JP2017537331A - ビタミンｄの測定法 - Google Patents

Abstract

本発明は、２５−ヒドロキシビタミンＤのｉｎ ｖｉｔｒｏ測定法であって、潜在的に干渉性である化合物、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３に特異的に結合し、そして２５−ヒドロキシビタミンＤに結合しない結合剤によってブロッキングする、前記方法に関する。

Description

本発明は、２５−ヒドロキシビタミンＤの測定のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法に関し、ここで潜在的干渉化合物である２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３を、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に特異的に結合し、そして２５−ヒドロキシビタミンＤに結合しない結合剤によってブロッキングする。

背景情報
ビタミンＤの適切な供給は、用語「ビタミン」がすでに示唆するように、生命維持に必要である。ビタミンＤ欠損は、くる病または骨粗鬆症などの深刻な疾患を導く。ビタミンＤは、前世紀の初めには、まだ、単一の物質と見なされていたが、ビタミンＤ系は、ここ数十年のうちに、ビタミンＤ代謝物の複雑でそして多様なネットワークに変化してきた。現在、４０を超える異なるビタミンＤ代謝産物が知られている（Ｚｅｒｗｅｋｈ， Ｊ．Ｅ．， Ａｎｎ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５１（２００４）２７２−２８１）。

ヒトは、皮膚に対する日光由来の紫外線の作用によってしか、Ｄ_３ビタミンまたはカルシフェロールを産生できない。血中で、ビタミンＤ_３は、いわゆるビタミンＤ結合タンパク質に結合し、そして肝臓に輸送されて、２５−ヒドロキシル化によって、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３に変換される。すでに言及した２つの臓器である皮膚および肝臓に加えて、現在では、複数の他の組織が、ビタミンＤ代謝に関与することが知られる（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｇａｙｋ， Ｈ．ら（監修）， “Ｃａｌｃｉｕｍ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅｓ， ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｎｄ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ”， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ （１９９０） ｐｐ． ２４−４７）。２５−ヒドロキシビタミンＤ、そしてより具体的には、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および２５−ヒドロキシビタミンＤ_３は、その量に関して、ヒト生物におけるビタミンＤの中心的な保存型である。必要な場合、これらの前駆体を腎臓において変換させて、生物学的に活性である１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、いわゆるＤホルモンを形成することも可能である。生物学的活性ビタミンＤは、とりわけ、腸からのカルシウム取り込み、骨ミネラル化を制御し、そして非常に多数の他の代謝経路、例えばインスリン系などに影響を及ぼす。

ビタミンＤレベル自体の測定は、被験体または患者のビタミンＤ状態を決定する際にほとんど有益ではなく、これは、ビタミンＤ（ビタミンＤ_２およびビタミンＤ_３）の濃度が、食品摂取または日光への曝露に応じて大きく変動するためである。さらに、ビタミンＤは、循環中（２４時間）、比較的短い生物学的半減期を有し、そしてまたこのため、患者のビタミンＤ状態を決定するために適切なパラメータではない。同じことが、ビタミンＤの生理学的活性型（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ）にも当てはまる。これらの生物学的活性型はまた、２５−ヒドロキシビタミンＤに比較して、比較的少量で、そして非常に増減する濃度で存在する。これらの理由すべてのため、特に、２５−ヒドロキシビタミンＤの定量化は、被験体または患者の総ビタミンＤ状態を全体的に分析するために適切な手段である。

２５−ヒドロキシビタミンＤのようなビタミンＤ代謝物は、ビタミンＤ結合タンパク質に高アフィニティで結合し、そしてまた、限定される度合いでアルブミンおよびいくつかのリポタンパク質にも結合する。ビタミンＤ結合タンパク質からビタミンＤ代謝物を放出させるのに適した方法は、通常の状況下で、任意の他のタンパク質からもまた、ビタミンＤ代謝物を放出させるために十分に適切であろう。

２５−ヒドロキシビタミンＤまたは他のビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質への結合は、ビタミンＤ化合物の決定を非常に複雑にする。すべての既知の方法は、分析されるビタミンＤ化合物がビタミンＤ結合タンパク質と形成する複合体から放出されるかまたは脱離していることを必要とする。以下で、これは、単純化のため、ビタミンＤ結合タンパク質からのビタミンＤ化合物の放出と称されるが、もちろん、これは、ビタミンＤ化合物およびビタミンＤ結合タンパク質の複合体からのみ放出可能であり、そしてビタミンＤ結合タンパク質のみからではない。

ビタミンＤ結合タンパク質は、酸性ｐＨではアンフォールディングするが、ｐＨが中性条件にシフトバックすると、正しく再フォールディングし、そして分析物に再結合する高い傾向を有する。したがって、ビタミンＤ結合タンパク質からビタミンＤ化合物をまず放出させ、そして次いで、ビタミンＤ結合タンパク質を、分析しようとするビタミンＤ化合物から分離することがしばしば必要である。

２５−ヒドロキシビタミンＤは臨床的に非常に重要であるため、２５−ヒドロキシビタミンＤが多かれ少なかれ信頼性を持って決定されることを可能にする多くの方法が文献から知られる。

例えば、Ｈａｄｄａｄ， Ｊ．Ｇ．ら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ３３ （１９７１）９９２−９９５、およびＥｉｓｍａｎ， Ｊ．Ａ．ら， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８０ （１９７７）２９８−３０５は、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いた、血液試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ濃度決定を記載する。

２５−ヒドロキシビタミンＤ決定のための他のアプローチは、とりわけ、ミルク中に存在するものなどのビタミンＤ結合タンパク質の使用に基づく。したがって、Ｈｏｌｉｃｋ， Ｍ．Ｆ．およびＲａｙ， Ｒ．（ＵＳ ５，９８１，７７９）、ならびにＤｅＬｕｃａら（ＥＰ ０ ５８３ ９４５）は、ヒドロキシビタミンＤおよびジヒドロキシビタミンＤに関するビタミンＤアッセイであって、これらの物質のビタミンＤ結合タンパク質への結合に基づき、これらの物質の濃度を、競合試験法によって決定する、前記アッセイを記載する。しかし、この方法の前提条件は、決定しようとするビタミンＤ代謝物がまず、元来の血液または血漿試料から単離されなければならず、そして例えばクロマトグラフィによって精製されなければならないことである。

Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ， Ｆ．Ｐ．ら（ＷＯ ９９／６７２１１）は、ビタミンＤ決定のために、エタノール沈殿によって、血清または血漿試料を調製しなければならないと解説する。この方法において、タンパク質沈殿物は、遠心分離によって除去され、そしてエタノール性上清は可溶性のビタミンＤ代謝物を含有する。これらを競合結合アッセイにおいて測定可能である。

あるいは、ＥＰ ０ ７５３ ７４３は、過ヨウ素酸塩を用いて、血液または血清試料からタンパク質を分離可能であると解説する。この場合、ビタミンＤ化合物を、過ヨウ素酸で処理した試料由来のタンパク質フリーの上清において決定する。いくつかの商業的試験において、血清または血漿試料の抽出には、アセトニトリルが推奨される（例えばＤｉａＳｏｒｉｎのラジオイムノアッセイにおいて、または「Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ」社のビタミンＤ試験において）。

近年、原理的には、試料中に存在するいずれの結合タンパク質からもビタミンＤ化合物を放出させるために適しているはずのいくつかの異なる放出試薬が提唱された。しかし、この放出または脱離は、比較的穏やかな条件下で行わなわれ、したがって、結合試験において、放出試薬で処理した試料を直接使用することを可能にしなければならない（例えば、ＷＯ ０２／５７７９７およびＵＳ ２００４／０１３２１０４）。近年の非常な努力にもかかわらず、ビタミンＤを決定するために利用可能なすべての方法は、労力を要する試料調製、不十分な標準化、試験法間の不十分な一致またはスパイク処理したビタミンＤの回収不良のような欠点を有する（これに関しては、特に、Ｚｅｒｗｅｋｈ， Ｊ．Ｅ、上記を参照されたい）。

ＵＳ ７，０８７，３９５において、金属水酸化物、ならびにシクロデキストリンおよびその誘導体、および金属サリチル酸塩が、ビタミンＤ結合タンパク質からビタミンＤ化合物を放出させるために用いられ、これは、ビタミンＤ結合タンパク質または他の血清タンパク質の不可逆的な変性を生じる。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００またはＴｗｅｅｎ−２０のような界面活性剤が、変性後、ビタミンＤ化合物が、試料中の脂質およびタンパク質に非特異的に付着することを防ぐために用いられてきている。

ビタミンＤ化合物に関する試験を自動化することは特に困難である。自動化のためには、非常に困難な問題を解決しなければならず、すなわち綱渡りを切り抜けなければならない：一方で、適切な放出試薬の助けをかりてビタミンＤ結合タンパク質からビタミンＤ化合物を放出する必要があり、他方で、試料がさらに直接分析可能であるような条件を選択しなければならない。この直接のさらなる分析の前提条件は、一方で、内因性ビタミンＤ結合タンパク質が、この分析中にビタミンＤ化合物に結合しないかまたは有意な度合いには結合せず、そしてしたがって、この分析に干渉せず、そしてもう一方で、用いる放出試薬が、検出試薬、例えば抗体、またはビタミンＤ結合タンパク質の結合に干渉しないことである。さらに、ヒトにおいては、生化学的に異なって振る舞うビタミンＤ結合タンパク質の異なるアレルが存在することが知られる。ビタミンＤ化合物の放出および測定は、多様なアレル／表現型に関して同等でなければならない。

近年（ＷＯ２０１１／１４４６６１）、適切な試薬処理を用いるビタミンＤアッセイは、オンラインで、そして試料中に存在しうるいずれのビタミンＤ結合タンパク質も沈殿／分離せずに、実行可能である。この方法は、炭酸水素塩および／または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を放出可能な物質、これらの総濃度は０．１Ｍ〜２．０Ｍである、還元剤、およびアルカリ化剤を含有するビタミンＤ放出試薬の使用に基づく。この放出試薬を用いることによって、いずれのビタミンＤ化合物もビタミンＤ結合タンパク質から放出され、一方、同時に、試料中に含まれるビタミンＤ結合タンパク質が不活性化され、そしてもはやビタミンＤに結合しない。放出されたビタミンＤ化合物を適切な手段によって測定可能である。

生物学的試料において、互いに構造的に緊密に関連する、多くのビタミンＤ関連化合物が存在する。２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３は、ほぼすべての生物学的試料において、非常に有意な量で存在し、そして２５−ヒドロキシビタミンＤの測定に干渉する。その濃度は、試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤの総量に、ならびに個体の臨床的背景に依存しており、異なる医学的背景を持つ患者コホート間の変動を導く。２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合し、そして２５−ヒドロキシビタミンＤに結合しない結合剤と試料をインキュベーションすることによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３によって引き起こされる干渉が回避可能であることを示すことが可能であった。

発明の概要
１つの態様において、本発明は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）被験体から得た試料を提供し、
ｂ）試料を
（ｂａ）２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤と混合し、それによって、第一の結合剤および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の間の複合体を形成し；
（ｂｂ）２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤と混合し、それによって第二の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤの間の複合体を形成し；
ｃ）（ｂｂ）において形成された複合体を測定し、それによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定する
工程を含む、前記方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するための、本発明にしたがった方法の使用に関する。

本発明はさらに、１つの態様において、被験体から得た試料において、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するための本発明にしたがったｉｎ ｖｉｔｒｏ法における、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤の使用に関する。

さらなる態様にしたがって、本発明は、
ａ）モノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の機能的活性部分である、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤、および
ｂ）ビタミンＤ結合タンパク質である、２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤
を少なくとも含む、本発明にしたがった方法を実行するためのキットに関する。

図１は、７｛２−［２−（２−｛（Ｓ）−３−［２−［（１Ｒ，７ａＲ）−１−（（Ｒ）−４，５−ジヒドロキシ−１，５−ジメチル−ヘキシル）−７ａ−メチル−オクタヒドロ−インデン−（４Ｅ）−イリデン］−エト−（Ｚ）−イリデン］−４−メチレン−シクロヘキシルオキシカルボニルアミノ｝−エトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−ヘプタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（酸のＮＨＳエステル）の化学構造を示す。 図２は、試薬Ｒ１中に、ブロッキング剤（第一の結合剤）をそれぞれ含まないまたは含むＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビタミンＤ総イムノアッセイを示す。２５−ヒドロキシビタミンＤ_３（○、２５（ＯＨ）Ｄ_３）；２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（●、２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３）。図２ａは、ブロッキング試薬（第一の結合剤）、ｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞ｒＫ−ＩｇＧを含まない結果を示す。 図２は、試薬Ｒ１中に、ブロッキング剤（第一の結合剤）をそれぞれ含まないまたは含むＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビタミンＤ総イムノアッセイを示す。２５−ヒドロキシビタミンＤ_３（○、２５（ＯＨ）Ｄ_３）；２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（●、２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３）。図２ｂは、干渉除去のため、ブロッキング試薬（第一の結合剤）、ｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞ｒＫ−ＩｇＧ（ｍＡｂ＜２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３＞）を含む結果を示す。 ２つの異なる試料セットに関して、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビタミンＤ総イムノアッセイおよびＬＣ−ＭＳビタミンＤ測定の間の相関を図３ａおよび３ｂに示す。ブロッキング試薬なし（○、第一の結合剤を含まない）およびブロッキング試薬を含む（●、第一の結合剤を含む）。 ２つの異なる試料セットに関して、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビタミンＤ総イムノアッセイおよびＬＣ−ＭＳビタミンＤ測定の間の相関を図３ａおよび３ｂに示す。ブロッキング試薬なし（○、第一の結合剤を含まない）およびブロッキング試薬を含む（●、第一の結合剤を含む）。

