teil X vorhanden ist, kann dieselbe in an sich bekannter Weise, z.B. nach einer der in der Peptidchemie gebräuchlichen Methoden, in die Amid-oder Estergruppe übergeführt werden.
  • Ein als Ausgangsstoff zu verwendendes N-Acyl- oder N,O,O-Triacyl-S-(2,3-dihydroxypropyl)-cystein gemäss Formel (VII), sofern W=OH und R3=H, ist, kann in folgender Weise erhalten werden: ausgehend von 1,2,5,6-D-Mannitdiacetonid gewinnt man durch Perjodatoxydation 2-O,3-O-lsopropyl- iden-D-glyzerinaldehyd, reduziert die Aldehyd- zur Carbinolgruppe und verestert diese mit p-Toluolsulfonsäure. Das so erhaltene 1-0-Tosyl-2(R)-O,3-0-isopropylidenglyzerin kondensiert man mit N-Acyl-(R)-cystein in Gegenwart eines basischen Mittels, z.B. Kaliumcarbonat, und erhält so das N-Acyl-S-[2(R),3-Isopropylendioxy-propyll-(R)-cystein, das sauer, z.B. mit Essigsäure, verseift wird. Das so erhaltene N-Acyl-S-[2(R),3-dihydroxypropyll-(R)-cystein kann, wenn erwünscht, in der 2- und 3-Stellung des Glyzerinanteils, vorzugsweise unter vorübergehendem Schutz der Carboxylgruppe, z.B. mittels der oben beschriebenen Trimethylsilyläthylgruppe oder vorzugsweise der Benzhydrylestergruppe, weiter acyliert werden.
  • Zur Herstellung eines als Ausgangsstoff gemäss Formel (VII) zu verwendendes N-Acyl- oder N,0,0,0-Tetraacyl-S-(2,3,4-trihydroxybutyl)-cysteins kann man analog der Methode von Beispiel 7 vorgehen.
  • Die zur verfahrensgemässen Herstellung der neuen Lipopeptide zu verwendenden Aminosäuren bzw. Peptide sind bekannt oder können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden.
  • Die obigen Ausgangsverbindungen (VII) für die Variante b) für den Fall, dass W = OH ist, sowie ihre diastereomeren Gemische, Salze und Komplexe besitzen selber auch eine immunpotenzierende Wirkung, wobei diese in vitro im gleichen Dosisbereich wie für die Verbindungen der Formel und ihre Derivate angegeben, auftritt. In vivo zeigen die genannten Verbindungen im oben beschriebenen Test zur Potenzierung der humoralen Immunität bei der intraperitonealen Verabreichung 5 Tage vor der Antigengabe einen Anstieg der Antikörpertiter im Serum im Dosenbereich von 1.0 bis 3 mg/kg Tier.
  • Diese Verbindungen können durch Acylierung einer Verbindung gemäss Formel (IX) in der jedoch anstelle von Z2 eine Hydroxygruppe vorhanden ist, wie oben für Variante c) beschrieben, erhalten werden. Die Herstellung der dazu benötigten Ausgangsstoffe, d.h. die Glyzeryl- bzw. Erithrityl-N-Acylcysteine ist oben beschrieben. Verbindungen der Formel (IX), in denen Z2 eine der Gruppe X in Formel (I) entsprechende Bedeutung hat, und in der aber keine freien Hydroxylgruppen vorhanden sind, können durch Umsetzung der soeben genannten N-Acyl-cystein-Derivate mit einer Verbindung der Formel NH2-Z2 nach den gleichen Prinzipien wie für die oben beschriebene Variante b) des allgemeinen Verfahrens zur Darstellung der erfindungsgemässen Lipopeptide angegeben, erhalten werden.
  • Die erhaltenen Lipopeptide können in an sich bekannter Weise in ihre Salze übergeführt werden, z.B. durch Umsetzen erhaltener saurer Verbindungen mit Alkali- oder Erdalkalihydroxyden oder erhaltener basischer Verbindungen mit Säuren.
  • Infolge der engen Beziehung zwischen den neuen Verbindungen in freier Form und in Form ihrer Salze und Komplexe sind im vorausgegangenen und nachfolgend unter den freien Verbindungen sinn-und zweckgemäss gegebenenfalls auch die entsprechenden Salze zu verstehen.
  • Erhaltene Isomerengemische können auf Grund der physikalisch-chemischen Unterschiede der Bestandteile in bekannter Weise aufgetrennt werden, beispielsweise durch Chromatographie und/oder fraktionierte Kristallisation. Vorteilhafterweise isoliert man das wirksamere der Isomeren.
  • Die oben beschriebenen Verfahren werden z.B. nach an sich bekannten Methoden durchgeführt, in Abwesenheit oder vorzugsweise in Anwesenheit von Verdünnungs- oder Lösungsmitteln, wenn notwendig, unter Kühlen oder Erwärmen, unter erhöhtem Druck und/oder in einer Inertgas, wie Stickstoffatmosphäre. Dabei sind unter Berücksichtigung aller im Molekül befindlichen Substituenten, wenn erforderlich, insbesondere bei Anwesenheit leicht hydrolysierbarer O-Acylreste, besonders schonende Reaktionsbedingungen, wie kurze Reaktionszeiten, Verwendung von milden sauren Mitteln in niedriger Konzentration stöchiometrische Mengenverhältnisse, Wahl geeigneter Katalysatoren, Lösungsmittel, Temperatur und/oder Druckbedingungen, anzuwenden.
  • Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsformen des Verfahrens, bei denen man von einer auf irgendeiner Stufe des Verfahrens als Zwischenprodukt erhältlichen Verbindung ausgeht und die fehlenden Verfahrensschritte durchführt, oder das Verfahren auf irgendeiner Stufe abbricht, oder einen Aufgangsstoff unter den Reaktionsbedingungen bildet oder in Form eines reaktions fähigen Derivats oder Salzes verwendet. Dabei geht man vorzugsweise von solchen Ausgangsstoffen aus, die verfahrensgemäss zu den oben als besonders wertvoll beschriebenen Verbindungen führen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls pharmzeutische Präparate, welche die beschriebenen neuen Lipopeptide gemäss der Erfindung, sowohl solche entsprechend der Formel (I) wie solche der Formel (VII), ihre Gemische, Salze oder Komplexe enthalten. Bei den erfindungsgemässen pharmzeutischen Präparaten handelt es sich um solche zur enteralen, wie oralen oder rektalen, sowie parenteralen Verabreichung an Warmblüter, welche den pharmkologischen Wirkstoff allein oder zusammen mit einem pharmazeutisch anwendbaren Trägermaterial enthalten. Die Dosierung des Wirkstoffes hängt von der Warmblüter-Spezies, dem Alter und dem individuellen Zustand, sowie von der Applikationsweise ab.
