DE3872153T2 - 25-hydroxy-vitamin-d3-derivate. - Google Patents
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Description
- Die Erfindung betrifft 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivate, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und sie verwendende Bestimmungsverfahren.
- Bekannte Bestimmungsverfahren für 25-Hydroxy-Vitamin- D&sub3; schließen ein kompetitives Proteinbindungsbestimmungs (CPBA)-Verfahren und ein Radioimmunoassay (RIA)-Verfahren ein. Bei diesen Verfahren wird eine Tritium [³H]-markierte Verbindung verwendet (PCT/JP 56/500538), beispielsweise ein Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat, welches mit Tritium in der 1- Position markiert ist (JP-A-60-163859). Im allgemeinen wird das beim CPBA-Verfahren verwendete Vitamin D-Bindungsprotein hergestellt aus dem Plasma einer Ratte, die mit einer Nahrung mit Vitamin D-Mangel gefüttert worden ist [Vitamin, 55(12), 595 - 605 : 1981]. Eine Verbindung mit einer Seitenkette mit einer terminalen Carbonylgruppe ist als Hapten bekannt für die Herstellung von Antikörpern, die in RIA- Verfahren eingesetzt werden (JP-A-58-92656, JP-A-55-47653 und JP-A-59-148775). Bei diesen Bestimmungsverfahren wird Tritium-markiertes 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; verwendet.
- Tritium-markierte Verbindungen weisen in bezug auf die Strahlungsenergie im Vergleich zu denen, die mit ³²P oder ¹²&sup5;I markiert sind, niedrige spezifische Aktivität auf und erfordern hohe Kosten und aufwendige Arbeitsverfahren. Bekannte Tritium-markierte Vitamin D&sub3;-Derivate haben nur eine niedrige Emissionsrate an β-Strahlen. Es gibt keine Berichte über ¹²&sup5;I-markierte Vitamin D&sub3;-Derivate, die τ- Strahlen mit hoher Energie emittieren, weil die konjugierte Trienstruktur von Vitamin D&sub3; als instabil bekannt ist und weil von ihr angenommen wird, daß sie durch eine Radikalreaktion einem Selbstabbau unterliegt.
- Es wurde ein Iod-Radioisotop-markiertes 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3;-Derivat mit hoher Strahlungsenergie gefunden, welches gegenüber Tritium- oder ³²P-markierten Verbindungen überlegene Eigenschaften hat. Die vorliegende Erfindung stellt ein Iod-Radioisotop-markiertes 25-Hydroxy-Vitamin- D&sub3;-Derivat der Formel (III) zur Verfügung
- wobei R&sub1; eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0; Alkylengruppe und R&sub3; eine ein Iod-Radioisotop enthaltende Gruppe bedeutet.
- Das Iod-Radioisotop ist bevorzugt ¹²&sup5;I. Das erfindungsgemäße Vitamin D&sub3;-Derivat ist stabil und unterliegt keinem Strukturabbau durch τ-Strahlen; es ist deshalb nützlich zum Einsatz bei Radioimmunoassay-Verfahren.
- Im allgemeinen können zum Bereitstellen der Radioisotop-markierten Verbindung Radioisotop-Markierungsverfahren, das direkte Markieren (Chloramin-T-Verfahren) und das indirekte Markieren (Bolton-Hunter-Reagenzverfahren) verwendet werden (Amersham Note, 1 November 1981). Das indirekte Markierungsverfahren mit milden Reaktionsbedingungen wird zum Herstellen des Derivats der Formel (III) auf Grund der Instabilität von Vitamin D gegen Säuren, Sauerstoff, oxidierende Mittel, Wärme und Licht bevorzugt.
- Die Derivate der Formel (III) können hergestellt werden aus einem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat, welches eine Seitenkette mit einer terminalen Aminogruppe aufweist.
- Die Erfindung stellt deshalb ein 25-Hydroxy-Vitamin- D&sub3;-Aminosäurederivat der Formel (I) zur Verfügung:
- wobei R&sub1; eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0; Alkylengruppe ist, bevorzugt eine C&sub2;&submin;&sub6; Alkylengruppe.
- In den beigefügten Zeichnungen zeigen:
- Fig. 1: eine Standardkurve eines (¹²&sup5;I)-markierten 25- Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivats;
- Fig. 2: Standardkurven von (¹²&sup5;I)- oder (³H)-markiertem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat;
- Fig. 3: Standardkurven von Monoiod (¹²&sup5;I)- oder Diiod (¹²&sup5;I)-markiertem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat;
- Fig. 4: Standardkurven von Verbindungen der Formel (IV) (gemäß nachfolgender Definition), wobei R&sub1; (-CH&sub2;)n-) bedeutet, wobei n die Bedeutung n = 1, n = 2 oder n = 3 hat;
- Fig. 5: Eine Standardkurve eines (¹²&sup5;I)-markierten 25- Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivats bei einem CPBA- Verfahren unter Verwendung von DBP anstelle von anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper; und
- Fig. 6: Stabilitätskurven von (¹²&sup5;I)-markiertem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat bei einem CPBA-Verfahren unter Verwendung von DBP anstelle von anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper.
- Das Derivat der Formel (I) kann als Hapten wirken, wenn es an das Trägerprotein gebunden wird und einem Tier zum Gewinnen von Antikörpern eingeimpft wird. Unter Verwendung der Antikörper und der Iod-Radioisotop-markierten Verbindung wird auch ein hochempfindliches und nützliches Radioimmunoassay-System für 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; in einer Probe zur Verfügung gestellt.
- Die Erfindung stellt auch ein Bestimmungsverfahren für 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; in einer Probe zur Verfügung, bei dem man
- einer Probe, die zu bestimmendes 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; enthält, ein Iod-Radioisotop-markiertes 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;- Derivat der Formel (III) gemäß vorstehender Definition zusetzt;
- der Probe anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper zusetzt, um sie kompetitiv mit dem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; und dem Iod- Radoisotop-markierten 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat der Formel (III) zu binden;
- den so erzeugten Iod-Radioisotop-markiertes 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3;-Derivat/anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper- Komplex vom Iod-Radioisotop-markierten 25-Hydroxy-Vitamin- D&sub3;-Derivat abtrennt; und
- die Menge der Iod-Radioisotop-Markierung in freier oder gebundender Form mißt.
- Die erfindungsgemäße Iod-Radioisotop-markierte Verbindung kann auch für ein CPBA-Verfahren unter Verwendung von DPB (Vitamin D bindendes Protein) zum Bestimmen von 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; mit hoher Empfindlichkeit verwendet werden.
- Die Erfindung stellt auch ein Bestimmungsverfahren für 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; in einer Probe zur Verfügung, bei dem man
- einer Probe, die zu bestimmendes 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; enthält, ein Iod-Radioisotop-markiertes 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;- Derivat der Formel (III) gemäß vorstehender Definition zugibt;
- der Probe Vitamin D bindendes Protein zusetzt, um es kompetitiv mit dem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; und dem Iod-Radoisotopmarkierten 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat der Formel (III) zu binden;
- den so erzeugten Iod-Radioisotop markiertes 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3;-Derivat/Vitamin D bindendes Protein-Komplex vom Iod-Radioisotop-markierten 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat abtrennt; und
- die Menge der Iod-Radioisotop-Markierung in freier oder gebundender Form mißt.
- Das 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat der Formel (I) kann erhalten werden durch Umsetzen einer Aminosäure mit der 3β-Hydroxygruppe von 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;. Die Verbindung der Formel (I) kann als Hapten bei der Herstellung von anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörpern verwendet werden. Die Verknüpfung des Haptens mit dem Trägerprotein erfolgt bevorzugt über die C&sub1;&submin;&sub1;&sub0; Alkylenkette.
- Die Verbindung der Formel (I) kann hergestellt werden durch Umsetzen von 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; mit einer Aminosäure der Formel (IV):
- HOOC-R&sub1;-NH&sub2;,
- wobei R&sub1; die vorstehend definierte Bedeutung hat, die Aminosäure eine geschützte Aminogruppe hat, um ein 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3; der Formel (II)
- zu erhalten und Entfernen der Schutzgruppen davon.
- Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Herstellen eines 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivats der Formel (I) gemäß vorstehender Definition zur Verfügung, wobei man von einer Verbindung der Formel (II)
- wobei R&sub1; die vorstehend definierte Bedeutung hat und R&sub2; eine aminoschützende Gruppe bedeutet, in Gegenwart einer Base und in einem inerten Lösemittel die Schutzgruppe entfernt.
- Beispiele für die Anzahl der Kohlenstoffatome im R&sub1;- Gruppe und Verbindungen aus denen sie erhalten werden können, sind n = 1; Glycin, n = 2; β-Alanin, n = 3; τ-Aminobuttersäure und β-Aminoisobuttersäure, n = 4; δ-Aminovaleriansäure, n = 5; ε-Amino-n-capronsäure, n = 6; 7-Aminoheptansäure und n = 10; 11-Aminoundecansäure. Die Kohlenstoffkette in R&sub1; ist bevorzugt geradkettig und enthält auch bevorzugt 2 bis 6 Kohlenstoffatome. Man kann auch δ-Aminolävulinsäure, Glycylglycin oder δ-Aminosäure, d.h. D- und/oder L-Lysin verwenden. Wenn die Hydroxylgruppe geschützt ist, kann eine Aminosäure mit einem Seitenkettenhydroxyl verwendet werden, z.B. 4-Amino-3-hydroxybuttersäure. Die durch R&sub1; dargestellte Alkylengruppe kann somit unsubstituiert oder substituiert sein, beispielsweise mit mindestens einer Amino-, Hydroxy- oder Oxogruppe.
- Geeignete aminoschützende Gruppen sind diejenigen, die man (auf Grund der möglichen Instabilität von Vitamin D bei strengeren Bedingungen zur Entfernung) bei milden Bedingungen leicht entfernen kann, wie z.B. bei schwachbasischen Bedingungen. Beispiele sind 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl- (nachfolgend als Fmoc bezeichnet), 9-(2-Sulfo)-fluorenylmethyloxycarbonyl-, 1,1-Dimethyl-2-cyanoethyloxycarbonyl- und 5-Benzisoxazolylmethyloxycarbonyl-Gruppen, auf Grund ihrer leichten Einsetzbarkeit am meisten bevorzugt eine 9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe. Eine aminogeschützte Gruppe kann mit bekannten Verfahren durch Umsetzen eines aktivierten Derivats hergestellt werden, z.B. eines aktivierten Esters einer Fmoc-enthaltenden Verbindung wie z.B. ein 9- Fluorenylmethyl-succinimidylcarbonat- oder 9-Fluorenylmethylchlorformiat-Derivat, mit einer Aminosäure [L.A. Carpino und G.Y. Ham, J. Org. Chem., 37: 3404 (1972)].
- Das 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat der Formel (II) kann erhalten werden - beispielsweise bei Verwendung von Fmoc-Aminosäure als aminogeschützte Aminosäure -, indem man ein Äquivalent 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; mit einem Äquivalent Fmoc-Aminosäure oder mit seinem Säureanhydrid, Säurehalogenid oder aktivierten Ester umsetzt. Bevorzugt wird ein Äquivalent Fmoc-Aminosäure mit einem Äquivalent eines gemischten Anhydrids mit einer anderen Säure unter Inertgas und in Anwesenheit einer Base in einem wasserfreien Lösemittel umgesetzt. Ein Grund für das Umsetzen des gemischten Anhydrids mit 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; liegt darin, die Bildung eines Nebenprodukts zu unterbinden, nämlich eines 25- Hydroxy-Vitamins-D&sub3;, welches eine in der 25-Position an die Hydroxygruppe angehängte Fmoc-Aminosäuregruppe aufweist.
- Beispiele für andere Säuren in dem gemischten Anhydrid sind Valeriansäure, Pivalinsäure und Isobutylchlorformiat; Pivalinsäure ist bevorzugt. Beispiele für wasserfreie Lösemittel sind wasserfreie organische Lösemittel wie z.B. Tetrahydrofuran oder Dioxan. Beispiele für Basen sind Dimethylaminopyridin (DMAP) und Piperidinopyridin (PPY), die zum Verestern eines sekundären Alkohols oder eines tertiären Alkohols mit sterischer Hinderung bevorzugt werden. Ein bevorzugtes Inertgas ist Argon oder Stickstoff. Die Reaktion läuft bevorzugt 1 bis 3 Stunden lang bei 0 bis 20 ºC ab. Das so erhaltene 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat der Formel (II) kann wenn nötig mit einem Reinigungsverfahren gereinigt werden wie beispielsweise der Säulenchromatographie oder der Dünnschichtchromatographie (TLC).
- Das 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat der Formel (II) wird zum Herstellen eines 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivats der Formel (II) in einem inerten Lösemittel in Anwesenheit einer Base der Entfernung der Aminogruppe unterworfen, d.h. der Entfernung von Fmoc. Beispiele für Basen sind Piperidin, Morpholin und Ethanolamin; Morpholin ist am meisten bevorzugt. Beispiele für inerte Lösemittel sind Ethanol und Methanol, bevorzugt wasserfreies Ethanol oder wasserfreies Methanol. Die Reaktion läuft 1 bis 3 Stunden lang im Dunkeln bei 0 bis 20 ºC unter Inertgas ab.
- Das so erhaltene 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat der Formel (I) kann mit der Säulenchromatographie oder der TLC gereinigt werden.
- Bei einem Iod-Radioisotop-markiertem 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3;-Derivat der Formel (III) hat R&sub1; die gleiche Bedeutung wie in Formel (I), und R&sub3; ist eine Gruppe, die ein Iod-Radioisotop enthält. Beispiele für ein Iod-Radioisotop sind ¹²&sup5;I und ¹³¹I; das Isotop ¹²&sup5;I mit relativ langer Halbwertszeit ist bevorzugt. Beispiele für solche Gruppen sind 3-(4-Hydroxy-3-iodo [¹²&sup5;I] phenyl)-propionyl, 3-(3,5- Diiodo [¹²&sup5;I] -4-hydroxyphenyl) propionyl, 2-(4-Hydroxy-3- iodo [¹²&sup5;I] phenyl) acetyl, 2-(3,5-Diiodo [¹²&sup5;I] -4-hydroxyphenyl) acetyl, 2-Iodo [¹²&sup5;I] acetyl, 4-Iodo [¹²&sup5;I] benzoxymethylcarbonyl und ein N-substituierter 3-iodo [¹²&sup5;I] tyrosin Rest. 3-(4-Hydroxy-3-iodo [¹²&sup5;I] phenyl) propionyl und 3-(3,5-Diiodo [¹²&sup5;I] -4-hydroxyphenyl) propionyl sind bevorzugt.
- Bei der Herstellung eines Iod-Radioisotop-markierten 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivats wird das 25-Hydroxy-Vitamin- D&sub3;-Aminosäurederivat der Formel (I) mit einem Iod-Radioisotop über ein indirektes Markierungsverfahren mit Hilfe eines Bolton-Hunter-Reagenzes markiert, um das Iod-Radioisotop-markierte 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat zu erhalten. Ein indirektes Markierungsverfahren ist ein Verfahren zum Herstellen eines Iod-Radioisotop-markierten 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3;-Derivats der Formel (III) durch Umsetzen eines reaktiven Derivats der Formel (IV) gemäß nachfolgender Definition, welches eine Iod-Radioisotop-markierte Gruppe aufweist, mit einem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat der Formel (I).
