JPH08511164A

JPH08511164A - ブレキナールおよび類縁体の検出のためのイムノアッセイ試剤および方法

Info

Publication number: JPH08511164A
Application number: JP7501825A
Authority: JP
Inventors: バツト，ダグラス・ガイ; ガルブレイス，ウイリアム; サイモン，ポール・ムーア
Original assignee: ザ・デュポン・メルク・ファーマシュウティカル・カンパニー
Priority date: 1993-06-08
Filing date: 1994-05-25
Publication date: 1996-11-26
Also published as: EP0702726A1; WO1994029478A1; US5707844A; AU7095494A; NZ268167A; CA2164510A1; US5393891A; ZA944024B

Abstract

(57)【要約】本発明は，キノリンカルボン酸たとえばブレキナールに特異的な抗体、イムノアッセイにおける標準としてまたは免疫原として高分子量担体への接合もしくはトレーサー化合物として検出可能な蛍光性残基への接合に有用な新規キノリンカルボン酸ハプテンを包含するイムノアッセイ試剤を目的とするものである、本発明はまた、臨床サンプル中のキノリンカルボン酸を検出するためのイムノアッセイ、および最後に上述の試剤を含有するキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ブレキナールおよび類縁体の検出のためのイムノアッセイ試剤および方法発明の分野本発明は、試験サンプル中の、ブレキナール（brequinar）を含めたキノリンカルボン酸の存在を測定するための抗体および他の試剤、イムノアッセイならびにそれらの試剤を含有するキットに関する。発明の背景ブレキナールは1987年7月14日に発行された米国特許第4,680,299号に記載されたキノリンカルボン酸である。本明細書および請求の範囲において用いられる「ブレキナール」の語は、ブレキナールナトリウム、すなわち化合物２−（2′− フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−６−フルオロ−３−メチル−４− キノリンカルボン酸ナトリウム塩または他の適当な塩もしくはその遊離酸を意味し、次式を有する。上記キノリンカルボン酸は、新規ピリミジンの生合成経路における第四の酵素であるジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（DHO-DH）の強力な阻害剤である。キノリンカルボン酸によるDHO-DHの阻害についての構造活性相関は、S-F．Chenら，Biochem.Pharmacol．40:709-714(1990)によって明らかにされた。このキノリンカルボン酸によるDHO-DHの阻害効果は、動物および患者における血漿ウリジン濃度の涸渇である〔G.J．Petersら，Cancer Res．50：464 4-4649(1990)〕。上記キノリンカルボン酸は腫瘍阻害剤として有用であることが明らかにされ（米国特許第4,680,299号）、また、抗炎症剤であることが示されている（米国特許第4,861,783号）。最近、ブレキナールは、インビボにおいて強力な免疫抑制剤であり、移植臓器の拒絶を防止すること（米国特許第4,968,701号）、また、1)マウス心臓同種移植片拒絶〔M．P．Murphy & R．E．Morris，Med．Sci．Res．19：835-836(1992) 〕、2)ラット心臓、肝臓および腎臓同種移植片拒絶〔D．V．Cramerら，Transpla nta-tion 53：303-308(1992)〕、ならびに3)ハムスターからラットへの心臓異種移植片拒絶〔D．V．Cramerら，Transplantation Proc．24：720-721(1992)〕の抑制能をもつことが明らかにされた。ブレキナールは現在、移植患者における移植片拒絶の防止について臨床試験が行われている。さらに、1987年7月14日に発行された米国特許第4,680,299号に同じく記載されたブレキナール類縁体、２− （1,1′−ビフェニル−４−イル）−５−クロロ−３−メチル−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩も免疫抑制剤として活性であることが確定している。化合物２−（2′−フルオロ−4′−ヒドロキシ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−６−フルオロ−３−メチル−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩は、ブレキナールで処置された患者から同定される一次代謝産物であった。このヒドロキシル代謝産物は免疫抑制剤としては薬理学的に不活性であることが確認された。移植された臓器の拒絶を防止するためには、ブレキナールまたは他の活性キノリンカルボン酸のあるレベルを血流中に維持しなければならないが、これらの化合物の分布および代謝は、個体間で、また治療中の単一個体内の測定値間で変動する。したがって、移植患者での正確な薬力学に対して投与量を維持し調整するために、生物学的液体中のキノリンカルボン酸のレベルを迅速かつ簡便な方法で監視することが重要である。患者からの臨床サンプル中のブレキナールおよび他の活性キノリンカルボン酸の測定はこの薬剤の最大効果の保証を可能にする重要な手段である。サンプルにおけるこのような測定は、上述の不活性ヒドロキシル代謝産物のようなキノリンカルボン酸の不活性代謝産物がその中に存在することによって複雑になる可能性が考えられる。したがって、ブレキナールまたは他のキノリンカルボン酸をその不活性な代謝産物とは独立に測定できることも望ましい。本発明は、上記キノリンカルボン酸で処置された患者からの生物学的液体中に存在するキノリンカルボン酸の測定に有用な抗体および他の試剤、イムノアッセイならびに診断用キットを指向するものである。イムノアッセイはそれらの迅速性、簡便性および感受性から治療薬剤の監視に頻繁に用いられている。とくに、免疫抑制剤、シクロスポリンＡは様々なイムノアッセイを用いて広く監視されている〔U．Kunzendorfら，Klin．Wochenschr．6 7：438-441(1989)およびB．Tjandra-Magaら，J．Clin．Chem．Clin．Biochem．2 8：53-57(1990)〕。EPO出願473,961号（Morrisonら）には、試験サンプル中のシクロスポリンを測定するためのイムノアッセイ試剤および方法が記載されている。現在、ブレキナールは高速液体クロマトグラフィーによって測定されているが、この方法は極めて高価につきしかも時間がかかる。したがってなお、患者体内のブレキナールを含めたキノリンカルボン酸のレベルを迅速かつ正確に測定するための特異的な高親和性試剤およびイムノアッセイの要求がある。本発明はこれらの、ならびに他の重要な要求に応えることを目的とするものである。発明の概要本発明の一実施態様は、ブレキナールを含む式IIの薬理学的に活性なキノリンカルボン酸（QCA）を包含するQCAに対するモノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマ細胞系を目的とする。式IIのQCAは、式（式中、Ｒは R³はＨ，１〜３個の炭素原子を有するアルコキシまたは１〜２個の炭素原子を有するアルキルであり、 R⁴はCO₂HまたはCO₂R¹¹であり， R⁵、R⁶、R⁷およびR⁸は独立に、Ｈ、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、CH₃、CF₃、SCH₃、または CH₂CH₃であって、R⁵、R⁶、R⁷およびR⁸の少なくとも２つはＨであり、 R⁹およびR^9Aは独立に、Ｈまたは１〜３個の炭素原子を有するアルキルであり、 R¹¹は(CH₂)_2-4NR⁹R^9Aであり、Ｗ、Ｙ、およびＺは独立に、Ｈ、Ｆ、Cl、Br、１〜５個の炭素原子を有するアルキル、NO₂、CF₃、またはOCH₃であり、ｍは０または１である）を有するかまたはそれらの医薬的に適当な塩である。本発明の他の実施態様は、上記ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体である。上記モノクローナル抗体はQCAの少なくとも１個の抗原決定基に特異的に結合することができる。本発明のさらに他の目的は、ブレキナールに高度に特異的なモノクローナル抗体に関する。すなわち、これらの抗体はブレキナールに特異的に結合し、その不活性なヒドロキシル代謝産物とは実質的に非反応性である。本明細書および請求の範囲において用いられる「実質的に非反応性」の語は上記抗体がサンプル中に存在する不活性ヒドロキシル代謝産物の１％未満の量としか結合しないことを意味する。本明細書および請求の範囲において用いられる「薬理学的に活性」の語は、免疫抑制剤、抗炎症剤または抗腫瘍剤として有用であるジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼの阻害剤として活性な化合物を意味し、式IIの化合物を包含する。