JPH03183497A - 四環式化合物に対するモノクローナル抗体、それらの生産方法および応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｒ−（−）−オキサプロチリンおよびそれの
代謝産物Ｒ−（−）−オキサプロチリンβ−グルクロニ
ドに対して向けられたモノクローナル抗体、それらの誘
導体、前記抗体およびそれらの誘導体の調製方法、前記
モノクローナル抗体を分泌するハイプリドーマ細胞系、
そのようなハイブリドーマの調製方法、前記モノクロー
ナル抗体および／またはそれらの誘導体を含有するテス
トキット、そしてＲ−（−）−オキサプロチリンおよび
Ｒ−（−）−オキサプロチリンβ−グルクロニドの定性
および定量のため並びにＲ−（−）−オキサプロチリン
の過量による中毒症の治療のための前記モノクローナル
抗体および／またはそれらの誘導体の利用に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕Ｒ−
（−）−オキサプロチリンは下式（１）の四環式化合物
である。

それは抗うつ薬として有用であり、そして例えば、抗侵
略性および抗ヒスタミン性を示す。Ｒ−（−）−オキサ
プロチリンの製造は、欧州特許第００１４４３３号に記
載されている。ヒト生物体において、Ｒ−（−）−オキ
サプロチリンは優勢的に下式（■）のＲ−（−）−オキ
サプロチリンβ−グルクロニドに代謝され、尿中に排出
される。

うつ病にかかっている患者をＲ−（−）−オキサプロチ
リンのような抗うつ薬で処置すると、患者における薬剤
の代謝に大きな個人差があり、このため用量、血漿レベ
ルおよび臨床応答の間の関係に大きな個人差があるため
、各個体が様々に反応することを念頭に置かなければな
らない。従って、過剰投薬による危険を回避するために
個々に治療上有効量を確認し、そして注意深く抗うっ治
療をモニタリングすることが必要である。更に、治療の
成功は、患者の迎合性（ｃｏｍｐｌ　１ａｎｃｅ）、即
ち投薬に関する医者の指図に従う程度に大きくかかって
いる。患者の不迎合性の問題は日常的であり、これは薬
剤に対する患者の応答を評価するのを難しくし、そして
処方されそして得られた薬をのまなければ不要な費用が
かかることにもなる。

上に示した目的上、全血、血漿、血清および／または尿
中の治療化合物またはその代謝産物を測定する方法が最
も適当である。理論上、体液中の薬剤の濃度を測定する
幾つかの分析技術、例えばガスクロマトグラフィー、高
圧液体クロマトグラフィー等が存在する。しかし、高い
経費および熟練された技術者の必要性のため、はとんど
の医療施設および実験室はそれらを日常の目的で使用す
る余裕はない。特に個人の医院においては、精巧な機器
を必要とする薬剤モニタリングは明らかに実施不可能で
ある。従って、Ｒ−（−）−オキサプロチリンおよび／
またはその代謝産物についてのより簡単で且つ経費のか
からない信頼できる分析テストを開発することが望まし
い。この課題を解決するのに最も適するのは、Ｒ−（−
）−オキサプロチリンおよびそれの代謝産物、例えばＲ
（−）−オキサプロチリンに対して向けられた選択的モ
ノクローナル抗体に基づくイムノアッセイであろう。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の目的は、抗うつ薬Ｒ−（−）−オキサプロチリ
ンおよびそれの代謝産物Ｒ−（−）−オキサプロチリン
β−グルクロニドに高度に特異的であるモノクローナル
抗体を提供することである。

該モノクローナル抗体は、全血、血漿または血清中の前
記薬剤の分布および濃度をモニターするため、並びに尿
中の前記代謝産物を検出および測定するために使用する
ことができる。従って、それらは有効量の決定および患
者の迎合性に関してＲ（−）−オキサプロチリンによる
抗うつ治療をモニタリングする際の価値ある手段である
。更に、そのようなモノクローナル抗体は、Ｒ−（−）
−オキサプロチリンに対する高い結合親和力により過剰
投薬された患者を解毒するために用いることもできる。

〔具体的説明〕

本発明は、Ｒ−（−）−オキサプロチリンおよび／また
はそれの主な代謝産物Ｒ−（−）−オキサプロチリンβ
−グルクロニド、好ましくはＲ−（＝）−オキサプロチ
リンに対して向けられたモノクローナル抗体、並びに前
記化合物の抗原決定基に対する特異性を保持しているそ
れらの誘導体に関する。

好ましいのは、Ｒ−（−）−オキサプロチリンおよびそ
れのβ−グルクロニドと構造的に類似している基質との
交差反応性をほとんどまたは全く示さないモノクローナ
ル抗体およびそれの誘導体であり、特に四環式環構造お
よび／または脂肪族側鎖の化学的変化によりＲ−（−）
−オキサプロチリンと異なっている他のジベンゾビシク
ロ〔２２，２〕オクタジ工ン化合物の存在下でＲ−（−
）−オキサプロチリンと選択的に結合するモノクローナ
ル抗体およびそれの誘導体である。Ｒ−（−）−オキサ
プロチリンと一緒に使用される可能性のある、ジベンゾ
ビシクロ〔２．２．２〕オクタジエン骨格を欠く他の治
療薬、例えば神経弛緩薬、不安解消薬、向精神薬、抗て
んかん薬、抗不整脈薬の存在下で、Ｒ−（−）−オキサ
プロチリンと選択的に結合するモノクローナル抗体およ
びそれの誘導体も好ましい。Ｓ−（＋）−オキサプロチ
リンの存在下でＲ−（−）−オキサプロチリンと選択的
に結合するモノクローナル抗体およびそれの誘導体も好
ましい。

最も好ましイノは、称号ＭＡｂ　１２１９Ｓ５９．１１
．　？ＩＡｂ１２１９Ｓ７８．６．　ＭＡｂ　１２２Ｏ
８３６，３，ＭＡｂ　１２２５Ｓ９３．２．　ＭＡｂ１
２２６Ｓ３１、Ｓ．　ＭＡｂ　１２２８Ｐ５４．６およ
びＭＡｂ　１２２８Ｐ６３．１゜特ニＭＡｂ　１２１９
Ｓ５９．１１．　ＭＡｂ　１２１９Ｓ７８．６．　ＭＡ
ｂ１２２６Ｓ３１、ＳおよびＭＡｂ　１２２ＢＰ６３．
１を有するモノクローナル抗体、並びにそれらの誘導体
である。

Ｒ−（−）−オキサプロチリンに対する本発明のモノク
ローナル抗体の親和力は、例えばＦｒｉｇｕｅｔら（Ｊ
、ＩｍｍｕｎｏＬＭｅｔｈｏｄｓ　７７＋　３０５＋　
１９８５）に従った阻害エンザイムイムノアッセイにお
いて測定することができる。該アッセイでは、テストし
ようとするモノクローナル抗体をＲ−（−）−オキサプ
ロチリンと共にブレインキュベートし、そして第二段階
において、Ｒ−（−）−オキサプロチリンの吸着性接合
体、例えばタンパク質接合体でコーティングされた固相
に暴露する。免疫複合体に携わっていないモノクローナ
ル抗体の部分が固相と結合し、そして該モノクローナル
抗体に対して向けられた第二抗体−酵素接合体により定
量される。

親和力は、ＩＣ５゜（阻害濃度）値、即ち固相抗原への
抗体結合の５０％阻害を引き起こす遊離抗原の濃度とし
て表わされる。

本発明のモノクローナル抗体の選択性は、構造的に類似
した化合物、例えば四環式環構造および／または脂肪族
側鎖の化学的変化によりＲ−（−）−オキサプロチリン
と異なっている他のジベンゾビシクロ［２，２，２〕オ
クタジエン化合物；抗うつ薬と共に使用される可能性の
あるジベンゾビシクロ（２，２，２３オクタジエン骨格
を欠く治療化合物；並びにエナンチオマーであるＳ−（
＋）−オキサプロチリンによる、Ｒ−（−）−オキサプ
ロチリンへのモノクローナル抗体結合の阻害を分析する
ことによりテストされる。これは、例えば、阻害エンザ
イムイムノアッセイにおいて実施され得る。この場合、
本発明のモノクローナル抗体が上記の可溶性化合物のい
ずれかと共にブレインキュベートされ、次いで、インキ
ュベーシゴン混合物が前記エンザイムイムノアッセイに
おいてテストされる。