- Das reaktive Derivat der Formel (IV) hat die Formel:
- R&sub3; - X (IV)
- wobei R&sub3; die vorstehend definierte Bedeutung hat und X eine Succinimidyl-N-oxy-, Phthalimidyl-N-oxy-, 5-Norbornen-2,3- dicarboximidyl-N-oxy- oder Maleimidyl-N-oxy-Gruppe bedeutet. N-Succinimidyl-3-(4-hydroxy-3-iodo [¹²&sup5;I] phenyl) propionat, für welches R&sub3; in der Verbindung der Formel (IV) die Bedeutung 3-(4-Hydroxy-3-iodo [¹²&sup5;I] phenyl) propionyl hat und X die Bedeutung Succinylimidyl-N-oxy hat, ist ein im Handel erhältliches [¹²&sup5;I] Bolton-Hunter-Reagenz. Ein indirektes Markierungsverfahren kann mit einem 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat der Formel (I) durchgeführt werden unter Verwendung dieses Bolton-Hunter-Reagenzes, indem man beispielsweise einige p-Mole bis einige m-Mole eines Tod [¹²&sup5;I]-Radioisotop-Bolton-Hunter-Reagenzes mit einer 500 bis 2000 Überschußmenge, bevorzugt eine 1000 Überschußmenge 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat 12 bis 72 Stunden lang bei 0 bis 30 ºC umsetzt. Um die Wirkung auf ein RIA- oder CPBA-Verfahren zu erhöhen, wird das hergestellte Radioisotop-markierte 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat der Formel (III) bevorzugt mit Hilfe von TLC oder HPLC gereinigt. Das so erhaltene ¹²&sup5;I-markierte 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3;-Derivat ist bei -20 ºC in Ethanol länger als zwei Monate der Halbwertszeit von ¹²&sup5;I stabil und kann in einem Radioimmunoassay eingesetzt werden.
- Die Lagertemperatur ist bevorzugt so niedrig wie möglich, d.h. 5 bis -20 ºC, bevorzugt niedriger als -20 ºC. Das Derivat kann in Alkohol oder Ether unter Inertgas gelagert werden.
- Anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper kann durch Einimpfen eines Konjugats eines Haptens, d.h. eines 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivats der Formel (I) und eines Trägerproteins in ein Tier hergestellt werden. Beispiele für ein Trägerprotein, welches zum Erhalten eines immunogenen Antigens für das Hapten essentiell ist, sind einfache Proteine, Polypeptide und komplexe Proteine wie z.B. ein Glycoprotein. Beispiele für ein einfaches Protein sind Rinderserumalbumin (BSA), Humanserumalbumin oder Humanserumglobulin. Ein Beispiel für ein Polypeptid ist Polylysin. Ein Beispiel für ein Glycoprotein ist Mucoprotein. Ein einfaches Protein wird bevorzugt, insbesondere Rinderserumalbumin und Humanserumalbumin.
- Das 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat der Formel (I) und ein Trägerprotein werden in Gegenwart eines Kondensationsreagenzes oder eines vernetzenden Reagenzes miteinander mit einer kovalenten Verbindung verbunden. Beispiele für Kondensationsreagenzien und vernetzende Reagenzien sind Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Säureanhydrid und Glutaraldehyd; DCC ist am meisten bevorzugt. Das Konjugationsverhältnis des 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivats und des Trägerproteins kann - auf Grund eines abnehmenden Antikörpertiters, wenn sich eines im Überschuß befindet - so sein, daß 10 bis 40 Moleküle 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat in einem Molekül Trägerprotein anwesend sind.
- Das so hergestellte Konjugat für die Antikörperproduktion wird zum Erzeugen eines Antikörpers einem Tier eingeimpft. Das Einimpfen kann durch parenterale Verabreichung erfolgen, wie beispielsweise subkutaner oder intrakutaner Injektion. Ein Konjugatantigen des obigen 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat/Trägerproteins wird zusammen mit einer Äquimenge des vollständigen Freund'schen Hilfsstoffes (C.F.A.) in einer Pufferlösung oder in physiologischer Kochsalzlösung gelöst, das Gemisch wird vollständig emulgiert und zur Immunisierung etwa 10 Mal alle 1 bis 3 Wochen einem homeothermalen Tier subkutan oder intrakutan eingeimpft. Alternativ kann man das Konjugatantigen direkt in die Milz einimpfen. Während der Immunisierungszeit wird der Serumantikörper-Titer zu verschiedenen Zeiten gemessen, und beim maximalen Titer werden Vollblutproben genommen und zum Koagulieren stehengelassen. Die koagulierte Probe wird mit Hilfe von Zentrifugation aufgetrennt, um Antiserum zu erhalten, welches den anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper enthält.
- Die Natur des homeothermalen Tiers ist nicht beschränkt; es kann ein Tier sein, welches Aktivität zur Antikörperproduktion aufweist. Bevorzugt werden große Mengen des Antikörpers aus Schafen oder Rindertieren erhalten. Allgemein bevorzugt sind Kaninchen oder Ratten. Das Isolieren des anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörpers aus dem Antiserum kann mit herkömmlichen Verfahren zur Antikörperreinigung erfolgen. Beispielsweise wird mit Ammoniumsulfat fraktioniertes Antiserum mit der Ionenaustauscherchromatographie oder Gelfiltration behandelt.
- Ein anderes Verfahren zum Herstellen des Antikörpers erfolgt durch Beimpfen von Milzzellen, die das gewünschte Antikörper des Tieres produzieren können, mit dem Konjugatantigen aus 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat/Trägerprotein und Fusionieren der Zellen mit etablierten Myelomzellen. Das so erhaltene Hybridom wird gezüchtet, und die von dem Hybridom erzeugten monoklonalen Antikörper werden verwendet.
- Beispielsweise wird eine Emulsion, die hergestellt wird durch Mischen eines in Pufferlösung oder physiologischer Kochsalzlösung gelösten Konjugatantigens aus 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat/Trägerprotein und eine gleiche Menge C.F.A. subkutan einer Maus, beispielsweise der Rasse Balb/c, zum Sensibilisieren eingeimpft. Die Zellfusion wird 3 bis 5 Tage nach endgültiger Sensibilisierung durchgeführt. 3 bis 5 Tage nach erfolgter Sensibilisierung werden anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper produzierende Milzzellen gesammelt und mit etablierten Myelomzellen fusioniert, die über einen langen Zeitraum gezüchtet werden können. Eine über einen langen Zeitraum züchtbare etablierte Zelle kann eine Zelle sein, die man über einen langen Zeitraum in vitro oder in vivo kultivieren und züchten kann, und die zum Erzeugen von Immunoglobulin oder seinen verwandten Proteinen in der Lage ist; im allgemeinen verwendet man gut gezüchtete Myelomzellen. Bevorzugte Myelomzellen sind die Zellinien P3-NSI/1-Ag4-1, P3-X63-Ag8U1, SP2/U-Ag14 und MPC11-45.6.TG.1.7. Für die vorliegende Erfindung wird P3-X63-Ag8U1 bevorzugt. Die Zellen können in herkömmlichen Zellkulturmedien gezüchtet werden. Das Züchten kann beispielsweise durchgeführt werden in einem Medium aus 10 % FCS, zugegeben zu RPMI 1640 (Warenzeichen von Flow Laboratory), zu welchem Glutamin, Brenztraubensäure, Penicillin und Streptomycin zugegeben werden. Zum Lagern einer Kultur wird dem obigen Medium S-Azaguanin zugegeben. Für die Zellfusion werden 1 - 3 x 10&sup8; Myelomzellen verwendet. Milzzellen kann man herstellen durch Zerschneiden einer Mausmilz und Zerdrücken der Milz auf einem Gitter zum Herstellen einer Suspension aus Milzzellen. Gewaschene Zellen, im allgemeinen 1 - 3 x 10&sup8; Zellen, werden durch Mischen jeder Zelle mit Myelomzellen fusioniert. Das Verhältnis der Zellen, die gemischt werden, beträgt experimentell Myelomzellen : Milzzellen 1 : 3 bis 10. Die Zellfusion erreicht man in einem Medium für Hybridomen. Bevorzugt ist ein herkömmliches Verfahren zum Zellfusionieren unter Verwendung eines Promotors wie beispielsweise Sendai-Virus oder Polyethylenglycol (PEG). Für die Erfindung am meisten bevorzugt ist PEG.
