DE68916608T2 - 1-Alpha oder 24R, 25-Dihydroxyvitamin-D3-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und Bestimmungsmethode unter Verwendung derselben. - Google Patents
1-Alpha oder 24R, 25-Dihydroxyvitamin-D3-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und Bestimmungsmethode unter Verwendung derselben.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft 1α- oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivate, ein Verfahren zu deren Herstellung und Analyseverfahren unter deren Verwendung.
- Bekannte Analyseverfahren für 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; schließen ein Radiorezeptor-Analyseverfahren (RRA) und ein Radioimmuno-Analyseverfahren (RIA) ein. Bei diesen Verfahren wird eine Tritium-[³H]-markierte Verbindung verwendet. Es ist bekannt, den Rezeptor aus einer zytoplasmatischen Fraktion der Darmschleimhaut vom Huhn im RRA-Verfahren zu verwenden [Arch. Biochem. Biophys., 176, 235-243 (1976), Vitamin, 55(12), 595-605: 1981 und Clinical Chem., 1 (1): 7-18 (1982)). Eine Verbindung mit einer Seitenkette mit einer endständigen Carbonylgruppe ist als ein Hapten für die Herstellung von im RIA-Verfahren verwendeten Antikörpern bekannt [JP-A-58-193463, JP-A-58-92656, JP-A-55-47653, JP- A-61-48497 und JP-A-59-148775, Clinical Science and Molecular Medicine, 54, 329-332 (1978); Clinical Chem., 27/3, 458-463 (1981); Clinical Chem., 26/5, 562-567 (1980); Clinical Chem., 29/1, 196-200 (1983); J. Biochem., 98, 991-998 (1985); und Biochem. Biophys. Res., Comm., 431-436 (1983)]. In diesen Analyseverfahren wird Tritium-[³H)-markiertes 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; verwendet.
- Bekannte Analyseverfahren für 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; schließen ein kompetitives Proteinbindungsanalyseverfahren (CPBA) ein, worin eine Tritium-[³H)-markierte Verbindung verwendet wird. Für das in dem CPBA-Verfahren verwendete Vitamin-D-bindende Protein (DBP) ist auch bekannt, das Plasma von Ratten zu verwenden, die mit Vitamin-D-Mangelnahrung gefüttert worden sind [Vitamin, 55 (12), 595-605: 1981, Pharma Medica Vol. 1(1): 89-96 (1985) und Hormone and Clinical Trials Bd. 33, Nr. 1a 915-924 (1985)].
- In dem Analyseverfahren für 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; in einer Probe zeigen die bekannten Tritium-(³H)-markierten Verbindungen eine niedrige spezifische Aktivität im Vergleich mit ³²P- oder ¹²&sup5;I-markierten Verbindungen, bezogen auf die Strahlungsenergie, weisen nachteiligerweise hohe Kosten auf und umfassen beschwerliche Verfahren mit einem Flüssigscintillationszähler. Bei dem Analyseverfahren von 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; in einer Probe ist die HPLC-UV- Methode weniger genau und somit ist das CPBA-Verfahren verwendet worden. Jedoch zeigt die Tritium-[³H]-markierte Verbindung die gleichen, vorstehend aufgeführten Probleme.
- Bekannte Tritium-markierte Vitamin-D&sub3;-Derivate zeigen nur eine geringe Rate an β-Strahlenemission. Es gibt keine Berichte über ¹²&sup5;I oder ³²P-markierte 1α- oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivate, die γ-Strahlen mit hoher Energie emittieren, da die konjugierte Trienstruktur von Vitamin-D&sub3; als instabil bekannt ist und als Bereich für eine Selbstabbau durch Radikalreaktion gehalten wird.
- Es wurde ein Iod-Radioisotop-Inarkiertes 1α- oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat mit hoher Strahlungsenergie gefunden, das hervorragende Eigenschaften aufweist. Die vorliegende Erfindung stellt ein Iod-Radioisotop-markiertes 1α- oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat der Formel (III) bereit
- worin R&sub1;&sub2; OH oder -O-CO-A-NH-R&sub5; bedeutet,
- R&sub2;&sub2; H, OH oder -O-Co-A-NH-R&sub5; bedeutet; und
- R&sub3;&sub2; H, OH oder -O-CO-A-NH-R&sub5; bedeutet,
- wobei A einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylenrest bedeutet und R&sub5; eine Iod- Radioisotop-enthaltende Gruppe bedeutet, mit der Maßgabe, daß:
- 1) einer der Reste R&sub2;&sub2; und R&sub3;&sub2; H bedeutet und der andere OH oder -O-CO-A-NH-R&sub5; bedeutet,
- 2) einer der Reste R&sub1;&sub2; und R&sub2;&sub2; OH bedeutet und der andere -O-CO-A-NH-R&sub5; bedeutet oder
- 3) einer der Reste R&sub1;&sub2; und R&sub3;&sub2; OH bedeutet und der andere -O-CO-A-NH-R&sub5; bedeutet.
- Das Iod-Radioisotop ist vorzugsweise ¹²&sup5;I. Das Vitamin-D&sub3;- Derivat der Formel (III) ist stabil und zeigt keinen Strukturabbau durch γ-Strahlen; deshalb ist es für die Verwendung in Radioimmuno-Analysetechniken brauchbar.
- Bei den Radioisotop-Markierungstechniken können die direkte Markierung (Chloramin-T-Methode) und die indirekte Markierung (Bolton-Hunter-Reagens-Methode) zur Bereitstellung der Radioisotop-markierten Verbindungen verwendet werden (Amersham Note, 1. Nov. 1981).
- Die indirekte Markierungsmethode mit milden Reaktionsbedingungen wird für die Herstellung der erfindungsgemäßen Derivate aufgrund der Instabilität von Vitamin D gegen Säuren, Sauerstoff, Oxidationsmitteln, Hitze und Licht bevorzugt.
- Die Derivate der Formel (III) können aus einem 1α- oder 24R,25-Dihydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat mit einer Seitenkette mit einer endständigen Aminogruppe hergestellt werden.
- Deshalb stellt die vorliegende Erfindung ein 1α- oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Aminiosäurederivat der Formel (I) bereit
- worin:
- R&sub1; OH oder -O-CO-A-NH&sub2; bedeutet,
- R&sub2; H, OH oder -O-CO-A-NH&sub2; bedeutet, und
- R&sub3; H, OH oder -O-CO-A-NH&sub2; bedeutet,
- wobei A einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylenrest bedeutet, mit der Maßgabe, daß:
- (1) einer der Reste R&sub2; und R&sub3; H bedeutet und der andere OH oder -O-CO-A-NH&sub2; bedeutet,
- (2) einer der Reste R&sub1; und R&sub2; OH bedeutet und der andere -O-CO-A-NH&sub2; bedeutet oder
- (3) einer der Reste R&sub1; und R&sub3; OH bedeutet und der andere -O-CO-A-NH&sub2; bedeutet
- Das Derivat der Formel (I) kann als Hapten wirken, wenn es an ein Trägerprotein gebunden ist und in Tiere zum Erhalt von Antikörpern inokuliert wird. Mit den Antikörpern und der Iod-Radioisotop-markierten Verbindung wird auch ein hochempfindliches und brauchbares Radioimmunosystem für 1α- -oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivate [nachstehend als 1α- oder 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3; bezeichnet] in einer Probe bereitgestellt.
- Die Iod-Radioisotop-markierte Verbindung der Formel (III) kann auch in einem CPBA-Verfahren unter Verwendung von DBP (Vitamin-D-bindendes Protein) für die Analyse von la- oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D3 mit hoher Empfindlichkeit verwendet werden.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Analyseverfahren für 1α- oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; in einer Probe bereit, umfassend:
- die Zugabe eines nach einem der Ansprüche 4 bis 6 definierten Iod-Radioisotop-markierten 1α- oder 24R,25-Dihydroxy- Vitamin-D&sub3;-Derivats zu einer zu analysierendes 1α- oder 24R,25-Dihydroxy-Vitamin-D&sub3; enthaltenden Probe,
- die Zugabe von anti-1α- oder -24R,25-Dihydroxy-Vitamin- D&sub3;-Antikörpern oder eines Vitamin-D&sub3; bindenden Proteins zu dem so gebildeten Gemisch, um an 1α- oder 24R,25-Dihydroxy- Vitamin-D&sub3; und an das Iod-Radioisotop-markierte 1α- oder 24R,25-Dihydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat kompetitiv zu binden, die Abtrennung des so hergestellten Iod-Radioisotop-markiertes 1α- oder 24R,25-Dihydroxy-vitamin-D&sub3;-Derivat-anti-1α- oder -24R,25-Dihydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörperkomplexes oder des Iod-Radioisotop-markiertes 1α- oder 24R,25-Dihydroxy-Vitamin- D&sub3;-Derivat-DBP-Komplexes von dem Iod-Radioisotop-markierten 1α- oder 24R,25-Dihydroxy-Vitamin-D&sub3;-Derivat, und
- die Messung der Menge der Iod-Radioisotopenmarkierung in gebundener oder freier Form.
- Das 1α- oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat der Formel [I] kann durch Umsetzung einer Aminosäure mit der 1α-Hydroxy- oder 3β-Hydroxygruppe von 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; oder mit der 24R-Hydroxy- oder 3β-Hydroxygruppe von 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; erhalten werden. Die Verbindung von Formel [I] kann als Hapten bei der Herstellung von anti-1α- oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörpern verwendet werden. Die Verknüpfung des Haptens mit dem Trägerprotein wird vorzugsweise durch die C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylenkette bereitgestellt.
- Die Verbindung von Formel [I] kann durch Umsetzung von 1α- oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; mit einer Aminosäure der Formel
- HOOC-A-NH&sub2; [IV]
- worin A wie vorstehend definiert ist und die Aminosäure eine geschützte Aminogruppe aufweist, zum Erhalt eines 1α- oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivats der Formel [II] und durch Entfernung der Schutzgruppe hergestellt werden.