本発明は、２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する結合剤の存在下で、２５−ヒドロキシビタミンＤの総量および／または濃度を決定するための方法、ならびにそれに関連するキット、組成物および使用に関する。

１つの態様において、本発明は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）被験体から得た試料を提供し、
ｂ）試料を
（ｂａ）２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤と混合し、それによって、第一の結合剤および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の間の複合体を形成し；
（ｂｂ）２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤と混合し、それによって第二の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤの間の複合体を形成し；
ｃ）（ｂｂ）において形成された複合体を測定し、それによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定する
工程を含む、前記方法に関する。

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、１または１より多い（すなわち少なくとも１つの）冠詞の文法的目的語を指すために用いられる。
表現「１またはそれより多く」は、１〜５０、好ましくは１〜２０、やはり好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または１５を示す。

用語「検出」は、分析物の量および／または濃度を決定するための、試料における分析物の定性的または定量的検出、本明細書において、２５−ヒドロキシビタミンＤなどの分析物の測定を指す。「検出」には、直接および間接的検出を含む、検出の任意の手段が含まれる。

用語「決定する」は、本明細書において、試料における分析物の定性的および定量的検出の両方に関して用いられ、そしてこれには、分析物の量および／または濃度の決定が含まれうる。該用語はまた、物理的パラメータに基づく、分析物の同定および／または任意の特徴付けも含む。

別に言及されない限り、用語「２５−ヒドロキシビタミンＤ」または「ビタミンＤ化合物」は、以下の構造式ＩおよびＩＩにしたがう、ビタミンＤ_２の骨格、またはビタミンＤ_３の骨格を含有する、すべての天然に存在する化合物を含むと理解されるものとする。

式Ｉ

式ＩＩ

構造式ＩおよびＩＩにおいて、ビタミンＤの位は、ステロイド命名法にしたがって言及される。２５−ヒドロキシビタミンＤは、構造式ＩおよびＩＩの２５位でヒドロキシル化されているビタミンＤ代謝物、すなわち２５−ヒドロキシビタミンＤ_２ならびに２５−ヒドロキシビタミンＤ_３を示す。さらなる既知のヒドロキシビタミンＤ化合物は、例えば１，２５−ジヒドロキシビタミンＤおよび２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ型である。

１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、構造式ＩおよびＩＩの１位ならびに２５位にヒドロキシル化を有するビタミンＤの活性型（いわゆるＤホルモン）を指す。
他の周知のビタミンＤ化合物は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３および３−エピ−２５−ジヒドロキシビタミンＤである。

本発明にしたがった１つの態様において、２５−ヒドロキシビタミンＤは、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３および３−エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤからなる群より選択される。好ましい態様において、２５−ヒドロキシビタミンＤは、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および２５−ヒドロキシビタミンＤ_３からなる群より選択される。

２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３は、ほぼすべての生物学的試料にかなり大量に存在し、そして２５−ヒドロキシビタミンＤの測定に干渉する。その濃度は、試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤの総量、ならびに個体の臨床的バックグラウンドに依存し、異なる医学的バックグラウンドを持つ患者コホート間の変動を導く。２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合し、そして２５−ヒドロキシビタミンＤに結合しない結合剤と、試料をインキュベーションすることによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３によって引き起こされる干渉を回避可能であることが示されることが可能であった。

別に言及しない限り、用語「２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ」は、ビタミンＤ_３の骨格、ならびに以下の構造式ＩＩＩにしたがって、炭素原子２４および２５に、それぞれＯＨ基を含有する、すべての天然に存在する化合物を含むと理解されるものとする。本発明にしたがった態様において、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（２４（Ｒ），２５−（ＯＨ）_２Ｄ_３）である。

式ＩＩＩ

分析物（例えば２５−ヒドロキシビタミンＤ、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３）を含む試料は、液体、ゲルまたは液化可能組成物、好ましくは液体であってもよい。こうした液体は、溶液、懸濁物またはエマルジョンであってもよい。特に、試料は、生物学的試料、特にヒトまたは動物から得られる体性試料、あるいはその混合物である。こうした体性試料を、被験体から回収した後、直接用いてもよいし、または意図する時点で本発明の方法を実行するために、適切な条件下で、例えば凍結によって保存してもよい。特に、被験体を比較するかまたは療法を監視するため、多様な被験体および／または異なる時点に由来する試料を測定してもよい。体性試料の回収は、試料に応じて、当業者によって実行可能である。好ましい態様において、試料は、血液、血清または血漿である。さらにさらなる態様において、試料は血液または血清である。こうした場合、血液を被験体から採取する。当該技術分野に知られる方法によって血液から血清を得ることも可能である。同様に、他の体性試料は、例えば尿を収集することによって、または生検を採取することによって、そして必要であれば試料をさらに処理することによって、得てもよい。

上述のように、試料は、それぞれ、分析物２５−ヒドロキシビタミンＤおよび２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３を含む。
「結合対メンバー」は、結合対（「ｂｐ」）のメンバーを指し、これは、分子の１つが、第二の分子と、化学的または物理的手段を通じて結合する、２つの異なる分子を意味する。抗原および抗体結合対メンバーに加えて、他の結合対には、限定なしの例として、ビオチンおよびアビジン、炭水化物およびレクチン、相補的ヌクレオチド配列、相補的ペプチド配列、エフェクターおよび受容体分子、酵素補因子および酵素、酵素阻害剤および酵素、ペプチド配列または化学部分（例えばジゴキシン／抗ジゴキシン）および該配列、化学部分または全タンパク質に特異的な抗体、ポリマー性酸および塩基、色素および対応するタンパク質結合剤、ペプチドおよび特異的タンパク質結合剤（例えばリボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプチドおよびリボヌクレアーゼＳ−タンパク質）、金属およびそのキレ−ター、アプタマー等が含まれる。さらに、結合対には、元来の結合メンバーの類似体、例えば分析物類似体、または例えば組換え技術または分子操作によって作製される、元来の結合対メンバーに類似であり、そして同じ結合特性を有する結合メンバーが含まれうる。

結合パートナーメンバーは、これらの両方が結合対の相補的メンバーへの結合と同じ方式で結合可能であるならば、結合対メンバーと類似である。こうした結合対メンバーは、例えば標識リガンドまたは標識受容体を提供するための基によって、少なくとも１つの水素原子が置換されることによって修飾されている、例えばリガンドまたは受容体のいずれかであってもよい。結合対メンバーは、分析物に、または分析物に相補的である結合対メンバーに、類似であってもよい。

「結合剤」は、結合対のもう一方のメンバー、対応するターゲット分子、例えば２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する、結合対（「ｂｐ」）のメンバーである。結合剤のアフィニティ（Ｋ_ｄ）は、対応するターゲット分子に対して、１０^−７ｍｏｌ／Ｌである。結合剤は、好ましくは、１０^−８ｍｏｌ／Ｌのアフィニティを有する。さらに好ましい結合剤は、そのターゲット分子に対して、１０^−９ｍｏｌ／Ｌのアフィニティを有する。さらにより好ましくは、結合剤は、そのターゲット分子に対して、１０^−１０ｍｏｌ／Ｌのアフィニティを有する。

当業者が認識するであろうように、用語、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する「第一の結合剤」は、試料中に存在する他の生体分子が、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に特異的な結合剤に有意には結合しないことを示すよう用いられる。好ましくは、ターゲット分子以外の生体分子に対する特異的結合剤の結合レベルは、ターゲット分子に対するアフィニティの、それぞれ、わずか１０％またはそれ未満、好ましくはわずか５％またはそれ未満の結合アフィニティを生じる。２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する好ましい第一の結合剤は、アフィニティに関する、ならびに特異性に関する、上記の最低限の基準のどちらも満たすであろう。

本発明にしたがった「第一の結合剤」は、１つの態様において、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および合成抗体（プラスチック抗体）からなる群より選択され、それぞれ、好ましくはモノクローナル抗体または合成抗体であり、さらに好ましくはモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の機能的活性部分である。第一の結合剤は、１つの態様において、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤに結合し、さらに好ましくは、第一の結合剤は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する。好ましくは、抗体は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合するモノクローナル抗体である。さらに好ましくは、抗体は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合するプラスチック抗体である。

「プラスチック抗体」は、本発明にしたがって、抗体様機能を持つ合成ポリマーナノ粒子である（Ｈｏｓｈｉｎｏ， Ｙ．ら， Ｊ． Ｍａｔｅｒ． Ｃｈｅｍ．， ２０１１， ２１， ３５１７−３５２１）。本発明にしたがったプラスチック抗体は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に特異的に結合し、そしてこれを中和することが可能である。

本発明にしたがった「第二の結合剤」は、１つの態様において、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶｉｔＤ−ＢＰ）、あるいは２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する抗体または該抗体の機能的活性部分である。さらに好ましくは、第二の結合剤は、ビタミンＤ結合タンパク質であり、好ましくは組換えビタミンＤ結合タンパク質である。さらにさらなる態様において、第二の結合剤は、ビタミンＤ結合タンパク質の機能的活性部分、好ましくはビタミンＤ結合タンパク質のドメインＩである。

本発明の例において、抗体ｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞ｒＫ−ＩｇＧは、第一の結合剤として成功裡に用いられた。好ましい態様において、第一の結合剤は、ｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞ｒＫ−ＩｇＧである。

天然に存在する抗体は、基本構造を共有する、免疫グロブリンとしても知られる球状血漿タンパク質である（〜１５０ｋＤａ（ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｄａｌｔｏｎ＿ｕｎｉｔ））。これらはアミノ酸残基に付加された糖鎖を有するため、糖タンパク質である。各抗体の基本機能単位は、免疫グロブリン（Ｉｇ）単量体（１つのＩｇ単位のみを含有する）であり；分泌抗体はまた、ＩｇＡのように２つのＩｇ単位を持つ二量体、硬骨魚ＩｇＭのように４つのＩｇ単位を持つ四量体、または哺乳動物ＩｇＭのように５つのＩｇ単位を持つ五量体であることも可能である。本発明において、適切な形式の例には、天然に存在する抗体の形式が含まれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭとして知られる抗体アイソタイプが含まれる。

Ｉｇ単量体は、４つのポリペプチド鎖からなる「Ｙ」型分子であり；２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖が、システイン残基間のジスルフィド結合によって連結される。各重鎖は、長さ約４４０アミノ酸であり；各軽鎖は、長さ約２２０アミノ酸である。重鎖および軽鎖は各々、そのフォールディングを安定化させる鎖間ジスルフィド結合を含有する。各鎖は、Ｉｇドメインと呼ばれる構造ドメインで構成される。これらのドメインは、約７０〜１１０アミノ酸を含有し、そしてそのサイズおよび機能にしたがって、異なるカテゴリーに分類される（例えば可変またはＶ、および定常またはＣ）。これらは特徴的な免疫グロブリンフォールドを有する、そこでは、保存されるシステインおよび他の荷電アミノ酸間の相互作用によって共に保持される「サンドイッチ」形状を、２つのベータシートが作り出す。

α、δ、ε、γ、およびμによって示される哺乳動物Ｉｇ重鎖の５つのタイプがある。存在する重鎖のタイプは、抗体のアイソタイプを定義する；ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ抗体には、それぞれ、これらの鎖が見出される。

別個の重鎖は、サイズおよび組成が異なる；αおよびγは、およそ４５０アミノ酸を含有し、そしてδはおよそ５００アミノ酸を含有する一方、μおよびεはおよそ５５０アミノ酸を有する。各重鎖は、２つの領域、定常領域（ＣＨ）および可変領域（ＶＨ）を有する。１つの種において、定常領域は、同じアイソタイプのすべての抗体において同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。重鎖γ、αおよびδは、３つのタンデムＩｇドメインで構成される定常領域、および与えられる柔軟性のためのヒンジ領域を有し；重鎖μおよびεは、４つの免疫グロブリンドメインで構成される定常領域を有する。重鎖の可変領域は、異なるＢ細胞によって産生される抗体で異なるが、単一のＢ細胞またはＢ細胞クローンによって産生されるすべての抗体に関しては同じである。各重鎖の可変領域は、長さおよそ１１０アミノ酸であり、そして単一のＩｇドメインで構成される。

