JPH02101060A - 新規な２４ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンｄ↓３誘導体及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ３アミノ酸誘導体を合成し、それをハブテンとして担
体蛋白質と結合させて免疫することにより得た抗体と、
ヨードの放射性同位元素で標識された新規なヨードの放
射性同位元素標識２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ３誘導体を用いて、被験液中の活性型である２４Ｒ，
２５−ジヒドロキシビタミンＤ３量を定量することに関
する。

〔従来の技術〕

従来、２４Ｒ，２５−ヒドロキシビタミンＤ３の定量法
として、コンペティティブプロテインパインディングア
ッセイ法（ＣＰＢＡ法）並びにＨＰＬＣ−ＵＶ法が報告
されている。ＣＰＢＡ法における標識化合物としては通
常トリチウム〔３Ｈ〕標識化合物が用いられている。一
方、ＣＰＢＡ法において用いられるビタミンＤバインデ
ィングプロティン（ＤＢＰ）は、一般にはビタミンＤ欠
乏飼料飼育ラットの血漿を用いることが知られている。

〔ビタミン第５５巻、１２号（１２月）、第５９５頁〜
６０５頁（１９８１、）、ｐｈａｒｍａ　　Ｍｅｄｉｃ
ａ　　Ｖｏｌ、Ｎｏ、１　８９〜９６（１９８５）、ホ
ルモンと臨床　Ｖｏｌ、３３Ｎｏ、１０　　９１５〜９
２４　　（１９８５））　　。

〔発明が解決しようとする課題〕

被験液中の２４Ｒ，２５−ビタミンＤ３の定量において
、前述のＨＰＬＣ−ＵＶ法は定量精度に難点があり、Ｃ
ＰＢＡ法が主流となっている。しかし、このＣＰＢＡ法
に用いられるトリチウム〔３旧標識化合物は、放射エネ
ルギーが３２ｐや１！５Ｉと比較して極めて低く、その
ためにトリチウム〔３Ｈ〕標識化合物を用いた定量法は
、液体シンチレーションカウンター等による検出装置を
必要とするため、高価であり且つ測定操作が煩雑であっ
た。そのため高感度でより簡便な測定法が望まれていた
。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、前述の問題点に鑑み鋭意研究の結果、高
放射線エネルギーを有し、汎用性において優れている放
射性ヨードで標識された２４Ｒ２２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ３誘導体を開発した。従来、単位時間当りの放射
エネルギーの低いβ線放出核種であるトリチウム〔３Ｈ
〕による種々のビタミンＤ３標識化合物が存在した。し
かし、トリチウムＣ″Ｈ）と同様にラジオイムノアッセ
イに汎用される放射エネルギーの高いγ線放出核種のヨ
ード〔１２５Ｉ〕やリン（ｌａｐ）で標識されたビタミ
ンＤ、誘導体は、ビタミンＤの特徴である共役トリエン
構造の不安定さゆえ、ラジカル反応を誘発し自己分解を
起こすと考えられ、現在まで報告されていない。

しかるに、本発明者らが開発したヨード〔１２５Ｉ〕で
標識された２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘
導体は、γ線による構造的分解を起こすことなく安定で
あり、ラジオイムノアッセイに利用し得るものであるこ
とを見出した。

一般に低分子化合物の放射性ヨード標識法としては、直
接標識法（クロラミン−Ｔ法）と間接標識法（ポルトン
−ハンター試薬等による方がある（Ａｍｅｒｓｈａｍ；
アマシャームノートＩＮ。

ｖ、１９８１）。しかし、ビタミンＤ類は酸、酸素、酸
化剤、熱、光に対して非常に不安定であるため、緩和な
反応条件で進行する間接標識法を用いることが最も好ま
しい。間接標識法を実施するにあたり、まず、側鎖末端
にアミノ基を有する新規な２４Ｒ，２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ３アミノ酸誘導体を合成した。さらに、該誘
導体をハプテンとして担体蛋白質と結合せしめ、これを
動物に接種して抗体を得た。また同誘導体にヨードの放
射性同意元素標識を行った。さらに、得られた抗体とヨ
ードの放射性同意元素標識化合物を用いてラジオイミノ
アッセイの測定系を確立するに到り、被検液中の２５−
ヒドロキシビタミンＤ３の定量に際して、該測定系を用
いるアッセイ法が高感度かつ簡便な極めて有用性に冨む
定量法であることを見出した。

また、従来行われているＤＢＰを用いたＣＰＢＡ法によ
っても本発明のヨード放射性同意元素標識化合物を用い
て高感度に２５−ヒドロキシビタミンＤ３を定量測定で
きることを見出した。

即ち本発明は、上記の知見に基づいて完成されたもので
あって、式（Ｉ） （式中、Ｒ＋、　Ｒ２は何れか一方が水酸基で他方がＯ
Ｃｏ　　Ｒ３ＮＨ２を示し、Ｒ３は炭素数１〜１０のア
ルキレン基を示す）で表される新規な２４Ｒ，２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘導体 および式（ＴＩ） （式中、Ｒｔ、Ｒｔは何れか一方が水酸基で他方が−Ｏ
Ｃｏ　　Ｒ，ｌ　ＮＨＲ４を示し、Ｒ１は炭素数１〜１
０のアルキレン基、Ｒ６はアミノ保護基を示す）で表さ
れる新規な２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘
導体を、塩基存在の不活性溶媒中でアミノ保護基を脱離
せしめることを特徴とする、式（１）で表される新規な
２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘導
体の製造法であり、式（ＩＩＩ　） （式中、Ｒｔ、Ｒｔは何れか一方が水酸基で他方が−〇
−Ｃｏ　　Ｒｐ　　ＮＨＲｓを示し、Ｒ３ば炭素数１〜
１０のアルキレン基、Ｒ１はヨードの放射性同位元素を
有する残基を示す）で表されるヨードの放射性同位元素
標ｍ２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、誘導体で
ある。また、被検液に式（ＩＩＩ　）で表されるヨード
の放射性同位元素標識２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ３誘導体と２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ３抗体またはビタミンＤバインディングプロティン（
ＤＢＰ）と反応せしめて生成する該ヨードの放射性同位
元素標識２４Ｒ１２５−ジヒドロキシビタミンＤ、誘導
体−２４Ｒ１２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体結合
体または該ヨードの放射性同位元素標識２４Ｒ，２５−
ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体−ビタミンＤバインデ
ィングプロティン結合体と未反応酸ヨードの放射性同位
元素標識２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導
体と分離し、次いで分離したいずれか一方の放射性同位
元素である標識ヨードの量を定量することを特徴とする
該被験液中の２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
の定量法を提供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

まず、式（１）で表される２４Ｒ，２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ３アミノ酸誘導体は、アミノ酸を２４Ｒ，２
５−ジヒドロキシビタミンＤ３の３位炭素のβ水酸基を
介して共有結合せしめて得られるもので、式ＣＩ）のＲ
８は炭素数１〜１０のアルキレン基である。また、この
式（１）で表される２４Ｒ，２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ３アミノ酸誘導体は、後述の２４Ｒ，２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ３抗体作製時のハプテンの誘導体として
も用いられ、ハプテンの誘導体として担体蛋白質と結合
させる際の架橋基の鎖長は、炭素数にして１〜１０個が
好ましく、特に好ましくは２〜６個が挙げられることか
ら、Ｒ，は直鎖状炭素数２〜６個からなるアルキレン基
であることが特に好ましい。

式〔■〕で示す２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
３アミノ酸誘導体は、２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ３にアミノ基が保護されたアミノ酸を反応せしめ
、式（ＩＩ）で表される２４Ｒ５２５−ジヒドロキシビ
タミンＤ３誘導体を得、該誘導体（ＩＩ）からアミノ保
護基を脱離せしめることにより得られる。

まずアミノ基を保護するために使用する原料アミノ酸と
しては、下記の式（ＴＶ） ＨＯＯＣＲ３ＮＨ２（ＩＶ） （式中、Ｒ３は前記と同じ基を示す）で表されるもので
あり、Ｒ３で示されるアルキレン基は炭素数ｎ−１，グ
リシン、ｎ−２，β−アラニン、ｎ−３ｎ＝４、δ−ア
ミノペンタン酸、ｎ−５゜ε−アミノ−ｎ−カプロン酸
、ｎ＝６．７−アミノへブタン酸、さらにｎ＝１０．１
１−アミノウンデシル酸であって、アミノ酸中の炭素構
造は好ましくは直鎖状であり、炭素数２〜６個のアルキ
レン基を有するものが好ましいが、本発明の技術思想か
らすれば、δ−アミノ−レブリン酸、グリシルグリシン
やδ−アミノ酸であるＤおよび／またはＬ体のリジン等
を用いることもできる。さらに、側鎖中に水酸基を有す
るアミノ酸、例えば４−アミノ−３ヒドロキシブチリン
クアシド等でも水酸基を保護することによって同様に用
いることができる。