- Zahlenbeispiele der Kohlenstoffatome Rest A und Verbindungen, von denen sie erhalten werden können, sind: n = 1; Glycin, n = 2; β-Alanin, n = 3; γ-Amino-n-buttersäure, n = 4; 8-Aminovaleriansäure, n = 5; ε-Amino-n-capronsäure, n = 6; 7-Aminoheptansäure, und n = 10; 11-Aminoundecansäure. Die Kohlenstoffkette in A ist vorzugsweise geradkettig und enthält auch vorzugsweise 2 bis 6 Kohlenstoffatome. 6- Aminolevulinsäure, Glycylglycin oder 6-Aminosäure, d.h. D- -und/oder L-Lysin, kann auch verwendet werden. Eine Aminosäure mit einer Hydroxygruppen-Seitenkette, beispielsweise 4-Amino-3-hydroxybuttersäure, kann verwendet werden, wenn die Hydroxygruppe geschützt ist. Somit kann der durch A dargestellte Alkylenrest unsubstituiert oder substituiert sein, beispielsweise durch mindestens eine Amino-, Hydroxy- -oder Oxogruppe.
- Geeignete Aminoschutzgruppen sind solche, die unter milden Bedingungen, wie schwach basische Bedingungen, aufgrund der möglichen Instabilität von Vitamin D unter strengeren Entfernungsbedingungen, entfernt werden können. Beispiel sind 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl- (nachstehend als Fmoc bezeichnet), 9-(2-Sulfo)-fluorenylmethyloxycarbonyl-, 1,1-Dimethyl-2-cyanoethyloxycarbonyl- und 5-Benzisoxazolylmethyloxycarbonyl-Gruppen, am meisten bevorzugt eine 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Gruppe. Eine Amino-geschützte Verbindung kann durch bekannte Verfahren mittels Umsetzung eines aktivierten Derivats, beispielsweise ein aktivierter Ester einer Fmoc-enthaltenden Verbindung, wie N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyloxy)-succinimid oder 9-Fluorenylmethylchloroformat-Derivat, mit einer Aminosäure hergestellt werden [L.A. Carpino und G.Y. Ham, J. Org. Chem. 37: 3404 (1972)].
- Das 1α- oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D²-Aminosäurederivat der Formel [II] kann beispielsweise mit einer Fmoc-Aminosäure als eine Amino-geschützte Aminosäure durch Umsetzung, im Fall von 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; für eine covalente Bindung über die 1α-Hydroxy- oder 3β-Hydroxygruppe und im Fall von 24R,25-Dihydroxyvitainin-D&sub3; für eine covalente Bindung über die 24R-Hydroxy- oder 3β-Hydroxygruppe, eines Äquivalents von 1α- oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; mit einem Aquivalent einer Fmöc-Aminosäure oder dessen Säureanhydrids, Säurehalids oder aktivierten Esters erhalten werden. Mehr bevorzugt wird ein Äquivalent einer Fmoc-Aminosäure mit einem Aquivalent eines mit einer anderen Aminosäure gemischten Anhydrids unter Inertgas und in Gegenwart einer Base in einem wasserfreien Lösungsmittel umgesetzt. Der Grund für die Umsetzung des gemischten Anhydrids mit 1α (oder 24R), 25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; ist die Verhinderung der Bildung eines Nebenprodukts, 1α (oder 24R), 25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; mit einer an die Hydroxygruppe bei Position 25 gebundener Fmoc-Säuregruppe.
- Beispiele anderen Säuren in einem gemischten Anhydrid sind Valeriansäure, Pivalinsäure und Isobutyloxycarbonsäure. Pivalinsäure wird bevorzugt. Beispiele von wasserfreien Lösungsmitteln sind wasserfreie organische Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran oder Dioxan. Beispiele von Basen sind Dimethylaminopyridin (DMAP) und Piperidinopyridin (PPY), die für die Esterbildung von sekundären oder tertiären Alkoholen mit sterischer Hinderung bevorzugt werden. Die bevorzugten Inertgase sind Argon und Stickstoff. Die Umsetzung wird vorzugsweise bei 0 bis 20ºC für 1 bis 3 Stunden durchgeführt. Das so erhaltene 1α (oder 24R), 25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat der Formel [II] wird in einem Gemisch mit einer Verbindung erhalten, die die -O-OC-A-NH-R&sub4;-Gruppe [V], worin A und R&sub4; die gleichen vorstehend aufgeführten Bedeutungen zeigen, bei der 1α- oder 3β-Stellung von 1α,25- Dihydroxyvitamin-D&sub3; oder bei 24R- oder 3β-Stellung von 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; covalent bindet, und kann, wenn nötig, durch eine herkömmliche Reinigungsmethode, wie HPLC, gereinigt werden.
- Das 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; der Formel [II] wird einer Reaktion zur Entfernung der Aminoschutzgruppe, d.h. der Entfernung von Fmoc in Gegenwart einer Base in einem inerten Lösungsmittel, zur Herstellung eines 1α (24R), 25-Dihydroxy-Vitamin-D&sub3;-Aminosäurederivats der Formel [I] unterworfen. Beispiele der Basen sind Piperidin, Morpholin und Ethanolamin. Morpholin wird bevorzugt. Beispiele der inerten Lösungsmittel sind Ethanol und Methanol, vorzugsweise wasserfreies Ethanol oder wasserfreies Methanol. Die Umsetzung wird unter Inertgas in Dunkelheit bei 0 bis 20ºC für 1 bis 3 Stunden durchgeführt.
- Im Fall, daß das 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat der Formel [II] ein Gemisch von Verbindungen ist, in der ein Rest der Formel [V] covalent an die 1α- oder 3β- Stellung von 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; oder an die 24R- und 3β-Stellung von 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; gebunden ist, kann das entsprechende Produkt der Formel [I] isoliert werden und aus dem resultierenden Gemisch durch HPLC gereinigt werden. Im Fall, daß das Derivat der Formel [II] eine zuvor isolierte und gereinigte Verbindung ist, kann die erhaltene Verbindung durch Säulenchromatographie oder durch TLC gereinigt werden.
- Das Nebenprodukt, das eine Verbindung ist, die den Rest der Formel [V] bei der 1α- und 3β-Stellung von 1a,25-Dihydroxyvitamin-D3 oder bei der 24R- und 3β-Stellung von 24R,25- Dihydroxyvitamin-D&sub3; covalent bindet, kann zu einem Ausgangsmaterial, 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;, durch Hydrolyse mit verdünntem wäßrigen Alkali umgewandelt werden. Eine Verbindung der Formel [VI]
- worin R&sub6; -O-CO-A-NH&sub2; bedeutet, R&sub7; Wasserstoff oder R&sub6; bedeutet, R&sub8; Wasserstoff oder R&sub6; bedeutet, einer der Reste R&sub7; und R&sub8; Wasserstoff bedeutet und der andere R&sub6; bedeutet und A die gleichen vorstehend aufgeführten Bedeutungen aufweist, kann durch Behandlung des Nebenprodukts mit Morpholin erhalten werden und wird als eine Haptenverbindung verwendet.
- In einem Iod-Radioisotop-markierten 1α- oder 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat der Formel [III] weist A die gleichen Bedeutungen wie in Formel [I] auf und R&sub5; bedeutet eine Iod-Radioisotop-enthaltende Gruppe. Beispiele von Iod-Radioisotopen sind ¹²&sup5;I und ¹³¹I. Das Isotop ¹²&sup5;I mit einer relativ langen Halbwertszeit wird bevorzugt. Beispiele solcher Gruppen sind 3-(4-Hydroxy-3-iodo[¹²&sup5;I]phenyl)pro-pionyl, 3-(3,5-Diiodo[¹²&sup5;I]-4-hydroxyphenyl)propionyl, 2-(4- Hydroxy-3-iod[¹²&sup5;I]phenyl)acetyl, 2-(3,5-Diiodo[¹²&sup5;I]-4-hydroxyphenyl)acetyl, 2-Iodo(¹²&sup5;I]ace-tyl, 4-Iodo[¹²&sup5;I]-benzoxymethylcarbonyl und ein N-substituierter-3- iodo[¹²&sup5;I]tyrosin-Rest. Von diesen werden 3-(4-Hydroxy-3- iodo[¹²&sup5;I]phenyl)propionyl und 3-(3,5-diiodo[¹²&sup5;I]-4-hydroxyphenyl)propionyl bevorzugt.
- Bei der Herstellung von einem Iod-Radioisotop-markiertem 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat der Formel [III] wird ein 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat der Formel [I] mit einem Iod-Radioisotop durch eine indirekte Markierungsmethode mittels einem Bolton-Hunter- Reagens zum Erhalt des Iod-Radioisotop-markierten 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivats der Formel [III] markiert. Eine indirekte Markierungsmethode ist eine Methode zur Herstellung eines Iod-Radioisotop-markierten 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivats der Formel [III] durch Umsetzung eines wie nachstehend definierten Derivats der Formel [VII], das eine Iod-Radioisotop-markierte Gruppe aufweist, mit einem 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;- Aminosäurederivat der Formel [I].
