JPH0549494A - 免疫学的検出方法 - Google Patents
免疫学的検出方法Info
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- JPH0549494A JPH0549494A JP3183548A JP18354891A JPH0549494A JP H0549494 A JPH0549494 A JP H0549494A JP 3183548 A JP3183548 A JP 3183548A JP 18354891 A JP18354891 A JP 18354891A JP H0549494 A JPH0549494 A JP H0549494A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
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- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
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- C07D251/02—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings
- C07D251/12—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D251/14—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hydrogen or carbon atoms directly attached to at least one ring carbon atom
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Abstract
(57)【要約】
【目的】土壌、水や空気の試料中または生体材料の抽出
中のスルホニル尿素除草剤の検出を迅速で信頼性の高い
免疫学的手法で行う。 【構成】スルホニル尿素除草剤（特にトリアスルフロ
ン）に対する高度の特異性および親和性を有し、該除草
剤の構造的類似体とは交差反応性を実質的に示さないモ
ノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ細
胞系（ＥＣＡＣＣ９００２ １７０２，９００２ １７
０３，９００２ １７０４）、該抗体を用いるスルホニ
ル尿素除草剤の免疫学的検出方法、該方法にそのまま使
用できる試験キット。
中のスルホニル尿素除草剤の検出を迅速で信頼性の高い
免疫学的手法で行う。 【構成】スルホニル尿素除草剤（特にトリアスルフロ
ン）に対する高度の特異性および親和性を有し、該除草
剤の構造的類似体とは交差反応性を実質的に示さないモ
ノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ細
胞系（ＥＣＡＣＣ９００２ １７０２，９００２ １７
０３，９００２ １７０４）、該抗体を用いるスルホニ
ル尿素除草剤の免疫学的検出方法、該方法にそのまま使
用できる試験キット。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、スルホニル尿素の群か
らの除草剤、例えばトリアスルフロン(triasulfurone)
に対して高度な選択性および親和性により区別され、そ
してそれ故に土、水もしくは空気試料中または植物抽出
物中のスルホニル尿素除草剤の迅速で効果的な検出のた
めのイムノアッセイにおける使用に極めて適しているモ
ノクローナル抗体、および該モノクローナル抗体の製造
方法に関する。
らの除草剤、例えばトリアスルフロン(triasulfurone)
に対して高度な選択性および親和性により区別され、そ
してそれ故に土、水もしくは空気試料中または植物抽出
物中のスルホニル尿素除草剤の迅速で効果的な検出のた
めのイムノアッセイにおける使用に極めて適しているモ
ノクローナル抗体、および該モノクローナル抗体の製造
方法に関する。
【０００２】本発明はまた、上記モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞系、上記モノクローナル抗
体を用いて土、水または空気試料中および生物学的材料
例えば植物抽出物中のスルホニル尿素除草剤を検出する
ための免疫学的方法、およびこれらの検出方法において
使用され得る試験キットに関する。
産生するハイブリドーマ細胞系、上記モノクローナル抗
体を用いて土、水または空気試料中および生物学的材料
例えば植物抽出物中のスルホニル尿素除草剤を検出する
ための免疫学的方法、およびこれらの検出方法において
使用され得る試験キットに関する。
【０００３】
【従来の技術】植物保護のための合成除草剤の使用およ
びそれと関連した環境問題は人々の論議の的となること
が近年頻繁になってきている。
びそれと関連した環境問題は人々の論議の的となること
が近年頻繁になってきている。
【０００４】スルホニル尿素は植物保護、特に穀物栽培
における広葉雑草の選択的で効果的な防除のために使用
される新しい部類の特に有効な除草剤である。
における広葉雑草の選択的で効果的な防除のために使用
される新しい部類の特に有効な除草剤である。
【０００５】この部類の代表はトリアスルフロン〔３−
（６−メトキシ−４−メチル−１，３，５−トリアジニ
−２−イル）−１−〔２−（２−クロロエトキシ）−フ
ェニルスルホニル〕−尿素〕であり、これは特に小粒の
穀物栽培における広葉雑草、例えばヴィオラ・トリコロ
ール(Viola tricolor)またはガリウム・アパリン(Galiu
m aparine)の選択的防除のために使用される。
（６−メトキシ−４−メチル−１，３，５−トリアジニ
−２−イル）−１−〔２−（２−クロロエトキシ）−フ
ェニルスルホニル〕−尿素〕であり、これは特に小粒の
穀物栽培における広葉雑草、例えばヴィオラ・トリコロ
ール(Viola tricolor)またはガリウム・アパリン(Galiu
m aparine)の選択的防除のために使用される。
【０００６】土壌および水の試料におけるスルホニル尿
素の群からの除草剤の検出は主としてガスまたは液体ク
ロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）〔ＧＣ：１；ＨＰ
ＬＣ：２１；８；１９，以下〔 〕内の数字は本明細書
末尾にまとめて示す表１の参考文献の番号と一致する〕
およびバイオアッセイにより現在行われている。
素の群からの除草剤の検出は主としてガスまたは液体ク
ロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）〔ＧＣ：１；ＨＰ
ＬＣ：２１；８；１９，以下〔 〕内の数字は本明細書
末尾にまとめて示す表１の参考文献の番号と一致する〕
およびバイオアッセイにより現在行われている。
【０００７】いくつかの場合において、土壌中のこれら
の除草剤のごく少量の残留は高度の残留活性を依然とし
て示し、スルホニル尿素に対して感受性である後に生じ
る作物に特に有害であるから、残留分析のための信頼性
が高く、非常に感度の高い検出方法を利用可能にするこ
とは非常に重要である。合成除草剤を検出するための上
記方法のほとんどは残留分析に必要な感度をもつけれど
も、それらの使用は一般に非常に多くの欠点を有する。
例えば、土壌試料中のトリアスルフロンをガスクロマト
グラフィーまたはＨＰＬＣにより検出するために、実際
にクロマトグラフィー分析する前に骨の折れる精製およ
び濃縮段階が行われなければならない。
の除草剤のごく少量の残留は高度の残留活性を依然とし
て示し、スルホニル尿素に対して感受性である後に生じ
る作物に特に有害であるから、残留分析のための信頼性
が高く、非常に感度の高い検出方法を利用可能にするこ
とは非常に重要である。合成除草剤を検出するための上
記方法のほとんどは残留分析に必要な感度をもつけれど
も、それらの使用は一般に非常に多くの欠点を有する。
例えば、土壌試料中のトリアスルフロンをガスクロマト
グラフィーまたはＨＰＬＣにより検出するために、実際
にクロマトグラフィー分析する前に骨の折れる精製およ
び濃縮段階が行われなければならない。
【０００８】これらの方法のその他の欠点は、例えば、
特定元素の検出器がガスクロマトグラフィーにおいて使
用され、一方比較的非特異的である光度検出器がＨＰＬ
Ｃにおいて使用されることであるとみなされてもよい。
質量スペクトル検出を除いて、クロマトグラフィー分析
の基本は特定物質の保持時間の決定である。しかしなが
ら、これらの値は相対的であり、それ故に構造に特異的
ではない。
特定元素の検出器がガスクロマトグラフィーにおいて使
用され、一方比較的非特異的である光度検出器がＨＰＬ
Ｃにおいて使用されることであるとみなされてもよい。
質量スペクトル検出を除いて、クロマトグラフィー分析
の基本は特定物質の保持時間の決定である。しかしなが
ら、これらの値は相対的であり、それ故に構造に特異的
ではない。
【０００９】同様に、上記したバイオアッセイ法はさほ
ど苦労せずに行われ得るが、十分に特異的でない。
ど苦労せずに行われ得るが、十分に特異的でない。
【００１０】確立された分析法の上記欠点を解消するた
め、広範囲の抗原を検出するための臨床的な治療に既に
日常使用されているもののように、農業領域、特に土
壌、水または空気の試料中の農薬の定量および定性分析
のための免疫学的方法を開発することが最近の試みられ
てきた。
め、広範囲の抗原を検出するための臨床的な治療に既に
日常使用されているもののように、農業領域、特に土
壌、水または空気の試料中の農薬の定量および定性分析
のための免疫学的方法を開発することが最近の試みられ
てきた。
【００１１】例えば、ある種の除草剤例えば２，４−ジ
クロロフェノキシ酢酸〔６〕またはクロロスルフロン
〔１０〕ならびに種々の殺虫剤例えばジフルベンズロン
〔２０〕、メタラキシル〔１４〕、アラクロル〔５〕ま
たはパラチオン〔４〕の検出のための免疫学的方法の開
発が既に進行中である。
クロロフェノキシ酢酸〔６〕またはクロロスルフロン
〔１０〕ならびに種々の殺虫剤例えばジフルベンズロン
〔２０〕、メタラキシル〔１４〕、アラクロル〔５〕ま
たはパラチオン〔４〕の検出のための免疫学的方法の開
発が既に進行中である。
【００１２】このようにスルホニル尿素の群からの除草
剤の免疫学的検出のための方法は既に記載されているが
〔１０〕、しかしそれらは上記した方法と同様に、相当
する抗原で予め免疫感作された動物から得られたポリク
ローナル抗血清の使用に基づいている。そして、標的物
質に対して十分に高度な親和性を有し、それ故に公知イ
ムノアッセイの一つにおいて本発明に係る使用に適して
いるスルホニル尿素除草剤に対するモノクローナル抗体
の調製は今まで成功していない。
剤の免疫学的検出のための方法は既に記載されているが
〔１０〕、しかしそれらは上記した方法と同様に、相当
する抗原で予め免疫感作された動物から得られたポリク
ローナル抗血清の使用に基づいている。そして、標的物
質に対して十分に高度な親和性を有し、それ故に公知イ
ムノアッセイの一つにおいて本発明に係る使用に適して
いるスルホニル尿素除草剤に対するモノクローナル抗体
の調製は今まで成功していない。
【００１３】ポリクローナル抗血清は非常に不均一な組
成物であり、すなわちそれらは特定の抗原の異なるエピ
トープと反応する極めて多くの異種抗体を含有する。実
験動物が特定の抗原で免疫感作されるとき、種々の抗体
産生細胞クローンを同時に刺激し、そのクローンの各々
が抗原分子上の異なるエピトープを認識し、その結果、
異なる抗体が刺激された細胞クローンにより産生される
から、ポリクローナル抗血清の不均一な組成物が生じ
る。
成物であり、すなわちそれらは特定の抗原の異なるエピ
トープと反応する極めて多くの異種抗体を含有する。実
験動物が特定の抗原で免疫感作されるとき、種々の抗体
産生細胞クローンを同時に刺激し、そのクローンの各々
が抗原分子上の異なるエピトープを認識し、その結果、
異なる抗体が刺激された細胞クローンにより産生される
から、ポリクローナル抗血清の不均一な組成物が生じ
る。
【００１４】これが、免疫感作された動物からの血清が
常にポリクローナルであり、それ故にそれらの特異性お
よび免疫グロブリンの個々のクラスの構成に関して不均
一である理由である。
常にポリクローナルであり、それ故にそれらの特異性お
よび免疫グロブリンの個々のクラスの構成に関して不均
一である理由である。
【００１５】従って、ポリクローナル抗血清の組成物に
おける不均一性は、不十分な親和性のためにそれらの検
出感度が標的物質の選択的検出に不適当であるとか、ま
たはこれらのポリクローナル抗体がイムノアッセイにお
いて使用される場合に、構造的に極めて近似の化合物、
例えばトリアスルフロンとその水酸化物を十分に識別で
きないという状態を導く。
おける不均一性は、不十分な親和性のためにそれらの検
出感度が標的物質の選択的検出に不適当であるとか、ま
たはこれらのポリクローナル抗体がイムノアッセイにお
いて使用される場合に、構造的に極めて近似の化合物、
例えばトリアスルフロンとその水酸化物を十分に識別で
きないという状態を導く。
【００１６】ポリクローナル抗血清のこれらの欠点を克
服するために、農業領域でもモノクローナル抗体の開発
に多くの努力がはらわれている。そして、酵素結合イム
ノアッセイにおけるアトラジンおよびヒドロキシアトラ
ジンに対するモノクローナル抗体の調製および使用が報
告されている〔１６〕。
服するために、農業領域でもモノクローナル抗体の開発
に多くの努力がはらわれている。そして、酵素結合イム
ノアッセイにおけるアトラジンおよびヒドロキシアトラ
ジンに対するモノクローナル抗体の調製および使用が報
告されている〔１６〕。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の範囲
内で解決しようとする課題は、土壌、水および空気の試
料中のスルホニル尿素除草剤、特にトリアスルフロンの
迅速で信頼できる検出のための、操作が容易で、効率的
で、そして選択性の高いイムノアッセイを提供すること
を第一とする。
内で解決しようとする課題は、土壌、水および空気の試
料中のスルホニル尿素除草剤、特にトリアスルフロンの
迅速で信頼できる検出のための、操作が容易で、効率的
で、そして選択性の高いイムノアッセイを提供すること
を第一とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】上記課題は、それ自体公
知のハイブリドーマ／モノクローナル抗体技術を使用し
て、スルホニル尿素除草剤に対する、特にトリアスルフ
ロンに対する高度の特異性および親和性を有するモノク
ローナル抗体を提供することにより、本発明の範囲内で
驚くべきことに今解決された。
知のハイブリドーマ／モノクローナル抗体技術を使用し
て、スルホニル尿素除草剤に対する、特にトリアスルフ
ロンに対する高度の特異性および親和性を有するモノク
ローナル抗体を提供することにより、本発明の範囲内で
驚くべきことに今解決された。
【００１９】非常に特定された抗原に対する抗体の供給
源としてのハイブリッド体細胞系（ハイブリドーマ）の
使用はケーラーおよびミルシュタインの研究〔１１〕に
由来する。
源としてのハイブリッド体細胞系（ハイブリドーマ）の
使用はケーラーおよびミルシュタインの研究〔１１〕に
由来する。
【００２０】これに記載された方法により得ることがで
きる抗体は、通常の免疫感作動物の抗血清から得られた
ものとは全く異なる。
きる抗体は、通常の免疫感作動物の抗血清から得られた
ものとは全く異なる。
【００２１】ハイブリドーマ／モノクローナル抗体技術
の原理は、２種の体細胞の融合から生じるハイブリッド
細胞が両方の親タイプの特徴を有するという観察に基づ
いている。
の原理は、２種の体細胞の融合から生じるハイブリッド
細胞が両方の親タイプの特徴を有するという観察に基づ
いている。
【００２２】モノクローナル抗体産生の場合には、特定
の抗体を合成する能力は、予め免疫感作された供与動物
から採取された免疫適格Ｂ細胞（通常脾臓細胞）に由来
し、一方、細胞が培養液中で連続的に分裂する能力は他
方の融合相手である腫瘍細胞系（しばしばミエローマ）
により付与される。
の抗体を合成する能力は、予め免疫感作された供与動物
から採取された免疫適格Ｂ細胞（通常脾臓細胞）に由来
し、一方、細胞が培養液中で連続的に分裂する能力は他
方の融合相手である腫瘍細胞系（しばしばミエローマ）
により付与される。
【００２３】一般に、供与動物は標的分子とそれらに連
結された高分子量担体分子とからなる複合体を用いて免
疫感作される。
結された高分子量担体分子とからなる複合体を用いて免
疫感作される。
【００２４】これらのハイブリッド細胞系の各々は、抗
原に応答して動物により生体内で合成され得る多くの可
能な抗体の単一の代表種だけを提示する均一な免疫グロ
ブリンを合成する。
原に応答して動物により生体内で合成され得る多くの可
能な抗体の単一の代表種だけを提示する均一な免疫グロ
ブリンを合成する。
【００２５】各々の免疫グロブリン産生クローンは単一
型の抗体を特徴とするから、「モノクローナル抗体」と
いう表現が採用された。
型の抗体を特徴とするから、「モノクローナル抗体」と
いう表現が採用された。
【００２６】モノクローナル抗体のポリクローナル抗体
に対する利点を以下に示す： ａ）モノクローナル抗体は数多く、そして高純度で得ら
れる、 ｂ）モノクローナル抗体の調製は抗原反応性に関して均
一であり、経時的に変化しない、 ｃ）モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはそ
れらの特異性、すなわちそれによる特定のモノクローナ
ル抗体の産生能を失うことなく数年および数十年間貯蔵
できる、 ｄ）ポリクローナル抗血清は例えば以下の点： α）抗血清を得るための免疫感作動物からの血液採取 β）追加の免疫感作のための材料の一定の入手可能性 γ）供与動物の限定された寿命 に関する広範囲の変動により悪影響を受けるから、モノ
クローナル抗体は標準試薬として使用するのにポリクロ
ーナル抗血清に比べより適当である。
に対する利点を以下に示す： ａ）モノクローナル抗体は数多く、そして高純度で得ら
れる、 ｂ）モノクローナル抗体の調製は抗原反応性に関して均
一であり、経時的に変化しない、 ｃ）モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはそ
れらの特異性、すなわちそれによる特定のモノクローナ
ル抗体の産生能を失うことなく数年および数十年間貯蔵
できる、 ｄ）ポリクローナル抗血清は例えば以下の点： α）抗血清を得るための免疫感作動物からの血液採取 β）追加の免疫感作のための材料の一定の入手可能性 γ）供与動物の限定された寿命 に関する広範囲の変動により悪影響を受けるから、モノ
クローナル抗体は標準試薬として使用するのにポリクロ
ーナル抗血清に比べより適当である。
【００２７】非常に多くの抗原に対して今調製されたモ
ノクローナル抗体は主として医学的治療において十分に
確立され、そしてもはやそれなしで済ますことはできな
い。
ノクローナル抗体は主として医学的治療において十分に
確立され、そしてもはやそれなしで済ますことはできな
い。
【００２８】本発明の範囲内で、それ自体公知でありそ
して簡単に上記したハイブリドーマ／モノクローナル抗
体技術を用いて、スルホニル尿素除草剤特にトリアスル
フロンに対する高度の特異性および親和性を有し、公知
のイムノアッセイの一つにおいて本発明に係る使用のた
めにそれらの高度の親和性により適当であるモノクロー
ナル抗体の製造を可能にする方法が初めて今可能になっ
た。
して簡単に上記したハイブリドーマ／モノクローナル抗
体技術を用いて、スルホニル尿素除草剤特にトリアスル
フロンに対する高度の特異性および親和性を有し、公知
のイムノアッセイの一つにおいて本発明に係る使用のた
めにそれらの高度の親和性により適当であるモノクロー
ナル抗体の製造を可能にする方法が初めて今可能になっ
た。
【００２９】特に、その方法は、供与動物の免疫感作の
ための複合体の製造において、全体のスルホニル尿素分
子ではなく、好ましくは該分子のスルホンアミド部分を
含む断片のみを使用するという事実により実質的に特徴
づけられる。そして、上記断片は慣用の高分子量担体分
子の一つに連結されている。
ための複合体の製造において、全体のスルホニル尿素分
子ではなく、好ましくは該分子のスルホンアミド部分を
含む断片のみを使用するという事実により実質的に特徴
づけられる。そして、上記断片は慣用の高分子量担体分
子の一つに連結されている。
【００３０】免疫応答が供与動物中に誘発された後、抗
体産生に関連する細胞が供与動物から単離され、そして
ハイブリドーマ細胞を製造するために、以下に詳細に記
載する方法で、適当なミエローマ細胞と融合される。
体産生に関連する細胞が供与動物から単離され、そして
ハイブリドーマ細胞を製造するために、以下に詳細に記
載する方法で、適当なミエローマ細胞と融合される。
【００３１】従って、本発明は、（ａ）標的分子のスル
ホンアミド部分を実質的に含む連結性成分が適当な高分
子量担体分子と複合され、（ｂ）供与動物が（ａ）に従
って製造された複合体で免疫感作され、（ｃ）免疫適格
Ｂ細胞が免疫感作された供与動物から単離され、（ｄ）
該免疫適格Ｂ細胞が連続的に細胞分裂し得る腫瘍細胞と
融合され、（ｅ）生成する融合物が単離され、そして選
択の後、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞がク
ローン化され、そして（ｆ）モノクローナル抗体を製造
するために該ハイブリドーマ細胞が試験管内または生体
内で培養される、ことからなる１種またはそれ以上のス
ルホニル尿素除草剤に対して高度の特異性および親和性
を有するモノクローナル抗体の製造方法に特に関する。
ホンアミド部分を実質的に含む連結性成分が適当な高分
子量担体分子と複合され、（ｂ）供与動物が（ａ）に従
って製造された複合体で免疫感作され、（ｃ）免疫適格
Ｂ細胞が免疫感作された供与動物から単離され、（ｄ）
該免疫適格Ｂ細胞が連続的に細胞分裂し得る腫瘍細胞と
融合され、（ｅ）生成する融合物が単離され、そして選
択の後、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞がク
ローン化され、そして（ｆ）モノクローナル抗体を製造
するために該ハイブリドーマ細胞が試験管内または生体
内で培養される、ことからなる１種またはそれ以上のス
ルホニル尿素除草剤に対して高度の特異性および親和性
を有するモノクローナル抗体の製造方法に特に関する。
【００３２】本発明はまた、本発明に係る方法から生じ
るモノクローナル抗体に関する。スルホニル尿素除草
剤、特にトリアスルフロンの迅速で信頼できる検出のた
めのイムノアッセイにおける使用のために低い交差反応
性により極めて適当であり、そしてそれ故に標的物質、
例えばトリアスルフロンを構造的に関連する化合物、特
にその水酸化物や不活性代謝物と識別するために使用さ
れ得るスルホニル尿素除草剤、特にトリアスルフロンに
対して高度の特異性および親和性を有するモノクローナ
ル抗体が好ましい。
るモノクローナル抗体に関する。スルホニル尿素除草
剤、特にトリアスルフロンの迅速で信頼できる検出のた
めのイムノアッセイにおける使用のために低い交差反応
性により極めて適当であり、そしてそれ故に標的物質、
例えばトリアスルフロンを構造的に関連する化合物、特
にその水酸化物や不活性代謝物と識別するために使用さ
れ得るスルホニル尿素除草剤、特にトリアスルフロンに
対して高度の特異性および親和性を有するモノクローナ
ル抗体が好ましい。
【００３３】それ故に、本発明の範囲内で、トリアスル
フロンに対して高度の特異性および親和性を有し、そし
てプリミスルフロン(primisulfurone)、スルホメツロン
−メチル(sulfometurone-methyl)、トリベヌロン−メチ
ル(tribenurone-methyl)、チアメツロン−メチル(thiam
eturone-methyl) 、クロロスルフロン(chlorosulfuron
e) 、ベンスルフロン−メチル(bensulfurone-methyl)