- Die fusionierten Zellen werden in das Medium für die Hybridomen eingeimpft, inkubiert und dann durch Inkubieren in HAT-Medium selektiert. HAT-Medium ist ein Medium für Hybridomen, wobei Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin zugesetzt ist. Weil im allgemeinen in der Vertiefung einer Platte zur Zelltrennung mehr als 2 Hybridomen gezüchtet werden, werden möglicherweise mehr als zwei Arten von Antikörpern erzeugt, oder Zellen, die keine Antikörper erzeugen, können kontaminiert werden. Um Zellen mit den gleichen Eigenschaften zu erhalten, sollte jeder Klon abgetrennt werden. Für das Klonen verwendet man eine begrenzende Verdünnungskultur oder eine Weichagar-Kultur. Für diese Erfindung wird eine begrenzende Verdünnungskultur bevorzugt.
- Der so erhaltene, Hybridom abscheidende anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper mit hohem Titer kann durch Lyophilisieren in einem frühen Stadium gelagert werden. Das Lyophilisieren kann mit herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, nämlich durch Einfrieren einer Zellsuspension in einem kleinen Rohr oder einer Ampulle in einem -80 ºC- Kühlschrank und Lagern in flüssigem Stickstoff. Ein anderes Beispiel für die Hybridomherstellung besteht darin, daß obige Hybridom intraperitoneal in mit Pristan (2,6,10,14- Tetramethylpentadecan, Aldrich Chemicals) behandelte Mäuse einzuimpfen und nach etwa 10 Tagen Aszites zu sammeln. Ein weiteres Verfahren besteht darin, das Hybridom in RPMI-Medium mit zugesetztem Rinderfötenserum zu inkubieren, oder in Darbecco-modifiziertem Igel-Medium. Der so erhaltene Antikörper kann mit herkömmlichen Verfahren gereinigt werden. Beispielsweise wird der Antikörper mit Ammoniumsulfat fraktioniert und mit Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration und Affinitätschromatographie zum Fraktionieren von IgG behandelt. Dann kann gereinigter monoklonaler anti-25- Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper erhalten werden.
- Weiter können Zellen, die monoklonale anti-25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3;-Antikörper erzeugen, in ein Tier eingeimpft und dort gezüchtet werden, welches ein identisches Histokompatibilitäts-Antigen aufweist oder als Tumor in eine nackte Maus, es können gezüchtete Zellen gesammelt und daraus monoklonale Antikörper gereinigt werden.
- Für ein Bestimmungsverfahren für 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; kann polyklonaler anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper oder monoklonaler anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper (nachfolgend werden manchmal beide als anti-25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3;-Antikörper bezeichnet) in löslichem Zustand oder in immobilsiertem Zustand verwendet werden.
- Unlöslicher Träger und anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper werden gebunden unter Verwendung eines polyfunktionellen Reagenzes, und der immobilisierte Antikörper hat einen Antikörpertiter gegen 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;. Beispiele für polyfunktionelle Reagenzien sind Verbindungen mit mehr als zwei Gruppen, die mit funktionellen Gruppen reagieren können wie z.B. Amino, Hydroxyl, Carboxyl und Thiol, wie z.B. Aldehyde wie z.B. Succinaldehyd, Glutaraldehyd oder Adipinaldehyd, Dicarboxylat wie z.B. Malonsäure, Succinsäure, Glutarsäure oder Adipinsäure oder deren reaktive Derivate, Diisocyanate wie z.B. Hexamethylendiisocyanat oder 2,4-Toluoldiisocyanat, Diisothiocyanat wie z.B. Hexamethylendiisothiocyanat, Maleimidcarboxylate wie z.B. Maleimidbenzoat oder Maleimidphenylacetat oder deren funktionelle Derivate, Dimaleimide wie z.B. N,N-Ethylen-bis- maleimid oder N,N'-O-Phenylendimaleimid, Bisdiazobenzidin, Diethylmalonimidat, Dimethyladipinimidat oder N,N'-Polymethylen-bisiodoacetamid und Thiocarboxylate wie z.B. 3-(2'- Benzothiozolyl-dithio) propionat oder 3-(2'-Pyridyldithio) propionat oder deren funktionelle Derivate. Das polyfunktionelle Reagenz kann ausgewählt werden durch Berücksichtigung der Bindung einer funktionellen Gruppe wie z.B. Amino, Carboxyl, Hydroxyl oder Thiol in einem anti-25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3;-Antikörper. Ein immobilisierter Träger ist ein Träger mit einer reaktiven Gruppe, die keine Bindung mit einer Gruppe zum Binden mit einem Antikörper in einer polyfunktionellen Gruppe eingeht. Beispiele für immobilisierte Träger sind unlösliche Proteine wie z.B. Albumin oder Gelatine, Epichlorhydrin-behandelte unlösliche Polysaccharide wie z.B. Agarose, Cellulose oder Dextrin, unlösliche Polymere oder Copolymere von Acrylnitril, Acrylsäure, Acrylatester, Metacrylsäure, Methacrylatester, Vinylalkohol, Vinylacetat, Styrol, Aminostyrol, Chlorstyrol, Maleinsäure oder Fumarsäure, welche mit Bromcyanat behandelt und entsprechend der Einführung von Aminogruppen mit Spacern eingeführt werden und unlösliche anorganische Träger, die mit einer funktionellen Gruppe wie beispielsweise einer Aminogruppe in eine anorganische Verbindung beispielsweise des Siliciums oder Aluminiums eingeführt werden. Ein immobilisierter Träger kann auch ein Träger sein, der ein anti-25- Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper durch physikalische Adsorption binden kann.
- Ein immobilisierter Träger liegt bevorzugt in Form von Teilchen vor, die in einfacher Weise durch Filtration isoliert werden können, z.B. Kügelchen mit einem Durchmesser von mehr als 1 mm, bevorzugt mehr als 5 mm, oder er liegt in Form einer Spindel vor, die der Bodenform eines Antigen/Antikörper-Reaktionsglases entspricht.
- Das Einführen einer reaktiven Gruppe in einen anti-25- Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper unter Verwendung eines einen Spacer einführenden Reagenzes kann durchgeführt werden durch Einführen einer zusätzlichen funktionellen Gruppe wie z.B. Aldehyd, Carboxyl, Amino oder Thiol und Umsetzen mit einem oder mehreren Spacer-einführenden Reagenzien, beispielsweise Dialdehyden wie z.B. Succinaldehyd, Glutaraldehyd oder Adipinaldehyd, reaktiven Derivaten wie z.B. dem Säurechlorid, dem Succinimidester oder dem p-Nitrophenylester von ω-Aminobuttersäure oder ω-Aminoglutaminsäure, reaktiven Derivaten von Dicarbonsäuren wie z.B. Malonsäure, Succinsäure, Glutarsäure oder Adipinsäure, Diaminen wie z.B. Hexamethylendiamin oder Decamethylendiamin, reaktiven Derivaten von 3-(2'-Pyridyl-dithio) propionsäure oder 3- (2'-Benzothiazolyl-dithio) propionsäure, S-Acetylmercaptosuccinanhydrid oder Thiolen wie z.B. 2-Aminoethanthiol.
- Anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper wird direkt oder über ein polyfunktionelles Reagenz mit einer reaktiven Gruppe in den immobilisierten Träger kondensiert. Die Kondensationsreaktion verläuft im allgemeinen bei 0 bis 40 ºC in einer Pufferlösung mit pH = 6,0 - 8,5 oder in einem organischen Lösemittel oder Gemischen davon. Weiterhin wird ein zweiter Antikörper, der erhalten wird durch Immunisieren großer Säugetiere, die mit einer Immunglobulinfraktion im Serum, welches zur Antikörperproduktion von 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3; verwendet wird, immobilisiert, und anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper wird daran mit Hilfe einer Antigen-Antikörper-Reaktion gebunden, um den immobilisierten Antikörper herzustellen.
- Der so erhaltene immobilisierte Antikörper wird gewaschen und gelagert.
- Für ein Bestimmungsverfahren für 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; in einer Probe unter Verwendung von anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper in flüssiger löslicher Phase wird eine festgesetzte Menge Iod-Radioisotop-markiertes 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3;-Derivat der Formel (III) vorher einer Probe zugesetzt, die 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; enthält, es wird dann eine optimale Menge anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper zur Bildung eines Reaktionsprodukts zugesetzt, welches Antigen und Antikörper kombiniert.