- Das reaktive Derivat der Formel [VII] zeigt die Formel
- R&sub5; - X [VII],
- worin R&sub5; wie vorstehend definiert ist und X eine Succinimidyl-N-oxy-, eine Phthalimidyl-N-oxy-, eine 5-Norbornen-2,3- dicarboxyimidyl-N-oxy- oder eine Maleimidyl-N-oxy-Gruppe bedeutet. N-Succinimidyl-3-(4-hydroxy-3-iodo(¹²&sup5;I]phenyl)- propionat, für die R&sub5; 3-(4-Hydroxy-3-iodo[¹²&sup5;I]phenyl)-propionyl bedeutet und X Succinimidyl-N-oxy in der Verbindung der Formel [VII] bedeutet, ist ein im Handel erhältliches [¹²&sup5;I]-Bolton-Hunter-Reagens. Eine indirekte Markierungsmethode kann mit einem 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;- Aminosäurederivat der Formel [I] unter Verwendung des Bolton-Hunter-Reagens durch Umsetzung von einigen p-Molen bis einigen m-Molen des Radioisotop Iod[¹²&sup5;I]-Bolton-Hunter- Reagens mit einem 500- bis 2000fachen Überschuß, vorzugsweise einem 1000fachen Überschuß an 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat bei 0 bis 30ºC für 12 bis 72 Stunden durchgeführt werden. Um die Wirkung auf die RIA- -oder CPBA-Methode zu erhöhen, wird das hergestellte Radioisotop-markierte 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat der Formel [III] vorzugsweise durch TLC oder HPLC gereinigt. Das so erhaltene (¹²&sup5;I]-markierte 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat ist bei -20ºC in Ethanol für mehr als die 2monatige Halbwertszeit von ¹²&sup5;I stabil und kann in Radioimmuntests verwendet werden.
- Die Lagerungstemperatur ist vorzugsweise so niedrig wie möglich, z.B. 5ºC bis -20ºC, und vorzugsweise auch unter -20ºC. Das Derivat kann in Alkohol oder Ether unter Inertgas gelagert werden.
- Anti-1α- (oder 24R), 25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper können durch Inokulieren eines Konjugats aus einem Hapten, z.B. einem 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat der Formel [I], und einem Trägerprotein in einem Tier hergestellt werden. Beispiele von Trägerproteinen, die zum Erhalt eines immunogenen Antigens für ein Hapten essentiell sind, sind einfache Proteine, Polypeptide und komplexe Proteine, wie Glycoproteine. Beispiele von einfachen Proteinen sind Rinderserumalbumin (BSA) menschliches Serumalbumin oder menschliches Serumglobulin. Ein Beispiel eines Polypeptids ist Polylysin. Ein Beispiel eines Glycoproteins ist Mucoprotein. Von diesen werden einfache Proteine bevorzugt und Rinderserumalbumin und menschliches Serumalbumin werden am meisten bevorzugt.
- Das 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat der Formel [I] und ein Trägerprotein werden in Gegenwart eines Kondensations- oder Quervernetzungsreagens kovalent verbunden. Beispiele von Kondensationsmitteln oder Quervernetzungsreagentien sind Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Säureanhydrid und Glutaraldehyd. DDC wird bevorzugt. Das Konjugationsverhältnis des 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin- D&sub3;-Aminosäurederivats zum Trägerprotein kann aufgrund eines abfallenden Titers der Antikörper, wenn im Überschuß vorhanden, derart sein, daß 10 bis 40 Moleküle des 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Aminosäurederivats pro 1 Molekül des Trägerproteins vorhanden sind.
- Das so hergestellte Konjugat für die Antikörperherstellung wird in ein Tier zur Erzeugung von Antikörpern inokuliert. Die Inokulation kann durch parenterale Verabreichung, wie subkutane oder intrakutane Injektion erfolgen. Ein konjugiertes Antigen des vorstehenden 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat-Trägerproteins wird in einer Pufferlösung oder einer physiologischen Kochsalzlösung zusammen mit einer gleichen Menge des vollständigen Freund'schen Adjuvans (C.F.A.) gelöst. Das Gemisch wird vollständig emulgiert und subkutan oder intrakutan in ein homöothermes Tier etwa zehnmal alle 1 bis 3 Wochen zu dessen Immunisierung inokuliert. In einer anderen Ausführungsform kann das konjugierte Antigen direkt in die Milz inokuliert werden. Während des Immunisierungszeitraums wird der Serumantikörpertiter bei konstanten Zeitabständen gemessen; bei maximalem Titer wird eine Vollblutprobe gesammelt und für die Coagulation stehengelassen. Die coagulierte Probe wird zentrifugal zum Erhalt eines anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper enthaltenden Antiserums abgetrennt.
- Die Art des homöothermen Tiers ist nicht beschränkt; es kann jedes Tier sein, das eine Aktivität zur Erzeugung von Antikörpern aufweist. Um große Mengen an Antikörpern zu erhalten, wird vorzugsweise eine Ziege, ein Schaf oder ein Rind verwendet. Im allgemeinen wird ein Huhn, ein Hase, eine Ratte oder eine Maus verwendet.
- Die Isolierung des anti-1α -(oder 24R),25-Dihydroxyvitamin- D&sub3;-Antikörpers aus dem Antiserum kann mit einer herkömmlichen Methode für die Antikörperreinigung durchgeführt werden. Beispielsweise kann Ammoniumsulfat-fraktioniertes Antiserum durch Ionenaustauscherchromatographie oder Gelfiltration behandelt werden.
- Ein anderes Verfahren zur Herstellung der Antikörper ist die Inokulation von Milzzellen, die die gewünschten Antikörper des Tieres erzeugen, mit dem konjugierten Antigen von anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat-Trägerprotein und Diffusion der Zellen mit etablierten Myelomazellen. Das so erhaltene Hybridom wird gezüchtet und die von dem Hybridom erzeugten monoclonalen Antikörper werden verwendet.
- Beispielsweise wird eine Emulsion, die durch Mischen eines in Pufferlösung oder physiologischer Kochsalzlösung gelösten Antigen-Konjugats von anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Aminosäurederivat-Trägerproteins und einer gleichen Menge von C.F.A. hergestellt wird, subkutan in Mäuse, beispielsweise vom Balb/c-Stamm, für die Sensitivierung mit mehrmaligen Inokulationen jede Woche inokuliert. Die Zellfusion wird 3 bis 5 Tage nach der letzten Sensibilisierung durchgeführt. Nach 3 bis 5 Tagen nach der letzten Sensibilisierung werden die Milzzellen, die anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper erzeugen, gesammelt und mit etablierten Myelomazellen, die über einen langen Zeitraum gezüchtet werden können, fusioniert. Über einen langen Zeitraum züchtbare etablierte Zellen können als Zellen definiert werden, die über einen langen Zeitraum in vitro oder in vivo gezüchtet werden können und wachsen, und die Immunoglobulin oder dessen verwandte Proteine erzeugen können. Im allgemeinen werden gut wachsende Myelomazellen verwendet. Bevorzugte Myelomazellen sind die Zellinien P3- NSI/1-Ag4-1, P3-X63-Ag8U1, SP2/U-Ag14 und MPC11- 45.6.TG.1.7. In der vorliegenden Erfindung wird P3-X63- Ag8U1 bevorzugt. Die Zellen können in einem herkömmlichen Zellkulturmedium gezüchtet werden. Beispielsweise kann die Züchtung in einem Medium von 10% FCS, zu dem RPMI 1640 (Warenbezeichnung von Flow Laboratory), das Glutamin, Brenztraubensäure, Penicillin und Streptomycin enthält, zugegeben wird, durchgeführt werden. Für eine Stammlösung wird S-Azaguanin zu dem vorstehenden Medium zugegeben. 1 bis 3 x 10&sup8; Myelomazellen werden für die Zellfusion verwendet. Milzzellen können durch Herausschneiden der Milz aus einer Maus und durch deren Zerkleinerung mit einem Sieb zur Herstellung einer Milzzellsuspension hergestellt werden. Die gewaschenen Zellen, im allgemeinen 1 bis 3 x 10&sup8; Zellen, werden durch Mischen mit Myelomazellen fusioniert. Das Verhältnis der gemischten Zellen kann Myelomazellen:Milzzellen 1:3 bis 10 betragen. Die Zellfusion wird in einem Medium für Hybridome erreicht. Eine herkömmliche Zellfusionsmethode mit einem Promotor, wie das Sendai-Virus oder Polyethylenglykol (PEG), wird bevorzugt. Insbesondere wird PEG bevorzugt.
- Die fusionierten Zellen werden in dem Medium für Hybridome inokuliert und inkubiert und anschließend durch Inkubation in HAT-Medium selektiert. HAT-Medium ist ein Medium für Hybridome mit zugegebenem Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin. Da mehr als zwei Hybridome in der Vertiefung einer Zell-Trennplatte wachsen können, werden möglicherweise mehr als zwei Arten von Antikörpern erzeugt oder keine Antikörper erzeugenden Zellen können eine Verunreinigung sein. Um Zellen mit den gleichen Eigenschaften zu erhalten, sollte jeder Clon abgetrennt werden. Für die Clonierung wird eine Kultur unter einschränkender Verdünnung oder eine Weichagarkultur verwendet. In der vorliegenden Erfindung wird eine Kultur unter einschränkender Verdünnung bevorzugt.
- Das so erhaltene, anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin- D&sub3;-Antikörper mit hohem Titer sekretierende Hybridom kann nach der Lyophilisierung in einem frühen Stadium gelagert werden. Die Lyophilisierung kann durch eine übliche Methode durchgeführt werden, nämlich eine Zellsuspension wird in einem kleinen Röhrchen oder Ampulle in einem -80ºC-Kühlschrank eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Ein anderes Beispiel der Hybridomherstellung ist, daß das vorstehende Hybridom intraperitoneal in mit Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan, Aldrich Chemicals) behandelten Mäusen inokuliert wird und nach etwa 10 Tagen wird die Ascitesflüssigkeit gesammelt. Eine weitere Methode ist, daß das Hybridom in fötalem Rinderserum mit zugegebenem RpMI-Medium oder in Darbecco-modifiziertes Gelmedium inkubiert wird. Die so erhaltenen Antikörper können durch eine herkömmliche Methode gereinigt werden. Beispielsweise werden die Antikörper mit Ammoniumsulfat fraktioniert und mit einer Ionenaustauscherchromatographie, Gelfiltration und Affinitätschromatographie zur Fraktionierung von IgG behandelt. Anschließend können die gereinigten monoclonalen anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper erhalten werden.