また、アミノ酸のアミノ保護基としては、アミノ保護基
の脱離操作に際して、苛酷な脱離条件を要する場合には
ビタミンＤ類自体が分解されることもあり得ることから
、弱塩基条件下で緩和に短時間で脱離できるものであれ
ばよく、例えば、９−フルオレニルメチルオキシカルポ
ニル基〔以下、Ｆｍｏｃと略すことがある）、９−（２
−スルホ）フルオレニルメチルオキシカルボニル基、１
１−ジメチル−２−シアノエチルオキシカルボニル基、
５−ヘンズイソキサゾリルメチルオキシカルボニル基等
が挙げられるが、特に好ましくは容易にアミノ酸のアミ
ノ基を保護することができる９−フルオレニルメチルオ
キシカルボニル基が、アミノ基の保護基として良い。ア
ミノ基を保護したアミノ酸を得るに当たっては、上述の
アミノ保護基を有する活性誘導体として、例えばＦｍ。

Ｃをもつ活性エステルである、Ｎ−（９−フルオレニル
メチルオキシカルボニルオキシ）サクシニミドが挙げら
れ、その他にも、９−フルオレニルメチルクロロホルメ
ートを用いることができる。

またアミノ基の保護を行うに際しては、該活性誘導体と
目的のアミノ酸を公知の方法（Ｌ、＾、　Ｃａｒｐｉｎ
ｏ　ａｎｄ　Ｇ、　Ｙ、　ｌ１ａｎ　Ｊ、　Ｏｒｇ、　
Ｃｈｅｍ１３７　＋　３４０４　（１９７２）　）にて
反応せしめＦｍｏｃ−アミノ酸を得ればよい。

さらにアミノ基を保護したアミノ酸としてＦｍ０Ｃ−ア
ミノ酸を用いて式（ＩＩ）の２４Ｒ，２５ジヒドロキシ
ビタミンＤ３アミノ酸誘導体を得るための方法を例にと
ると、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を２４Ｒ，２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ３の２４Ｒ位炭素の水酸基又は３位炭素の
β水酸基を介して共有結合せしめるに当り、２４Ｒ，２
５−ジヒドロキシビタミンＤ３１当量に対してＦｍｏｃ
−アミノ酸またはその酸無水物、酸ハライドまたは活性
エステル等の通常使用されるカルボキシル基反応性誘導
体を１当量用いることにより式〔■〕で表される化合物
が得られる。より好ましくは、Ｆｍｏｃ−アミノ酸１当
量と”他の酸”１当量からなる混合酸無水物を、不活性
ガス霊気下、塩基存在の無水溶媒中で反応せしめる。該
混合酸無水物を用いて２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ３と反応せしめるのは、２４Ｒ，２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ３の炭素２５位の水酸基にＦｍｏｃ−ア
ミノ酸が結合した副生成物を生成させないためであり、
該混合酸無水物を調製するに当リ”他の酸”としては、
吉草酸、ピバリン酸、イソブチロキシカルボニルが用い
られ、特にピバリン酸が好ましい。２４Ｒ，２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ３とＦｍｏｃ−アミノ酸との反応に
おいて、無水溶媒としてはテトラヒドロフラン、ジオキ
サン等の無水有機溶媒が好ましい。また、塩基としては
、特にジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）およびピペ
リジノピリジン（ＰＰＹ）が好ましい。これは、立体障
害のある２級アルコール、３級アルコールのエステル化
に有用である。不活性ガスとしては、アルゴンおよび窒
素ガスが好ましい。また、反応に当たり、反応温度は０
〜２０℃、反応時間は１〜３時間が好ましい。このよう
にして得られた式（ＩＩ）で表される２４Ｒ，２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ３誘導体は、２４Ｒ１２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ３の２４Ｒ位または３β位に下記の
式（Ｖ） −Ｏ−ＱＣ−Ｒ３−ＮＨ−Ｒ４（Ｖ） （式中、Ｒ，ｌ、Ｒ，は前記と同じ基を示す）で表され
る残基が共有結合した化合物の混合物であり、必要に応
じてＨＰＬＣ等により分離、精製するこができる。

さらに式［Ｉ［）で表される該２４Ｒ，２５一ジヒドロ
キシビタミンＤ３誘導体を、塩基存在の不活性溶媒中で
アミノ保護基の脱離操作（脱Ｆ　ｍ　。

Ｃ化）により、式（１）で表される２４Ｒ，２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘導体とする。この保護
基の脱離操作を行うに当たり、用いられる塩基としては
、ピペリジン、モルホリン、エタノールアミン等があり
、特にモルホリンが好ましく、不活性溶媒としては、エ
タノール、メタノールが良く、特に無水エタノール、無
水メタノールが好ましい。また反応は不活性ガス霊気下
、遮光状態で行ない、反応温度は０〜２０℃、反応時間
は１〜３時間が好ましい。式（ＩＩ）で表される２４Ｒ
，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体からして２４
Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の２４Ｒ位または
３β位に式〔Ｖ〕で表される残基が共有結合した化合物
の混合物を使用した時には、必要に応じてＨＰＬＣ等に
より対応して生成する式（１）で表される２種の化合物
を単離生成すればよい。また前工程にて単離生成した１
種の式（ＩＴ）で表される化合物を使用した時には、必
要に応じてカラムクロマトグラフィー、ＴＬＣ等の精製
手段を用いて精製してもよい。

また前述の合成工程において副生ずる２４Ｒ２２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ３の２４Ｒ位およびβ位に式（Ｖ
）で表される残基が共有結合した化合物は、希アルカリ
水溶液で加水分解処理することにより原料の２４Ｒ，２
５−ジヒドロキシビタミンＤ３とすることができる。さ
らに前述の副生する化合物をモルホリン処理することに
より式、Ｒ３は前記と同じ基を示す）で表される化合物
が得られ、ハプテン化合物として利用することもできる
。

次いで、式（ＩＩＩ）で表されるヨードの放射性同位元
素標識２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、誘導体
について述べる。Ｒ３については上述の式（１）におい
て説明したＲ８と同意味を示し、Ｒ６はヨードの放射性
同位元素を有する残基であり、用いられるヨードの放射
性同位元素としては、１２５１や＋３１　■などが用い
られるが、好ましくは半減期の比較的長い１２５■が良
い。ヨード〔１２５１３の放射性同位元素を有する残基
としては、３−　（４−ヒドロキシ−３−ヨード（＋２
５　ｒ　）フェニル）プロピオニル基、３−　（３，５
−’；ヨーｌ’　（”Ｉ〕−４−ヒドロキシフェニル）
プロピオニル基、２−（４−ヒドロキシ−３−ヨード（
１２５Ｔ）フェニル）アセチル基、２−　（３，５−ジ
ヨード（Ｉｔｓ　１　）　−４−ヒドロキシフェニル）
アセチル基、２−ヨード（Ｉｔｓ　Ｉ）アセチル基、４
−ヨード（＋２５１　）−ベンゾキシメチルカルボニル
基、Ｎ−置換−３−ヨード（Ｉｔｓ　Ｊ　）チロシン残
基などが挙げられる。特に３−（４−ヒドロキシ−３−
ヨード（１２５■）フェニル）プロピオニル基および３
−　（３，５−ショート（ＩＺ５１〕−４−ヒドロキシ
フェニル）プロピオニル基が好ましい。

ヨードの放射性同位元素標ｍ２４Ｒ，２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ３誘導体の製造においては、式（１）で表
される２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３アミノ
酸誘導体に、間接標識法（例えば、ポルトン−ハンター
試薬による方法）により放射性ヨードで標識せしめるこ
とにより、式（Ｉｌｒ）で表されるヨードの放射性同位
元素標識２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、誘導
体を得る。ここでいう間接標識法とは、ヨードの放射性
同位元素を有する残基を構成成分とする後記の反応性誘
導体ＣＶＩＩ　）と、２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ３アミノ酸誘導体を反応せしめ、放射性コードを
標識せしめた式（Ｉ［［）で表されるヨードの放射性同
位元素標識２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ８誘
導体を得る方法である上記した反応性誘導体（ＶＩＩ　
）は、式％式％） で表され、Ｒ５は前述と同じ意味を示し、Ｘは、サクシ
ニイミディルーＮ−オキシ基、フタルゴミデイルーＮ−
オキシ基、５−ノルボルネン−２゜３−ジカルボキシイ
ミディルーＮ−オキシ基またはマレゴミデイルーＮ−オ
キシ基を示し、Ｒ５が３−（４−ヒドロキシ−３−ヨー
ド（１２５１）フェニル）プロピオニル基であり、Ｘが
サクシニルゴミデイルーＮ−オキシ基であるＮ−サクシ
ニルイミディル３−（４−ヒドロキシ−３−：ｌ？−１
’（１２５１）フェニル）プロピオネートは−〔１２５
Ｉ〕ポルトン−ハンター試薬として市販されており、簡
便に使用できる。