- Der so gebildete markierte 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat/anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper-Bindungskomplex, 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;/Antikörper-Bindungskomplex und freies markiertes 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat werden aufgetrennt unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers für anti- 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper. Der erwähnte spezifische Antikörper wird als zweiter Antikörper bezeichnet. Der zweite Antikörper kann beispielsweise erhalten werden durch Einimpfen einer normalen Immunglobulinfraktion in das Serum eines Tieres, welches als Antigen zum Immunisieren verwendet wird zur Antikörperproduktion von 25-Hydroxy-Vitamin- D&sub3;, und dann durch Isolieren des Antikörpers aus dem so erhaltenen Antiserum. Der zweite Antikörper kann erforderlichenfalls mit einem bekannten Verfahren gereinigt werden, oder er kann bevorzugt im Zustand eines Antiserums verwendet werden.
- Ein Bestimmungsverfahren für 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; in einer Probe unter Verwendung von anti-25-Hydroxy-Vitamin- D&sub3;-Antikörper und Iod-Radioisotop-markiertem 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3;-Derivat wird wie folgt erläutert:
- 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; in einer Probe wie z.B. einem bekannten Serum wird aus der Serumprobe extrahiert. Eine Probe, die ein Gemisch aus Serum und einer gleichen Menge von zugegebenem Lösemittel darstellt, wird gerührt, stehengelassen und zentrifugiert. Die abgetrennte überstehende Lösung wird säulenchromatographisch behandelt, und man erhält eine Fraktion, die 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; enthält. Bevorzugt wird die Probe mit HPLC gereinigt.
- Die 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Fraktion kann geprüft werden durch vorherige Zugabe von Tritium [³H]-markiertem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;. Die 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Fraktion wird im Vakuum getrocknet, das Vakuum durch Argongas ersetzt und die Fraktion in Ethanol zum Bereiten einer Probe gelöst. Zur Probe wird eine festgesetzte Menge Iod-Radioisotop-markiertes 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat zugesetzt, und die am meisten geeignete Menge anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper zugesetzt. Das Gemisch wird etwa 15 bis 72 Stunden lang bei 4 bis 5 ºC in einem Medium für Antigen/Antikörper wie beispielsweise einem Phosphatpuffer oder Veronalpuffer inkubiert, um die kompetitive Reaktion von Iod-Radioisotop- markiertem Hapten und nichtmarkiertem Hapten mit dem Antikörper ablaufen zu lassen. Der so gebildete Antigen/Antikörper-Bindungskomplex, d.h. eine gebundene Form des Iod- Radioisotop-markierten 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat/anti- 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörpers (B) und eine nichtumgesetzte freie Form von Iod-Radioisotop-markiertem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat (F), werden mit Hilfe eines Dextran/Aktivkohle (DC)-Verfahrens mit Filtration oder Zentrifugation 15 Minuten lang bei 3.000 min&supmin;¹ getrennt. Bei der B/F-Trennung wird die Radioaktivität in B oder F gemessen. Die Menge an 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; (H) in einer Probe wird berechnet durch Messen der Radioaktivität und durch Berechnen von B/(B + F) oder B/F. Wenn die Menge an H zunimmt, nimmt die Radioaktivität von B ab, und diejenige von F nimmt zu. Deshalb kann die unbekannte Menge H erhalten werden durch Messen der Radioaktivität von B und F mit Hilfe einer vorher aufgestellten Standardkurve einer bekannten Menge.
- Bei der B/F-Trennung, wenn eine Zweifach-Antikörpertechnik für einen Antikörper in löslichem Zustand verwendet wird, werden ein zweiter Antikörper - bevorzugt einer zweiter Antikörper, der Antiserum enthält - und falls erforderlich Normalserum derselben Art des für die Herstellung von anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper verwendeten Tieres nach der kompetitiven Reaktion zugegeben und 1 bis 12 Stunden lang inkubiert. Danach wird der gebildete Bildungskomplex durch 10 bis 30-minütiges Zentrifugieren bei 3.000 min&supmin;¹ gefällt, um Fällung (B) und Überstand (F) voneinander abzutrennen, und es wird dann die Radioaktivität von B oder F gemessen.
- Gemäß dem vorliegenden Bestimmungsverfahren kann eine Standardkurve für 2 pg/Test bis 256 pg/Test hergestellt werden, und es kann eine schnelle Reaktionszeit von 16 Stunden bei 5 ºC oder 1 Stunde bei 37 ºC erhalten werden. Die weitere Aufarbeitung nach der Reaktion ist recht einfach. Daneben zeigen Verdünnungs- und Wiederfindungsversuche unter Verwendung einer Probe eine Linearität mit hoher Präzision. Der Korrelationskoeffizient τ zwischen dem [¹²&sup5;I] RIA-Verfahren der vorliegenden Erfindung und einem bekannten [³H] CPBA-Verfahren bei der Bestimmung von 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; in Humanserum beträgt 0.980 (y = 0.928 X + 1.90; n = 18).
- Wenn ein Antikörper durch das bekannte DBP ersetzt wird, kann es mit einem Iod [¹²&sup5;I]-Radioisotop markierten 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat umgesetzt werden, und man kann eine Standardkurve zwischen 1 bis 32 pg/Test aufstellen. Das DBP kann erhalten werden aus dem Serum von Huhn, Ratte, Maus, Kaninchen, Ziege, Schaf, Rind oder des Menschen.
- Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:
- Extraktion und Reinigung von 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; aus Serum
- Ein Gemisch aus 0,5 ml Serum und 0,5 ml Acetonitril wurde mit einem BORTEX-Mischer gerührt und dann 30 Minuten lang stehengelassen. Die durch 30-minütige Zentrifugation bei 3.000 min&supmin;¹ erhaltene überstehende Flüssigkeit (0,8 ml) wurden auf eine Sep-Pack C - 18-Cartridge-Säule (Warenzeichen, MILLIPORE, Waters Corp.) aufgebracht, die mit Ethanol aktiviert war, mit 50 % Acetonitril äquilibriert und mit wäßrigem Acetonitril eluiert. Die Säule wurde dann mit 4 ml 50 % Acetonitril gewaschen, dann mit 4 ml 64 % Acetonitril eluiert (eine Fraktion 1 α, 25-Dihydroxy-Vitamin-D&sub3;) und mit 4 ml 73 % Acetonitril eluiert (eine Fraktion 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; und 24, 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;). Die mit 73 % Acetontril eluierte Fraktion wurde im Vakuum getrocknet und mit Argongas gepackt, und es wurde eine 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3; enthaltende Fraktion erhalten. Die so erhaltene Rohfraktion wurde gelöst in 20 ul eines Gemisches aus n- Hexanisopropanol (9 : 1) und mit Hilfe von HPLC auf einer Zorbax-SIL (Dupont Inc.) 0,46 x 25 cm-Säule gereinigt. Die obigen Fraktionen aus 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; wurden durch vorherige Zugabe von Tritium [³H]-markiertem 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3; gesichert [26,27-Methyl-³H]. Die Fraktion aus 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; (Rt = 4 bis 5 Min.) wurde im Vakuum getrocknet und mit Argongas gepackt.
- Die Fraktionen wurden in 2 ml Ethanol gelöst, und 20 ul davon wurden für eine Bestimmung verwendet.
- Die Wiederfindung des 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; beträgt 94,6 ± 2,4 % (n = 18).
- τ-Amino-n-propionsäure (178 mg, 2 mM) wurde N-Succinimidyl-9-fluorenylmethyloxycarboxylat (674 mg, 2 mM) zugesetzt, welches in 25 ml eines Gemisches aus Tetrahydrofuran (THF)/Dimethylformamid (DMF)/H&sub2;O (1 : 2 : 2) gelöst war, und es wurde über Nacht bei Zimmertemperatur umgesetzt. Das Reaktionslösemittel wurde im Vakuum abdestilliert, und der Rückstand wurde auf eine Silikagel-Säule (Waki-gel C-200, 75 g) aufgebracht und getrennt und gereinigt durch Eluieren mit CHCl&sub3; : Methanol = 9 : 1, und es wurden 538,8 mg einer Verbindung erhalten (Ausbeute 86,5 %).