本発明のモノクローナル抗体の誘導体は、Ｒ−（−）−
オキサプロチリンおよび／またはＲ−（−）−オキサプ
ロチリンβ−グルクロニドの抗原決定基に対する特異性
を保持している。即ち、それらは、前記化合物への親の
抗体の特徴的結合パターンを保持している。そのような
誘導体の例は、酵素、蛍光マーカー、化学発光マーカー
、金属キレート、アビジン、ビオチン等と該モノクロ−
ナル抗体との接合体、放射能ラベル化された抗体または
抗体断片である。

本発明の抗体接合体に使用される酵素は、例えば、西洋
ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース牙キシダーゼ、グ
ルコアミラーゼ、カルボアンヒドラーゼ、アセチルコリ
ンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナー
ゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。

本発明のモノクローナル抗体と接合される蛍光マーカー
は、フルオレセイン、フルオロクロム、ローダミン等で
ある。化学発光マーカーは、例えばアクリジニウムエス
テルまたはルミノールである。そのような接合体におい
ては、抗体は直接またはスペーサーもしくはリンカ−基
を介して接合パートナ−と結合している。金属キレート
化剤についての例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）　、’；エチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＰＴ＾
）、１，４，８゜１１〜テトラアザテトラデカン、１．
４，８．１１〜テトラアザテトラデカン−１，４，８，
１１〜テトラ酢酸、１〜オキサ−４，７，１２，１５−
テトラアザヘプタデカン−４、７，１２，１５−テトラ
酢酸等である。

放射能ラベル化されたモノクローナル抗体は、例えば放
射性−Ｈ素（１２３１、１２％　１　、１３１　ｉ　）
　、イツトリウム（９０ｙ）、テクネチウム（９９”Ｔ
ｃ　）等を含む。

本発明の抗体断片は、例えば−価の断片Ｆａｂ　（Ｆａ
ｂ＝抗原結合性断片）またはＦａｂ　’および二価の断
片Ｆ（ａｂ’　）ｚである。

本発明のモノクローナル抗体およびその誘導体は、所望
のモノクローナル抗体を分泌する下記に定義されるハイ
ブリドーマ細胞を試験管内または生体内で既知の方法に
従って増殖させることを特徴とする、それ自体既知の方
法により得られる。

必要であれば、得られたモノクローナル抗体は単離され
そして／またはその誘導体に変換される。

試験管内での増殖は、常用の標準培地である適当な培地
、例えばダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）また
はＲＰＭＩ　１６４０培地中で行われ、該培地は所望に
より哺乳類の血清、例えばウシ胎児血清、または微量元
素および増殖維持補足物、例えば支持細胞、例えば正常
マウス腹腔浸出細胞、肺細胞または骨髄マクロファージ
、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリ
ン、低密度リポタンパク質、オレイン酸等により補充さ
れる。

試験管内生産は比較的純粋な抗体調製物を提供し、そし
て大量の所望の抗体を得るためにスケールアップするこ
とができる。組織培養条件下での大スケールのハイブリ
ドーマ培養のための技術は当業界において既知であり、
そして例えばエアーリフト反応器もしくは連続撹拌反応
器中での均一懸濁培養、または中空繊維中、マイクロカ
プセル中、アガロースミクロビーズ上もしくはセラミッ
クカートリッジ上に固定化もしくは封入された細胞培養
を含む。

モノクローナル抗体の単離については、まず、例えば硫
酸アンモニウムでの沈澱、ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）のような吸湿性物質に対する透析、選択膜を通し
た濾過等により、培地上清中の免疫グロブリンを濃縮す
る。必要および／または所望により、濃縮された抗体を
常用のクロマトグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン
交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースもしく
はプロティンＡ上でのクロマトグラフィー、または免疫
アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。

ハイブリドーマ細胞を生体内増殖させることによって大
量の所望のモノクローナル抗体を得ることもできる。親
細胞と組織適合性である補乳類、例えば同系マウスに細
胞クローンを注入し、抗体産生腫瘍細胞の増殖を誘発す
る。所望により、注入前に炭化水素、特に鉱油、例えば
ブリスタン（テトラメチルペンタデカン）により動物を
感作する。例として、Ｂａ１ｂ／ｃマウス由来のハイブ
リドーマ細胞を、所望によりプリスタンで前処理したＢ
ａ１ｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、そして１〜２週間後
、マウスの腹水を回収する。上述したような常法により
体液からモノクローナル抗体が単離される。

本発明の抗体の接合体は、当業界で既知の方法により、
例えば、上述のようにして調製されたニックローナル抗
体を、縮合剤、例えばグルタル：ルデヒド、過ヨウ素酸
塩、Ｎ、Ｎ’　−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（
ｍ−マレイ旦ドベン）イルオキシ）スクシンイミド、Ｎ
−（３−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンオキシ］
スクシニイξド、Ｎ−エチル−Ｎ’　−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボシイごド等の存在下で酵素２反
応させることにより調製される。アビジンとＣ接合体も
同様にして調製される。ビオチンとの扛合体は、例えば
、モノクローナル抗体をビオチンの活性化エステル、例
えばビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイごドエステルと
反応させることにより調製される。蛍光または化学発光
マーカーとの接合体は、縮合剤、例えば上に挙げたもの
の存在下で調製されるか、またはインチオシアネート、
好ましくはフルオレセインインチオシアネートとの反応
により調製される。金属キレートとの抗体接合体も同様
にして調製される。

ヨウ素（１２３Ｉ、　Ｉｔｓ　（、１ｕｌｌ　Ｏテ放射
能うヘル化されたモノクローナル抗体は、例えば、放射
性ヨウ化ナトリウムもしくはカリウム、および化学的酸
化剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム、フロラ逅ンＴ等、
または酵素的酸化剤、例えばラクトペルオキシダーゼ、
またはグルコースオキシダーゼとグルコースを用いたそ
れ自体既知のヨウ素化により、本発明のモノクローナル
抗体から得られる。

本発明のモノクローナル抗体は、例えばジエチレントリ
アミンペンタ酢酸（ＤＰＴＡ　）キレート化によりイツ
トリウム（”Ｙ）と結合される。テクネチウム−９９ｍ
ラベル化抗体は、リガンド交換反応により、例えば過テ
クネチウム酸塩（Ｔｃ０４−）を第一スズイオンで還元
し、還元されたテクネチウムをセファデックスカラム上
にキレート化しそしてこのカラムに抗体を適用すること
により；または直接ラヘル化技術により、例えば過テク
ネチウム酸塩を５ｎＣＩ！、ｚのような還元剤、フタル
酸カリウムナトリウム溶液のような緩衝液および抗体と
共にインキュベートすることにより、調製される。

モノクローナル抗体の断片、例えばＦａｂ、　Ｐａｂ’
またはＦ（ａｂ’　Ｌ断片は、それ自体既知の方法によ
り、例えばペプシンもしくはパパインのような酵素での
消化および／または化学的還元によるジスルフィド結合
の開裂により、上述のようにして調製された抗体から得
ることができる。

本発明は更にハイブリドーマ細胞系にも関し、該ハイブ
リドーマ細胞系は、Ｒ−（−）−オキサプロチリンおよ
び／またはＲ−（−）−オキサプロチリンβ−グルクロ
ニドに対して向けられた、特にＲ−（−）−オキサプロ
チリンに対して向けられた前記モノクローナル抗体を分
泌することを特徴とする 特に本発明は、ミエローマ細胞、特にマウスミエローマ
細胞と、免疫原性Ｒ−（−）−オキサプロチリン接合体
で免疫処置された哺乳類、好ましくは同系マウスのＢリ
ンパ球とのハイブリッドである細胞系に関する。適当な
Ｒ−（−）−オキサプロチリンの免疫原性接合体は下記
に記載される。