  • Die neuen pharmazeutischen Präparate enthalten von etwa 10% bis etwa 95%, vorzugsweise von etwa 20% bis etwa 90% des Wirkstoffs. Erfindungemässe pharmazeutische Präparate können z.B. in Dosiseinheitsform, wie Dragees, Tabletten, Kapseln, Suppositorien oder Ampullen vorliegen.
  • Die pharmazeutischen Präparate der vorliegenden Erfindung werden in an sich bekannter Weise, z.B. mittels konventioneller Misch-, Granulier-, Dragier-, Lösungs- oder Lyophilisierungsverfahren hergestellt.
  • Geeignete Trägerstoffe sind insbesondere Füllstoffe, wie Zucker, z.B. Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit, Cellulosepräparate und/oder Calciumphosphate, z.B. Tricalciumphosphat oder Calciumhydrogenphosphat, ferner Bindemittel, wie Stärkekleister unter Verwendung z.B. von Mais-, Weizen-, Reis- oder Kartoffelstärke, Gelatine, Traganth, Methylcellulose, Hydroxypropyl-methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon, und/oder, wenn erwünscht, Sprengmittel, wie die obgenannten Stärken, ferner Carboxymethylstärke, quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon, wie Natriumalginat Hilfsmittel sind in erster Linie Fliessregulier-und Schmiermittel, z.B. Kieselsäure, Talk, Stearinsäure oder Salze davon, wie Magnesium- oder Calciumstearat, und/oder Polyäthylenglykol. Dragee-Kerne werden mit geeigneten, gegebenenfalls magensaftresistenten Ueberzügen versehen, wobei man u.a. konzentrierte Zuckerlösungen, welche gegebenenfalls arabischen Gummi, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Polyäthylenglycol und/oder Titandioxid enthalten, Lacklösungen in geeigneten organischen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen oder, zur Herstellung von Magensaft-resistenten Ueberzügen, Lösungen von geeigneten Cellulosepräparaten, wie Acetylcellulosephthalat oder Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, verwendet. Den Tabletten oder Dragee-Ueberzügen können Farbstoffe oder Pigmente, z.B. zur Identifizierung oder zur Kennzeichnung verschiedener Wirkstoffdosen, beigefügt werden.
  • Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die oben beschrieben Erfindung; sie sollen jedoch diese in ihrem Umfang in keiner Weise einschränken. Temperaturen werden in Celsiusgraden angegeben. Die benützten Abkürzungen bedeuten:
    Figure imgb0011
  • In DC verwendet man Kieselgel als Adsorbens und folgende Systeme als Laufmittel:
    • System 3: Essigester-Pyridin-Wasser (65:20:15)
    • System 157: Chloroform-Methanol-Wasser-Eisessig (70:42:10:0.5)
    • System 157c: Chloroform-Methanol-Wasser-Eisessig (75:25:5:0.5)
    Beispiel 1
  • 1,13 g [N-Palmitoyl-S-2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ser(But)-Ser(But)-Asn-OBut werden in 5 ml 90 proz. Trifluoressigsäure aufgenommen und nach 45 Minuten bei 20° die Lösung auf ca. 2 ml eingeengt. Das Produkt wird durch Zugabe von 75 ml peroxidfreiem Aether ausgefällt, abfiltriert und über Kaliumhydroxid getrocknet. Das so erhaltene Lipopeptid[N-Palmitoyl-S-2(R),3-dipalmitoyloxy- , propyl]-Cys-Ser-Ser-Asn-OH zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende RF-Werte: Rf (Chloroform-Methanol-Eisessig-Wasser 79:25:0,5:4,5) = 0,25.
  • 0.89 A [N-Palmitoyl-S-2(R),3-dihydroxypropyl]-Cys-Ser(But)-Ser(But)-Asn-OBut werden in 10 ml Pyridin aufgenommen, 0,725 ml Palmitinsäurechlorid zugegeben und die Lösung 24 Stunden bei 45° gehalten. Man gibt dann 200 ml Chloroform zu und extrahiert die Lösung mit IN Zitronensäure, IN Natriumbicarbonat und Wasser, trocknet die organische Phase über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab. Der Rückstand wird durch Chromatographie an Kieselgel im System Chloroform, bzw. Chloroform-Methanol (98:2) gereinigt. Das dünnschichtchromatographisch einheitliche Lipopeptid [N-Palmitoyl-S-2(R),3-dipalmitoyloxypropyl)-Cys-Ser(But)-Ser(But)-Asn-OBut zeigt im System Chloroform-Methanol (9:1) auf Silikagel einen Rf-Wert von 0,75.
  • Zu 0,90 g [N-Palmitoyl-S-2(R),3-dihydroxypropyl]-Cystein und 0,99 g H-Ser(But)-Ser(But)-Asn-OBut in 20 ml Dimethylformamid werden bei 0° 0,472 g Dicyclohexylcarbodiimid und 0,309 A N-Hydroxybenzotriazol gegeben. Nach 2 Stunden bei 0° und 15 Stunden bei 20° wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Den Rückstand reinigt man durch Chromatographie an einer Säule von Silikagel im System Chloroform-Methanol (98-2). Im Dünnschichtchromatogramm auf Silikagel zeigt das so erhaltene Lipopeptid-derivat [N-Palmitoyl-S-2(R),3-dihydroxypropyl]-Cys-Ser(But)-Ser(But)-Asn-OBut einen Rf-Wert von 0,60 (Chloroform-Methanol 8:2).
  • 6,09 g Z-Ser(But)-Ser(But)-Asn-OBut werden in 60 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 0,5 g Pd-Kohle (1 O%ig) bei Raumtemperatur während 3 Stunden hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Das Produkt fällt als weisser Schaum an. Im Dünnschichtchromatogramm auf Silikagel zeigt das Peptid H-Ser(But)-Ser(But)-Asn-OBut einen Rf-Wert von 0,41 im System Chloroform-Methanol (8:2).
  • 4,134 g Z-Ser(But)-OH und 4,64 g H-Ser(But)-Asn-OBut werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst und bei 0° 3,172 g Dicyclohexylcarbodiimid und 1,89 g N-Hydroxybenzotriazol zugegeben. Nach 2 Stunden bei 0° und 15 Stunden bei 20° wird der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff abgesaugt, das Filtrat eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und die Lösung mit IN Zitronensäure, IN Natriumbicarbonat und Wasser extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigester-Hexan umkristallisiert. Das erhaltene Peptid Z-Ser(But)-Ser(But)Asn-OBut hat einen Schmelzpunkt von 96-98°. Auf Silikagel: Rf (Chloroform-Methanol 95:5) = 0,25.