- Darüberhinaus können monoclonale, anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper erzeugende Zellen in einem Tier mit identischen Histokompatibilitäts-Antigenen oder in Nacktmäusen als Tumor inokuliert und wachsen gelassen werden, und anschließend werden die gewachsenen Zellen gesammelt und die monoclonalen Antikörper daraus abgetrennt.
- Bei einer Analyse von 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; können polyclonale anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin- D&sub3;-Antikörper oder monoclonale anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper (nachstehend manchmal gemeinsam als anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper bezeichnet) in löslichem Zustand oder in immobilisiertem Zustand verwendet werden. Ein unlöslicher Träger und anti- 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper werden unter Verwendung eines polyfunktionellen Reagens gebunden und der immobilisierte Antikörper zeigt einen Antikörpertiter gegen 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;. Beispiele von polyfunktionellen Reagentien sind Verbindung mit mehr als zwei funktionellen Gruppen, die mit funktionellen Gruppen, wie Amino, Hydroxyl, Carboxyl und Thiol, reagieren können und umfassen Aldehyde, wie Succinaldehyd, Glutaraldehyd und Adipoaldehyd, Dicarboxylate, wie Malonsäure, Succinsäure, Glutarsäure oder Adipinsäure oder deren reaktive Derivate, Diisocyanate, wie Hexamethylendiisocyanat oder 2,4-Toluoldiisocyanat, Diisocyanate, wie Hexamethylendiisocyanat, Maleimidcarboxylate, wie Maleimidbenzoat oder Maleimidphenylacetat oder deren funktionellen Derivate, Dimaleimide, wie N,N-Ethylen-bis-maleimid oder N,N'-O-phenylen-dimaleimid, Bisdiazobenzidin, Diethylmalonimidat, Dimethyl-adipinimidat oder N,N'-Polymethylenbisiodoacetamid und Thiocarboxylate, wie 3-(2'-Benzothiozolyldithio)propionat und 3-(2'-Pyridyltdithio)propionat oder deren funktionellen Derivate. Das polyfunktionelle Reagens kann durch Beachten der Bindung von funktionellen Gruppen, wie Amino, Carboxyl, Hydroxyl oder Thiol, in einem 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper ausgewählt werden.
- Der immobilisierte Träger ist ein Träger mit einer reaktiven Gruppe, die nicht an Gruppen für die Bindung mit polyfunktionellen Gruppen in Antikörpern bindet. Beispiele der immobilisierten Träger sind unlösliche Proteine, wie Albumin oder Gelatine, Epichlorhydrin-behandelte unlösliche Polysaccharide, wie Agarose, Cellulose oder Dextrin, unlösliche Polymere oder Copolymere von Acrylnitril, Acrylsäure, Säureester, Methacrylsäure, Methacrylatester, Vinylalkohol Vinylacetat, Styrol, Aminostyrol, Chlorstyrol, Maleinsäure und Fumarsäure, die mit Bromcyanat behandelt wird und mit einem der Aminogruppeneinführung entsprechenden Abstandhalter eingeführt wird, und ein unlöslicher anorganischer Träger, der mit einer funktionellen Gruppe, wie einer Aminogruppe, in eine anorganische Verbindung, beispielsweise Silicium oder Aluminium, eingeführt wird. Der immobilisierte Träger kann auch ein Träger sein, der anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper durch physikalische Adsorption bindet.
- Der immobilisierte Träger ist vorzugsweise in einer aus Einzelteilen bestehenden Form, die leicht durch Filtration isoliert werden kann, beispielsweise Kügelchen mit einem Durchmesser von mehr als 1 mm, vorzugsweise mehr als 5 mm, oder in Spindelform, die der Bodenform eines Antigen-Antikörper-Reaktionsgefässes entspricht.
- Die Einführung einer reaktiven Gruppe in anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper unter Verwendung eines Abstandshalter-einführenden Reagens kann durch Einführung zusätzlicher funktioneller Gruppen, wie Aldehyd, Carboxyl, Amino oder Thiol, und Umsetzung mit mindestens einem Abstandshalter-einführenden Reagens, beispielsweise ein Dialdehyd, wie Succinaldehyd, Glutaraldehyd oder Adipoaldehyd, einem reaktiven Derivat, wie Säurechlorid, Succinimidester oder p-Nitrophenylester, der ω-Aminobuttersäure oder ω-Aminoglutaminsäure, einem reaktiven Derivat der Dicarbonsäuren, wie Malonsäure, Succinsäure, Glutarsäure oder Adipinsäure, Diaminen, wie Hexamethylendiamin oder Decamethylendiamin, reaktive Derivate der 3-(2'-Pyridyldithio) propionsäure oder 3-(2'-Benzothiazolyl-(dithio)-propionsäure, S-Acetylmercaptosuccinanhydrid, oder Thiole, wie 2-Aminoethanthiol, durchgeführt werden.
- Anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper können direkt oder über polyfunktionelle Reagentien mit reaktiven Gruppen im immobilisierten Träger kondensiert werden. Die Kondensation wird im allgemeinen bei 0 bis 40ºC in einer Pufferlösung mit pH 6,0 bis 8,5 oder einem organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch davon durchgeführt. Ferner wird ein zweiter Antikörper, der durch Immunisierung großer Säuger, die mit einer Immunoglobulinfraktion im Serum, das für die Antikörperherstellung von 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; verwendet wird, inokuliert wurden, erhalten wird, immobilisiert und ein anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper wird daran durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion zur Herstellung des immobilisierten Antikörpers gebunden.
- Die so erhaltenen immobilisierten Antikörper werden gewaschen und gelagert.
- Bei einer Analyse von 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; in einer Probe unter Verwendung von anti-1α (oder 24R),25- Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörpern in einer flüssigen, löslichen Phase wird eine bestimmte Menge des Iod-Radioisotop- markierten 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat der Formel [III] zuerst zu einer 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; enthaltenden Probe zugegeben und anschließend wird eine optimale Menge der anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper zur Bildung eines Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukts zugegeben.
- Der so gebildete markierte 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat-anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper-bindende Komplex, der 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper-bindende Komplex und das freie markierte 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;- Derivat werden unter Verwendung von spezifischen Antikörpern für anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörpern abgetrennt. Die spezifischen Antikörper werden nachstehend als zweite Antikörper bezeichnet. Die zweiten Antikörper können beispielsweise durch Inokulation einer normalen Immunoglobulinfraktion in das Serum eines Tieres, das zur Antikörperherstellung von 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D3 verwendet wird, als ein Antigen zur Immunisierung erhalten werden, wobei anschließend die zweiten Antikörper aus dem so erhaltenen Antiserum isoliert werden. Die zweiten Antikörper können, wenn nötig, durch ein bekanntes Verfahren gereinigt werden oder sie können vorzugsweise in Form eines Antiserums verwendet werden.
- Ein Analyseverfahren für 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin- D&sub3; in einer Probe unter Verwendung von anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxvvitamin-D&sub3;-Antikörpern und Iod-Radioisotop-markiertem 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat wird nachfolgend erläutert:
- 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; in einer Probe, wie ein bekanntes Serum, wird aus der Serumprobe extrahiert. Eine Probe, die ein Gemisch aus Serum und einer gleichen Menge von zugegebenem Lösungsmittel ist, wird gerührt, stehengelassen und zentrifugiert. Die abgetrennte überstehende Lösung wird mit Säulenchromatographie behandelt und eine 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; enthaltende Fraktion wird gesammelt und vorzugsweise durch HPLC gereinigt.
- Die 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Fraktion kann durch zuvor zugegebenes Tritium [³H]-markiertes 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; überprüft werden. Die 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Fraktion wird unter vermindertem Druck getrocknet, das Vakuum wird mit Argongas ausgeglichen und die Fraktion wird in Ethanol zur Herstellung einer Probe gelöst. Eine bestimmte Menge des Iod-Radioisotop-markierten 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivats wird zu der Probe zugegeben und die geeigneteste Menge an anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper wird hinzugegeben. Das Gemisch wird in einem Medium für Antigen-Antikörper, wie Phosphatpuffer oder Veronalpuffer, bei 4 bis 5ºC für etwa 15 bis 72 Stunden zur Förderung der kompetitiven Reaktion des Iod-Radioisotop-markierten Antigens und nicht-markierten Antigens mit den Antikörpern inkubiert. Der so gebildete Antigen-Antikörper-bindende Komplex, nämlich eine gebundene Form des Iod-Radioisotopmarkierten 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat- anti-1α (oder 24R),25 Dihydroxy-Vitamin-D&sub3;-Antikörpers (B), und eine nicht-umgesetzte freie Form des Iod-Radioisotop-markierten 1α (oder 24R),25-Dihydroxvvitamin-D&sub3;-Derivats (F) wird mit der Dextran-Aktivkohle (DC)-Methode durch Filtration oder durch Zentrifugation bei 3000 UpM für 15 Minuten getrennt. Nach der B-F-Trennung wird die Radioaktivität von jeweils B und F gemessen.
- Die Menge an 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; (H) in einer Probe wird durch Messung der Radioaktivität und Berechnung von B/(B+F) oder B/F bestimmt. Wenn die Menge an H erhöht wird, erniedrigt sich die Radioaktivität von B und die von F wird erhöht. Deshalb kann eine unbekannte Menge H durch Messung der Radioaktivität von B und F aus einer zuvor aufgezeichneten Standardkurve von bekannten Mengen bestimmt werden.
- Nach der B-F-Trennung, wenn die doppelte Antikörpertechnik mit Antikörpern in löslichem Zustand verwendet wird, werden zweite Antikörper, vorzugsweise Antikörper, die ein Antiserum IgG und, wenn nötig, ein normales Serum IgG der gleichen Art für die anti-1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;- Antikörperherstellung verwendeten Tierart enthalten, nach der kompetitiven Reaktion zugegeben und für 1 bis 12 Stunden inkubiert. Danach wird der gebildete bindende Komplex durch Zentrifugation bei 3000 UpM für 10 bis 30 Minuten zur Trennung des Niederschlags (B) und des Überstands (F) präzipitiert und anschließend wird die Radioaktivität von B oder F gemessen.