好ましいのは、称号１２１９Ｓ５９．１１．１２１９Ｓ
７Ｂ、６゜１２２Ｏ３３６，６，１２２５Ｓ９３．２．
１２２６５３１、Ｓ．１２２８Ｐ５４．６および１２２
８Ｐ６３．１を有するハイブリドーマ細胞系である。称
号１２１９５５９．１１．１２１９Ｓ７Ｂ、６．１２２
０Ｓ３６．６゜１２２５Ｓ９３．２および１２２６Ｓ３
１、Ｓを有すルハイブリトーマ細胞系は、マウスミエロ
ーマ細胞系５ｐ２１０−Ａｇ１４と、Ｒ−（−）−オキ
サプロチリンのウシ血清アルブくン（ＢＳＡ）接合体で
免疫処置されたＢａｌ　　ｂ　／　ｃマウスの肺臓のＢ
リンパ球とのハイブリッドである。称号１２２８Ｐ５４
．６および１２２８Ｐ６３．１を有するハイブリドーマ
細胞系は、マウスミエローマ細胞系ＦＡＩと、Ｒ−（−
）−オキサプロチリンのＢＳＡ接合体で免疫処置された
Ｂａ１ｂ／ｃマウスの肺臓のＢリンパ球とのハイブリッ
ドである。特に好ましいのは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＡｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅｓ（Ｅ、Ｃ，Ａ、Ｃ，Ｃ，）＋　ＰＨＬＳ　
Ｃｅｎｔｒｅｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ　＆　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ＰｏｒｔｏｎＤ
ｏｗｎ、　５ａｌｉｓｂｕｒｙ、　Ｗｉｌｔｓ、ＳＦ３
０ＪＧ、　Ｕ、に、にそれぞれ寄託番号８９０３１４０
４．８９０３１４０３および８９０３１４０５ノもとに
寄託されたハイブリドーマ細胞系１２１９Ｓ５９．１１
　。

６、１２２０Ｓ３６、６および１２２８Ｐ６３．１　、
並びニＥ、Ｃ，Ａ、Ｃ，Ｃ。

に１９８９年３月２１日に寄託番号８９０３２１０４（
７）もとに寄託されたハイブリドーマ細胞系１２２６Ｓ
３１、Ｓである。

本発明のハイブリドーマ細胞系は遺伝的に安定であり、
一定の特異性を有する本発明のモノクロ活性化され得る
。

本発明は、本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイ
ブリドーマ細胞系の調製方法にも関し、該方法は、適当
な哺乳動物を免疫原性Ｒ−（−）−オキサプロチリン接
合体で免疫処置し、この動物の抗体産生細胞を連続細胞
系の細胞と融合し、融合で得られたハイブリッド細胞を
クローン化し、そして所望の抗体を分泌する細胞クロー
ンを選択することを特徴とする。

高収量の抗体を得るために、Ｒ−（−）−オキサプロチ
リンはハプテンでありそれだけでは免疫原性でないので
、免疫処置のためにＲ−（−）−オキサプロチリンの免
疫原性接合体を使用することが必要である。適当なＲ−
（−）−オキサプロチリン接合体は下記に記載される。

適当な担体分子は、例えばウシ血清７）Ｌｔブミ：／　
（ＢＳＡ　；　ＭＷ　６６．２００）、バシラス・サブ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）からの
α−アくラーゼ（ＭＷ　５８．０００）またはアオガイ
ヘモシアニン（ＫＬＨ、ＭＷ＞１，０００，０００）の
ような高分手量タンパク質であり、これらは多量で商業
的に人手可能である。ブタチログロブリン、毒素、例え
ば破傷風、コレラまたはジフテリア毒素、ヒト血清アル
ブミン（ＩＳＡ）　、β−２−ミクログロブリン等、並
びにマウスＩｇＧ　（Ｈ＋　Ｌ）に対する精製されたウ
サギＩｇＧ画分（Ｋａｗａｍｕｒａ　＆　Ｂｅｒｚｏｆ
ｓｋｙ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６．５８．１９８６）も担体とし
て使用することができる。他の可能な担体分子は、多糖
、天然または合成リポ多糖、ポリリジンのような合成ペ
プチド、活性膜、ラテックス粒子、サルモネラ（Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ）菌のような細菌等を含む。好ましいの
は、Ｒ−（−）−オキサプロチリンがウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）と結合された免疫原性Ｒ（−）−オキサプ
ロチリン接合体である。

本発明のＲ−（−）−オキサプロチリン接合体は、それ
自体既知の方法により、例えば担体へのＲ−（−）−オ
キサプロチリンの吸着、またはカルボシイごド、過ヨウ
素酸塩、グルタルアルデヒド、Ｎ、Ｎ’−ｏ−フェニレ
ンシマレイ旦ド、Ｎ（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ
）スクシンイミド、Ｎ−Ｃ３−（２’−ピリジルジチオ
）プロピオンオキシ〕スクシンイミド等を使った縮合の
いずれかにより、調製される。

免疫原性Ｒ−（−）−オキサプロチリン接合体は、アジ
ュバント、即ち免疫応答を更に増加させる剤と混合され
得る。可能なアジュバントは、完全フロインドアジュバ
ント（鉱油、水および微生物抽出物の乳濁液）、不完全
フロインドアジュバント（水と油のみの乳濁液）、水酸
化アルミニウムゲル等である。

免疫原性Ｒ−（−）−オキサプロチリン接合体は、外来
分子として該接合体を認識する適当な哺乳動物、特にマ
ウスまたはラット、好ましくはマウスを免疫処置するた
めに使われる。特に好ましいのはＢａ１ｂ／ｃマウスで
ある。

免疫処置の経路は、特に、皮肉、皮下、筋肉内、腹腔内
、静脈内および頭蓋内注射である。高い抗体価が所望さ
れるので、通常一連の注射が与えられる。免疫処置は、
例えば、所望により不完全または完全フロインドアジュ
バントと混合された免疫原性Ｒ−（−）−オキサプロチ
リン接合体を、３〜８回非経口的に、例えば腹腔内およ
び／または皮下的に、約３０Ｉｔｇの量においてＢａ１
ｂ／ｃマウスに１〜３週問おきに注射し、次いで動物を
犠牲にする１〜３日前に約３Ｏｎのブースター注射を行
うことにより達成される。

免疫処置された動物の抗体産生細胞、好ましくはリンパ
系細胞、例えば肺臓リンパ球をブースター注射の例えば
１〜３日後に取り、これを融合の結果生ずるハイブリッ
ド細胞に複製能力を付与する連続細胞系の細胞、即ち連
続的に複製を行う細胞クローンと融合する。そのような
細胞系の例は、それ自体は免疫グロブリンまたはその断
片を産生しないが大量の抗体を産生および分泌する潜在
能力を有し、そしてハイブリッド細胞を未融合の親細胞
に対して選択できるように遺伝子マーカーを担持してい
る、腫瘍細胞系（ミエローマ）である。

幾つかの適当なミエローマ細胞系が当業者で知られてい
る。好ましいのは、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホ
リボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＰＴ　）酵素また
はチくジンキナーゼ（ＴＫ）酵素を欠き、従ってヒポキ
サンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する選
択培地（）ＩＡＴ培地）中で生存できないミエローマ細
胞系である。特に好ましいのは、ＨＡＴ培地中で生存で
きず、そして免疫グロブリンまたはその断片を分泌しな
いミエローマ細胞系および誘導細胞系、例えばＳρ２１
０−Ａｔ１４またＰＡＩである。

融合は、融合促進物質、例えば、所望により紫外＆’１
（ＬＪＶ）で不活性化された形のセンダイウィルスもし
くは他のバラミクソウィルス、化学融合剤（ｆｕｓｏｇ
ｅｎ）　、例えばカルシウムイオン、界面活性脂質、例
えばりゾレシチン、もしくはポリエチレングリコール（
ＰＥＧ　）の存在下で、または電気的融合（ｅｌｅｃｔ
ｒｏｆｕｓｉｏｎ）により行われる。好ましくは、ミエ
ローマ細胞は、１０００〜４０００の分子量のポリエチ
レングリコールを約３０％〜約６０％含有する溶液中で
３〜２０倍過剰の免疫処置動物からの牌細胞と融合され
る。

融合後、細胞は選択培地、例えばＨＡＴ培地中に再懸濁
され、培養される。この培地中では、バイブリドーマ細
胞のみが生き残るだろう。というのは、それらは親のミ
エローマ細胞のような試験管内で増殖および複製する能
力と、免疫処置動物の抗体産生肺細胞から受は継いだＨ
ＡＴ培地中での生存に不可欠な失なったＨＧＰＲＴまた
はＴＫ遺伝子とを合わせ持つ。

ハイブリドーマ細胞の増殖のための適当な培地は、標準
培地、例えはダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）
　、最少必須培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地等であり、
所望により哺乳類の血清、例えば１０〜１５％ウシ胎児
血清により補足される。好ましくは、支持細胞、例えば
正常マウス腹腔浸出細胞、牌細胞、骨髄マクロファージ
等が、融合段階の直後の細胞増殖の開始時に添加され、
特に細胞密度が低い場合には、増殖因子等を与えること
によりハイプリ見 ドーマ細胞に栄養与えそしてそれらの増殖を維持する。

マクロファージや単核細胞のような食細胞を使用するな
らば、アミノプテリン処理後に常に見られる死んだミエ
ローマ細胞の破片を掃去する際に役に立つことができる
。ハイブリドーマが過剰増殖しないようにミエローマ細
胞を保護するために、培地は選択培地で補足される。