とくに、ブレキナールの薬理学的に活性な類縁体としては、化合物：２−（1,1′− ビフェニル−４−イル）−５−クロロ−３−メチル−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩（以下、「類縁体」という）がある。本明細書および請求の範囲において用いられる「不活性代謝産物」の語は薬理学的に活性なQCAの免疫抑制活性をもたない代謝産物を意味し、たとえば確認されたブレキナールのヒドロキシル代謝産物、２−（2′−フルオロ−4′−ヒドロキシ−1,1′−ビフェニル−４− イル）−６−フルオロ−３−メチル−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩である。上述のように、これはヒトにおいて同定されたブレキナールの一次代謝産物であり、免疫抑制剤としては薬理学的に不活性である。本明細書および請求の範囲において用いられる「ハプテン」の語は他の分子への接合に有用な下記の式（Ｉ）のキノリンカルボン酸を意味する。さらに、他の実施態様はキノリンカルボン酸の少なくとも１個の抗原決定基に特異的に結合することができるポリクローナル抗体（抗血清、精製IgGまたはアフィニティー精製抗体として）を目的とする。このようなポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、腫瘍増殖もしくは乾癖の阻害またはあらゆるタイプの移植組織の拒絶の阻害を包含する目的で処置された患者の液体サンプル中における、キノリンカルボン酸たとえばブレキナールを測定するためのイムノアッセイ試剤として有用である。本発明のさらに他の実施態様はブレキナールを含むキノリンカルボン酸の液体中における存在を検出するためのイムノアッセイであり、たとえば、尿、全血、血清または血漿のような患者の液体を本発明のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と接触させ、ついでキノリンカルボン酸−抗体相互作用をスクリーニングすることからなるイムノアッセイである。このようなイムノアッセイは本技術分野において既知であり、たとえばEPO出願473,961号および283,801号（これらはその全体を参考として本明細書に導入する）に記載されているようなラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、蛍光イムノアッセイおよび蛍光偏光イムノアッセイ（FPIA）が包含される。他の実施態様は、本発明に従って所望のイムノアッセイを行うために必要な必須試剤すべてから構成される診断キットを包含する。診断キットは、必要な試剤を収納した１個または２個以上の容器の組み合わせとして市販用に包装された形態で提供されてもよい。このようなキットは、キノリンカルボン酸たとえばそれらに限定されるものではないがブレキナールを含む式（II）の化合物、または標準対照指標として用いられる式（Ｉ）のハプテンおよび本発明のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を、慣用の診断キット成分と組み合わせて構成されていてもよい。上記のキットにはまた、蛍光イムノアッセイにおいて「トレーサー化合物」として使用するための検出可能な蛍光性残基、酵素またはビオチンに接合されたハプテンを含有させてもよく、または上記キットには、「免疫原」と呼ばれる高分子量担体分子に接合されたハプテンを含有させてもよい。上記ハプテン接合分子すなわちトレーサー化合物および免疫原のいずれのタイプも本発明の実施態様であり、以下にさらに詳述する。慣用の診断キット成分は本技術分野の熟練者には自明であり、多くの刊行物、たとえば、Antibodies A Labor atory Manual（E．Hrlow，D．Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，19 89；この開示はその全体を参考として本明細書に導入する）に開示されている。慣用の診断キット成分には、以下の品目たとえば、マイクロタイタープレート、緩衝液たとえばＥＤＴＡ緩衝液、トリス緩衝液、第二緩衝液たとえばペルオキシダーゼ接合抗−マウスIgGまたは抗−ウサギIgG、ならびに他の標準試剤および成分（第一抗体が誘導された動物に対する抗−IgG）が包含される。ブレキナールのようなキノリンカルボン酸の蛍光偏光イムノアッセイ測定のための診断キットがとくに好ましく、これは本発明の適当な蛍光トレーサー化合物、本発明の適当な抗体試剤、沈殿試剤（たとえば、酢酸アンモニウムおよびイソプロパノール）および他の慣用材料から構成される。さらに、本発明は、式（Ｉ）のハプテンまたはその適当な塩から構成される薬理的に活性なQCAのハプテンとして有用な新規なキノリンカルボン酸化合物を提供する。上記式中、ＲはＸはＯ、Ｓ、NR⁷またはCH＝Nであり、 R¹は５〜１２個の炭素原子を有するアルキル、５〜12個の炭素原子を有するアルケニル、３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル、５〜12個の炭素原子を有するシクロアルキルアルキル、０〜３個のＹで置換されたフェニル、または０〜３個のＹで置換されたベンジルであり、 R²は０〜３個のＹで置換されたフェニル、または０〜３個のＹで置換されたベンジルであり、 R³はＨ、１〜３個の炭素原子を有するアルコキシ、１〜３個の炭素原子を有するアルキルチオ、または１〜２個の炭素原子を有するアルキルであり、 R⁴はCOOHであり、 R⁵はＨ、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、CH₃、CF₃、S(O)_nR⁸またはエチルであり、 R⁶は(CR⁹R¹⁰)_pCH₂NH₂であり、 R⁷、R⁸、R⁹およびR¹⁰は独立してＨまたは１〜３個の炭素原子を有するアルキルであり、Ｙは各場合独立に、Ｈ、Ｆ、Cl、Br、１〜５個の炭素原子を有するアルキル、 NO₂、１〜５個の炭素原子を有するアルコキシ、１〜５個の炭素原子を有するアルキルチオ、OH、CF₃およびNH₂からなる群より選択され、ｍおよびｎは独立に０、１、または２であり、ｐは０〜12である。好ましいハプテンは、式Ｉにおいて、Ｒはパラ−フェニレンであり、 R¹は３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル；ヒドロキシルで置換されていてもよいフェニル；１個のハロゲン、１〜５個の炭素原子を有するアルキルもしくはCF₃で置換され、さらに１個のヒドロキシルで置換されていてもよいフェニル；フェノキシ；または１個のハロゲンもしくは１〜５個の炭素原子を有するアルキルで置換されたフェノキシであり、 R³はＨ、１〜２個の炭素原子を有するアルキルまたはメチルチオであり、 R⁵はＨ、ハロゲン、CH₃またはCF₃であり，ｐは１〜12である、ハプテンまたはそれらの適当な塩である。さらに好ましくはハプテンは式Ｉにおいて、 R¹はシクロヘキシル、フェニル、ヒドロキシフェニル、フルオロフェニル、フルオロヒドロキシフェニル、またはメチルフェニルであり、 R⁵は水素であり、また R⁶は(CH₂)_pNH₂であって、キノリン環の６位に存在し、ｐは２〜８である。ハプテンまたはそれらの適当な塩である。とくに好ましいハプテンは式Ｉの以下のハプテン、すなわち、２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸、２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩、２−（2′−フルオロ−4′−ヒドロキシ−1,1′−ビフェニル−４−イル）− ３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸、および２−（2′−フルオロ−4′−ヒドロキシ−1,1′−ビフェニル−４−イル）− ３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩である。式（Ｉ）のハプテンの用途は多い。たとえば、高分子量担体分子と接合して抗体を産生させるための抗原性を提供し；検出可能な標識残基、酵素もしくはビオチンと接合してイムノアッセイにおけるトレーサー化合物として使用され；またはイムノアッセイにおいて試験サンプルからのキノリンカルボン酸の測定値と比較するのための標準対照として使用することができる。本明細書および請求の範囲において用いられる「接合」の語またはこれを含む語は、２個の分子を共有結合で連結する機構または挙動を意味する。さらに他の実施態様では前述のトレーサー化合物が意図される。本明細書および請求の範囲において用いられる「トレーサー化合物」の語は、キノリンカルボン酸、たとえば、ブレキナールを含めた式（II）の化合物、または検出可能な蛍光性残基、酵素もしくはビオチンに接合される式（Ｉ）のハプテンを意味する。検出可能な残基成分は、本技術分野において知られている様々な検出可能な標識、たとえば化学発光分子、発光分子たとえばフルオレセインおよびフルオレセイン類縁体、酵素等から選択される。本発明においては、フルオレセインおよびフルオレセイン類縁体としては、たとえばアミノメチルフルオレセイン類、カルボキシフルオレセイン類およびフルオレセインアミン類が好ましく、これらの蛍光トレーサー化合物は蛍光偏光イムノアッセイの実施にとくに有用である。本発明の一実施態様はまた、適当な高分子量担体分子に接合した式（Ｉ）の上記の新規な任意のハプテンからなる免疫原を作成することにより、ブレキナールを含めたQCAの免疫原性特性を創成することを意図する。