- NMR. δ (DMSO - d&sub6;)
- 2,50 - 2,60 (2H, t, -CH&sub2;-CO-)
- 3,28 - 3,35 (2H, m, -CH&sub2;-N-)
- 4,33 - 4,44 (3H, m, Fmoc )
- 7,35 - 8,06 (8H, m, Fmoc )
- Pivaloylchlorid (7,38 ul, d = 0,979, 0,06 mM) und Di- methylaminopyridin (DMAP, 732 mg, 0,06 mM) wurden 3-(N-9- Fluorenylmethyloxycarbonyl) aminopropionsäure (18,7 mg, 0,06 mM) zugesetzt, die in 3 ml trockenem THF gelöst war, und 15 Minuten lang bei -15 ºC unter Argonatmosphäre im Dunkeln umgesetzt. Es wurden 1 ml einer THF-Lösung von 25- Hydroxy-Vitamin-D³ (24,0 mg, 0,06 mM) zugesetzt und 1 Stunde lang bei 0 ºC und 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur umgesetzt; dabei verschwand 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;. Zum Abbrechen der Reaktion wurden 0,5 ml Methanol zugesetzt und dann im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Hilfe von präparativer TLC gereinigt [Art. 5717, Merck, 20x20 cm, Entwickler : Ethylacetat/Hexan (1:2)], und es wurden 30,1 mg einer Verbindung erhalten (Ausbeute 72,4 %).
- NMR. δ (CDCl&sub3;) ppm
- 0,537 (3H, s, -CH&sub3;-18)
- 3,30 - 3,60 (2H, m, -CH&sub2;-N-)
- 4,10 - 4,50 (3H, m, Fmoc )
- 4,80 - 5,60 (4H, m, H-19E, H-3α, H-19Z, -NH )
- 5,94 - 6,29 (2H, m H-7, H-6)
- 7,20 - 7,81 (8H, m, Fmoc )
- UV. λ max (EtOH) nm 300.2, 266.4, 214.4
- Das in Beispiel 1 erhaltene 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-3β- 3-0-[3-(N-9'-fluorenylmethyloxycarbonyl) aminopropionat] (30,1 mg, 0,043 mM) wurde in 1 ml Ethanol gelöst. Es wurden 10 ml Morpholin zugegeben und 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur und im Dunkeln unter Argonatmosphäre zur vollständigen Umsetzung gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert und mit Hilfe von präperativer TLC gereinigt [Art. 5717, Merck, 10x20 cm, Entwickler : Ethylacetat- MeOH (1:4)], und es wurden 8,3 mg einer Verbindung erhalten (Ausbeute 40,6 %).
- Ninhydrinfärbung : positiv
- NMR. δ (CDCl&sub3;) ppm
- 0,54 (3H, s, -CH&sub3;-18)
- 2,36 - 2,52 (2H, m, -CO-CH&sub2;)
- 2,90 - 3,05 (2H, m, -CH&sub2;-N-)
- 3,50 - 4,00 (2H, b, -NH&sub2; )
- 4,86 - 5,08 (3H, H19E, H- 3α, H-19Z)
- 5,90 - 6,30 (2H, m, H-7, H-6)
- UV. λ max (EtOH) nm 264,5
- Das in Beispiel 2 erhaltene 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-3β- 0-[3-aminopropionat] (18,1 mg, 38,43 x 10&supmin;³ mM) wurde in 1 ml THF gelöst und wurde bei 0 ºC zusammen mit 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (9,6 mg, 1,3 x 38,43 x 10&supmin;³ mM) BSA zugegeben (Molekulargewicht 65.000, 50 mg, 1/50 x 38,43 x 10&supmin;³), welches in Tris-Puffer gelöst war (0,1 M, pH = 8,6). Dem Reaktionsgemisch wurden viermal 10 ml Chloroform zugesetzt, und der nicht umgesetzte 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-3β-0-(3-aminopropionatester) wurde entfernt. Die wäßrige Schicht wurde gefriergetrocknet, und es wurden 45 mg lyophilisiertes Produkt erhalten, welches einen Komplex aus 22 Molekülen 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-3β-0- (3-aminopropionatester) darstellte, die über die Aminogruppen an deren 3-Position an ein Molekül BSA gebunden waren.
- Das vorstehend in (1) erhaltene lyophilisierte 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-3ß-0-[3-BSA-aminopropionat]-Antigen wurde in Tris-Puffer gelöst (0,1 M, pH = 8,6). Es wurde eine gleiche Menge C.F.A. zugegeben und zum Herstellen von 1 ug bis 200 ug/ml Antigen zum Emulgieren gemischt. Die Emulsion wurde alle 2 Wochen zehnmal einem Kaninchen, 50 τ-500 τ/Kopf, eingeimpft. Während der Immunisierung wurde der Titer einer alle 10 Tage abgenommener Blutprobe gemessen, und beim maximalen Antikörpertiter wurde Vollblut abgenommen. Die Blutprobe wurde 60 Minuten lang bei Zimmertemperatur zum Koagulieren stehengelassen und dann 10 Minuten lang bei 3.000 min&supmin;¹ zentrifugiert, und es wurde 25-Hydroxy-Vitamin- D&sub3;-Antikörper enthaltendes Antiserum erhalten, welches mit Ammoniumsulfat zum Gewinnen der IgG-Fraktion fraktioniert wurde.
- Das vorstehend (1) erhaltene und in Phosphatpuffer, pH=7,2 gelöste lyophilisierte 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-3β-0- [3-(BSA-amino)propionat]-Antigen, 50 τ, wurde zusammen mit C.F.A. subkutan in weibliche Balb/c-Mäuse mit einem Alter von 4 Wochen eingeimpft. Nach einer Woche wurden 50 τ davon subkutan eingeimpft, und nach 2 Wochen wurden 50 τ Antigen intraperitoneal eingeimpft. Drei Tage nach der letzten Einimpfung wurde die Milz fein geschnitten und auf einem Sieb zerdrückt, um eine Milzzellen-Suspension herzustellen. Die Zellfusion wurde mit einem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von Maus-Myelomzellen P3-X-3-Ag8U1 durchgeführt. Eine 30-prozentige wäßrige PEG-Lösung (Molekulargewicht 1.000) wurde bei 37 ºC inkubiert. Die Milzzellen und die Myelomzellen (insgesamt 4 x 10&sup7; Zellen, 5 : 1) wurden in RPMI-Medium (5 ml) suspendiert, und beide Zellen wurden behutsam gemischt und 10 Minuten lang bei 1.000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Der Überstand wurde dann im Vakuum filtriert. Das Zentrifugationsrohr wurde zum Mischen der Zellpellets leicht geschüttelt, und es wurde 1,0 ml PEG-Lösung langsam zugegeben und behutsam gerührt. Das Gemisch wurde unter leichtem Schütteln bei 27 ºC inkubiert, dann die Zellfusion durch langsame Zugabe eines herkömmlichen Mediums (10 ml) abgebrochen und erneut Zellen suspendiert. Die Suspension wurde 5 Minuten lang bei 1.000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Das abgeschiedene Zellpellet wurde durch behutsames Schütteln dispergiert und langsam in HAT-Medium (5 ml) suspendiert und in HAT-Medium (1 ml) in einem Gefäß überführt. Die Zellen wurden mikroskopisch betrachtet. Es wurden 200 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen pipetiert und im CO&sub2;-Inkubator gezüchet. Die fusionierten Zellen wurden in HAT-Medium mit Hilfe des Verfahren der begrenzenden Verdünnung zum Klonen selektiert. Die erhaltene Klonsuspension wurde in dem Peritoneum von mit Pristan behandelter Balb/c-Maus gezüchtet. Die IgG- Fraktion wurde mit einem herkömmlichen Verfahren aus Aszites und Serum gewonnen und mit Hilfe von Affinitätschromatographie unter Verwendung von an Protein A gebundener Sepharose CL-4B gereinigt. Die so erhaltene IgG-Unterklasse war IgG 1 und wurde als monoklonaler Antikörper eingesetzt.