ハイブリドーマ細胞培養上清は、好ましくはエンザイム
イムノア・ンセイまたはラジオイムノア・ンセイにより
、所望のモノクローナル抗体についてスクリーニングさ
れる。陽性のノＡイプリドーマ細胞は、例えば限定希釈
によりまたは軟寒天中で、好ましくは２回以上クローニ
ングされる。所望により、ハイブリドーマ細胞は腹腔内
注射および腹水の回収により、動物、例えばマウスで継
代される。これはハイブリドーマを安定化し、そして増
殖特性を改善する。クローニングされた細胞系は常法に
より凍結され得る。

本発明のモノクローナル抗体および／またはそれらの誘
導体は、例えば有効量の決定および治療薬のモニタリン
グのために全血、血漿もしくは血清中のまたは患者の迎
合性をテストするために尿中のＲ−（−）−オキサプロ
チリンまたはＲ−（−）−オキサプロチリンβ−グルク
ロニドの定性および／または定量に有用である。

例えば、該抗体またはその誘導体は、Ｒ−（−）−オキ
サプロチリンおよびＲ−（−）−オキサプロチリンβ−
グルクロニドのそれぞれの抗原決定基と該モノクローナ
ル抗体のパラトープとの間の結合相互作用に頼る既知の
イムノアッセイのいずれにおいても利用され得る。その
ようなイムノアッセイは、既知の方法よりも費用および
時間の消費が少なく、そして複雑で高価な機器を要求す
ることなく信頼でき且つ再現性のある結果をもたらす。

適当なイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（
ＲＩＡ）、酵素、免疫蛍光、化学発光、免疫沈澱、ラテ
ックス凝集または血球凝集イムノアッセイである。その
ようなイムノアッセイは、例えば抗うつ薬での治療中の
患者の体液、例えば全血、血漿、血清および尿それぞれ
の中の薬剤またはその代謝産物の定性および定量におい
て有用である。

本発明の抗体は、それ自体でまたは放射能ラベル化され
た誘導体の形でラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）におい
て使用できる。小さい分子に適するＲＩＡの既知の変形
、例えばＲ−（−）−オキサプロチリンまたはＲ−（−
）−オキサプロチリンβ−グルクロニドの直接または間
接（競合）測定を用いる、可溶検相（均一）ＲＩＡ、固
相（不均一）ＲＩＡ、単一ＲＩＡまたは二重（サンドイ
ンチ）ＲＩＡのいずれも利用することができる。

そのようなラジオイムノアッセイの例は、未知の量のＲ
−（−）−オキサプロチリンまたはＲ−（−）−オキサ
プロチリンβ−グルクロニドを本発明のモノクローナル
抗体および放射能ラベル化すレタ、例えばＩｆ１３（、
ＩｔＳｉ　　、　ｌｆｆ１　ｌ−１４Ｃ−または３Ｈ−
ラベル化されたＲ−（＝）−オキサプロチリンと共にイ
ンキュベートし、形成された免疫複合体を分離し、そし
て免疫複合体中の放射能の量を測定すするイムノアッセ
イである。

分離は、無関係の免疫グロブリン、例えばウシ、ウマ、
ウサギまたはラット免疫グロブリンの添加後に適当な溶
媒、例えばポリエチレングリコールの添加による免疫複
合体の沈澱により行われる。

あるいは、免疫複合体は、本発明のモノクローナル抗体
に対して高い親和力を有するアフィニティークロマトグ
ラフィー材料、例えば本発明のモノクローナル抗体を認
識しそして結合する抗体、例えばウサギ抗−マウス免疫
グロブリンまたはプロティンＡと結合されたクロマトグ
ラフィー材料上に吸着され得る。免疫複合体の分離を促
進するために嘘、本発明のモノクローナル抗体は、固体
担体、例えばビーズ、濾過可能な粒子、または磁石の助
けをかりて収集および分離することができる常磁性粒子
と、そのようなモノクローナル抗体との接合体で置き換
えることができる。担体材料は無機または有機材料、例
えばプラスチックもしくはガラスピーズ、イムノアフィ
ニティクロマトグラフィーにおける担体として有用な濾
過可能粒子、例えば架橋アガロース、架橋デキストラン
もしくはポリアクリルアミド粒子、または無機常磁性オ
キシド粒子であることができる。

本発明に係わるモノクローナル抗体は、それ自体でまた
は酵素接合誘導体の形でエンザイムイムノアッセイにお
いて使用することができる。ラジオイムノアッセイにつ
いて上述したように、小さい分子に適するエンザイムイ
ムノアッセイの既知の変形のいずれも使用することがで
きる。

該テストは、放射能ラベルの代わりに酵素ラベルを使っ
て、前述のラジオイムノアッセイと同様にして行われる
。形成される複合体の量は酵素基質溶液の添加により測
定される。酵素基質溶液は、例えば、肉眼または光学測
定装置により観察できる色の変化を生しる。

本発明のモノクローナル抗体は、それ自体でまたは化学
発光マーカーと接合された本発明の誘導体の形で化学発
光アッセイにおいて使用することができる。ラジオイム
ノアッセイについて上述したように、小さい分子に適す
る化学発光アッセイの既知の変形のいずれも使用するこ
とができる。

Ｒ−（−）−オキサプロチリンまたはＲ−（−オキサプ
ロチリンβ−グルクロニドの定性および定量のための上
記に記載されたようなモノクローナル抗体およびその誘
導体の利用は、それ自体既知の小分子に適する他のイム
ノアッセイ、例えば免疫蛍光アッセイ、抗体コートまた
は抗原コートされたラテックス粒子を用いるラテックス
凝集アッセイ、抗体コートまたは抗原コートされた赤血
球を用いる血球凝集アッセイ、抗体コートされた先帝フ
ァイバーを使った消失光波（ｅｖａｎｅｓｃｅｎ　ｔｌ
ｉｇｈｔ　ｗａｖｅ）アッセイおよび結合反応を電気ま
たは光のシグナルに変換する他の直接作用イムノセンサ
ー等を包含する。

本発明は、Ｒ−（−）−オキサプロチリンまたはＲ−（
−）−オキサプロチリンβ−グルクロニドの定量および
定性のためのテストキットにも関し、該キットは、本発
明のモノクローナル抗体および／またはその誘導体、並
びに所望により、他のモノクローナル抗体もしくはポリ
クローナル抗体および／または添加剤を含んで成る。

） ラジオイムノアッセイ用の本発明のテストキットは、例
えば、適当な担体、例えば本発明のモノクローナル抗体
でコーティングされているかまたはされていない、ミク
ロタイタープレートまたは常磁性粒子、所望により凍結
乾燥形または濃縮された溶液の本発明のモノクローナル
抗体および／またはその放射能ラベル化誘導体または放
射能ラベル化Ｒ−（−）−オキサプロチリン、Ｒ−（−
）−オキサプロチリンまたはＲ−（−）−オキサプロチ
リンの標準溶液、緩衝液、並びに所望により、ポリペプ
チド、非特異的吸着および凝集物形成を防ぐための洗浄
剤および添加剤、ピペット、反応容器、検量線、取扱い
説明書等を含んで成る。

エンザイムアッセイ用の本発明のテストキットは、例え
ば、適当な担体、例えば本発明のモノクローナル抗体ま
たはＲ−（−）−オキサプロチリン接合体でコーティン
グされているかまたはされていない、ミクロタイタープ
レートまたはニトロセルロース紙、所望により凍結乾燥
形または濃縮された溶液の本発明のモノクローナル抗体
および／またはＲ−（−）−オキサプロチリンに対する
かもしくはＲ−（−）−オキサプロチリンを認識する第
一抗体に対する酵素ラベル化モノクローナルもしくはポ
リクローナル抗体、または酵素ラベル化Ｒ−（−）−オ
キサプロチリン、固体もしくは溶解された形の酵素基質
、Ｒ−（−）−オキサプロチリンまたはＲ，−（−）−
オキサプロチリンの標準溶液、並びに所望によりポリペ
プチド、洗浄剤および添加剤、ピペット、反応容器、検
量線、比色衣、取扱い説明書等を含んで戒る。

化学発光テスト用の本発明のテストキットは、例えば、
適当な担体、例えばポリスチレン試験管、所望により凍
結乾燥形または濃縮された溶液の本発明のモノクローナ
ル抗体および化学発光性マーカー、例えばアクリジニウ
ムエステルと接合された本発明の抗体を認識するポリク
ローナル抗体、発光を触発する化合物、例えばＨ，０□
およびＮａＯＨ。