例えば、この〔１２５Ｉ〕ポルトン−ハンター試薬を用
いて、弐（Ｉ）で表される２４Ｒ，２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ、アミノ酸誘導体に間接標識を行うために、
ヨードの放射性同位元素とアミノ基を介して共有結合せ
しめる際は、反応に用いるヨード（＋！５１）ポルトン
−ハンター試薬数ｐＩＩｌＯ１ｅ〜数−ｗｌｏｌｅに対
して、２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３アミノ
酸誘導体を５００〜２０００倍程度過剰に添加するのが
好ましく、特に１０００倍で添加するのが好ましい。通
常、反応は０〜３０℃、１２〜７２時間行えばよい。こ
こで、反応生成物であるヨード（Ｉｔｓ　Ｔ）の放射性
同位元素標識２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
誘導体ＣＩ［［］は、ＲＩＡ法またはＣＰＢＡ法におけ
る利用率を高めるために、ＴＬＣまたは高性能液体クロ
マトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）などでより純度を高く
することが好ましい。このようにして得られたヨード（
Ｉｔｓ　１　）標ｍ２４Ｒ２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ３誘導体は、エタノール溶液中に一２０℃保存におい
てヨード〔１２５Ｉ〕の半減期である２ケ月以上安定で
あり、ラジオイムノアッセイに充分使用し得るものであ
った。この際、保存温度はできるだけ低温が良く５℃〜
−２０℃以下、特に−２０℃以下が好ましい。

溶媒はアルコール系、エーテル系が好ましく、保存の際
は不活性ガスで置換することが好ましい。

つぎに、ハブテンである２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビ
タミンＤ３の抗体作製のために用いる、前述の如くに得
られた式（１）で表される２４Ｒ１２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ、アミノ酸誘導体を担体蛋白質と結合させ、
それを動物に接種することにより２４Ｒ，２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ、抗体を作製し得る。２４Ｒ，２５−
ジヒドワキシビタミンＤ３抗体を得るにあたり、まず抗
体作製のために用いるハプテンの免疫原性抗原を得るに
必要な担体蛋白質としては、例えば、単純蛋白質、ポリ
ペプチド、糖蛋白などの複合蛋白質等が挙げられ、単純
蛋白質としては生血端アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清
アルブミン、ヒト血清グロブリンなどがあり、ポリペプ
チドとしては、ポリリジン等で、糖蛋白としてはムコ蛋
白質等が挙げられる。中でも単純蛋白質が好ましく、特
に牛血清アルブミン、ヒト血清アルブミンが好ましい。

２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘導
体（１）と上述の担体蛋白質とを縮合剤、架橋剤の存在
下で共有結合せしめる。その際、縮合剤、架橋剤として
は、ジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）、酸無水物、グ
ルタルアルデヒドなどが用いられるが、中でも特にＤＣ
Ｃが好ましい。２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
３アミノ酸誘導体と担体蛋白質との結合比率は、一般に
多過ぎても少な過ぎても得られる抗体の力価が低下する
ため、担体蛋白質一分子当りにつき、２４Ｒ，２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘導体を１０〜４０個
結合せしめるのが好ましい。

かくして得られる抗体作製のための上記の結合体は、動
物に接種して抗体を生産させることができる。動物に接
種するには、非経口的に投与する方法が採用され、例え
ば皮下または皮肉に注射することによって行われる。接
種する際には、例えば、上述の操作で得られた２４Ｒ，
２５−ジヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘導体−担体
蛋白質の結合抗原を緩衝液または生理食塩水に溶解し、
同量のコンプリート・フロイント・アジュバント（Ｃｏ
ｍｐｌｅｔｅ　ｆｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ：　
Ｃ，Ｆ、　Ａ）を加え、充分乳化した後、用いる溢血動
物の皮下、皮肉に投与し、１〜３週間毎に同一結合抗原
を約１０回はど投与して免疫せしめる。また必要により
、結合抗原を免疫担当中枢器官である肺臓に直接接種し
てもよい。この間、一定期間毎に血中抗体価を測定しな
がら最高時点で全採血しこれを静置し、凝固せしめて遠
心分離し、２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、抗
体を含有する抗血清を得る。また、この場合に用いる溢
血動物としては抗体産生能のある動物であれば何れを用
いてもよく、大量の抗体を得るにはヤギ、ウシ、ヒツジ
等の大型動物を用いるのが好ましい。通常はニワトリ、
ウサギ、ラット、ラビット、マウスを用いるが、何ら限
定されるものではない。さらにこれらの被免疫動物から
得られた２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体
を含有する抗血清から２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ３抗体を得るには、通常用いられる抗体の精製手
段の方法によって行えばよく、例えば抗血清を硫安分画
し、次いでイオン交換クロマトグラフィーあるいはゲル
濾過によって精製・採取すればよい。

さらに２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体を
得る別法としては、上述の２４Ｒ，２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ３アミノ酸誘導体−担体蛋白質の結合体抗原
を接種した動物の目的抗体産生肺臓細胞と株化された骨
髄腫細胞とを融合せしめて得られるハイブリドーマ（融
合細胞）が産生ずるモノクロナール抗体を製造する方法
を用いてもよい。特に、哺乳動物としてマウスを用いる
方法がよく利用されている。例えばマウス（Ｂａｄｂ　
／　ｃ　）を用い、２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤ３アミノ酸誘導体−担体蛋白質の結合抗原を緩衝液
または生理食塩水に溶解し、同量のコンプリート・フロ
イント・アジュバントを加えて混和懸濁した乳化液をマ
ウスの皮下に投与し、約１週間毎に複数回追加投与し、
感作を行なう。その後、最終感作の３〜５日後に細胞融
合の作業を行う。これは最終感作３〜５日後の肺臓にお
ける抗体産生前駆細胞を使用する細胞融合は、目的抗体
の産生能を有するハイブリドーマが最も得られやすいと
いわれているためであって、通常このような細胞が最も
多くなる最終感作後３日月頃の肺臓細胞が融合に用いら
れる。それ故、最終感作から３〜５日後に、２４Ｒ，２
５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体産生細胞である肺臓
細胞を採取して、これを長期培養可能な株化骨髄腫細胞
と融合させる。長期培養可能な株化細胞とは、インビト
ロまたはインビボの条件下で長期間生育し増殖する免疫
グロブリンまたはその類縁蛋白質の産生細胞であればよ
く、通常は増殖が旺盛な腫瘍細胞株が用いられる。好ま
しい代表例を挙げると骨髄腫細胞株（ミエローマ細胞）
であるＰ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−Ｘ６３−
Ａｇ８Ｕ１、ＳＰ２／Ｕ−Ａｇ１４、ＭＰＣＩＩ−４５
，６，ＴＧ、１．７等の細胞株が挙げられるが、本発明
においてはＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ１が好適である。こ
れらの細胞株は通常の細胞培養培地で培養保存される。

例えば培養は１０％ＦＣ３添加ＲＰＭ１１６４０　（商
品名：ＲＰＭ１１６４０：フローラボラトリー社製）に
グルタミン、ピルビン酸、ペニシリン、ストレプトマイ
シン等を加えた培地で行い、保存には同じ培地にＳ−ア
ザグアニンを添加した培養液が用いられる。細胞融合に
際しては１回の融合に１〜３×ｌ０Ｌ１個のミエローマ
細胞を使用すればよい。融合に用いられる抗体産生細胞
である肺臓細胞は、前記したような感作後のマウスを解
剖して肺臓をとり出し、細断した後、細胞用メソシュ上
ですりつぶし、肺臓細胞懸濁液を調製する。細胞は洗浄
等の処置をしてからミエローマ細胞との融合に使うが、
１回の融合には、通常１〜３Ｘ１０８個の細胞が使用さ
れる。細胞融合は上記の如くして得られた肺臓細胞とミ
エローマ細胞を混合して行われる。混合の割合は、経験
的にミエローマ細胞：肺臓細胞を１：３〜１０の割合で
行われる。細胞融合はハイブリドーマ用培地で行われる
。融合に際しては、通常の細胞融合の方法、即ちセンダ
イウィルスやポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の融
合促進剤を用いるのがよいことは言うまでもないが、本
発明においてはＰＥＧの使用が最適である。このように
細胞促進剤を加えて融合した細胞を前記したハイブリド
ーマ用培地へ分注し、培養を行う。このようにしてマウ
ス肺臓細胞とマウスミエローマ細胞の融合が行われるが
、融合細胞のみを選択するためにＨＡＴ培地にて融合細
胞を識別増殖させる。ＨＡ　Ｔ培地は前記したハイブリ
ドーマ用培地にヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ
ジンを添加した培地である。このように選択したハイブ
リドーマは一般に細胞選択用プレートの１穴当り２個以
上のハイブリドーマが生育しており、２種以上抗体が分
泌される可能性があることや、他に抗体を分泌できない
ハイブリドーマが混在していたりするので、同一の性質
を有する細胞を得るために、個々のクローンを分離する
必要がある。即ち、クローン化（クローニング）を行う
ことが必要である。