これらの免疫原は免疫反応を起こさせ、したがって動物に抗体を産生させることが可能である。本明細書および請求の範囲において用いられる「免疫原」の語は、適当な高分子量担体分子に共有結合で連結した式（Ｉ）のハプテン１個または２個以上からなる構造を意味する。これらの高分子量担体分子としては、蛋白質、多糖類および各種ラテックス粒子が挙げられる。上記蛋白質としては、ウシ血清アルブミン、オバルブミン、およびキーホールリンペットヘモシアニンがある。とくに好ましい免疫原にはウシ血清アルブミン（BSA）の一級アミノ基に接合した２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル） −４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩；キーホールリンペットヘモシアニン（ KLH）の一級アミノ基に接合した２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４ −イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸のナトリウム塩；オバルブミン（OA）の一級アミノ基に接合した２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩；およびBSAの一級アミノ基に接合した２−（2′−フルオロ−4′−ヒドロキシ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩が包含される。発明の詳細な説明接合体は、本技術分野の熟練者には自明な各種様式で得ることが可能であり、これらの方法の多くは下記の実施例に記載するが、またChemistry of Protein C onjugation and Cross-Linking，S.Wong，CRC Press，Inc．にも記載されている（この記載はその全体を参考として本明細書に導入する）。基本的にはそれは、式（Ｉ）のハプテンの、カップリング基（たとえば、式ＩのハプテンのＲ⁶のNH₂ 基）を介して検出可能な蛍光性残基（トレーサー化合物の場合）または適当な高分子量担体分子（免疫原の場合）のいずれかへの、アミド結合または他の適当な結合たとえばシッフの塩基を形成するのに通常用いられる条件下での共有結合による連結を包含する。本発明のハイブリドーマおよびモノクローナル抗体は、任意の慣用方法または以下の実施例に記載する方法によって得ることができる。一般に、動物（広範囲の脊椎動物種が使用可能であり、最も一般的にはマウス、ラット、モルモット、ハムスターおよびウサギが用いられる）を、アジュバントたとえば完全または不完全フロインドアジュバント、水酸化アルミニウムまたは免疫原の有効性の増強に補助的に作用する任意の試剤中に乳化した免疫原で免疫処置し、規則的な間隔をおいてブースター投与が行われる。動物血清は任意の慣用方法により、多くの場合、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，６巻，第２部，Elsevier，1987（この記載はその全体を参考として本明細書に導入する）に記載のELISAまたはRIAを用いて、所望の抗体の存在についてアッセイされる。許容される抗体力価、たとえば１：500またはそれ以上が検出されたならば、動物を安楽死させ、脾臓を融合のために無菌的に摘出する。脾臓細胞は、とくに選択された不死化骨髄腫細胞系たとえばSp2/0-Ag14またはNS1細胞系と混合し、ついで混合物を、細胞の融合を促進する試剤、通常ポリエチレングリコール等に暴露する。これらの環境下で融合はランダムセレクションによって起こり、得られた生成物は融合細胞と各型の非融合細胞との混合物である。融合に用いられる骨髄腫細胞系は、選択培地たとえばHAT：ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを用いることにより、融合混合物から培養液中に維持される細胞が免疫処置ドナーから誘導された細胞と骨髄細胞の間のハイブリッド細胞だけであるように特異的に選択される。融合後、細胞は選択培地中に希釈し、培養される。培地にはハイブリドーマの形成および増殖を促進するため、成長因子たとえばIL-6またはインスリンを補充してもよい。十分な細胞増殖が起こったならば、消費された培養上清を、選択された免疫原に対して予定した特異性を有する抗体の存在について、任意の慣用方法、たとえばELISAまたはRIAによって試験する。好ましい抗体を含有するこれらの培養体を、培養細胞が起源の単一な細胞（モノクローナル）であること、すなわち存在するすべての細胞が同一の抗体遺伝子産物を合成することが確実に提示されるまで限界稀釈を行い、クローニングする。これらの細胞からのモノクローナル抗体プレパレーションは、単一の免疫原性決定基と反応性を示す。さらに、ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の調製についてはたとえば Antibodies A Laboratory Manual（E．Harlow，D．Lane，Cold Spring Harbor L aboratory Press，1989）に記載されている。この開示はその全体を参考として本明細書に導入する。対象の免疫原に対するポリクローナル抗体もまた本発明により提供される。このようなポリクローナル抗体は標準的技術、たとえば上述のように乳化した免疫原で動物を免疫処置し、その動物から血清を採取し、ついで得られたポリクローナル抗体を血清から収穫することによって製造することができる。所望により、ポリクローナル抗体は、IgG分画として使用することもできるし、またさらに様々な程度に精製することもできる。ポリクローナル抗体の調製、収穫および精製操作は本技術分野でよく知られていて、たとえばMethods in Enzymology；ALabo ratory Text for Instruction and Research（Garveyら，第３版，第22章，24-3 0頁；W．A．Benjamin Inc.，1977）に記載されている。この開示はその全体を参考として本明細書に導入する。本技術分野の熟練者には明らかであるように、診断用イッムノアッセイにおける本発明のモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体の量は様々に変動する。一般的な指針としては、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体は、液体サンプル中に存在するブレキナールを含めたキノリンカルボン酸との有意な結合を可能にするのに十分な量で存在しなければならない。本技術分野の熟練者には明らかなように、液体１mlあたり抗体約0.1〜約５μgが一般的に適当であるが、それ以上またはそれ以下の量の抗体も使用できる。本発明はまた、本発明による所望のイムノアッセイを実施するために必要なすべての必須試剤を含有する診断キットを意図するものである。そのキット成分を用いることにより、患者の体液サンプル、たとえば、全血またはその部分もしくは分画、または尿を、本発明の抗体を用いるイムノアッセイで試験し、QCAたとえばブレキナールを含めた式（II）のQCAまたは式（Ｉ）のハプテンを標準として用いた類似の試験結果と比較することができる。本発明をさらに以下の実施例により説明する。これらの実施例は添付の請求の範囲を限定するものと解釈すべきではない。ハプテンの合成本発明のハプテンは本技術分野の熟練者に既知の方法を用いて調製することができる。とくに有用な方法はたとえば、Hessonの米国特許第4,680,299号（この記載はその全体を参考として本明細書に導入する）に記載されたPfitzinger縮合である。すなわち、適当に置換されたイサチン類縁体２および適当に置換されたケトン３を、適当な反応溶媒たとえばエタノール中、適当な温度、通常は溶媒の沸点で、塩基たとえば水酸化カリウムの存在下に反応させる。イサチン類縁体の一級アミノ基は、適当な保護基、たとえばトリフルオロ酢酸アミドを用いて保護することができる。反応混合物を酸性にすると所望の化合物１のカルボン酸型が得られる。場合により、反応体上の置換基は適当な保護基を用いて保護することができる。たとえばフェノール性ヒドロキシル基の保護にはtert−ブチルエーテル。このような場合には、保護基は縮合を行ったのちに標準方法を用いて除去される。カルボン酸は標準方法を用いて適当な塩に変換することができる。R⁶中の一級アミン基もまた標準方法を用いて適当な酸付加塩たとえば塩酸塩に変換することができる。任意の構成要素または式（Ｉ）もしくは本明細書中の他の式における可変部分（たとえば、R¹〜R¹⁰、ｍ、ｎ、Ｐ、Ｘ、Ｙ、等）が２個以上ある場合、それぞれの場合における定義は、他のすべての場合における定義とは無関係である。また置換基および／または可変部分の組合せは、このような組合せで安定な化合物を生じる場合にのみ許容される。本明細書および請求の範囲において用いられる「アルキル」の語は、特定数の炭素原子を有する分岐状および直鎖状両者の飽和脂肪炭化水素基を包含することを意図し、「アルコキシ」は指示数の炭素原子を有し酸素橋を介して結合したアルキル基を表し、「シクロアルキル」は飽和環状基たとえばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルを包含することを意図し、「ビシクロアルキル」は飽和二環式環状基、たとえば、〔3.3.0〕ビシクロオクタン、〔4.3.0〕ビシクロノナン、〔4.4.0〕ビシクロデカン（デカリン）、〔2.2.2〕ビシクロオクタン等を包含することを意図する。