  • 4,65 g Z-Ser(But)-Asn-OBut werden in 50 ml Methanol in Gegenwart von 0,4 g Pd-Kohle (1 O%ig) hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Eindampfen des Filtrates wird das Peptid H-Ser(But)Asn-OBut als weisser Schaum erhalten. Auf Silikagel: Rf (Chloroform-Methanol 7: 3) = 0,48.
  • 5,9 g Z-Ser(But)-OH und 3,76 g H-Asn-OBut werden in 60 ml Dimethylformamid gelöst und bei 0° mit 3,06 g N-Hydroxybenzotriazol und 4,53 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 2 Stunden bei 0° und 15 Stunden bei 20° filtriert man, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester-Petroläther. Das erhaltene Peptid Z-Ser(But)-Asn-OBut schmilzt bei 114-115°. [α]20 D = + 4° (C = 1,5 in Methanol). Auf Silikagel: Rf (Chloroform-Methanol 9:1) = 0,48.
    • Beispiel 2
  • 1,6 g [N-Palmitoyl-S-2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ser(But)-Ser(But)-Asn-Ala-OBut werden in 7,5 ml 90%iger-Trifluoroessigsäure gelöst und die Lösung nach 15 Minuten bei 20° auf ca. 2 ml eingeengt. Man fällt das Produkt mit 100 ml Aether aus, filtriert und trocknet über Natriumhydroxyd. Es resultiert ein weisses Pulver vom Schmelzpunkt 215-217° (Zersetzung), das das Lipopeptid [N-Palmitoyl-S-2(R),3-dipalmotoyloxypropyl]-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-OH darstellt. Auf Silikagel: Rf (157) = 0,55.
    • Beispiel 3
  • 0,95 g [N-Palmitoyl-S-2(R),3-dipalmotoyloxypropyl]-Cys-Ser(But)-Ser(But)-OBut werden in 4 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst. Nach 1 5 Minuten bei 20° gibt man 100 ml Aether zu, filtriert ab und trocknet den Rückstand über Natriumhydroxyd. Das erhaltene Lipopeptid [N-Palmitoyl-S-2(R),3- dipalmotoyloxypropyl]Cys-Ser-Ser-OH wird als farbloses, nicht hygroskopisches Pulver erhalten. Auf Silikagel: Rf (Chloroform-Methanol-Eisessig-Wasser 79:25:0,5:4,5) = 0,53.
    • Beispiel 4
  • Das in Beispiel 1 als Ausgangsstoff verwendete N-Palmitoyl-S-2(R),3-dihydroxypropyl]-(R)-cystein kann folgendermassen hergestellt werden:
    • 13,9 g N-Palmitoyl-(R)-cystein, 5,5 g Kaliumcarbonat und 15 g 1-0-Tosyl-2(R)-0-3-0-isopropyliden-glyzerin erhitzt man 8 Stunden bei 80° in 250 ml Aethanol unter Stickstoff. Man reinigt das nach dem Eindampfen erhaltene Reaktionsgemisch durch Chromatographie an 400 g Kieselgel Merck durch Elution, zuerst mit Chloroform/Aceton (8:2), dann mit Chloroform/Methanol (8:2) Man erhält so das Kaliumsalz des N-Palmitoyl-S-[2(R),3-isopropylidendioxypropyl]-(R)-cystein, das durch 4- stündiges Erhitzen auf 80° in 80% wässriger Essigsäure verseift wird. Man dampft zur Trockne, löst den Rückstand in Chloroform und schüttelt mit Wasser aus. Nach Trocknen und Eindampfen der Chloroform-Phase erhält man einen farblosen Rückstand, der aus Cyclohexan umkristallisiert wird und das N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dihydroxypropyl]-(R)-cystein darstellt. Fp. 110°, [α]20 D =― 25° (c = 0.9, MeOH).
  • Das N-Palmitoyl-(R)-cystein kann folgendermassen hergestellt werden:
    • 45 g (R)-Cystein (0,37 mol) suspendiert man in 350 ml Pyridin und tropft unter gutem Rühren und in einer Stickstoffatomosphäre bei Raumtemperatur eine Lösung von 140 ml (1,67 Aequivalente) Palmitinsäurechlorid in 550 ml Methylenchlorid zu. Nach 20-stündigem Rühren säuert man mit 2N-Salzsäure an und verteilt zwischen Chloroform und Wasser. Nach Trocknen und Eindampfen der Chloroform-Phase erhält man ein Kristallgemisch, bestehend aus etwa einem Drittel Dipalmitoylcystein und etwa zwei Drittel Monopalmitoylcystein. Man extrahiert dreimal mit 1 Liter heissem Aceton, aus dem ein 1 : 1-Gemisch von Di- und Mono-Palmitoylcystein auskristallisiert. Aus der Acetonlösung erhält man durch Eindampfen N-Palmitoylcystein, das aus Benzin umkristallisiert wird. Fp 65­67°. [α]20 D = + 1 ° (c = 0,8; Methanol).
  • Die Mischungen aus Di- und Mono-palmitoyl-cystein werden in methanolischer Lösung unter Zugabe einer wässrigen Lösung von 12 g Natriumsulfid mit 2 ml conc. Natronlauge 15 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Nach Abdampfen des Methanols und Ansäueren des Rückstandes mit 2N-Salzsäure erhält man durch Chloroform-Extraktion das restliche N-Palmitoyl-cystein, das ebenfalls aus Benzin umkristallisiert wird.
    • Beispiel 5
  • 0,80 g N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-(R)-cystein und 0,67 g H-Ser(But)-Ser(But)-Phe-Ala-Glu(OBut)2 werden in 10 ml Dimethylformamid aufgenommen und 0,22 g Dicyclohexylcarbodiimid und 0,16 g N-Hydroxybenzotriazol zugegeben. Durch kurzes Erwärmen auf 40° wird eine klare Lösung erhalten, die nach ca. einer Stunde bei 20° zu einer Gallerte erstarrt. Letztere wird nach 24 Stunden durch Erwärmen auf 40° wieder in Lösung gebracht und daraus das N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ser(But)-Ser(But)-Phe-Ala-Glu(OBut)2 mit Wasser ausgefällt. Das Produkt wird durch Chromatographie an Kieselgel im system Chloroform bzw. Chloroform-Methanol 98:2 gereinigt und besitzt dann den Rf-Wert 0,64 in Chloroform-Methanol-Wasser 95:5.