哺乳動物においては、λおよびκによって示される２つのタイプの免疫グロブリン軽鎖がある。軽鎖は、２つの連続ドメイン：１つの定常ドメイン（ＣＬ）および１つの可変ドメイン（ＶＬ）を有する。軽鎖のおよその長さは、２１１〜２１７アミノ酸である。各抗体は、常に同一である２つの軽鎖を含有し；哺乳動物においては、抗体あたり１つのみのタイプの軽鎖、κまたはλが存在する。軽鎖の他のタイプ、例えばι鎖は、より低次の脊椎動物、軟骨魚類および硬骨魚類に見られる。

天然に存在する抗体に加えて、抗体断片を含む人工的抗体形式が開発されてきている。これらのいくつかを以下に記載する。
すべての抗体の一般的な構造は非常に類似するが、所定の抗体のユニークな特性は、上述のような可変（Ｖ）領域によって決定される。より具体的には、可変ループ、各軽鎖（ＶＬ）の３つおよび重鎖（ＶＨ）上の３つが、抗原への結合に関わる、すなわち抗原特異性に関わる。これらのループは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。ＶＨおよびＶＬドメイン両方に由来するＣＤＲが抗原結合部位に寄与するため、最終的な抗原特異性を決定するのは、重鎖および軽鎖の組み合わせであり、そしてどちらか一方ではない。

したがって、用語「抗体」は、本明細書において、天然に存在する抗体に構造的類似性を有し、そしてそれぞれのターゲットに対して特異的に結合可能である、任意のポリペプチドを意味し、結合特異性はＣＤＲによって決定される。したがって、「抗体」は、それぞれのターゲットに結合する、免疫グロブリン由来構造に関するように意図される、限定されるわけではないが、全長または全抗体、抗原結合断片（物理的にまたは概念的に、抗体構造に由来する断片）、前述のいずれかの誘導体、キメラ分子、前述のいずれかと別のポリペプチドの融合体、あるいはそれぞれのターゲットに選択的に結合する任意の代替構造／組成物が含まれる。抗体またはその機能的活性部分は、少なくとも１つの抗原結合性断片を含む、任意のポリペプチドであってもよい。抗原結合性断片は、両方のドメインがともに、特異的抗原に結合可能である方式で配置された、少なくとも重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインからなる。「それぞれのターゲット」は、捕捉分子、結合分子および検出分子の場合には分析物であり、そして好ましい捕捉分子としての抗イディオタイプ抗体の場合には結合分子である。

「全長」または「完全」抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含み；（１）重鎖に関しては、可変領域、ならびに３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む重鎖定常領域；ならびに（２）軽鎖に関しては、軽鎖可変領域、および１つのドメインＣＬを含む軽鎖定常領域を含む、タンパク質を指す。用語「完全抗体」に関しては、天然に存在する抗体の典型的な全体ドメイン構造を有し（すなわち３または４の定常ドメインの重鎖および１つの定常ドメインの軽鎖ならびにそれぞれの可変ドメインを含む）、各ドメインは、突然変異、欠失、または挿入のような、全体のドメイン構造を変化させないさらなる修飾を含んでもよい。

「抗体の機能的活性部分」または「抗体断片」はまた、上に定義するような少なくとも１つの抗原結合性断片を含有し、そして機能的活性部分（または断片）が由来する完全抗体と本質的に同じ機能および結合特異性を示す。パパインでの限定タンパク質分解的消化は、Ｉｇプロトタイプを３つの断片に切断する。各々、１つの全Ｌ鎖およびほぼ半分のＨ鎖を含有する２つの同一のアミノ末端断片は、抗原結合性断片（Ｆａｂ）である。サイズが同様であるが、両方の重鎖のカルボキシル末端側の半分を含有し、鎖間ジスルフィド結合を有する、第三の断片は、結晶化可能断片（Ｆｃ）である。Ｆｃは、炭水化物、補体結合性、およびＦｃＲ結合性部位を含有する。限定ペプシン消化は、両方のＦａｂ片、およびＨ−Ｈ鎖間ジスルフィド結合を含むヒンジ領域を含有する、単一のＦ（ａｂ’）２断片を生じる。Ｆ（ａｂ’）２は、抗原結合に関して二価である。Ｆ（ａｂ’）２のジスルフィド結合は、Ｆａｂ’を得るために切断可能である。さらに、重鎖および軽鎖の可変領域をともに融合させて、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を形成することも可能である。

完全サイズの抗体の第一世代は、いくつかの問題を提示したため、第二世代抗体の多くは、抗体の断片のみを含む。可変ドメイン（Ｆｖ）は、１つのＶＬおよび１つのＶＨからなる損なわれていない（インタクト）抗原結合ドメインを含む最小断片である。結合ドメインしか含まないこうした断片は、酵素的アプローチまたは関連遺伝子断片の例えば細菌および真核細胞における発現によって生成できる。異なるアプローチ、例えばＦｖ断片のみ、またはＦｖに加えて第一の定常ドメインを含む「Ｙ」の上部アームの１つを含む’Ｆａｂ’断片を用いてもよい。これらの断片は、通常、２つの鎖間にポリペプチド連結を導入することによって安定化され、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の産生を生じる。あるいは、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｄｓＦｖ）断片を用いてもよい。断片の結合ドメインは、任意の定常ドメインと組み合わせて全長抗体を生産してもよいし、または他のタンパク質およびポリペプチドと融合させてもよい。

組換え抗体断片は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片であり、これは、本発明にしたがった抗体の好ましい機能的活性部分である。一般的に、該断片は、その抗原に高いアフィニティを有し、そして多様な宿主において発現可能である。これらおよび他の特性によって、ｓｃＦｖ断片は、医学において適用可能であるだけでなく、バイオテクノロジー適用にも潜在能力を有する。上に詳述するように、ｓｃＦｖ断片において、ＶＨおよびＶＬドメインを親水性および柔軟性ペプチドリンカーで連結し、これによって、発現およびフォールディング効率が改善される。通常、約１５アミノ酸のリンカーを用い、このうち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーが最も頻繁に用いられてきている。ｓｃＦｖ分子は、用いるリンカーに応じて、タンパク質分解的に容易に分解されうる。遺伝子操作技術の発展とともに、これらの限界は、機能および安定性の改善に焦点を置いた研究によって実質的に克服可能であった。例は、ＶＨ−ＶＬ二量体が鎖間ジスルフィド結合によって安定化される、ジスルフィド安定化（またはジスルフィド連結）Ｆｖ断片の生成である。システインがＶＬおよびＶＨドメインのインターフェースに導入され、ジスルフィド架橋を形成し、これが２つのドメインをともに保持する。

ｓｃＦｖの解離は、単量体ｓｃＦｖを生じ、これは二量体（ディアボディ）、三量体（トリアボディ）またはより大きい凝集体、例えばＴａｎｄＡｂおよびフレキシボディに複合体化可能であり、これらもまた、本発明にしたがった抗体の機能的活性部分に相当する。

２つの結合ドメインを有する抗体を、単純なポリペプチド連結での２つのｓｃＦｖの結合を通じて（ｓｃＦｖ）２、または２つの単量体の二量体化を通じて（ディアボディ）のいずれかで生成可能である。最も単純な設計は、同じか、類似であるか（二価ディアボディ）または別個の抗原に対する特異性を有する（二重特異性ディアボディ）か、いずれであってもよい、２つの機能的抗原結合ドメインを有するディアボディである。これらの二重特異性抗体は、例えば、ターゲット細胞への新規エフェクター機能（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）の補充を可能にし、これによって、これらは医学における適用のために非常に有用になりうる。

また、重鎖の４つの可変ドメインおよび軽鎖の４つの可変ドメインを含む抗体形式が開発されてきている。これらの例には、四価二重特異性抗体（ＴａｎｄＡｂおよびフレキシボディ、Ａｆｆｉｍｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＡＧ、ドイツ・ハイデルベルグ）が含まれる。二重特異性ディアボディとは対照的に、二重特異性ＴａｎｄＡｂは、１つのポリペプチドのみからなるホモ二量体である。２つの異なる鎖のため、ディアボディは、３つの異なる二量体を構築しうるが、このうち１つしか機能しない。したがって、この均一な産物を産生し、そして精製するほうが、より単純であり、そしてより安価である。さらに、ＴａｎｄＡｂは、通常、より優れた結合特性（２倍の結合部位数を所持する）およびｉｎ ｖｉｖｏでの増加した安定性を示す。フレキシボディは、ｓｃＦｖとディアボディ多量体モチーフの組み合わせであり、細胞表面上の各々まったく離れた２つの分子を連結するために、高い度合いの柔軟性を持つ多価分子を生じる。２より多い機能的抗原結合ドメインが存在し、そしてこれらが別個の抗原に対する特異性を有する場合、抗体は多重特異性である。

要約すると、抗体またはその機能的活性部分に相当する特異的免疫グロブリンタイプには、限定されるわけではないが、以下の抗体が含まれる：Ｆａｂ（可変軽鎖（ＶＬ）、可変重鎖（ＶＨ）、定常軽鎖（ＣＬ）および定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインを含む一価断片）、Ｆ（ａｂ’）２（ヒンジ領域でジスルフィド架橋または代替によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）、Ｆｖ（ＶＬおよびＶＨドメイン）、ｓｃＦｖ（ＶＬおよびＶＨがリンカー、例えばペプチドリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ）、二重特異性抗体分子（本明細書に記載するような特異性を持つ抗体分子であって、限定なしに、別のペプチドまたはタンパク質、例えば抗体または受容体リガンドを含む、該抗体とは異なる結合特異性を有する第二の機能部分に連結された、前記抗体分子）、二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ（ＣＨ３に連結されたｓｃＦｖ）。

限定されるわけではないが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ分子またはドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ）を含む、特定の抗体分子またはその機能的活性部分を、ジスルフィド架橋を取り込んでＶＨおよびＶＬドメインを一列に並べることによって、安定化させることも可能である。慣用的技術、化学的産生またはハイブリッドハイブリドーマからの産生を含む特定の方法、ならびに限定されるわけではないが、ＢｉＴＥＴＭ技術（ペプチドリンカーを含む、異なる特異性の抗原結合領域を所持する分子）および穴内ノブ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）操作を含む他の技術を用いて、二重特異性抗体を産生することも可能である。

したがって、抗体分子またはその機能的活性部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、二価抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディまたはミニボディであってもよい。

別の好ましい態様において、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。モノクローナル抗体は、すべて単一の親細胞のクローンである１つのタイプの免疫細胞によって産生されるため、同一である単一特異性抗体である。キメラ抗体は、免疫原性を減少させるために、１つの種の免疫グロブリンの少なくとも１つの領域が、別の種の免疫グロブリンの別の領域に融合されている抗体である。例えば、ネズミＶＬおよびＶＨ領域を、ヒト免疫グロブリンの残りの部分に融合させてもよい。特定のタイプのキメラ抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲをコードするＤＮＡを、ヒト抗体産生ＤＮＡに融合させることによって産生される。次いで、生じたＤＮＡ構築物を用いて、ＣＤＲのみが非ヒトであるため、通常、非ヒト非経口抗体またはキメラ抗体ほどは免疫原性でない抗体を発現し、そして産生することも可能である。

本発明の好ましい態様において、本発明の方法において用いる抗体分子またはその機能的活性部分は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン、およびヒトＩｇＡ定常ドメインからなる群より選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。

本発明の抗体の文脈で上に詳述したように、天然に存在する抗体の各重鎖は、２つの領域、定常領域および可変領域を有する。哺乳動物免疫グロブリン重鎖の５つのタイプ：γ、δ、α、μ、およびεがあり、これらは、それぞれ、免疫グロブリンＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥのクラスを定義する。

ヒトにおいては４つのＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３および４）があり、これらは血清中の存在量にしたがって名付けられている（ＩｇＧ１が最も豊富である）。ＩｇＧサブクラスのＦｃ領域間には、約９５％の類似性があるが、ヒンジ領域の構造は比較的異なる。Ｆａｂアーム（断片抗原結合）ならびに両方の重鎖の２つのカルボキシ末端ドメインＣＨ２およびＣＨ３の間のこの領域が、分子の柔軟性を決定する。上部ヒンジ（アミノ末端寄り）セグメントは、Ｆａｂアーム間の角度の可変性（Ｆａｂ−Ｆａｂ柔軟性）ならびに各個々のＦａｂの回転柔軟性を可能にする。下部ヒンジ領域（カルボキシ末端寄り）の柔軟性は、Ｆｃ領域に対するＦａｂアームの位置を直接決定する（Ｆａｂ−Ｆｃ柔軟性）。ヒンジ依存性Ｆａｂ−ＦａｂおよびＦａｂ−Ｆｃ柔軟性は、補体活性化およびＦｃ受容体結合などのさらなるエフェクター機能を誘発する際に重要でありうる。したがって、ヒンジ領域の構造は、４つのＩｇＧクラス各々に、そのユニークな生物学的プロファイルを与える。