Ｒ−（−）−オキサプロチリンまたはＲ−（−）−オキ
サプロチリンを含む標準溶液、並びに所望により、ポリ
ペプチド、洗浄剤および添加剤、ピペット、反応容器、
検量線、取扱い説明書等を含んで成る。

本発明のテストキットの特定の態様は、検出帯において
本発明の非ラベル化モノクローナル抗体が含浸されてい
る多孔質固相材料、例えばニトロセルロースから作られ
たイムノストリップ（デイツプスティック）である。該
抗体は堅固に固定化されている。Ｒ−（−）−オキサプ
ロチリンまたはそれのβ−グルクロニドを含むテスト溶
液、例えば全血、血漿、血清または尿が、テストストリ
ップの一部分に適用され、そして通常水などの溶出溶媒
の助力によりストリップ材料を通して浸透される。こう
して、試料は検出帯内にまたは検出帯を通って進行する
。試料のＲ−（−）−オキサプロチリンまたはＲ−（−
）−オキサプロチリンβ−グルクロニドが検出帯におい
て結合する程度は、ラベル化された結合試薬を用いて測
定することができる。ラベル化された結合試薬は、テス
トストリップ中に含まれるかまたはその後にテストスト
リップに適用され得る。ラベル化された結合試薬は、湿
潤状態の多孔質担体内を自由に移動し、そして移動中に
検出帯において結合される。ラベル化結合試薬は、Ｒ−
（−）−オキサプロチリンまたはそれのβ−グルクロニ
ドに対する特異的結合相手、例えば、固定化された抗体
よりもＲ−（−）−オキサプロチリンまたはＲ−（−）
−オキサプロチリンβ−グルクロニドの異なるエピトー
プを認識する本発明のラベル化モノクローナル抗体であ
る。あるいは、ラベル化結合試薬は、ラベルと接合され
ているＲ−（−）−オキサプロチリンまたはそれのβ−
グルクロニド自体である。

該ラベルは、容易に検出可能なシグナル、例えば色の形
成または色の変化を、検出帯においてもたらすものであ
る。直接ラベル、例えば金属（例えば金）もしくは色素
溶液、または間接ラベル、例えば酵素、例えばアルカリ
ホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼで
ある。ラベル化は既知の方法に従って行われる。所望に
より、イムノストリップは、水不透過性固体材料から作
製された中空ケースを含んで成る分析テスト装置中に含
まれてもよい。

典型例は、競合アッセイの理論を使ったイムノストリッ
プである。多孔質固相材料、好ましくはニトロセルロー
スのストリップが、第−帯においてＲ−（−）−オキサ
プロチリンまたはＲ−（−）−オキサプロチリンβ−グ
ルクロニドおよびラベル、例えば直接ラベル、例えば色
素、または間接ラベル、例えばアルカリホスファターゼ
で含浸される。ラベル化されたＲ−（−）−オキサプロ
チリンまたはＲ−（−）−オキサプロチリンβ−グルク
ロニドは第−帯に保持され、多孔質材料は乾燥状態にあ
るが、例えば水性液体テスト試料の適用により多孔質材
料が湿潤化されると自由に移動できる。第−帯と空間的
に離れた第二（検出）帯において、本発明のモノクロー
ナル抗体は湿潤状態において多孔質材料を通って自由に
移動しないように多孔質材料上にしっかりと固定化され
る。

測定しようとする未知量のＲ−（−）−オキサプロチリ
ンまたはＲ−（−）−オキサプロチリンβグルクロニド
を含むテスト試料、例えば全血、血漿、血清または尿の
適用後、テスト試料のＲ（−）−オキサプロチリンまた
はＲ−（−）−オキサプロチリンβ−グルクロニドおよ
びラベル化されたＲ−（−）−オキサプロチリンまたは
Ｒ（−）−オキサプロチリンβ−グルクロニドは、多孔
質材料を通って移動し、そして検出帯中の固定化された
モノクローナル抗体の結合部位を目当てに競争する。検
出帯において形成された免疫複合体の量は、ラベルの検
出により、例えば、色素をラベルとして使用した時は直
接的に、または酵素をラベルとして使用した時は適当な
基質溶液の添加後に、肉眼または光学測定装置により検
出帯において生じた色を検出することにより測定される
。

本発明のモノクローナル抗体およびそれらの誘導体は、
上述したようなラジオイムノアッセイ、化学発光イムノ
アッセイ等のイムノアッセイの理論を使うイムノストリ
ップのいずれの既知の変形においても使用することがで
きる。

本発明のモノクローナル抗体は、Ｒ−（−）−オキサプ
ロチリンの過剰投薬の治療においても有用である。該モ
ノクローナル抗体は、所望により無機または有機性の固
体または液体の医薬上許容される担体と一緒にまたは混
合して、本発明のモノクローナル抗体の治療上有効量を
含んで成る医薬製剤の形で適用される。

本発明に係わる医薬製剤は、温血動物、例えばヒトへの
非経口投与、例えば鼻内、筋肉内、皮下または静脈内投
与のためのものである。意図される投与方法に依存して
、医薬製剤は単位投薬形、例えばアンプル、バイアル、
坐剤、糖剤、錠剤、カプセルまたは液体もしくは固体の
算用スプレーの形であることができる。

投与すべき化合物の治療上有効量は、温血動物、例えば
ヒトの状態、例えば体重および全体的状態、中毒症状を
導＜Ｒ−（−）−オキサプロチリンの量、並びに投与方
法にも依存し、そして処置を与える医師の評価に従って
決定される。有効量は体重１ｋｇあたりｌ〜１００■の
規模のオーダーであり、１回で適用されるかまたは１．
２もしくは３日以内で数回適用される。

本発明に係わる医薬製剤は、所望により他の治療上有効
な化合物および／または添加剤と共に、常用の無機また
は有機の固体または液体の医薬上許容される担体を含ん
で篤る。好ましくは、該抗体の溶液もしくは懸濁液、特
に等張水性溶液もしくは懸濁液、または使用直前に水に
溶解される凍結乾燥製剤が使用される。該医薬製剤は滅
菌することができ、モして／または保存剤、安定剤、湿
潤剤、乳化剤、可溶化剤、増粘性物質、浸透圧を調節す
るための塩および／または緩衝剤、並びに他のクンバク
質、例えばヒト血清アルブミンもしくはヒト血漿製剤も
含むことができる。

〔実施例］ 以外の例は本発明を説明するためであり、決して限定す
るものではない。

例において使用する略語は次のような意味を有する。

ＢＳＡ＝ウシ血清アルブ≧ン Ｂ５５＝平衡塩類溶液 ＤＭＦ＝Ｎ　、Ｎ−ジメチルホルムアミドＦＣ３＝ウシ
胎児血清 ＨＡＴ−ヒボキサンチン／アミノプテリン／チミジン １ｇ＝免疫グロブリン ＰＢＳ＝リン酸塩緩衝化塩溶液 抗体を誘起せしめるのに使用する免疫原は、スクシニル
化されたＢＳＡとＲ−（−）−オキサプロチリンとの免
疫原性接合体であり、これは次の手順により調製される
。

スクシニル化されたＢＳＡの調製については、ＩｇのＢ
　Ｓ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ）を５０ｄの１００ｍＭ　Ｐ　
Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７）中に溶解させる。ｐＨを６．７〜７
、Ｓに維持しなから、Ｉｇのコハク酸無水物を少しずつ
添加する。

この混合物を蒸留水に対して４°Ｃで６時間透析し、次
いで凍結乾燥する。

次に、スクシニル化されたＢＳＡをＥＰ　Ｏ０１４４３
３に従って調製されたＲ−（−”）−オキサプロチリン
３３■およびＮ−エチル−Ｎ’　−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミドと共に室温で２時間インキ
ュベートする。過剰の試薬を除去するためにこの混合物
を蒸留水に対して徹底的に透析する。得られたＲ−（−
）−オキサプロチリン−ＢＳＡ接合体を凍結乾燥する。

１．２　Ｂａｌ　ｂ　Ｃマウスの　　几看生後５〜６週
間のＢａ１ｂ／ｃマウスに、完全フロインドアジュバン
ト（３００Ｉ！り中の例１．１のＲ（−）−オキサプロ
チリン−ＢＳＡ接合体３０■を皮下および腹腔内注射す
る。４週間後、不完全フロインドアジュバント中の前記
接合体３０■を腹腔内および皮下注射する。更に３週間
後、ＰＨ３中の前記接合体３０Ｉ！ｇを腹腔内注射する
。更に１〜２週間後、マウスの血液を取り、そして血清
を例１．４のイムノアッセイによりテストする。