  • 540 mg der so erhaltenen Verbindung werden in 30 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst und die Lösung nach 30 Minuten bei 20° auf ungefähr die Hälfte eingeengt und mit Petroläther das N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ser-Ser-Phe-Ala-Glu-OH ausgefällt. Die Verbindung wird abzentrifugiert, dreimal mit Petroläther gewaschen und über Kaliumhydroxid getrocknet. Sie stellt ein weisses Pulver mit dem Rf-Wert (System 157) = 0,63 dar.
  • In analoger Weise werden folgende Lipopeptide hergestellt:
    • N-Palmitoyl-S-[2(R,S),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Phe-Phe-Asn-Ala-Lys-OH, Rf (System 157 c) = 0,18;
    • N-Myristoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyll-Cys-Glu-Gln-Asn-Ala-Lys-OH, Rf (System 157 c) = 0,12;
    • N-Lauroyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Glu-OH, Rf (System 157 c)=0,20;
    • N-Stearoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Ala-OH, Rf
  • Das oben beschriebene mit den genannten Schutzgruppen versehene Peptid, das als Ausgangsstoff für die Kondensation mit N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-(R)-Cystein verwendet wird, kann folgendermassen hergestellt werden:
    • 17,22 g Z-Ala-ONp, 14,8 g HCI. HGlu(OBut)2 und 6,3 ml N-Ethylmorpholin werden in 40 ml Dimethylformamid über Nachtbei 20° stehen gelassen. Die Lösung wird eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit 1-N-Natriumbicarbonat und Wasser extrahiert.
  • Die Essigesterlösung wird eingedampft und es hinterbleibt als Schaum das Z-Ala-Glu(OBut)2 mit dem Rf-Wert 0,60 (in Chloroform-Methanol 95:5), das direkt weiterverarbeitet wird: 8,5 g werden in 60 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 0,8 mg Pd-Kohle (10%-ig) bei 20° während 2 Stunden hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Man erhält das H-Ala-Glu(OBut)2 als weissen Schaum, das den Rf 0.36 in Chloroform-Methanol 9:1 aufweist.
  • Zu 11,46 g Z-Phe-OH und 12,64 g H-Ala-Glu(OBut)2 in 50 ml Dimethylformamid gibt man bei 0° 8,68 g Dicyclohexylcarbodiimid und 5,86 g N-Hydroxybenzotriazol. Nach 15 Stunden bei 4° wird abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand aus Essigester-Hexan umkristallisiert. Man erhält das Z-Phe-Ala-Glu(OBut)2 vom Smp. 161-163°. Rf (Toluol-Aceton 1:1) = 0,63.
  • 6,4 g dieses Produkts werden in 50 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 0,5 g Pd-Kohle (10%-ig) bei 20° während 20 Minuten hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft, wobei das H-Phe-Ala-Glu(OBut)2 als weisser Schaum erhalten wird. Rf (Chloroform-Methanol 7:3) = 0,75.
  • Zu 4,43 g Z-Ser(But)-OH und 3,18 g HCI.H-Ser(But)-OMe in 30 ml Dimethylformamid gibt man bei 0° 1,89 ml N-Ethylmorpholin, 2,29 g HOBt und 3,4 g Dicyclohexylcarbodiimid. Nach 2 Stunden bei 0° und 15 Stunden bei 20° wird abfiltriert, das Filtrat eingedampft und in Essigester aufgenommen. Nach Extraktion der Lösung mit Natriumbicarbonat, verdünnter Salzsäure und Wasser dampft man ein, wobei das Z-Ser(But)-Ser(But)-CMe als Oel erhalten wird. Rf (Toluol-Aceton 1:1) = 0,70.
  • Zu einer Lösung von 6,8 g dieses Produkts in 40 ml Methanol werden 7,5 ml Hydrazinhydrat gegeben und nach 24 Stunden bei 20° auf etwa die Hälfte des Volumens eingedampft. Man nimmt in 250 ml Essigester auf und extrahiert mit Wasser. Die Essigesterlösung wird eingeengt und das erhaltene Z-Ser(But)-Ser(But)-NH―NH2 mit Petroläther ausgefällt. Rf (Toluol-Aceton 1:1) = 0,50.
  • 2,26 g dieses Produkts werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und bei -10° mit 7,022 ml 1,78 N-HCI in Essigester und 0,635 ml tert. Butylnitrit versetzt. Nach 10 Minuten bei -10° wird eine Lösung von 2,38 g H-Phe-Ala-Glu(OBut)2 und 2,52 ml N-Ethylmorpholin zugetropft und eine Stunde bei -10° und 15 Stunden bei 0° gehalten. Die Lösung wird dann eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit Natriumbicarbonat, verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen. Das nach Eindampfen der Losüng erhaltene Z-Ser(But)-Ser(But)-Phe-Ala-Glu(OBut)2 wird aus Essigester-Hexan umkristallisiert. Smp. 213-215°, Rf (Toluol-Aceton 1:1) = 0,70.
  • 2,30 g dieses Produkts werden in 40 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 0,5 g Pd-Kohle (10%-ig) bei 20° während 2 Stunden hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft, wobei das H-Ser(But)-Ser(But)-Phe-Ala-Glu(OBut)2 als weisser Schaum anfällt. Rf (Toluol-Aceton 1:1)= 0,23.
  • Das als Ausgangsstoff verwendete N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl)-(R)-cystein und das diastereomere Gemisch dieser Verbindung mit der entsprechenden 2(S)-Verbindung, die abgekürzt hier als 2(R,S) bezeichnet wird, können folgendermassen hergestellt werden:
    • 6,3 g (2.78 mMol) N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-(R)-cystein-benzhydrylester löst man in einer Mischung aus 12 ml Trifluoressigsäure und 48 ml Methylenchlorid. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur dampft man die Lösung ein und verreibt den öligen Rückstand mit Wasser. Das auskristallisierte N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-(R)-cystein wird abgesaugt, getrocknet und zur Entfernung des Benzhydrols dreimal mit Benzin verrieben. Man kristallisiert den Rückstand aus Aceton-Wasser und erhält so farblose Kristalle dieses Produkts vom Smp. 71-75° und [α]20 D =― 1 ° (Dioxan).
  • Den obigen Ester erhält man auf folgende Art:
    • 12 g (20 mMol) N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dihydroxypropyl]-(R)-cystein-benzhydrylester löst man in einer Mischung aus 60 ml Pyridin und 60 ml Methylenchlorid und tropft bei 0-10° 14,5 ml (13,2 g) Palimitinsäurechlorid zu. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur ist die Reaktion gemäss Dünnschichtchromatogramm beendet. Man gibt zur Suspension (Pyridinhydrochlorid) 10 ml Methanol, rührt 20 Minuten bei 25° und dampft dann das Reaktionsgemisch weitgehend ein. Man nimmt den Rückstand in Chloroform auf, schüttelt je zweimal mit 0,5 N-Salsäure, 10% Natriumbicarbonat und Wasser aus, trocknet die Chloroform-Phase mit Natriumsulfat und dampft sie zum Syrup ein. Den reinen Ester erhält man durch Chromatographie dieses Syrups über Kieselgel in Chloroform. Die chromatographisch einheitlichen Fraktionen (DC-Kontrolle auf Kieselgel in Chloroform: Essigester 98:2, Rf=0,5) werden eingedampft und aus Aceton umkristallisiert. Man erhält farblose Kristalle des N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-(R)-cystein-benzhydrylesters vom Smp. 69-71 °.