ヒンジ領域の長さおよび柔軟性は、ＩｇＧサブクラス間で多様である。ＩｇＧ１のヒンジ領域は、アミノ酸２１６〜２３１を含み、そして非常に柔軟であるため、Ｆａｂ断片は、対称軸の周りを回転し、そして２つの重鎖間ジスルフィド架橋の最初のものを中心にした球内を移動することが可能である。ＩｇＧ２は、ＩｇＧ１より短いヒンジを有し、１２アミノ酸残基および４つのジスルフィド架橋を有する。ＩｇＧ２のヒンジ領域はグリシン残基を欠き、比較的短く、そして追加の重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化される、固いポリプロリン二重らせんを含有する。これらの特性は、ＩｇＧ２分子の柔軟性を制限する。ＩｇＧ３は、ユニークな伸長ヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジより約４倍長い）によって他のサブクラスとは異なり、６２アミノ酸（２１プロリンおよび１１システインを含む）を含有し、柔軟性のないポリプロリン二重らせんを形成する。ＩｇＧ３において、Ｆａｂ断片は、Ｆｃ断片から比較的離れており、分子により高い柔軟性を与える。ＩｇＧ３の長いヒンジはまた、他のサブクラスに比較してより高いその分子量に関係する。ＩｇＧ４のヒンジ領域はＩｇＧ１のものより短く、そしてその柔軟性は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２のものの中間である。

ビタミンＤ結合タンパク質を第二の結合剤として用いる場合、このインキュベーション工程中のｐＨは、１つの態様において、好ましくは、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の間で選択される。

１つの態様において、第二の結合剤として、２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する抗体を用いる場合、このインキュベーション工程中のｐＨは、ｐＨ５〜ｐＨ８の間であり、好ましくは、このインキュベーション工程中のｐＨは、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５の間であろう。

特定の態様にしたがって、第一の結合剤は、モノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の機能的活性部分であり、そして第二の結合剤は、ビタミンＤ結合タンパク質または該ビタミンＤ結合タンパク質の機能的活性部分である。

さらなる態様において、第一の結合剤は、モノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の機能的活性部分であり、そして第二の結合剤は、モノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の機能的活性部分である。

やはりさらなる態様において、第一の結合剤は、ｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞または該モノクローナル抗体の機能的活性部分であり、そして第二の結合剤は、ｍＡｂ＜２５−ヒドロキシビタミンＤ＞または該モノクローナル抗体の機能的活性部分である。

本発明にしたがった１つの態様において、結合剤は、固定のための手段を所持し、そして固定に使用可能である。固定のための手段は、支持体、好ましくは固体支持体への、共有または非共有的結合を可能にしうる。

用語「固体支持体」または「固相」は、不均一な反応によって、液相中の試薬と相互作用する固相中の材料を指す。固体支持体の使用は、化学、生化学、薬学および分子生物学の分野において周知である。解決しようとする技術的問題に応じて、多くのタイプの固体支持体が開発されてきている。本発明の背景において、これらのうちのいずれを用いてもよい。例えば、本発明の方法において用いられる固体支持体には、シリカ、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、またはフッ化ポリビニリデン、あるいはその組み合わせの構成要素が含まれることも可能である。さらに適切な固体支持体には、限定されるわけではないが、調節孔ガラス、ガラスプレートまたはスライド、ポリスチレン、および活性化デキストランが含まれる。他の側面において、合成有機ポリマー、例えばポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、およびポリスチレンもまた、例示的な支持体表面である。さらに、多糖、例えばセルロースおよびデキストランが支持体表面をさらに例示する例である。他の支持体表面、例えば繊維もまた操作可能である。

例えばコンビナトリアルまたはタンパク質化学において用いられる一般的な樹脂支持体には、ポリスチレン樹脂、例えばジビニルベンゼンで架橋したもの；ヒドロキシメチルポリスチレン；アミノメチルポリスチレン；ＴｅｎｔａＧｌ樹脂（ＴＧ）およびＡｒｇｏＧｅｌ（ＡＧ）：ポリスチレン／ＤＶＢ−ポリ（エチレングリコール）グラフトコポリマー（ＰＳ−ＰＥＧ）−Ｂａｙｅｒ；Ｃｒｏｗｎｓ／Ｐｉｎｓ（ＣＰ）（放射グラフトポリエチレン／ポリプロピレン支持体）；Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ／ポリアクリルアミドに基づく樹脂（ＫＰＡ）；調節孔ガラス；ＰＥＧＡ−ポリ（エチレングリコール）／ジメチルアクリルアミドコポリマーが含まれる。

実体または支持体の、結合剤、例えばタンパク質または抗体への共有カップリングを可能にする官能基を含むよう修飾されたかまたは活性化された固体支持体を用いて、固体支持体への固定を達成することも可能である。典型的には、脂肪族リンカーアームを使用する。結合剤、特にタンパク質または抗体を、例えばイオン性または疎水性機構を通じて、表面に非共有的に付着させることも可能であり、そしてこれらの機構を局所的に阻害する放出剤によって脱離させる。さらに、結合剤、例えばタンパク質または抗体の、表面、例えばガラスまたは金属酸化物表面への共有付着は、表面をまずアミノシランで活性化することによって達成可能である。次いで、アミン反応性官能基で誘導体化した結合剤を表面に付着させることが可能である。支持体、特に固体支持体を、タンパク質、例えば酵素、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドで、１またはそれより多い付着部位を通じて、共有または非共有結合によって誘導体化して、それによって同じ酸を固体支持体に結合させることも可能である。

（固体）支持体は、容器中に含有されてもよく、容器はチューブ、例えば遠心管またはスピンチューブ、シリンジ、カートリッジ、チャンバー、マルチウェルプレート、または試験管、あるいはその組み合わせである。結合剤のリンカー仲介性結合を可能にするために、（固体）支持体を前処理するかまたは官能化することも可能である。１つの態様において、固体支持体は、通常、適切な接触を可能にする、繊維性または粒子状であってもよい。本発明の方法において使用するために適した（固体）支持体のサイズは、選択する方法にしたがって多様でありうる。第一の結合剤または第二の結合剤を、それぞれ、１つの（固体）支持体のみ（例えば１つの容器またはマルチウェルプレート）に結合させてもよいし、あるいは多数の（固体）支持体（例えばビーズ）に結合させてもよい。本発明の方法において使用するために適した（固体）支持体の形状は、例えば、シート、プレカット・ディスク、シリンダー、単一の繊維、または粒子で構成される固体支持体であってもよい。１つの態様において、（固体）支持体は、最適な接触を可能にする、繊維性または粒子状であってもよい。（固体）支持体のサイズは、多様であることが可能であり、そして実行しようとする方法に応じて選択することが可能である。

いくつかの態様において、固体支持体は、試験片、チップ、特にマイクロアレイまたはナノアレイチップ、マイクロタイタープレートまたは微粒子（ビーズ）である。
多くの商業的試験系は、アビジンまたはストレプトアビジン（ＳＡ）でコーティングされた固体支持体、例えばＳＡコーティングマイクロタイタープレート、ＳＡコーティング格子、またはＳＡコーティング微粒子（ビーズ）の使用に基づく。

ビオチン化分析物誘導体を、例えば、試験法の前にまたは試験法の間に、このＳＡ固体支持体に結合させる。ビタミンＤ化合物を検出する際、このビオチン化分析物誘導体化合物は、例えば、ビオチン化２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および／またはビオチン化２５−ヒドロキシビタミンＤ_３であってもよい。

本発明の１つの態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ検出法を競合的アッセイとして実行する。こうした競合的試験において、試験に、定義された量で添加されるビタミンＤ化合物誘導体は、特異的結合剤の結合部位に関して、試料由来の対応するビタミンＤ化合物と競合する。より多くのビタミンＤ化合物が試料中に存在すれば、検出シグナルはより小さくなる。

１つの態様において、ビタミンＤ化合物誘導体は、ビオチン化ビタミンＤ化合物である。さらなる態様において、ビオチン化ビタミンＤ化合物は、ビオチン化２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および／またはビオチン化２５−ヒドロキシビタミンＤ_３である。さらなる態様において、ビオチン化ビタミンＤ化合物は、ビオチン化２５−ヒドロキシビタミンＤ_２である。

１つの態様において、ビタミンＤ化合物誘導体は、ルテニル化（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｅｄ）ビタミンＤ化合物である。さらなる態様において、ルテニル化ビタミンＤ化合物は、ルテニル化２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および／またはルテニル化２５−ヒドロキシビタミンＤ_３である。さらなる態様において、ルテニル化ビタミンＤ化合物は、ルテニル化２５−ヒドロキシビタミンＤ_２である。

上述のように、本明細書に開示するような検出法において使用するための上記の好ましい第二の結合剤は、抗体およびビタミンＤ結合タンパク質である。ビタミンＤ結合タンパク質は、競合的アッセイ形式で用いる場合、１またはそれより多い（ビオチン化）ビタミンＤ化合物誘導体への結合と競合するすべてのビタミンＤ化合物の統合された測定を導くであろう。１つの態様において、ビタミンＤ結合タンパク質は、検出可能に標識され、例えばルテニル化されるであろう。

１つの態様において、本発明にしたがった方法は、競合的アッセイ形式で行われ、ここで
ｉ）固体支持体はＳＡコーティング微粒子（ビーズ）であり、競合剤はビオチン化ビタミンＤ化合物誘導体であり、そして第二の結合剤はルテニル化ビタミンＤ結合タンパク質コンジュゲートであるか、または
ｉｉ）固体支持体はＳＡコーティング微粒子（ビーズ）であり、競合剤はルテニル化ビタミンＤコンジュゲートであり、そして第二の結合剤はビオチン化ビタミンＤ結合タンパク質コンジュゲートである。

好ましい態様にしたがって、第一の結合剤は、第二の結合剤への２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の結合を妨げる。さらにさらなる好ましい態様において、第一の結合剤に結合した２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３は、第二の結合剤によって結合されることは不可能である。やはりさらなる態様において、第二の結合剤は、第一の結合剤に結合した２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３を放出させることができない。

当業者は、被験体から得られる試料中に存在するビタミンＤ化合物は、ビタミンＤ結合タンパク質に結合していることを知っている。したがって、本発明にしたがった方法において、ビタミンＤ結合タンパク質に結合している試料中に存在するビタミンＤ化合物を、特定の態様では、工程（ｂ）より前に、放出試薬で、ビタミンＤ結合タンパク質から放出させる。

方法にしたがって、被験体から得られ提供される試料は、１つの態様において、ビタミンＤ結合タンパク質に結合しているビタミンＤ化合物を含む。
放出試薬は、ビタミンＤ結合タンパク質を変性させ、好ましくは、放出試薬は、ビタミンＤ結合タンパク質を不可逆的に変性させる。

特定の態様において、ビタミンＤ化合物を、工程（ｂ）の前に、それぞれ、タンパク質分解的分解、酸性放出、アルカリ放出、メタノール放出、エタノール沈殿（ＷＯ ９９／６７２１１）、過ヨウ素酸塩放出（ＥＰ ０ ７５３ ７４３）、アセトニトリル抽出、金属水酸化物放出（ＵＳ ７，０８７，３９５）、シクロデキストリンおよび／またはその誘導体による放出（ＵＳ ７，０８７，３９５）あるいは金属サリチル酸塩放出（ＵＳ ７，０８７，３９５）からなる群より選択される方法によってビタミンＤ結合タンパク質から放出させる。当業者は、ビタミンＤ化合物の決定／測定前に、ビタミンＤ結合タンパク質に結合しているビタミンＤ化合物を放出させるために適した方法を知っている。近年、試料中に存在するいずれの結合タンパク質からもビタミンＤ化合物を放出させるために原理上適している、多くの異なる放出試薬が提唱された。

さらなる態様において、本発明は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）被験体から得た試料を提供し、そして
放出試薬を用いて、ビタミンＤ結合タンパク質に結合している試料中に存在するビタミンＤ化合物を放出させ、
ｂ）試料を
（ｂａ）２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤と混合し、それによって、第一の結合剤および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の間の複合体を形成し；
（ｂｂ）２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤と混合し、それによって第二の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤの間の複合体を形成し；
ｃ）（ｂｂ）において形成された複合体を測定し、それによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わない、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定する
工程を含む、前記方法に関する。

特定の態様にしたがって、ビタミンＤ化合物は、工程（ｂ）の前に、アルカリ放出によって、ビタミンＤ結合タンパク質から放出される。アルカリ条件は、ビタミンＤ結合タンパク質の変性および調べようとする試料中に存在するビタミンＤ化合物の放出を生じる。アルカリ化剤の濃度は、工程（ｂ）の前の前処理反応において、「試薬混合物」（＝調べようとする試料＋アルカリ化剤＋さらなる試薬）のｐＨを、少なくともｐＨ１０．０、好ましくは少なくともｐＨ１０．５、より好ましくは少なくともｐＨ１１．０に増加させるために十分でなければならない。当業者は、試薬混合物のｐＨが、調べようとする試料＋アルカリ化剤＋さらなる試薬を混合した時点で測定されなければならないことを知っている。炭酸水素塩および／または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を放出可能な物質が加水分解されるため、ｐＨは、試薬混合物中で減少するであろう。