、メツスルフロン−メチル(metsulfurone-methyl) 、
ニコスルフロン−メチル(nicosulfurone-methyl)および
ＤＰＸ９６３６からなる群から選択される構造的に関連
する化合物と交差反応性を実質的に示さないモノクロー
ナル抗体が特に好ましい。
フロンに対して高度の特異性および親和性を有し、そし
てプリミスルフロン(primisulfurone)、スルホメツロン
−メチル(sulfometurone-methyl)、トリベヌロン−メチ
ル(tribenurone-methyl)、チアメツロン−メチル(thiam
eturone-methyl) 、クロロスルフロン(chlorosulfuron
e) 、ベンスルフロン−メチル(bensulfurone-methyl)
、メツスルフロン−メチル(metsulfurone-methyl) 、
ニコスルフロン−メチル(nicosulfurone-methyl)および
ＤＰＸ９６３６からなる群から選択される構造的に関連
する化合物と交差反応性を実質的に示さないモノクロー
ナル抗体が特に好ましい。
【００３４】同様に、トリアスルフロンに対して高度の
特異性および親和性を有し、そしてプリミスルフロン、
スルホメツロン−メチル、トリベヌロン−メチル、チア
メツロン−メチル、クロロスルフロン、ベンスルフロン
−メチル、メツスルフロン−メチル、ニコスルフロン−
メチルおよびＤＰＸ９６３６からなる群から選択される
構造的に関連するトリアスルフロン類似体とは１．０％
未満、特に０．７％未満の交差反応性を示すモノクロー
ナル抗体が好ましい。
特異性および親和性を有し、そしてプリミスルフロン、
スルホメツロン−メチル、トリベヌロン−メチル、チア
メツロン−メチル、クロロスルフロン、ベンスルフロン
−メチル、メツスルフロン−メチル、ニコスルフロン−
メチルおよびＤＰＸ９６３６からなる群から選択される
構造的に関連するトリアスルフロン類似体とは１．０％
未満、特に０．７％未満の交差反応性を示すモノクロー
ナル抗体が好ましい。
【００３５】ＥＣＡＣＣ９００２ １７０２またはＥＣ
ＡＣＣ９００２ １７０３の特徴を有するハイブリドー
マ細胞系から得られるモノクローナル抗体並びに該モノ
クローナル抗体の誘導体が特に好ましい。
ＡＣＣ９００２ １７０３の特徴を有するハイブリドー
マ細胞系から得られるモノクローナル抗体並びに該モノ
クローナル抗体の誘導体が特に好ましい。
【００３６】同様に、トリアスルフロンに対して高度の
特異性および親和性を有し、そしてプリミスルフロン、
スルホメツロン−メチル、トリベヌロン−メチル、チア
メツロン−メチル、クロロスルフロン、ベンスルフロン
−メチル、メツスルフロン−メチル、ニコスルフロン−
メチルおよびＤＰＸ９６３６からなる群から選択される
構造的に関連するトリアスルフロン類似体とは０．１％
未満、特に０．０１％未満の交差反応性を示すモノクロ
ーナル抗体が特に好ましい。
特異性および親和性を有し、そしてプリミスルフロン、
スルホメツロン−メチル、トリベヌロン−メチル、チア
メツロン−メチル、クロロスルフロン、ベンスルフロン
−メチル、メツスルフロン−メチル、ニコスルフロン−
メチルおよびＤＰＸ９６３６からなる群から選択される
構造的に関連するトリアスルフロン類似体とは０．１％
未満、特に０．０１％未満の交差反応性を示すモノクロ
ーナル抗体が特に好ましい。
【００３７】ＥＣＡＣＣ９００２ １７０４の特徴を有
するハイブリドーマ細胞系から得られるモノクローナル
抗体および該モノクローナル抗体の誘導体が中でも好ま
しい。
するハイブリドーマ細胞系から得られるモノクローナル
抗体および該モノクローナル抗体の誘導体が中でも好ま
しい。
【００３８】本発明の範囲内でモノクローナル抗体の誘
導体とは、例えば、トリアスルフロンの抗原決定基に対
する高度の特異性および親和性を依然有する抗体断片、
さらに例えば放射性ヨウ素（125 Ｉ， 131Ｉ）、炭素（
14Ｃ ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（ 3Ｈ）等で標識
される放射標識モノクローナル抗体、モノクローナル抗
体とビオチンまたはアビジン、酵素例えば西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミ
ラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラ
ーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼまたはグ
ルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼとの複合
体、モノクローナル抗体と生物発光剤（例えばルシフェ
ラーゼ）、化学発光剤（例えばアクリジンエステル）ま
たは蛍光剤（例えばフィコビリタンパク質）との複合体
を意味する。二重特異性の、そしていわゆる交差結合抗
体も同様に本発明に包含される。ここに挙げた抗体の例
は本発明を説明するためのものであり、これにより本発
明の対象をなんら限定しようとするものではない。
導体とは、例えば、トリアスルフロンの抗原決定基に対
する高度の特異性および親和性を依然有する抗体断片、
さらに例えば放射性ヨウ素（125 Ｉ， 131Ｉ）、炭素（
14Ｃ ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（ 3Ｈ）等で標識
される放射標識モノクローナル抗体、モノクローナル抗
体とビオチンまたはアビジン、酵素例えば西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミ
ラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラ
ーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼまたはグ
ルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼとの複合
体、モノクローナル抗体と生物発光剤（例えばルシフェ
ラーゼ）、化学発光剤（例えばアクリジンエステル）ま
たは蛍光剤（例えばフィコビリタンパク質）との複合体
を意味する。二重特異性の、そしていわゆる交差結合抗
体も同様に本発明に包含される。ここに挙げた抗体の例
は本発明を説明するためのものであり、これにより本発
明の対象をなんら限定しようとするものではない。
【００３９】「交差反応性を実質的に示さない」という
用語は本発明の範囲内ではトリアスルフロンに対して特
異的なモノクローナル抗体とその他の化合物、特に構造
的に関連した化合物、例えばその水酸化物の非特異的エ
ピトープとの反応性が１０％未満、好ましくは１．５％
未満、そして特に０．１％未満であることを意味するこ
とを意図する。
用語は本発明の範囲内ではトリアスルフロンに対して特
異的なモノクローナル抗体とその他の化合物、特に構造
的に関連した化合物、例えばその水酸化物の非特異的エ
ピトープとの反応性が１０％未満、好ましくは１．５％
未満、そして特に０．１％未満であることを意味するこ
とを意図する。
【００４０】交差反応性の百分率（％）は本発明の範囲
内では下の式により規定される：〔５０％阻害のための
トリアスルフロン濃度（Ｉ50）／５０％阻害のためのト
リアスルフロン類似体の濃度（Ｉ50）〕×１００。
内では下の式により規定される：〔５０％阻害のための
トリアスルフロン濃度（Ｉ50）／５０％阻害のためのト
リアスルフロン類似体の濃度（Ｉ50）〕×１００。
【００４１】Ｉ50値は、例えば競合エリザアッセイ（実
施例８参照）によって決定され得る。この際にＩ50値は
担体結合抗原への抗体の結合の５０％阻害を導く抗原濃
度に相当する。
施例８参照）によって決定され得る。この際にＩ50値は
担体結合抗原への抗体の結合の５０％阻害を導く抗原濃
度に相当する。
【００４２】本発明はさらに、上で詳細に特徴づけられ
たモノクローナル抗体を合成し、そして好ましくは周囲
の培地に分泌するハイブリドーマ細胞系に関する。
たモノクローナル抗体を合成し、そして好ましくは周囲
の培地に分泌するハイブリドーマ細胞系に関する。
【００４３】本発明は特に、トリアスルフロンに対して
高度の特異性および親和性を有し、そしてプリミスルフ
ロン、スルホメツロン−メチル、トリベヌロン−メチ
ル、チアメツロン−メチル、クロロスルフロン、ベンス
ルフロン−メチル、メツスルフロン−メチル、ニコスル
フロン−メチルおよびＤＰＸ９６３６からなる群から選
択される構造的に関連する化合物と交差反応性を実質的
に示さないモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞系に関する。
高度の特異性および親和性を有し、そしてプリミスルフ
ロン、スルホメツロン−メチル、トリベヌロン−メチ
ル、チアメツロン−メチル、クロロスルフロン、ベンス
ルフロン−メチル、メツスルフロン−メチル、ニコスル
フロン−メチルおよびＤＰＸ９６３６からなる群から選
択される構造的に関連する化合物と交差反応性を実質的
に示さないモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞系に関する。
【００４４】トリアスルフロンに対して高度の特異性お
よび親和性を有し、そして非常に多くの構造的に関連す
るトリアスルフロン類似体とは１０％未満、特に１．５
％未満、そしてとりわけ０．１％未満の交差反応性を示
すモノクローナル抗体を合成し、そして好ましくは周囲
の培地に分泌するハイブリドーマ細胞系が好ましい。
よび親和性を有し、そして非常に多くの構造的に関連す
るトリアスルフロン類似体とは１０％未満、特に１．５
％未満、そしてとりわけ０．１％未満の交差反応性を示
すモノクローナル抗体を合成し、そして好ましくは周囲
の培地に分泌するハイブリドーマ細胞系が好ましい。
【００４５】トリアスルフロンに対して高度の特異性お
よび親和性を有し、そしてプリミスルフロン、スルホメ
ツロン−メチル、トリベヌロン−メチル、チアメツロン
−メチル、クロロスルフロン、ベンスルフロン−メチ
ル、メツスルフロン−メチル、ニコスルフロン−メチル
およびＤＰＸ９６３６からなる群から選択される構造的
に関連するトリアスルフロン類似体とは１．０％未満、
特に０．７％未満の交差反応性を示すモノクローナル抗
体を合成し、そして好ましくは周囲の培地に分泌するハ
イブリドーマ細胞系が特に好ましい。
よび親和性を有し、そしてプリミスルフロン、スルホメ
ツロン−メチル、トリベヌロン−メチル、チアメツロン
−メチル、クロロスルフロン、ベンスルフロン−メチ
ル、メツスルフロン−メチル、ニコスルフロン−メチル
およびＤＰＸ９６３６からなる群から選択される構造的
に関連するトリアスルフロン類似体とは１．０％未満、
特に０．７％未満の交差反応性を示すモノクローナル抗
体を合成し、そして好ましくは周囲の培地に分泌するハ
イブリドーマ細胞系が特に好ましい。
【００４６】ＥＣＡＣＣ９００２ １７０２またはＥＣ
ＡＣＣ９００２ １７０３の特徴を有するハイブリドー
マ細胞系およびそれらのクローンおよびサブクローンが
非常に好ましい。
ＡＣＣ９００２ １７０３の特徴を有するハイブリドー
マ細胞系およびそれらのクローンおよびサブクローンが
非常に好ましい。
【００４７】トリアスルフロンに対して高度の特異性お
よび親和性を有し、そしてプリミスルフロン、スルホメ
ツロン−メチル、トリベヌロン−メチル、チアメツロン
−メチル、クロロスルフロン、ベンスルフロン−メチ
ル、メツスルフロン−メチル、ニコスルフロン−メチル
およびＤＰＸ９６３６からなる群から選択される構造的
に関連するトリアスルフロン類似体とは０．１％未満、
特に０．０１％未満の交差反応性を示すモノクローナル
抗体を合成し、そして好ましくは周囲の培地に分泌する
ハイブリドーマ細胞系もまた特に好ましい。
よび親和性を有し、そしてプリミスルフロン、スルホメ
ツロン−メチル、トリベヌロン−メチル、チアメツロン
−メチル、クロロスルフロン、ベンスルフロン−メチ
ル、メツスルフロン−メチル、ニコスルフロン−メチル
およびＤＰＸ９６３６からなる群から選択される構造的
に関連するトリアスルフロン類似体とは０．１％未満、
特に０．０１％未満の交差反応性を示すモノクローナル
抗体を合成し、そして好ましくは周囲の培地に分泌する
ハイブリドーマ細胞系もまた特に好ましい。
【００４８】ＥＣＡＣＣ９００２ １７０４の特徴を有
するハイブリドーマ細胞系およびそれらのクローンおよ
びサブクローンが中でも好ましい。
するハイブリドーマ細胞系およびそれらのクローンおよ
びサブクローンが中でも好ましい。
【００４９】本発明はまた、自然に生じるか、または公
知方法を用いて人工的に製造し得、かつ、出発物の特徴
を依然有する、すなわち本発明に係る抗体を産生し得、
そして好ましくは周囲の培地にそれらを分泌し得る、上
に詳細に記載されたハイブリドーマ細胞系の突然変異体
および変種に関する。
知方法を用いて人工的に製造し得、かつ、出発物の特徴
を依然有する、すなわち本発明に係る抗体を産生し得、
そして好ましくは周囲の培地にそれらを分泌し得る、上
に詳細に記載されたハイブリドーマ細胞系の突然変異体
および変種に関する。
【００５０】本発明はまた、上記ハイブリドーマ細胞系
の製造方法および上記モノクローナル抗体の製造方法を
包含する。
の製造方法および上記モノクローナル抗体の製造方法を
包含する。
【００５１】ハイブリドーマ細胞系のクローンおよびサ
ブクローンは、出発クローンから反復クローニングによ
り製造され、そして該出発クローンの本発明に必須の特
性を依然有するハイブリドーマであると理解されるべき
である。
ブクローンは、出発クローンから反復クローニングによ
り製造され、そして該出発クローンの本発明に必須の特
性を依然有するハイブリドーマであると理解されるべき
である。
【００５２】本発明は、本発明に係るモノクローナル抗
体を用いて、例えば土壌、水または空気の試料中および
生物学的材料例えば植物または動物抽出物中のスルホニ
ル尿素除草剤、特にトリアスルフロンの免疫学的検出方
法にも関する。
体を用いて、例えば土壌、水または空気の試料中および
生物学的材料例えば植物または動物抽出物中のスルホニ
ル尿素除草剤、特にトリアスルフロンの免疫学的検出方
法にも関する。
【００５３】本発明はまた、試薬として本発明に係るモ
ノクローナル抗体を少なくとも１種含有し、そしてスル
ホニル尿素除草剤、特にトリアスルフロンの迅速で信頼
できる検出のために野外条件下での使用に適している、
使用のために調整されている試験キットの形態にあるス
ルホニル尿素除草剤、特にトリアスルフロンの定性およ
び定量分析のための手段を包含する。
ノクローナル抗体を少なくとも１種含有し、そしてスル
ホニル尿素除草剤、特にトリアスルフロンの迅速で信頼
できる検出のために野外条件下での使用に適している、
使用のために調整されている試験キットの形態にあるス
ルホニル尿素除草剤、特にトリアスルフロンの定性およ
び定量分析のための手段を包含する。
【００５４】本発明に係るモノクローナル抗体はそれ自
体公知の方法により調製され、ケーラーおよびミルシュ
タインにより開発された方法〔１１〕に本質的に基づい
ている。
体公知の方法により調製され、ケーラーおよびミルシュ
タインにより開発された方法〔１１〕に本質的に基づい
ている。
【００５５】分析されるべき、そしてそれに対する抗体
が開発されるべきである標的物質（スルホニル尿素除草
剤）例えばトリアスルフロンは、それを実験動物に投与
した後に適当な免疫応答を誘発することができないよう
な比較的小さくそして単純な分子であるから、実際の免
疫感作の前に予備手段を施すことが最初に必要である。
が開発されるべきである標的物質（スルホニル尿素除草
剤）例えばトリアスルフロンは、それを実験動物に投与
した後に適当な免疫応答を誘発することができないよう
な比較的小さくそして単純な分子であるから、実際の免
疫感作の前に予備手段を施すことが最初に必要である。
【００５６】この種の化合物は、それらの大きさと単純
な構造のために免疫反応を誘導できず、ハプテンまたは
不完全抗原と呼ばれ、それ故に抗原として作用しそして
免疫応答を誘導し得る完全抗原（＝免疫原）と区別され
る。この種のハプテン分子は高分子量化合物（担体分
子）に複合され得、その結果、それらは自身の特性に関
して完全抗原に匹敵するものとなる、すなわちハプテン
分子はその時免疫応答を誘発し得る。
な構造のために免疫反応を誘導できず、ハプテンまたは
不完全抗原と呼ばれ、それ故に抗原として作用しそして
免疫応答を誘導し得る完全抗原（＝免疫原）と区別され
る。この種のハプテン分子は高分子量化合物（担体分
子）に複合され得、その結果、それらは自身の特性に関
して完全抗原に匹敵するものとなる、すなわちハプテン
分子はその時免疫応答を誘発し得る。
【００５７】免疫感作反応の間に形成される抗体のいく
つかは、ハプテン分子がそれ自体の上にあるか、または
担体分子に結合されたままであるかにかかわらず、次に
ハプテン分子上の特定のエピトープと反応し得る。
つかは、ハプテン分子がそれ自体の上にあるか、または
担体分子に結合されたままであるかにかかわらず、次に
ハプテン分子上の特定のエピトープと反応し得る。
【００５８】以下に頻繁に使用されるハプテンという用
語は本発明の範囲内で、免疫感作に使用されるトリアス
ルフロン分子またはそれらの一部を主として意味するも
のと理解されるべきである。
語は本発明の範囲内で、免疫感作に使用されるトリアス
ルフロン分子またはそれらの一部を主として意味するも
のと理解されるべきである。
【００５９】従って、本発明の範囲内で、実験動物が免
疫感作される前に、ハプテンとして作用する標的物質
は、ハプテンとして作用する該標的物質に完全抗原の活
性を付与するのに適当である高分子量担体に結合され
る。
疫感作される前に、ハプテンとして作用する標的物質
は、ハプテンとして作用する該標的物質に完全抗原の活
性を付与するのに適当である高分子量担体に結合され
る。
【００６０】本発明の範囲内で適当な担体分子は主とし
て、ハプテンとの連結反応に自由に利用され得る反応基
を有し、そして該ハプテンに連結されることによりそれ
に免疫原性を付与し得るか、または既に存在するそれら
の免疫原性を高め得る巨大分子化合物であると理解され
るべきである。
て、ハプテンとの連結反応に自由に利用され得る反応基
を有し、そして該ハプテンに連結されることによりそれ
に免疫原性を付与し得るか、または既に存在するそれら
の免疫原性を高め得る巨大分子化合物であると理解され
るべきである。
【００６１】自由に利用可能な反応性アミノ基を含む巨
大分子化合物が本発明の範囲内で特に好ましい。
大分子化合物が本発明の範囲内で特に好ましい。
【００６２】分子量が１００００と１５０００００の間
のリシンに富むタンパク質、例えば市販のものが入手さ
れ得、それ故にあらゆる所望量で利用できるウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ：分子量６６２００）、ヒト血清アル
ブミン（ＨＳＡ：分子量５８０００）、またはキーホー
ルカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ：分子量＞１００００
００）が本発明に係る使用に適した担体分子として特に
好ましい。
のリシンに富むタンパク質、例えば市販のものが入手さ
れ得、それ故にあらゆる所望量で利用できるウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ：分子量６６２００）、ヒト血清アル
ブミン（ＨＳＡ：分子量５８０００）、またはキーホー
ルカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ：分子量＞１００００
００）が本発明に係る使用に適した担体分子として特に
好ましい。
【００６３】その他の巨大分子化合物が上記の要求に合
致しさえすれば、それらを担体分子として使用すること
は本発明の範囲内でもちろん可能であり、そのような化
合物には例えばブタチログロブリン、Ｂ２ミクログロブ
リン、ヘモシアニン、免疫グロブリン、毒素（コレラ毒
素、破傷風毒素、ジフテリア毒素その他）、多糖、リポ
多糖、天然または合成ポリアデニル酸およびポリウリジ
ル酸、ポリアラニルおよびポリリシンポリペプチド、ま
たは細胞膜成分例えばホルマリンまたはグルタルアルデ
ヒド処理赤血球細胞膜がある。
致しさえすれば、それらを担体分子として使用すること
は本発明の範囲内でもちろん可能であり、そのような化
合物には例えばブタチログロブリン、Ｂ２ミクログロブ
リン、ヘモシアニン、免疫グロブリン、毒素（コレラ毒
素、破傷風毒素、ジフテリア毒素その他）、多糖、リポ
多糖、天然または合成ポリアデニル酸およびポリウリジ
ル酸、ポリアラニルおよびポリリシンポリペプチド、ま
たは細胞膜成分例えばホルマリンまたはグルタルアルデ
ヒド処理赤血球細胞膜がある。
【００６４】例えば、文献
〔９〕に記載された方法に従
ってウサギからのマウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対する精製
またはＩｇＧ画分も同様に本発明に係る方法において担
体分子として使用するのに適当である。
ってウサギからのマウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対する精製
またはＩｇＧ画分も同様に本発明に係る方法において担
体分子として使用するのに適当である。
【００６５】担体分子に対するハプテンの複合は直接、
または好ましくは適当である場合にハプテン分子に最初
に付加されるスペーサー断片を介して行われ得る。
または好ましくは適当である場合にハプテン分子に最初
に付加されるスペーサー断片を介して行われ得る。
【００６６】分析すべき物質の担体分子への連結は、標
的物質の関連構造成分が自由に利用可能のままであり、
そしてそれ故に特異的な免疫応答を誘発し得る、すなわ
ち特異的な抗体の産生を誘導するような方法で行われな
ければならない。従って、スルホニル尿素誘導体、特に
トリアスルフロン誘導体の製造において、それらの構造
成分が保持されるように留意されなければならない。
的物質の関連構造成分が自由に利用可能のままであり、
そしてそれ故に特異的な免疫応答を誘発し得る、すなわ
ち特異的な抗体の産生を誘導するような方法で行われな
ければならない。従って、スルホニル尿素誘導体、特に
トリアスルフロン誘導体の製造において、それらの構造
成分が保持されるように留意されなければならない。
【００６７】本発明の範囲内で、誘発されるべき特異的
免疫応答のために、全体のそのままのスルホニル尿素分
子の存在することが必須ではなくて、該分子の選択され
た断片も優れた結果を導き、そして生成する抗体の親和
性に関し最終的にはより良い結果を導くことが驚くべき
ことに今見出された。例えば、スルホニル尿素類の除草
剤に対して高度の親和性および選択性を有するモノクロ
ーナル抗体は、スルホンアミド部分、尿素橋および複素
環部分からなる複雑な全体の分子ではなく、スルホンア
ミド部分を連結性成分として排他的に用い、そのスルホ
ンアミド部分を上記したように適当な担体分子に連結し
て製造され得る。それは、前記分子の断片が非常に複雑
な全体の分子に比べより取扱いが容易であるから、技術
的な面から大きな利点である。
免疫応答のために、全体のそのままのスルホニル尿素分
子の存在することが必須ではなくて、該分子の選択され
た断片も優れた結果を導き、そして生成する抗体の親和
性に関し最終的にはより良い結果を導くことが驚くべき
ことに今見出された。例えば、スルホニル尿素類の除草
剤に対して高度の親和性および選択性を有するモノクロ
ーナル抗体は、スルホンアミド部分、尿素橋および複素
環部分からなる複雑な全体の分子ではなく、スルホンア
ミド部分を連結性成分として排他的に用い、そのスルホ
ンアミド部分を上記したように適当な担体分子に連結し
て製造され得る。それは、前記分子の断片が非常に複雑
な全体の分子に比べより取扱いが容易であるから、技術
的な面から大きな利点である。
【００６８】本発明の範囲内で示されたように、１種の
慣用の高分子量担体とスルホニル尿素除草剤のスルホン
アミド部分とからなる上記複合体での供与動物の免疫感
作は高度に特異的な抗体の産生を生じ、最終的には、連