０．９％塩溶液中の３０μｇのＲ−（−）−オキサプロ
チリン−ＢＳＡ接合体の追加のブースター注射を２〜３
週間後に腹腔内に行う。３日後、例１．４のイムノアッ
セイにおいて血清が陽性であるマウスの肺臓を取り出す
。

１、Ｓ　　豊慾做査 融合方法はにδ旧ｅｒおよびＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎ
ａｔｕｒｅ　２５６＋４９５、１９７５）により記載さ
れた一般的プロトコールの変形に従う。１０　Ｘ　１０
’個の牌細胞および１〜２×１０７個のミエローマ細胞
Ｓｐ２　／　Ｏ−Ａｇ１４　（Ｓｃｈｕ　Ｉｍａｎら、
Ｎａｔｕｒｅ　２７６、２６９．１９７８）またはＦ　
Ａ　Ｉ　（Ｓｔｏｃｋｅｒら、Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲ
ｏｃｈｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ　
Ｎａ２１７１３、１９８２）のベレットを４１％ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ　４０００．　Ｍｅｒｃｋ）
の存在下で混合し、ＲＰ月Ｔ　１６４０培地中で洗浄し
、そして１０％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ　１６４０培地中
に２Ｘ１０ｂ細胞／　ｍｌの割合で再懸濁する。この細
胞を２４ウエルのミクロタイタープレー）　（Ｃｏｓｔ
ａｒ）のウェル中に０．５　ｍｌアリコートに分ける。

１，８．１０および１２日目に、ピポキサンチン、アミ
ノプテリンおよびチミジンを含む新鮮培地（ＨＡＴ培地
）を添加する。１５日目にＨＡＴ培地をアミノブチリン
ネ含有のＨＴ培地と交換する。２９日目に、生き残った
ハイブリドーマ細胞をＲＰＭＩ　１６４０／１０％ＦＣ
３中で培養する。増殖しているクローンの上清を例１．
４のイムノアッセイによりＲ−（−）−オキサプロチリ
ンに対する抗体の存在についてテストする。陽性のハイ
ブリドーマを、ミクロタイタープレート中で同系のマウ
ス腹腔マクロファージ（１０，０００細胞数／ウエル）
の存在下で限定希釈することによりクローニングする。

このハイブリドーマ細胞を培養により増殖させ、−８０
°Ｃでまたは液体窒素中で凍結し、次いで再活性化する
ことができる。

増殖しているハイブリドーマをエンザイムリンクドイム
ノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により抗−Ｒ−（
−）−オキサプロチリン抗体の存在についてテストする
。まず、ＢＳＡに対する抗体による妨害を回避するため
に、ミクロタイタープレー）　（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｍ
ｉｃｒｏｔｅｓｔＴＩ４）のウェルをムチンとＲ−（−
）−オキサプロチリンとの接合体でコーティングする。

Ｒ−（−）−オキサプロチリン−ムチン接合体は次の手
順で調製される。

ウシ顎下腺からのムチン（タイプＩ　、　Ｓｉｇｏ＋ａ
　Ｍ２ＳＯ４）、２８■を水５ｍに溶解させる。８５Ｉ
ｌ！の０．１　Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、室温
で１時間放置しておき、次いで混合物を水に対して透析
する。

１２５ｊ１１の１Ｍ水素化シアノホウ素ナトリウムを添
加し、次に０．５　ｄのｌＮＨＣｌおよび１ＩＩＩｌの
水に溶解された６、３■のＲ−（−）−オキサプロチリ
ンを添加する。沈澱が生成する。この混合物を７０°Ｃ
に１．５時間維持し、次いで水および４Ｍ塩酸グアニジ
ンに対して一晩透析する。

接合体溶液（０，６６■／ｄ）をコーティング緩衝液ｐ
Ｈ９，８（炭酸ナトリウム４７７■、炭酸水素ナトリウ
ム８９７■、アジ化ナトリウム６０■、蒸留水３００Ｆ
ｄ）中に１０００倍希釈し、そしてミクロタイタープレ
ートのウェル中４°Ｃで２日間インキュベートする。Ｔ
ｗｅｅｎ　２０（Ｓｉｇｍａ　、　０．１％）を含むＰ
ＢＳでウェルを３回洗浄する。１００　ｄのＰＢＳ／　
Ｔｗｅｅｎ　２０と１時間インキュベートすることによ
り、プレート上の残りの吸着部位を飽和する。Ｒ−（−
）−オキサプロチリンに対する抗体の存在についてテス
トしようとする溶液１００ｄを、ウェル中室温で１時間
インキュベートする。　　ＰＢＳ／Ｔ賀ｅｅｎ　２０で
３回洗浄した後、アルカリホスファターゼ接合抗−マウ
スｒｇｃ抗血清（Ｓｉｇｍａ）を１０００倍希釈におい
て３７°Ｃで１時間接触させる。ミクロタイタープレー
トをＰＢＳ／　Ｔｉｍｅｅｎ　２０で５回洗浄し、モし
てジェタノールアミン緩衝液（ｐＨ９，８）中のｐ−ニ
トロフェールリン酸二ナトリウム（１＠　／　ｙｄｌ　
：　Ｓｉｇｍａ）から成るアルカリホスファターゼ基質
を用いて前記酵素接合体結合した抗血清を発色させる。

該基質は黄色の着色を与え、これを６０分後に比色計（
Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ）により４０５
ｎｍの波長で測定する。

Ｒ−（−）−オキサプロチリン−ムチン接合体を認識す
る結合抗体がハブテンに対して向けられ、モしてムチン
とＲ−（−）−オキサプロチリンとの結合または結合し
たＲ−（−）−オキサプロチリンの特定のコンホメーシ
ョンに対して向けられるのではないことを確かめるため
に、例３．４に記載されるようにして遊離Ｒ−（−）−
オキサプロチリンの阻害テストを行う。

各々１２２８Ｐ５４．６および１２２８Ｐ６３．１　（
融合相手二Ｐ／ｌ細胞系）並びに１２１９Ｓ５９．１１
．１２１９Ｓ７８．６゜１２２０Ｓ３６．６．１２２５
Ｓ９３．２および１２２６Ｓ３１、Ｓ（融合相手＝Ｓｐ
２１０−Ａｇ１４細胞系）の称号を有するハイブリドー
マを更なる特徴付けのために選択する。それらのハイブ
リドーマにより分泌されるモノクローナル抗体は、接頭
辞“’ＭＡｂ”と個々のパイブリドーマの番号により、
例えばＭＡｂ　１２１９Ｓ５９．１１のように、命名さ
れる。

拠し：モノクローナル　　の　　および生後４〜６週間
のＢａ１ｂ／ｃマウスを、０、Ｓ　ｒｎｌのブリスタン
（Ａｌｄｒｉｃｈ）で腹腔内的に前処理する。

１〜３週間後、０．２　ｄのＢＳＳおよび０．２　ｄの
ブリスタン中の１〜２Ｘ１０６個のクローン化されたハ
イブリドーマ細胞を腹腔内に接種する。８〜１０日後腹
水を回収し、８００Ｘｇで遠心し、−２０°Ｃで保存す
る。

解凍された腹水を５０．０００Ｘ　ｇで６０分間遠心す
る。

液面上に浮いている脂肪層を注意深く除去し、そしてタ
ンパク質濃度を１０■／ｄの濃度に調整する。

０．９容量当量の飽和硫酸アンモニウムの滴下添加によ
り４°Ｃで粗免疫グロブリンを沈澱させ、次いで２０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆおよび５０＋ｎＭ　ＮａＣｊ！　
（ｐＨ７，９）中に溶解し、そしてこの緩衝液に対して
３回透析する。透析した溶液を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
（ｆ！　（ｐＨ７，９）で１　：　１　（ｖ／ｖ）希釈
し、モしてＤＥＡＥ−セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ）上
でのクロマトグラフィーにより精製する。例１．４のイ
ムノアッセイにおいて陽性の両分を合わせ、０．５Ｍ　
ＰＢＳ（ｐＨ７，２）に対して透析する。

試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）増殖により、少量のモノ
クローナル抗体（約１■）を得ることもまた可能である
。ハイブリドーマ細胞をプラスチックフラスコ（Ｃｏｓ
ｔａｒ）中で培地（１０％ＦＣ３が補足されたＲＰＭＩ
　１６４０培地）中生理的温度（約３７°Ｃ）において
５　Ｘ　１０’　−１０６１１１胞／Ｉ１１の細胞密度
まで培養する。