放出試薬は、特定の態様において、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩および／または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を放出可能な物質、還元剤およびアルカリ化剤を含む。さらなる特定の態様において、放出試薬は、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩、還元剤およびアルカリ化剤を含む。さらなる特定の態様において、放出試薬は、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を放出可能な物質、還元剤およびアルカリ化剤を含む。こうした放出試薬および放出法は、ＷＯ ２０１１／１４４６６１およびＷＯ ２０１３／０７２３４２に詳細に記載される。

「炭酸水素イオン」（重炭酸イオン）は、実験式ＨＣＯ_３ ⁻および６１．０１ダルトンの分子量を持つ陰イオンである。
「炭酸水素イオン」は、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ_３）、炭酸水素アンモニウム（ＮＨ_４ＨＣＯ_３）、炭酸水素カルシウム（Ｃａ（ＨＣＯ_３）_２）および炭酸水素マグネシウム（Ｍｇ（ＨＣＯ_３）_２）からなる群より選択される化合物である。

「加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を放出させることが可能な物質」は、本発明の態様にしたがって、炭酸エステルである。「炭酸エステル」は、本発明にしたがって、２つのアルコキシ基が隣接したカルボニル基である。これらの炭酸塩の一般構造は、Ｒ_１Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ_２である。環状炭酸エステル（例えば炭酸エチレン）または非環状炭酸エステル（例えば炭酸ジメチル）ならびにそのヒドロキシル化またはハロゲン化誘導体が入手可能である。

当業者は、適切な還元剤を選択することを知っており、例えばこれらは２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌおよびジチオスレイトール（ＤＴＴ）からなる群より選択される。

また、当業者は、適切なアルカリ化剤を選択することを知っており、例えばこれらは、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２、およびＬｉＯＨ、またはその混合物からなる群より選択される。

分析物（ビタミンＤ化合物）の結合分子（ビタミンＤ結合タンパク質）からの本質的に完全な放出が、本発明にしたがった方法の工程（ｂ）より前に行われれば、好適である。
本発明にしたがった方法の工程（ｂ）において、特定の態様において、第一の結合剤および第二の結合剤を、試料と同時に接触させる。言い換えると、工程（ｂａ）および（ｂｂ）は、本発明の方法にしたがって、同時に行われる。

本発明にしたがった方法の工程（ｂ）において、特定の態様において、第一の結合剤を、試料と第二の結合剤を接触させる前または後に、試料と接触させる。言い換えると、特定の態様において、工程（ｂａ）は、本発明の方法にしたがって、工程（ｂｂ）の前に行われる。さらなる態様において、工程（ｂａ）は、本発明の方法にしたがって、工程（ｂｂ）の後に行われる。

本発明の方法にしたがった態様において、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を、イムノアッセイ法において決定／測定／検出する。
イムノアッセイは、当業者に周知である。こうしたアッセイを実行するための方法、ならびに実際の適用および方法は、関連する教科書に要約される。関連する教科書の例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｐ．， 酵素−抗体または他の酵素−巨大分子コンジュゲートの調製： Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ中， ｐｐ． ２２１−２７８， Ｂｕｒｄｏｎ， Ｒ．Ｈ．およびｖ． Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ， Ｐ．Ｈ．（監修）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９０）、ならびに免疫学的検出法を扱う、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｏｗｉｃｋ， Ｓ．Ｐ．，およびＣａｐｌａｎ， Ｎ．Ｏ．（監修）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）の多様な巻、特に、７０、７３、７４、８４、９２および１２１巻である。

１つの態様において、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するための方法は、酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）からなる群より選択される。好ましい態様において、２５−ヒドロキシビタミンＤは、酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）において検出される。２５−ヒドロキシビタミンＤは、さらに好ましい態様において、（電気）化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）において検出される。２５−ヒドロキシビタミンＤは、さらなる態様において、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において検出される。やはり好ましい態様は、２５−ヒドロキシビタミンＤを決定するための化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）である。さらなる好ましいアッセイは、サンドイッチ蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、微粒子捕捉酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）、固相蛍光イムノアッセイ（ＳＰＦＩＡ）、粒子濃度蛍光イムノアッセイ（ＰＣＦＩＡ）、ラテックス粒子増進を伴うおよび伴わない比濁分析および比濁アッセイ（ＬＰＩＡ）である。また、アッセイは、１つの態様において、試験片の形であってもよい。

現時点では、分析測定のために電気化学発光（ＥＣＬ）を利用する多くの商業的に入手可能な装置がある。概説に関しては、Ｒｉｃｈｔｅｒ， Ｍ．Ｍ．， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １０４ （２００４）３００３−３０３６を参照されたい。ＥＣＬを放出するように誘導可能な種（ＥＣＬ活性種）が、ＥＣＬ標識として用いられてきている。ＥＣＬ標識の例には、有機金属化合物、例えばトリス−ビピリジル−ルテニウム［Ｒｕ（ｂｐｙ）_３］^２＋部分があり、金属は、例えばＶＩＩおよびＶＩＩＩ族の金属であり、これには、Ｒｅ、Ｒｕ、ＩｒおよびＯｓが含まれる。ＥＣＬプロセスにおいて、ＥＣＬ標識と反応する種は、本明細書において、ＥＣＬ共反応物質と称される。ＥＣＬのために一般的に用いられる共反応物質には、三級アミン（例えばトリプロピルアミン（ＴＰＡ））、シュウ酸塩、および過硫酸塩が含まれる。ＥＣＬ標識および共反応物質の協調した反応によって光が生じ；結合相互作用における結合試薬の関与は、ＥＣＬ標識から放出されるＥＣＬを測定することによって監視可能である。あるいは、ＥＣＬ活性化合物からのＥＣＬシグナルは、化学環境の指標となりうる（例えば、特定のＥＣＬ共反応物質の存在または破壊を監視するＥＣＬアッセイを記載する、米国特許第５，６４１，６２３号および第５，６４３，７１３号を参照されたい）。ＥＣＬ、ＥＣＬ標識、ＥＣＬアッセイおよびＥＣＬアッセイを行うための指示のさらなる背景に関しては、ＥＰ ０ ４４１ ８７５、ＥＰ ０ ５００ ３０５、ＥＰ ０ ９７３ ０３５、ＥＰ １ ８９２ ５２４、ならびに公開ＰＣＴ第ＷＯ８７／０６７０６号；第ＷＯ８９／１０５５１号；第ＷＯ９０／０５３０１号；第ＷＯ９３／０１３０８号；第ＷＯ９８／１２５３９号；第ＷＯ９９／３２６６２号；第ＷＯ９９／５８９６２号；第ＷＯ９８／５７１５４号および第ＷＯ２００１／０１３０９５号を参照されたい。

商業的に入手可能なＥＣＬ装置の非常に優れた性能が示されてきている。これらは、優れた感度、ダイナミックレンジ、正確さ、および複雑な試料マトリックスの耐性を含む理由のために広く使用されてきている。商業的に入手可能な装置は、永続的に再使用可能なフローセルを用いた、フローセルに基づく設計を用いる。

分析物の決定のために利用可能な試料体積は、しばしば限定され、そして１つの試料から決定されるべき異なる分析物が増えてきている。また、アッセイ自動化のためのより迅速な実験装置の開発、および分析物の検出のためのより高感度な方法が必要である。これによって、高感度でそして特異的な電気化学発光アッセイおよびこれを実行するための方法の必要性が生じている。さらに、安全上の問題または環境上の懸念に関連する改善が考慮されるべきである。

さらなる態様において、２５−ヒドロキシビタミンＤを、サンドイッチアッセイにおいて決定する。
さらなる好ましい態様において、試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤを決定するために、サンドイッチイムノアッセイを用いる。こうしたサンドイッチイムノアッセイは、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤを特異的に検出する。

サンドイッチアッセイにおいて、本発明にしたがった第二の結合剤を、１つの態様において用いて、２５−ヒドロキシビタミンＤを捕捉し、そして直接または間接的に検出可能であるように標識されている第三の結合剤を用いて、第二の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤで形成される複合体を捕捉する。

サンドイッチ型アッセイ形式で用いられる第二の結合剤および第三の結合剤は、１つの態様において、それぞれ抗体であるか、またはさらなる態様において、第二の結合剤としてのビタミンＤ結合タンパク質および第三の結合剤としての抗体の組み合わせを用いる。サンドイッチ型アッセイにおいて、抗体を用いる場合、やはり抗体の機能的活性部分も、１つの態様において使用可能である。

１つの態様において、本発明のキットを、定性的（２５−ヒドロキシビタミンＤが存在するかまたはしないか）または定量的（２５−ヒドロキシビタミンＤの量を決定する）または半定量的（相対量、特にカットオフ値より高いかまたは低いかを提供する）イムノアッセイに用いる。

好ましい態様において、２５−ヒドロキシビタミンＤを電気化学または電気化学発光イムノアッセイ（＝ＥＣＬＩＡ）において検出する。電気化学または電気化学発光アッセイにおいて、結合した分析物分子を、検出剤（ターゲット分子）に連結された標識によって検出する。電極は、検出剤に連結された化学標識の発光を電気化学的に開始する。標識から放出される光を、光検出装置によって測定し、そしてこれは、結合分析物分子／ターゲット分子複合体の存在または量を示す。ＥＣＬＡ法は、例えば、米国特許第５，５４３，１１２号；第５，９３５，７７９号；および第６，３１６，６０７号に記載される。正確でそして高感度の測定のため、異なる分析物分子濃度に関して、シグナル調節を最大化することも可能である。

用語「標識」または「検出可能標識」は、本明細書において、直接または間接的検出を介して、シグナルを生じることが可能ないずれの物質も指す。したがって、検出可能標識を直接または間接的に検出することも可能である。直接検出のため、本発明において使用するために適した検出標識は、任意の既知の検出可能マーカー基、例えば色素原、蛍光基、化学発光基（例えばアクリジニウムエステルまたはジオキセタン）、電気化学発光化合物、触媒、酵素、酵素基質、色素、蛍光色素（例えばフルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンおよびその誘導体）、コロイド状金属および非金属粒子、ならびに有機ポリマーラテックス粒子より選択されうる。検出可能標識の他の例は、発光金属錯体、例えばルテニウムまたはユーロピウム錯体、例えばＥＣＬＩＡに用いられるようなもの、酵素、例えばＥＬＩＳＡに用いられるようなもの、および放射性同位体、例えばＲＩＡに用いられるようなものである。

間接的検出系は、例えば、生物親和性（ｂｉｏａｆｆｉｎｅ）結合対の第一のパートナーで標識されている検出試薬、例えば検出抗体を含む。
適切な結合対の例は、ハプテンまたは抗原／抗体、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸または核酸類似体／相補的核酸、ならびに受容体／リガンド、例えばステロイドホルモン受容体／ステロイドホルモンである。好ましい第一の結合対メンバーは、ハプテン、抗原およびホルモンを含む。特に好ましいのは、ジゴキシンおよびビオチンならびにその類似体のようなハプテンである。こうした結合対の第二のパートナー、例えば抗体、ストレプトアビジン等は、通常、例えば上述のような検出可能標識による直接検出が可能であるように標識される。

当業者は、第一および／または第二の結合剤を、それぞれ、検出可能標識で標識してもよいことを知っている。当業者は、第一の結合剤に関して選択される標識が、第二の結合剤に関して選択される標識とは異ならなければならないことを知っている。

特定の態様にしたがって、第一の結合剤は、ｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞であり、そして第二の結合剤は、それぞれ、ビタミンＤ結合タンパク質、好ましくは標識ビタミンＤ結合タンパク質、より好ましくはビオチン化またはルテニル化ビタミンＤ結合タンパク質である。

直接検出のため、本発明における使用のために適した標識基または標識は、任意の既知の検出可能マーカー基から選択されることも可能であり、限定されるわけではないが、色素原、蛍光基、化学発光基（例えばアクリジニウムエステルまたはジオキセタン）、電気化学発光化合物、触媒、酵素、酵素基質、色素、蛍光色素（例えばフルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンおよびその誘導体）、コロイド状金属および非金属粒子、ならびに有機ポリマーラテックス粒子が含まれる。標識基の他の例は、発光金属錯体、例えばルテニウムまたはユーロピウム錯体、酵素、例えばＥＬＩＳＡに用いるようなもの、および放射性同位体である。

間接検出系は、例えば、生物親和性結合対の第一のパートナーで標識される検出試薬、例えば検出抗体を含む。適切な結合パートナーはハプテンまたは抗原／抗体、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸または核酸類似体／相補的核酸、ならびに受容体／リガンド、例えばステロイドホルモン受容体／ステロイドホルモンである。好ましい第一の結合対メンバーは、ハプテン、抗原およびホルモンを含む。特に好ましいのは、ジゴキシンおよびビオチンならびにその類似体のようなハプテンである。こうした結合対の第二のパートナー、例えば抗体、ストレプトアビジン等は、通常、例えば上述のような検出可能標識による直接検出が可能であるように標識される。