結性成分として全体の分子が使用された場合に比べ、特
定の標的分子に対して遙に高度の親和性を概して有する
モノクローナル抗体の産生を可能にする。
慣用の高分子量担体とスルホニル尿素除草剤のスルホン
アミド部分とからなる上記複合体での供与動物の免疫感
作は高度に特異的な抗体の産生を生じ、最終的には、連
結性成分として全体の分子が使用された場合に比べ、特
定の標的分子に対して遙に高度の親和性を概して有する
モノクローナル抗体の産生を可能にする。
【００６９】本発明の重要な面は、従って、供与動物の
免疫感作に使用され得、そしてスルホニル尿素除草剤に
対して高度の親和性を有するモノクローナル抗体の産生
を最終的に導く複合体製造用の前記除草剤のスルホンア
ミド部分の使用である。前記スルホンアミド部分は好ま
しくは置換アリールスルホニルであり、そのアリール基
は通常フェニル基、ピリジル基、チエニル基またはピラ
ゾリル基である。スルホニル尿素除草剤の典型的な例
は、例えばＥＰ０１５８６００およびＥＰ０３６７８８
７並びにそれらに参照された文献中に記載されている。
免疫感作に使用され得、そしてスルホニル尿素除草剤に
対して高度の親和性を有するモノクローナル抗体の産生
を最終的に導く複合体製造用の前記除草剤のスルホンア
ミド部分の使用である。前記スルホンアミド部分は好ま
しくは置換アリールスルホニルであり、そのアリール基
は通常フェニル基、ピリジル基、チエニル基またはピラ
ゾリル基である。スルホニル尿素除草剤の典型的な例
は、例えばＥＰ０１５８６００およびＥＰ０３６７８８
７並びにそれらに参照された文献中に記載されている。
【００７０】それ故に本発明の好ましい実施態様におい
て、担体分子に連結される全体のトリアスルフロン分子
でなく、非常に特異的な免疫応答を誘発する形態にある
特に望ましい決定基を含む上記分子の選択された部分で
ある。トリアスルフロンのスルホンアミド部分に限定さ
れたままであるトリアスルフロン断片が本発明の範囲内
で特に好ましい。
て、担体分子に連結される全体のトリアスルフロン分子
でなく、非常に特異的な免疫応答を誘発する形態にある
特に望ましい決定基を含む上記分子の選択された部分で
ある。トリアスルフロンのスルホンアミド部分に限定さ
れたままであるトリアスルフロン断片が本発明の範囲内
で特に好ましい。
【００７１】上記スルホンアミド部分は、例えば、相当
するスルホニル尿素除草剤をそれ自体公知の方法により
スルホンアミド官能部分で加水分解的に切断することに
より得られる。従って、そのようにして得られるスルホ
ンアミド連結性断片は−ＳＯ2 ＮＨ2 末端基を有し、次
いで該末端基には、ハプテン分子の引き続く複合に使用
され得る適当なスペーサー断片を連結することが極めて
容易である。スペーサー断片の連結は、例えば、上記−
ＳＯ2 ＮＨ2 基を反応性カルボン酸誘導体例えばコハク
酸誘導体、または相当する無水物と反応させることによ
り達成され得る。コハク酸誘導体が使用される場合、基
−ＳＯ2 ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＯＯＨが工程
中に形成される。反応は好ましくは塩基性媒体中、特に
適当な触媒、例えば実施例１．２で使用される１，８−
ジアザビシクロ〔５．４．０〕ウンデセ−７−エンの存
在下で行われる。
するスルホニル尿素除草剤をそれ自体公知の方法により
スルホンアミド官能部分で加水分解的に切断することに
より得られる。従って、そのようにして得られるスルホ
ンアミド連結性断片は−ＳＯ2 ＮＨ2 末端基を有し、次
いで該末端基には、ハプテン分子の引き続く複合に使用
され得る適当なスペーサー断片を連結することが極めて
容易である。スペーサー断片の連結は、例えば、上記−
ＳＯ2 ＮＨ2 基を反応性カルボン酸誘導体例えばコハク
酸誘導体、または相当する無水物と反応させることによ
り達成され得る。コハク酸誘導体が使用される場合、基
−ＳＯ2 ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＯＯＨが工程
中に形成される。反応は好ましくは塩基性媒体中、特に
適当な触媒、例えば実施例１．２で使用される１，８−
ジアザビシクロ〔５．４．０〕ウンデセ−７−エンの存
在下で行われる。
【００７２】カルボキシ末端基はまた、文献に頻繁に記
載されている公知方法を用いて、ハプテン分子を連結す
るには十分な反応性を同様に有するアミノ基（ＮＨ2 ）
またはＳＨ基に変換され得る。
載されている公知方法を用いて、ハプテン分子を連結す
るには十分な反応性を同様に有するアミノ基（ＮＨ2 ）
またはＳＨ基に変換され得る。
【００７３】それ故に特に、ハプテンの担体分子への複
合のための適当なスペーサー断片は担体分子の自由に利
用可能な反応基と相互作用し得る少なくとも１種または
それ以上の反応基を含む化合物である。
合のための適当なスペーサー断片は担体分子の自由に利
用可能な反応基と相互作用し得る少なくとも１種または
それ以上の反応基を含む化合物である。
【００７４】２個と１０個の間の架橋性炭素原子を含
み、そして反応基として１個またはそれ以上の反応基例
えばアミノ基、カルボキシル基またはＳＨ基を有するス
ペーサー断片を使用することが本発明の範囲内で特に好
ましい。これらの反応基はそれ自体公知の方法を用いて
ハプテンおよび担体分子の反応基と反応してハプテン−
担体複合体を形成し得る。
み、そして反応基として１個またはそれ以上の反応基例
えばアミノ基、カルボキシル基またはＳＨ基を有するス
ペーサー断片を使用することが本発明の範囲内で特に好
ましい。これらの反応基はそれ自体公知の方法を用いて
ハプテンおよび担体分子の反応基と反応してハプテン−
担体複合体を形成し得る。
【００７５】例えば、スペーサー断片を反応性アミノ基
を介してジアルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）に
より担体分子の遊離アミノ基の一つに結合することも可
能である。スペーサー断片が反応性ＳＨ基を有する場
合、ハプテンの担体分子への複合は担体上の遊離ＳＨ基
を含めた酸化により行われ得る。
を介してジアルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）に
より担体分子の遊離アミノ基の一つに結合することも可
能である。スペーサー断片が反応性ＳＨ基を有する場
合、ハプテンの担体分子への複合は担体上の遊離ＳＨ基
を含めた酸化により行われ得る。
【００７６】担体分子の遊離アミノ基に水結合性剤、例
えばカルボジイミド、好ましくはＮ，Ｎ’−ジシクロヘ
キシルカルボジイミドによって連結され得るカルボキシ
ル基を有するスペーサー断片を使用することが本発明の
範囲内で特に好ましい。
えばカルボジイミド、好ましくはＮ，Ｎ’−ジシクロヘ
キシルカルボジイミドによって連結され得るカルボキシ
ル基を有するスペーサー断片を使用することが本発明の
範囲内で特に好ましい。
【００７７】抗原を担体タンパク質に連結するために、
その連結を起こし得る誘導体を製造することがまず有利
である。
その連結を起こし得る誘導体を製造することがまず有利
である。
【００７８】本発明の特定の実施態様において、全体の
そのままのスルホニル尿素分子が、供与動物の免疫感作
の後に特異的免疫応答および最終的に式（Ａ）で表され
るスルホニル尿素除草剤に対するモノクローナル抗体の
産生を導く複合体の製造のために使用される。
そのままのスルホニル尿素分子が、供与動物の免疫感作
の後に特異的免疫応答および最終的に式（Ａ）で表され
るスルホニル尿素除草剤に対するモノクローナル抗体の
産生を導く複合体の製造のために使用される。
【００７９】本発明の範囲内で連結性成分として使用さ
れ得るトリアスルフロン誘導体はそれ故に特に次式
（Ａ）：
れ得るトリアスルフロン誘導体はそれ故に特に次式
（Ａ）：
【化８】 （式中、ｎが１ないし１０、好ましくは１ないし６の整
数である場合、ＲはＣＯＯＨを表し、そしてｎが２ない
し１０、好ましくは１ないし６の整数である場合、Ｒは
ＣＯＯＨ、ＮＨ2 またはＳＨを表す）で表されるトリア
ジン環の４位にＲ−（ＣＨ2 ）n −Ｏ−基を有する化合
物である。
数である場合、ＲはＣＯＯＨを表し、そしてｎが２ない
し１０、好ましくは１ないし６の整数である場合、Ｒは
ＣＯＯＨ、ＮＨ2 またはＳＨを表す）で表されるトリア
ジン環の４位にＲ−（ＣＨ2 ）n −Ｏ−基を有する化合
物である。
【００８０】しかしながら、驚くべきことに、式（Ａ）
で表される複雑な分子の代わりに、式（Ｂ）で表される
かなり単純な断片が連結性成分として使用され得ること
が見出された。
で表される複雑な分子の代わりに、式（Ｂ）で表される
かなり単純な断片が連結性成分として使用され得ること
が見出された。
【００８１】それ故に、本発明の好ましい実施態様にお
いて、供与動物の免疫感作の後に特異的免疫応答および
最終的に式（Ａ）で表されるスルホニル尿素除草剤に対
する高度の親和性を有するモノクローナル抗体の産生を
導く複合体の製造のために、該スルホニル尿素除草剤の
スルホンアミド部分が使用される。スルホンアミド部分
をより安定な断片（Ｂ）に変換することにより、式
（Ａ）で表されるスルホニル尿素除草剤に対する高度の
親和性を有するモノクローナル抗体に極めて適している
ほぼ理想的な連結性成分が得られる。
いて、供与動物の免疫感作の後に特異的免疫応答および
最終的に式（Ａ）で表されるスルホニル尿素除草剤に対
する高度の親和性を有するモノクローナル抗体の産生を
導く複合体の製造のために、該スルホニル尿素除草剤の
スルホンアミド部分が使用される。スルホンアミド部分
をより安定な断片（Ｂ）に変換することにより、式
（Ａ）で表されるスルホニル尿素除草剤に対する高度の
親和性を有するモノクローナル抗体に極めて適している
ほぼ理想的な連結性成分が得られる。
【００８２】次式（Ｂ）：
【化９】 （式中、Ｒ’はＣＯＯＨ、ＮＨ2 またはＳＨを表し、そ
してｎは１ないし１０、好ましくは１ないし６の整数を
表す）で表されるトリアスルフロン断片が特に好まし
く、そしてこのようにスルホンアミド部分に限定されて
いる。
してｎは１ないし１０、好ましくは１ないし６の整数を
表す）で表されるトリアスルフロン断片が特に好まし
く、そしてこのようにスルホンアミド部分に限定されて
いる。
【００８３】下に詳細に記載されるように４段階工程で
製造され得る式（ＩＶ）で表されるトリアスルフロン誘
導体が本発明の範囲内で好ましい。その工程で使用され
得る出発化合物および反応体は公知であるか、または公
知の構造的に類似の化合物と同様に製造され得る。トリ
アジン基の−（ＣＨ2 ）（ＣＨ2 ）ＣＯＯＨ基への置換
により形成されたものと考えられる式（Ｖ）で表される
トリアスルフロン誘導体が本発明の範囲内で特に好まし
い。
製造され得る式（ＩＶ）で表されるトリアスルフロン誘
導体が本発明の範囲内で好ましい。その工程で使用され
得る出発化合物および反応体は公知であるか、または公
知の構造的に類似の化合物と同様に製造され得る。トリ
アジン基の−（ＣＨ2 ）（ＣＨ2 ）ＣＯＯＨ基への置換
により形成されたものと考えられる式（Ｖ）で表される
トリアスルフロン誘導体が本発明の範囲内で特に好まし
い。
【００８４】連結し得る生成トリアスルフロン誘導体は
新規であり、そしてそれらの特異的連結能力のために、
トリアスルフロン特異性を有するモノクローナル抗体製
造における重要な出発材料である。それ故に、それらは
本発明の重要な一部を構成する。
新規であり、そしてそれらの特異的連結能力のために、
トリアスルフロン特異性を有するモノクローナル抗体製
造における重要な出発材料である。それ故に、それらは
本発明の重要な一部を構成する。
【００８５】実際の連結反応は活性エステル法またはジ
アゾニウム法〔１０〕を用いて行われるのが好ましい。
活性エステル法が使用される場合、トリアスルフロン誘
導体は最初に適当な溶媒中に可溶化される。適当な溶媒
は特に、低い蒸発率を有する非プロトン性溶媒、例えば
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。
アゾニウム法〔１０〕を用いて行われるのが好ましい。
活性エステル法が使用される場合、トリアスルフロン誘
導体は最初に適当な溶媒中に可溶化される。適当な溶媒
は特に、低い蒸発率を有する非プロトン性溶媒、例えば
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。
【００８６】予め可溶化されたトリアスルフロン誘導体
を例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキ
シスルホスクシンイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル
カルボジイミドもしくはＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダ
ゾールまたはこれら化合物の誘導体と反応させることに
より、カルボキシル基が次に誘導されて活性エステルを
形成する。
を例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキ
シスルホスクシンイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル
カルボジイミドもしくはＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダ
ゾールまたはこれら化合物の誘導体と反応させることに
より、カルボキシル基が次に誘導されて活性エステルを
形成する。
【００８７】活性エステルを次に反応混合物から取り出
し、そしてＢＳＡまたはＫＬＨに添加する。０．１ない
し１２時間、好ましくは３ないし５時間保温した後、沈
殿を除去する。上澄みは次いで、必要ならばさらに精製
段階を挿入した後、実際の免疫感作反応に使用され得
る。
し、そしてＢＳＡまたはＫＬＨに添加する。０．１ない
し１２時間、好ましくは３ないし５時間保温した後、沈
殿を除去する。上澄みは次いで、必要ならばさらに精製
段階を挿入した後、実際の免疫感作反応に使用され得
る。
【００８８】本発明の範囲内で好ましい活性エステル法
の他に、ハプテンの担体分子への連結のためのその他の
方法、例えば混合無水物法を用いることも可能である。
この方法においてスペーサー断片のカルボキシル基は無
水酢酸またはカルボジイミド誘導体１−エチル−３−
（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを用
いて担体分子に連結される。
の他に、ハプテンの担体分子への連結のためのその他の
方法、例えば混合無水物法を用いることも可能である。
この方法においてスペーサー断片のカルボキシル基は無
水酢酸またはカルボジイミド誘導体１−エチル−３−
（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを用
いて担体分子に連結される。
【００８９】誘導体の連結が反応性ＮＨ2 基を介して起
こるならば、文献〔１０〕に記載のジアゾニウム法を用
いることが好ましい。
こるならば、文献〔１０〕に記載のジアゾニウム法を用
いることが好ましい。
【００９０】その方法において、亜硝酸ナトリウムが相
当する反応性ＮＨ2基に、好ましくは低下させた温度、
特に約０℃の温度で、強酸性溶液中で添加される。生成
するジアゾニウム塩は次に担体分子の緩衝化塩基性溶液
にゆっくり添加される。さらに精製段階の後、溶液は実
際の免疫感作に使用され得る。
当する反応性ＮＨ2基に、好ましくは低下させた温度、
特に約０℃の温度で、強酸性溶液中で添加される。生成
するジアゾニウム塩は次に担体分子の緩衝化塩基性溶液
にゆっくり添加される。さらに精製段階の後、溶液は実
際の免疫感作に使用され得る。
【００９１】供与動物の免疫感作は、高分子量の担体分
子に結合されたハプテンの１回またはそれ以上の投与に
より行われる。７ないし３０日、特に１２ないし１６日
間隔で２または３回の投与が特に好ましい。
子に結合されたハプテンの１回またはそれ以上の投与に
より行われる。７ないし３０日、特に１２ないし１６日
間隔で２または３回の投与が特に好ましい。
【００９２】静脈内、腹膜腔内もしくは皮下に行われ得
る注射が本発明の範囲内での好ましい投与形態である。
皮下注射と腹膜腔内注射との組合せが好ましい。この場
合に抗原（トリアスルフロン複合体）は適当な緩衝液、
例えば慣用のアジュバントの１種を含有するＰＢＳ緩衝
液中に存在する。フロイントのアジュバントを使用する
ことが本発明の範囲内で特に好ましい。
る注射が本発明の範囲内での好ましい投与形態である。
皮下注射と腹膜腔内注射との組合せが好ましい。この場
合に抗原（トリアスルフロン複合体）は適当な緩衝液、
例えば慣用のアジュバントの１種を含有するＰＢＳ緩衝
液中に存在する。フロイントのアジュバントを使用する
ことが本発明の範囲内で特に好ましい。
【００９３】０．５ないし４ヵ月間処置せずに放置した
後、１００μｇないし１０００μｇ、特に５０μｇない
し５００μｇの投与量でもう１回の投与が行われる。
後、１００μｇないし１０００μｇ、特に５０μｇない
し５００μｇの投与量でもう１回の投与が行われる。
【００９４】最後の投与の１ないし６日後に供与動物は
殺され、そして脾臓細胞懸濁液が調製される。
殺され、そして脾臓細胞懸濁液が調製される。
【００９５】単離された脾臓細胞は適当な緩衝液（例え
ばＢＳＳ緩衝液）中に懸濁され、そしてそれらが適当な
ミエローマ細胞と融合されるまで細胞懸濁液の形態で保
存される。
ばＢＳＳ緩衝液）中に懸濁され、そしてそれらが適当な
ミエローマ細胞と融合されるまで細胞懸濁液の形態で保
存される。
【００９６】これらの融合は、ミエローマ細胞系もまた
モノクローナル抗体を合成し、結果としてハイブリッド
は２種のモノクローナル抗体、１つはミエローマ細胞に
由来し、第２は免疫適格細胞の遺伝情報により決定され
る、という事実により最初は複雑だった。
モノクローナル抗体を合成し、結果としてハイブリッド
は２種のモノクローナル抗体、１つはミエローマ細胞に
由来し、第２は免疫適格細胞の遺伝情報により決定され
る、という事実により最初は複雑だった。
【００９７】従って、本発明の範囲内で好ましく使用さ
れる腫瘍細胞はそれ自体モノクローナル抗体を産生でき
ないもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４〔１７〕、Ｘ６
３−Ａｇ８．６５３またはＰＡＩ〔１８〕であり、これ
らは生成する融合物の分析を極めて単純にする。脾臓細
胞がミエローマ細胞に対して２ないし２０倍過剰に存在
するならば融合の成功のために有利である。
れる腫瘍細胞はそれ自体モノクローナル抗体を産生でき
ないもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４〔１７〕、Ｘ６
３−Ａｇ８．６５３またはＰＡＩ〔１８〕であり、これ
らは生成する融合物の分析を極めて単純にする。脾臓細
胞がミエローマ細胞に対して２ないし２０倍過剰に存在
するならば融合の成功のために有利である。
【００９８】脾臓細胞とミエローマ細胞との融合は意図
される細胞融合に最適である条件を提示する組成を有す
る特別な融合培地中で行われる。
される細胞融合に最適である条件を提示する組成を有す
る特別な融合培地中で行われる。
【００９９】該融合培地は、細胞を融合するために慣用
の融合促進剤の一つ、例えば適当である場合には紫外線
不活性の形態にあるセンダイウイルスまたはその他のパ
ラミクソウイルス、カルシウムイオン、表面活性脂質例
えばリゾレシチン、またはポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）特に平均分子量６００ないし６０００で濃度が３
０％ないし６０％のＰＥＧを含有する緩衝液が好まし
い。４０％ないし５０％のＰＥＧ濃度が特に好ましい。
最適融合温度は１８℃と３９℃の間である。３７℃の温
度が特に好ましい。
の融合促進剤の一つ、例えば適当である場合には紫外線
不活性の形態にあるセンダイウイルスまたはその他のパ
ラミクソウイルス、カルシウムイオン、表面活性脂質例
えばリゾレシチン、またはポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）特に平均分子量６００ないし６０００で濃度が３
０％ないし６０％のＰＥＧを含有する緩衝液が好まし
い。４０％ないし５０％のＰＥＧ濃度が特に好ましい。
最適融合温度は１８℃と３９℃の間である。３７℃の温
度が特に好ましい。
【０１００】免疫適格脾臓細胞とミエローマ細胞との融
合の後、融合された抗体産生ハイブリッド細胞はそれ自
体公知の方法により選択される。融合が成功したもの
（ハイブリッド細胞）を２種の親細胞から選択するため
の種々の手段が存在する。１００万またはそれ以上の各
親細胞が融合プロトコルにおいて通常使用されている。
融合率が１００％でないから、大過剰の未融合または自
己融合細胞から融合物を分離することは困難な仕事であ
るかもしれない。
合の後、融合された抗体産生ハイブリッド細胞はそれ自
体公知の方法により選択される。融合が成功したもの
（ハイブリッド細胞）を２種の親細胞から選択するため
の種々の手段が存在する。１００万またはそれ以上の各
親細胞が融合プロトコルにおいて通常使用されている。
融合率が１００％でないから、大過剰の未融合または自
己融合細胞から融合物を分離することは困難な仕事であ
るかもしれない。
【０１０１】上記したように、ハイブリドーマ細胞は短
寿命の抗体産生（脾臓）Ｂ細胞と長寿命のミエローマ細
胞の融合により製造される。
寿命の抗体産生（脾臓）Ｂ細胞と長寿命のミエローマ細
胞の融合により製造される。
【０１０２】所望の結果は抗体を産生する長寿命の細胞
系である。脾臓細胞は培養液中では限られた寿命を有す
るから、未融合または自己融合脾臓細胞が死滅するまで
ただ待つことは原理的には可能である。しかしながら、
この後に、抗体を産生しない長寿命の細胞から長寿命の
抗体産生細胞を分離する仕事が残っている。実行可能な
選択系は酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）が利用可能かまたは
利用不可能かに基づいている。この酵素は哺乳類細胞中
のプリン再利用経路の構成要素である。これらの細胞は
またさらにプリンを新たに合成することができる。
系である。脾臓細胞は培養液中では限られた寿命を有す
るから、未融合または自己融合脾臓細胞が死滅するまで
ただ待つことは原理的には可能である。しかしながら、
この後に、抗体を産生しない長寿命の細胞から長寿命の
抗体産生細胞を分離する仕事が残っている。実行可能な
選択系は酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）が利用可能かまたは
利用不可能かに基づいている。この酵素は哺乳類細胞中
のプリン再利用経路の構成要素である。これらの細胞は
またさらにプリンを新たに合成することができる。
【０１０３】通常の環境中ではおそらく両方の合成経路
はある範囲まで平行に作用する。しかしながら、細胞が
ＨＧＰＲＴを有しない場合、再利用経路はブロックさ
れ、そしてプリンは非プリン物質から製造されなければ
ならない。プリンであるグアニンに非常に類似の構造を
有し、それ故にいくつかの通常の反応においてプリンを
代替する８−アザグアニンのようないわゆるプリン抗代
謝物質が、ＨＧＰＲＴ陰性のミエローマ細胞の選択のた
めに一般に使用される。
はある範囲まで平行に作用する。しかしながら、細胞が
ＨＧＰＲＴを有しない場合、再利用経路はブロックさ
れ、そしてプリンは非プリン物質から製造されなければ
ならない。プリンであるグアニンに非常に類似の構造を
有し、それ故にいくつかの通常の反応においてプリンを
代替する８−アザグアニンのようないわゆるプリン抗代
謝物質が、ＨＧＰＲＴ陰性のミエローマ細胞の選択のた
めに一般に使用される。
【０１０４】アザグアニンがＤＮＡ中に取り込まれる
と、それは通常の成長反応に関与し、最終的に細胞の死
を導く。アザグアニンは再利用経路を介して置換されな
ければならないから、ＨＧＰＲＴ活性を有しないそれら
全ての細胞はアザグアニンを利用することができず、そ
れ故にその存在下で成長する。
と、それは通常の成長反応に関与し、最終的に細胞の死
を導く。アザグアニンは再利用経路を介して置換されな