- Nach dem vorliegenden Analyseverfahren kann eine Standardkurve für 2 pg/Test bis 256 pg/Test hergestellt werden und eine schnelle Reaktionszeit von 16 Stunden bei 5ºC oder 1 Stunde bei 37ºC kann erreicht werden. Ferner ist die Handhabung nach der Reaktion sehr einfach. Darüberhinaus zeigen die Verdünnungs- und Wiedergewinnungstests unter Verwendung der Proben eine Linearität mit hoher Genauigkeit.
- Wenn die Antikörper durch bekanntes DBP ersetzt werden, kann es mit einem Iod[¹²&sup5;I]-Radioisotop-markierten 1α (oder 24R),25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat umgesetzt werden und eine Standardkurve für den Bereich von 1 bis 32 pg/Test kann hergestellt werden. Däs DPB kann aus dem Serum von Hühnern, Ratten, Mäusen, Hasen, Ziegen, Schafen, Rindern oder Menschen erhalten werden.
- Die nachfolgenden Beispiele erläutern weiter die vorliegende Erfindung.
- Ein Gemisch aus Serum (0,5 ml) und Acetonitril (0,5 ml) wurde in einem BORTEX-Mischgerät gerührt und anschließend für 30 Minuten stehengelassen. Die überstehende, durch Zentrifugation bei 3000 UpM für 10 Minuten erhaltene Lösung (0,8 ml) wurde auf eine Sept-pack C-18-Kartusche-Säule (Warenbezeichnung, MIILIPORE, Waters Corp.), die mit Ethanol aktiviert wurde, aufgetragen, mit 50% Acetonitril equilibriert und mit hydratisiertem Acetonitril eluiert. Die Säule wurde anschließend mit 50% Acetonitril (4 ml) gewaschen, danach mit 64% Acetonitril (4 ml) eluiert (eine Fraktion von 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;) und mit 73% Acetonitril (4 ml) eluiert (eine Fraktion von 25-Hydroxy Vitamin-D&sub3; und 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;). Die mit 64% Acetonitril eluierte Fraktion wurde unter vermindertem Druck getrocknet und mit Argongas zum Erhalt einer 1α,25- Dihydroxyvitamin-D&sub3; enthaltenden Fraktion gespült. Die so erhaltene Rohfraktion wurde in einem Gemisch (200 ul) von n-Hexan-Isopropanol (9:1) gelöst und durch HPLC über einer Zorbax-SIL (Dupont Inc.) 0,46 x 25 cm-Säule gereinigt. Die vorstehenden Fraktionen von 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; wurden durch zuvor zugegebenes Tritium [³H]-markiertes 1α,25- Dihydroxyvitamin-D&sub3; [26,27-Methyl-³H) überprüft. Die Fraktion von 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; (Rt = 9 bis 13 Minuten) wurde ünter vermindertem Druck getrocknet und mit Argongas gespült.
- Diese Fraktionen wurden in Ethanol gelöst und 10 ul davon wurden für eine Analyse verwendet.
- Die Wiedergewinnung von 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; betrug 95 ± 2% (n = 10).
- γ-Aminopropionsäure (β-Alanin, 178 mg, 2 mmol) wurde in einem Gemisch von Tetrahydrofuran (THF)-Dimethylformamid (DMF)-H&sub2;O (1:2:2) (25 ml) gelöstem N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyloxy)succinimid (674 mg, 2 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde auf eine Silicagelsäule (Wako-Gel C-200, 75 g) aufgetragen und getrennt und durch Elution mit CHCl&sub3;:Methanol = 9:1 zum Erhalt der vorstehenden Verbindung (538,8 mg) (Ausbeute: 86,5%) gereinigt.
- NMR. δ (DMSO-d6) ppm
- 2,50 - 2,60 (2H,t, -CH&sub2;-CO-)
- 3,28 - 3,35 (2H, m, -CH&sub2;-N-)
- 4,33 - 4,44 (3H, m, Fmoc)
- 7,35 - 8,06 (8H, m, Fmoc)
- Pivaloylchlorid (Trimethylacetylchlorid 3,07 ul, 0,025 mmol) und Dimethylaminopyridin (DMAP, 3,05 mg, 0,025 mmol) wurden zu in trockenem THF (2 ml) gelöster 3-(N-Fluorenylmethyloxycarbonyl)aminopropionsäure (Fmoc-β-Ala) (7,775 mg, 0,025 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde bei -15ºC für 15 Minuten umgesetzt. 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; (10,4 mg, 0,025 mmol) wurde hinzugegeben und das Gemisch wurde bei -15ºC für 5 Minuten und bei 0ºC für 1,5 Stunden umgesetzt. Methanol (0,5 ml) wurde zu dem Gemisch zugegeben und anschließend unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie [Wako-Gel C-200, 150 g, Entwickler:Ethylacetat-n-Hexan (4:1)] zum Erhalt der nachstehenden drei Fraktionen getrennt
- 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-bis-(β-Ala-Fmoc) [= 1α,25-Dihydroxyvitamin- D&sub3;-1α,3β-bis-[3-(N-fluorenylmethyloxycarbonyl)amino]propionat,
- Ausbeute: 19,1% (Rf: 0,59)
- Ein Gemisch aus 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β-O-β-Ala-Fmoc und 1α,25- (OH)&sub2;-D&sub3;-1α-O-β-O-Ala-Fmoc,
- Ausbeute: 20,3% (RF: 0,47)
- Ausgangsmaterial, 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;
- Ausbeute: 41,2% (Rf: 0,20)
- Fraktion 2 wurde mit HPLC (Zorbax-ODS; φ 0,46 x 25 cm, Entwicklerflüssigkeit: 10% H&sub2;O-Methanol; Elution: 1 ml/min) zur Trennung jeder Komponente behandelt.
- Die physikalischen Eigenschaften von jedem Produkt sind nachstehend aufgezeigt:
- HPLC Rt = 17,46 min
- NMR δ (CDCl&sub3;) ppm
- 0,55 (3H, s), 0,94 (3H, d), 1,22 (6H, s), 2,53 (2H, t), 3,44 3,48 (3H, m), 4,22 (1H, t), 4,37 4,41 (3H, m), 5,03 (1H, d), 5,27 5,30 (2H, m), 5,35 (1H, m), 6,01 (1H, d), 6,34 (1H, d) 7,29 7,77 (8H, m),
- EtOH
- UVλmax (nm) 300,5, 266,3 214,6
- HPLC Rt = 14,92 min
- NMR δ (CDCl&sub3;) ppm
- 0,50 (3H, s), 0,90 (3H, d), 1,20 (3H, s), 1,27 (3H, s), 4,04 4,05 (1H, m), 4,21 (1H, m), 4,41 4,46 (2H, m), 5,05 (1H, d), 5,27 (1H, t), 5,32 (1H, m), 5,50 (1H, t), 5,90 (1H, d), 6,30 (1H, d), 7,28 7,79 (8H, m),
- EtOH
- UV max (nm) 300,4 266,4 214,3
- NMR. δ (CDCl&sub3;) ppm
- 0,50 (3H, s), 0,90 (3H, d), 1,20 (3H, s), 1,26 (3H, s), 2,40 2,65 (4H, m), 3,30 3,55 (4H, m), 4,10 4,50 (6H, m), 5,05 5,60 (6H, m), 5,90 (1H, d), 6,32 (1H, d), 7,20 7,83 (16H, m),
- 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β-Ala-Fmoc (13,4 mg, 18,86 x 10&supmin;³ mmol) wurde in Ethanol (2,5 ml) gelöst. Morpholin (2,5 ml) wurde hinzugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter Argonatmosphäre gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck zum Erhalt eines Rohprodukts konzentriert und durch LH-20 (H&sub2;0, 10 ml, Warenbezeichnung) gereinigt und mit 20 bis 30 ml Wasser zur Entfernung von Morpholin gewaschen. Das Produkt wurde mit Methanol eluiert und das so eluierte Produkt wurde auf Amprep-NH&sub2; (Amarsham Corp. 500 mg, n-Hexan-Dichlormethan 1:1), das mit 30 ml n-Hexan-Dichlormethan (1:1) gewaschen wurde, aufgetragen und anschließend zum Erhalt der Verbindung mit Methanol eluiert.
- Ausbeute: 8,73 x 10&supmin;³ mmol (Ausbeute: 46,25%)
- UV λ E : 264,2 nm
- Ninhydrin-Färbung: positiv
- TLC (Silicagel, Merck 5715, Entwicklerflüssigkeit : Ethylacetat-Methanol = 1:4) Rf: 0,15
- Im vorstehenden Punkt (1) wurde 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β-O-β-Ala- Fmoc durch 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-1α-O-β-Ala-Fmoc zum Erhalt des gewünschten Produkts ersetzt.
- Ausbeute: 62,5%
- UV λ E 265,4 nm
- Ninhydrinfärbung: positiv
- TLC (Silicagel, Merk 5715, Ethylacetat-Methanol = 1:4): Rf: 0,25
- Das durch Entfernung von Fmoc erhaltene 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β- O-β-Ala (12,2 mg, 25,05 x 10&supmin;³ mmol) wurde in THF (1 ml) gelöst und wurde zu in Tris-Puffer (0,1 M, pH 8,6, 10 ml) bei 0 ºC mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (6,3 mg, 1,3 x 25,05 x 10&supmin;³ mmol) gelöstem BSA (M.W. 65.000, 32,6 mg, 1/50 x 25,05 x 10&supmin;³ mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0ºC für 3 Stunden umgesetzt. Chloroform (10 ml) wurden viermal zu dem Reaktionsgemisch zugegeben und nicht-umgesetztes 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β-O-β-Ala wurde entfernt. Die wäßrige Schicht wurde zum Erhalt des lyophilisierten Produkts (28,0 mg) gefriergetrocknet, das ein Komplex aus 18 Molekülen 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β-O-β-Ala gebunden über eine Aminogruppe bei Stellung-3 mit einem Molekül BSA war.