特定の態様において、試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度は、少なくとも１ｎｍｏｌ／Ｌ（０．４ｎｇ／ｍＬ）、さらに好ましくは最大５００ｎｍｏｌ／Ｌ（２００ｎｇ／ｍＬ）、さらに好ましくは、１０ｎｍｏｌ／Ｌ（４ｎｇ／ｍＬ）〜５００ｎｍｏｌ／Ｌ（２００ｎｇ／ｍＬ）の範囲であり、さらに好ましくは１０ｎｍｏｌ／Ｌ（４ｎｇ／ｍＬ）〜２５０ｎｍｏｌ／Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ）の範囲である。

本発明にしたがって、「交差反応」または「交差反応性」は、第一の結合剤、特に抗体が向けられる干渉化合物（例えば２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３）とは別個の、決定しようとするビタミンＤ化合物（例えば２５−ヒドロキシビタミンＤ）に対する結合強度が、分析物で測定される結合強度の１０％またはそれ未満、好ましくは５％またはそれ未満を有することを意味する。結合強度は、特に、ＢｉａＣｏｒｅ^ＴＭを用いたアフィニティ試験を適用することによって、測定可能である。当業者が知るように、結合アフィニティ（アフィニティまたは結合強度）は、Ｋ_ｄで与えられた場合、Ｋ_ｄが低ければ、より優れている／より高い。

さらに、実施例において、本発明の第一の結合剤は、２５−ヒドロキシビタミンＤに対するいずれの有意な交差反応性も示さない；すなわち２５−ヒドロキシビタミンＤに対する交差反応性が、１０％またはそれ未満、特に５％またはそれ未満、特に１％またはそれ未満の交差反応性であることが見出されていることが示されうる。１つの態様において、第一の結合剤は、２５−ヒドロキシビタミンＤに対する有意な交差反応性をまったく持たず、好ましくは、それぞれ、第一の結合剤は、２５−ヒドロキシビタミンＤに対して、１０％またはそれ未満の交差反応性を有し、さらに好ましくは、第一の結合剤は、２５−ヒドロキシビタミンＤに対して、５％またはそれ未満の交差反応性を有し、さらに好ましくは、第一の結合剤は、２５−ヒドロキシビタミンＤに対して、１％またはそれ未満の交差反応性を有する。したがって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の存在下であっても、少量の２５−ヒドロキシビタミンＤもまた、特異的にそして信頼性を持って検出可能である。

本発明にしたがって、Ｋ_ｄ（第一の結合剤）は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対する第一の結合剤のアフィニティであり、そしてＫ_ｄ（第二の結合剤）は、２５−ヒドロキシビタミンＤに対する第二の結合剤のアフィニティである。

「アフィニティ」は、２つの種間の相互作用の強度を定義し、そして好ましくは、表面プラズモン共鳴を通じて、特にＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）系を用いて、決定される。抗体または抗体断片の場合、アフィニティは、好ましくは、表面プラズモン共鳴を通じて、特にＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）系を用いて決定されるＫ_ｄ値として決定される。アフィニティの決定は、「抗体−抗原アフィニティおよび動力学の検出および測定のための表面プラズモン共鳴」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第５巻， 第２号， １９９３， ２８２−２８６ページに記載されるように実行可能である。

さらに、本発明にしたがって、濃度（第一の結合剤）および濃度（第二の結合剤）は、上述の本発明の方法の工程ｂ）における、それぞれ、第一の結合剤および第二の結合剤のモル濃度である。

さらに、本発明にしたがって、ＭＲ（第一の結合剤）は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対する結合に関する、第一の結合剤の結合価であり、そしてＭＲ（第二の結合剤）は、２５−ヒドロキシビタミンＤに対する、第二の結合剤の結合価である。

「結合価」は、本発明にしたがって、結合パートナーの所定の対に関する結合部位の実験的に決定された数と理解される。抗体またはその機能的活性部分に関して、理論的結合価は、典型的には１または２であるが、実験的に決定される結合価は、立体効果のため、非整数の値（例えば１．４）であることも可能である。好ましい第一の結合剤としての抗体の場合、理論的結合価は、典型的には１である。再び、実験的に決定される結合価は、立体効果のため、非整数の値（例えば０．９）であることも可能である。結合価の決定は、Ｓｃｈｒａｅｍｌ Ｍ．ら（２０１２） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． ９０１， １７１−１８１に記載されるように実行可能である。

２５−ヒドロキシビタミンＤの本質的に完全な測定を達成するため、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対する第一の結合剤のＫ_ｄが、２５−ヒドロキシビタミンＤに対する第二の結合剤のアフィニティの最大で１０倍高く、好ましくは同じであり、さらに好ましくはそれ未満であれば、好都合である。したがって、さらなる好ましい態様において、Ｋ_ｄ（第一の結合剤）／Ｋ_ｄ（第二の結合剤）は、１０またはそれ未満、好ましくは１またはそれ未満、より好ましくは０．１またはそれ未満である。

２５−ヒドロキシビタミンＤの本質的に完全な測定を達成するため、１つの態様において、第一の結合剤の濃度が、それぞれ、第二の結合剤の濃度と同じである、好ましくは少なくとも１０倍高い、さらに好ましくは５０倍高い、さらに好ましくは１００倍高い、やはり好ましくは２００倍高い場合、さらに好都合である。したがって、さらにさらなる好ましい態様において、濃度（第一の結合剤）／濃度（第二の結合剤）は、それぞれ、最大２００、好ましくは最大１００、好ましくは最大５０、好ましくは最大１０、好ましくは最大１であり、特に濃度（第一の結合剤）は、１^＊（１〜１０）ｎｍｏｌ／Ｌ〜２００^＊（１〜１０）ｎｍｏｌ／Ｌの範囲であり、そして／または濃度（第二の結合剤）は、１〜１０ｎｍｏｌ／Ｌの範囲である。

特定の態様にしたがって、第一の結合剤は、２４，２５−ヒドロキシビタミンＤ_３に対して、それぞれ、第二の結合剤と少なくとも同じ、好ましくはそれより少なくとも１０倍高い、さらに好ましくは少なくとも１００倍高い結合アフィニティを有する。

別の重要な側面は、本発明の方法において、特に、第一の結合剤および／または第二の結合剤が抗体またはその機能的活性部分である場合、使用する第一の結合剤および第二の結合剤の結合価である。小さい分析物、例えばビタミンＤ化合物に結合する際、抗体である結合分子は、典型的には、ＭＲ＝２の結合価を示し、一方、立体的理由のため、抗体である第一の結合剤は、典型的には、ＭＲ＝１およびそれより小さい結合価を示す。この場合、機能的モル濃度指数を好ましくは考慮するものとする。

分析物（例えばビタミンＤ化合物、好ましくは２５−ヒドロキシビタミンＤ）の総量を決定するためには、分析物に結合するよう意図される第二の結合剤が、この分析物に対して十分に高いアフィニティを示すならば、さらに好適である。さらに、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合することが意図される第一の結合剤が、この２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対して十分に高いアフィニティを示すならば好適である。

２５−ヒドロキシビタミンＤの総量を決定するためには、第一の結合剤に対する２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の本質的に完全な結合を達成するため、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対する第一の結合剤のアフィニティが十分に高いならば、さらに好適である。したがって、さらなる態様において、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３への結合に関する第一の結合剤のＫ_ｄは、１０^−８ｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満、好ましくは１０^−９ｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満、より好ましくは１０^−１０ｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満である。

さらにさらなる態様において、２５−ヒドロキシビタミンＤへの結合に関する第二の結合剤のＫ_ｄは、１０^−８ｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満、好ましくは１０^−９ｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満、より好ましくは１０^−１０ｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満である。

第一の結合剤が、２５−ヒドロキシビタミンＤの偽陽性検出を最小限にするため、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対して特異性を示すならば、さらに好都合である。さらに、第一の結合剤が、特に、第一の結合剤の損失を最小限にし、そして２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３への結合を最大限にするため、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３への特異性を示すならば、好都合である。したがって、好ましい態様において、第一の結合剤は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に特異的に結合し、特に、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３とは異なるターゲットへの第一の結合剤の結合は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３への第一の結合剤の結合の最大５％である。

さらにさらなる特定の態様において、第一の結合剤の濃度は、１^＊（１〜１０）ｎｍｏｌ／Ｌ〜２００^＊（１〜１０）ｎｍｏｌ／Ｌの範囲、例えば１^＊（１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）ｎｍｏｌ／Ｌ〜２００^＊（１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）ｎｍｏｌ／Ｌ、特に１〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌ、３０〜８００ｎｍｏｌ／Ｌ、５０〜７００ｎｍｏｌ／Ｌ、１００〜６００ｎｍｏｌ／Ｌである。

当業者は、こうした方法が、ビタミンＤ化合物の定量的測定のためには、標準化する必要があることを知っている。さらにさらなる態様において、本発明にしたがった方法を、ビタミンＤ標準物質によって標準化する。

当業者はまた、本発明にしたがって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するための方法はまた、修飾された方法で実行可能であることも知っている。

さらなる態様において、本発明は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）被験体から得た試料を提供し、
ｂ）試料を２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤と混合し、それによって、それぞれ、第一の結合剤および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の間の第一の複合体、ならびに第二の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤの間の第二の複合体を形成し、そして
ｃ）（ｂ）において形成された第二の複合体を測定し、それによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定する
工程を含む、前記方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）被験体から得た試料を提供し、
ｂ）試料を
ｂａ）２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤と混合し、それによって、第一の結合剤および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の間の第一の複合体を形成し、
ｂｂ）２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤と混合し、それによって該結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤの間の第二の複合体を形成し、
ｃ）２５−ヒドロキシビタミンＤを含まない第二の結合剤から、第二の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤを含む第二の複合体を分離し、そして
ｄ）（ｂｂ）において形成された第二の複合体を測定し、それによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定する
工程を含む、前記方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）被験体から得た試料を提供し、
ｂ）試料を
（ｂａ）２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤と混合し、それによって、第一の結合剤および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の間の複合体を形成し、
（ｂｂ）２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤と混合し、
ｃ）試料を標識２５−ヒドロキシビタミンＤと混合し、試料由来の２５−ヒドロキシビタミンＤおよび標識２５−ヒドロキシビタミンＤが２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤への結合に関して競合し、それによって、第二の結合剤および標識２５−ヒドロキシビタミンＤの間の第二の複合体を得て、
ｄ）第二の複合体中に含まれない標識２５−ヒドロキシビタミンＤから、工程（ｃ）で得た第二の複合体中に含まれる標識２５−ヒドロキシビタミンＤを分離し、そして
ｅ）第二の複合体中に含まれる標識２５−ヒドロキシビタミンＤを測定し、それによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定する
工程を含む、前記方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）被験体から得た試料を提供し、そして
放出試薬を用いて、ビタミンＤ結合タンパク質に結合している試料中に存在するビタミンＤ化合物を放出させ、
ｂ）試料を
（ｂａ）２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤と混合し、それによって、第一の結合剤および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の間の複合体を形成し、
（ｂｂ）２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤と混合し、
ｃ）試料を標識２５−ヒドロキシビタミンＤと混合し、試料由来の２５−ヒドロキシビタミンＤおよび標識２５−ヒドロキシビタミンＤが２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤への結合に関して競合し、それによって、第二の結合剤および標識２５−ヒドロキシビタミンＤの間の第二の複合体を得て、
ｄ）第二の複合体中に含まれない標識２５−ヒドロキシビタミンＤから、工程（ｃ）で得た第二の複合体中に含まれる標識２５−ヒドロキシビタミンＤを分離し、そして
ｅ）第二の複合体中に含まれる標識２５−ヒドロキシビタミンＤを測定し、それによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定する
工程を含む、前記方法に関する。

使用：
本発明の方法を用いて、２５−ヒドロキシビタミンＤの総量および／または濃度を検出することも可能である。

１つの態様において、本発明は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するための、本発明の方法にしたがったｉｎ ｖｉｔｒｏ法の使用に関する。

さらなる態様において、本発明は、被験体から得た試料において、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するための、本発明にしたがったｉｎ ｖｉｔｒｏ法における、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤の使用に関する。

好ましくは、本発明の態様にしたがって、第一の結合剤としてｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞を、そして第二の結合剤としてビタミンＤ結合タンパク質を用いる。

さらに、本発明は、１つの態様において、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わない２５−ヒドロキシビタミンＤの決定のための本明細書に開示するキットの使用に関する。

キット：
１つの態様において、本発明は、本発明にしたがった方法を実行するためのキットであって、
ａ）モノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の機能的活性部分である、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤、および
ｂ）ビタミンＤ結合タンパク質である、２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤
を少なくとも含む、前記キットに関する。

好ましくは、本発明の態様にしたがって、キットにおいて、第一の結合剤としてｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞を、そして第二の結合剤としてビタミンＤ結合タンパク質を提供する。