クローン化の方法としては、限界希釈法や軟寒天法が用
いられるが、本発明においては限界希釈法が簡便である
。

このようにして得られた、高力価の２４Ｒ，２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ３抗体を分泌するハイブリドーマを
保存するのであれば、なるべく早い時期の内に凍結保存
するのがよい。凍結保存は通常の方法にしたがい、例え
ば凍結用小試験管やアンプルに細胞液を入れ、−８０℃
のフリーザー中で凍結させて、更に液体窒素中にて保存
すればよい。さらに、ハイブリドーマ増殖法の一例とし
ては、予めプリスタン（ｐｒｉｓｔａｎ、２．６．１０
．１４ｔｅｔｒａｍｅｔｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ、
アルドリッチ社製）を腹腔内投与したプリスタン処理マ
ウスの腹腔に、前記のハイブリドーマを投与し、約１０
日後腹水を採取することにより抗体の大量調製を行うこ
ともできる。また該ハイブリドーマをウシ胎児血清含有
ＲＰＭＩ培地やダルベツコ変法イーグル培地等にて培養
してもよい。得られた抗体は通常用いられる精製手段、
例えば抗体を硫安分画し、次いでイオン交換クロマトグ
ラフィーあるいはゲル濾過やアフィニティークロマトグ
ラフィー等を行って、ＴｇＧ分画を行う。このようにし
て精製された２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
モノクロナール抗体を得ればよい。また、２４Ｒ，２５
−ジヒドロキシビタミンＤ３モノクロナール抗体産生細
胞を、組織適合性抗原を同じくする動物や無胸腺のヌー
ドマウスの体内で腫瘍として生育せしめ、これから採取
、精製してもよい。

さらに２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の定量
に際し、２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ポリ
クロナール抗体または２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ３モノクロナール抗体（以下、−括して２４Ｒ，
２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体と略すことがある
）は、そのままの可溶性の状態で用いてもよく、または
不溶性担体に固定化した固相体として用いてもよい。こ
のような固相体としては、不溶性担体と２４Ｒ，２５−
ジヒドロキシビタミンＤ３抗体とを、多官能性試薬を用
いて結合せしめ、且つこの結合抗体が２４Ｒ，２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ３に対して抗体活性を保持してい
ればよい。用いられる多官能性試薬としては、アミノ基
、水酸基、カルボキシル基、チオール基等の官能基と反
応し得る基を二以上有する多官能性試薬であればよく、
例えば、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒド、ア
ジポアルデヒド等のアルデヒド化合物、マロン酸、コハ
ク酸、グルタル酸、アジピン酸等のジカルボン酸または
その反応性誘導体、ヘキサメチレンジイソシアナート、
２，４−トルエンジイソシアナート等のジイソシアナー
ト化合物、ヘキサメチレンジイソチオシアナート等のジ
イソチオシアナート化合物、マレイミド安息香酸、マレ
イミドフェニル酢酸等のマレイミドカルボン酸またはそ
の反応性誘Ｎ　体、Ｎ、　Ｎ’　−エチレンビスマレイ
ミド、Ｎ、　Ｎ’　−０−フェニレンジマレイミド等の
シマレイミド化合物、ビスジアゾベンジジン、ジエチル
マロンイミデート、ジメチルアジピンイミデート、Ｎ、
Ｎ’　−ポリメチレンビスヨードアセトアミドや３−　
（２’　−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン酸、
３−（２°　−ピリジルジチオ）プロピオン酸等のチオ
カルボン酸化合物またはその反応性誘導体等が挙げられ
、これらの多官能性試薬は、２４Ｒ，２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ３抗体のアミノ基、カルボキシル基、水酸
基、チオール基等の官能基との結合を考慮して選択すれ
ばよい。用いられる不溶性担体としては、用いる抗体を
結合させることができる多官能性試薬の官能基以外の他
の官能基と反応し得る基を導入せしめたものであればよ
く、例えばアルブミンやゼラチン等の不溶化蛋白質、ア
ガロース、セルロースやデキストリン等のエピクロルヒ
ドリン処理による不溶化多糖類や臭化シアン処理および
アミノ基導入を目的として、これに対応するスペーサー
が導入され、且つ不溶化されたアクリロニトリル、アク
リル酸、アクリル酸エステル、メタアクリル酸、メタア
クリル酸エステル、ビニルアルコール、酢酸ビニル、ス
チレン、アミノスチレン、クロルスチレン、マレイン酸
、フマル酸等の重合体または共重合体等の不溶性合成高
分子系担体やケイ素やアルミニウム等の無機化合物にア
ミノ基等の官能基導入の不溶性無機系担体が挙げられる
。また用いる不溶性担体は、単なる物理的な吸着作用に
より、２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、抗体を
結合し得るものであってもよい。これらの不溶性担体は
、通常少なくとも濾過等の手段により容易に単離できる
粒径のものがよく、例えば径１ｍｍ以上、好ましくは５
ｍｍ以上のものがよく、ビーズ状のものが繁用される。

また、ビーズ状の代わりに、抗原抗体反応管の管底部の
形状と相似した紡錘形の形状のものとして用いてもよい
。

２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、抗体にスペー
サー導入試薬を用いて反応し得る基を導入するに当たっ
ては、例えば、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒ
ド、アジボアルデヒド等のジアルデヒド化合物、ω−ア
ミノ酪酸、ω−アミノグルタミン酸の酸クロライド、ス
クシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル等
の反応性誘導体、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、ア
ジピン酸等のジカルボン酸化合物の反応性誘導体１ヘキ
サメチレンジアミン、デカメチレンジアミン等のジアミ
ン化合物、３−　（２’　−ヒリシルージチオ）プロピ
オン酸、３−　（２’　−ベンゾチアゾリル−ジチオ）
プロピオン酸等の反応性誘導体、Ｓ−アセチルメルカプ
トサクシニック・アンハイドライド、２−アミノエタン
チオール等のチオール化合物等のスペーサー導入試薬の
１個または２個以上を用いて新たにアルデヒド基、カル
ボキシル基、アミノ基、チオール基等の官能基を導入す
ればよい。

次いでこのような不溶性担体の反応し得る基に、２４Ｒ
，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体を直接または多
官能性試薬を用いて結合せしめるのであるが、縮合にお
いては、通常ｐ）（Ｅ＋、Ｏ〜８．５の緩衝液または有
機溶媒またはこれらの混合媒体中で０〜４０℃にて各々
を反応せしめればよい。また別の固相体を製造する方法
としては、用いる不溶性担体の物理的な吸着能を利用し
て吸着固定化せしめてもよい。さらにこの２４Ｒ，２５
−ジヒドロキシビタミンＤ３の抗体産生に用いた動物の
血清に存在する通常の免疫グロブリン画分を用いて他種
の動物、特に大型哺乳動物に免疫せしめて得られた第二
抗体を用い、この第二抗体を不溶性担体に固定化せしめ
、次いでこれに２４Ｒ２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
抗体を抗原抗体反応により結合せしめて得られる２４Ｒ
，２５−シヒドロキシビタミンＤ、抗体活性がほとんど
失活せしめることのない固定化手段によって固相体を得
てもよい。さらにこのようにして得られた固相体は、洗
浄、保存すればよい。

さらにまた上記の同相体を用いる代わりに２４Ｒ２２５
−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体を可溶性のままで用い
て、被検液中の２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
３を定量する場合には、予め一定量の式（ＩＩＩ）で表
されるヨードの放射性同位元素標識２４Ｒ，２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ３誘導体が加えられた被検液に、最
適量の２４Ｒ２２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体を
添加することによって産生される上記の標識２４Ｒ。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体および被検液中
に存在する２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と
２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体との抗原
抗体反応結合体と未反応の標識２４Ｒ，２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ３誘導体とを分離するために、２４Ｒ，
２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体に対する特異的抗
体が用いられる。この特異的抗体は第二抗体とも呼ばれ
、第二抗体は例えば２４Ｒ，２５−ジヒドロビタミンＤ
３の抗体産生に用いた動物の血清に存在する通常の免疫
グロブリン画分を抗原として用い、これを公知の免疫手
段により他種の動物、特に大型哺乳動物の皮下、または
皮肉に注射して免疫し、その抗血清から得ることができ
る。この第二抗体は必要に応じて公知の精製手段により
抗血清から抗体を得てもよく、また抗血清の状態にて利
用することが簡便である。