- Iod [¹²&sup5;I]-Bolton-Hunter-Reagenz [NEN, NEX-120-10, 2200 Ci/mM, insgesamt 0,33 mCi/100 ul Benzollösung] (100 pM/66,6 ul/220 uCi) und DMAP (1 nM/1 ul THF) wurden einer THF-Lösung (130 ul) des in Beispiel 2 erhaltenen 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-3β-0-(3-aminopropionats) (100 nM/127,8 ul THF) zugesetzt und 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur unter Argonatmosphäre im Dunkeln umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Hilfe von HPLC gereinigt (Zorbax-SIL, 4,6 mm x 25 cm-Säule, 20 % Isopropanol-n-Hexan, Fluß 1 ml/min). Die obige Verbindung weist einen Rt-Wert von 8,50 bis 9,50 min und eine Wiederfindung von 20,0 % auf (Iod [¹²&sup5;I]-Bolton-Hunter-Reagenz : Rt = 14,0 bis 16,0 min). Das Monoiod- Radioisotop-markierte 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; wurde mit Hilfe von synthetisiertem, Nichtmonoiod-Radioisotop-markiertem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; mit Hilfe von HPLC identizifiert.
- Iod [¹²&sup5;I]-Bolton-Hunter-Reagenz [NEN, NEX-120H-10, 4400 Ci/mM, insgesamt 0,33 mCi/100 ul Benzollösung] (25 pM/33,3 ul/110 uCi) und DMAP (1 nM/1 ul THF) wurden einer THF- Lösung (120 ul) des in Beispiel 2 erhaltenen 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-3β-0-(3-aminopropionats) (25 nM/6,952 ul THF) zugesetzt und 20 Stunden lang bei Zimmertemperatur unter Argonatmosphäre im Dunkeln umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Hilfe von HPLC gereinigt (Zorbax-SIL, 4,6 mm x 25 cm-Säule, 20 % Isopropanol-n-Hexan, Fluß 1 ml/min). Die obige Verbindung weist einen Rt-Wert von 8,90 bis 10,10 min und eine Wiederfindung von 9,9 % auf (Iod [¹²&sup5;I]-Bolton- Hunter-Reagenz : Rt = 14,0 bis 16,0 min). Das Monodiiod- Radioisotop-markierte 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; wurde mit Hilfe von synthetisiertem, nichtmarkiertem Diiod-Radioisotop-markiertem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; mit Hilfe von HPLC identizifiert.
- Eine 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Standard-Ethanollösung mit 256 p/g/20 ul wurde mit zweifach/zweifach-Verdünnung zu einer Verdünnungreihe verdünnt, und es wurden Lösungen mit 128 pg/20 ul, 64 pg/ul, 32 pg/20 ul, 16 pg/20 ul, 8 pg/20 ul, 4 pg/20 ul und 2 pg/20 ul hergestellt.
- Proben (20 ul) jeder der obigen Konzentrationen wurden in drei Reagenzgläser pepitiert. 20 ul einer Ethanollösung von [¹²&sup5;I]-Iod-Radioisop-markiertem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;- Derivat, welches das Antioxidans Tocopherol enthielt, wurden in jedes Reagenzglas pipetiert (20 ul, ca. 13.000 cpm).
- In jedes Reagenzglas wurde 1 ml anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Kaninchenserum gegeben, welches mit Trispuffer mit ph=8,6 verdünnt war (Verdünnung etwa 15.000). Jedes Gemisch in den Reagenzgläsern wurde mit einem BORTEX-Mischer gerührt und bei 5 ºC über Nacht (20 bis 24 Stunden) stehengelassen. In die Reaktionsgläser wurde Glycinpuffer, pH= 8,6, gegeben, der mit einem Gemisch aus Dextran T70 und Aktivkohle (1 : 10) suspendiert war (jeweils 300 ul), es wurde mit einem BORTEX-Mischer gemischt und 1 Stunde lang bei 5 ºC inkubiert. Die B/F-Trennung wurde durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 3.000 min&supmin;¹ durchgeführt, und 1 ml jeder überstehenden Lösung wurde 1 Minute lang mit einem Autowell-τ-Zähler gemessen. Das Bindungsverhältnis wird mit der folgenden Gleichung berechnet:
- Bindungsverhältnis =
- wobei (B) die Nummer der Zählung in jedem Reagenzglas, (BL) die Nummer der Zählung bei Verwendung von 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3; (1.000 pg/20 ul) anstelle von ¹²&sup5;I-markiertem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat und (Bo) die Nummer der Zählung unter Verwendung von 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; bei Nullkonzentration bedeutet. Fig. 1 zeigt die Standardkurve von [¹²&sup5;I]-markiertem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat.
- Es wurde in derselben Weise wie vorstehend in (1) für [¹²&sup5;I]-markiertes Derivat eine Standardkurve unter Verwendung von Tritium [³H]-markiertem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat (26,27-Methyl-³H) erstellt.
- Das Ergebnis ist in Fig. 2 gezeigt. In Fig.2 wurden die [¹²&sup5;I]-markierte (- - -) und ³H-markierte (- - -)-Verbindung verwendet. Bei Einsatz von [¹²&sup5;I]-Markierung wurde eine gleiche oder eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zur [³H]-Markierung gefunden. Insbesondere bei niederen Konzentrationen (10 pg/Reagenzglas) wurde höhere Emfindlichkeit beobachtet.
- [¹²&sup5;I]-Monoiod-Markierung und [¹²&sup5;I]-Diiod-Markierung wurden mit dem gleichen Verfahren wie vorstehend miteinander verglichen. Das Ergebnis ist in Fig. 3 gezeigt. In Fig. 3 wurden eine [¹²&sup5;I)-Monoiod-Markierung (- - -) und eine [¹²&sup5;I]-Diiod-Markierung (- - -) eingesetzt.
- Das Iod-Radioisotop-markierte 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;- Derivat hat die Formel (V):
- Die Bestimmungen bei Verwendung von [¹²&sup5;I]-Monoiod- markierter Verbindung und [¹²&sup5;I]-Diiod-markierter Verbindung haben nahezu gleiche Empfindlichkeit; die [¹²&sup5;I]-Monoiod-Markierung ist bevorzugt.
- Es wurden Bestimmungen unter Verwendung einer Verbindung der Formel (IV) miteinander verglichen, wobei R&sub1; = Methylen [-(CH&sub2;)n-] bedeutet, wobei n = 1, n = 2 oder n = 3.
- Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt, wobei - - - : n = 1 bedeutet, - - - : n = 2 bedeutet und - - - : n = 3 bedeutet; n = 2 und n = 3, bevorzugt n = 2, zeigen bei Vergleich mit n = 1 gute Ergebnisse.
- 3,3 ml mit Phosphatpuffer (pH=7,4, 0,01 M) verdünntes Kalbfötenserum wurde auf eine Säule aus Blue-Spharose (Warenzeichen der Pharmacia Corp.), ∅2,5 x 7,5 cm) aufgebracht und die de-Albumin-Behandlung durch 40 ml Gelbettvolumen durchgeführt.
- Jeweils 5 ml der Fraktionen Nr. 7 bis 10 mit einer Adsorption bei 280 nm wurden gesammelt (insgesamt 20 ml). FCS kann durch Serum homothermaler Tiere ersetzt werden.
- Eine Standard-Ethanollösung von 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; mit 1.024 p/g/20 ul wurde mit zweifach/zweifach-Verdünnung zu einer Verdünnungsreihe verdünnt, und es wurden Lösungen mit 32 pg/20 ul, 16 pg/ul, 8 pg/20 ul, 4 pg/20 ul, 2 pg/20 ul und 1 pg/20 ul hergestellt.
- Proben (20 ul) jeder der obigen Konzentrationen wurden in zwei Reagenzgläser pepitiert. 20 ul einer Ethanollösung von [¹²&sup5;I]-Iod-Radioisop-markiertem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;- Derivat, welches das Antioxidans Tocopherol enthielt, wurden in jedes Reagenzglas pipetiert (20 ul, ca. 30.000 cpm). 500 ul DBP, verdünnt mit Trispuffer mit pH= 8,6 (ca. 500 bis 1.000 Verdünnung der DBP-Fraktion gemäß vorstehend (1)) wurden in jeder Lösung gerührt und 16 Stunden lang bei 4 ºC stehengelassen.