当業者は、本明細書に開示する試薬が、本発明にしたがった方法を実施するためのキットの製造に適していることを知っている。
特定の態様において、キットはまた、０．１Ｍ〜２．０Ｍの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を放出可能な物質、還元剤およびアルカリ化剤を有する、試薬組成も含み、好ましくは、キットは、本発明にしたがった第一の結合剤および第二の結合剤に加えて、０．１Ｍ〜２．０Ｍの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を放出可能な物質、２ｍＭ〜３０ｍＭの還元剤、１Ｍ〜１．５Ｍのアルカリ化剤の溶液を有する試薬組成を含む。

さらなる特定の態様において、キットは、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌおよびジチオスレイトール（ＤＴＴ）からなる群より選択される還元剤、ならびにＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２からなる群より選択されるアルカリ化剤の１Ｍ〜１．５Ｍの溶液を含む。

さらに、キットは、１つの態様において、ビタミンＤ標準物質を含む。
本発明にしたがったキットは、ビタミンＤ化合物に関する自動化試験において使用するために適していることが証明されてきている。本発明は、好ましくは、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わない２５−ヒドロキシビタミンＤの決定のための、本発明にしたがったキットの使用に関する。

２５−ヒドロキシビタミンＤに関する試験は、好ましくは完全に自動化されている。この場合、「完全に自動化されている」は、実験者が、調べようとする試料およびビタミンＤ化合物を測定するためのすべての構成要素を含有する試薬パックを、自動化分析装置に乗せさえすればよく、そしてすべてのさらなる工程が、分析装置によって自動的に行われることを意味する。完全に自動化された試験は、特に好ましくは、Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）分析装置上で行われる。

さらなる態様において、本発明にしたがって、それぞれ、試薬組成物、第一の結合剤および第二の結合剤を、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わない２５−ヒドロキシビタミンＤの決定のためｉｎ ｖｉｔｒｏ法において用い、ここで、２５−ヒドロキシビタミンＤは、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３、および３−エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤを含む群より選択され、好ましくは、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３である。

すでに上述したように、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および２５−ヒドロキシビタミンＤ_３が、診断のためのビタミンＤの特に関連のある型である。本発明にしたがったｉｎ ｖｉｔｒｏ法において、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２または２５−ヒドロキシビタミンＤ_３に対する特異的抗体を通じた、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わない、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および２５−ヒドロキシビタミンＤ_３あるいは両方の特異的検出もまた、好ましい態様に相当する。

別に定義しない限り、本明細書に用いる技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の一般的な当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第２版， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク州ニューヨーク（１９９４）； Ｍａｒｃｈ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， 第４版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク州ニューヨーク（１９９２）； Ｌｅｗｉｎ， Ｂ．， Ｇｅｎｅｓ Ｖ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ刊行（１９９４）， ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９； Ｋｅｎｄｒｅｗ， Ｊ．ら（監修）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．刊行（１９９４）， ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９；ならびにＭｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ．（監修）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．刊行（１９９５）， ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８は、当業者に、本出願で用いる用語の多くに関する一般的な手引きを提供する。

本発明の実施は、別に示さない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の、技術分野の技術範囲内である、慣用的な技術を使用するであろう。こうした技術は、文献、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（１９８９）； Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （１９８４）； Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ． （監修）， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ （１９８７）； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら（監修）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９８７）および定期的な改訂； Ｍｕｌｌｉｓら（監修）， ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （１９９４）に十分に説明される。

本発明のさらなる場合による特徴および態様は、好ましい態様の続く説明に、好ましくは、付随する請求項と組み合わせて、より詳細に開示されるであろう。この中で、それぞれの場合による特徴は、単離された様式で、ならびに当業者が理解するであろうように、任意に受け入れられうる組み合わせで、実現可能である。本発明の範囲は、好ましい態様によっては制限されない。

本発明の知見を要約して、以下の態様が好ましい：
１． ２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）ビタミンＤ結合タンパク質に結合しているビタミンＤ化合物を含む、被験体から得た試料を提供し、
ｂ）試料を
（ｂａ）２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤と混合し、それによって、第一の結合剤および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の間の複合体を形成し；
（ｂｂ）２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤と混合し、それによって第二の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤの間の複合体を形成し；
ｃ）（ｂｂ）において形成された複合体を測定し、それによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わない、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定する
工程を含む、前記方法。

２． 試料が、血液、血清または血漿である、請求項１記載の方法。
３． ビタミンＤ結合タンパク質に結合している、試料中に存在するビタミンＤ化合物を、放出試薬を用いて、工程（ｂ）の前に、ビタミンＤ結合タンパク質から放出させる、請求項１および２のいずれか一項記載の方法。

４． 放出試薬が、ビタミンＤ結合タンパク質を変性させ、好ましくは放出試薬がビタミンＤ結合タンパク質を不可逆的に変性させる、請求項３記載の方法。
５． ビタミンＤ化合物が、工程（ｂ）の前に、それぞれ、タンパク質分解的分解、酸性放出、アルカリ放出、メタノール放出、エタノール沈殿、過ヨウ素酸塩放出、アセトニトリル抽出、金属水酸化物放出、シクロデキストリンおよび／またはその誘導体による放出あるいは金属サリチル酸塩放出からなる群より選択される方法によってビタミンＤ結合タンパク質から放出される、請求項３および４のいずれか一項記載の方法。

６． 放出試薬が、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩および／または加水分解に際して０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度で炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を放出可能な物質、還元剤およびアルカリ化剤を含む、請求項３〜４のいずれか一項記載の方法。

７． −Ｋ_ｄ（第一の結合剤）／Ｋ_ｄ（第二の結合剤）が１０またはそれ未満、好ましくは１またはそれ未満、より好ましくは０．１またはそれ未満であり；そして／または
−濃度（第一の結合剤）／濃度（第二の結合剤）が最大で２００、好ましくは最大で１００、好ましくは最大で５０、より好ましくは最大で１０である；
ここで、Ｋ_ｄ（第一の結合剤）は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対する第一の結合剤のアフィニティであり、そしてＫ_ｄ（第二の結合剤）は、２５−ヒドロキシビタミンＤに対する第二の結合剤のアフィニティであり、そして
濃度（第一の結合剤）および濃度（第二の結合剤）は、それぞれ、工程ｂ）における、第一の結合剤および第二の結合剤のモル濃度であり、特に濃度（第一の結合剤）は、１^＊（１〜１０）ｎｍｏｌ／Ｌ〜２００^＊（１〜１０）ｎｍｏｌ／Ｌの範囲であり、そして／または濃度（第二の結合剤）は、１〜１０ｎｍｏｌ／Ｌの範囲である
請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。

８． −２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３への結合に関する第一の結合剤のＫ_ｄが、１０^−８ｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満、好ましくは１０^−９ｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満、より好ましくは１０^−１０ｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満であり；そして／または
−２５−ヒドロキシビタミンＤへの結合に関する第二の結合剤のＫ_ｄが、１０^−８ｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満、好ましくは１０^−９ｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満、より好ましくは１０^−１０ｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満である
請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。

９． ａ）被験体がヒトであり；そして／または
ｂ）方法が、酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）からなる群より選択され；そして／または
ｃ）２５−ヒドロキシビタミンＤが、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３および３−エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤからなる群より選択され；そして／または
ｄ）２５−ヒドロキシビタミンＤが、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および２５−ヒドロキシビタミンＤ_３からなる群より選択され；そして／または
ｅ）第一の結合剤が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および合成抗体（プラスチック抗体）からなる群より選択され、好ましくは合成抗体またはモノクローナル抗体であり、さらに好ましくはモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の機能的活性部分であり；そして／または
ｆ）第二の結合剤がビタミンＤ結合タンパク質、好ましくは組換えビタミンＤ結合タンパク質であり；そして／または
ｇ）第一の結合剤がモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の機能的活性部分であり、そして第二の結合剤がビタミンＤ結合タンパク質または該ビタミンＤ結合タンパク質の機能的活性部分であり；そして／または
ｈ）第一の結合剤が、ｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞であり、そして第二の結合剤が、ビタミンＤ結合タンパク質、好ましくは標識ビタミンＤ結合タンパク質、より好ましくはルテニル化ビタミンＤ結合タンパク質であり；そして／または
ｉ）第一の結合剤が、モノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の機能的活性部分であり、そして第二の結合剤が、モノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の機能的活性部分であり；そして／または
ｊ）第一の結合剤が、ｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞または該モノクローナル抗体の機能的活性部分であり、そして第二の結合剤が、ｍＡｂ＜２５−ヒドロキシビタミンＤ＞または該モノクローナル抗体の機能的活性部分であり、固体支持体上に固定可能であり；そして／または
ｋ）第一の結合剤が、第二の結合剤への２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の結合を防止し；そして／または
ｌ）第一の結合剤に結合した２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３が、第二の結合剤によって結合不可能であり；そして／または
ｍ）第二の結合剤が、第一の結合剤に結合している２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３を放出することが不可能であり；そして／または
ｎ）第一の結合剤が、２４，２５−ヒドロキシビタミンＤ_３に対して、それぞれ、第二の結合剤と少なくとも同じ、好ましくはそれより少なくとも１０倍高い、さらに好ましくは少なくとも１００倍高い結合アフィニティを有し；そして／または
ｏ）それぞれ、第一の結合剤が、２５−ヒドロキシビタミンＤに対して、有意な交差反応性を持たず、好ましくは、第一の結合剤が、２５−ヒドロキシビタミンＤに対して、１０％またはそれ未満の交差反応性を有し、さらに好ましくは、第一の結合剤が、２５−ヒドロキシビタミンＤに対して、５％またはそれ未満の交差反応性を有し、さらに好ましくは、第一の結合剤が、２５−ヒドロキシビタミンＤに対して、１％またはそれ未満の交差反応性を有し；そして／または
ｐ）請求項１の工程（ｂ）にしたがった第一の結合剤および第二の結合剤が、試料と同時に接触し；そして／または
ｑ）第二の結合剤と試料を接触させる前またはさせた後に、請求項１の工程（ｂ）にしたがった試料と第一の結合剤を接触させ；そして／または
ｒ）試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度が、少なくとも１ｎｍｏｌ／Ｌ（０．４ｎｇ／ｍＬ）、さらに好ましくは最大５００ｎｍｏｌ／Ｌ（２００ｎｇ／ｍＬ）、さらに好ましくは、１０ｎｍｏｌ／Ｌ（４ｎｇ／ｍＬ）〜５００ｎｍｏｌ／Ｌ（２００ｎｇ／ｍＬ）の範囲であり、さらに好ましくは１０ｎｍｏｌ／Ｌ（４ｎｇ／ｍＬ）〜２５０ｎｍｏｌ／Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ）の範囲であり；そして／または
ｓ）方法がビタミンＤ標準物質によって標準化される
請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。

１０． ２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するための、請求項１〜９のいずれか一項記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法の使用。

１１． 被験体から得た試料において、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法における、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤の使用。

１２． ａ）２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤、第一の結合剤はモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の機能的活性部分である、および
ｂ）２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤、第二の結合剤はビタミンＤ結合タンパク質である、
を少なくとも含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法を実行するためのキット。

１３． ２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）被験体から得た試料を提供し、
ｂ）試料を２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤と混合し、それによって、それぞれ、第一の結合剤および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の間の第一の複合体、ならびに第二の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤの間の第二の複合体を形成し、そして
ｃ）（ｂ）において形成された第二の複合体を測定し、それによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定する
工程を含む、前記方法。

１４． ２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）被験体から得た試料を提供し、
ｂ）試料を
ｂａ）２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤と混合し、それによって、第一の結合剤および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の間の第一の複合体を形成し、
ｂｂ）２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤と混合し、それによって該結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤの間の第二の複合体を形成し、
ｃ）２５−ヒドロキシビタミンＤを含まない第二の結合剤から、第二の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤを含む第二の複合体を分離し、そして
ｄ）（ｂｂ）において形成された第二の複合体を測定し、それによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤを決定する
工程を含む、前記方法。

１５． ２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）被験体から得た試料を提供し、
ｂ）試料を
（ｂａ）２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤と混合し、それによって、第一の結合剤および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の間の複合体を形成し、
（ｂｂ）２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤と混合し、
ｃ）試料を標識２５−ヒドロキシビタミンＤと混合し、試料由来の２５−ヒドロキシビタミンＤおよび標識２５−ヒドロキシビタミンＤが２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤への結合に関して競合し、それによって、第二の結合剤および標識２５−ヒドロキシビタミンＤの間の第二の複合体を得て、
ｄ）第二の複合体中に含まれない標識２５−ヒドロキシビタミンＤから、工程（ｃ）で得た第二の複合体中に含まれる標識２５−ヒドロキシビタミンＤを分離し、そして
ｅ）第二の複合体中に含まれる標識２５−ヒドロキシビタミンＤを測定し、それによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わない、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定する
工程を含む、前記方法。

