JP6471099B2 - 1,25−ジヒドロキシビタミンdを検出するための方法及びキット並びに関連する抗体 - Google Patents
1,25−ジヒドロキシビタミンdを検出するための方法及びキット並びに関連する抗体 Download PDFInfo
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Description
以下に本発明を示す。
[発明1]
複合体を形成していないビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)と交差反応せずに、VDR−LBDと1,25−ジヒドロキシビタミンD又は1,25−ジヒドロキシビタミンDの類似体との間で形成される複合体のVDR−LBDに特異的に結合する、抗体。
[発明2]
重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、前記重鎖可変ドメインが、配列番号1、2、及び3からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含むモノクローナル抗体である、発明1に記載の抗体。
[発明3]
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号4、5、及び6からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む、発明1から2までに記載の抗体。
[発明4]
前記重鎖可変ドメインが、配列番号1、2、及び3を含む、発明2に記載の抗体。
[発明5]
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号4、5、及び6を含む、発明3又は4に記載の抗体。
[発明6]
前記重鎖可変ドメインが、配列番号7を含むか、又は配列番号8を含む核酸配列によりコードされる、発明4に記載の抗体。
[発明7]
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号9を含むか、又は配列番号10を含む核酸配列によりコードされる、発明5又は6に記載の抗体。
[発明8]
全長免疫グロブリン、又はF(ab)、F(ab’)、F(ab’) 2 、F(v)、F(c)、F(d)、単鎖抗体(scFv)からなる群から選択される抗体断片である、発明1から7までのいずれか一項に記載の抗体。
[発明9]
生物学的流体試料中の1,25−ジヒドロキシビタミンD(1,25(OH) 2 D)又はその類似体を検出するための方法であって、
(i)6から9の間に含まれる値に前記生物学的流体試料のpHを調整するステップ、同時に又は続いて、ビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)を含む受容体タンパク質を、前記生物学的流体試料に添加するステップであって、それによって、前記受容体タンパク質のVDR−LBDに1,25−ジヒドロキシビタミンD又はその類似体を結合させるステップと、
(ii)1,25−ジヒドロキシビタミンD又はその類似体に結合したビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)を含む前記受容体タンパク質を、複合体を形成していないVDR−LBDと交差反応せずに、1,25−ジヒドロキシビタミンD又はその類似体に結合したビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)に特異的に結合することができる捕捉部分によって捕捉するステップと、
(iii)1,25−ジヒドロキシビタミンD又はその類似体に結合したビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)を含む捕捉された前記受容体タンパク質を検出するステップとを含む、上記方法。
[発明10]
前記受容体タンパク質が、単離された形態又は操作された形態の完全体のビタミンD受容体タンパク質又はそのリガンド結合ドメイン(LBD)である、発明9に記載の方法。
[発明11]
前記ビタミンD類似体が、19−ノル−1α−25−ジヒドロキシビタミンD 2 、1α−ヒドロキシビタミンD 2 、1α−ヒドロキシエルゴカルシフェロール、又は2−メチレン−19−ノル−(20S)−1α,25−(OH) 2 D 3 である、発明9又は10に記載の方法。
[発明12]
前記捕捉部分が、発明1から8までのいずれか一項に記載の抗体である、発明9から11までのいずれか一項に記載の方法。
[発明13]
前記捕捉部分が、固体支持体上に固定される、発明9から12までのいずれか一項に記載の方法。
[発明14]
前記生物学的流体が、全血、血漿、血清、又は尿である、発明9から13までのいずれか一項に記載の方法。
[発明15]
ステップ(i)において、前記生物学的流体試料のpHが、7から8.6の間に含まれる値に調整される、発明9から14までのいずれか一項に記載の方法。
[発明16]
サンドイッチイムノアッセイである、発明9から15までのいずれか一項に記載の方法。
[発明17]
1,25−ジヒドロキシビタミンD又はその類似体に結合したビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)を含む捕捉された前記受容体タンパク質を検出するステップ(iii)が、標識された抗VDR−LBD検出抗体を用いて実施される、発明16に記載の方法。
[発明18]
生物学的流体試料中の1,25−ジヒドロキシビタミンD又はその類似体を検出するためのキットであって、
− ビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)を含む受容体タンパク質;