完全な予備培養物゛を、３０００−の容量まで目盛りの
ついたＢｅ１ｌｃｏ撹拌ボトルに移す。培地を加えて１
５００ｄの最終容量にする。培養液を生理的温度にて５
％ＣＯ□で富化された空気中で３０ｒｐｎ＋で２〜３日
間撹拌する。培養液の容量を更に培地で３０００１ｄに
増加させる。そして上記の培養条件を使って更に７〜１
０日間培養する。細胞を含む培地を４°Ｃにて１１００
０Ｘで２０分間遠心する。無菌条件下で上清を濾過（孔
径０．２．ｎ）Ｌそして濃縮する。飽和硫酸アンモニウ
ムの添加により粗製免疫グロブリンを得、次いで前述の
ようにして精製する。

前記モノクローナル抗体のイソタイプは、マウスＴｇク
ラスおよびサブクラスに対するウサギ抗血清（Ｂｉｏｒ
ａｄ　Ｍｏｕｓｅ　Ｔｙｐｅｒ”　Ｓｕｂ　Ｉｓｏｔｙ
ｐｉｎｇ　Ｋｉｔ）を用いたＥＬＩＳＡ分析により決定
される。

全てのモノクローナル抗体がＴｇＧ　１イソタイプであ
り、ただしＭＡｂ　１２１９Ｓ７８．６はＩｇＧ　２ｂ
である。

抗うつ薬と共に使用されることがある多数の治療薬およ
び生体アミンが本発明のモノクローナル抗体の結合を阻
害する能力を二段階阻害エンザイムイムノアッセイにお
いて調べ、テスト化合物に対するモノクローナル抗体の
選択性を確立する。

該アッセイは次に記載れれるようにして行われる。６０
ｕ１のＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ　２０　（０，０５％）中の
一定濃度のテストしようとするモノクローナル抗体（例
１．４のＥＬＩＳＡにおいて対照の２０倍を超える吸光
度をもたらす抗体の量と等価）を、未コートの９６ウエ
ルの旦クロタイタープレート中で、ＰＢＳ　／　Ｔｗｅ
ｅｎ２０（０，０５％）中一定濃度のテストしようとす
る化合物（Ｉ　Ａ−１５０ｐＭ）６０１！ｌを含む試料
と共に一晩プレインキュベートする。次いでインキュベ
ーション混合物を、Ｒ−（−）−オキサプロチリン−ム
チン接合体でコーティングされたミクロタイタープレー
トに移し、水溶性化合物により免疫複合体に携わってい
ないモノクローナル抗体の相対濃度を例１．４に記載の
ようにして測定する。

水溶性化合物に対するモノクローナル抗体の相対結合親
和力をＩＣ５ｏ（阻害濃度）、即ち、固相抗原へのモノ
クローナル抗体の結合を５０％阻害する化合物の濃度と
して表わす。モノクローナル抗体ＭＡｂ　１２２６Ｓ３
１、Ｓについての結果を第１表に示す。

アルキルアミノ側鎖を有する三環式薬剤は、弱い阻害活
性を示すが、その他のテスト化合物はテストされたどの
濃度においても全く阻害しない。

遊離のＲ−（−）−オキサプロチリンおよびＲ−（−）
−オキサプロチリンと構造的に類似している多数の化合
物が抗原への本発明のモノクローナル抗体の結合を阻害
する能力を、例３．２に本質的に記載されるような阻害
エンザイムイムノアッセイにおいて測定する。ＭＡｂを
、例３．２のテスト化合物の代わりに遊離のＲ−（−）
−オキサプロチリンおよび種々の構造類似体それぞれと
インキュベートする。テストされる構造類似体は第２Ａ
表に示される。

遊離のＲ−（−）−オキサプロチリンとのブレインキュ
ベーションは、固体表面上への結合時のＲ−（−）−オ
キサプロチリンの起こり得るコンホメーション変化を調
べるために行われ、そして抗原へのモノクローナル抗体
の結合親和力の一般的指標を与える。

モノクローナル抗体ＭＡｂ　１２１９Ｓ５９．１１．　
ＭＡｂ１２１９Ｓ７８．６．　ＭＡｂ　１２２５Ｓ９３
．２．　ＭＡｂ　１２２６Ｓ３１、ＳおよびＭＡｂ　１
２２８Ｐ６３．１についてのＩＣ，。イ直およびそれか
ら誘導される相対親和蓄力を第２Ｂ表に示す。

ＭＡｂ　１２１９ｓ５９．１１は、Ｒ−（−）−オキサ
プロチリンに対して最も高い選択性および感受性を示す
抗体である。それは大部分の類似体と適度にのみ立体特
異性および交差反応性を示す。ＭＡｂ１２１９Ｓ７８．
６は、あまり明確ではないが同様に反応する。ＭＡｂ１
２２５Ｓ９３．２．１２２６Ｓ３１、Ｓおよび１２２８
Ｐ６３．１は、２つの−オキサプロチリンエナンチオマ
ー間をほとんど識別しない。共通の四環式構造の幾つか
の変化は認識される。ヒドロキシル基のグルクロニド化
は、全てのテスト抗体の結合能力を種々の程度減少させ
る。しかしなから、それらの代謝産物の高い尿濃度を考
慮すると、ＭＡｂは例えば患者の迎合性について該化合
物を測定するのに十分である。

本発明のモノクローナル抗体は、ヒト血清中のＲ−（−
）−オキサプロチリンまたは尿中のＲ−（−）−オキサ
プロチリンβ−グルクロニドの定性および／または定量
のために、下記に記載の競合化学発光イムノアッセイに
おいて使用することができる。

置型 第−段階において、次のようにしてＲ−（−）−オキサ
プロチリンスクシネートを調製する。

２０４■のＲ−（−）−オキサプロチリン・ＨＣ１！を
３　ｍｌのメタノールと１　ａｌｌの水に溶解する。撹
拌下でｐＨをＩ　Ｎ　ＮａＯＨで中性に調整しなから１
１０■のコハク酸無水物を添加する。１時間後、ＨＣｆ
で溶液をｐ）１３に酸性化し、水で２５−の全容量に希
釈する。

氷上で冷却した後、沈澱を濾取し、乾燥する（収率９５
％）。

次に、７９■のＲ−（−）−オキサプロチリンスクシネ
ートを０．５−のジオキサンに溶解し、０、Ｓ−のジオ
キサン中の２３■のＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよ
び０、Ｓ−のジオキサン中４２■のジシクロへキシルカ
ルボシイごドを添加する。溶液を室温で２時間反応させ
る。４−の酢酸エチルを添加し、沈澱を除去し、２Ｉｒ
ｄｌの氷冷１０％ＮａＨＣＯｓおよび２１１ｄｌの水で
洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、窒素下で
濾過する。

こうして１周製されたＲ−（−）−オキサプロチリンの
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを第三段階にお
いてリゾチームと接合させる。まずＤＭＦ中の活性化エ
ステルの２ＩＩＩＭ溶液１容量およびアクリジニウムエ
ステルの２ｍＭ溶液ｌ容量を、０、１　Ｍリン酸緩衝液
および０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ８）中のりゾチ
ームの０．２ｍＭ溶液５容量と共に２時間インキュベー
トする。Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ−６上でのクロマトグラフィ
ーにより、接合体を精製する。

４．２　　Ａモノクローナル　　を　いたイムノアッセ
イ １００ＩＩＩのモノクローナル抗−Ｒ−（−）−オキサ
プロチリン抗体（１０Ｊ１ｇ／＃１１２）をポリスチレ
ン試験管中で室温にて１時間インキュベートする。

ＰＢＳで３回洗浄した後、残りの吸着部位を、ゼラチン
（２，５ｍｇ／ｒｎ１）およびＴｗｅｅｎ　２０”　（
Ｓｉｇｍａ。

０．１％）を含むＰＢＳで１時間飽和する。テストしよ
うとする血清および尿試料に例４．１のアクリジニウム
エステルおよびリゾチームとＲ−（−）−オキサプロチ
リンスクシネートとの接合体０．８■／ｄを補足する。

この試料をＭＡｂでコーティングされたポリスチレン試
験管中で室温にて１時間インキュベートする。ＰＢＳで
洗浄した後、発光反応を開始させる過酸化水素／水酸化
ナトリウムの添加により結合した接合体を検出し、Ｃｉ
ｂａＣｏｒｎｉｎｇ　Ｍａｇｉｃ　ＬｉＬｅＩＩ発光測
定計において発光を測定する。