さらに、上述の如く得られた２４Ｒ，２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ、抗体とヨードの放射性同位元素標識２４
Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体を用いた被
検液中の２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の定
量法を述べる。まず、２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ、ｌの含有量を測定しようとする被検液、例えば
ヒトの血清において、まず血清中の２４Ｒ，２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ３を抽出する。血清と同量の溶媒を
加えて攪拌・静置後、遠心分離にて抽出し、得られた上
清液を分離し、カラムクロマトグラフィーにて２４Ｒ，
２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を粗精製し、２４Ｒ，
２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の溶出画分を分取する
。さらに好ましくは、これをＨＰＬＣカラムにチャージ
し、溶出することにより精製するのがよい。２４Ｒ，２
５−ジヒドロキシビタミンＤ３の溶出画分は、予めトリ
チウム〔３Ｈ〕の放射性同位元素標識２４Ｒ，２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ、を用いて確認しておきその両分
を集めて２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を回
収する。この２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、
溶出画分を減圧乾燥し、アルゴンガスで置換し、さらに
エタノールに溶解し、被験液として測定に用いる。次い
で、該被験液中の２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ３を定量する。まず、該被験液に一定適量のヨードの
放射性同位元素標識２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤ、誘導体を添加し、次いで最適量の２４Ｒ，２５−
ジヒドロキシビタミンＤ３抗体を加え、抗原抗体反応用
溶媒、例えばリン酸緩衝液やベロナール緩衝液中４〜５
℃程度にて約１５時間〜７２時間インキュベートして抗
体に対する放射性ヨード標識ハプテンと定置すべき無標
識ハプテンとの競争反応を惹起せしめる。その後、抗体
に対する放射性ヨード標識ハプテンと定量すべき無標識
ハプテンとの競争反応の結果、生成した抗原抗体結合体
、特にヨードの放射性同位元素標識２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ３誘導体−２４Ｒ２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤ、抗体の結合体（Ｂ）と、結合体形成に関与しない
で残存する未反応の遊離体（Ｆ）、特に未反応遊離体で
あるヨードの放射性同位元素標識２４Ｒ，２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ３誘導体とを分離するために、デキス
トラン−チャコール法（ＤＣ法）により、濾過または遠
心分離（３０００ｒｐｍ、１５ｍ１ｎ、）によりＢ−Ｆ
分離を行ない各々の放射活性を測定し、そのＢ／（Ｂ＋
Ｆ）あるいはＢ／Ｆの放射活性を算出して、被検液中の
２４．Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３　　（Ｈ）
の量を求める。

すなわち、Ｈの量が増大すれば、Ｂの放射活性は減少し
、Ｆの放射活性は増大する。したがって、未知量のＨが
存在する条件下でＢとＦの放射活性を測定すれば、あら
かじめ既知量を用いて作製しておいた標準曲線から未知
量のＨの量を測定できる。

また、Ｂ−Ｆ分離に当たって、用いる抗体が可溶性のま
まであり、第二抗体を用いる二抗体法を採用する場合に
は、競争反応後、第二抗体、さらに好ましくは第二抗体
を含有するＴｇＧ、必要に応じてキャリアーとして２４
Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体作製に用いた
同一種の動物のＴｇＧを加えて、１−１２時間インキュ
ベートし、その後抗原抗体反応によって生成した結合体
を３００ＯｒｐｍｌＯ〜３０分程度の遠心分離で沈殿せ
しめた沈澱部分（Ｂ）とその上清部分（Ｆ）とを分別し
、洗浄した沈澱物または上清のいづれか一方の放射活性
を測定すればよい。

本測定によって、２１）ｇ／Ｔｅｓ　ｔ〜２５６ｐｇ／
Ｔｅ５ｔまでの標準曲線が作製でき、この測定系におい
て、反応時間は５℃、１６時間または３７℃、１時間で
、迅速性を有し、反応後の処理操作は簡便であり、被検
液の希釈および添加回収試験も直線性をもつことから、
かなり高精度である。

また、従来より用いられているＤＢＰを抗体の代わりに
使用しても、本発明中の２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビ
タミンＤ３−ヨード（＋ｚｓ　１　）放射性同位元素標
識誘導体と反応し、１〜３２ｐｇ／　Ｔｅ　ｓ　ｔの間
で標識曲線が作製できる。ＤＢＰは、ニワトリ、ラット
、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ヒトなどの血
清より得られる。

次いで、本発明の実施例および参考例を挙げて具体的に
述べるが、本発明は何らこれらによって限定されるもの
ではない。

参考例　１ 血清０．５ｍｊ！に対してアセトニトリル０．　５ｍｌ
を用いポルテックスミキサーにて攪拌後３０分静置した
。その後遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍ１ｎ、）し
、得られた上滑液０．８ｍｊ２を分取した。その上清液
０．８ｍｊ！をセソプパソクＣ−１８カートリッジカラ
ム（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、　Ｗａｓｔｅｒｓ社
製）にチャージし、含水アセトニトリルで溶出し、粗精
製した。その際、セップバソクＣ−１８カートリッジカ
ラムは常法に従いエタノールで活性化し、５０％アセト
ニトリルで平衡化したものを使用した。次に５０％アセ
トニトリル４ｍｌで洗浄し、次に６４％アセトニトリル
４ｍｌで溶出（１α−２５ヒドロキシビタミンＤ３を含
む両分）し、次に７３％アセトニトリル４ｍｌでｉ出（
２５−ヒドロキシビタミンＤ３．２４２５−ヒドロキシ
ビタミンＤ３を含む両分）し、７３％アセトニトリル溶
出画分を減圧乾燥し、アルゴンガスで置換することによ
り２４Ｒ，２５一ジヒロキシビタミンＤ３画分を得た。

さらに好ましくは、この粗精製の両分をｎ−ヘキサン−
イソプロパツール（９：　１）の混合溶媒２００μｌに
溶解し、ＨＰＬＣのＺｏｒｂａｘ−３ＩＬ　（Ｄｕｐｏ
ｎｔ社製）０．４６Ｘ２５ｃｍカラムにチャージして同
溶媒で溶出することにより精製した。ここで、セソプバ
ソクＣ−１８カートリッジカラムおよびＨＰ　Ｌ　Ｃに
おける２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、の溶出
画分は、予めトリチウム〔３Ｈ〕の標識２４Ｒ，２５−
ジヒロキシビタミンＤ３　　（２６，２７ｍｅ　ｔ　ｈ
　ｙ　１−３Ｈ）を用いて確認した。さらに、ＨＰＬＣ
における２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の溶
出画分（Ｒｔ−５〜７ｍ１ｎ、）を減圧乾燥し、アルゴ
ンガスで置換した。この溶出画分をエタノール２００μ
ｌに溶解し、測定にはその２０μｌを使用した。

本操作による２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
の回収率は９２％（ｎ−１８）であった。

実施例　１ ２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−３β−０−
（３−（Ｎ−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ア
ミノ）プロピオン酸エステル〔以下、２４Ｒ，２５−（
ＯＨ）２　Ｄ、−３β−〇−β−Ａｈａ−Ｆｍｏｃと称
す〕及び２４Ｒ２２５−ジヒロキシビタミンＩ）＋　　
　２４Ｒ−０−（３−（Ｎ−フルオレニルメチルオキシ
カルボニル）アミノ）プロピオン酸エステル（以下、２
４Ｒ，２５−（ＯＨ）２　Ｄ３−２４Ｒ−０−β−Ａｌ
ａ−Ｆｍｏｃと称す〕の合成法３−（Ｎ−フルオレニル
メチルオキシカルボニル）アミノプロピオン酸〔以下、
β−Ａｌａ−Ｆｍｏｃと称す）１１．６ｇ　（１，５Ｘ
０．００２５ｍｍｏｌｅ）とピバロイルクロリド４．６
２μ７！　（１，５Ｘ０．０２５ｍ　　ｍｏｌｅ）及び
ジメチルピリジン〔以下、ＤＭＡＰと称す〕４．５７ｍ
ｇ　（１，５Ｘ０．０２５ｍ　　ｍｏｌｅ）をアルゴン
霊気下無水テトラヒドロフラン〔以下、ＴＨＦと称す）
２ｍｎ中−１０°Ｃで混合反応させ、β−Ａｌａ−Ｆｍ
ｏｃとピバロイルクロリドの混合酸無水物を生成させた
。約１０分間−１０°Ｃで保ち、２４Ｒ，２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ３〔以下、２４Ｒ，２５−（ＯＨ）２
　Ｄ３と称す〕１０、　４ｍｇ　（０，０２５ｍ　　ｍ
ｏ　ｌ　ｅ）を加え、０℃で３０分間、引き続き室温に
戻して１時間反応させた。この反応液を析出塩を除いた
後に減圧濃縮し、分取用シリカゲルＴＬＣ（Ｍｅｒｋ５
７１７　２０Ｘ２０　（Ｈ）ｃｍ　　酢酸エチル−ヘキ
サン−２：１〕で分離・精製することによって目的とす
る２４Ｒ，２５−（ＯＨ）２　Ｄ３−３β−〇−Ａｌａ
−Ｆｍｏｃと２４Ｒ，２５−（ＯＨ）　！　Ｄ３　２４
　Ｒ−０−β−Ａｈａ−Ｆｍｏｃの混合物、原料２４Ｒ
，２５（ＯＨ）２　Ｄ３および２４Ｒ，２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ３−ビス（３−（Ｎ−フルオレニルメチ
ルオキシカルボニル）アミノ）プロピオン酸エステル〔
以下、２４Ｒ，２５−（ＯＨ）ｔ　Ｄ３−Ｂｉｓ　　（
β−Ａ１ａ−Ｆｍｏｃ）と称す〕の粗製物が得られた。