本明細書および請求の範囲において用いられる「ハロゲン」の語は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指し、「対イオン」は小さな負に荷電された種、たとえばクロリド、ブロミド、ヒドロキシド、アセテート、サルフェート等を表すために用いられる。本明細書および請求の範囲において用いられる「置換された」の語は、指定された原子上の１個または２個以上の水素が指定された群から選択された種により置き換えられることを意味し、この場合、指定された原子の正常な原子価を超えることなく、置換が安定化合物を生じることが条件である。「安定な化合物」または「安定な構造」とは、本明細書では、反応混合物から有用な程度の純度への単離、および抗原性免疫原の発生のために有効なハプテンまたはトレーサー化合物としての処方に耐えられる十分な強度を有する化合物を意味する。本明細書および請求の範囲において用いられる「適当な塩」の語は、酸または塩基塩の作成により、または改変部が定常的な操作もしくはインビボにおいて母体化合物に切断されるように化合物中に存在する官能基を改変することにより、修飾される開示化合物の誘導体を意味する。例としては、塩基性残基たとえばアミンの鉱酸もしくは有機酸の塩、酸性残基たとえばカルボン酸のアルカリもしくは有機塩等がある。本発明の化合物の適当な塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、化学量論量の適当な塩基または酸と、水中もしくは有機溶媒中、またはその二者の混合物中で反応させることにより調製できる。一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適当な塩の一覧表はRemington's Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1985，1418頁に見られる。この開示は参考として本明細書に導入する。代表的なハプテンの製造を実施例１〜４に示す。実施例実施例１２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２ −アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸５−（２−トリフルオロアセチルアミノエチル）−イサチン（572mg、2.0mmol ）ならびに４−（２−フルオロフェニル）プロピオフェノン（457mg、2.0mmol）をエタノール（６ml）中に懸濁し、水（３ml）中KOH（1.01ｇ、18.0mmol）で処理した。混合物を還流下に48時間加熱した。ついで混合物を冷却し、水を追加して希釈し、真空中で濃縮してエタノールを除去し、ろ過した。固体を水で洗浄し、水性のろ液を合わせて、希ＨCl水溶液でpHを８に調整した。得られた固体をろ過により収集し、水で完全に濯いで、乾燥すると標記ハプテンがクリーム色の固体（500mg、62％）として得られた。融点＞250℃；NMR(CF₃COOD)δ8.61(d，1H) ，8.44(s，1H)，8.33(d，1H)，8.12(d，2H)，7.95（d，2H)，7.69(t，1H)，7.57 (m，1H)，7.43(t，1H)， 7.35(m，1H)，3.92(bs，2H)，3.71(bt，2H)，2.95(s，3H)；質量スペクトル（NH₃ -CI）m/z 401（100％）実施例２２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２ −アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩メタノール（10ml）中実施例１の生成物（100mg）の懸濁液を、1.0ＮのNaOH水溶液（0.25ml）で処理し、ほぼ均一な溶液となるまで室温で撹拌した。その溶液をろ過し、真空中で濃縮した。残留した水をトルエンの添加および真空中での濃縮によって除去した。標記ハプテンは灰色を帯びた白色粉末（106mg、100％）として得られた。融点＞250℃ 実施例３２−（2′−フルオロ−4′−ヒドロキシ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３ −メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸実施例１の記載と同じ操作を用いて、４−（２−フルオロ−４−tert−ブチルオキシフェニル）プロピオフェノン（901mg、3.0mmol）を２−（2′−フルオロ −4′−tert−ブチルオキシ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６ −（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸に変換した（998mg、70％）。この物質を精製することなく、トリフルオロ酢酸（50ml）中、室温で５時間撹拌した。この溶液を水（300ml）中に注ぎ、NaOH水溶液でpHを7.5に調整した。懸濁液をろ過し、収集された固体を水で洗浄し、乾燥すると、淡黄色の固体（873m g）が得られた。溶出液として７：３メタノール−水を用いC₁₈−コート逆相シリカゲル上クロマトグラフィーに付すと標記ハプテンが淡黄色を帯びた固体（464mg、53％）として得られた。融点＞250 ℃；NMR(CF₃COOD)δ11.6(bs)，8.53(d，1H)，8.36(s，1H)，8.28(d，1H)，8.05( d，2H)，7.90(d，2H)，7.63(t，1H)，7.1〜7.0(2H)，3.89(bt，2H)，3.67(bt，2 H)，2.94(s，3H)；質量スペクトル(NH₃-CI)m/z417(100％) 実施例４２−（2′−フルオロ−4′−ヒドロキシ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３ −メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩実施例２の操作を用いて、実施例３の生成物（405mg）を、標記のハプテン（4 25mg、100％）に変換した。融点＞250℃ 実施例１〜４の方法または類似の方法を用いて調製できる他のハプテンを表Ｉに示す。表中「Ph」はフェニルを示す。実施例 43トレーサーの調製本発明のトレーサー化合物は、蛍光性残基好ましくはフルオレセインの類縁体をキノリンカルボン酸たとえばブレキナールまたは式（Ｉ）のハプテンにカップリングさせることにより調製する。蛍光性残基は、適当な溶媒中、標準的なペプチドカップリング技術を用い、アミド結合を介して、アミノ基たとえば式（Ｉ）中のR⁶に連結させることがでる。標準的なペプチドカップリング技術は本技術分野の熟練者には既知であり、しばしばN,N'−ジ置換カルボジイミド、およびたとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはｐ−ニトロフェノールのような添加剤が使用される。これらの添加剤は、アミノ残基と反応可能な安定ではあるが活性化されたエステルを形成する。さらに、以下の実施例に記載されたペプチドカップリング技術は、記述のように、高分子量担体分子よりもむしろ式（Ｉ）のハプテンに蛍光残基をカップリングさせるために使用できる。実施例 44免疫原の調製Ａ．リンカーとしてグルタルアルデヒドの使用ブレキナールに特異的な抗体を産生させるために、ブレキナールのアミノエチルハプテン、２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩を用いて免疫原を調製した。このハプテンをE．Harlow & D．Lane，Antobodies a labora tory manual，Cold Spring Harbor，1989，78〜81頁の記載と同様に、リンカーとしてグルタルアルデヒドを用い、オバルブミン（以下OA）、ウシ血清アルブミン（以下BSA）、およびキーホールリンペットヘモシアニン（以下KLH）と接合させた。略述すれば、リン酸塩緩衝食塩溶液（PBS）中10mg／mlのOA、BSAまたはKL H蛋白質とPBS中５mg／mlの２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩の等容量を混合した。蛋白質と２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル− ４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩を合した容量と等容量のPBS中、0.2％グルタルアルデヒドを混合しながら徐々に添加した。たとえば、0.2mlの蛋白質と0.2mlの２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル） −４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩を0.4mlの0.2％グルタルアルデヒドと混合した。