- Das in vorstehendem Punkt (1) erhaltene lyophilisierte 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-3β-[3-(BSA-amino)propionat] (Antigen) wurde in Tris-Puffer (0,1 M, pH 8,6) gelöst. Eine gleiche Menge C.F.A. wurde hinzugegeben und das Material wurde zu dessen Emulgierung gemischt, um 1 ug bis 100 ug/ml Antigen herzustellen. Die Emulsion wurde subkutan zehnmal alle zwei Wochen, 10 γ bis 200 γ/Kopf, in Hasen inokuliert. Während dieser Immunisierung wird der Titer der alle zehn Tage gesammelten Blutproben gemessen und bei einem maximalen Antikörpertiter wurde das Vollblut gesammelt. Die Blutproben wurden bei Raumtemperatur für 60 Minuten zur Coagulierung stehengelassen und wurden bei 3000 UpM für 10 Minuten zum Erhalt eines anti-1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Antikörper enthaltenden Antiserums zentrifugiert, das mit Ammoniumsulfat zur Gewinnung einer IgG-Fraktion fraktioniert wurde.
- Das im vorstehenden Punkt (1) erhaltene, in Phosphatpuffer, pH 7,2 (50 γ ) gelöste lyophilisierte 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-3β-[3-(BSA-amino)propionat] (Antigen) wurde zusammen mit C.F.A. subkutan in weibliche, vier Wochen alte Balb/c-Mäuse inokuliert. Nach 1 Woche wurden 50 γ davon subkutan inokuliert und nach 2 Wochen wurden 50 γ Antigen intraperitoneal inokuliert. Drei Tage nach der letzten Inokulation wurde die Milz der Mäuse sauber herausgeschnitten und durch ein Sieb zur Herstellung einer Milz-Zellsuspension zerkleinert. Die Zellfusion wurde unter Verwendung von Maus-Myelomazellen P3-X63-Ag8U1 mit einer herkömmlichen Methode durchgeführt. Eine wäßrige 30% PEG (M.W. 1.000)-Lösung wurde bei 37ºC inkubiert. Die vorstehenden Milzzellen und Myelomazellen (insgesamt 4 x 10&sup7; Zellen, 5:1) wurden in RPMI-Medium (5 ml) suspendiert und beide Zellarten wurden vorsichtig gemischt, bei 1.000 UpM für 10 Minuten zentrifugiert und anschließend wurde der Überstand unter vermindertem Druck filtriert. Das Teströhrchen wurde zum Mischen der Zellniederschläge vorsichtig geschüttelt, die PEG-Lösung (1,0 ml) wurde langsam zugegeben und das Gemisch wurde vorsichtig gerührt. Das Gemisch wurde bei 37ºC unter vorsichtigem Schütteln inkubiert, anschließend wurde die Fusionsreaktion durch langsame Zugabe eines herkömmlichen Mediums (10 ml) beendet und die Zellen wurden wieder suspendiert.
- Die Suspension wurde bei 1.000 UpM für 5 Minuten zentrifugiert. Der präzipitierte Zellniederschlag wurde durch vorsichtiges Schütteln dispergiert, langsam in HAT-Medium (5 ml) suspendiert und in ein Gefäß mit HAT-Medium (1 ml) überführt. Die Zellen wurden mikroskopisch beobachtet. Die Zellsuspension (jeweils 200 ul) wurde in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen pipettiert und in einem CO&sub2;-Inkubator wachsen gelassen. Die fusionierten Zellen wurden in HAT-Medium für die Clonierung durch einschränkende Verdünnungstechnik selektiert. Die erhaltene Clonsuspension wurde im Bauchfell von Pristan-behandelten Balb/c-Mäusen wachsen gelassen. Die IgG-Fraktion wurde mit einre herkömmlichen Methode aus Ascitesflüssigkeit und Serum gesammelt und durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein A-gebundener Sepharose CL-4B gereinigt. Die so erhaltene IgG-Unterklasse war IgG 1, die als monoclonale Antikörper verwendet wurde.
- Iod [¹²&sup5;I]-Bolton-Hunter-Reagens [NEN, NEX-120-10, 2200 Ci/mmol, 0,33 mCi/100 ul Benzol: 50 uCi], THF (75 ul) und Triethylamin (Et&sub3;N, 300 pmol) wurden zu einer Ethanollösung von in Beispiel 3 (1) erhaltenem 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β-O-β-Ala (72,8 nmol/25 ul EtOH) zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden unter Argonatmosphäre umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
- Radioaktivitätswiedergewinnung: 27,4 uCi (54,7%)
- Säule: Zorbax-ODS; φ 4,6 x 250 mm 5 um
- Elution: 15% H&sub2;O-Methanol, 1ml/min
- Rt: 13,5 bis 15,6 min
- Säule: Zorbax-SIL; φ 4,6 x 250 mm 5 um
- Elution: 20% Isopropanol-n-Hexan;
- 1 ml/min; Rt: 16 bis 22 min.
- Das in vorstehendem Punkt (1) aufgeführte 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;- 3β-O-β-Ala wurde durch 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-1α-O-β-Ala zum Erhalt des gewünschten Produkts ersetzt.
- Radioaktivitätsgewinnung: 30,2 uCi (60,4%)
- HPLC: Die gleichen Bedingungen wie unter vorstehendem Punkt :
- Rt: 14,2 bis 16,8 min
- Die gleichen Bedingungen wie unter vorstehendem Punkt :
- Rt: 13,6 bis 16,1 min
- Morpholin (2 ml) wurde zu einem Gemisch (8,4 mg x 10&supmin;³ mmol) aus in Ethanol (2 ml) gelöstem 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β-Ala- Fmoc und 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-1α-O-β-Ala-Fmoc bei Raumtemperatur zugegeben und bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter Argonatmosphäre umgesetzt. Das Reaktionslösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch LH-20 (H&sub2;O, 10 ml) (Pharmacia Corp.) wie in Beispiel 3 (1) gereinigt.
- Der Rückstand wurde weiter durch Amprep-NH&sub2; (Amersham Corp., 500 mg) wie in Beispiel 3 (1) gereinigt.
- Ausbeute: 5,13 x 10&supmin;³ mmol (43,4%) [Gemisch, enthaltend ca. 2,5:1 1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β-O-β-Ala und 1α,25- (OH)&sub2;-D&sub3;-1α-O-β-Ala
- Uv λ E 265,0 nm
- Ninhydrinfärbung: positiv
- TLC (Silicagel, Merck 5715, Ethylacetat-Methanol 1:4): Rf: 0,15 [1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β-O-β-Ala], 0,25 [1α,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-1α-O-β-Ala]
- Iod [¹²&sup5;I]-Bolton-Hunter-Reagens [NEN, NEX-120-10, 2200 Ci/mmol, 0,33 mCi/100 ul Benzol: 100 uCi], THF (30 ul) und Triethylamin (600 pmol) wurden zu einer Ethanollösung (205 nmol/100 ul Ethanol) des im vorstehenden Punkt (1) erhaltenen Gemisches zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden unter Argonatmosphäre umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
- Radioaktivitätsgewinnung: 50,7 uCi (50,7%)
- HPLC: die gleichen Bedingungen wie unter vorstehendem Punkt
- Rt: 13 bis 17 min
- die gleiche Bedingungen wie unter vorstehendem Punkt
- Rt: 13 bis 22 min
- Die 3β-markierte Verbindung und die 1α-markierte Verbindung wurden durch HPLC mit den unter Punkt aufgeführten Bedingungen getrennt und gereinigt.
- 1α-markierte Verbindung: Rt: 13,0 bis 15,6 min
- Radioaktivitätsgewinung: 16, 3 uCi
- 3β-markierte Verbindung: Rt: 16,0 bis 21,2 min
- Radioaktivitätsgewinnung: 34,5 uCi
- Das Verhältnis der Gewinnung der 1α- und 3β-Verbindung betrug: 1:2,1, das mit dem Verhältnis des Ausgangsmaterials (vor de-Fmoc) identisch war.
- Eine Standard-Ethanollösung von 1α,25-Dihydroxyvitämin-D&sub3; wurde stufenweise durch zweifache Verdünnung zur Herstellung von 1024 pg/20 ul-, 512 pg/20 ul-, 256 pg/20 ul-, 128 pg/20 l-, 64 pg/20 i£l- 32 pg/20 iLl-, 16 pg/20 ul-, 8 pg/20 ul- und 4 pg/20 ul- und O (für Bo) und 2048 pg/20 ul- (für NSB) Proben verdünnt.
- Die Proben (20 ul) jeder vorstehenden Konzentration wurden in zwei Röhrchen pipettiert. Die jeweils 20 ul-Ethanollösungen der Iod [125I]-Radioisotop-markierten Verbindung (3b-markierten Verbindung) wurden in jedes Röhrchen pipettiert (20 ul, ca. 12.000 cpm), mit Ausnahme der Proben Bo und NSB.
- Jeweils 1 ml mit Tris-Puffer pH 8,6 verdünntes anti-1α, 25- Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Schafserum wurde zu jedem Röhrchen zugegeben. Jedes Gemisch in den Röhrchen wurde bei 5ºC über Nacht für 16 bis 24 Stunden,inkubiert. Jeweils 200 ul eines Gemisches aus Dextran und Aktivkohle wurde in die Reaktionsröhrchen zugegeben. Die B-F-Trennung wurde durch Zentrifugation bei 5ºC für 30 Minuten durchgeführt und jede überstehende Lösung (1 ml) mit einem automatischen γ-Vertiefungszähler gemessen. Das Bindungsverhältnis wurde mit der folgenden Gleichung berechnet:
- worin (B) die ausgezählte Anzahl in jedem Röhrchen war, (NSB) die ausgezählte Anzahl war, die unter Verwendung von 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; (2048 pg/20 ul) anstelle von ¹²&sup5;I-markiertem 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat gemessen wurde, und (Bo) die ausgezählte Anzahl war, die unter Verwendung von 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; bei Null-Konzentration gemessen wurde. Fig. 1 zeigt die Standardkurve von [¹²&sup5;I]-markiertem 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat.