得られた２４Ｒ，２５−（ＯＨ）２　Ｄ３−３β−〇−
β−Ａ　］　ａ−Ｆｍｏ　ｃと２４Ｒ，２５−（ＯＨ）
ｔＤｓ　　２４Ｒ−〇−β−Ａｌａ−Ｆｍｏｃの混合物
は、ＨＰＬＣ（Ｚｏｂａｘ−３ｒＬ５％イソプロパノー
ルーヘキサン２ｍｊ！／分又はＺｏｒｂａｘ−ＯＤＳＩ
Ｏ％Ｈ２０（ＣＨ３ＣＮ−メタノール−１：　１））２
ｍｌ１７分を用いて分離・精製し、単一物を得た。

各生成物の収率は以下の通りである。

２４　Ｒ，２５−（ＯＨ）　ｚ　Ｄ３　３β−０−β−
Ａｌａ−Ｆｍｏｃ　　　　　　　　　４３．１％２４Ｒ
，２５（ＯＨ）ｚ　Ｄ３　２４Ｒ−０−β−Ａｌａ−Ｆ
ｍｏｃ　　　　　　　　１２．７％２４Ｒ，２５−（Ｏ
Ｈ）２　Ｄ３−ビス（β−Ａｌａ−Ｆｍｏｃ）　　　　
　　　　　　　　　　３３．　５％回収原料２４Ｒ，２
５（ＯＨ２）　Ｄ３１０、８％ 各物質の物性： ２４Ｒ，２５−（ＯＨ）　２Ｄ３−３β−０−β−Ａｌ
ａ−Ｆｍｏｃ ＮＭＲδ（ＣＤＣＩｌａ　）　Ｉ）Ｉ）ｍｏ、５５　（
３Ｈ，ｓ）　、０．９４　（３Ｈ，ｄ）、１．１７　　
（３Ｈ，ｓ）　、１．２１　　（３Ｈ，ｓ）、２．１７
〜２．２４　（ＩＨ，ｍ）　、２．３５〜２．４２　（
２Ｈ，ｍ）　、２．５３〜２．６０　（３Ｈｍ）　、２
．７７〜２．８１　　（Ｌ　Ｈ，ｍ）、３．３１〜３．
３５　（ＩＨ，ｍ）　、３．４４〜３．４９　（２Ｈ，
ｍ）　、４．１９〜４．３８（３Ｈ，ｍ）　、４．８５
　（ＩＨ，ｄ）　、４．９８〜５．０２　（ＩＨ，ｍ）
　、５．０７　（ＬＨ。

ｍ）　、５．２７〜５．３０　（ＩＨ，ｂ）　、６゜０
３　　（ＩＨ，ｄ）　、６．２１　　（ＩＨ，ｄ）　、
７２９〜７．７７　（８Ｈ，ｍ） ＥｔＯＨ ＵＶλ　　　　　（ｎｍ）２９９．　７．２６５．２ａ
ｘ ＨＰ　Ｌ　Ｃ。

■Ｚｏｒｂａｘ−３ＩＬ５０％イソプロパノ−ルーヘキ
サン、２ｍ　Ａ　７分　Ｒｔ：１４．０分 ■Ｚｏｒｂａｘ−ＯＤＳＩＯ％Ｈ２０（ＣＨ３ＣＨＩ−
メタノール−１：　１）　、２ｍ１．／分Ｒｔ７８．４
分 ２４　Ｒ，２５−（ＯＨ）　　２　　Ｉ）ｌ−２４ＲＯ
−β−Ａｌａ−Ｆｍｏｃ ＮＭＲδ　（ＣＤＣＪｚ　）　　ｐｐｍ０、　５２　　
（３Ｈ，ｓ）　　、０．９２　　（３Ｈ，ｄ）　　、１
、　１９　　（３Ｈ，ｓ）　　、１．２１　　（３Ｈ，
ｓ）　　、２、　１５〜２．　１７　　（ＩＨ，ｍ）　
　、２．２５〜２．２８　　（ＬＨ，ｍ）　　、２．３
０〜２．３８　　（ＩＨ，ｍ）　　、２．５５〜２．６
１　　（３Ｈ，ｍ）、２．　７９〜２．８３　　（ＬＨ
，ｍ）　　、３．４８〜３．５６　　（２Ｈ，ｍ）　　
、３．９３〜３．９５（ＩＨ，ｍ）　　、４．２０〜４
．３９　　（３Ｈ，ｍ）、４．　８０　　（ＬＨ，ｄ）
　　、４．　８２〜４．８５（ＩＨ，ｍ）　　、５．　
０２　　（ＬＨ，ｍ）　　、５．　４９　　（ＩＨ，ｂ
）　　、６．　０１　　（ＬＨ，ｄ）　　、６゜２２　
　（ＩＨ，ｄ）７．２９〜７．７７（８Ｈ。

ｍ） ＨＰＬＣ； ■条件上記に同じ、Ｒｔ：１８．４分 ■条件上記に同じ、Ｒｔ：６．５分 ２４Ｒ，２５−（ＯＨｚ　）Ｄｓ−ビス（β−ＡＬａ−
Ｆｍｏｃ） ＮＭＲδ（ＣＤＣＩ１３　）　ｐＩ）ｍｏ、５２　（３
Ｈ，ｓ）　、０．９２　（３Ｈ，ｄ）、１．１９　（３
Ｈ，ｓ）　、１．２１　（３Ｈ，ｓ）、２．１７〜２．
２２　（ＩＨ，ｍ）　、２．３５〜２．４１　　（２Ｈ
，ｍ）　、２．５３〜２．６１　　（５Ｈ，ｍ）　、２
．７５〜２．７８　（ＩＨ，ｍ）、３．４４〜３．５７
　（４Ｈ，ｍ）　、４．１８〜４．　３９　　（６Ｈ，
ｍ）　　、　４．　８３〜４．　８５（２Ｈ，ｍ）　　
、４．　９８〜５．　０１　　（ＬＨ，ｍ）、　５．　
０４　　（ＩＨ，ｍ）　　、　５．　２８〜５．　３０
（ＩＨ，ｂ）　　、５．　４８〜５．　５１　　（ＬＨ
，ｂ）、６．　００　　（１１−１，ｄ）　　、６．　
２０　　（ＩＨ，ｄ）、７．　２９〜７．　７７　　（
１６Ｈ，ｍ）実施例　２ （ｌ１２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、−３β
−０−（３−アミノ）プロピオン酸エステル〔以下、２
４Ｒ，２５−（ＯＨ）２　Ｄ３−３β−０−β−Ａｌａ
と称す〕の合成実施例１で得られた２４Ｒ，２５（ＯＨ
）ｚＤ３−３β−０−β−Ａｌａ−Ｆｍｏｃ２．４ｍｇ
　（３，３８Ｘ　１０−３ｍ　　ｍｏ　ｌ　ｅ）をエタ
ノール１ｍ７！に熔かし、その溶液にモルホリン１ｍｊ
２を加え、室温下２時間反応させる。反応液を減圧留去
後残渣をＬＨ−２０（ファルマシア社製８ｍｊ！！Ｈ！
Ｏ）にチャージし、精製水３　Ｑ　ｍ　Ｉ！で残存する
モリホンを洗い出した。目的物をメタノールで溶出し、
そのフラクションを減圧濃縮し、ＡＩ）ｒｅｐ−ＮＨ２
（アマージャム製５０　Ｑｍｇヘキサン−ジクロロメタ
ン−１＝１〕にチャージし、ヘキサン１：１ジクロロメ
タン２０　ｍ　１２で洗浄した後、エタノールで溶出し
て目的物を得た。

回収率　２５．４％ ニンヒドリン呈色　陽性 （２１２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−２４
Ｒ−０−（３−アミノ）プロピオン酸エステル〔以下、
２４Ｒ，２５−（ＯＨ）Ｚ　Ｄ３２４Ｒ−０−β−Ａｌ
ａと称す〕の合成上記（１１において２４Ｒ，２５−（
ＯＨ）２　Ｄ３−３β−０−β−Ａｌａ−Ｆｍｏｃの代
わりに、２．４Ｒ，２５（ＯＨ）　ｚ　Ｄ３　　２４Ｒ
Ｏ−β−Ａｌａ−Ｆｍｏｃを用い、その他は同様の操作
を行って目的物を得た。

回収率　４０％ ＥｔＯＨ ＵＶλｍａｘ　　　　　　２６５．４βｍ実施例　３ （１）ヨード（＋２５７）放射性同位元素標識２４Ｒ２
５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体（２４Ｒ，２５−
ジヒドロキシビタミンＤ、−３β−Ｏ−（３−（Ｎ−３
−（４−ヒドロキシ−３−ヨード（＋２５　　ｒ）フェ
ニル）プロピオニル〕アミノ）プロピオン酸エステルの
合成 実施例２の（１）で得られた２４Ｒ，２５−（ＯＨ）Ｚ
Ｄ３−３β−０−β−Ａｌａのエタノール溶液（６６、
３５ｎ　　　　ｍｏｌｅ／１００．ｃ＋＃　　エタノ　
−ル）に、ＴＨＦ２０μｌ、及びトリエチルアミン３Ｑ
Ｑｐ　　ｍｏｌｅ／２，１ｊＮＴＨＦを加え、さらＧこ
ヨード（１２５１）ポルトン−ハンター試薬（ＮＥＮｌ
！　　ＮＥＸ−１２０−１０，２２００Ｃ４／ｍ　　ｍ
ｏｌｅ）５０．ｃ＋ｃｉ／３０ｐ　　ｍｏｌｅ／１５μ
ｌヘンゼンを加えて、アルゴン霊気下、遮光して室温で
２４時間反応させた。反応液をＨＰＬＣによって分離・
精製することによって目的物を得た。