１６． ２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）被験体から得た試料を提供し、そして
放出試薬を用いて、ビタミンＤ結合タンパク質に結合している試料中に存在するビタミンＤ化合物を放出させ、
ｂ）試料を
（ｂａ）２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤と混合し、それによって、第一の結合剤および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の間の複合体を形成し、
（ｂｂ）２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤と混合し、
ｃ）試料を標識２５−ヒドロキシビタミンＤと混合し、試料由来の２５−ヒドロキシビタミンＤおよび標識２５−ヒドロキシビタミンＤが２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤への結合に関して競合し、それによって、第二の結合剤および標識２５−ヒドロキシビタミンＤの間の第二の複合体を得て、
ｄ）第二の複合体中に含まれない標識２５−ヒドロキシビタミンＤから、工程（ｃ）で得た第二の複合体中に含まれる標識２５−ヒドロキシビタミンＤを分離し、そして
ｅ）第二の複合体中に含まれる標識２５−ヒドロキシビタミンＤを測定し、それによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わない、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定する
工程を含む、前記方法。

図面の説明
本発明はさらに、以下の実施例および図によって解明される。実際の保護範囲は、本発明に付随する請求項から生じる。態様を図に模式的に示す。

図１：図１は、７｛２−［２−（２−｛（Ｓ）−３−［２−［（１Ｒ，７ａＲ）−１−（（Ｒ）−４，５−ジヒドロキシ−１，５−ジメチル−ヘキシル）−７ａ−メチル−オクタヒドロ−インデン−（４Ｅ）−イリデン］−エト−（Ｚ）−イリデン］−４−メチレン−シクロヘキシルオキシカルボニルアミノ｝−エトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−ヘプタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（酸のＮＨＳエステル）の化学構造を示す。

図２：図２は、試薬Ｒ１中に、ブロッキング剤（第一の結合剤）をそれぞれ含まないまたは含むＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビタミンＤ総イムノアッセイを示す。２５−ヒドロキシビタミンＤ_３（○、２５（ＯＨ）Ｄ_３）；２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（●、２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３）。
図２ａは、ブロッキング試薬（第一の結合剤）、ｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞ｒＫ−ＩｇＧを含まない結果を示す。
図２ｂは、干渉除去のため、ブロッキング試薬（第一の結合剤）、ｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞ｒＫ−ＩｇＧ（ｍＡｂ＜２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３＞）を含む結果を示す。

図３：２つの異なる試料セットに関して、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビタミンＤ総イムノアッセイおよびＬＣ−ＭＳビタミンＤ測定の間の相関を図３ａおよび３ｂに示す。ブロッキング試薬なし（○、第一の結合剤を含まない）およびブロッキング試薬を含む（●、第一の結合剤を含む）。

実施例１
２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対するブロッキング試薬の合成法
１．１ 抗原および抗原コンジュゲートの合成
７−｛２−［２−（２−｛（Ｓ）−３−［２−［（１Ｒ，７ａＲ）−１−（（Ｒ）−４，５−ジヒドロキシ−１，５−ジメチル−ヘキシル）−７ａ−メチル−オクタヒドロ−インデン−（４Ｅ）−イリデン］−エト−（Ｚ）−イリデン］−４−メチレン−シクロヘキシルオキシカルボニルアミノ｝−エトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−ヘプタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（図１の酸のＮＨＳエステル）の合成
出発材料２４，２５−Ｏ−イソプロピリデン−２４Ｒ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の合成は、Ｓｅｓｔｅｌｏ， Ｊｏｓｅ Ｐｅｒｅｚ； Ｃｏｒｎｅｌｌａ， Ｉｖａｎ； Ｄｅ Ｕｎａ， Ｏｌｇａ； Ｍｏｕｒｉｎｏ， Ａｎｔｏｎｉｏ； Ｓａｒａｎｄｅｓｅｓ， Ｌｕｉｓ Ａ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ − Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ （２００２）， ８（１２）， ２７４７−２７５２に記載される。構造を図１に示す。

１００ｍｇの出発材料および２６．８ｍｇのＤＭＡＰをフラスコ中で乾燥させ、そして２０ｍｌのジクロロメタンを添加した。１２１μｌトリエチルアミンを添加した後、８６．７ｍｇホスホゲンを、トルエン２０％溶液として添加した。溶液を不活性大気下で４５分間攪拌し、そして室温（ＲＴ；ＲＴは当業者には、２０℃〜２５℃（６８°Ｆ〜７７°Ｆ）として知られる）で光から保護し、そして１０ｍｌジクロロメタン中に溶解した３２４．６ｍｇのジアミノ−ジオキサ−オクタンを添加した。同じ条件下で、混合物をさらに一晩攪拌した。産物を調製用ＨＰＬＣによって精製した。収率＝７２ｍｇ。

アセトニトリル中、１６８ｍｇオクタンジオン酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、６８μｌトリエチルアミンと室温（ＲＴ）で一晩反応させることによって、５５ｍｇのアミン誘導体をＮＨＳエステルに変換した。ほぼ１ｇのＤｏｗｅｘ ５０ＷＸＨの添加によって、保護基を切断し、そして反応が完了するまで連続して攪拌した。産物を調製用ＨＰＬＣによって精製した。収率１６ｍｇ。ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｍ^＋＝８４４．７Ｄａ
抗原コンジュゲートの合成：
上述の５．６３ｍｇのＮＨＳエステルを、５００μｌ ＤＭＳＯに溶解し、そして５０ｍｇ ＫＬＨ（キーホール・リンペットヘモシアニン、Ｓｉｇｍａ Ｈ８２８３）の溶液に添加した。ｐＨをｐＨ＝８．３に調整し、そして溶液を一晩攪拌した。混合物をＡｍｉｃｏｎ攪拌セルにおいて精製した。

アミノ基の分析：抗原−ＫＬＨ比、およそ５００：１
１．２ ２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対する抗体の生成
ウサギＢ細胞ＰＣＲを用いた抗体発展：
２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対する抗体の生成のため、１６週齢のＺｉＫａウサギを、ＫＬＨにカップリングした２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３で免疫した。すべてのウサギを反復免疫に供した。最初の月は、動物を毎週免疫した。２ヶ月目以降は、動物を月１回免疫した。各免疫に関して、５００μｇ ＫＬＨカップリング２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３を、１ｍＬ １４０ｍＭ ＮａＣｌに溶解し、そして１ｍｌ ＣＦＡで乳化した。免疫開始４５日後および１０５日後に、力価の発展を評価する。免疫原に対する力価は、ＥＬＩＳＡによって検出可能になるとき、抗体は、Ｓｅｅｂｅｒら、２０１４に記載されるようなＢ細胞クローニングによって発展される。ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって、組換え全長ウサギＩｇＧを産生する。

力価分析：
２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対する血清力価を決定するため、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３のビオチン化変異体をストレプトアビジンコーティング９６ウェルプレートにカップリングした。免疫キャンペーン開始の４５日後および１０５日後に、各ウサギの少量の血清を収集する。ビオチン化２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３を、１５ｎｇ／ｍＬの濃度で、プレート表面に固定した。各ウサギ由来の血清を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に希釈し、そして希釈をプレートに添加した。血清を、希釈１：３００、１：９００、１：２７００、１：８１００、１：２４３００、１：７２９００、１：２１８７００および１：６５６１００で試験した。結合した抗体をＨＲＰ標識Ｆ（ａｂ’）_２ヤギ抗ウサギＦｃγ（Ｄｉａｎｏｖａ）および基質としてのＡＢＴＳ（Ｒｏｃｈｅ）で検出した。

実施例２
結合アッセイへの２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対するブロッキング試薬の適用
アッセイ法に応じて、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に特異的に結合する、ブロッキング試薬（例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の機能的活性部分、または合成抗体（プラスチック抗体））を、処理前に、あるいは放出試薬、アッセイ希釈剤またはアッセイ緩衝剤に添加して、アッセイのそれぞれの標識結合構成要素（コンジュゲート）の前にまたはそれと一緒に、試料中のビタミンＤ化合物と接触させる。

例えば、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビタミンＤ総イムノアッセイにおける２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３のブロッキングを記載する：
・０．０７５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞ｒＫ−ＩｇＧを、ルテニル化ビタミンＤ結合タンパク質コンジュゲートを含有するＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビタミンＤ総イムノアッセイの試薬Ｒ１に添加した。

・ビタミンＤ代謝物を含まないマトリックス（普遍的希釈剤）中、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３（○、２５（ＯＨ）Ｄ_３）または２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（●、２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３）いずれかの希釈シリーズで、ビタミンＤ総アッセイ適用を実行した。

・参照（ブロッキング試薬を含まない）は、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対する交差反応性を示した（表１および図２ａ）。
・ブロッキング試薬を伴うイムノアッセイ適用は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３への減少した交差反応性を示す一方、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３に対する特異性は影響を受けない（表１および図２ｂ）。

表１： ２５−ヒドロキシビタミンＤ_３（２５（ＯＨ）Ｄ_３）および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３）に関するシグナルダイナミクス（Ｂ／Ｂ０として示される）に対するｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞ｒＫ−ＩｇＧの効果

ｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞ｒＫ−ＩｇＧの陽性効果はまた、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および２５−ヒドロキシビタミンＤ_３のみに特異的であるＬＣ−ＭＳ／ＭＳに対して改善された相関で、２つの異なる試料セットに関して独立に見られることが可能であった。ブロッキング剤を伴わない（○）と、相関は０．９２（左）または０．７９（右）であった。ｍＡｂ＜２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３＞ｒＫ−ＩｇＧ（●、２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３）を添加した後、相関は、それぞれ、０．９４（左）または０．９０（右）に改善された。

Claims (15)

1. ２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：
   ａ）ビタミンＤ結合タンパク質に結合しているビタミンＤ化合物を含む、被験体から得た試料を提供し、
   ｂ）試料を
   （ｂａ）２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤と混合し、それによって、該第一の結合剤および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の間の複合体を形成し；
   （ｂｂ）２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤と混合し、それによって該第二の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤの間の複合体を形成し；
   ｃ）（ｂｂ）において形成された複合体を測定し、それによって、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わない、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定する
   工程を含む、前記方法。
2. 前記試料が、血液、血清または血漿である、請求項１記載の方法。
3. ビタミンＤ結合タンパク質に結合している、試料中に存在する前記ビタミンＤ化合物を、放出試薬を用いて、工程（ｂ）の前に、ビタミンＤ結合タンパク質から放出させる、請求項１または２のいずれか一項記載の方法。
4. 請求項１〜３のいずれか一項記載の方法であって、
   −Ｋ_ｄ（第一の結合剤）／Ｋ_ｄ（第二の結合剤）が１０またはそれ未満であり；そして／または
   −濃度（第一の結合剤）／濃度（第二の結合剤）が最大で２００である；
   ここで、Ｋ_ｄ（第一の結合剤）は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対する第一の結合剤のアフィニティであり、そしてＫ_ｄ（第二の結合剤）は、２５−ヒドロキシビタミンＤに対する第二の結合剤のアフィニティであり、そして
   濃度（第一の結合剤）および濃度（第二の結合剤）は、それぞれ、工程ｂ）における、第一の結合剤および第二の結合剤のモル濃度であり、特に濃度（第一の結合剤）は、１^＊（１〜１０）ｎｍｏｌ／Ｌ〜２００^＊（１〜１０）ｎｍｏｌ／Ｌの範囲であり、そして／または濃度（第二の結合剤）は、１〜１０ｎｍｏｌ／Ｌの範囲である
   前記方法。
5. 請求項１〜４のいずれか一項記載の方法であって、
   −２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３への結合に関する第一の結合剤のＫ_ｄが、１０^−８ｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満であり；そして／または
   −２５−ヒドロキシビタミンＤへの結合に関する第二の結合剤のＫ_ｄが、１０^−８ｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満である
   前記方法。
6. 酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
7. 前記２５−ヒドロキシビタミンＤが、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３および３−エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
8. 前記第一の結合剤がモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の機能的活性部分であり、そして前記第二の結合剤がビタミンＤ結合タンパク質または該ビタミンＤ結合タンパク質の機能的活性部分である、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
9. 前記第一の結合剤が、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に対して、前記第二の結合剤と、少なくとも同じ結合アフィニティを有する、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
10. 前記第二の結合剤が、第一の結合剤に結合している２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３を放出させることが不可能である、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
11. 前記第一の結合剤が、２５−ヒドロキシビタミンＤに対する有意な交差反応性を持たない、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
12. 前記決定のｉｎ ｖｉｔｒｏ法が競合アッセイとして行われる、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
13. ２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するための、請求項１〜１２のいずれか一項記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法の使用。
14. 被験体から得た試料において、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による干渉を伴わずに、２５−ヒドロキシビタミンＤの濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法における、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤および２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤の使用。
15. 請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法を実行するためのキットであって、
    ａ）２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３に結合する第一の結合剤、該第一の結合剤はモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の機能的活性部分である、および
    ｂ）２５−ヒドロキシビタミンＤに結合する第二の結合剤、該第二の結合剤はビタミンＤ結合タンパク質である、
    を少なくとも含む、前記キット。

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