混合物を室温において少なくとも１時間インキュベートし、反応混合物に一級アミン基を過剰に供給するクエンチ剤の添加によって反応を停止させた。一級アミンの簡便な供給源としてはグリシンを用いた。総反応混合物の1/4に等しい容量の１Ｍグリシンを添加し、室温で少なくとも１時間インキュベートした．上述の実施例では、0.8mlの反応液のクエンチに0.2ml の１Ｍグリシンを使用した。免疫原、蛋白質に接合した２−（2′−フルオロ−1 ,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４− キノリンカルボン酸ナトリウム塩を、分子サイジング（脱塩）カラムを用いて少量の反応体から分離した。透析を用いても同様の結果が達成されたであろう。脱塩カラムでは、免疫原はカラムからの最初の分画であり、280および260nmに有意な吸光度を示した。蛋白質含有分画を、免疫処置用としてまたはイムノアッセイ試剤としての将来の使用のためにプールした。Ｂ．リンカーとしての、ビス〔２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）−エチル〕スルホン（スルホ−BSOCOES）の使用２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩を、D．A．Zarling ら，J．Immunol．124(2)，913-920，1980（参考として本明細書に導入する）に記載のように、連結剤としてスルホ−BSOCOESを用い、OA、BSAおよびKLH蛋白質に接合させた。容量0.4mlのPBS中反応液あたり蛋白質２mgを用いた。ジメチルスルホキシド（DMSO）中２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）− ３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩（５mg／ml、0.01ml）を蛋白質溶液に添加し、ついでDMSO中100mMのスルホ−BSO COES 0.01mlを添加した。反応混合物を氷上で時々振盪しながら30分間インキュベートし、ついでPBS中１Ｍグリシン0.1mlでクエンチした。免疫原はグルタルアルデヒド接合の場合と同様に脱塩カラムを用いて単離した。Ｃ．リンカーとしての炭酸ジスクシンイミジルの使用無水コハク酸24.3mgをジメチルホルムアミド（DMF）1.635ml中に溶解して保存溶液を調製した。２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３− メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩（10 mg）を、16μlの無水コハク酸保存溶液および９μlの乾燥トリエチルアミンとともにガラス製バイアル中に加えた。これを暗所、室温で一夜撹拌した。炭酸ジスクシンイミジル（DSC）の保存溶液は乾燥DMF1.59ml中にDSC62.4mlを溶解して調製した。DSC保存溶液174μlおよび乾燥トリエチルアミン９μlを、２−（2′− フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩−スクシンアミド酸溶液に活性化のために添加した。これを暗所、室温で１時間撹拌した。活性化２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩−スクシンアミド酸溶液の半分をBS AまたはKLH溶液（蛋白質26mgを0.15Ｍ炭酸水素ナトリウム、pH8.1、43.3ml中に溶解）のいずれかに急速に添加し、暗所４℃で、一夜穏やかに攪拌した。カップリングしたのちChemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking，S．Won g，CRC Press，1991（参考として本明細書に導入する）の記載のように、免疫原をPBSに対してこれを３回交換して透析し、遊離のハプテンならびに過剰のカップリング剤を除去した．ハプテンはまた、この方法を用いてOAにも接合させた。ブレキナールの不活性代謝産物のアミノエチルハプテン、２−（2′−フルオロ−4′−ヒドロキシ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２ −アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩を用いた免疫原も、不活性ブレキナール代謝産物に対して特異的な抗体を産生させるために、上記方法に従って調製した。実施例 45ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の調製マウス（６週齢Balb/Cマウス）を、完全フロインドアジュバント（CFA）中免疫原を動物あたり10、50または100μgの１回腹腔内または皮下接種によって免疫処置した（上述の場合と同様）。３週後、各マウスに不完全フロインドアジュバント（IFA）中同用量の免疫原をブースターした。10日後マウスの後眼窩神経叢から採血し、血清を酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を用い所望の抗体の存在について試験した。最も高い抗体力価を示したマウスには、Antibodies，A Labo ratory Manual，E．Harrow，D．Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1989（参考として本明細書に導入する）の記載のように、融合の４および３日前にPBS およびIFA中100μgの免疫原を腹腔内に投与した。ブースターしたマウスを屠殺し、脾臓を摘出し、体細胞融合を次のように実施した。すなわち、脾細胞（１〜４×10⁸細胞）をNS1骨髄腫細胞（ATCC TIB 18、P 3/NS1/1-Ag4-1）とそれぞれ５〜１の比率で、撹拌しながら１分間を要して徐々に添加した50％ポリエチレングリコール（1500）１mlの存在下に融合させた。融合後直ちに、細胞をヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン（HAT）ならびに15％ウシ胎児血清（FBS）、２mMグルタミン、および10単位／ml のIL-6を含有するIscove改良DMEM総容量50ml中に37℃で再懸濁した。希釈した細胞を５個の96−ウエル組織培養プレート中に取り37℃でインキュベートした。融合後、日１、２、および３に、細胞に培地を供給した。２週間後に、ハイブリドーマを検出し、上清をスクリーニングのため収集した。モノクローナル抗体上清のスクリーニングは、OAに接合して96−ウエルマイクロタイタープレートに吸着したハプテンへの結合能に基づいて行った。プレートを、PBS中に５μg／mlに希釈したハプテン−OAでコーティングし、４℃で一夜インキュベートした。ウエルをPBS-Tween20で３回洗浄し、200μlの１％魚ゼラチン（BSA、インスタントミルク等も使用可能）でブロックし、室温で最低限の45 分間インキュベートした。再度ウエルを６回洗浄し、ハイブリドーマ上清100μl を各ウエルに添加し、室温で２時間インキュベートした。ウエルをさらに６回洗浄し、PBSで１：3000に希釈したアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗−マウスIgG 100μlと室温で１時間インキュベートした。さらにウエルを６回洗浄し、基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム錠１錠、10％ジエチルアミン５ml あたり５mg）100μlを各ウェルに添加した。発色後、吸光度をマイクロプレートリーダーにより405nmで測定した。ELISAにより実質的な活性（対照培地の３倍以上）を示す抗体を増産し、一部を凍結した。融合１からの５つのクローンおよび融合２からの40のクローンが陽性の結果を示した。これらのうちの８個を限界希釈法によってクローンニングした。単一のモノクローナル抗体産生細胞の単離を保証するため、ハイブリドーマを ELISAによる反応性の差に基づいて、限界稀釈によるサブクローニングのために選択した。ウエルあたり細胞20、10、５、１および0. 5個の希釈範囲のセットを各クローンについて調製した。支持細胞としてのマウス腹腔マクロファージ100μlを一夜予め接種したマイクロタイタープレート上に希釈液100μlを配置した。サブ−クローンは５日後に現れ始め、上述のELISA法によりスクリーニングした。５つの抗体産生単一細胞系が単離されるまで再クローニングを反復した。クローンを多重組織培養フラスコ中で培養し、抗体は、プロテインＡ／Ｇアガロースカラムを通過させ、0.2Ｍグリシン塩酸塩、pH2.5溶出緩衝液で溶出して精製した。収集した抗体を20倍容量のPBSに対して透析し、３〜４倍に濃縮した。上記方法により発生させた抗体は、Sang Statイソタイピングキットを用いてサブクラス分類を行い、IgG１であることを確定した。総マウスIgG濃度はマウス IgG ELISAにより測定し、各クローンの特異性は直接ELISAにより測定した。これらの抗体は接合に用いられた各蛋白質（すなわちBSA単独）に対してもスクリーニングして、交差反応性をもたないことを確認した。実施例 46ポリクローナル抗体の調製ウサギは日０に、完全フロインドアジュバント２ml中免疫原100μgを背部周辺に多重皮内注射することにより免疫処置した。