- Ein Gemisch aus Serum (0,5 ml) und Acetonitril (0,5 ml) wurde in einem BORTEX-Mischgerät gerührt und anschließend 30 Minuten stehengelassen. Die durch Zentrifugation bei 3000 UpM für 10 Minuten erhaltene überstehende Lösung (0,8 ml) wurde auf eine Sep-pack C-18-Cartouschensäule (Warenbezeichnung, MILLIPORE, Waters Corp.) aufgetragen, die mit Ethanol aktiviert und mit 50% Acetonitril equilibriert wurde, und mit hydratisiertem Acetonitril eluiert. Die Säule wurde weiter mit 50% Acetonitril (4 ml) gewaschen, anschließend mit 64% Acetonitril (4 ml) (eine Fraktion von 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;) eluiert und mit 73% Acetonitril (4 ml) (eine Fraktion von 25-Hydroxyvitamin-D&sub3; und 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;) eluiert. Die mit 73% Acetonitril eluierte Fraktion wurde unter vermindertem Druck getrocknet und mit Argongas zum Erhalt einer 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-enthaltenden Fraktion gespült. Die so erhaltene Rohfraktion wurde in einem Gemisch (200 ul) von n- Hexan-Isopropanol (9:1) gelöst und durch HPLC mit einer Zorbax-SIL (Dupont Inc.) 0,46 x 25 cm-Säule gereinigt. Die vorstehende Fraktion von 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; wurde durch zuvor zugegebenes Tritium [³H]-markiertes 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-[26,27-methyl-³H] überprüft. Die Fraktion von 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; (Rt = 5 bis 7 min) wurde unter vermindertem Druck getrocknet und mit Argongas gespült.
- Diese Fraktionen wurden in Ethanol (200 ml) gelöst und 20 ul davon wurden für eine Analyse verwendet.
- Die Gewinnung von 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; betrug 92% (n = 18).
- Pivaloylchlorid (4,62 ul, 1,5 x 0,025 mmol) und Dimethylaminopyridin (DMAP, 4,57 mg, 1,5 x 0,025 mmol) wurden zu in trockenem THF (2 ml) gelöster 3-(N-Fluorenylmethoxycarbonyl)aminopropionsäure [nachstehend als β-Ala-mFoc bezeichnet] (11,6 mg, 1,5 x 0,025 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde bei -10ºC unter Argonatmosphäre zur Herstellung eines gemischten Anhydrids von β-Ala-Fmoc und Pivaloylchlorid umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei -10ºC für etwa 10 Minuten gehalten, 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; (10,4 mg, 0,025 mmol) wurde hinzugegeben und das Gemisch wurde bei 0ºC für 30 Minuten und anschließend bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde nach Entfernung eines Niederschlags unter vermindertem Druck konzentriert und danach durch präparative Silicagel-TLC (Merck 57 17, 20 x 20 (H) cm, Ethylacetat-n-hexan = 2:1] gereinigt, um das Gemisch aus 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β-O-Ala-Fmoc und 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-24R-O-β-Ala-Fmoc, ein Ausgangsmaterial 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3; und 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-bis-[3-(N- fluorenylmethyloxycarbonyl)amino]propionat[nachstehend als 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-bis-(β-Ala-Fmoc) bezeichnet] zu erhalten.
- Ausbeute:
- 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β-O-β-Ala-Fmoc 43, 1%
- 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-24R-O-β-Ala-Fmoc 12,7%
- 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-bis(β-Ala-Fmoc) 33,5%
- wiedergewonnenes Ausgangsmaterial: 24R,25-(OH)&sub2;- D&sub3; 10,8%
- Physikalische Eigenschaften:
- 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β-Ala-Fmoc:
- NMRδ(CDCl&sub3;) ppm
- 0,55 (3H, s), 0,94 (3H, d), 1,17 (3H, s), 1,21 (3H, s) , 2,17 2,24 (1H, m), 2,35 2,42 (2H, m), 2,53 2,60 (3H, m), 2,77 2,81 (1H, m), 3,31 3,35 (1H, m), 3,44 3,49 (2H, m), 4,19 4,38 (3H, m), 4,85 (1H, d), 4,98 5,02 (1H, m), 5,07 (1H, m), 5,27 5,30 (1H, b), 6,03 (1H, d), 6,21 (1H, d), 7,29 7,77 (8H, m)
- UV λ H (nm) 299,7, 265,2
- HPLC:
- Zorbax-SIL 5% Isopropanol-n-Hexan, 2 ml/min
- Rt: 14,0 min
- Zorbax-ODS 10% H&sub2;O (CH&sub3;CN - Methanol = 1:1), 2 ml/min Rt: 8,4 min
- 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-24R-O-β-Ala-Fmoc:
- NMRδ (CDCl&sub3;) ppm
- 0,52 (3H, s), 0,92 (3H, d), 1,19 (3H, s), 1,21 (3H, s), 2,15 2,17 (1H, m), 2,25 2,28 (1H, m), 2,30 2,38 (1H, m), 2,55 2,61 (3H, m), 2,79 2,83 (1H, m), 3,48 3,56 (2H, m), 3,93 3,95 (1H, m), 4,20 4,39 (3H, m), 4,80 (1H, d), 4,82 4,85 (1H, m), 5,02 (1H, m), 5,49 (1H, b), 6,01 (1H, d), 6,22 (1H, d), 7,29 7,77 (8H, m)
- UV λ H (nm) 299,6, 265,3
- HPLC;
- die gleichen Bedingungen wie vorstehend unter ,
- Rt: 18,4 min
- die gleichen Bedingungen wie vorstehend unter ,
- Rt: 6,5 min
- 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-bis-(β-Ala-Fmoc):
- NMRδ (CDCl&sub3;) ppm
- 0,52 (3H, s), 0,92 (3H, d), 1,19 (3H, s), 1,21 (3H, s), 2,17 2,22 (1H, m), 2,35 2,41 (2H, m), 2,53 2,61 (5H, m), 2,75 2,78 (1H, m), 3,44 3,57 (4H, m), 4,18 4,39 (6H, m), 4,83 4,85 (2H, m), 4,98 5,01 (1H, m), 5,04 (1H, m), 5,28 5,30 (1H, b), 5,48 5,51 (1H, b), 6,00 (1H, d), 6,20 (1H, d), 7,29 7,77 (16H, m)
- Das in Beispiel 7 erhaltene 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β-O-β-Ala-Fmoc (2,4 mg, 3,38 x 10&supmin;³ mmol) wurde in Ethanol (1 ml) gelöst. Morpholin (1 ml) wurde hinzugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck konzentriert und durch LH-20 (H&sub2;O 8 ml, Warenbezeichnung) gereinigt und mit gereinigtem Wasser (30 ml) zur Entfernung von Morpholin gewaschen. Das Produkt wurde mit Methanol eluiert und das so eluierte Produkt wurde konzentriert und auf Amprep-NH&sub2; (Amersham Corp., 500 mg, n-Hexan-Dichlormethan 1:1) ausgetragen, das mit 20 ml n-Hexan-Dichlormethan (1:1) gewaschen wurde, und anschließend mit Ethanol zum Erhalt der Verbindung eluiert.
- Ausbeute: 25,4%
- UV λ H : 264,6 nm
- Ninhydrinfärbung: positiv
- Das im vorstehenden Punkt (1) aufgeführte 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3;- 3β-O-β-Ala-Fmoc wurde durch 24R,25-OH)&sub2;-D&sub3;-24R-O-β-Ala- Fmoc zum Erhalt des gewünschten Produkts ersetzt.
- Ausbeute: 40%
- UV λ H 265,4 nm
- Ninhydrinfärbung: positiv
- Iod [¹²&sup5;I]-Bolton-Hunter-Reagens [NEN, NEX-120-10, 2200 Ci/mmol] (50 uCi/30 pM/15, ul Benzol), THF (20 ul) und Triethylamin (300 pmol) wurden zu einer Ethanollösung von in Beispiel 8(1) erhaltenem 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-3β-O-β-Ala (66,35 nmol/100 ul EtOH) zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden und unter Argonatmosphäre in Dunkelheit umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
- HPLC:
- Zorbax-ODS; 15% H&sub2;O-Methanol, 1 ml/min
- Rt: 12,0 bis 13,3 Minuten
- Zorbax-SIL; 20% Isopropanol-n-Hexan, 1ml/min.
- Rt: 12,6 bis 17,2 Minuten
- Radioaktivitätsgewinnung: 29,9 MCi (59,7%)
- Das in vorstehendem Punkt (1) aufgeführte 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3;- 3β-O-β-Ala wurde durch in Beispiel 8(2) erhaltenem 24R,25- (OH)&sub2;-D&sub3;-24R-O-β-Ala zum Erhalt des Produkts ersetzt.
- HPLC:
- Die gleichen wie unter vorstehendem Punkt aufgeführten Bedingungen:
- Rt: 9,9 bis 11,3 Minuten
- Die gleichen wie unter vorstehendem Punkt aufgeführten Bedingungen:
- Rt: 11,3 bis 14,8 Minuten
- Radioaktivitätsgewinnung: 53,9% Beispiel 10: Herstellung einer Standardkurve von 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3; unter Verwendung von Iod [¹²&sup5;I]-Radioisotop-markiertem 24R,25- (OH)&sub2;-D&sub3;:
- Eine Standard-Ethanollösung von 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3; (1,024 pg/20 ul) wurde stufenweise durch zweifache Verdünnung zur Herstellung von 128 pg/20 ul, 64 pg/20 ul, 32 pg/20 ul, 16 pg/20 ul, 8 pg/20 ul, 4 pg/20 ul, 2 pg/20 ul und 0 pg/20 ul verdünnt.