  • Der oben verwendete Benzydrylester der N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dihydroxypropyl]-(R)-cysteins erhält man z.B. auf folgende Weise:
    • 23,4 g (54 mMol) N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dihydroxypropyl]-(R)-cystein löst man in 150 ml Chloroform-Aethanol-Gemisch 1:1 und tropft dazu bei Raumtemperatur eine Lösung von 13,6 g (70 mMol) Diphenyldiazomethan in 50 ml Chloroform. Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur ist die anfänglich rote Lösung entfärbt und nach DC (Chloroform: Methanol = 9:1, Kieselgel) die Reaktion beendet.
  • Man dampft im Vakuum zur Trockne und extrahiert den Rückstand kalt mit Petroläther. Der Rückstand wird über Kieselgel mit Methylenchlbrid als Lösungsmittel filtriert. Man erhält so farblose Kristalle des Benzhydrylesters vom Smp. 88-91 °.
  • Zur Herstellung des N-Palmitoyl-2-[2(R,S),3-dihydroxypropyl]-(R)-cysteins verfährt man wie folgt:
    • 50 g (139 mMol) N-Palmitoyl-(R)-cystein, 12,4 g Glycid und 45 g Kaliumcarbonat werden in 375 ml Aethanol unter Stickstoff und gutem Rühren 16 Stunden auf 80° erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur säuert man mit 2 N-Salzsäure auf pH ca. 4 an und versetzt mit Wasser; dabei fällt das Produkt aus. Man saugt ab und wäscht mit Wasser bis das Filtrat frei von Chlorionen ist. Nach dem Trocknen des Nutschgutes im Vakuum kristallisiert man aus Essigester um. Man erhält farblose Kristalle des Diastereomerengemisches des N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dihydroxypropyl]-(R)-cysteins und N-Palmitoyl-S-[2(S),3-dihydroxypropyl]-(R)-cysteins vom Smp. 76-155°.
  • Durch Umsetzung des N-Palmitoyl-2-[2(R,S),3-dihydroxypropyl]-(R)-cysteins mit Diphenyldiazomethan, wie oben für R-Verbindung angegeben S, und anschliessende Palmitoylerung ebenfalls wie eben angegeben erhält man den N-Palmitoyl-S-[2(R,S),3-dipalmitoyloxypropyl]-(R)-cystein- benzhydrylester: farblose Kristalle vom Smp. 84-85°.
  • Wenn man dieses Diastereomeren-Gemisch (19,8 g) an einer Säule mit 250 g Kieselgel (Merck) mit Methylenchlorid als Lösungsmittel chromatographiert, so erhält man in einer ersten Fraktion (1,55 g) das R-Diastereomere (Rf = 0,61, Methylenchlorid: Essigester = 98:2, Dünnschicht, Kieselgel), in einer zweiten Fraktion 12,7 g eines R,S-Diastereomerengemisches und in einer dritten Fraktion (1,1 g) des S-Diastereomeren (Rf = 0,53 in Methylenchlorid: Essigester = 98:2).
  • Aus dem (S)-Diastereomeren erhält man in der oben beschriebenen Weise das N-Palmitoyl-S-[2(S),3-dipalmitoyloxypropyl](R)-cystein; farblose Kristalle, Smp. 64-65° [α]20 D = + 1 ° (Dioxan).
  • Die für die Herstellung der in diesem Beispiel erwähnten in analoger Weise wie das N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ser-Ser-Phe-Ala-Glu-OH herzustellenden neuen Lipopeptide gemäss der Erfindung benötigten Ausgangsstoffe sind z.B. das
    • N-Myristoyl-S-[2(R),3-dihydroxypropyl]-(R)-cystein, farblose Kristalle vom Smp. 140-150°, und das
    • N-Stearoyl-S-[2(R),3-dihydroxypropyl]-(R)-cystein, farblose Kristalle vom Smp. 140-150°;
    • N-Lauroyl-S-[2(R),3-dihydroxypropyl]-(R)-cystein, farblose Kristalle vom Smp. 140-150°.
  • Sie können gemäss den Angaben im Beispiel 4 hergestellt werden.
  • Die gemäss den obigen Angaben herzustellenden Benzhydrylester haben folgende Daten:
    • N-Myristoyl-S-[2(R),3-dihydroxypropyl]-(R)-cystein-benzhydrylester, farblose Kristalle vom Smp. 90-92°;
    • N-Stearoyl-S-[2(R),3-dihydroxypropyl]-(R)-cystein-benzhydrylester, farblose Kristalle vom Smp. 95°-97°;
    • N-Lauroyl-S-[2(R),3-dihydroxypropyl]-(R)-cystein-benzhydrylester, farblose Kristalle vom Smp. 95-97°.
  • In analoger Weise wie beschrieben kann man folgende N-Acyl-S-[2(R),3-diacyloxypropyl]-(R)-cystein-benzhydrylester mit verschiedenen Acylgruppen am N und an den O-Atomen erhalten:
    • N-Lauroyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyll-(R)-cystein-benzhydrylester, Smp, 65-68°;
    • N-Myristoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-(R)-cystein-benzhydrylester, Smp. 68-70°;
    • N-Stearoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-(R)-cystein-benzhydrylester, Smp. 70-72°.
  • Weitere als Zwischenprodukt zur Verwendende Verbindungen, die nach den obigen Angaben hergestellt werden können, sind:
    • N-Lauryl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-(R)-cystein, farblose Kristalle, Smp. 70-72°;
    • N-Myristoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-(R)-cystein, farblose Kristalle, Smp. 71-73°;
    • N-Stearoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-(R)-cystein, farblose Kristalle, Smp. 74-77°.
    Beispiel 6
  • Mittels der im Beispiel 5 beschriebenen Reaktionen werden folgende Ausgangsstoffe zur Herstellung von Lipopeptiden gemäss der Anmeldung hergestellt:
    • N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dilauroyloxypropyl]-(R)-cystein-benzhydrylester, farbloses Wachs;
    • N-Palmitoyl-S-[2(R),3-distearoyloxypropyl]-(R)-cystein-benzhydrylester, farblose Kristalle, Smp. 80―82°;
    • N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dioleoyloxypropyl]-(R)-cystein-benzhydrylester, farbloses Oel;
    • N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dibehenoyloxypropyl]-(R)-cystein-benzhydrylester, farblose Kristalle, Smp. 85-88°;
    • N-Palmitoyl-S-[2(R),3-di-(dihydrosterkuloyloxypropyl]-(R)-cystein-benzhydrylester, farbloses Wachs.