- In die Reaktionsgläser wurde Glycinpuffer, pH= 8,6, gegeben, der mit einem Gemisch aus Dextran T70 und Aktivkohle (1 : 10) suspendiert war (jeweils 300 ul), es wurde gerührt und 30 Minuten lang bei 4 ºC inkubiert. Die B/F- Trennung wurde durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 4 ºC und 3.000 min&supmin;¹ durchgeführt, und jeweils 500 ml der überstehenden Lösung wurden 1 Minute lang mit einem Autowell-τ- Zähler gemessen. Das Bindungsverhältnis wird mit der folgenden Gleichung berechnet:
- Bindungsverhältnis =
- wobei (B) die Nummer der Zählung in jedem Reagenzglas, (NSB) die Nummer der Zählung bei Verwendung von 25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3; (1024 pg/20 ul) anstelle von ¹²&sup5;I-markiertem 25- Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat und (Bo) die Nummer der Zählung unter Verwendung von 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; bei Nullkonzentration bedeutet. Fig. 5 zeigt die Standardkurve von [¹²&sup5;I]-markiertem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat.
- Eine 50-prozentige H&sub2;O/Ethanol-Lösung des gemäß Beispiel 4 oder Beispiel 5 erhaltenen [¹²&sup5;I]-25-Hydroxy- Vitamin-D&sub3;-Derivats wurde in einem Gefäß bei -20 ºC in Argonatmosphäre aufbewahrt. Es wurde eine Standardkurve unter Verwendung der obigen Proben gemäß dem obigen Verfahren (2) erstellt. In Fig. 6 bedeutet -o-o- den Tag = 0, - - - den Tag 21 und - - - den Tag 49 der Standardkurve. Wie in Fig. 6 gezeigt ist, wurden bei Lagerung bei -20 ºC innerhalb des Bereiches von 2 bis 32 pg/Test keine Veränderungen der Kurve beobachtet. Das Ergebnis zeigt, daß das [¹²&sup5;I]- 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat in einem Radioimmunoassay mit guter Stabilität eingesetzt werden kann.
- Wie vorstehend gezeigt wurde stellt die Erfindung ein Iod-Radioisotop-markiertes 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat mit hoher Strahlungsenergie und breiter Anwendbarkeit zur Verfügung. Vorher war [³H]-Tritium-markiertes Vitamin-D&sub3; mit β-Emission mit niedriger Strahlungsenergie bekannt. Bis jetzt wurde angenommen, daß die hohe Strahlungsenergie des [¹²&sup5;I]-Iod-Radioisotops-Vitamin-D&sub3; auf Grund einer radikalischen Reaktion der konjugierten Doppelbindung in der Vitamin-Struktur automatisch abbaut. Das erfindungsgemäße [¹²&sup5;I]-markierte 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat unterliegt keinem Eigenabbau durch τ-Strahlen und ist genügend stabil für den Einsatz in einem Radioimmunoassay.
- Im allgemeinen wird Vitamin-D&sub3; in vivo in der Leber oder in der Niere metabolisiert und in aktiviertes Vitamin- D&sub3; übergeführt. Das aktivierte Vitamin-D&sub3;, wie beispielsweise 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;, 1α, 25-Dihydroxy-Vitamin-D&sub3;, 1α Hydroxy-Vitamin-D&sub3; und 1α, 24-Dihydroxy-Vitamin-D&sub3;, wird klinisch zur Behandlung von Osteoporose und Osteomalazie eingesetzt. Die klinische Dosis dafür ist auf Grund seiner starken physiologischen Wirkung sehr niedrig. Die pharmakologische Aktivität hängt mit dem Blutwert und dem Gewebewert des Wirkstoffs zusammen, und Messungen des Blutwertes des dem Menschen verabreichten Wirkstoffs sind deshalb aus klinischer Sicht bedeutsam. Im Hinblick darauf ist die vorliegende Erfindung von Wert für die Bestimmung von aktiviertem Vitamin-D&sub3; in klinischen Studien.
Claims (10)
1. Iod-Radioisotop markiertes
25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat der Formel (III):
wobei R&sub1; eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0; Alkylengruppe und R&sub3; eine ein Iod-
Radioisotop enthaltende Gruppe bedeutet.
2. Iod-Radioisotop markiertes
25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat nach Anspruch 1, wobei das Iod-Radioisotop ¹²&sup5;I
ist.
3. Iod-Radioisotop markiertes 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat
nach Anspruch 2, wobei die ein Iod-Radioisotop
enthaltende Gruppe eine 3-(4-Hydroxy-3-iodo[¹²&sup5;I]-phenyl)-
propionyl- oder 3-(3,5-Diiodo[¹²&sup5;I]-4-hydroxyphenyl)-
propionylgruppe bedeutet.
4. Iod-Radioisotop markiertes
25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R&sub1; eine
C&sub2;&submin;&sub6; Alkylengruppe bedeutet.
5. Bestimmungsverfahren für 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; in einer
Probe, bei der man:
einer Probe, die zu bestimmendes 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;
enthält, ein Iod-Radioisotop-markiertes 25-Hydroxy-
Vitamin-D&sub3;-Derivat der Formel (III) gemäß Definition
nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zugibt;
der Probe anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper
zusetzt, um sie kompetitiv mit dem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;
und dem Iod-Radoisotop-markierten 25-Hydroxy-Vitamin-
D&sub3;-Derivat der Formel (III) zu binden;
den so erzeugten Iod-Radioisotop-markiertes 25-Hydroxy-
Vitamin-D&sub3;-Derivat/anti-25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörper-Komplex vom Iod-Radioisotop-markierten 25-Hydroxy-
Vitamin-D&sub3;-Derivat abtrennt; und
die Menge der Iod-Radioisotop-Markierung in freier oder
gebundender Form mißt.
6. Bestimmungsverfahren für 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; in einer
Probe, bei der man:
einer Probe, die zu bestimmendes 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;
enthält, ein Iod-Radioisotop-markiertes 25-Hydroxy-
Vitamin-D&sub3;-Derivat der Formel (III) gemäß Definition
nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zugibt;
der Probe Vitamin D bindendes Protein zusetzt, um es
kompetitiv mit dem 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3; und dem Iod-
Radoisotop-markierten 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat der
Formel (III) zu binden;
den so erzeugten Iod-Radioisotop markiertes 25-Hydroxy-
Vitamin-D&sub3;-Derivat/Vitamin D bindendes Protein-Komplex
vom Iod-Radioisotop-markierten 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-
Derivat abtrennt; und
die Menge der Iod-Radioisotop-Markierung in freier oder
gebundender Form mißt.
7. 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat der Formel (I):
wobei R&sub1; wie in Anspruch 1 oder 4 definiert ist.
8. Verfahren zum Herstellen eines
Iod-Radioisotop-markierten 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivats der Formel (III)
gemäß Definition nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei
man ein 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat der Formel (I)
gemäß Definition in Anspruch 7 mit einer Verbindung der
Formel (IV) umsetzt:
R&sub3;-X,
wobei R&sub3; gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert
ist und X eine Succinimidyl-N-oxy-, Phthalimidyl-N-
oxy-, 5-Norbornen-2,3-dicarboxyimidyl-N-oxy- oder
Maleimidyl-N-oxy-Gruppe bedeutet.
9. Verfahren zum Herstellen eines 25-Hydroxy-Vitamin-D&sub3;-
Aminosäurederivats der Formel (I) gemäß Definition in
Anspruch 7, wobei man von einer Verbindung der Formel
(II):
wobei R&sub1; gemäß Anspruch 1 oder 4 definiert ist und R&sub2;
eine aminoschützende Gruppe bedeutet, in Gegenwart
einer Base und in einem inerten Lösemittel die
Schutzgruppe entfernt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei R&sub2; eine
9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe bedeutet.
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