ＨＰＬＣ ■Ｚｏｒｂａｘ−ＯＤＳ　　１５％水−メタノール、１
　ｍ　！！　７分、Ｒｔ　：１２．Ｏ〜１３．３分 ■Ｚｏｒｂａｘ−３ＩＬ　　２０％イソプロパノ−ルー
ヘキサン、Ｉ　ｍ　ｌ！　７分、Ｒｔ：１２゜６〜１７
．２分 放射能回収率　２９．９μＣ４（５９，７％）（２）２
４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−２４Ｒ−０−
（３−（Ｎ−３−（４−ヒドロキシ−３−ヨード（Ｉｔ
ｓ　１　）フェニル）プロピオニルコアミノ）プロピオ
ン酸エステルの合成上記（１）において２４Ｒ，２５−
（ＯＴ（ｚ）Ｄ＋　−３β−０−β−Ａｌａの代わりに
実施例２（ｌ）で得た２４Ｒ，２５−（ＯＨＭ）Ｄ３−
２４−Ｒ−０−一β−Ａｌａを用いた他は同様に操作し
て目的物を得た。

ＨＰＬＣ ■条件上記に同じ、Ｒｔ：９，９〜１１．３分■条件上
記に同じ、Ｒｔ：１１．３〜１４．８分 放射能回収率　５３．９％ 実施例　４ ２４Ｒ，２５−（ＯＨ）Ｚ　Ｄｆｆのヨード（１２５■
〕標識化合物を用いた２　４Ｒ，２５（ＯＨ）２Ｄ３の
標準曲線の作製 ２４Ｒ，２５−（ＯＨ）！　Ｄ３の標準エタノール溶液
の濃度を調整し、１１０２４ｐ／２０．ｃｉ！、１２８
βｇ／２０μｌ、６４βｇ／μｍ３２ｐｇ／ｐｌ、１６
βｇ／２０ｔｔｌ、８βｇ／２０ｐｌ、４βｇ／２０．
ｕｊ！、２βｇ／２０ｐＨ及びブランクＯとした。各濃
度の標準液２０μｌをチューブ２本にそれぞれ分注し、
次に抗酸化剤としてトコフェロールを含有するヨード（
Ｉｔｓ　ｌ）標識２４Ｒ，２５（ＯＨ）２　Ｄｓ誘導体
のエタノール溶液を各チューブに２０μｊ！　（約１３
．　０００　ｃｐｍ）ずつ分注した。さらにｐＨ８，６
のトリス緩衝液で希釈したＤＢＰ　（ビタミンＤバイン
ディングプロティン）を各チューブに１７！づつ加え、
攪拌後。５℃で一晩（約２０−２４時間）静置した。そ
の後、デキストランチャコール溶液２００μｌを加え攪
拌し、１５分毎に攪拌を繰り返し、３０分間、５℃でイ
ンキュベーションを行った。

その後、３００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離によりＢ−
Ｆ分離を行い、上清１ｍｌ！を別チューブに分取し、オ
ートウェルγ−カウンタにて測定する。得られた各チュ
ーブのカウントの平均をプロットして標準曲線を作製す
ることができる。その結果を図に示す。

〔発明の効果〕

以上に述べた如く、本発明は高放射エネルギーを有し、
汎用性において優れている放射性ヨードで標識された２
４Ｒ，２５−ジヒロキシビタミンＤ、誘導体を提供でき
るものである。従来は、単位時間当りの放射エネルギー
の低いβ線放出核種であるトリチウム〔３Ｈ〕による種
々のビタミンＤ、標識化合物が存在した。しかしトリチ
ウム〔３Ｈ）と同様にラジオイムノアッセイに汎用され
る放出エネルギーの高いγ線放出核種のヨード〔２５Ｉ
〕およびリン（”　Ｐ　）で標識されたビタミンＤ３誘
導体は、ビタミンＤの特徴でもある共役トリエン構造の
不安定さゆえ、ラジカル反応を誘発し自己分解を起こす
と考えられ、現在まで報告されていなかった。しかるに
、本発明者により提供されるヨード〔１２５Ｉ〕で標識
された２４Ｒ１２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体
はＴ線による構造的分解を起こすことなく非常に安定で
あり、ラジオイムノアッセイに利用し得るものであるこ
とを見出した。

一般にビタミンＤ３は、生体内において肝臓もしくは腎
臓によって代謝され、活性型のビタミンＤ３となる。こ
れらの活性型のビタミンＤ３　（２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ１．１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）や
、１α−ヒドロキシビタミンＤ３．１α、２４−ジヒド
ロキシビタミンＤ３などの活性型ビタミンＤ、類は、臨
床的に粗に症、骨軟化症等の治療剤薬として用いられ、
あるいはその開発が行われている。これらの薬物の臨床
用量は、その強い整理作用の為通常著しく少ない。一方
、薬理作用は薬物の血清中濃度、組織中濃度と相関を有
しており、特にヒトにおける薬物の血清中濃度の測定は
臨床上極めて重要な意義を有する、これにより、本発明
は臨床上、活性型ビタミンＤ３類を測定する上で高い利
用価値を有する。