  • Die entsprechenden nicht veresterten substituierten Cysteine haben folgenden Daten:
    • N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dilauroyloxypropyl]-(R)-cystein, farbloses Oel, Rf=0,27;
    • N-Palmitoyl-S-[2(R),3-distearoyloxypropyl]-(R)-cystein, farblose Kristalle, Smp. 82-85°;
    • N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dioleoyloxypropyl]-(R)-cystein, farbloses Oel, Rf in Chloroform: Methanol = 9:1 (Dünnschicht- Kieselgel-Merck) = 0,35;
    • N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dibehenoyloxypropyl]-(R)-cystein, farblose Kristalle., Smp. 87-90°;
    • N-Palmitoyl-S-[2(R),3-di-(dihydrosterkuloyloxypropyl]-(R)-cystein, farbloses Wachs, Rf=0,38 (gleiche Bedingungen wie oben für das N-Palmitoyl-2,3-dioleoyloxy-Derivat angegeben).
  • Diese Cystein-Derivate werden nach den Angaben im Beispiel 5 mit folgenden Peptiden kondensiert:
    • H-Phe-Phe-Asn-Ala-Lys-OH
    • H-Glu-Gln-Asn-Ala-Lys-OH
    • H-Ser-Ser-Asn-Ala-Glu-OH
  • Man erhält so die entsprechenden Lipopeptide gemäss der Erfindung.
    • Beispiel 7
  • Man lässt 0,9 g N-Palmitoyl-S-2(R),3(R),4-tripalmitoyloxy-butyl-(R)-cystein-benzhydrylester in einer Mischung aus 3 ml Trifluoressigsäure und 12 ml Methylenchlorid 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Dann dampft man zur Trockne, verreibt den Rückstand mit Eiswasser, saugt ab und trocknet den Festkörper. Dann extrahiert man ihn mit Benzin und kristallisiert aus Aceton um. Man erhält farblose Kristalle des N-Palmitoyl-S-2(R),3(R),4-tripalmitoyloxy-butyl-(R)-cysteins vom Smp. 76-76,5° und der spezifischen Drehung [α]20 D =―5° (c = 0,819, Dioxan).
  • Den als Ausgangsmaterial verwendeten Benzhydrylester gewinnt man auf folgende Weise:
    • 1 g N-Palmitoyl-S-2(R),3(R),4-trihydroxybutyl-(R)-cystein-benzhydrylester werden in einer Mischung aus 6 ml Pyridin in 5 ml Methylenchlorid mit 1,83 ml Palmitinsäurechlorid acyliert. Nach 18 Stunden bei Raumtemperatur gibt man 1 ml Methanol zu und dampft zur Trockne. Den Rückstand filtriert man über 100 g Kieselgel Merck mit Chloroform als Lösungsmittel. Die nach Dünnschichtchromatographie (CHCI3: Essigester = 98:2) reinen Fraktionen geben nach Eindampfen farblose Kristalle vom Smp. 60-62°.
  • Das Ausgangsmaterial für die obige Reaktion gewinnt man wie folgt:
    • 2,53 g N-Palmitoyl-S-2(R),3(R),4-trihydroxybutyl-(R)-cystein lässt man in einer Mischung aus 12 ml Aethanol und 32 ml Chloroform mit 1,37 g Diphenyldiazomethan 15 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Man dampft zur Trockne und reinigt den entstandenen Benzhydrylester an 150 g Kieselgel in Chloroform als Lösungsmittel. Rf = 0,3 (CHC13: Aceton = 95:5) Kieselgel Merck, Dünnschicht.
  • N-Palmitoyl-S-2(R),3(R),4-trihydroxybutyl-(R)-cystein gewinnt man auf folgende Weise.
  • 20 g N-Palmitoyl-cystein, 27,6 g 1-Toxyl-2,4-äthyliden-D-erythrit und 17 g Pottasche werden unter Stickstoff in 240 ml Aethanol 15 Stunden bei 80° gerührt. Dann filtriert man die Salze ab und dampft das Filtrat zur Trockne. Man nimmt den Rückstand in 200 ml H20: Tetrahydrofuran = 1:1 auf und säuert mit 2 N-Salzsäure auf pH = 3 an. Dann schüttelt man dreimal mit Aether aus, stellt mit Pyridin den pH der Aetherphase auf 4,5 ein, schüttelt mit Wasser aus, trocknet die Aetherphase und dampft zur Trockne. Diesen Rückstand reinigt man über 200 g Kieselgel Merck mit Chloroform: Aceton = 8:2 (1 1) und dann mit CHCl3:MeOH = 6:4 (1,2 1) als Elutionsmittel.
  • Die reinen Fraktionen werden eingedampft, mit Hexan verrieben und aus Essigester-Petroläther umkristallisiert.
  • Man erhält farblose Kristalle des N-Palmitoyl-S-[(2,4-äthyliden)-erythrityl]-(R)-cysteins vom Smp. 62­65°.
  • Die Hydrolyse dieser Verbindung wird mit 3-proz. HBF4 bei 80° während 4.5 Stunden ausgeführt.
  • 8,2 g Aethylidenderivat werden in 100 ml Dimethoxyäthan und 100 ml 3-proz. HBF behandelt. Dann kühlt man auf 0°, wobei das Hydrolyseprodukt ausfällt. Nach Absaugen und Trocken kristallisiert man aus Essigester um. Smp. 160-165°, Sintern ab 93 °. Rf = 0,285 (CHCl3:MeOH = 6:4) Dünnschicht, Kieselgel, Merck.
    • Beispiel 8
  • Analog den Angaben von Beispiel 5 werden aus N-Stearoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropylJ-(R)-cystein und aus N-Palmitoyl-S-[2(R),3(R),4-tripalmitoyloxybutyl]-(R)-cystein folgende Lipopeptide hergestellt:
    • N-Stearoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Glu-Ile-Asp-Glu-OH, Rf (157) = 0,32;
    • N-Palmitoyl-S-[2(R),3(R),4-tripalmitoyloxybutyl]-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Lys-OH, Rf (157) = 0,55;
    • N-Palmitoyl-S-[2(R),3(R),4-tripalmitoyloxybutyl]-Cys-Ser-Ser Asn-Ala-Lys-Ile-Asp-Glu-OH, Rf (157) = 0,38.