ければならないから、ＨＧＰＲＴ活性を有しないそれら
全ての細胞はアザグアニンを利用することができず、そ
れ故にその存在下で成長する。
【０１０５】同じ酵素に作用するが、しかし反対の徴候
を示す選択系はジェイ．ダブリュ．リトルフィールドに
より報告されている〔１３〕が、この場合にはＨＧＰＲ
Ｔ陽性細胞が選択される。
を示す選択系はジェイ．ダブリュ．リトルフィールドに
より報告されている〔１３〕が、この場合にはＨＧＰＲ
Ｔ陽性細胞が選択される。
【０１０６】この選択系は、特にヒポキサンチン、アミ
ノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）を構成要素と
して含有するいわゆるＨＡＴ培地の使用に基づいてい
る。アミノプテリンは生体内でのプリン合成ならびにデ
オキシウリジレートのチミジレートへのメチル化を阻害
する抗代謝物質である。ヒポキサンチンはアミノプテリ
ンが新たなプリン合成を阻害し、一方でチミジンが不要
なデオキシウリジレートのメチル化を行う場合における
別のプリンとして作用し得る。従って、アミノプテリン
の存在下では全てのＨＧＰＲＴ陽性細胞が増殖し、一方
ＨＧＰＲＴ陰性細胞が死滅するであろう。
ノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）を構成要素と
して含有するいわゆるＨＡＴ培地の使用に基づいてい
る。アミノプテリンは生体内でのプリン合成ならびにデ
オキシウリジレートのチミジレートへのメチル化を阻害
する抗代謝物質である。ヒポキサンチンはアミノプテリ
ンが新たなプリン合成を阻害し、一方でチミジンが不要
なデオキシウリジレートのメチル化を行う場合における
別のプリンとして作用し得る。従って、アミノプテリン
の存在下では全てのＨＧＰＲＴ陽性細胞が増殖し、一方
ＨＧＰＲＴ陰性細胞が死滅するであろう。
【０１０７】本発明の範囲内での選択のために使用され
るハイブリッド系において、ミエローマ細胞はアザグア
ニンに対して耐性であり、アミノプテリンに対して感受
性である、すなわちそれらがＨＧＰＲＴ陰性であること
が好ましい。抗体産生細胞はこれに対してＨＧＰＲＴ陽
性である。
るハイブリッド系において、ミエローマ細胞はアザグア
ニンに対して耐性であり、アミノプテリンに対して感受
性である、すなわちそれらがＨＧＰＲＴ陰性であること
が好ましい。抗体産生細胞はこれに対してＨＧＰＲＴ陽
性である。
【０１０８】細胞の融合およびＨＡＴ培地中での培養に
より、増殖に関与するミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ活性
の存在下でのみ成長し、そしてこの活性はＨＧＰＲＴ陽
性細胞系により提供されるはずであるから、成功裏に融
合した細胞を選択することは可能である。
より、増殖に関与するミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ活性
の存在下でのみ成長し、そしてこの活性はＨＧＰＲＴ陽
性細胞系により提供されるはずであるから、成功裏に融
合した細胞を選択することは可能である。
【０１０９】ＨＧＰＲＴ陽性抗体産生細胞系がこの培地
中で死滅しないことは真実である。しかしながら、それ
らはある一定の期間だけ生き残り、そして増殖すること
ができない。
中で死滅しないことは真実である。しかしながら、それ
らはある一定の期間だけ生き残り、そして増殖すること
ができない。
【０１１０】ＨＡＴ培地中での細胞の融合は、ミエロー
マ細胞と抗体産生細胞とはハイブリッド細胞の製造に十
分である期間成長することができるが、ハイブリッド細
胞だけが生き残り、そして増殖し得る系を提供する。
マ細胞と抗体産生細胞とはハイブリッド細胞の製造に十
分である期間成長することができるが、ハイブリッド細
胞だけが生き残り、そして増殖し得る系を提供する。
【０１１１】本発明の特定の実施態様において、融合さ
れたハイブリッド細胞は、未処理の非免疫感作実験動物
の腹膜から予め単離されたマクロファージ、いわゆる食
細胞の存在下で培養される。融合されたハイブリッド細
胞の培養および選択のために、細胞懸濁液は少量ずつい
くつかに分けられ、そして個々の部分がハイブリッド細
胞培養物の開発および抗体の産生のために連続的に調べ
られる。
れたハイブリッド細胞は、未処理の非免疫感作実験動物
の腹膜から予め単離されたマクロファージ、いわゆる食
細胞の存在下で培養される。融合されたハイブリッド細
胞の培養および選択のために、細胞懸濁液は少量ずつい
くつかに分けられ、そして個々の部分がハイブリッド細
胞培養物の開発および抗体の産生のために連続的に調べ
られる。
【０１１２】ミクロタイタープレート上で融合ハイブリ
ッド細胞を培養することが本発明の範囲内で特に好まし
い。
ッド細胞を培養することが本発明の範囲内で特に好まし
い。
【０１１３】これは、ミクロタイタープレートの個々の
ウエルにわたり分配され、そして融合ハイブリッド細胞
の成長を促進する適当な条件下（例えばＨＡＴ／ＨＴ培
地）で７ないし３０日の期間培養される融合の後に得ら
れる細胞懸濁液を必要とする。成長したハイブリッド培
養物の上澄みは抗体の産生を連続的に調べる。
ウエルにわたり分配され、そして融合ハイブリッド細胞
の成長を促進する適当な条件下（例えばＨＡＴ／ＨＴ培
地）で７ないし３０日の期間培養される融合の後に得ら
れる細胞懸濁液を必要とする。成長したハイブリッド培
養物の上澄みは抗体の産生を連続的に調べる。
【０１１４】陽性ハイブリッド細胞培養物は次に公知の
方法、好ましくは限界希釈法を用いて選び出され、そし
て引続き適当な培養培地中でクローン化される。成長し
た細胞クローンからの上澄みも同様に抗体の産生を調べ
る。
方法、好ましくは限界希釈法を用いて選び出され、そし
て引続き適当な培養培地中でクローン化される。成長し
た細胞クローンからの上澄みも同様に抗体の産生を調べ
る。
【０１１５】上記のように製造された本発明に係るハイ
ブリドーマ細胞クローンは、好ましくはこの目的のため
に慣用のイムノアッセイの一つ、例えば酵素結合イムノ
アッセイまたはラジオイムノアッセイを用いて適当なモ
ノクローナル抗体の産生に対してスクリーニングされ
る。
ブリドーマ細胞クローンは、好ましくはこの目的のため
に慣用のイムノアッセイの一つ、例えば酵素結合イムノ
アッセイまたはラジオイムノアッセイを用いて適当なモ
ノクローナル抗体の産生に対してスクリーニングされ
る。
【０１１６】酵素結合イムノアッセイにおいて、上に詳
細に特徴づけたハプテン複合体をまず固体支持材に吸着
させる。担体分子を添加することにより残りの遊離結合
部位を次に飽和させ、それによりブロックする。
細に特徴づけたハプテン複合体をまず固体支持材に吸着
させる。担体分子を添加することにより残りの遊離結合
部位を次に飽和させ、それによりブロックする。
【０１１７】モノクローナル抗体を検出するために、上
記ハイブリドーマ細胞クローンの上澄みの一部を担体結
合ハプテン複合体と保温する。
記ハイブリドーマ細胞クローンの上澄みの一部を担体結
合ハプテン複合体と保温する。
【０１１８】本発明はさらに、本発明に係る抗体を合成
しそして好ましくは周囲の培地中にそれらを分泌する上
で詳細に特徴づけられた本発明に係るハイブリドーマ細
胞系またはそれらのクローンもしくはサブクローンが公
知の方法により試験管内または生体内で培養されること
を特徴とする、それ自体公知の方法を用いることによる
モノクローナル抗体の製造に関する。
しそして好ましくは周囲の培地中にそれらを分泌する上
で詳細に特徴づけられた本発明に係るハイブリドーマ細
胞系またはそれらのクローンもしくはサブクローンが公
知の方法により試験管内または生体内で培養されること
を特徴とする、それ自体公知の方法を用いることによる
モノクローナル抗体の製造に関する。
【０１１９】本発明に係るハイブリドーマ細胞の試験管
内培養は適当な培養培地、特に慣用の標準化培養培地例
えば適当である場合には哺乳類の血清、例えばウシ胎児
血清の添加、成長促進添加剤または微量成分により補足
されてもよいダルベッコの変形イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）またはＲＰＭＩ１６４０培地中で行われる。
内培養は適当な培養培地、特に慣用の標準化培養培地例
えば適当である場合には哺乳類の血清、例えばウシ胎児
血清の添加、成長促進添加剤または微量成分により補足
されてもよいダルベッコの変形イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）またはＲＰＭＩ１６４０培地中で行われる。
【０１２０】モノクローナル抗体の単離はハイブリドー
マ培養液の特定の上澄みからの免疫グロブリン画分の、
例えば硫酸アンモニウムを用いることによる沈殿で始め
るのが好ましい。次いで仕上げ、および当業者には公知
であり、例えばクロマトグラフィー法、例えばゲルろ
過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロー
スクロマトグラフィー、プロテインＡまたはイムノアフ
ィニティクロマトグラフィーの使用を包含する精製段階
を行う。
マ培養液の特定の上澄みからの免疫グロブリン画分の、
例えば硫酸アンモニウムを用いることによる沈殿で始め
るのが好ましい。次いで仕上げ、および当業者には公知
であり、例えばクロマトグラフィー法、例えばゲルろ
過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロー
スクロマトグラフィー、プロテインＡまたはイムノアフ
ィニティクロマトグラフィーの使用を包含する精製段階
を行う。
【０１２１】しかしながら、生体内法を用いて本発明に
係るモノクローナル抗体を大量に得ることをまた可能で
ある。
係るモノクローナル抗体を大量に得ることをまた可能で
ある。
【０１２２】従って、例えば、抗体産生ハイブリドーマ
細胞クローンを適当な哺乳類に注射することが可能であ
るが、これは処置動物中に抗体産生腫瘍の進展を誘導す
る。１ないし３週間の後、抗体はこの方法で処置された
動物の体液から単離され得る。
細胞クローンを適当な哺乳類に注射することが可能であ
るが、これは処置動物中に抗体産生腫瘍の進展を誘導す
る。１ないし３週間の後、抗体はこの方法で処置された
動物の体液から単離され得る。
【０１２３】本発明の特定の実施態様において、適当で
ある場合には炭化水素例えばプリスタンで前処理された
メスのＢａｌｂ／ｃマウスが本発明に係るハイブリドー
マ細胞クローンの腹膜腔内注射を受容する。ハイブリド
ーマ細胞クローンの注射の１なしい３週間後、腹水を集
め、そしてさらに処理するまで保存する。
ある場合には炭化水素例えばプリスタンで前処理された
メスのＢａｌｂ／ｃマウスが本発明に係るハイブリドー
マ細胞クローンの腹膜腔内注射を受容する。ハイブリド
ーマ細胞クローンの注射の１なしい３週間後、腹水を集
め、そしてさらに処理するまで保存する。
【０１２４】試験管内で培養されたハイブリドーマの上
澄みからの上記単離と同様の方法でモノクローナル抗体
を単離する。
澄みからの上記単離と同様の方法でモノクローナル抗体
を単離する。
【０１２５】トリアスルフロン誘導体のための上記方法
がその他のトリアスルフロン誘導体に対しても同様に適
用され得ることはもちろんである。
がその他のトリアスルフロン誘導体に対しても同様に適
用され得ることはもちろんである。
【０１２６】本発明はまた、土壌、空気または水の試料
中および適当である場合には植物またはその他の生体材
料からの抽出物中のスルホニル尿素除草剤の検出、特に
トリアスルフロンの検出のために、およびスルホニル尿
素除草剤特にトリアスルフロンを構造的に関連する化合
物特にプリミスルフロン、スルホメツロン−メチル、ト
リベヌロン−メチル、チアメツロン−メチル、クロロス
ルフロン、ベンスルフロン−メチル、メツスルフロン−
メチル、ニコスルフロン−メチルおよびＤＰＸ９６３６
からなる群から選択されるトリアスルフロン類似体と識
別するための通常のイムノアッセイの一つに本発明に係
る抗体を使用することに関する。
中および適当である場合には植物またはその他の生体材
料からの抽出物中のスルホニル尿素除草剤の検出、特に
トリアスルフロンの検出のために、およびスルホニル尿
素除草剤特にトリアスルフロンを構造的に関連する化合
物特にプリミスルフロン、スルホメツロン−メチル、ト
リベヌロン−メチル、チアメツロン−メチル、クロロス
ルフロン、ベンスルフロン−メチル、メツスルフロン−
メチル、ニコスルフロン−メチルおよびＤＰＸ９６３６
からなる群から選択されるトリアスルフロン類似体と識
別するための通常のイムノアッセイの一つに本発明に係
る抗体を使用することに関する。
【０１２７】本発明に係るモノクローナル抗体は従っ
て、抗原と相当するモノクローナル抗体との特異的結合
に基づいた全ての公知イムノアッセイ、例えばラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（エ
リザ）、免疫蛍光試験その他に使用され得る。
て、抗原と相当するモノクローナル抗体との特異的結合
に基づいた全ての公知イムノアッセイ、例えばラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（エ
リザ）、免疫蛍光試験その他に使用され得る。
【０１２８】本発明に係るモノクローナル抗体はＲＩＡ
試験における放射標識誘導体の形態で使用され得る。こ
れに関連して、本発明の範囲内に関する標的物質を検出
するためのＲＩＡ試験のこれまで公知の全ての変形、例
えば均質または固相でのＲＩＡ試験および抗原の直接ま
たは間接（競合）検出を伴う単一または二重（サンドイ
ッチ）ＲＩＡ試験を使用することも可能である。同様の
ことが酵素結合イムノアッセイの使用にも当てはまる。
試験における放射標識誘導体の形態で使用され得る。こ
れに関連して、本発明の範囲内に関する標的物質を検出
するためのＲＩＡ試験のこれまで公知の全ての変形、例
えば均質または固相でのＲＩＡ試験および抗原の直接ま
たは間接（競合）検出を伴う単一または二重（サンドイ
ッチ）ＲＩＡ試験を使用することも可能である。同様の
ことが酵素結合イムノアッセイの使用にも当てはまる。
【０１２９】トリアスルフロンを検出するための競合イ
ムノアッセイにおいて本発明に係るモノクローナル抗体
を使用することは本発明の範囲内で好ましい。
ムノアッセイにおいて本発明に係るモノクローナル抗体
を使用することは本発明の範囲内で好ましい。
【０１３０】競合イムノアッセイの原理は標識抗原また
は固体支持材に結合される抗原と、抗体分子上の関連結
合部位のための遊離抗原との競合に基づいている。
は固体支持材に結合される抗原と、抗体分子上の関連結
合部位のための遊離抗原との競合に基づいている。
【０１３１】原理的にその競合イムノアッセイを行う２
つの可能な方法がある： ａ）第１の方法は固体支持材に結合される抗原と標識が
施されている抗体上での遊離結合部位への遊離抗原との
競合に基づいている。これに関連して、固体支持材への
抗原の結合は直接、または担体分子を介して起こり得
る。この場合、遊離抗原の濃度は支持材上に固定された
抗原に結合される標識抗体中での減少を通じて決定され
る。この減少は試料中に含まれていた遊離抗原の量に比
例する。 ｂ）別の方法は遊離および標識抗原は、ある場合には固
体支持材に結合される抗体上の関連結合部位に対して互
いに競合するという事実に基づいている。抗原の濃度
は、遊離抗原の濃度の関数として変化する標識抗原中の
減少を通じて決定される。
つの可能な方法がある： ａ）第１の方法は固体支持材に結合される抗原と標識が
施されている抗体上での遊離結合部位への遊離抗原との
競合に基づいている。これに関連して、固体支持材への
抗原の結合は直接、または担体分子を介して起こり得
る。この場合、遊離抗原の濃度は支持材上に固定された
抗原に結合される標識抗体中での減少を通じて決定され
る。この減少は試料中に含まれていた遊離抗原の量に比
例する。 ｂ）別の方法は遊離および標識抗原は、ある場合には固
体支持材に結合される抗体上の関連結合部位に対して互
いに競合するという事実に基づいている。抗原の濃度
は、遊離抗原の濃度の関数として変化する標識抗原中の
減少を通じて決定される。
【０１３２】抗原または抗体の結合に適当である固体支
持材の例はミクロタイタープレートまたは試験管のプラ
スチック表面、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩
化ビニル、ガラスまたはプラスチック等からなるビーズ
表面、濾紙、デキストラン、セルロースもしくはニトロ
セルロースまたはその他の類似の材料の細片の表面であ
る。最後に記載した細片の表面は、単純吸着等により生
じる支持材への結合が可能である、本発明に係るモノク
ローナル抗体の一種で、または抗原で被覆され、そして
適当である場合にはこの被覆操作は予め例えばグルタル
アルデヒドまたは臭化シアンでの支持材の活性化を行っ
た後に行う。
持材の例はミクロタイタープレートまたは試験管のプラ
スチック表面、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩
化ビニル、ガラスまたはプラスチック等からなるビーズ
表面、濾紙、デキストラン、セルロースもしくはニトロ
セルロースまたはその他の類似の材料の細片の表面であ
る。最後に記載した細片の表面は、単純吸着等により生
じる支持材への結合が可能である、本発明に係るモノク
ローナル抗体の一種で、または抗原で被覆され、そして
適当である場合にはこの被覆操作は予め例えばグルタル
アルデヒドまたは臭化シアンでの支持材の活性化を行っ
た後に行う。
【０１３３】酵素結合イムノアッセイ（エリザ；酵素結
合イムノソルベントアッセイ）において本発明に係るモ
ノクローナル抗体を使用することが本発明の範囲内で特
に好ましい。これは、そのまま、または酵素結合誘導体
の形態で使用される本発明に係るモノクローナル抗体を
必要とする。
合イムノソルベントアッセイ）において本発明に係るモ
ノクローナル抗体を使用することが本発明の範囲内で特
に好ましい。これは、そのまま、または酵素結合誘導体
の形態で使用される本発明に係るモノクローナル抗体を
必要とする。
【０１３４】エリザアッセイは本発明に係る抗体の酵素
結合誘導体またはその他のそれ自体公知でありそして本
発明に係る抗体のエピトープを認識し結合する酵素結合
抗体の使用のいずれかに基づいている。
結合誘導体またはその他のそれ自体公知でありそして本
発明に係る抗体のエピトープを認識し結合する酵素結合
抗体の使用のいずれかに基づいている。
【０１３５】上記の支持材の一つが抗原で最初に被覆さ
れているエリザアッセイを使用することが本発明の範囲
内で特に好ましい。担体結合抗原は次に、検出すべき抗
原および本発明に係る抗体の一種を含有する試験溶液と
保温される。検出すべき抗原はこの際に遊離の形態で、
または水もしくは土壌の試料の構成成分として存在し得
る。
れているエリザアッセイを使用することが本発明の範囲
内で特に好ましい。担体結合抗原は次に、検出すべき抗
原および本発明に係る抗体の一種を含有する試験溶液と
保温される。検出すべき抗原はこの際に遊離の形態で、
または水もしくは土壌の試料の構成成分として存在し得
る。
【０１３６】１０分ないし２時間の保温時間の後に、全
体の混合物は、本発明に係るモノクローナル抗体を認識
し、そして結合する酵素標識抗体と保温される。この種
の酵素標識抗体の一例はホスファターゼ標識ヤギ抗ヒツ
ジ免疫グロブリン、または相当するヤギ抗マウス抗体で
あり、両方とも市販されている。結合された抗体タンパ
ク質の量は酵素−基質反応、例えば分光法を用いて決定
される。
体の混合物は、本発明に係るモノクローナル抗体を認識
し、そして結合する酵素標識抗体と保温される。この種
の酵素標識抗体の一例はホスファターゼ標識ヤギ抗ヒツ
ジ免疫グロブリン、または相当するヤギ抗マウス抗体で
あり、両方とも市販されている。結合された抗体タンパ
ク質の量は酵素−基質反応、例えば分光法を用いて決定
される。
【０１３７】上記の支持材の一つに結合した抗体に対す
る標識および遊離抗原の競合に基づいたエリザ試験も同
様に本発明の範囲内で好ましい。
る標識および遊離抗原の競合に基づいたエリザ試験も同
様に本発明の範囲内で好ましい。
【０１３８】特定の試料中に存在する抗原の量はこの場
合標識抗原における減少により決定される。これはは試
料中に含有される遊離抗原の量が多いほど、より正確で
ある。
合標識抗原における減少により決定される。これはは試
料中に含有される遊離抗原の量が多いほど、より正確で
ある。
【０１３９】本発明はさらに、本発明に係るモノクロー
ナル抗体および／またはそれらの誘導体の他に、適当で
ある場合にはさらにその他のモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体、特に標識モノクローナルまたはポリク
ローナル抗体、およびその他の添加剤を含有し得る試験
キットの形態にあるスルホニル尿素除草剤の定性および
定量試験のための手段に関する。
ナル抗体および／またはそれらの誘導体の他に、適当で
ある場合にはさらにその他のモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体、特に標識モノクローナルまたはポリク
ローナル抗体、およびその他の添加剤を含有し得る試験
キットの形態にあるスルホニル尿素除草剤の定性および
定量試験のための手段に関する。
【０１４０】ラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノア
ッセイおよび化学発光アッセイからなる群から選択され
る慣用のイムノアッセイの一つに基づいた試験キットが
本発明の範囲内で特に好ましい。本発明の範囲内で特に
好ましい試験キットはスルホニル尿素除草剤の検出が競
合イムノアッセイ、特に酵素結合直接または間接イムノ
アッセイ（エリザ）に基づいたものである。
ッセイおよび化学発光アッセイからなる群から選択され
る慣用のイムノアッセイの一つに基づいた試験キットが
本発明の範囲内で特に好ましい。本発明の範囲内で特に
好ましい試験キットはスルホニル尿素除草剤の検出が競
合イムノアッセイ、特に酵素結合直接または間接イムノ
アッセイ（エリザ）に基づいたものである。
【０１４１】本発明の範囲内で好ましいトリアスルフロ
ンの放射免疫学的検出のための試験キットは、例えば以
下の構成成分を含有し得る： （ａ）被覆されていなくても、または本発明に係る抗体
の一つもしくは抗原複合体で被覆されていてもよい適当
な支持材、（ｂ）本発明に係る抗体の一つおよび／また
はそれらの放射標識誘導体または放射標識抗原の適当な
場合には凍結乾燥または濃縮された溶液または抗原の標
準化溶液、（ｃ）緩衝液、（ｄ）適当である場合には、
例えば非特異的吸着および凝集体の形成を防止するポリ
ペプチド、界面活性剤およびその他の添加剤、および
（ｅ）ピペット、反応容器、計算曲線、封入ラベルその
他。
ンの放射免疫学的検出のための試験キットは、例えば以
下の構成成分を含有し得る： （ａ）被覆されていなくても、または本発明に係る抗体
の一つもしくは抗原複合体で被覆されていてもよい適当
な支持材、（ｂ）本発明に係る抗体の一つおよび／また
はそれらの放射標識誘導体または放射標識抗原の適当な
場合には凍結乾燥または濃縮された溶液または抗原の標
準化溶液、（ｃ）緩衝液、（ｄ）適当である場合には、
例えば非特異的吸着および凝集体の形成を防止するポリ
ペプチド、界面活性剤およびその他の添加剤、および
（ｅ）ピペット、反応容器、計算曲線、封入ラベルその
他。
【０１４２】酵素結合イムノアッセイ（エリザ）に基づ
いたスルホニル尿素除草剤の免疫学的検出のための試験
キットは、例えば以下の構成成分を含有し得る： （ａ）被覆されていなくても、または本発明に係る抗体
の一つもしくは抗原複合体で被覆されていてもよい適当
な支持材、（ｂ）本発明に係る抗体の一つおよび／また
は決定すべき抗原に対して反応するか、または抗原を認
識する抗体に対して反応する第２の酵素標識モノクロー
ナルまたはポリクローナル抗体の適当な場合には凍結乾
燥または濃縮された溶液、（ｃ）固体または溶解した形
態の酵素基質、（ｄ）抗原または抗原の標準化溶液、
（ｅ）緩衝液、（ｆ）適当である場合には、例えば非特
異的吸着および凝集体の形成を防止するポリペプチド、