日14に、ウサギに不完全フロインドアジュバント２ml中免疫原50μgをブースター投与した。試験採血は日21に行った。製造用採血は毎週、不完全フロインドアジュバント中50〜200μgの免疫原によるブースターは毎月行った。一つの順序で、ウサギはOAまたはKLHのいずれかに接合した２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル） −４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩で免疫処置され、したがってBSA−連結２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２ −アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩を、担体蛋白質と交差反応する抗体が分析を妨害しないようにそのような抗体の検出に使用した。２− （2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩−BSAを96−ウエルEIAプレート上に10、５、２、および１μg／ml（0.1ml／ウエル）濃度でコーティングさせた。他の場合には室温における１〜２時間のコーティングで十分であったが、この場合のコーティングは密閉プラスチックバッグ中冷蔵庫内で一夜進行させた。EIAプレートを洗浄し（PBS 0.2ml／ウエルで２回）、PBS中５％ドライミルク（0.2ml／ウエル）で90分間ブロックし、洗浄した（PBS中0.05％Tween20、0.2ml ／ウエルで２回、ついでPBS 0.2ml／ウエルで２回）。コーティングし、洗浄し、ブロックし、そして洗浄したEIAプレートに希釈した抗血清のアリコート0.1ml ／ウエルを添加した。ウサギからの前採血血清はPBS中に１：50に希釈して評価した。試験採血抗血清は２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル） −３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩−BSAの４種類の量それぞれに対して１：50、１：500、および１：5000で評価した。これにより、以降の実験に際しての高力価抗体を有するウサギの選択および妥当なシグナルを与える２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩−BSA のレベルの選択が可能になった。EIAプレート上の一部のウエルは、担体蛋白質に対する抗体を検出し、またウサギがBSAと交差反応する天然の抗体をもっていないことを確認するため、OA、BSAまたはKLHでコーティングした。抗血清はEIA プレート上で１〜２時間インキュベートし、ついで1)洗浄（PBS中0.05％Tween 2 0、0.2ml／ウエルで２回ついでPBS 0.2ml/ウエルによる）および2)酵素連結二次抗体0.1ml／ウエルの添加を行った。この場合、ヤギ抗−ウサギIgG−アルカリホスファターゼ（１：5000希釈）を用いたが、数種の市販の酵素連結二次抗体も使用可能であり、適当である。二次抗体と室温で１〜２時間または場合により密閉プラスチックバッグ中冷蔵庫内で一夜インキュベートしたのち、EIAプレートを洗浄し（PBS中0.05％Tween 20、0.2ml／ウエルで２回、ついでPBS 0.2ml／ウエル、最後にアルカリホスファターゼ緩衝液：0.5mM MgCl₂含有0.1mMジエタノールアミンpH9.5による）、ついで0.1ml／ウエルの基質、この場合にはHarlow & Lan e 597頁に示唆されている0.5mM MgCl₂含有0.1mMジエタノールアミンpH9.5中１mg ／mlのｐ−ニトロフェニルホスフェートとインキュベートした。得られた発色を、マイクロプレートリーダーを用い、405nmで測定した。実施例 47競合アッセイによる抗体の評価 BSA−またはKLH−２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３ −メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩免疫原にによる免疫処置で誘導されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を、OA−またはBSA−２−（2′ −フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩に対する競合アッセイにより試験した。EIAプレートを５または２μg／mlのOA−またはBSA−２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル） −４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩0.1ml／ウエルでコーティングした（抗体力価が上昇したのでプレートのコーティングに必要な免疫原の量は低下した）。抗血清の希釈度は、発色反応（Ａ405）が添加された抗血清の量に比例する希釈範囲を決定する試験に基づいて選択された。通常、ポリクローナル抗血清はPB S中１：2000〜１：4000に希釈され、一方、モノクローナル抗体はPBS中0.1〜0.2 μg／mlで用いられた。各種マトリックスにおける有用性を証明するため、ブレキナールをPBSまたはラット血漿中に溶解させた。ブレキナール溶液および抗体溶液を96−ウエル「低結合」プレート中で混合し（各0.1ml／ウエル）、室温で１〜２時間インキュベートしたのち、コーティングし、ブロックし、洗浄したEI Aプレート（上述）に移した。混合物を、予め免疫原でブロックしたEIAプレート上、室温で２時間インキュベートし、洗浄し（上述のように）、ついで酵素連結二次抗体とともに１時間インキュベートして、マウス（モノクローナル抗体の場合）またはウサギ（ポリクローナル抗体の場合）免疫グロブリン（上述）を検出した。この場合、ヤギ抗−マウスまたはヤギ抗−ウサギIgGアルカリホスファターゼを使用したが、他の適当な任意の二次抗体も使用できる。非結合二次抗体を除去するために洗浄したのち、アルカリホスファターゼの基質（上述）を添加した。生じた発色反応を分光測光EIAプレートリーダーを用いて測定した。この競合ELISA イムノアッセイを用ると、得られたポリクローナル抗体では血漿中0.01μg／ml までの低濃度のブレキナールを検出することが可能であり、上述のハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体の場合は血漿中１ng／mlまでの低濃度のブレキナール濃度を検出することが可能であった。したがって、本発明の抗体は臨床サンプル中のブレキナールの検出に有用である。実施例 48ブレキナールに対する抗体の特異性ブレキナールを、患者の体内で自然に形成される不活性なヒドロキシル代謝産物から特異的に識別できる抗血清および抗体の開発が更なる目的であった。特異的抗血清がブレキナールをその不活性ヒドロキシル代謝産物から識別する能力、およびこれらの同じ抗血清が薬理学的に活性な類縁体を、ブレキナールの場合よりも高濃度においてであっても、検出する手段として使用できる可能性を証明するために、以下の実験を用いた。ブレキナール、その不活性ヒドロキシル代謝産物（上に定義した「不活性代謝産物」）および薬理学的に活性な類縁体（上に定義した「活性な類縁体」）をそれぞれラット血漿中に希釈した。EIAプレートを、２μg／mlの、ポリクローナル抗体の場合には、２−（2′−フルオロ−1,1′ −ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩−BSA免疫原、またモノクローナル抗体の場合には、２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩−OA免疫原0.1ml／ウエルによってコーティングした。希釈したブレキナール、類縁体または代謝産物を含有するラット血漿を、抗血清またはモノクローナル抗体とともに、ポリプロピレン96−ウエルプレート中室温で１〜２時間インキュベートしたのちEIAプレートに移し、さらに１〜２時間インキュベートした。適当な二次抗体（PBS中１：2000に希釈したヤギ抗− ウサギIgGまたはヤギ抗−マウスIgG−アルカリホスファターゼ、0.1ml／ウエル）をそのプレート上で１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼの基質を添加して20〜40分後に、Ａ405nmの読み取りを行なった。下記の表（IIはポリクローナル抗体、IIIはモノクローナル抗体の場合）は特異性および交差反応性の情報を提供する。これらの抗体（ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体の両者）は明らかにブレキナールとその不活性ヒドロキシル−代謝産物の識別が可能である。試験された各抗血清について、不活性代謝産物に対する交差反応は１％未満であった。すなわち、1.0μg／mlの濃度において、不活性代謝産物は、ブレキナール 0.01μg／ml未満に相当するシグナルを与えた。さらに、一部の抗血清は薬理学的に活性な類縁体を検出する妥当な能力（交差反応性８〜10％）を有し、その検出および他の活性キノリンカンルボン酸の検出に有用と考えられる。