    Beispiel 9
  • Analog den Angaben des Beispiels 5 werden aus N-Palmitoyl-2(R),3-dipalmitoyloxypropyl-(R)-cystein oder N- Palmitoyl 2(R,S), 3-dipalmitoyloxypropyl-Cystein die nachstehend aufgeführten Lipopeptide hergestellt, wobei die Reste der eben genannten Cystein-Derivate mit PC(R) bzw. PC(R,S) bezeichnet werden:
    • PC(R,S)-Ser-Ser-Asn-OH
    • PC(R)-Ser-Ser-Asn-Ala-Lys-OH
    • PC(R,S)-Ser-Ser-Asn-Ala-Lys-OH
    • PC(R)-Ser-OH
    • PC(R,S)-Ser-OH
    • PC(R,S)-Ser-Ser-Asn-Ala-OH
    • PC(R)-Phe-Ile-Ile-Phe-Ala-OH
    • PC(R,S)-Phe-Ile-Ile-Phe-Ala-OH
    • PC(R)-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH
    • PC(R,S)-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH
    • PC(R)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
    • PC(R,S)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
    • PC(R)-Ser-Ser-Asn-Ala-Lys-Ile-Asp-Glu-OH
    • PC(R,S)-Ser-Ser-Asn-Ala-Lys-Ile-Asp-Glu-OH
  • Ferner stellt man die R, S-Epimerengemische sämtlicher in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Lipopeptide her.

Claims (33)

1. Verbindungen der Formel
Figure imgb0012
worin R, und R2 je einen gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen oder gemischt aliphatischcycloaliphatischen, gegebenenfalls auch durch Sauerstoffunktionen substituierten, Kohlenwasserstoffrest mit 11-21 C-Atomen, R3 Wasserstoff oder den Rest R1―CO―O―CH2― wo R, die gleiche Bedeutung hat, und X eine peptidisch gebundene natürliche aliphatische Aminosäure mit freier, veresterter oder amidierter Carboxylgruppe, oder eine Aminosäurensequenz von 2-10 natürlichen aliphatischen Aminosäuren, deren terminale Carboxylgruppe in freier, veresterter oder amidierter Form vorliegt, bedeuten, wobei die mit * bzw. ** bezeichneten Asymmetriezentren die absolute R- bzw; S- oder R-Konfiguration besitzen, und gegebenenfalls Gemische der an den **C-Atomen epimeren R- und S-Verbindungen, und ihre Salze und Komplexe.
2. Verbindungen gemäss Anspruch 1, worin die Acylreste R,CO und R2CO sich von gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren mit 14-18 C-Atomen ableiten, und worin R, und R2 identisch oder verschieden sein können.
3. Verbindungen gemäss Anspruch 1, worin die Acylreste sich von der Palmitin-, Stearin-, Oel-, Laurin-, Myristin-, Behen-, Dihydrosterkul-, Malval-, Hydnocarpus- oder Chaulmoograsäure ableiten.
4. Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1-3, worin hydrophile Gruppen tragende Aminosäuren in X die ionischen Aminosäuren Asparagin-, Glutamin- und/oder Oxyglutaminsäure, oder Lysin, Ornithin, Arginin und/oder Histidin. oder Asparagin. Glutamin, Serin und/oder Threonin sind, und keine hydrophile Gruppen tragenden Aminosäuren in X Glycin, Alanin, Valin, Norvalin, Leucin, Isoleucin und/ oder Methionin sind.
5. Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1-4, worin in der Peptidkette X die Aminosäuren mit hydrophilem Charakter direkt miteinander verbunden sind.
6. Verbindungen gemäss Anspruch 5, worin die Sequenz der Aminosäuren mit hydrophilem Charakter direkt an die Carboxylgruppe des Cysteins im Triacyl-Glyzeryl-bzw. Tetracyl-, Erithrityl-cystein-Teil gebunden ist.
7. Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1-6, worin X in Formel 1 eine Aminosäure oder eine Peptidkette mit 2-5 Aminosäuren darstellt.
8. Verbindungen gemäss Anspruch 1 der Formel
Figure imgb0013
ihre Salze und Komplexe, worin X eine peptidisch gebundene natürliche aliphatische Aminosäure mit einer hydrophilen Gruppe und freier, veresterter oder amidierter Carboxylgruppe, oder eine Aminosäuresequenz von 2-5 natürlichen aliphatischen Aminosäuren, von denen die Hälfte mindestens eine hydrophile Gruppe tragen, deren terminale Carboxylgruppe in freier, veresterter oder amidierter Form vorliegt, wobei die mit * und ** bezeichneten Asymmetrizentren die R-Konfiguration haben.
9. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1-6, worin X in Formel des Anspruchs 1 eine im Vergleich zu den bekannten Murein-Lipoprotein-Abbau-Lipopeptiden unnatürliche Aminosäuresequenz aufweist.
10. Verbindungen entsprechend denjenigen des Anspruchs 8, in denen jedoch die Konfiguration am C**-Atom S statt R ist, und die Gemische der R- und S-Diastereomeren.
11. Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1-6 der Formel
Figure imgb0014
worin R, und R2 die für Formel I angegebene Bedeutung haben, und X eine Peptidkette mit 6-10 Aminosäuren darstellt, wobei die mit * und ** bezeichneten Asymmetriezentren die R-Konfiguration haben, sowie die am C**-Atom die (S)-Konfiguration aufweisenden Verbindungen, sowie die R- und S-Diastereomeren-Gemische, ihre Salze und Komplexe.
12. Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1-6 der Formel
Figure imgb0015
worin R, und Rz die in einem der Ansprüche 1-6 gegebene Bedeutung haben, und X eine Aminosäure oder eine Peptidkette mit 2-5 Aminosäuren bedeutet, und Gemische der and den **C-Atomen stereoisomeren Verbindungen, und ihre Salze und Komplexe.
13. Die Amide und Ester der Verbindungen gemäss den Ansprüchen 7-12, worin sich ein Esterrest in der tereminalen veresterten Carboxylgruppe von Xvon einem niederen aliphatischen Alkohol mit 1-7 C-Atomen, einem Aethylenglykol oder dem Glyzerin ableitet, und eine terminale Amidgruppe in X die Amidgruppe CONH2 ist oder eine sich von einem niederen aliphatischen Amin 1-7 C-Atomen, dem Pyrrolidin, Piperidin oder Piperazin ableitende Amidgruppe ist.
14. Das Lipopeptid N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Lys-OH, gemäss Anspruch 1.
15. Das Lipopeptid N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ser-Ser-Phe-Ala-Glu-OH gemäss Anspruch 1.
16. Das N-Palmitoyl-S-[2(R),3-di-(dihydrosterkuloyloxypropyl]-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Glu-OH gemäss Anspruch 1.