界面活性剤およびその他の添加剤、および（ｇ）ピペッ
ト、反応容器、計算曲線、カラーチャート、封入ラベル
その他。
いたスルホニル尿素除草剤の免疫学的検出のための試験
キットは、例えば以下の構成成分を含有し得る： （ａ）被覆されていなくても、または本発明に係る抗体
の一つもしくは抗原複合体で被覆されていてもよい適当
な支持材、（ｂ）本発明に係る抗体の一つおよび／また
は決定すべき抗原に対して反応するか、または抗原を認
識する抗体に対して反応する第２の酵素標識モノクロー
ナルまたはポリクローナル抗体の適当な場合には凍結乾
燥または濃縮された溶液、（ｃ）固体または溶解した形
態の酵素基質、（ｄ）抗原または抗原の標準化溶液、
（ｅ）緩衝液、（ｆ）適当である場合には、例えば非特
異的吸着および凝集体の形成を防止するポリペプチド、
界面活性剤およびその他の添加剤、および（ｇ）ピペッ
ト、反応容器、計算曲線、カラーチャート、封入ラベル
その他。
【０１４３】化学発光試験に基づいたスルホニル尿素除
草剤の検出のための試験キットは、例えば以下の構成成
分を含有し得る： （ａ）被覆されていなくても、または本発明に係る抗体
の一つもしくは抗原複合体で被覆されていてもよい適当
な支持材、（ｂ）本発明に係る抗体の一つおよび本発明
に係る第１の抗体を認識し得そして化学発光標識に結合
される第２のポリクローナル抗体の適当な場合には凍結
乾燥または濃縮された溶液、（ｃ）光放射を誘導する成
分、例えばＨ2 Ｏ2 またはＮａＯＨを含有する溶液、
（ｄ）緩衝液、（ｅ）適当である場合には、例えば非特
異的吸着および凝集体の形成を防止するポリペプチド、
界面活性剤およびその他の添加剤、および（ｆ）ピペッ
ト、反応容器、封入ラベルその他。
草剤の検出のための試験キットは、例えば以下の構成成
分を含有し得る： （ａ）被覆されていなくても、または本発明に係る抗体
の一つもしくは抗原複合体で被覆されていてもよい適当
な支持材、（ｂ）本発明に係る抗体の一つおよび本発明
に係る第１の抗体を認識し得そして化学発光標識に結合
される第２のポリクローナル抗体の適当な場合には凍結
乾燥または濃縮された溶液、（ｃ）光放射を誘導する成
分、例えばＨ2 Ｏ2 またはＮａＯＨを含有する溶液、
（ｄ）緩衝液、（ｅ）適当である場合には、例えば非特
異的吸着および凝集体の形成を防止するポリペプチド、
界面活性剤およびその他の添加剤、および（ｆ）ピペッ
ト、反応容器、封入ラベルその他。
【０１４４】本発明の範囲内で使用され得る支持材は、
ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエ
ステル、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリ
アクリルアミド、ニトロセルロース、架橋デキストラ
ン、フッ化樹脂、アガロース、架橋アガロース、多糖そ
の他からなる群から選択される不溶性ポリマー材料から
主として構成される。しかしながら、これらの他に、例
えばガラス、金属、ナイロンベースネット等も使用し得
る。
ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエ
ステル、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリ
アクリルアミド、ニトロセルロース、架橋デキストラ
ン、フッ化樹脂、アガロース、架橋アガロース、多糖そ
の他からなる群から選択される不溶性ポリマー材料から
主として構成される。しかしながら、これらの他に、例
えばガラス、金属、ナイロンベースネット等も使用し得
る。
【０１４５】上記の特定の支持材は非常に広範囲のデザ
インを有し、そして使用の特に意図された特定の目的に
応じて非常に異なる形状を有し得る。それらは例えば
皿、球、プレート、小さいロッド、セル、小さいボト
ル、小さいチューブ、ファイバー、ネットその他からな
る。
インを有し、そして使用の特に意図された特定の目的に
応じて非常に異なる形状を有し得る。それらは例えば
皿、球、プレート、小さいロッド、セル、小さいボト
ル、小さいチューブ、ファイバー、ネットその他からな
る。
【０１４６】被覆されていなくても、または本発明に係
る抗体の一つ、遊離抗原もしくは抗原複合体で被覆され
ていてもよい透明プラスチック材料、例えばポリ塩化ビ
ニルまたはポリスチレンからなるミクロタイタープレー
トが試験キットを製造するために頻繁に使用される。ポ
リスチレンおよびポリスチレンラテックスの小球、チュ
ーブまたはロッドもまた使用され得、この場合には周囲
のラテックス材料は遠心分離によりポリスチレン粒子か
ら分離することが可能である。
る抗体の一つ、遊離抗原もしくは抗原複合体で被覆され
ていてもよい透明プラスチック材料、例えばポリ塩化ビ
ニルまたはポリスチレンからなるミクロタイタープレー
トが試験キットを製造するために頻繁に使用される。ポ
リスチレンおよびポリスチレンラテックスの小球、チュ
ーブまたはロッドもまた使用され得、この場合には周囲
のラテックス材料は遠心分離によりポリスチレン粒子か
ら分離することが可能である。
【０１４７】本発明に係る試験キットのもう一つの成分
は、複合体形成性反応、特に免疫学的反応の存在の検出
を可能にする、好ましくは抗原抗体複合体またはリガン
ドレセプター複合体を生じ、その場合に適当であるなら
ば定性情報の他に定量情報が検出されるべき抗原につい
て得られるであろうマーカーまたはインジケーターから
なる。適当なマーカーまたはインジケーターは、検出可
能な信号を直接または間接的に生じ得る単一の原子およ
び分子である。これらのマーカーまたはインジケーター
は検出すべき抗原または本発明に係るモノクローナル抗
体に直接結合しているか、または後者のモノクローナル
抗体に包含されていてもよい。しかしながら、それらは
単一物質の形態であっても、またはそれ自体検出すべき
抗原でも本発明に係るモノクローナル抗体の一つでもな
いがレセプター分子と反応できる分離した化合物の成分
の形態、例えば錯体形成物であってもよい。
は、複合体形成性反応、特に免疫学的反応の存在の検出
を可能にする、好ましくは抗原抗体複合体またはリガン
ドレセプター複合体を生じ、その場合に適当であるなら
ば定性情報の他に定量情報が検出されるべき抗原につい
て得られるであろうマーカーまたはインジケーターから
なる。適当なマーカーまたはインジケーターは、検出可
能な信号を直接または間接的に生じ得る単一の原子およ
び分子である。これらのマーカーまたはインジケーター
は検出すべき抗原または本発明に係るモノクローナル抗
体に直接結合しているか、または後者のモノクローナル
抗体に包含されていてもよい。しかしながら、それらは
単一物質の形態であっても、またはそれ自体検出すべき
抗原でも本発明に係るモノクローナル抗体の一つでもな
いがレセプター分子と反応できる分離した化合物の成分
の形態、例えば錯体形成物であってもよい。
【０１４８】これらの分離化合物は好ましくは、ストレ
プトコッカス・アウレウスプロテインＡその他の補体タ
ンパク質またはそれらの断片に由来するモノクローナル
およびポリクローナルであり得る第２の抗体分子の形態
を採る。これらの分離化合物はレセプター分子、例えば
検出すべき抗原または本発明に係るモノクローナル抗体
の一つ、特に複合体の形態で存在するレセプター分子を
特異的に認識し、結合する。多くの場合において、次い
でマーカーと協調してのみ検出可能な信号を導くさらに
別の試薬に対する要求がある。このことは、酵素が含ま
れるときに特に当てはまる。
プトコッカス・アウレウスプロテインＡその他の補体タ
ンパク質またはそれらの断片に由来するモノクローナル
およびポリクローナルであり得る第２の抗体分子の形態
を採る。これらの分離化合物はレセプター分子、例えば
検出すべき抗原または本発明に係るモノクローナル抗体
の一つ、特に複合体の形態で存在するレセプター分子を
特異的に認識し、結合する。多くの場合において、次い
でマーカーと協調してのみ検出可能な信号を導くさらに
別の試薬に対する要求がある。このことは、酵素が含ま
れるときに特に当てはまる。
【０１４９】本発明の範囲内で使用され得るマーカーま
たはインジケーターは、免疫学および免疫化学の分野の
熟練者には非常によく知られている。それらは、例えば
放射性マーカー元素もしくは物質、酵素または化学発光
物質からなる。可能なマーカーまたはインジケーターの
以下のリストは、実施例により使用され得る広範囲の物
質および試薬を説明するためのものであり、これにより
本発明の対象物質を制限するものではない。
たはインジケーターは、免疫学および免疫化学の分野の
熟練者には非常によく知られている。それらは、例えば
放射性マーカー元素もしくは物質、酵素または化学発光
物質からなる。可能なマーカーまたはインジケーターの
以下のリストは、実施例により使用され得る広範囲の物
質および試薬を説明するためのものであり、これにより
本発明の対象物質を制限するものではない。
【０１５０】適当なマーカーまたはインジケーターの例
は放射性元素の群の中に見出され得る。これに関連する
特に好ましい元素はそれ自体γ線を放射するもの、例え
ば124 Ｉ、125 Ｉ、128 Ｉ、 132Ｉまたは51Ｃｒ、これ
らの線の放射を誘導するもの、例えば11Ｃ、18Ｆまた
は、13Ｎである。いわゆるβ放射体、例えば 111Ｉｎ、
14Ｃおよび 3Ｈも同様に適当である。
は放射性元素の群の中に見出され得る。これに関連する
特に好ましい元素はそれ自体γ線を放射するもの、例え
ば124 Ｉ、125 Ｉ、128 Ｉ、 132Ｉまたは51Ｃｒ、これ
らの線の放射を誘導するもの、例えば11Ｃ、18Ｆまた
は、13Ｎである。いわゆるβ放射体、例えば 111Ｉｎ、
14Ｃおよび 3Ｈも同様に適当である。
【０１５１】その他の適当なマーカーは、化学的手段に
より非常に簡単に抗原に、または抗原を変性させること
なく抗体に連結され得る、化学発光物質、特に蛍光物質
からなる。生成するフルオロクロムは蛍光定量法を用い
て容易に検出され得る。フルオレセインイソシアネー
ト、フルオレセインイソチオシアネート、５−ジメチル
アミノ−１−ナフタレンスルホニルクロリド、テトラメ
チルローダミンイソチオシアネート、リザミン、ローダ
ミン８２００スルホニルクロリドその他がこの点におい
て特記する価値がある。
より非常に簡単に抗原に、または抗原を変性させること
なく抗体に連結され得る、化学発光物質、特に蛍光物質
からなる。生成するフルオロクロムは蛍光定量法を用い
て容易に検出され得る。フルオレセインイソシアネー
ト、フルオレセインイソチオシアネート、５−ジメチル
アミノ−１−ナフタレンスルホニルクロリド、テトラメ
チルローダミンイソチオシアネート、リザミン、ローダ
ミン８２００スルホニルクロリドその他がこの点におい
て特記する価値がある。
【０１５２】その他の蛍光剤および分析技術の記載は、
デルカ(DeLuca)編『免疫蛍光分析』(Immunofluorescenc
e Analysis) ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社(Joh
n Wiley & Sons, Ltd.) 刊（１９８２年）の第１８９−
２３１頁の「道具としての抗体」マルシャロニス等
〔３〕に見出される。
デルカ(DeLuca)編『免疫蛍光分析』(Immunofluorescenc
e Analysis) ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社(Joh
n Wiley & Sons, Ltd.) 刊（１９８２年）の第１８９−
２３１頁の「道具としての抗体」マルシャロニス等
〔３〕に見出される。
【０１５３】マーカーまたはインジケーター物質として
酵素を使用することは本発明の範囲内で特に好ましい。
例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセ
チルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒド
ロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ等である。酵素がマーカー物質として使用される
場合、酵素活性を通して続けられる免疫複合体の形成を
可能にする追加の試薬、および適当である場合には酵素
反応が停止され得る停止試薬を添加することが必要であ
る。
酵素を使用することは本発明の範囲内で特に好ましい。
例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセ
チルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒド
ロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ等である。酵素がマーカー物質として使用される
場合、酵素活性を通して続けられる免疫複合体の形成を
可能にする追加の試薬、および適当である場合には酵素
反応が停止され得る停止試薬を添加することが必要であ
る。
【０１５４】呈色反応を生じる試薬が本発明の範囲内で
特に好ましい。西洋ワサビペルオキシダーゼの場合に
は、この点に関して記載され得る例は過酸化水素であ
り、これは追加の酸化された顔料前駆体例えばジアミノ
ベンジジンまたはｏ−フェニレンジアミンと組み合わさ
って褐色または黄色を生じる。グルコースオキシダーゼ
がマーカー用物質として使用される場合、例えば２，
２’−アジド−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６
−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を基質として使用すること
ができる。
特に好ましい。西洋ワサビペルオキシダーゼの場合に
は、この点に関して記載され得る例は過酸化水素であ
り、これは追加の酸化された顔料前駆体例えばジアミノ
ベンジジンまたはｏ−フェニレンジアミンと組み合わさ
って褐色または黄色を生じる。グルコースオキシダーゼ
がマーカー用物質として使用される場合、例えば２，
２’−アジド−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６
−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を基質として使用すること
ができる。
【０１５５】本発明はさらに、スルホニル尿素除草剤特
にトリアスルフロンの迅速で効率的な定性および／また
は定量分析のために、およびそれらの化合物を構造的に
関連する化合物、特にメツスルフロン−メチル、ベンス
ルフロン−メチル、チアメツロン−メチル、スルホメツ
ロン−メチル、トリベヌロン−メチル、クロロスルフロ
ン、およびピリミスルフロンからなる群から選択される
トリアスルフロン類似体と識別するために、試薬として
本発明に係るモノクローナル抗体少なくとも１種を含む
試験キットの使用に関する。
にトリアスルフロンの迅速で効率的な定性および／また
は定量分析のために、およびそれらの化合物を構造的に
関連する化合物、特にメツスルフロン−メチル、ベンス
ルフロン−メチル、チアメツロン−メチル、スルホメツ
ロン−メチル、トリベヌロン−メチル、クロロスルフロ
ン、およびピリミスルフロンからなる群から選択される
トリアスルフロン類似体と識別するために、試薬として
本発明に係るモノクローナル抗体少なくとも１種を含む
試験キットの使用に関する。
【０１５６】
【実施例】次に実施例に基づいて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 Ｉ．実施例 Ａ．実験操作 実施例１：トリアスルフロン連結性成分の合成 １．１：担体タンパク質に連結し得るトリアスルフロン
誘導体の製造 担体タンパク質に連結し得るトリアスルフロン誘導体の
製造は下の反応スキーム（化１０，化１１）に従って行
われ得る。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 Ｉ．実施例 Ａ．実験操作 実施例１：トリアスルフロン連結性成分の合成 １．１：担体タンパク質に連結し得るトリアスルフロン
誘導体の製造 担体タンパク質に連結し得るトリアスルフロン誘導体の
製造は下の反応スキーム（化１０，化１１）に従って行
われ得る。
【化１０】
【化１１】 詳しくは上記４段階工程は以下のように行われる： 段階１：２−ヒドロキシプロピルカルバモイルオキシメ
チルベンゼンの製造 ３−アミノ−１−プロパノール（アルドリッチ）２２．
５ｇおよびトリエチルアミン３０．３ｇを塩化メチレン
４００ｍｌ中に導入し、次いでわずかに冷却しながら１
５℃ないし２０℃で３０分間かけて１−クロロギ酸ベン
ジルエステル５１．２ｇを添加する。そのようにして得
られた溶液を次に室温でさらに２時間攪拌し、脱イオン
水で３回洗浄し、Ｎａ2 ＳＯ4 で乾燥させ、そして全体
を濃縮する。
チルベンゼンの製造 ３−アミノ−１−プロパノール（アルドリッチ）２２．
５ｇおよびトリエチルアミン３０．３ｇを塩化メチレン
４００ｍｌ中に導入し、次いでわずかに冷却しながら１
５℃ないし２０℃で３０分間かけて１−クロロギ酸ベン
ジルエステル５１．２ｇを添加する。そのようにして得
られた溶液を次に室温でさらに２時間攪拌し、脱イオン
水で３回洗浄し、Ｎａ2 ＳＯ4 で乾燥させ、そして全体
を濃縮する。
【０１５７】粗製物を次にシリカゲルカラム（３００
ｇ）上でのクロマトグラフィーにより精製する。使用さ
れた溶出液はトルエン：酢酸エチル＝１：１（ｖ／ｖ）
の混合物である。溶離液を石油エーテル（３０℃ないし
７０℃の留分）から結晶化させる。ろ過および乾燥後、
式（Ｉ）で表される化合物が収量１３ｇ（理論収量の２
０．７％）、融点５２℃−５３℃で得られる。
ｇ）上でのクロマトグラフィーにより精製する。使用さ
れた溶出液はトルエン：酢酸エチル＝１：１（ｖ／ｖ）
の混合物である。溶離液を石油エーテル（３０℃ないし
７０℃の留分）から結晶化させる。ろ過および乾燥後、
式（Ｉ）で表される化合物が収量１３ｇ（理論収量の２
０．７％）、融点５２℃−５３℃で得られる。
【０１５８】段階２：２−アミノ−４−クロロ−６−メ
チルトリアジン４．１２ｇ、炭酸カリウム３．９ｇおよ
び式（Ｉ）で表される化合物〔２−ヒドロキシプロピル
カルバモイルオキシメチルベンゼン〕６．３ｇからなる
アセトン８０ｍｌ中の懸濁液に、アセトン２０ｍｌ中に
溶解したトリメチルアミン１．８５ｇを１分以内に添加
する。この混合物を次に４０℃ないし４５℃の温度でさ
らに１５時間攪拌し、その後蒸発により濃縮して乾燥さ
せ、そして酢酸エチル中に取り出す。
チルトリアジン４．１２ｇ、炭酸カリウム３．９ｇおよ
び式（Ｉ）で表される化合物〔２−ヒドロキシプロピル
カルバモイルオキシメチルベンゼン〕６．３ｇからなる
アセトン８０ｍｌ中の懸濁液に、アセトン２０ｍｌ中に
溶解したトリメチルアミン１．８５ｇを１分以内に添加
する。この混合物を次に４０℃ないし４５℃の温度でさ
らに１５時間攪拌し、その後蒸発により濃縮して乾燥さ
せ、そして酢酸エチル中に取り出す。
【０１５９】脱イオン水で２回洗浄した後、酢酸エチル
相をＮａ2 ＳＯ4 で乾燥させ、そして数ｍｌの残留容量
まで濃縮する。生成する結晶をろ別し、洗浄し、そして
乾燥させると、式（ＩＩ）で表される化合物（白色結
晶）が収量３．１ｇ（理論収量の３４．２％）、融点１
２６℃−１２８℃で得られる。
相をＮａ2 ＳＯ4 で乾燥させ、そして数ｍｌの残留容量
まで濃縮する。生成する結晶をろ別し、洗浄し、そして
乾燥させると、式（ＩＩ）で表される化合物（白色結
晶）が収量３．１ｇ（理論収量の３４．２％）、融点１
２６℃−１２８℃で得られる。
【０１６０】段階３および４：３−（６−（３−アミノ
−ｎ−プロポキシ）−４−メチル−１，３，５−トリア
ジニ−２−イル）−１−〔２−（２−クロロエトキシ）
−フェニルスルホニル〕−尿素の製造 ２−（２−クロロエトキシ）−フェニルスルホニルイソ
シアネート２．７５ｇおよび式（ＩＩ）で表されるアミ
ノトリアジン３．３５ｇをジオキサン（無水）２０ｍｌ
中８０℃ないし８５℃の温度で５時間攪拌する。透明溶
液を蒸発により濃縮して乾燥させ、そして粗製物をトル
エン：酢酸エチル＝１：２（ｖ／ｖ）を用いてシリカゲ
ル上でクロマトグラフィーを行う。
−ｎ−プロポキシ）−４−メチル−１，３，５−トリア
ジニ−２−イル）−１−〔２−（２−クロロエトキシ）
−フェニルスルホニル〕−尿素の製造 ２−（２−クロロエトキシ）−フェニルスルホニルイソ
シアネート２．７５ｇおよび式（ＩＩ）で表されるアミ
ノトリアジン３．３５ｇをジオキサン（無水）２０ｍｌ
中８０℃ないし８５℃の温度で５時間攪拌する。透明溶
液を蒸発により濃縮して乾燥させ、そして粗製物をトル
エン：酢酸エチル＝１：２（ｖ／ｖ）を用いてシリカゲ
ル上でクロマトグラフィーを行う。
【０１６１】式（ＩＩＩ）で表されるスルホニル尿素を
含む画分を一緒にし、そして脱イオン水２００ｍｌおよ
びＮａ2 ＣＯ3 １．８３ｇ中、Ｐｄ／Ｃ５％０．５ｇの
存在下、直接水素で水素添加する。結晶のろ別後、２Ｎ
ＨＣｌの添加により無色溶液をｐＨ５．５ないし６．
０に酸性化する。このようにして形成された沈殿をろ別
し、そして乾燥させる。式（ＩＶ）で表される最終生成
物が収量２．６ｇ、融点１４６℃−１４７℃で得られ
る。
含む画分を一緒にし、そして脱イオン水２００ｍｌおよ
びＮａ2 ＣＯ3 １．８３ｇ中、Ｐｄ／Ｃ５％０．５ｇの
存在下、直接水素で水素添加する。結晶のろ別後、２Ｎ
ＨＣｌの添加により無色溶液をｐＨ５．５ないし６．
０に酸性化する。このようにして形成された沈殿をろ別
し、そして乾燥させる。式（ＩＶ）で表される最終生成
物が収量２．６ｇ、融点１４６℃−１４７℃で得られ
る。
【０１６２】上記の４段階工程で使用された出発化合物
および反応体は公知であるか、または公知方法と同様に
製造され得る。
および反応体は公知であるか、または公知方法と同様に
製造され得る。
【０１６３】実施例１．２：担体タンパク質に連結し得
るトリアスルフロン断片の製造 担体タンパク質に連結し得る第２のトリアスルフロン断
片の製造は下の反応スキーム（化１２）に従って行われ
得る。
るトリアスルフロン断片の製造 担体タンパク質に連結し得る第２のトリアスルフロン断
片の製造は下の反応スキーム（化１２）に従って行われ
得る。
【化１２】 詳しくは、以下の工程段階が行われる。ジオキサン中に
溶解した１，８−ジアザビシクロ〔５．４．０〕ウンデ
セ−７−エン１８．５ｇをジオキサン１５０ｍｌ中の２
−（２−クロロエトキシ）フェニルスルホンアミド１
４．１ｇおよび無水コハク酸６．０ｇの溶液にわずかに
冷却しながら室温で１時間３０分かけて滴下する。
溶解した１，８−ジアザビシクロ〔５．４．０〕ウンデ
セ−７−エン１８．５ｇをジオキサン１５０ｍｌ中の２
−（２−クロロエトキシ）フェニルスルホンアミド１
４．１ｇおよび無水コハク酸６．０ｇの溶液にわずかに
冷却しながら室温で１時間３０分かけて滴下する。
【０１６４】生成する白色懸濁液を室温でさらに２時間
攪拌し、２Ｎ ＨＣｌ６５ｍｌで酸性化し、そして蒸発
により濃縮して乾燥させる。油状残渣を酢酸エチル中に
採取し、そして脱イオン水で２回洗浄する。Ｎａ2 ＳＯ
4で乾燥させ、蒸発により再び濃縮した後、エタノール
４０ｍｌから再結晶すると、融点１６６℃−１６８℃を
有する式（Ｖ）で表される化合物の白色結晶が７．１ｇ
（理論収量の３５．３％）得られる。
攪拌し、２Ｎ ＨＣｌ６５ｍｌで酸性化し、そして蒸発
により濃縮して乾燥させる。油状残渣を酢酸エチル中に
採取し、そして脱イオン水で２回洗浄する。Ｎａ2 ＳＯ
4で乾燥させ、蒸発により再び濃縮した後、エタノール
４０ｍｌから再結晶すると、融点１６６℃−１６８℃を
有する式（Ｖ）で表される化合物の白色結晶が７．１ｇ
（理論収量の３５．３％）得られる。
【０１６５】実施例１．３：トリアスルフロン−タンパ
ク質複合体 実施例１．３．１に従って製造したトリアスルフロン誘
導体または実施例１．２に従って製造したトリアスルフ
ロン断片を文献〔１０〕に記載されたジアゾニウム法ま
たは文献〔１２〕に記載された活性化エステル法により
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；フルカ）か、キーホール
カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ；カルビオケム）のいず
れかに複合させる。
ク質複合体 実施例１．３．１に従って製造したトリアスルフロン誘
導体または実施例１．２に従って製造したトリアスルフ
ロン断片を文献〔１０〕に記載されたジアゾニウム法ま
たは文献〔１２〕に記載された活性化エステル法により
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；フルカ）か、キーホール
カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ；カルビオケム）のいず
れかに複合させる。
【０１６６】１．３．１：式（ＩＶ）で表される化合物
のＢＳＡまたはＫＬＨへのジアゾニウム法による連結 式（ＩＶ）で表されるトリアスルフロン誘導体１００ｍ
ｇを酢酸（１０ｍｌ）およびプロピオン酸（５ｍｌ）の
混合物中に懸濁する。生成する混合物を０℃まで冷却
し、濃ＨＣｌ（０．２ｍｌ）および亜硝酸ナトリウム
（０．０５ｇ）を添加する。反応バッチの温度を３０分
間０℃の一定に保持する。生成する黄色溶液を次に各
７．５ｍｌの２つに分け、各々を０．０５Ｍホウ酸緩衝
液（ｐＨ９．０）２０ｍｌ中のＢＳＡまたはＫＬＨ０．
１ｇにゆっくり添加する。溶液のｐＨを１Ｍ ＮａＯＨ
の添加により９．０の一定に保つ。
のＢＳＡまたはＫＬＨへのジアゾニウム法による連結 式（ＩＶ）で表されるトリアスルフロン誘導体１００ｍ
ｇを酢酸（１０ｍｌ）およびプロピオン酸（５ｍｌ）の
混合物中に懸濁する。生成する混合物を０℃まで冷却
し、濃ＨＣｌ（０．２ｍｌ）および亜硝酸ナトリウム
（０．０５ｇ）を添加する。反応バッチの温度を３０分
間０℃の一定に保持する。生成する黄色溶液を次に各
７．５ｍｌの２つに分け、各々を０．０５Ｍホウ酸緩衝
液（ｐＨ９．０）２０ｍｌ中のＢＳＡまたはＫＬＨ０．
１ｇにゆっくり添加する。溶液のｐＨを１Ｍ ＮａＯＨ
の添加により９．０の一定に保つ。
【０１６７】この反応の最終生成物を免疫感作に使用す
る前に、リン酸緩衝化塩溶液〔（ＰＢＳ）０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウムおよび０．１４５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ
７．０〕に対して十分に透析する。
る前に、リン酸緩衝化塩溶液〔（ＰＢＳ）０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウムおよび０．１４５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ
７．０〕に対して十分に透析する。
【０１６８】１．３．２：式（Ｖ）で表される化合物の
ＢＳＡまたはＫＬＨへの活性化エステル法による連結 詳しくは、式（Ｖ）で表されるトリアスルフロン断片の
カルボキシ基をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）（７．２ｍｇ／２００μｌ）中に室温で可溶化し、
次に４モル過剰のα−ヒドロキシスクシンイミド（９．
１ｍｇ／２００μｌ）およびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（１６ｍｇ／２００μｌ）を添加す
る。反応混合物を最初に２２℃で１時間、次に４℃で１
８時間攪拌する。
ＢＳＡまたはＫＬＨへの活性化エステル法による連結 詳しくは、式（Ｖ）で表されるトリアスルフロン断片の
カルボキシ基をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）（７．２ｍｇ／２００μｌ）中に室温で可溶化し、
次に４モル過剰のα−ヒドロキシスクシンイミド（９．
１ｍｇ／２００μｌ）およびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（１６ｍｇ／２００μｌ）を添加す
る。反応混合物を最初に２２℃で１時間、次に４℃で１
８時間攪拌する。
【０１６９】反応の間に形成された沈殿を室温で１２０
００ｇ３分間の遠心分離により除去し、そして活性化エ
ステルを次にリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ緩衝液）３．
３ｍｌ中に予め可溶化したＢＳＡ〔１２ｍｇ〕またはＫ
ＬＨ〔１２ｍｇ〕に添加する。
００ｇ３分間の遠心分離により除去し、そして活性化エ
ステルを次にリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ緩衝液）３．
３ｍｌ中に予め可溶化したＢＳＡ〔１２ｍｇ〕またはＫ
ＬＨ〔１２ｍｇ〕に添加する。
【０１７０】４℃の温度で４時間保温した後、形成され
た沈殿を４℃で２０００ｇ１０分間の遠心分離により除
去し、そして残留する上澄みを免疫感作実験に使用する
前に、ＰＢＳに対して十分に透析する。
た沈殿を４℃で２０００ｇ１０分間の遠心分離により除
去し、そして残留する上澄みを免疫感作実験に使用する
前に、ＰＢＳに対して十分に透析する。
【０１７１】連結反応の範囲は吸光光度法により決定さ
れる。トリアスルフロン断片：ＢＳＡのモル比は約１
０：１、好ましくは１２：１である。
れる。トリアスルフロン断片：ＢＳＡのモル比は約１
０：１、好ましくは１２：１である。
【０１７２】実施例２：免疫感作 ４週齢ないし６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス〔チエ
ルファルム・ズィゼルン(Tierfarm Sisseln)，スイス
国〕各群５匹（２群）はＫＬＨ複合トリアスルフロンの
３回の腹膜腔内および皮下の一連の注射を２週間間隔で
受容する。実施例１．３．１で製造した式（ＩＶ）で表
されるトリアスルフロン複合体の投与量は８０μｇ／注
射であり、一方実施例１．３．２で製造した式（Ｖ）で
表されるトリアスルフロン複合体は６０μｇ／注射の投
与量で投与される。
ルファルム・ズィゼルン(Tierfarm Sisseln)，スイス
国〕各群５匹（２群）はＫＬＨ複合トリアスルフロンの
３回の腹膜腔内および皮下の一連の注射を２週間間隔で
受容する。実施例１．３．１で製造した式（ＩＶ）で表
されるトリアスルフロン複合体の投与量は８０μｇ／注
射であり、一方実施例１．３．２で製造した式（Ｖ）で
表されるトリアスルフロン複合体は６０μｇ／注射の投
与量で投与される。
【０１７３】第１の注射はＰＢＳ中に複合体０．１ｍｌ
を含み、完全フロイントのアジュバント０．１ｍｌと
１：１の比率で混合されている。この注射液５０μｌは
腹膜腔内に注射され、そして残りの１５０μｌは皮下に
注射される。
を含み、完全フロイントのアジュバント０．１ｍｌと
１：１の比率で混合されている。この注射液５０μｌは
腹膜腔内に注射され、そして残りの１５０μｌは皮下に
注射される。
【０１７４】第２および第３の注射はそれぞれ第１の投
与の１４日および３０日後に行われ、完全フロイントの
アジュバントの代わりに不完全フロイントのアジュバン
トを用いる。
与の１４日および３０日後に行われ、完全フロイントの
アジュバントの代わりに不完全フロイントのアジュバン
トを用いる。
【０１７５】最後の注射の１週間後、血清を実験動物か
ら採取し、そして血液滴定は、ＢＳＡ複合ハプテン（項
６参照）で予め被覆したミクロタイタープレートを用い
るエリザ試験により決定される。
ら採取し、そして血液滴定は、ＢＳＡ複合ハプテン（項
６参照）で予め被覆したミクロタイタープレートを用い
るエリザ試験により決定される。
【０１７６】２ヵ月の放置期間の後に、ＫＬＨ複合体の
もう１回の腹膜腔内注射が８３０μｇ／２００μｌＰＢ
Ｓ〔式（ＩＶ）で表されるトリアスルフロン複合体〕ま
たは５４０μｇ／２００μｌＰＢＳ〔式（Ｖ）で表され
るトリアスルフロン複合体〕の投与量で行われる。３な
いし４日後、マウスを殺し、そして脾臓細胞を単離し、
それをミエローマ細胞系ＰＡＩ〔１８〕と融合させる
〔実施例３．４参照〕。
もう１回の腹膜腔内注射が８３０μｇ／２００μｌＰＢ
Ｓ〔式（ＩＶ）で表されるトリアスルフロン複合体〕ま
たは５４０μｇ／２００μｌＰＢＳ〔式（Ｖ）で表され
るトリアスルフロン複合体〕の投与量で行われる。３な
いし４日後、マウスを殺し、そして脾臓細胞を単離し、
それをミエローマ細胞系ＰＡＩ〔１８〕と融合させる
〔実施例３．４参照〕。
【０１７７】実施例３：融合プロトコル ３．１．食細胞（腹膜マクロファージ）の入手 約６週齢ないし８週齢の未処置Ｂａｌｂ／ｃマウスを融
合１日前に殺し、そして７０％のアルコール中に浸漬す
ることにより殺菌する。
合１日前に殺し、そして７０％のアルコール中に浸漬す
ることにより殺菌する。
【０１７８】次に殺菌切開は腹膜を傷つけることなく柔
毛および上部腹皮になされる。滅菌５ｍｌプラスチック
シリンジおよび滅菌１８ゲージ注射針がＢＳＳ（Ｃａ2+
およびＭｇ2+なし）４ｍｌおよび空気１ｍｌを腹腔内に
注射するために使用される。
毛および上部腹皮になされる。滅菌５ｍｌプラスチック
シリンジおよび滅菌１８ゲージ注射針がＢＳＳ（Ｃａ2+
およびＭｇ2+なし）４ｍｌおよび空気１ｍｌを腹腔内に
注射するために使用される。
【０１７９】腹部をゆるやかに揉んだ後（シリンジおよ
び針は腹腔内に残っている）、前に注射されたＢＳＳ緩
衝液を腹膜腔内から再び引き出し、そして滅菌ファルコ
ンチューブ中に入れる。この操作をさらに２回繰り返
す。この方法で得られたマクロファージは氷で冷し、そ
して引続きＢＳＳ各回２０ｍｌで２回洗浄する。
び針は腹腔内に残っている）、前に注射されたＢＳＳ緩
衝液を腹膜腔内から再び引き出し、そして滅菌ファルコ
ンチューブ中に入れる。この操作をさらに２回繰り返
す。この方法で得られたマクロファージは氷で冷し、そ
して引続きＢＳＳ各回２０ｍｌで２回洗浄する。
【０１８０】マクロファージを３００ｇおよび５℃の温
度で１０分間遠心分離する。ペレットを次にＨＡＴ培地
５０ｍｌ中に再懸濁し、そして細胞懸濁液を全部で２４
ウエルの４つのコスタープレートに分配する（０．５ｍ
ｌ／ウエル）。
度で１０分間遠心分離する。ペレットを次にＨＡＴ培地
５０ｍｌ中に再懸濁し、そして細胞懸濁液を全部で２４
ウエルの４つのコスタープレートに分配する（０．５ｍ
ｌ／ウエル）。
【０１８１】この方法で調製したマクロファージを３７
℃の温度および６％のＣＯ2 濃度でインキュベータに保
存する。
℃の温度および６％のＣＯ2 濃度でインキュベータに保
存する。
【０１８２】約４×１０6 マクロファージが各融合あた
り必要である。
り必要である。
【０１８３】３．２．ミエローマ細胞系ＰＡＩの培養 上記ミエローマ細胞系ＰＡＩは、それ自体抗体を分泌せ
ず、そして文献〔１８〕に記載されているミエローマ細
胞系である。
ず、そして文献〔１８〕に記載されているミエローマ細
胞系である。
【０１８４】少なくとも１０億個の細胞を含む十分に成
長した培養液５０ｍｌが各融合に必要である。ミエロー
マ細胞は好ましくはＴ１７５ファルコンボトル（ベクト
ン・アンド・ディケンソンにより供給される）中で培養
される。
長した培養液５０ｍｌが各融合に必要である。ミエロー
マ細胞は好ましくはＴ１７５ファルコンボトル（ベクト
ン・アンド・ディケンソンにより供給される）中で培養
される。
【０１８５】融合１日後、培養培地（ＲＰＭＩ１６４
０）を新鮮ＲＰＭＩ１６４０培地に代える。融合１日目
にＰＡＩ細胞を集め、５０ｍｌ滅菌プラスチックチュー
ブに入れ、そして３００ｇおよび５℃の温度で１０分間
遠心分離する（ＭＳＥ遠心分離機，チルスピン型，英
国）。遠心分離後、上澄みを吸い出し、そして捨てる。
細胞をＢＳＳ緩衝液（Ｃａ2+およびＭｇ2+なし）各回約
３０ｍｌで２回洗浄し（３００ｇ，５℃で１０分）、そ
してＢＳＳ５ｍｌ中に再懸濁する。
０）を新鮮ＲＰＭＩ１６４０培地に代える。融合１日目
にＰＡＩ細胞を集め、５０ｍｌ滅菌プラスチックチュー
ブに入れ、そして３００ｇおよび５℃の温度で１０分間
遠心分離する（ＭＳＥ遠心分離機，チルスピン型，英
国）。遠心分離後、上澄みを吸い出し、そして捨てる。
細胞をＢＳＳ緩衝液（Ｃａ2+およびＭｇ2+なし）各回約
３０ｍｌで２回洗浄し（３００ｇ，５℃で１０分）、そ
してＢＳＳ５ｍｌ中に再懸濁する。
【０１８６】細胞懸濁液の一部を細胞数決定のために除
去し、そしてフルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）で
染色する。さらに使用するまでミエローマ細胞を氷上に
保存する。
去し、そしてフルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）で
染色する。さらに使用するまでミエローマ細胞を氷上に
保存する。
【０１８７】３．３．脾臓細胞懸濁液の調製 実施例２に記載されたように予め免疫感作されたＢａｌ
ｂ／ｃマウスから滅菌条件下および氷上で冷却しながら
脾臓を除去する。
ｂ／ｃマウスから滅菌条件下および氷上で冷却しながら
脾臓を除去する。
【０１８８】予め免疫感作されたＢａｌｂ／ｃマウスを
断頭により殺し、そして滅菌条件下で脾臓を除去する。
このためにマウスは７０％のエタノール中に短時間浸漬
され、滅菌器具で解剖される。脾臓を注意深く除去し、
そして細かいナイロンネット上に置く。そこでハサミで
小片に切断され、次に５ｍｌのシリンジプランジャーを
用い、この操作であまりにも多くの細胞を破壊すること
なく注意深くネットを通す。ネットはこの操作を通じて
ＢＳＳですすがれる。
断頭により殺し、そして滅菌条件下で脾臓を除去する。
このためにマウスは７０％のエタノール中に短時間浸漬
され、滅菌器具で解剖される。脾臓を注意深く除去し、
そして細かいナイロンネット上に置く。そこでハサミで
小片に切断され、次に５ｍｌのシリンジプランジャーを
用い、この操作であまりにも多くの細胞を破壊すること
なく注意深くネットを通す。ネットはこの操作を通じて
ＢＳＳですすがれる。
【０１８９】この方法で得られた細胞懸濁液を５０ｍｌ
のプラスチックチューブに入れ、そして３００ｇおよび
５℃の温度で１０分間遠心分離する（ＭＳＥ遠心分離
機，チルスピン型，英国）。次に細胞をＢＳＳ各回約２
０ｍｌで２回洗浄し（３００ｇ，５℃で１０分，ＭＳＥ
遠心分離機，チルスピン型）、そして遠心分離後の細胞
ペレットをＢＳＳ１０ｍｌ中に再懸濁する。
のプラスチックチューブに入れ、そして３００ｇおよび
５℃の温度で１０分間遠心分離する（ＭＳＥ遠心分離
機，チルスピン型，英国）。次に細胞をＢＳＳ各回約２
０ｍｌで２回洗浄し（３００ｇ，５℃で１０分，ＭＳＥ
遠心分離機，チルスピン型）、そして遠心分離後の細胞
ペレットをＢＳＳ１０ｍｌ中に再懸濁する。
【０１９０】脾臓細胞はＰＡＩミエローマ細胞と融合さ
れるまで氷上に保持される。
れるまで氷上に保持される。
【０１９１】３．４．融合：脾臓細胞とＰＡＩミエロー
マ細胞 融合のためのミエローマ細胞：脾臓細胞の比率は１：１
０にすべきである。
マ細胞 融合のためのミエローマ細胞：脾臓細胞の比率は１：１
０にすべきである。
【０１９２】脾臓細胞（ＢＳＳ緩衝液中）およびＰＡＩ
ミエローマ細胞（ＢＳＳ緩衝液中）を上記比率で混合
し、そして３００ｇおよび５℃の温度で１０分間遠心分
離する（ＭＳＥ遠心分離機，チルスピン型）。ペレット
をＢＳＳ緩衝液中に再懸濁し、そして次に懸濁液を再び
遠心分離する。ペレットを注意深い攪拌によりばらばら
にし、そして水浴中に３７℃で入れる。次いで予備加熱
した滅菌ＰＥＧ４０００（メルク）１ｍｌを６０秒かけ
て細胞に滴下し、この間全体の混合物は絶えずかき混ぜ
る。細胞を次にさらに３０秒間揺動した後、予め加熱し
たＢＳＳ緩衝液（Ｃａ2+およびＭｇ2+なし）５ｍｌを同
様に約５分かけて絶えず攪拌しながら滴下する。
ミエローマ細胞（ＢＳＳ緩衝液中）を上記比率で混合
し、そして３００ｇおよび５℃の温度で１０分間遠心分
離する（ＭＳＥ遠心分離機，チルスピン型）。ペレット
をＢＳＳ緩衝液中に再懸濁し、そして次に懸濁液を再び
遠心分離する。ペレットを注意深い攪拌によりばらばら
にし、そして水浴中に３７℃で入れる。次いで予備加熱
した滅菌ＰＥＧ４０００（メルク）１ｍｌを６０秒かけ
て細胞に滴下し、この間全体の混合物は絶えずかき混ぜ
る。細胞を次にさらに３０秒間揺動した後、予め加熱し
たＢＳＳ緩衝液（Ｃａ2+およびＭｇ2+なし）５ｍｌを同
様に約５分かけて絶えず攪拌しながら滴下する。
【０１９３】上記のようにして融合させた細胞は次に遠
心分離され（３００ｇ，２０℃で１０分，ＭＳＥ遠心分
離機，チルスピン型）、そして上澄みが吸い出され、廃
棄される。細胞ペレットをＨＡＴ培地５０ｍｌ中に再懸
濁し、そしてこのようにして得られた細胞懸濁液は準備
された４つのコスタープレート（各ウエルの直径２４ｍ
ｍの２４ウエルのミクロタイタープレート；細胞成長の
ための全表面積２．０ｃｍ2 ）に分配される（０．５ｍ
ｌ／ウエル）。
心分離され（３００ｇ，２０℃で１０分，ＭＳＥ遠心分
離機，チルスピン型）、そして上澄みが吸い出され、廃
棄される。細胞ペレットをＨＡＴ培地５０ｍｌ中に再懸
濁し、そしてこのようにして得られた細胞懸濁液は準備
された４つのコスタープレート（各ウエルの直径２４ｍ
ｍの２４ウエルのミクロタイタープレート；細胞成長の
ための全表面積２．０ｃｍ2 ）に分配される（０．５ｍ
ｌ／ウエル）。
【０１９４】コスタープレートを３７℃の温度および６
％のＣＯ2 濃度で保温する。
％のＣＯ2 濃度で保温する。
【０１９５】実施例４：ハイブリッド細胞の培養 細胞融合１日後、ＨＡＴ培地１ｍｌを培養プレートの各
ウエルに添加する。細胞融合３ないし４日後、顕微鏡下
で融合された細胞を調べる。同時に使用された培地を吸
い出し、そして新鮮ＨＡＴ培地１ｍｌに置き換える。さ
らに３日後（細胞融合６−７日後）、培養培地を再び変
える。細胞融合７ないし１０日後、各ウエルを顕微鏡下
でハイブリッドを求めて追跡し、そして培地を１週間に
２または３回交換する。
ウエルに添加する。細胞融合３ないし４日後、顕微鏡下
で融合された細胞を調べる。同時に使用された培地を吸
い出し、そして新鮮ＨＡＴ培地１ｍｌに置き換える。さ
らに３日後（細胞融合６−７日後）、培養培地を再び変
える。細胞融合７ないし１０日後、各ウエルを顕微鏡下
でハイブリッドを求めて追跡し、そして培地を１週間に
２または３回交換する。
【０１９６】ハイブリッドがウエル中で成長するとすぐ
（通常２ないし４週間後）、その中のＨＡＴ培地はＨＴ
培地に代えてもよい。成長したハイブリッド培養液から
の上澄み（ウエルの少なくとも１０％）が滅菌パスツー
ルピペットで除去され、そして抗体の存在に対して試験
される。
（通常２ないし４週間後）、その中のＨＡＴ培地はＨＴ
培地に代えてもよい。成長したハイブリッド培養液から
の上澄み（ウエルの少なくとも１０％）が滅菌パスツー
ルピペットで除去され、そして抗体の存在に対して試験
される。
【０１９７】ウエルが陽性ハイブリッドコロニーの成長
により被覆されるとすぐに、該ハイブリッドコロニーを
ＲＰＭＩ１６４０培地中の新たなコスタープレートに移
してもよく、このとき成長して被覆されている１つのウ
エルの内容物は新たな２または３個のウエルに分配され
る。
により被覆されるとすぐに、該ハイブリッドコロニーを
ＲＰＭＩ１６４０培地中の新たなコスタープレートに移
してもよく、このとき成長して被覆されている１つのウ
エルの内容物は新たな２または３個のウエルに分配され
る。
【０１９８】実施例５：陽性ハイブリッド細胞のクロー
ニング ピペットを用いて陽性ウエル中の細胞を分離し、そして
チューブ内の培地１ｍｌ中に移す。細胞数の決定のため
に一部を次に除去し、そしてＦＤＡで染色する（ＦＤＡ
で希釈１：２，細胞５０μｌ＋顔料５０μｌ）。好まし
い細胞数は１０ 5 ないし１０6 細胞／ｍｌである。ハイ
ブリッド細胞を次にＨＴ培地で１：１００の比率で希釈
する（例えば細胞１００μｌ＋ＨＴ培地９．９ｍｌ）。
ニング ピペットを用いて陽性ウエル中の細胞を分離し、そして
チューブ内の培地１ｍｌ中に移す。細胞数の決定のため
に一部を次に除去し、そしてＦＤＡで染色する（ＦＤＡ
で希釈１：２，細胞５０μｌ＋顔料５０μｌ）。好まし
い細胞数は１０ 5 ないし１０6 細胞／ｍｌである。ハイ
ブリッド細胞を次にＨＴ培地で１：１００の比率で希釈
する（例えば細胞１００μｌ＋ＨＴ培地９．９ｍｌ）。
【０１９９】ＨＴ培地２５ｍｌを２本の５０ｍｌファル
コンチューブに入れ、各々のチューブをマクロファージ
懸濁液５ｍｌで全量３０ｍｌとする。マクロファージを
マウスから予め単離され、そしてＨＴ培地１０ｍｌ中に
再懸濁されていた（項３．１参照）。
コンチューブに入れ、各々のチューブをマクロファージ
懸濁液５ｍｌで全量３０ｍｌとする。マクロファージを
マウスから予め単離され、そしてＨＴ培地１０ｍｌ中に
再懸濁されていた（項３．１参照）。
【０２００】細胞濃度が（ｉ）２７０細胞／３０ｍｌま
たは（ｉｉ）９０細胞／３０ｍｌに達するまでハイブリ
ッド細胞をマクロファージ含有ファルコンチューブ中で
希釈する。これらの混合物を次にコスタープレート（９
６ウエルのミクロタイタープレート）上に、各ウエルが
２００μｌとなるように分配する。これはそれぞれ細胞
数（ｉ）１．８細胞／ウエルまたは（ｉｉ）０．６細胞
／ウエルに相当する。１．５ミクロタイタープレートが
各希釈のためのこの方法において必要とされる。
たは（ｉｉ）９０細胞／３０ｍｌに達するまでハイブリ
ッド細胞をマクロファージ含有ファルコンチューブ中で
希釈する。これらの混合物を次にコスタープレート（９
６ウエルのミクロタイタープレート）上に、各ウエルが
２００μｌとなるように分配する。これはそれぞれ細胞
数（ｉ）１．８細胞／ウエルまたは（ｉｉ）０．６細胞
／ウエルに相当する。１．５ミクロタイタープレートが
各希釈のためのこの方法において必要とされる。
【０２０１】７日後、個々のウエルを顕微鏡下で調べ、
そして細胞クローンを含むウエルに注意する。ウエルの
約５０％が細胞クローンを含む希釈がエリザ試験のため
に用いられる。これは一般に０．６細胞／ウエルの希釈
であることが望ましい。約７−１０日後、陽性細胞の上
澄み（クローンと共に）がモノクローナル抗体の存在に
対してエリザ試験で試験され、そして陽性クローンをＲ
ＰＭＩ１６４０培地中コスタープレート（２４ウエル）
上で成長させる。これら陽性クローンの一部は液体窒素
中に保存される。
そして細胞クローンを含むウエルに注意する。ウエルの
約５０％が細胞クローンを含む希釈がエリザ試験のため
に用いられる。これは一般に０．６細胞／ウエルの希釈
であることが望ましい。約７−１０日後、陽性細胞の上
澄み（クローンと共に）がモノクローナル抗体の存在に
対してエリザ試験で試験され、そして陽性クローンをＲ
ＰＭＩ１６４０培地中コスタープレート（２４ウエル）
上で成長させる。これら陽性クローンの一部は液体窒素
中に保存される。
【０２０２】実施例６：ハイブリドーマスクリーニング
（エリザ試験） 炭酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．６）中のＢ
ＳＡ複合ハプテン溶液（２μ／ｍｌ）１００μｌを最初
にミクロタイタープレートの個々のウエル中に入れ、そ
してこの混合物を湿度室中４℃で一晩保温する。次いで
各ウエルを０．１％ＰＢＳツイーン緩衝液で５回洗浄す
る。ミクロタイタープレート上の未占有結合部位をブロ
ックするために、ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液（１％）２００μ
ｌを各ウエル中に入れる。この混合物を室温で１−２時
間保温し、次に０．１％強度のＰＢＳツイーン緩衝液で
洗浄する。
（エリザ試験） 炭酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．６）中のＢ
ＳＡ複合ハプテン溶液（２μ／ｍｌ）１００μｌを最初
にミクロタイタープレートの個々のウエル中に入れ、そ
してこの混合物を湿度室中４℃で一晩保温する。次いで
各ウエルを０．１％ＰＢＳツイーン緩衝液で５回洗浄す
る。ミクロタイタープレート上の未占有結合部位をブロ
ックするために、ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液（１％）２００μ
ｌを各ウエル中に入れる。この混合物を室温で１−２時
間保温し、次に０．１％強度のＰＢＳツイーン緩衝液で
洗浄する。
【０２０３】ＰＢＳツイーン緩衝液（０．１％）で１：