本発明の有用性を証明するためにここに示した例では、ELISAフォーマット− 抗体捕捉／抗原競合を用いて行われた。しかしながら、これは本発明の有用性をこのフォーマットに限定するものではない。本技術分野の通常の熟練者にはこれらのモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が、上述のフォーマットたとえば（これらに限定するものではないが）ラジオイムノアッセイ、蛍光偏光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、酵素増幅イムノアッセイおよび他の固相イムノアッセイにおいて、臨床サンプル中のブレキナールを含めたキノリンカルボン酸の検出に有用な試剤であることが期待できるものである。本明細書中に提示および記載した事項に加えて、式（Ｉ）のハプテンからのたとえば免疫原の創成、したがって抗体の創成による本発明の様々な改変が可能なことは、以上の記載から本技術分野の熟練者には明白であろう。このような改変もまた添付の請求の範囲に包含されることを意図するものである。以上の開示は、請求された本発明の実施が本技術分野の熟練者により可能になるために必須と考えられるすべての情報を包含するものである。引用された出願がさらに有用な情報を提供すると考えられることから、これらの引用された刊行物は参照によりその全体を本明細書に導入する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/18 8517−4ＨＣ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 5/10 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｓ 15/02 8310−2Ｊ 33/531 ＡＧ０１Ｎ 33/53 8310−2Ｊ 33/533 33/531 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 33/533 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ 33/577 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者サイモン，ポール・ムーアアメリカ合衆国デラウエア州 19802．ウイルミントン．アービングドライブ307

Claims

【特許請求の範囲】１．キノリンカルボン酸の少なくとも１個の抗原決定基に特異的に結合可能なモノクローナル抗体。２．キノリンカルボン酸は式（II）の化合物である請求項１記載のモノクローナル抗体。３．キノリンカルボン酸はブレキナールである請求項２記載のモノクローナル抗体。４．キノリンカルボン酸はブレキナールの薬理学的に活性な類縁体である請求項２記載のモノクローナル抗体。５．上記抗体はブレキナールの不活性ヒドロキシル代謝産物と実質的に非反応性である請求項３記載のモノクローナル抗体。６．請求項１記載のモノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマ細胞系。７．請求項２記載のモノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマ細胞系。８．請求項３記載のモノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマ細胞系。９．請求項４記載のモノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマ細胞系。 10．請求項５記載のモノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマ細胞系。 11．キノリンカルボン酸の少なくとも１個の抗原決定基に特異的に結合可能なポリクローナル抗体。 12．キノリンカルボン酸は式（II）の化合物である請求項11記載のポリクローナル抗体。 13．キノリンカルボン酸はブレキナールである請求項12記載のポリクローナル抗体。 14．キノリンカルボン酸はブレキナールの薬理学的に活性な類縁体である請求項 12記載のポリクローナル抗体。 15．上記抗体はブレキナールの不活性ヒドロキシル代謝産物と実質的に非反応性である請求項13記載のポリクローナル抗体。 16．患者体内のキノリンカルボン酸を検出するイムノアッセイにおいて、（ｉ）患者からの体液を請求項１記載のモノクローナル抗体と接触させることおよび（ii）キノリンカルボン酸：抗体相互作用のスクリーニングを行うこと、からなるイムノアッセイ。 17．患者体内のキノリンカルボン酸を検出するイムノアッセイにおいて、（ｉ）患者からの体液を請求項２記載のモノクローナル抗体と接触させることおよび（ii）キノリンカルボン酸：抗体相互作用のスクリーニングを行うこと、からなるイムノアッセイ。 18．患者体内のキノリンカルボン酸を検出するイムノアッセイにおいて、（ｉ）患者からの体液を請求項３記載のモノクローナル抗体と接触させることおよび（ii）キノリンカルボン酸：抗体相互作用のスクリーニングを行うこと、からなるイムノアッセイ。 19．患者体内のキノリンカルボン酸を検出するイムノアッセイにおいて、（ｉ）患者からの体液を請求項４記載のモノクローナル抗体と接触させることおよび（ii）キノリンカルボン酸：抗体相互作用のスクリーニングを行うこと、からなるイムノアッセイ。 20．患者体内のキノリンカルボン酸を検出するイムノアッセイにおいて、（ｉ）患者からの体液を請求項５記載のモノクローナル抗体と接触させることおよび（ii）キノリンカルボン酸：抗体相互作用のスクリーニングを行うこと、からなるイムノアッセイ。 21．患者体内のキノリンカルボン酸を検出するイムノアッセイにおいて、（ｉ）患者からの体液を請求項11記載のポリクローナル抗体と接触させることおよび（ii）キノリンカルボン酸：抗体相互作用のスクリーニングを行うこと、からなるイムノアッセイ。 22．患者体内のキノリンカルボン酸を検出するイムノアッセイにおいて、（ｉ）患者からの体液を請求項12記載のポリクローナル抗体と接触させることおよび（ii）キノリンカルボン酸：抗体相互作用のスクリーニングを行うこと、からなるイムノアッセイ。 23．患者体内のキノリンカルボン酸を検出するイムノアッセイにおいて、（ｉ）患者からの体液を請求項13記載のポリクローナル抗体と接触させることおよび（ii）キノリンカルボン酸：抗体相互作用のスクリーニングを行うこと、からなるイムノアッセイ。 24．患者体内のキノリンカルボン酸を検出するイムノアッセイにおいて、（ｉ）患者からの体液を請求項14記載のポリクローナル抗体と接触させることおよび（ii）キノリンカルボン酸：抗体相互作用のスクリーニングを行うこと、からなるイムノアッセイ。 25．患者体内のキノリンカルボン酸を検出するイムノアッセイにおいて、（ｉ）患者からの体液を請求項15記載のポリクローナル抗体と接触させることおよび（ii）キノリンカルボン酸：抗体相互作用のスクリーニングを行うこと、からなるイムノアッセイ。 26．上記アッセイはRIA、ELISAおよびFPIAよりなる群から選択される請求項16記載のイムノアッセイ。 27．上記アッセイはRIA、ELISAおよびFPIAよりなる群から選択される請求項17記載のイムノアッセイ。 28．上記アッセイはRIA、ELISAおよびFPIAよりなる群から選択される請求項18記載のイムノアッセイ。 29．上記アッセイはRIA、ELISAおよびFPIAよりなる群から選択される請求項19記載のイムノアッセイ。 30．上記アッセイはRIA、ELISAおよびFPIAよりなる群から選択される請求項20記載のイムノアッセイ。 31．上記アッセイはRIA、ELISAおよびFPIAよりなる群から選択される請求項21記載のイムノアッセイ。 32．上記アッセイはRIA、ELISAおよびFPIAよりなる群から選択される請求項22記載のイムノアッセイ。 33．上記アッセイはRIA、ELISAおよびFPIAよりなる群から選択される請求項23記載のイムノアッセイ。 34．上記アッセイはRIA、ELISAおよびFPIAよりなる群から選択される請求項24記載のイムノアッセイ。 35．上記アッセイはRIA、ELISAおよびFPIAよりなる群から選択される請求項25記載のイムノアッセイ。 36．キノリンカルボン酸はブレキナールである請求項16記載のイムノアッセイ。 37．キノリンカルボン酸はブレキナールである請求項17記載のイムノアッセイ。 38．キノリンカルボン酸はブレキナールである請求項18記載のイムノアッセイ。 39．キノリンカルボン酸はブレキナールである請求項19記載のイムノアッセイ。 40．キノリンカルボン酸はブレキナールである請求項20記載のイムノアッセイ。 41．キノリンカルボン酸はブレキナールである請求項21記載のイムノアッセイ。 42．キノリンカルボン酸はブレキナールである請求項22記載のイムノアッセイ。 43．キノリンカルボン酸はブレキナールである請求項23のイムノアッセイ。 44．キノリンカルボン酸はブレキナールである請求項24記載のイムノアッセイ。 45．キノリンカルボン酸はブレキナールである請求項25記載のイムノアッセイ。 46．キノリンカルボン酸の標準化合物およびキノリンカルボン酸の少なくとも１個の抗原決定基に特異的に結合できるモノクローナル抗体を慣用の診断キット成分と組合わせてなる診断用イムノアッセイキット。 