【図面の簡単な説明】

図面は、２４　Ｒ，２５（ＯＨ）　２　Ｄ３の標準曲線
である。 手続ネＦＴＴ正書 ■、事件の表示 昭和　Ｇ３年　特許側　第２５１６６１号２、発明の名
称 新規な２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体
及びその製造法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町二福６３２番地の１名称　東
洋醸造株式会社 ４、代理人　〒１７０ 東京都豊島区北大塚２−２５−１ ５、補正の対象 （１）明細書の特許請求の範囲の欄 （２）明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１）、明細書の特許請求の範囲を別紙の通り訂正する
。 （２）、明細書第７真上から８行目「２４Ｒ１２５ヒド
ロキシ」とあるをｒ２４Ｒ，２５−ジヒドロキシ」と訂
正する。 （３）、明細書第８頁上から３行目ｒ２４Ｒ，２５ビタ
ミンｐ３」とあるをｒ２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ、＋Ｊと訂正する。 （４）、同真下から３行目［２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ３Ｊとあるを「２５−ジヒドロキシビタミンＤ、」と
訂正する。 （５）、明細書第１０頁上から９行目「いてラジオイミ
ノアッセイ」とあるを「いてラジオイムノアッセイ」と
訂正する。 （６）、同頁上から１０行目［２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ３Ｊとあるをｒ２４−Ｒ，２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ３Ｊと訂正する。 （７）、同真下から４行目「２５−ヒドロキシビタ」と
あるをｒ２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタ」と訂正する
。 （８）、明細書筒１ 正する。 ［ ２頁の構造式を下記のごとく訂 （ｌω、明細書第１３頁の構造式を下記のごとく訂正す
る。 「 」 （９）、同真下から９行目「（式中、Ｒ１＋Ｒ１は」と
あるを［（式中、ＲＩＩ＋　Ｒ２１は」と訂正する。 （ＩＱ、同頁下から１０行目［（式中、Ｒ，、Ｒ，は何
れか」とあるを［（式中、Ｒ＋ｚ、Ｒｔ□は何れか」と
訂正する。 ０ａ、明細書第１４真下から２行目「式（１）のＲ，は
」とあるを「式（１）のＲ３は」と訂正する。 ０１、明細書第１５頁上から７行目ｒ　Ｒ＋は直鎖状炭
素」とあるを「Ｒ２は直鎖状炭素」と訂正する。 （１４）、明細書第２２真下から９行目［式中、Ｒ，、
Ｒ，は−ＯＣＲａ　　Ｎ　Ｈｚ　Ｊとあるを「式中、Ｒ
６，Ｒ？は−０−Ｃｏ−ＲｆｆＮＨ２基」と訂正する。 （国、明細書第２３頁下から１行目「ヒドロキシビタミ
ンＤ３誘導体」とあるを「ヒドロキシビタミンＤ３誘導
体〔■〕」と訂正する。 ００、明細書第２５＠上から５行目「プロピオネートは
−（＋２ＳＩＪとあるを「プロピオネートはヨード〔１
２５■」と訂正する。 ０η、明細書第２７真下から７行目「ジシクロカルボシ
イ」とあるを「ジシクロヘキシカル力ルボジイ」と訂正
する。 ＯＬ同頁下から３行目「ミノ酸誘導体」とあるを「ミノ
酸誘導体〔■〕」と訂正する。 ０９１、明細書第２８頁上から２行目「誘導体を」とあ
るを「誘導体（１）を４と訂正する。 ＱＩＩ１１明細書第３２真上から９行目「ポリエチレン
」とあるを１ポリエチレン」と訂正する。 （２１）、明細書第４５頁上から１０行目「参考例１」
とあるを「参考例　ｌ　血清中の２４Ｒ，２５（ＯＨ）
ｚ　Ｄ：＋の抽出・精製法」と訂正する。 （２２）、明細書第４６真上から３行目［（１α２５ヒ
ドロキシビタミン」とあるを「（１α、２５−ジヒドロ
キシビタミン」と訂正する。 （２３）、同頁−ヒから６行目「２５−ヒドロキシビタ
ミン」とあるを「２５−ジヒドロキシビタミン」と訂正
する。 （２４）、明細書第４７頁上から１０行目［β−〇（３
−（Ｎ−Ｊとあるを「β−０−（３−（Ｎ」と訂正する
。 （２５）、同頁下から６行目ＩＯ−（３−（Ｎ−フルオ
レ」とあるをｒ　（３−（Ｎ−フルオレ」と訂正する。 （２６）、明細書第５３真上から９行目「３β−０（３
−アミノ）」とあるを「３β−（３−アミノ）」と訂正
する。 （２７）、同頁下から１行目「減圧濃縮し、Ａｐ」とあ
るを「減圧濃縮し、ＡｍｐＪと訂正する。 （２８）、明細古筆５５頁上から１行「Ｉと２行目との
間に「ニンヒドリン呈色　　陽性」を挿入する。 （２９）、同頁上から６行目ｒ−０−　（３−（Ｎ−Ｊ
とるをｒ−（３−（Ｎ−Ｊと訂正する。 「（ｌ）式 ％式％（９１ （式中、Ｒ＋　、Ｒ２は何れが一方が水酸基で他方が一
〇　　Ｃｏ　　Ｒｚ　　ＮＨｚを示し、Ｒ４は炭素ＤＩ
〜１０のアルキレン基を示す）で表される新規な２４Ｒ
，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘導体。 （２）式 （式中、Ｒ−４，Ｒ，、は何れか一方が水酸基で他方が
−０−Ｃｏ　　Ｒａ　　ＮＴＩ　　Ｒｓを示し、Ｒ３は
炭素数１〜１０のアルキレン基、Ｒ４はアミノ保護基を
示す）で表される２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ３誘導体を、塩基存在の不活性溶媒中でアミン保護基
を脱＾Ｕせしめることを特徴とする式、 （式中、Ｒ，、Ｒ２は何れか一方が水酸基で他方が−０
−ＣＯ−Ｒ３−Ｎ　Ｒ２を示し、Ｒ３は炭素数１〜ＩＯ
のアルキレン基を示す）で表される新規な２／ＩＲ，，
２５−ジヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘導体の製造
法。 （３）アミノ保３１基が、９−フルオレニルメチルオキ
シカルボニル基である請求項２記載の製造法。 （４）式 （６）ヨードの放射性同位元素を有する残基が、３（４
−ヒ１′ロキシー３−ヨード〔１２５Ｉ〕−フェニル）
プロピオニル基又は３−　（３，５−ショート［ｌ２Ｊ
）−４−ヒドロキシフェニル〕プロピオニル基である請
求項４記載のヨードの放射性同位元素標識２４Ｒ，２５
−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体。 （７）被験液に、式 （式中、ＲＪ　２　＋　　ＲＺ　２は何れか一方が水酸
基で他方が−ｏ−ｃｏ−Ｒ３−ＮＨ−Ｒ５を示し、Ｒ３
は炭素数１〜１０のアルキレン基、Ｒ５はヨードの放射
性同位元素を有する残基を示す）で表されるヨードの放
射性同位元素標識２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ、誘導体。 （５）ヨードの放射性同位元素が、１′夏である請求項
４記載のヨードの放射性同位元素標識２４Ｒ２２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ３誘導体。 （式中、ＲＪＪ、ｌ　Ｒ２２は何れか一方が水酸基で他
方が−ＯＣｏ　　Ｒ３ＮＨＲ５を示し、Ｒ３しま炭素数
１〜１０のアルキレン基、Ｒ２はヨードの放射性同位元
素を有する残基を示す）で表されるヨードの放射性同位
元素標ｍ２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と２
４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体またはビタ
ミンＤバインディングプロティン（ＤＢＰ）と反応せし
めて生成する該ヨードの放射性同位元素標識２４Ｒ，２
５ジヒドロキシビタミンＤ３誘１体−２４Ｒ，２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ３抗体結合体または該ヨードの放
射性同位元素標識２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ３誘導体−ビタミンＤバインディングプロティン結合
体と未反応該ヨードの放射性同位元素標識２４Ｒ，２５
−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体と分離し、次いで分
離したいずれか一方の放射性同位元素である標識ヨード
の量を定量することを特徴とする該被験液中の２４Ｒ５
２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の定量法。」以上 手続補正書 １、事件の表示 昭和　６３年　特許願　第２５１６６１号２、発明の名
称 新規な２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体
及びその製造法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三福６３２番地の１名称　東
洋醸造株式会社 ４、代理人　〒１７０ 東京都豊島区北大塚２−２５−１ ５、補正の対象 平成１年１１月１０日付提出の手続補正書の６、補正の
内容 手続補正書第６ページ（２４）の項を下記のように訂正
する。 明細書第４７真上から１０行目「β−０−（３（Ｎ−」
とあるを［β−（３−（Ｎ−Ｊと訂正する。 以上

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２は何れか一方が水酸基で他方が
   −Ｏ−ＣＯ−Ｒ＿３−ＮＨ＿２を示し、Ｒ＿３は炭素数
   １〜１０のアルキレン基を示す）で表される新規な２４
   Ｒ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３アミノ酸誘導体
   。
2. （２）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２は何れか一方が水酸基で他方が
   −Ｏ−ＣＯ−Ｒ＿３−ＮＨ−Ｒ＿４を示し、Ｒ＿３は炭
   素数１〜１０のアルキレン基、Ｒ＿４はアミノ保護基を
   示す）で表される２４Ｒ、２５−ジヒドロキシビタミン
   Ｄ＿３誘導体を、塩基存在の不活性溶媒中でアミノ保護
   基を脱離せしめることを特徴とする、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２は何れか一方が水酸基で他方が
   −Ｏ−ＣＯ−Ｒ＿３−ＮＨ＿２を示し、Ｒ＿３は炭素数
   １〜１０のアルキレン基を示す）で表される新規な２４
   Ｒ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３アミノ酸誘導体
   の製造法。
3. （３）アミノ保護基が、９−フルオレニルメチルオキシ
   カルボニル基である請求項２記載の製造方法。
4. （４）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２は何れか一方が水酸基で他方が
   −Ｏ−ＣＯ−Ｒ＿３−ＮＨ−Ｒ＿５を示し、Ｒ＿３は炭
   素数１〜１０のアルキレン基、Ｒ＿５はヨードの放射性
   同位元素を有する残基を示す）で表されるヨードの放射
   性同位元素標識２４Ｒ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ
   ＿３誘導体。
5. （５）ヨードの放射性同位元素が、＾１＾２＾５Ｉであ
   る請求項４記載のヨードの放射性同位元素標識２４Ｒ、
   ２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３誘導体。
6. （６）ヨードの放射性同位元素を有する残基が、３−（
   ４−ヒドロキシ−３−ヨード〔＾１＾２＾５Ｉ〕−フェ
   ニル）プロピオニル基又は３−（３，５−ジョード〔＾
   １＾２＾５Ｉ〕−４−ヒドロキシフェニル〕プロピオニ
   ル基である請求項４記載のヨードの放射性同位元素標識
   ２４Ｒ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３誘導体。
7. （７）被検液に、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２は何れか一方が水酸基で他方が
   −Ｏ−ＣＯ−Ｒ＿３−ＮＨ−Ｒ＿５を示し、Ｒ＿３は炭
   素数１〜１０のアルキレン基、Ｒ＿５はヨードの放射性
   同位元素を有する残基を示す）で表されるヨードの放射
   性同位元素標識２４Ｒ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ
   ＿３と２４Ｒ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３抗体
   またはビタミンＤバインディグプロテイン（ＤＢＰ）と
   反応せしめて生成する該ヨードの放射性同位元素標識２
   ４Ｒ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３誘導体−２４
   Ｒ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３抗体結合体また
   は該ヨードの放射性同位元素標識２４Ｒ、２５−ジヒド
   ロキシビタミンＤ＿３誘導体−ビタミンＤバインディン
   グプロテイン結合体と未反応該ヨードの放射性同位元素
   標識２４Ｒ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３誘導体
   と分離し、次いで分離したいずれか一方の放射性同位元
   素である標識ヨードの量を定量することを特徴とする該
   被検液中の２４Ｒ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３
   の定量法。