２の比率に希釈したハイブリドーマ上澄み２００μｌを
次に各ウエル中に入れ、そして全体の混合物を室温で２
時間保温する。次いでウエルを０．１％ＰＢＳツイーン
緩衝液で５回洗浄する。
２の比率に希釈したハイブリドーマ上澄み２００μｌを
次に各ウエル中に入れ、そして全体の混合物を室温で２
時間保温する。次いでウエルを０．１％ＰＢＳツイーン
緩衝液で５回洗浄する。
【０２０４】この次にホスファターゼ複合ヤギ抗マウス
抗体（キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリー）
と保温する。アフィニティークロマトグラフィーにより
精製され、そしてＰＢＳツイーン（０．１％）（キルケ
ガード・アンド・ペリー・ラボラトリー）中１：１５０
０の希釈で存在し、そしてアルカリホスファターゼで標
識されているマウスＩｇＧに対するヤギ抗体１００μｌ
を最初に各ウエルに添加する。
抗体（キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリー）
と保温する。アフィニティークロマトグラフィーにより
精製され、そしてＰＢＳツイーン（０．１％）（キルケ
ガード・アンド・ペリー・ラボラトリー）中１：１５０
０の希釈で存在し、そしてアルカリホスファターゼで標
識されているマウスＩｇＧに対するヤギ抗体１００μｌ
を最初に各ウエルに添加する。
【０２０５】保温時間は室温で１．５時間である。個々
のウエルを次に再び０．１％ＰＢＳツイーン緩衝液で５
回洗浄する。
のウエルを次に再び０．１％ＰＢＳツイーン緩衝液で５
回洗浄する。
【０２０６】基質含有溶液（１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロ
フェニルホスフェート）１５０μｌを各ウエル中に入れ
る。暗所中２時間の保温の後、４０５ｎｍでの分光分析
を行う。特異的な抗体を分泌する陽性ハイブリドーマ細
胞は選択された波長で強い陽性信号を与える。これらの
細胞を次に限界希釈法[Goding (1980)] によりクローン
化する。純粋なモノクローナル抗体は適切に処置された
マウスの腹水から得られる〔２〕。
フェニルホスフェート）１５０μｌを各ウエル中に入れ
る。暗所中２時間の保温の後、４０５ｎｍでの分光分析
を行う。特異的な抗体を分泌する陽性ハイブリドーマ細
胞は選択された波長で強い陽性信号を与える。これらの
細胞を次に限界希釈法[Goding (1980)] によりクローン
化する。純粋なモノクローナル抗体は適切に処置された
マウスの腹水から得られる〔２〕。
【０２０７】実施例７：ハイブリドーマ細胞のマウス中
での増殖 腹水産生を刺激するために、メスのＢａｌｂ／ｃマウス
（２０ｇ−２５ｍｇ）（チエルファルム・ズィゼルン，
スイス国）を腹膜腔内注射によりプリスタン油（アルド
リッチ・ケミカル）０．３ｍｌで前処理する。プリスタ
ン投与の１ないし３週間後、マウスに第２の注射（プリ
スタン油０．２ｍｌ）を行う。該第２の注射と同時に、
動物はＰＢＳ０．２ｍｌ中の２×１０6 のハイブリドー
マ細胞を受容する。
での増殖 腹水産生を刺激するために、メスのＢａｌｂ／ｃマウス
（２０ｇ−２５ｍｇ）（チエルファルム・ズィゼルン，
スイス国）を腹膜腔内注射によりプリスタン油（アルド
リッチ・ケミカル）０．３ｍｌで前処理する。プリスタ
ン投与の１ないし３週間後、マウスに第２の注射（プリ
スタン油０．２ｍｌ）を行う。該第２の注射と同時に、
動物はＰＢＳ０．２ｍｌ中の２×１０6 のハイブリドー
マ細胞を受容する。
【０２０８】この処置から生じる腹水を集め、８００ｇ
で遠心分離し、そして−２０℃の温度で保存する。解凍
後、腹水を３００００ｇで１時間遠心分離する。主に脂
質を含む上層を廃棄する。次いでタンパク質濃度を決定
し、ＰＢＳを添加することにより１０ｍｇ／ｍｌの値に
調整する。
で遠心分離し、そして−２０℃の温度で保存する。解凍
後、腹水を３００００ｇで１時間遠心分離する。主に脂
質を含む上層を廃棄する。次いでタンパク質濃度を決定
し、ＰＢＳを添加することにより１０ｍｇ／ｍｌの値に
調整する。
【０２０９】免疫グロブリンＧ画分（ＩｇＧ）を飽和硫
酸アンモニウム溶液０．９容量部の０℃での滴下により
沈殿させる。１時間後、ＩｇＧ画分を２２０００ｇで１
時間遠心分離することによりペレット化する。次いでペ
レットを５０ｍＭＮａＣｌ含有の２０ｍＭトリスＨＣｌ
緩衝液ｐＨ７．９中に溶解させ、そして同様の緩衝液に
対して４℃で透析する。
酸アンモニウム溶液０．９容量部の０℃での滴下により
沈殿させる。１時間後、ＩｇＧ画分を２２０００ｇで１
時間遠心分離することによりペレット化する。次いでペ
レットを５０ｍＭＮａＣｌ含有の２０ｍＭトリスＨＣｌ
緩衝液ｐＨ７．９中に溶解させ、そして同様の緩衝液に
対して４℃で透析する。
【０２１０】ＩｇＧ画分の引き続く仕上げはＤＥ−５２
ジエチルアミノエチルセルロース（ホワットマン）上で
の陰イオン交換クロマトグラフィーにより行う。試料
は、最終ＮａＣｌ濃度が２５ｍＭになるまで２０ｍＭト
リスＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．９で１：２（ｖ／ｖ）に希釈
され、そしてタンパク質１０ｍｇ／ゲルｍｌをカラムに
注入する。溶出はＮａＣｌ濃度を２５ｍＭないし２００
ｍＭまで増加させる（リニアグラジエント）ことにより
行われる。モノクローナル抗体は一般に８０ｍＭＮａＣ
ｌの領域に溶出される。
ジエチルアミノエチルセルロース（ホワットマン）上で
の陰イオン交換クロマトグラフィーにより行う。試料
は、最終ＮａＣｌ濃度が２５ｍＭになるまで２０ｍＭト
リスＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．９で１：２（ｖ／ｖ）に希釈
され、そしてタンパク質１０ｍｇ／ゲルｍｌをカラムに
注入する。溶出はＮａＣｌ濃度を２５ｍＭないし２００
ｍＭまで増加させる（リニアグラジエント）ことにより
行われる。モノクローナル抗体は一般に８０ｍＭＮａＣ
ｌの領域に溶出される。
【０２１１】その画分をＰＢＳに対して４℃で一晩透析
し、そして−７０℃で保存する。純度をドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）および等電点電気泳動により決定する。
し、そして−７０℃で保存する。純度をドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）および等電点電気泳動により決定する。
【０２１２】この場合の純度は９０％を越えている。
【０２１３】実施例８：トリアスルフロン検出 トリアスルフロンの検出は２段階競合エリザ試験により
行われる。
行われる。
【０２１４】５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
６）中のＢＳＡ複合ハプテン（ＢＳＡ複合ハプテン２０
０ｎｇ／炭酸ナトリウム緩衝液１００μｌ）をマイクロ
タイタープレート（例えばダイナテック，タイプＭ１２
９Ａ）上に最初に吸着させ、そして４℃で一晩保温す
る。なお、このＢＳＡ複合ハプテンは実施例１．３．１
または１．３．２に従って製造されたものである。
６）中のＢＳＡ複合ハプテン（ＢＳＡ複合ハプテン２０
０ｎｇ／炭酸ナトリウム緩衝液１００μｌ）をマイクロ
タイタープレート（例えばダイナテック，タイプＭ１２
９Ａ）上に最初に吸着させ、そして４℃で一晩保温す
る。なお、このＢＳＡ複合ハプテンは実施例１．３．１
または１．３．２に従って製造されたものである。
【０２１５】プレートを次に０．１％（ｖ／ｖ）ポリソ
ルベート２０（ツイーン２０）を補足したＰＢＳ緩衝液
（ＰＢＳ−ツイーン）で５回洗浄する。
ルベート２０（ツイーン２０）を補足したＰＢＳ緩衝液
（ＰＢＳ−ツイーン）で５回洗浄する。
【０２１６】ＰＢＳ−ＢＳＡを１％溶液（ｗ／ｖ）の形
態で添加することにより、固体支持材上に残る遊離結合
部位を次にブロックする。２２℃で２時間保温した後、
プレートをＰＢＳ−ツイーン（０．１％）で再び洗浄す
る。
態で添加することにより、固体支持材上に残る遊離結合
部位を次にブロックする。２２℃で２時間保温した後、
プレートをＰＢＳ−ツイーン（０．１％）で再び洗浄す
る。
【０２１７】予めクローン化したハイブリドーマ細胞
（１：２０００または１：４０００の希釈）の上澄み５
０μｌまたは予め精製したモノクローナル抗体（４０−
１２０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌをａ）トリアスルフロンま
たはトリアスルフロン類似体の増加する量を含む標準溶
液９５０μｌ、ｂ）トリアスルフロン含有水試料、また
はｃ）トリアスルフロン含有土壌抽出物と保温する。
〔ＰＢＳ−ツイーン（０．１％）が全ての希釈のために
使用される〕
（１：２０００または１：４０００の希釈）の上澄み５
０μｌまたは予め精製したモノクローナル抗体（４０−
１２０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌをａ）トリアスルフロンま
たはトリアスルフロン類似体の増加する量を含む標準溶
液９５０μｌ、ｂ）トリアスルフロン含有水試料、また
はｃ）トリアスルフロン含有土壌抽出物と保温する。
〔ＰＢＳ−ツイーン（０．１％）が全ての希釈のために
使用される〕
【０２１８】室温（２２℃）で１時間の保温後、抗原／
抗体混合物２００μｌをミクロタイタープレートの各ウ
エルに添加し、そして全体の混合物をさらに１時間保温
する。ウエルを次にＰＢＳ−ツイーン（０．１％）で５
回洗浄し、アルカリホスファターゼ（希釈１：１５０
０）に複合されているヤギ抗マウスＩｇＧ抗体１００μ
ｌ／ウエルを入れ、そして１．５時間保温する。
抗体混合物２００μｌをミクロタイタープレートの各ウ
エルに添加し、そして全体の混合物をさらに１時間保温
する。ウエルを次にＰＢＳ−ツイーン（０．１％）で５
回洗浄し、アルカリホスファターゼ（希釈１：１５０
０）に複合されているヤギ抗マウスＩｇＧ抗体１００μ
ｌ／ウエルを入れ、そして１．５時間保温する。
【０２１９】再び洗浄した後、１ｍｇ／ｍｌジエタノー
ルアミン緩衝液（１ｍＭ，ｐＨ９．８，０．５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 ×６Ｈ2 Ｏを補足）中に溶解された基質ｐ−ニ
トロフェニルホスフェート１５０μｌ／ウエルをウエル
に添加する。
ルアミン緩衝液（１ｍＭ，ｐＨ９．８，０．５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 ×６Ｈ2 Ｏを補足）中に溶解された基質ｐ−ニ
トロフェニルホスフェート１５０μｌ／ウエルをウエル
に添加する。
【０２２０】２２℃の温度で２時間保温した後、固相に
結合した抗原と反応した抗体量に比例する色変化が観察
される。起こった呈色反応の強度は４０５ｎｍの波長で
決定される。個々の試料の希釈は、０．３と０．５の間
の範囲の吸収が阻害剤（Ｂｏ）を添加せずに得られるよ
うに選択される。Ａ405 ≦０．０１の値が対照（抗体を
含まない）に対して得られる。全ての試料が３回測定さ
れる。
結合した抗原と反応した抗体量に比例する色変化が観察
される。起こった呈色反応の強度は４０５ｎｍの波長で
決定される。個々の試料の希釈は、０．３と０．５の間
の範囲の吸収が阻害剤（Ｂｏ）を添加せずに得られるよ
うに選択される。Ａ405 ≦０．０１の値が対照（抗体を
含まない）に対して得られる。全ての試料が３回測定さ
れる。
【０２２１】試料中に存在するトリアスルフロンの量を
決定するために、Ｂ／Ｂｏ×１００が阻害剤の濃度に対
してプロットされている計算曲線を最初に作成する。
（Ｂｏは抗体に対してトリアスルフロン阻害剤を添加せ
ずに計算された吸収を示し、そしてＢはトリアスルフロ
ン阻害剤の種々の濃度で添加されたときの吸収を示す）
Ｉ50値は固相への抗体の結合が５０％に阻害されている
抗原の濃度を示す。Ｉ50値は本発明の条件に特に適格化
され、そして４パラメータ記号論理的曲線〔１５〕に基
づいたＥＮＺＦＩＴＴＥＲ（レザーバロー，エルゼビー
ル−バイオソフト）曲線計算プログラムを用いて計算さ
れる。エリザの範囲内での土壌または水の試料中のトリ
アスルフロンの定量測定はまた、各マイクロタイタープ
レート上に含まれる標準に基づいた曲線を適合してＥＮ
ＺＦＩＴＴＥＲプログラムを用いて行われる。
決定するために、Ｂ／Ｂｏ×１００が阻害剤の濃度に対
してプロットされている計算曲線を最初に作成する。
（Ｂｏは抗体に対してトリアスルフロン阻害剤を添加せ
ずに計算された吸収を示し、そしてＢはトリアスルフロ
ン阻害剤の種々の濃度で添加されたときの吸収を示す）
Ｉ50値は固相への抗体の結合が５０％に阻害されている
抗原の濃度を示す。Ｉ50値は本発明の条件に特に適格化
され、そして４パラメータ記号論理的曲線〔１５〕に基
づいたＥＮＺＦＩＴＴＥＲ（レザーバロー，エルゼビー
ル−バイオソフト）曲線計算プログラムを用いて計算さ
れる。エリザの範囲内での土壌または水の試料中のトリ
アスルフロンの定量測定はまた、各マイクロタイタープ
レート上に含まれる標準に基づいた曲線を適合してＥＮ
ＺＦＩＴＴＥＲプログラムを用いて行われる。
【０２２２】実施例９．１：土壌試料の分析 種々の採取地からの標準土壌試料の一部（２ｇ）は以下
の方法に従って抽出される。：方法（Ａ）（文献〔８〕
に準拠）：試料１００ｇをメタノール：リン酸緩衝液
（ＰＢ）〔ｐＨ７．０，全体のリン酸塩濃度０．０７
Ｍ〕＝２：１（ｖ／ｖ）混合物３００ｍｌと震盪するこ
とにより抽出器中２時間抽出する。ろ過およびリン酸で
の酸性化の後、トリアスルフロンをＣＨ2 Ｃｌ2 ７５ｍ
ｌで３回再び抽出する。溶媒を蒸発させた後、試料をＰ
Ｂ緩衝液１０ｍｌ中に溶解し、そしてろ過により精製す
る。 方法（Ｂ）：方法（Ａ）による抽出を別の２種の試料で
繰り返し、そして最後の有機相を炭酸水素塩水溶液（５
％）と震盪することによりさらに精製する〔８〕。炭酸
水素テトラブチルアンモニウムの添加後、トリアスルフ
ロンをジクロロメタン／ｎ−ヘキサン（８０：２０）中
に再抽出する。有機相を蒸発させた後、トリアスルフロ
ンをＰＢ緩衝液１０ｍｌ中に採取する。試料をエリザ試
験に使用する前に、ＰＢＳツイーン０．１％中に１：２
０または１：４０の比率で希釈する。 方法（Ｃ）：この場合、震盪による抽出はテトラブチル
アンモニウムヒドロキシドを用いてメタノール／ＰＢ抽
出物と直接行われる。水相を次に液−液分別カートリッ
ジ〔登録商標クリンエルット(ClinElut)No. 1010，アナ
リチケム・インターナショナル，カリフォルニア州ハー
バーシティ〕に移し、そしてｎ−ヘキサン３０ｍｌで洗
浄する。トリアスルフロンをジクロロメタン／ｎ−ヘキ
サン（６０：４０）で溶出させる。有機相を蒸発させ、
そして残る残渣をＰＢＳ中に取り出す。
の方法に従って抽出される。：方法（Ａ）（文献〔８〕
に準拠）：試料１００ｇをメタノール：リン酸緩衝液
（ＰＢ）〔ｐＨ７．０，全体のリン酸塩濃度０．０７
Ｍ〕＝２：１（ｖ／ｖ）混合物３００ｍｌと震盪するこ
とにより抽出器中２時間抽出する。ろ過およびリン酸で
の酸性化の後、トリアスルフロンをＣＨ2 Ｃｌ2 ７５ｍ
ｌで３回再び抽出する。溶媒を蒸発させた後、試料をＰ
Ｂ緩衝液１０ｍｌ中に溶解し、そしてろ過により精製す
る。 方法（Ｂ）：方法（Ａ）による抽出を別の２種の試料で
繰り返し、そして最後の有機相を炭酸水素塩水溶液（５
％）と震盪することによりさらに精製する〔８〕。炭酸
水素テトラブチルアンモニウムの添加後、トリアスルフ
ロンをジクロロメタン／ｎ−ヘキサン（８０：２０）中
に再抽出する。有機相を蒸発させた後、トリアスルフロ
ンをＰＢ緩衝液１０ｍｌ中に採取する。試料をエリザ試
験に使用する前に、ＰＢＳツイーン０．１％中に１：２
０または１：４０の比率で希釈する。 方法（Ｃ）：この場合、震盪による抽出はテトラブチル
アンモニウムヒドロキシドを用いてメタノール／ＰＢ抽
出物と直接行われる。水相を次に液−液分別カートリッ
ジ〔登録商標クリンエルット(ClinElut)No. 1010，アナ
リチケム・インターナショナル，カリフォルニア州ハー
バーシティ〕に移し、そしてｎ−ヘキサン３０ｍｌで洗
浄する。トリアスルフロンをジクロロメタン／ｎ−ヘキ
サン（６０：４０）で溶出させる。有機相を蒸発させ、
そして残る残渣をＰＢＳ中に取り出す。
【０２２３】実施例９．２：水試料の分析 競合エリザのために、１０倍濃度のＰＢＳツイーン緩衝
液１００μｌを水試料８５０μｌに添加する。このバッ
チを次に抗トリアスルフロン抗体５０μｌと保温する。
液１００μｌを水試料８５０μｌに添加する。このバッ
チを次に抗トリアスルフロン抗体５０μｌと保温する。
【０２２４】Ｂ．結果 １）モノクローナル抗体の製造 （ａ）実施例１．３．１に従って製造されたＫＬＨ複合
体〔式（ＩＶ）で表されるトリアスルフロン複合体〕で
免疫感作されたマウスを用いた５種の融合結果物から始
めて、トリアスルフロンに対して高度の親和性を有する
モノクローナル抗体を産生する１個のハイブリドーマが
得られる〔ＭＡｂ４１３４−４０−１〕。融合率は約８
２％である。 （ｂ）実施例１．３．２に従って製造されたＫＬＨ複合
体〔式（Ｖ）で表されるトリアスルフロン複合体〕で免
疫感作されたマウスを用いた５種の融合結果物から始め
て、トリアスルフロンに対して高度の親和性を有するモ
ノクローナル抗体を産生する１９個のハイブリドーマが
得られる。それらの交差反応パターンに基づいて、ＭＡ
ｂ４１４７−１９−４およびＭＡｂ４１４９−１−１と
表される２群のモノクローナル抗体が区別され得る。両
方のＭＡｂはＩｇＧ１イソタイプに属する。
体〔式（ＩＶ）で表されるトリアスルフロン複合体〕で
免疫感作されたマウスを用いた５種の融合結果物から始
めて、トリアスルフロンに対して高度の親和性を有する
モノクローナル抗体を産生する１個のハイブリドーマが
得られる〔ＭＡｂ４１３４−４０−１〕。融合率は約８
２％である。 （ｂ）実施例１．３．２に従って製造されたＫＬＨ複合
体〔式（Ｖ）で表されるトリアスルフロン複合体〕で免
疫感作されたマウスを用いた５種の融合結果物から始め
て、トリアスルフロンに対して高度の親和性を有するモ
ノクローナル抗体を産生する１９個のハイブリドーマが
得られる。それらの交差反応パターンに基づいて、ＭＡ
ｂ４１４７−１９−４およびＭＡｂ４１４９−１−１と
表される２群のモノクローナル抗体が区別され得る。両
方のＭＡｂはＩｇＧ１イソタイプに属する。
【０２２５】これら２つのＭＡｂの交差反応パターンは
第Ｉ表に示すように非常に異なる。ＭＡｂ４１４７−１
９−４と異なり、ＭＡｂ４１４９−１−１はヒドロキシ
ル化トリアスルフロンとの顕著な交差反応性を示す。
第Ｉ表に示すように非常に異なる。ＭＡｂ４１４７−１
９−４と異なり、ＭＡｂ４１４９−１−１はヒドロキシ
ル化トリアスルフロンとの顕著な交差反応性を示す。
【０２２６】一方、ＭＡｂ４１４７−１９−４はその他
の多くのトリアスルフロン類似体、特にシノスルフロン
と交差反応性を示す。シノスルフロンとの交差反応性は
１５０％である。本発明に係るＭＡｂを用いるトリアス
ルフロンのより低い検出限界（緩衝液中）は０．０１な
いし１ｎｇ／ｍｌ緩衝液の範囲である。相当するＩ50値
はＭＡｂ４１４７−１９−４で０．０９ｎｇ／ｍｌであ
り、ＭＡｂ４１４９−１−１で０．０５ｎｇ／ｍｌであ
る。
の多くのトリアスルフロン類似体、特にシノスルフロン
と交差反応性を示す。シノスルフロンとの交差反応性は
１５０％である。本発明に係るＭＡｂを用いるトリアス
ルフロンのより低い検出限界（緩衝液中）は０．０１な
いし１ｎｇ／ｍｌ緩衝液の範囲である。相当するＩ50値
はＭＡｂ４１４７−１９−４で０．０９ｎｇ／ｍｌであ
り、ＭＡｂ４１４９−１−１で０．０５ｎｇ／ｍｌであ
る。
【０２２７】抽出された土壌試料の分析 トリアスルフロンを既知組成の標準土壌試料５種からの
抽出物に異なる濃度で添加し、次にＭＡｂ４１４７−１
９−４およびＭＡｂ４１４９−１−１を用いてエリザ試
験により決定される。結果を第ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ
表に示す。
抽出物に異なる濃度で添加し、次にＭＡｂ４１４７−１
９−４およびＭＡｂ４１４９−１−１を用いてエリザ試
験により決定される。結果を第ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ
表に示す。
【０２２８】この結果は、本発明に係るＭＡｂがエリザ
アッセイを用いる土壌試料中のトリアスルフロンの検出
に極めて適していることを示している。より低い検出限
界は約０．１ｐｐｂである。
アッセイを用いる土壌試料中のトリアスルフロンの検出
に極めて適していることを示している。より低い検出限
界は約０．１ｐｐｂである。
【０２２９】ＩＩ．寄託 本発明の範囲内で製造されそして使用されるハイブリド
ーマ細胞系は国際寄託機関に認められている英国サリス
バリィにあるヨーロピアン・コレクション・オブ・アニ
マル・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）に、特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
の要求に従って、寄託番号ＥＣＡＣＣ９００２ １７０
２、ＥＣＡＣＣ９００２ １７０３およびＥＣＡＣＣ９
００２１７０４の下に寄託された。寄託した試料の生存
の証明書は上記国際寄託機関により発行されている。 細胞系 寄託日 寄託番号 生存証明日 ──────────────────────────────── ハイブリドーマ 1990年 2月17日 9002 1702 1990年 2月17日 クローン4134-40-1 ハイブリドーマ 1990年 2月17日 9002 1703 1990年 2月17日 クローン4147-19-4 ハイブリドーマ 1990年 2月17日 9002 1704 1990年 2月17日 クローン4149-1-1 ────────────────────────────────
ーマ細胞系は国際寄託機関に認められている英国サリス
バリィにあるヨーロピアン・コレクション・オブ・アニ
マル・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）に、特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
の要求に従って、寄託番号ＥＣＡＣＣ９００２ １７０
２、ＥＣＡＣＣ９００２ １７０３およびＥＣＡＣＣ９
００２１７０４の下に寄託された。寄託した試料の生存
の証明書は上記国際寄託機関により発行されている。 細胞系 寄託日 寄託番号 生存証明日 ──────────────────────────────── ハイブリドーマ 1990年 2月17日 9002 1702 1990年 2月17日 クローン4134-40-1 ハイブリドーマ 1990年 2月17日 9002 1703 1990年 2月17日 クローン4147-19-4 ハイブリドーマ 1990年 2月17日 9002 1704 1990年 2月17日 クローン4149-1-1 ────────────────────────────────
【０２３０】ＩＩＩ．培地および緩衝液 （Ａ）ＲＰＭＩ１６４０培地 ＲＰＭＩ１６４０（セロメド）は以下の添加剤を含む： 子牛血清 １５％ Ｌ−グルタミン ４ｍＭ ゲンタマイシン ０．０１％ ピルビン酸ナトリウム １ｍＭ ２−メルカプトエタノール ５０μＭ インシュリン ５μＭ トランスフェリン ５μＭ セレニウム（ＩＴＳ） ５μＭ （Ｂ）ＨＡＴ培地 ベーリンガーからのＨＡＴ濃厚液（５０倍）２０ｍｌを
添加したＲＰＭＩ１６４０培地１リットルで以下の組成
を有する： ヒポキサンチン６８０ ５．０ｍｇ／ｌ アミノプテリン ８．８ｍｇ／ｌ チミジン １９３．８ｍｇ／ｌ （Ｃ）ＨＴ培地 ベーリンガーからのＨＡＴ濃厚液（５０倍）２０ｍｌを
添加したＲＰＭＩ１６４０培地１リットルで以下の組成
を有する： ヒポキサンチン６８０ ５．０ｍｇ／ｌ チミジン １９３．８ｍｇ／ｌ （Ｄ）ＢＳＳ緩衝液（Ｃａ2+およびＭｇ2+を含まないイ