− 複合体を形成していないVDR−LBDと交差反応せずに、VDR−LBDと1,25−ジヒドロキシビタミンD又はその類似体との間で形成される複合体のビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)に特異的に結合することができる捕捉部分、及び
− 6から9の間に含まれるpHを有する結合緩衝液
を含む、上記キット。
[発明19]
前記受容体タンパク質が、単離された形態又は操作された形態の完全体のビタミンD受容体タンパク質又はそのリガンド結合ドメインである、発明18に記載のキット。
[発明20]
前記捕捉部分が、発明1から8までのいずれか一項に記載の抗体である、発明18又は19に記載のキット。
[発明21]
前記結合緩衝液が、7から8.6の間に含まれるpHを有している、発明18から20までのいずれか一項に記載のキット。
また、出願時の請求項18で定義するような、生物学的流体試料中の1,25(OH)2D又はその類似体を検出するためのキットも、本発明の範囲内にある。
る。
て利用可能にされたため、抗体それ自体も、本発明の範囲内に入る。
ラットVDR−LBDタンパク質の発現及び精製
本発明の方法及びキットのための適切な試薬として使用され得る組換えVDR−LBDタンパク質を作製するために、プラスミドベースの発現ベクターを構築した。手短に言えば、47アミノ酸の内部ループ(165〜211)が欠失しているドブネズミに由来するビタミンD受容体のリガンド結合ドメインの残基116〜423(rVDR−LBD)をコードするDNAを、Nde I/Bgl II制限部位組合せを用いることによってpET−29bプラスミド(Novagen)中にクローニングした。組換えVDR−LBDタンパク質の検出及び精製を容易にするために、VDR−LBDコード配列の下流にHisタグコード配列、続いて停止コドンをクローニングすることによって、対象のタンパク質のC末端にポリヒスチジンタグを付加することができる。
VDR−LBD/1,25(OH)2D複合体を認識できる立体構造特異的モノクローナル抗体の作製
立体構造特異的抗体を作製するために本発明者らが追究する戦略は、1,25(OH)2Dに結合したビタミンD受容体の結合ドメイン(VDR−LBD)からなる複合体を免疫原として利用することに基づいた。適切なアジュバントを用いて配合した免疫原の個々の使用アリコートをBALB/cマウスに注射した。4週間後、6週間後、及び8週間後に、ポリエチレングリコール(PEG)を融合剤として用いて、マウス脾臓由来のリンパ球をSP2/0マウス骨髄腫細胞と融合した。これらのハイブリッド細胞を、ハイスループットな96ウェル培養プレート形式で、384個のウェルに播種した。
ハイブリドーマクローン11B4H11H10によって発現された免疫グロブリンGのVH遺伝子及びVL遺伝子のDNAコンセンサス配列の同定
11B4H11H10の大もとの貯蔵バイアルを解凍し増殖させて、cDNAライブラリー構築のために典型的な(representative)数の細胞を生じさせた。手短に言えば、75cm2フラスコ中の活発な対数増殖細胞培養物から1×107個のハイブリドーマ細胞を単離し、50cm2のポリプロピレン製滅菌済み遠心分離チューブ中、500×gで4分間、遠心分離した。TRIzol(登録商標)試薬(Invitrogen)を用いて全RNAを単離し、Nanodrop(商標)を用いて定量した。オリゴdTプライマー手順を用いて、ハイブリドーマの全RNA(500ng)を逆転写した。マウスの免疫グロブリン可変重鎖(Vh)及び可変軽鎖(Vl)を、特異的プライマーを用いることによってcDNAライブラリーから増幅させた(RT−PCR)。増幅されたそれらの鎖を、TAクローニングによってTOPOベクター(Invitrogen)中にランダムな向きで独立に挿入した。このライゲーション産物を、エレクトロポレーションによって、大腸菌(E.coli)のエレクトロコンピテント維持株にトランスフォームした。
1,25(OH)2Dアッセイ
本発明のアッセイの好ましい実施形態の内の1つを次のようにして発展させた。常磁性微粒子(PMP)(Dynal、Norway)を、供給業者の取扱い説明書に従って11B4モノクローナル抗体でコーティングした。このアッセイで使用した組換えVDR−LBDは、実施例1で説明したようにして調製し、アフィニティータグと結合させた(以下、「TAG」と呼ぶ)。このアッセイで使用した11B4H11H10モノクローナル抗体は、実施例2で説明したようにして調製した。マウスモノクローナル抗TAG抗体を、pH7.4のPBS緩衝液に溶かした環状アミノブチルエチルイソルミノール(cABEI)と結合させた。算出されたcABEI組込みは、抗体分子1個当たり2〜3分子であった。ステロイドを含まないチャコール処理済ヒト血清中に様々な濃度の1,25(OH)2Dエタノール溶液を添加することによって、標準物質を調製した。アッセイ用緩衝液配合物は、50mM TRIS(pH7.4)、0.02%CHAPS、1mM EDTA、8mg/mlヘパリン、及び異好性のヒト抗マウス(HAMA)干渉を軽減するための1%マウス血清からなった。
Claims (17)
- ビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)と1,25−ジヒドロキシビタミンD又は1,25−ジヒドロキシビタミンDの類似体との間で形成される複合体に特異的に結合する、モノクローナル抗体であって、モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインのCDRのアミノ酸配列が配列番号1、2、及び3であり、モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインのCDRのアミノ酸配列が配列番号4、5、及び6である、モノクローナル抗体。