４、Ｓ　　テストキット 例４．２のイムノアッセイ用テストキットは次のものを
含む： ポリスチレン試験管 Ｒ−（−） 取扱説明書 −オキサプロチリン ・・・１０ｍｇ 尿中のＲ−（−）−オキサプロチリンβ−グルクロニド
は、イムノストリップまたはデイツプスティック上での
競合エンザイムイムノアッセイにおいて検出することが
できる。

本発明のモノクローナル抗体（ＰＢＳ　ｐＨ７，４中２
■／ｄ）を、限定された検出帯中にマイクロシリンジで
１　ｃｍ　Ｘ　５　ｃｍストリップのニトロセルロース
（８ｔｔｍ　；　５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃ
ｈｕｅｌｌ）に適用する。

適用した物質を室温で１時間乾燥し、ニトロセルロース
上の残りの結合部位をポリビニルアルコール（２０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−Ｈ（、ｅ　ｐＨ７，４中１％−／ｖ）で室
温で３０分間ブロックし、該シートを蒸留水で徹底的に
洗浄し、そして３０″Ｃで３０分間乾燥する。

アルカリホスファターゼとＲ−（−）−オキサプロチリ
ンβ−グルクロニドの接合体を調製し、そしてシ＝Ｊ糖
（蒸留水中６０％−／ν）の下層の上に固定化された抗
体の下側の検出帯に適用する。次いでストリップを乾燥
する。

イムノストリップの通用帯に新鮮な尿試料（１００メ）
を適用することによりアッセイを行う。各試料をストリ
ップ上に５分間流す。次いで基質溶液を添加し、そして
検出帯において生じた色を肉眼または反射率計により読
む。

あるいは、アルカリホスファターゼ接合体の代わりに、
共有結合した色素とＲ−（−）−オキサプロチリンの接
合体を使う。この場合、検出帯における色の生成のため
に基質の添加は不必要である。

班旦：韮鵞工堕辻０１艷剋 本発明のモノクローナル抗体２．０■を生理的食塩水５
０−に溶かす。この溶液を細菌フィルターに通し、濾液
を無菌条件下で１０本のアンプル（５ｍ）に充填する。

好ましくは冷却下、例えば−２０°Ｃでアンプルを保存
する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｒ−（−）−オキサプロチリンおよび／またはＲ−
   （−）−オキサプロチリンβ−グルクロニドに対して向
   けられたモノクローナル抗体、並びに前記化合物の抗原
   決定基に対する特異性を保持しているその誘導体。 ２、Ｒ−（−）−オキサプロチリンに対して向けられた
   請求項１に記載のモノクローナル抗体およびその誘導体
   。 ３、四環式環構造および／または脂肪族側鎖の化学的変
   化によりＲ−（−）−オキサプロチリンと異なっている
   他のジベンゾビシクロ〔２．２．２〕オクタジエン化合
   物の存在下でＲ−（−）−オキサプロチリンと選択的に
   結合する、請求項１または２に記載のモノクローナル抗
   体およびその誘導体。 ４、ジベンゾビシクロ〔２．２．２〕オクタジエン骨格
   を欠きＲ−（−）−オキサプロチリンと共に使用される
   可能性のある他の治療薬の存在下でＲ−（−）−オキサ
   プロチリンと選択的に結合する、請求項１〜３のいずれ
   か一項に記載のモノクローナル抗体およびその誘導体。 ５、Ｓ−（＋）−オキサプロチリンの存在下でＲ−（−
   ）−オキサプロチリンと選択的に結合する、請求項１〜
   ４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体およびそ
   の誘導体。 ６、称号ＭＡｂ１２１９Ｓ５９．１１、ＭＡｂ１２１９
   Ｓ７８．６、ＭＡｂ１２２０Ｓ３６．６、ＭＡｂ１２２
   ５Ｓ９３．２、ＭＡｂ１２２６Ｓ３１．３、ＭＡｂ１２
   ２８Ｐ５４．６およびＭＡｂ１２２８Ｐ６３．１を有す
   る抗体から選択された、請求項１〜５のいずれか一項に
   記載のモノクローナル抗体、およびその誘導体。 ７、称号ＭＡｂ１２１９Ｓ５９．１１を有する請求項６
   に記載のモノクローナル抗体、およびその誘導体。 ８、称号ＭＡｂ１２１９Ｓ７８．６を有する請求項６に
   記載のモノクローナル抗体、およびその誘導体。 ９、称号ＭＡｂ１２２６Ｓ３１．３を有する請求項６に
   記載のモノクローナル抗体、およびその誘導体。 １０、称号ＭＡｂ１２２８Ｐ６３．１を有する請求項６
   に記載のモノクローナル抗体、およびその誘導体。 １１、酵素、蛍光マーカー、化学発光マーカー、金属キ
   レート、アビジンまたはビオチンとの接合体である請求
   項１〜１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体
   の誘導体。 １２、放射能ラベル化されている請求項１〜１０のいず
   れか一項に記載のモノクローナル抗体の誘導体。 １３、断片である請求項１〜１０のいずれか一項に記載
   のモノクローナル抗体の誘導体。 １４、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のモノクロ
   ーナル抗体およびその誘導体の生産方法であって、前記
   モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を試
   験管内または生体内で増殖させ、そして必要であれば、
   得られた前記モノクローナル抗体を単離しそして／また
   はその誘導体に変換することを特徴とする方法。 １５、請求項１に記載のモノクローナル抗体を分泌する
   ことを特徴とするハイブリドーマ細胞系。 １６、ミエローマ細胞と免疫原性Ｒ−（−）−オキサプ
   ロチリン接合体で免疫処置された哺乳動物のＢリンパ球
   とのハイブリッドであることを特徴とする、請求項１５
   に記載のハイブリドーマ細胞系。 １７、マウスミエローマ細胞と免疫原性Ｒ−（−）−オ
   キサプロチリン接合体、で免疫処置された同系マウスの
   Ｂリンパ球とのハイブリッドであることを特徴とする、
   請求項１５に記載のハイブリドーマ細胞系。 １８、称号１２１９Ｓ５９．１１、１２１９Ｓ７８．６
   、１２２０Ｓ３６．６、１２２５Ｓ９３．２、１２２６
   Ｓ３１．３、１２２８Ｐ５４．６および１２２８Ｐ６３
   ．１を有するハイブリドーマ細胞系から選択された、請
   求項１５に記載のハイブリドーマ細胞系。 １９、称号１２１９Ｓ５９．１１を有する請求項１８に
   記載のハイブリドーマ細胞系。 ２０、称号１２１９Ｓ７８．６を有する請求項１８に記
   載のハイブリドーマ細胞系。 ２１、称号１２２６Ｓ３１．３を有する請求項１８に記
   載のハイブリドーマ細胞系。 ２２、称号１２２８Ｐ６３．１を有する請求項１８に記
   載のハイブリドーマ細胞系。 ２３、請求項１５に記載のハイブリドーマ細胞系の調製
   方法であって、適当な哺乳動物を免疫原性Ｒ−（−）−
   オキサプロチリン接合体で免疫処置し、この動物の抗体
   産生細胞を連続細胞系の細胞と融合し、融合で得られた
   ハイブリッド細胞をクローニングし、そして所望のモノ
   クローナル抗体を分泌する細胞クローンを選択すること
   を特徴とする方法。 ２４、Ｒ−（−）−オキサプロチリンおよび／またはＲ
   −（−）−オキサプロチリンβ−グルクロニドの測定方
   法であって、請求項１に記載のモノクローナル抗体およ
   び／またはその誘導体をイムノアッセイにおいて使用す
   ることを特徴とする方法。 ２５、前記アッセイがラジオイムノアッセイであること
   を特徴とする、請求項２４に記載の方法。 ２６、前記アッセイがエンザイムイムノアッセイである
   ことを特徴とする、請求項２４に記載の方法。 ２７、前記アッセイが化学発光イムノアッセイであるこ
   とを特徴とする、請求項２４に記載の方法。 ２８、Ｒ−（−）−オキサプロチリンおよび／またはＲ
   −（−）−オキサプロチリンβ−グルクロニドの定性お
   よび定量のためのテストキットであって、請求項１に記
   載のモノクローナル抗体および／またはその誘導体を含
   んで成るテストキット。 ２９、イムノストリップである請求項２８に記載のテス
   トキット。 ３０、Ｒ−（−）−オキサプロチリンの過剰投薬のため
   中毒にかかっているヒト以外の温血動物の治療のための
   医薬製剤であって、請求項１に記載のモノクローナル抗
   体および／またはその誘導体並びに医薬担体を含んで成
   る医薬製剤。