ーグル塩溶液，ｐＨ７．４） ＫＣｌ ７．３ｍＭ ＮａＣｌ １１６．０ｍＭ ＮａＨＣＯ3 ２６．０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ １．０ｍＭ グルコース ５．５ｍＭ フェノールレッド ４８．０μＭ ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（セロメド）の１
％添加（ｖ／ｖ）（ペニシリン１００００Ｕ，１０ｍｇ
／ｍｌストレプトマイシン） （Ｅ）炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６） Ｎａ2 ＣＯ3 ４７７．０ｍｇ ＮａＨＣＯ3 ８７９．０ｍｇ ＮａＮ3 １．８ｍｇ Ｈ2 Ｏ ３００ｍｌ添加 （Ｆ）ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０） ＮａＣｌ ８．５ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ １．２８ｇ ＮａＨ2 ＰＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．４３６ｇ Ｈ2 Ｏ １０００ｍｌ添加 （Ｇ）ＰＢＳ−ツイーン２０（０．１％） ツイーン２０（セルバ）１ｍｌ＋ＰＢＳ１０００ｍｌ （Ｈ）ＰＢＳ−ＢＳＡ（１％） ＢＳＡ ５．０ｇ ＮａＮ3 ３．０ｍｌ ＰＢＳ ５００ｍｌ添加 （Ｉ）基質緩衝液（ジエタノールアミン緩衝液，ｐＨ
９．８） ジエタノールアミン ９７．０ｍｌ ＮａＮ3 （０．５Ｍ） ６．０ｍｌ ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ １００．０ｍｇ Ｈ2 Ｏ １０００ｍｌ添加 濃ＨＣｌでｐＨ９．８に調整 基質の調製：使用直前に、ｐ−ニトロフェニルホスフェ
ート基質（シグマ１０４）の基質タブレット１個（＝５
ｍｇ）を基質緩衝液５ｍｌ中に溶解する。
添加したＲＰＭＩ１６４０培地１リットルで以下の組成
を有する： ヒポキサンチン６８０ ５．０ｍｇ／ｌ アミノプテリン ８．８ｍｇ／ｌ チミジン １９３．８ｍｇ／ｌ （Ｃ）ＨＴ培地 ベーリンガーからのＨＡＴ濃厚液（５０倍）２０ｍｌを
添加したＲＰＭＩ１６４０培地１リットルで以下の組成
を有する： ヒポキサンチン６８０ ５．０ｍｇ／ｌ チミジン １９３．８ｍｇ／ｌ （Ｄ）ＢＳＳ緩衝液（Ｃａ2+およびＭｇ2+を含まないイ
ーグル塩溶液，ｐＨ７．４） ＫＣｌ ７．３ｍＭ ＮａＣｌ １１６．０ｍＭ ＮａＨＣＯ3 ２６．０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ １．０ｍＭ グルコース ５．５ｍＭ フェノールレッド ４８．０μＭ ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（セロメド）の１
％添加（ｖ／ｖ）（ペニシリン１００００Ｕ，１０ｍｇ
／ｍｌストレプトマイシン） （Ｅ）炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６） Ｎａ2 ＣＯ3 ４７７．０ｍｇ ＮａＨＣＯ3 ８７９．０ｍｇ ＮａＮ3 １．８ｍｇ Ｈ2 Ｏ ３００ｍｌ添加 （Ｆ）ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０） ＮａＣｌ ８．５ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ １．２８ｇ ＮａＨ2 ＰＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．４３６ｇ Ｈ2 Ｏ １０００ｍｌ添加 （Ｇ）ＰＢＳ−ツイーン２０（０．１％） ツイーン２０（セルバ）１ｍｌ＋ＰＢＳ１０００ｍｌ （Ｈ）ＰＢＳ−ＢＳＡ（１％） ＢＳＡ ５．０ｇ ＮａＮ3 ３．０ｍｌ ＰＢＳ ５００ｍｌ添加 （Ｉ）基質緩衝液（ジエタノールアミン緩衝液，ｐＨ
９．８） ジエタノールアミン ９７．０ｍｌ ＮａＮ3 （０．５Ｍ） ６．０ｍｌ ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ １００．０ｍｇ Ｈ2 Ｏ １０００ｍｌ添加 濃ＨＣｌでｐＨ９．８に調整 基質の調製：使用直前に、ｐ−ニトロフェニルホスフェ
ート基質（シグマ１０４）の基質タブレット１個（＝５
ｍｇ）を基質緩衝液５ｍｌ中に溶解する。
【０２３１】ＩＶ．参考文献
【表１】
【０２３２】Ｖ．表 第Ｉ表：種々のトリアスルフロン類似体とＭＡｂ４１３
４−４０−１、ＭＡｂ４１４７−１９−４およびＭＡｂ
４１４９−１−１との交差反応性
４−４０−１、ＭＡｂ４１４７−１９−４およびＭＡｂ
４１４９−１−１との交差反応性
【表２】 ａ）Ｉ50＝対照と比較して５０％までエリザ信号を低下
させる阻害剤濃度 ｂ）交差反応性＝（５０％阻害のためのトリアスルフロ
ン濃度）／（５０％阻害のためのトリアスルフロン類似
体濃度）×１００ トリアスルフロン類似体ＡないしＴは以下の構造式で表
される。
させる阻害剤濃度 ｂ）交差反応性＝（５０％阻害のためのトリアスルフロ
ン濃度）／（５０％阻害のためのトリアスルフロン類似
体濃度）×１００ トリアスルフロン類似体ＡないしＴは以下の構造式で表
される。
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【０２３３】第ＩＩ表：標準土壌試料抽出物へのトリア
スルフロンの添加後に該抽出物中に見出されたトリアス
ルフロン百分率（％）
スルフロンの添加後に該抽出物中に見出されたトリアス
ルフロン百分率（％）
【表７】 （ａ）方法Ａに従って調製された土壌抽出物（実施例
９．１参照） （ｂ）ＰＢＳツイーン中に得られたトリアスルフロンを
標準として計算された値（５回の実験の平均） （ｃ）〔（添加後に測定されたｐｐｂ−添加前に測定さ
れたｐｐｂ）／添加されたｐｐｂ〕×１００
９．１参照） （ｂ）ＰＢＳツイーン中に得られたトリアスルフロンを
標準として計算された値（５回の実験の平均） （ｃ）〔（添加後に測定されたｐｐｂ−添加前に測定さ
れたｐｐｂ）／添加されたｐｐｂ〕×１００
【０２３４】第ＩＩＩ表：土壌マトリックス効果：異な
る抽出方法の比較
る抽出方法の比較
【表８】 ａ）実施例９．１参照 ｂ）ＰＢＳツイーン中に得られたトリアスルフロンを標
準として計算された値（各試験４ないし８回の実験の平
均） ｎｄ：測定されず
準として計算された値（各試験４ないし８回の実験の平
均） ｎｄ：測定されず
【０２３５】第ＩＶ表：トリアスルフロンを補足した種
々の土壌試料からのトリアスルフロンの回収
々の土壌試料からのトリアスルフロンの回収
【表９】 （ａ）方法Ｃに従って調製された土壌抽出物（実施例
９．１参照） （ｂ）ＰＢＳツイーン中に得られたトリアスルフロンを
標準として計算された値（４回の実験の平均） （ｃ）〔（添加後に測定されたｐｐｂ−添加前に測定さ
れたｐｐｂ）／添加されたｐｐｂ〕×１００ （ｄ）ＳＤ，標準偏差；ＣＶ，変差係数
９．１参照） （ｂ）ＰＢＳツイーン中に得られたトリアスルフロンを
標準として計算された値（４回の実験の平均） （ｃ）〔（添加後に測定されたｐｐｂ−添加前に測定さ
れたｐｐｂ）／添加されたｐｐｂ〕×１００ （ｄ）ＳＤ，標準偏差；ＣＶ，変差係数
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ａ０１Ｎ 47/36 １０１ Ｅ 8930−4Ｈ Ｃ０７Ｄ 251/16 7019−4Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 クラウス ラムシユタイネル スイス国 4132 ムツテンツ シユツツエ ンハオスシユトラーセ 44 (72)発明者 ヴイリイ メイエル スイス国 4125 リーエン タルヴエーク 49
Claims (58)
- 【請求項１】（ａ）標的分子のスルホンアミド部分を実
質的に含む連結性成分が適当な高分子量担体分子と複合
され、 （ｂ）供与動物が（ａ）に従って製造された複合体で免
疫感作され、 （ｃ）免疫適格Ｂ細胞が免疫感作された供与動物から単
離され、 （ｄ）該免疫適格Ｂ細胞が連続的に細胞分裂し得る腫瘍
細胞と融合され、 （ｅ）生成する融合物が単離され、そして選択の後、所
望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞がクローン化さ
れ、そして （ｆ）モノクローナル抗体を製造するために該ハイブリ
ドーマ細胞が試験管内または生体内で培養される、こと
からなる１種またはそれ以上のスルホニル尿素除草剤に
対して高度の特異性および親和性を有するモノクローナ
ル抗体の製造方法。 - 【請求項２】 前記スルホンアミド部分が置換アリール
スルホニル基である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記アリール基がフェニル基、ピリジル
基、チエニル基またはピラゾリル基である請求項２記載
の方法。 - 【請求項４】 前記スルホニル尿素除草剤が次式
（Ａ）： 【化１】 （式中、ｎが１ないし１０の整数である場合、ＲはＣＯ
ＯＨを表し、そしてｎが２ないし１０の整数である場
合、ＲはＣＯＯＨ、ＮＨ2 またはＳＨを表す）で表され
るトリアジン環の４位にＲ−（ＣＨ2 ）n −Ｏ−基を有
する化合物である請求項１ないし３のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項５】 スルホンアミド部分として次式（Ｂ）： 【化２】 （式中、Ｒ’はＣＯＯＨ、ＮＨ2 またはＳＨを表し、そ
してｎは１ないし１０の整数を表す）で表される安定化
された断片が使用される請求項１ないし４のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項６】 式（Ａ）中のＲがＮＨ2 を表し、そして
ｎが２ないし６の整数を表す請求項１ないし５のいずれ
か１項に記載の方法。 - 【請求項７】 ＲがＮＨ2 を表し、そしてｎが３を表す
請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 式（Ｂ）中のＲ’がＣＯＯＨを表し、そ
してｎが１ないし６の整数を表す請求項１ないし７のい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 Ｒ’がＣＯＯＨを表し、そしてｎが２を
表す請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 請求項１ないし９のいずれか１項に記
載の方法に従って製造された、１種またはそれ以上のス
ルホニル尿素除草剤に対して高度の特異性および親和性
を有するモノクローナル抗体。 - 【請求項１１】 トリアスルフロンに対して高度の特異
性および親和性を有し、そして非常に多くの構造的に関
連するトリアスルフロン類似体と交差反応性を実質的に
示さないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
細胞系。 - 【請求項１２】 トリアスルフロンに対して高度の特異
性および親和性を有し、そしてプリミスルフロン、スル
ホメツロン−メチル、トリベヌロン−メチル、チアメツ
ロン−メチル、クロロスルフロン、ベンスルフロン−メ
チル、メツスルフロン−メチル、ニコスルフロン−メチ
ルおよびＤＰＸ９６３６からなる群から選択される構造
的に関連する化合物と交差反応性を実質的に示さないモ
ノクローナル抗体を産生する請求項１１記載のハイブリ
ドーマ細胞系。 - 【請求項１３】 トリアスルフロンに対して高度の特異
性および親和性を有し、そしてプリミスルフロン、スル
ホメツロン−メチル、トリベヌロン−メチル、チアメツ
ロン−メチル、クロロスルフロン、ベンスルフロン−メ
チル、メツスルフロン−メチル、ニコスルフロン−メチ
ルおよびＤＰＸ９６３６からなる群から選択される構造
的に関連するトリアスルフロン類似体とは１．０％未満
の交差反応性を示すモノクローナル抗体を産生する請求
項１１記載のハイブリドーマ細胞系。 - 【請求項１４】 ＥＣＡＣＣ９００２ １７０２の特徴
を有する請求項１３記載のハイブリドーマ細胞系並びに
それらのクローンおよびサブクローン。 - 【請求項１５】 ＥＣＡＣＣ９００２ １７０３の特徴
を有する請求項１３記載のハイブリドーマ細胞系並びに
それらのクローンおよびサブクローン。 - 【請求項１６】 トリアスルフロンに対して高度の特異
性および親和性を有し、そしてプリミスルフロン、スル
ホメツロン−メチル、トリベヌロン−メチル、チアメツ
ロン−メチル、クロロスルフロン、ベンスルフロン−メ
チル、メツスルフロン−メチル、ニコスルフロン−メチ
ルおよびＤＰＸ９６３６からなる群から選択される構造
的に関連するトリアスルフロン類似体とは０．１％未満
の交差反応性を示すモノクローナル抗体を産生する請求
項１１記載のハイブリドーマ細胞系。 - 【請求項１７】 ＥＣＡＣＣ９００２ １７０４の特徴
を有する請求項１６記載のハイブリドーマ細胞系並びに
それらのクローンおよびサブクローン。 - 【請求項１８】 出発物の特徴を依然有する、すなわち
１種またはそれ以上のスルホニル尿素除草剤に対して高
度の特異性および親和性を有するモノクローナル抗体の
合成および周囲の培地中への分泌が依然可能である請求
項１１ないし１７のいずれか１項に記載のハイブリドー
マ細胞系の突然変異体または変種。 - 【請求項１９】 トリアスルフロンに対して高度の特異
性および親和性を有し、そして非常に多くの構造的に関
連するトリアスルフロン類似体と交差反応性を実質的に
示さないモノクローナル抗体またはその誘導体。 - 【請求項２０】 トリアスルフロンに対して高度の特異
性および親和性を有し、そしてプリミスルフロン、スル
ホメツロン−メチル、トリベヌロン−メチル、チアメツ
ロン−メチル、クロロスルフロン、ベンスルフロン−メ
チル、メツスルフロン−メチル、ニコスルフロン−メチ
ルおよびＤＰＸ９６３６からなる群から選択されるトリ
アスルフロン類似体と交差反応性を実質的に示さない請
求項１９記載のモノクローナル抗体またはその誘導体。 - 【請求項２１】 トリアスルフロンに対して高度の特異
性および親和性を有し、そしてプリミスルフロン、スル
ホメツロン−メチル、トリベヌロン−メチル、チアメツ
ロン−メチル、クロロスルフロン、ベンスルフロン−メ
チル、メツスルフロン−メチル、ニコスルフロン−メチ
ルおよびＤＰＸ９６３６からなる群から選択される構造
的に関連するトリアスルフロン類似体とは１．０％未満
の交差反応性を示す請求項１９記載のモノクローナル抗
体またはその誘導体。 - 【請求項２２】 ＥＣＡＣＣ９００２ １７０２の特徴
を有するハイブリドーマ細胞系から得られる請求項２１
記載のモノクローナル抗体またはその誘導体。 - 【請求項２３】 ＥＣＡＣＣ９００２ １７０３の特徴
を有するハイブリドール細胞系から得られる請求項２１
記載のモノクローナル抗体またはその誘導体。 - 【請求項２４】 トリアスルフロンに対して高度の特異
性および親和性を有し、そしてプリミスルフロン、スル
ホメツロン−メチル、トリベヌロン−メチル、チアメツ
ロン−メチル、クロロスルフロン、ベンスルフロン−メ
チル、メツスルフロン−メチル、ニコスルフロン−メチ
ルおよびＤＰＸ９６３６からなる群から選択される構造
的に関連するトリアスルフロン類似体とは０．１％未満
の交差反応性を示す請求項１９記載のモノクローナル抗
体またはその誘導体。 - 【請求項２５】 ＥＣＡＣＣ９００２ １７０４の特徴
を有するハイブリドーマ細胞系から得られる請求項２４
記載のモノクローナル抗体またはその誘導体。 - 【請求項２６】（ａ）適当なトリアスルフロン連結性成
分が合成され、そして担体分子と複合され、 （ｂ）供与動物が該複合体で免疫感作され、 （ｃ）免疫適格Ｂ細胞が免疫感作された供与動物から単
離され、 （ｄ）該免疫適格Ｂ細胞が連続的に細胞分裂し得る腫瘍
細胞系と融合され、 （ｅ）生成する融合物が単離され、適当な培養培地中で
培養され、そして陽性ハイブリドーマ細胞がクローン化
され、そして （ｆ）所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が選択
される、請求項１１記載のハイブリードーマ細胞系の製
造方法。 - 【請求項２７】 スルホニル尿素連結性成分との連結反
応に自由に利用される反応基を含み、そして該スルホニ
ル尿素成分に免疫原性を付与し得る巨大分子化合物が担
体分子として使用される請求項１ないし９または２６の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２８】 分子量が１００００ないし１５０００
００のリシンに富むタンパク質が使用される請求項２７
記載の方法。 - 【請求項２９】 スルホニル尿素連結性成分の担体分子
への複合が直接起こるか、または担体分子の反応基と相
互作用し得る１種またはそれ以上の反応基を有するスペ
ーサー断片（スペーサー）を介して起こる請求項１ない
し９または２６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３０】 前記反応基がカルボキシル基、アミノ
基またはＳＨ基である請求項２９記載の方法。 - 【請求項３１】 前記スルホニル尿素連結性成分が次式
（Ａ）： 【化３】 （式中、ｎが１ないし１０の整数である場合、ＲはＣＯ
ＯＨを表し、そしてｎが２ないし１０の整数である場
合、ＲはＣＯＯＨ、ＮＨ2 またはＳＨを表す）で表され
るトリアジン環の４位にＲ−（ＣＨ2 ）n −Ｏ−基を有
する化合物である請求項２６記載の方法。 - 【請求項３２】 前記スルホニル尿素連結性成分が次式
（Ｂ）： 【化４】 （式中、Ｒ’はＣＯＯＨ、ＮＨ2 またはＳＨを表し、そ
してｎは１ないし１０の整数を表す）で表される化合物
である請求項２６記載の方法。 - 【請求項３３】 連結反応が活性エステル法またはジア
ゾニウム法を用いて行われる請求項１ないし９または２
６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３４】 供与動物の免疫感作が連結性成分と担
体分子とからなる複合体の１回またはそれ以上の投与に
より行われる請求項１ないし９または２６のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項３５】 投与が静脈内注射、腹膜腔内注射もし
くは皮下注射またはそれらの組合せの形態で行われる請
求項３４記載の方法。 - 【請求項３６】 ＨＡＴ選択培地が融合ハイブリッド細
胞の選択のために使用される請求項１ないし９または２
６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３７】 陽性モノクローナル抗体産生性ハイブ
リッド細胞培養物が限界希釈法により分離され、次に適
当名培養培地中でクローン化される請求項１ないし９ま
たは２６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３８】 請求項３７記載の方法に従ってクロー
ン化されたハイブリドーマ細胞クローンが適当なモノク
ローナル抗体の形成に対するイムノアッセイにより試験
される請求項１ないし９または２６のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項３９】 請求項１１ないし１８のいずれか１項
に記載のハイブリドール細胞系が生体内または試験管内
で公知方法により培養され、そして産生されるモノクロ
ーナル抗体が単離されるモノクローナル抗体の調製方
法。 - 【請求項４０】 請求項１０記載のモノクローナル抗体
が使用されるスルホニル尿素除草剤の免疫学的検出方
法。 - 【請求項４１】 請求項１９ないし２５のいずれか１項
に記載のモノクローナル抗体が使用されるトリアスルフ
ロンの免疫学的検出方法。 - 【請求項４２】 使用されるモノクローナル抗体が、Ｅ
ＣＡＣＣ９００２１７０２の特徴を有するハイブリドー
マ細胞系またはそのクローンもしくはサブクローンから
得られる請求項４１記載のトリアスルフロンの免疫学的
検出方法。 - 【請求項４３】 使用されるモノクローナル抗体が、Ｅ
ＣＡＣＣ９００２１７０３の特徴を有するハイブリドー
マ細胞系またはそのクローンもしくはサブクローンから
得られる請求項４１記載のトリアスルフロンの免疫学的
検出方法。 - 【請求項４４】 使用されるモノクローナル抗体が、Ｅ
ＣＡＣＣ９００２１７０４の特徴を有するハイブリドー
マ細胞系またはそのクローンもしくはサブクローンから
得られる請求項４１記載のトリアスルフロンの免疫学的
検出方法。 - 【請求項４５】 競合的イムノアッセイである請求項４
０ないし４４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項４６】 慣用の支持材、試薬およびその他の添
加剤の他に、試薬として請求項１０記載のモノクローナ
ル抗体を少なくとも１種含有する、使用のために調整さ
れている試験キットの形態にあるスルホニル尿素除草剤
の免疫学的検出用組成物。 - 【請求項４７】 慣用の支持材、試薬およびその他の添
加剤の他に、試薬として請求項１９ないし２５のいずれ
か１項に記載のモノクローナル抗体を少なくとも１種含
有する、使用のために調整されている試験キットの形態
にあるトリアスルフロンの免疫学的検出用組成物。 - 【請求項４８】 慣用の支持材、試薬およびその他の添
加剤の他に、ＥＣＡＣＣ９００２ １７０２の特徴を有
するハイブリドーマ細胞系またはそのクローンもしくは
サブクローンから得られるモノクローナル抗体を少なく
とも１種含有する、請求項４７記載の使用のために調整
されている試験キットの形態にあるトリアスルフロンの
免疫学的検出用組成物。 - 【請求項４９】 慣用の支持材、試薬およびその他の添
加剤の他に、ＥＣＡＣＣ９００２ １７０３の特徴を有
するハイブリドーマ細胞系またはそれらのクローンもし
くはサブクローンから得られるモノクローナル抗体を少
なくとも１種含有する、請求項４７記載の使用のために
調整されている試験キットの形態にあるトリアスルフロ
ンの免疫学的検出用組成物。 - 【請求項５０】 慣用の支持材、試薬およびその他の添
加剤の他に、ＥＣＡＣＣ９００２ １７０４の特徴を有
するハイブリドーマ細胞系またはそれらのクローンもし
くはサブクローンから得られるモノクローナル抗体を少
なくとも１種の含有する、請求項４７記載の使用のため
に調整されている試験キットの形態にあるトリアスルフ
ロンの免疫学的検出用組成物。 - 【請求項５１】 次式（Ａ）： 【化５】 （式中、ｎが１ないし１０の整数である場合、ＲはＣＯ
ＯＨを表し、そしてｎが２ないし１０の整数である場
合、ＲはＣＯＯＨ、ＮＨ2 またはＳＨを表す）で表され
るトリアジン環の４位にＲ−（ＣＨ2 ）n −Ｏ−基を有
するトリアスルフロン連結性成分。 - 【請求項５２】 ＲがＮＨ2 を表し、そしてｎが２ない
し６の整数を表す請求項５１記載のトリアスルフロン連
結性成分。 - 【請求項５３】 ＲがＮＨ2 を表し、そしてｎが３を表
す請求項５２記載のトリアスルフロン連結性成分。 - 【請求項５４】 次式（Ｂ）： 【化６】 （式中、Ｒ’はＣＯＯＨ、ＮＨ2 またはＳＨを表し、そ
してｎは１ないし１０の整数を表す）で表されるトリア
スルフロン連結性成分。 - 【請求項５５】 Ｒ’がＣＯＯＨを表し、そしてｎが１
ないし６の整数を表す請求項５４記載のトリアスルフロ
ン連結性成分。 - 【請求項５６】 Ｒ’がＣＯＯＨを表し、そしてｎが２
を表す請求項５５記載のトリアスルフロン連結性成分。 - 【請求項５７】 スルホニル尿素除草剤をそれ自体公知
の方法によりスルホンアミド官能部分で加水分解的に切
断し、そしてそのようにして得られる−ＳＯ2 ＮＨ2 基
を反応性カルボン酸誘導体と反応させ、そして場合によ
り、生成するＣＯＯＨ末端基を公知方法によりＮＨ2 基
またはＳＨ基に変換することからなる、スルホニル尿素
分子のスルホンアミド部分を実質的に含み、かつ適当な
高分子量担体分子に連結されて供与動物中で前記スルホ
ンアミド部分に対して向けられた特異的免疫応答を誘発
し得るスルホニル尿素連結性成分の製造方法。 - 【請求項５８】 前記連結性成分が次式（Ｂ）： 【化７】 （式中、Ｒ’はＣＯＯＨ、ＮＨ2 またはＳＨを表し、そ
してｎは１ないし１０の整数を表す）で表されるトリア
スルフロン連結性成分である請求項３８記載の方法。
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