- 前記重鎖可変ドメインが、配列番号7のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号8を含む核酸配列によりコードされる、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 前記軽鎖可変ドメインが、配列番号9のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号10を含む核酸配列によりコードされる、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体。
- 全長免疫グロブリン、又はF(ab)、F(ab’)2、F(v)、単鎖抗体(scFv)からなる群から選択される抗体断片である、請求項1から3までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
- 生物学的流体試料中の1,25−ジヒドロキシビタミンD(1,25(OH)2D)又はその類似体を検出するための方法であって、
(i)6から9の間に含まれる値に前記生物学的流体試料のpHを調整するステップ、同時に又は続いて、ビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)を含む受容体タンパク質を、前記生物学的流体試料に添加するステップであって、それによって、前記受容体タンパク質のVDR−LBDに1,25−ジヒドロキシビタミンD又はその類似体を結合させるステップと、
(ii)1,25−ジヒドロキシビタミンD又はその類似体に結合したビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)を含む前記受容体タンパク質を、ビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)と1,25−ジヒドロキシビタミンD又はその類似体との間で形成される複合体に特異的に結合することができるモノクローナル抗体によって捕捉するステップであって、モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインのCDRのアミノ酸配列が配列番号1、2、及び3であり、モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインのCDRのアミノ酸配列が配列番号4、5、及び6である、ステップと、
(iii)1,25−ジヒドロキシビタミンD又はその類似体に結合したビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)を含む捕捉された前記受容体タンパク質を検出するステップとを含む、上記方法。 - 前記受容体タンパク質が、単離された形態又は操作された形態の完全体のビタミンD受容体タンパク質又はそのリガンド結合ドメイン(LBD)である、請求項5に記載の方法。
- 前記ビタミンD類似体が、19−ノル−1α−25−ジヒドロキシビタミンD2、1α−ヒドロキシビタミンD2、1α−ヒドロキシエルゴカルシフェロール、又は2−メチレン−19−ノル−(20S)−1α,25−(OH)2D3である、請求項5又は6に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、請求項1から4までのいずれか一項に記載の抗体である、請求項5から7までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、固体支持体上に固定される、請求項5から8までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的流体が、全血、血漿、血清、又は尿である、請求項5から9までのいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(i)において、前記生物学的流体試料のpHが、7から8.6の間に含まれる値に調整される、請求項5から10までのいずれか一項に記載の方法。
- サンドイッチイムノアッセイである、請求項5から11までのいずれか一項に記載の方法。
- 1,25−ジヒドロキシビタミンD又はその類似体に結合したビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)を含む捕捉された前記受容体タンパク質を検出するステップ(iii)が、標識された抗VDR−LBD検出抗体を用いて実施される、請求項12に記載の方法。
- 生物学的流体試料中の1,25−ジヒドロキシビタミンD又はその類似体を検出するためのキットであって、
− ビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)を含む受容体タンパク質;
− ビタミンD受容体のリガンド結合ドメイン(VDR−LBD)と1,25−ジヒドロキシビタミンD又はその類似体との間で形成される複合体に特異的に結合することができるモノクローナル抗体であって、モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインのCDRのアミノ酸配列が配列番号1、2、及び3であり、モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインのCDRのアミノ酸配列が配列番号4、5、及び6である、モノクローナル抗体、及び
− 6から9の間に含まれるpHを有する結合緩衝液
を含む、上記キット。 - 前記受容体タンパク質が、単離された形態又は操作された形態の完全体のビタミンD受容体タンパク質又はそのリガンド結合ドメインである、請求項14に記載のキット。
- 前記モノクローナル抗体が、請求項1から4までのいずれか一項に記載の抗体である、請求項14又は15に記載のキット。
- 前記結合緩衝液が、7から8.6の間に含まれるpHを有している、請求項14から16までのいずれか一項に記載のキット。
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