47．さらに、検出可能な蛍光性残基と接合させたキノリンカルボン酸からなるトレーサー化合物を含む請求項46記載の診断用イムノアッセイキット。 48．キノリンカルボン酸の標準化合物およびキノリンカルボン酸の少なくとも１個の抗原決定基に特異的に結合できるポリクローナル抗体を慣用の診断キット成分と組合わせてなる診断用イムノアッセイキット。 49．さらに、検出可能な蛍光性残基で標識されたキノリンカルボン酸からなるトレーサー化合物を含む請求項48記載の診断用イムノアッセイキット。 50．式〔式中、ＲはＸはＯ、Ｓ、NR⁷またはCH＝Nであり、 R¹は５〜12個の炭素原子を有するアルキル、５〜12個の炭素原子を有するアルケニル、３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル、５〜12個の炭素原子を有するシクロアルキルアルキル、０〜３個のＹで置換されたフェニル、または０〜３個のＹで置換されたベンジルであり、 R²は０〜３個のＹで置換されたフェニル、または０〜３個のＹで置換されたベンジルであり、 R³はＨ、１〜３個の炭素原子を有するアルコキシ、１〜３個の炭素原子を有するアルキルチオ、または１〜２個の炭素原子を有するアルキルであり、 R⁴はCOOHであり、 R⁵はＨ、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、CH₃、CF₃、S(O)_nR⁸またはエチルであり、 R⁶は(CR⁹R¹⁰)_pCH₂NH₂であり、 R⁷、R⁸、R⁹およびR¹⁰は独立してＨまたは１〜３個の炭素原子を有するアルキルであり、Ｙは各場合独立に、Ｈ、Ｆ、Cl、Br、１〜５個の炭素原子を有するアルキル、NO₂、１〜５個の炭素原子を有するアルコキシ、１〜５個の炭素原子を有するアルキルチオ、OH、CF₃およびNH₂からなる群より選択され、ｍおよびｎは独立に０、１、または２であり、ｐは０〜12である〕を有するハプテンまたはその適当な塩。 51．Ｒはパラ−フェニレンであり、 R¹は３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル；ヒドロキシルで置換されていてもよいフェニル；１個のハロゲン、１〜５個の炭素原子を有するアルキルもしくはCF₃で置換され、さらに１個のヒドロキシルで置換されていてもよいフェニル；フェノキシ；または１個のハロゲンもしくは１〜５個の炭素原子を有するアルキルで置換されたフェノキシであり、 R³はＨ、１〜２個の炭素原子を有するアルキルまたはメチルチオであり、 R⁵はＨ、ハロゲン、CH₃またはCF₃であり、ｐは１〜12である請求項50記載のハプテンまたはそれらの適当な塩。 52．R¹はシクロヘキシル、フェニル、ヒドロキシフェニル、フルオロフェニル、フルオロヒドロキシフェニル、またはメチルフェニルであり、 R⁵は水素であり、また R⁶は(CH₂)_pNH₂であって、キノリン環の６位に存在し、ｐは２〜８である請求項50記載のハプテンまたはそれらの適当な塩。 53．２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６− （２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸、２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６− （２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩、２−（2′−フルオロ−4′−ヒドロキシ−1,1′−ビフェニル−４−イル） −３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸、および２−（2′−フルオロ−4′−ヒドロキシ−1,1′−ビフェニル−４−イル） −３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩、からなる群より選択される請求項50記載のハプテン。 54．検出可能な蛍光性残基に接合されている請求項50記載のハプテンからなるトレーサー化合物。 55．検出可能な蛍光性残基に接合されている請求項51記載のハプテンからなるトレーサー化合物。 56．検出可能な蛍光性残基に接合されている請求項52記載のハプテンからなるトレーサー化合物。 57．検出可能な蛍光性残基に接合されている請求項53記載のハプテンからなるトレーサー化合物。 58．上記検出可能な蛍光性残基は化学発光分子、発光分子および酵素分子からなる群より選択される請求項54記載のトレーサー化合物。 59．上記検出可能な蛍光性残基は化学発光分子、発光分子および酵素分子からなる群より選択される請求項55記載のトレーサー化合物。 60．上記検出可能な蛍光性残基は化学発光分子、発光分子および酵素分子からなる群より選択される請求項56記載のトレーサー化合物。 61．上記検出可能な蛍光性残基は化学発光分子、発光分子および酵素分子からなる群より選択される請求項57記載のトレーサー化合物。 62．上記発光分子はフルオレセイン分子またはその類縁体である請求項58記載のトレーサー化合物。 63．上記発光分子はフルオレセイン分子またはその類縁体である請求項59記載のトレーサー化合物。 64．上記発光分子はフルオレセイン分子またはその類縁体である請求項60記載のトレーサー化合物。 65．上記発光分子はフルオレセイン分子またはその類縁体である請求項61記載のトレーサー化合物。 66．上記フルオレセイン分子またはその類縁体はアミノフルオレセイン類、カルボキシフルオレセイン類およびフルオレセインアミン類からなる群より選択される請求項62記載のトレーサー化合物。 67．上記フルオレセイン分子またはその類縁体はアミノフルオレセイン類、カルボキシフルオレセイン類およびフルオレセインアミン類からなる群より選択される請求項63記載のトレーサー化合物。 68．上記フルオレセイン分子またはその類縁体はアミノフルオレセイン類、カルボキシフルオレセイン類およびフルオレセインアミン類からなる群より選択される請求項64記載のトレーサー化合物。 69．上記フルオレセイン分子またはその類縁体はアミノフルオレセイン類、カルボキシフルオレセイン類およびフルオレセインアミン類からなる群より選択される請求項65記載のトレーサー化合物。 70．式〔式中、ＲはＸはＯ、Ｓ、NR⁷またはCH＝Nであり、 R¹は５〜12個の炭素原子を有するアルキル、５〜12個の炭素原子を有するアルケニル、３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル、５〜12個の炭素原子を有するシクロアルキルアルキル、０〜３個のＹで置換されたフェニル、または０〜３個のＹで置換されたベンジルであり、 R²は０〜３個のＹで置換されたフェニル、または０〜３個のＹで置換されたベンジルであり、 R³はＨ、１〜３個の炭素原子を有するアルコキシ、１〜３個の炭素原子を有するアルキルチオ、または１〜２個の炭素原子を有するアルキルであり、 R⁴はCOOHであり、 R⁵はＨ、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、CH₃、CF₃、S(O)_nR⁸またはエチルであり、 R⁶は(CR⁹R¹⁰)_pCH₂NH₂であり、 R⁷、R⁸、R⁹およびR¹⁰は独立してＨまたは１〜３個の炭素原子を有するアルキルであり、Ｙは各場合独立に、Ｈ、Ｆ、Cl、Br、１〜５個の炭素原子を有するアルキル、NO₂、１〜５個の炭素原子を有するアルコキシ、１〜５個の炭素原子を有するアルキルチオ、OH、CF₃およびNH₂からなる群より選択され、ｍおよびｎは独立に０、１、または２であり、ｐは０〜12である〕のハプテンまたはその適当な塩に接合された適当な高分子量担体分子からなる免疫原。 71．ハプテンは２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６− （２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸、２−（2′−フルオロ−1,1′−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩、２−（2′−フルオロ−4′−ヒドロキシ−1,1′−ビフェニル−４−イル） −３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸、および２−（2′−フルオロ−4′−ヒドロキシ−1,1′−ビフェニル−４−イル） −３−メチル−６−（２−アミノエチル）−４−キノリンカルボン酸ナトリウム塩、からなる群より選択される請求項70−の免疫原。 72．適当な高分子量担体分子は蛋白質、多糖およびラテックス粒子からなる群より選択される請求項70−の免疫原。 73．適当な高分子量担体分子は蛋白質、多糖およびラテックス粒子からなる群より選択される請求項71記載の免疫原。 74．蛋白質分子はウシ血清アルブミン、オバルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニンからなる群より選択される請求項72記載の免疫原。 75．蛋白質分子はウシ血清アルブミン、オバルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニンからなる群より選択される請求項73記載の免疫原。