- Die Proben (20 ul) jeder vorstehend aufgeführten Konzentration wurden in zwei Röhrchen pipettiert. Jeweils 20 ul Aliquote einer Ethanollösung des Iod [¹²&sup5;I]-Radioisotop-markierten 24R,25-(OH)&sub2;-D&sub3;-Derivats, das Tocopherol als Antioxidationsmittel enthielt, wurden in jedes Röhrchen (20 ul, ca. 13.000 cpm) pipettiert. Jeweils 1 ml mit Tris-Puffer, pH 8,6, verdünntes DBP wurde gerührt und bei 5ºC über Nacht (20 bis 24 Stunden) stehengelassen.
- Eine Lösung aus Dextran und Aktivkohle (200 ul) wurde in die Reaktionsröhrchen zugegeben, gerührt und bei 5ºC für 30 Minuten unter Rühren bei 15minütigen Intervallen inkubiert. Die B-F-Trennung wurde durch Zentrifugation bei 3000 UpM für 15 Minuten ausgeführt und jede überstehende Lösung (1 ml) wurde mit einem automatischen γ-Vertiefungszähler gemessen. Die Standardkurve wurde durch Auftragen einer in jedem Röhrchen erhaltenen Durchschnittsanzahl hergestellt. Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt.
- Die vorliegende Erfindung stellt Radioisotop-markierte 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivate mit hoher Strahlungsenergie und breiter Anwendbarkeit, verglichen mit der niedrigen Strahlungsenergie des β-Strahlen-emittierenden Tritium [³H]-markierten Vitamin-D&sub3;, bereit. Es könnte angeführt werden, daß die hohe Strahlungsenergie des Radioisotops Iod (¹²&sup5;I] oder Phosphor [³²P]vitamin-D&sub3; aufgrund der Reaktion mit der konjugierten Doppelbindung in der Vitamin-D-Struktur selbst abbauen würde, aber das [¹²&sup5;I]- markierte 1α (oder 24R), 25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivat der vorliegenden Erfindung wird tatsächlich nicht durch γ- Strahlen selbst abgebaut und ist völlig stabil für die Verwendung in einem Radioimmunotest.
- Im allgemeinen wird Vitamin-D&sub3; in vivo in der Leber oder Niere metabolisiert und zu aktiviertem Vitamin-D&sub3; umgewandelt. Das aktivierte Vitamin-D&sub3;, wie 25-Hydroxyvitamin-D&sub3;, 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;, 1α,-Hydroxyvitamin-D&sub3; und 1α,24- Dihydroxyvitamin-D&sub3; wird klinisch für die Therapie von Osteoporose und Osteomalazie verwendet. Die klinische Dosis davon ist aufgrund seiner starken physiologischen Wirkung sehr gering. Die pharmakologische Aktivität ist mit dem Blutgehalt und Gewebegehalt des Arzneistoffes korreliert und deshalb ist die Messung des Blutgehalts des bei Menschen verabreichten Arzneistoffes aus klinischem Gesichtspunkt wichtig. Unter Beachtung der vorstehenden Ausführungen ist die vorliegende Erfindung für die Analyse von aktiviertem Vitamin-D&sub3; in klinischen Tests nützlich.
- Die beigefügten Zeichnungen zeigen:
- Figur 1 ist die Standardkurve von 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3; unter Verwendung eines [¹²&sup5;I]-markierten 1α,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivats; und
- Figur 2 ist die Standardkurve von 24R,25-Dihydroxyvitamin- D&sub3; unter Verwendung eines [¹²&sup5;I]-markierten 24R,25-Dihydroxyvitamin-D&sub3;-Derivats.
Claims (8)
1. 1α- oder
24R,25-Dihydroxy-Vitamin-D3-Aminosaurederivat der Formel (I):
worin:
R&sub1; OH oder -O-CO-A-NH&sub2; bedeutet,
R&sub2; H, OH oder -O-CO-A-NH&sub2; bedeutet, und
R&sub3; H, OH oder -O-CO-A-NH&sub2; bedeutet,
wobei A einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylenrest bedeutet, mit der Maßgabe,
daß:
(1) einer der Reste R&sub2; und R&sub3; H bedeutet und der andere
OH oder -O-CO-A-NH&sub2; bedeutet,
(2) einer der Reste R&sub1; und R&sub2; OH bedeutet und der andere
-O-CO-A-NH&sub2; bedeutet oder
(3) einer der Reste R&sub1; und R&sub3; OH bedeutet und der andere
-O-CO-A-NH&sub2; bedeutet.
2. Verfahren zur Herstellung eines
Vitamin-D3-Aminosäurederivates mit der in Anspruch 1 definierten Formel (I), das
die Entfernung einer Aminoschutzgruppe von einem Vitamin-D3-
Derivat der Formel (II):
worin:
R&sub1;&sub1; OH oder -O-CO-A-NH-R&sub4; bedeutet,
R&sub2;&sub1; H, OH oder -O-CO-A-NH-R&sub4; bedeutet, und
R&sub3;&sub1; H, OH oder -O-CO-A-NH-R&sub4; bedeutet,
wobei A einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylenrest bedeutet und R&sub4; eine
Aminoschutzgruppe bedeutet, mit der Maßgabe, daß:
(1) einer der Reste R&sub2;&sub1; und R&sub3;&sub1; H bedeutet und der andere
OH oder -O-CO-A-NH-R&sub4; bedeutet,
(2) einer der Reste R&sub1;&sub1; und R&sub2;&sub1; OH bedeutet und der
andere -O-CO-A-NH-R&sub4; bedeutet oder
(3) einer der Reste R&sub1;&sub1; und R&sub3;&sub1; OH bedeutet und der
andere -O-CO-A-NH-R&sub4; bedeutet,
in Gegenwart einer Base und eines inerten Lösungsmittels
umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin R&sub4; eine
9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Gruppe bedeutet.
4. Iod-Radioisotop-markiertes 1α- oder 24R,25-Dihydroxy-
Vitamin-D3-Derivat der Formel (III):
worin:
R&sub1;&sub2; OH oder -O-CO-A-NH-R&sub5; bedeutet,
R&sub2;&sub2; H, OH oder -O-CO-A-NH-R&sub5; bedeutet, und
R&sub3;&sub2; H, OH oder -O-CO-A-NH-R&sub5; bedeutet,
wobei A einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylenrest bedeutet und R&sub5; eine
Iod-Radioisotop-enthaltende Gruppe bedeutet, mit der Maßgabe, daß:
(1) einer der Reste R&sub2;&sub2; und R&sub3;&sub2; H bedeutet und der andere
OH oder -O-CO-A-NH-R&sub5; bedeutet,
(2) einer der Reste R&sub1;&sub2; und R&sub2;&sub2; OH bedeutet und der
andere O-CO-A-NH-R&sub5; bedeutet oder
(3) einer der Reste R&sub1;&sub2; und R&sub3;&sub2; OH bedeutet und der
andere -O-CO-A-NH-R&sub5; bedeutet.
5. Vitamin-D3-Derivat nach Anspruch 4, worin das
Iod-Radioisotop ¹²&sup5;I bedeutet.
6. Vitamin-D3-Derivat nach Anspruch 5, worin die
Iod-Radioisotop-enthaltende Gruppe eine 3-(4-Hydroxy-3-iodo(¹²&sup5;I)-
phenyl)propionyl- oder eine
3-(3,5-Diiodo(¹²&sup5;I)-4-hydroxyphenyl)propionyl-Gruppe bedeutet.
7. Analyseverfahren für 1α- oder 24R,25-Dihydroxy-
Vitamin-D3 in einer Probe, umfassend:
die Zugabe eines nach einem der Ansprüche 4 bis 6
definierten Iod-Radioisotop-markierten 1α- oder 24R,25-Dihydroxy-
Vitamin-D3-Derivats zu einer zu analysierendes 1α- oder
24R,25-Dihydroxy-Vitamin-D3 enthaltenden Probe,
die Zugabe von anti-1α- oder -24R,25-Dihydroxy-Vitamin-
D3-Antikörpern oder eines Vitamin-D3 bindenden Proteins zu dem
so gebildeten Gemisch, um an 1α- oder 24R,25-Dihydroxy-
Vitamin-D3 und an das Iod-Radioisotop-markierte 1α- oder
24R,25-Dihydroxy-Vitamin-D3-Derivat kompetitiv zu binden,
die Abtrennung des so hergestellten
Iod-Radioisotop-markiertes 1α- oder
24R,25-Dihydroxy-Vitamin-D3-Derivat-anti-1α- -oder -24R,25-Dihydroxy-Vitamin-D3-Antikörperkomplexes oder des
Iod-Radioisotop-markiertes 1α- oder 24R,25-Dihydroxy-Vitamin-
D3-Derivat-DBP-Komplexes von dem Iod-Radioisotop-markierten
1α- oder 24R,25-Dihydroxy-Vitamin-D3-Derivat, und
die Messung der Menge der Iod-Radioisotopenmarkierung in
gebundener oder freier Form.
8. Verfahren zur Herstellung eines nach einem der
Ansprüche 4 bis 6 definierten Iod-Radioisotop-markierten
1α- -oder 24R,25-Dihydroxy-Vitamin-D3-Derivats, worin ein nach
Anspruch 1 definiertes 1α- oder
24R,25-Dihydroxy-Vitamin-D3-Derivat mit einer Verbindung der Formel (VII):
R&sub5;-X
wobei R&sub5; in Anspruch 4 definiert ist und X eine Succinimidyl-
N-oxy-, Phthalimidyl-N-oxy-, 5-Norbornen-2,3-dicarboximidyl-N-
oxy- oder Maleimidyl-N-oxy-Gruppe bedeutet, umgesetzt wird.
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