17. Das Lipopeptid N-Lauroyl-S-[2(R),3-dipalmitoyl-oxypropyll-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Glu-OH gemäss Anspruch 1.
18. Das N-Myristoyl-S-[2(R),3-Dipalmitoyloxypropyll-Cys-Glu-Gin-Asn-Ala-Lys-OH gemäss Anspruch 1.
19. Das N-Palmitoyl-S-[2(R,S),3-dilauroyloxypropyl]-Cys-Phe-Phe-Asn-Ala-Lys-OH gemäss Anspruch 1.
20. Das N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dilauroyloxy]-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Glu-OH gemäss Anspruch 1.
21. Das N-Palmitoyl-S-[3(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 gemäss Anspruch 1.
22. Das N-Palmitoyl-S-[2(R),3-dioleoyloxypropyl]-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Glu-OH gemäss Anspruch 1.
23. Das N-Palmitoyl-S-[2(R,S),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Phe-Phe-Asn-Ala-Lys-OH gemäss Anspruch 1.
24. Das N-Stearoyl-S-[2(R),3-dipalmitoyloxypropyl]-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala-Glu-lle-Asp-Glu-OH gemäss Anspruch 1.
25. Die Verbindungen der Ansprüche 14-15 entsprechenden Lipopeptide, in denen anstelle der Palmitoylreste im Diacyloxypropylrest Lauroyl-, Stearoyl, Oleoyl-, Behenoyl- oder Dihydrosterkuloyl-Reste vorhanden sind.
26. Eine Verbindung der Ansprüche 14-18, 21 und 23-24 mit R-Konfiguration am 2-C-Atom des Propylrestes entsprechende epimere Verbindung mit S-Konfiguration oder ein Diastereomeren-gemisch von R- und S-Verbindung.
27. Ammoniumsalze, Alkali- oder Erdalkalisalze von sauren Verbindungen, und pharmazeutisch anwendbare, nichttoxische Säureadditionssalze von basischen Verbindungen, und Kupfer-, Zink-, Eisen-oder Kobalt-Komplexsalze von Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1-26.
28. Verbindungen der Formel
Figure imgb0016
worin R1, R2 je einen gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen oder gemischt aliphatischcycloaliphatischen, gegebenenfalls auch durch Sauerstofffunktionen substituierten Kohlenwasserstoffrest mit 11-21 C-Atomen und R3 Wasserstoff oder den Rest R1―CO―OCH2―, wo R, die gleiche Bedeutung hat, bedeuten, wobei die mit * bzw. ** bezeichneten Asymmetriezentren die absolute R bzw. S- oder R-Konfiguration besitzen, und Gemische der an den C**-Atomen stereoisomeren Verbindungen.
29. Eine Verbindung gemäss Anspruch 28, worin R3 Wasserstoff bedeutet und worin sich die Acylreste R, und R2 von der Palmitin-, Stearin-, Oel-, laurin-, Myristin-, Behen-, Dihydrosterkul-, Malval-Hydnocarpus- oder Chaulmoograsäure ableiten.
30. Pharmazeutische Präparate enthaltend eine Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1-28.
31. Eine Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1-28 zur Anwendung in einem Verfahren für die therapeutische Behandlung des tierischen oder menschlichen Körpers.
32. Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1-20 zur Anwendung als immunstimmulierende Mittel, insbesondere als Adjuvantien bei der Herstellung von Antiseren für Therapie und Diagnostik und bei der Induktion von immunologisch aktivierten Lymphocyten-populationen für Zelltransferverfahren, oder als Prophylaktikum oder Therapeutikum gegen Infektionskrankheiten bei Mensch und Tier.
33. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel
Figure imgb0017
worin R1 und R2 je einen gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen oder gemischt aliphatischcycloaliphatischen, gegebenenfalls auch durch Sauerstoffunktionen substituierten, Kohlenwasserstoffrest mit 11-21 C-Atomen, R3 Wasserstoff oder den Rest R1―CO―O―CH2―, wo R1die gleich Bedeutung hat, und X eine peptidisch gebundene natürliche aliphatische Aminosäure mit freier, veresterter oder amidierter Carboxylgruppe, oder eine Aminosäurensequenz von 2-10 natürlichen aliphatischen Aminosäuren, deren terminale Carboxylgruppe in freier, veresterter oder amidierter Form vorliegt, bedeuten, wobei die mit * bzw. ** bezeichneten Asymmetriezentren die absolute R- bzw. S- oder R-konfiguration besitzen, und gegebenenfalls von Gemischen der an den Cu-Atomen epimeren R- und S-Verbindungen, und ihren Salzen und Komplexen, dadurch gekennzeichnet, dass man
a) in einer Verbindung der Formel
Figure imgb0018
worin R1, R2 und R3 die für Formel (I) angegebene Bedeutung haben und Y eine X in der Formel (I) entsprechende Aminosäure oder Aminosäurensequenz darstellt, worin jedoch mindestens eine der die Aminosäuren substituierenden hydrophilen Gruppen und/oder die terminale Carboxylgruppe durch eine unter neutralen oder milden sauren Bedingungen abspaltbare Schutzgruppe geschützt ist, oder in einem Salz einer solchen Verbindung, die Schutzgruppe(n) abspaltet, oder
b) dass man eine Verbindung der Formel
Figure imgb0019
worin R1, R2 und R3 die für Formel (I) angegebene Bedeutung haben und W = OH oder eine Aminosäure oder eine unvollständige Sequenz von Aminosäuren gemäss X in Formel (I) darstellt, mit einer Verbindung der Formel
Figure imgb0020
wo Z1 eine der Gruppe X in Formel (I) entsprechende Gruppe bzw. eine zur genannten Aminosäure oder unvollständigen Sequenz von Aminosäuren gemäss X komplementären Aminosäuresequenz bzw. Aminosäure bedeutet, in welchen Sequenzen jedoch keine freien Aminogruppen vorhanden sind, oder einem Salz derselben, umsetzt, oder
c) eine Verbindung der Formel
Figure imgb0021
worin R2 die für Formel (I) angegebene Bedeutung besitzt und R3 Wasserstoff oder die Gruppe H―O―CH2― darstellt, und Z2 eine X in Formel (I) entsprechende Gruppe darstellt, worin jedoch keine freien Hydroxygruppen vorhanden sind, oder ein Salz dieser Verbindung, in an sich bekannter Weise acyliert, und, wenn erwünscht, in erhaltenen Verbindungen mit freier terminaler Carboxylgruppe, dieselbe in eine Amidgruppe oder Estergruppe überführt, und/oder die Verbindungen in ihre Salze oder Komplexe überführt.
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