KR20180104080A - 비타민 d 대사산물 검출용 장치 - Google Patents

비타민 d 대사산물 검출용 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 측면 유동 장치를 사용하여, 작은 분석물을 사용하여 분석물을 신속하게 검출하기 위한 방법, 장치 및 조성물을 제공한다. 본원에는 전혈, 혈청 또는 혈장 샘플에서 샌드위치-기반 면역검정을 사용함으로써 비타민 D를 검출하고 정량할 수 있는 그러한 측면 유동 장치가 기술된다.

Description

비타민 D 대사산물 검출용 장치
교차-참조
본 출원은 2016년 1월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 62/286,297 (대리인 사건 번호 49821-701.101)의 이익을 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 비타민 D 대사산물 검출용 장치 및 방법에 관한 것이다.
비타민 D는 칼슘의 장 흡수를 향상시키고 그것의 항상성의 조절에 책임이 있는 스테로이드 호르몬의 그룹을 말한다. 비타민 D의 두 가지 흔한 형태는 비타민 D2 및 비타민 D3이다. 비타민 D3은 자외선에의 노출을 통해 인간 피부에서 자연적으로 생성되는 반면, 비타민 D2는 주로 음식과 보충제로부터 얻어진다. 비타민 D2 및 비타민 D3은 생물학적으로 비활성이고; 활성화는 비타민 D2 및 비타민 D3의 간으로의 수송을 필요로 하고, 간에서 그것들은 본원에서 25-하이드록시 비타민 D ("25-(OH)D")로서 언급된 활성 형태로 하이드록실화에 의해 대사될 수 있다. 비타민 D 결합 단백질 DBP는 모든 비타민 D 대사산물에 대해 지배적인 혈청 수송 단백질이다. DBP는 총 25-OHD의 95 내지 99%를 수송하고 단지 1 내지 5%만이 알부민 및 리포단백질에 의해 운반된다. 비타민 D 결핍은 골다공증, 골연화증, 구루병, 암, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 및 감염성 질환을 포함하여, 많은 질환과 결부되었고, 또한 증가된 사망률 위험과도 관련된다.
유감스럽게도, 비타민 D 결핍은 전세계적으로 상당한 건강 관심사이고 세계적으로 유행이 되었다. 추산하여 전세계적으로 10억명의 사람들이 적당한 비타민 D 수준을 갖고 있지 않다. 나아가, 64%의 미국인이 충분한 비타민 D의 차선 비타민 D 수준을 갖고 있지 않은 것으로 추정된다. 비타민 D 결핍의 주요 원인은 대부분의 사람들에게 비타민 D의 주요 공급원인 적당한 햇빛 노출의 부족이다.
25-(OH)D 혈액 테스트는 대상체의 순환 비타민 D 농도를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 25-OH(D2) 및 25-OH(D3)를 포함하여 25-(OH)D의 혈액 농도는 비타민 D 상태의 최상의 지표라고 여겨진다. 지난 10년은 환자 집단에서 25-(OH)D 수준의 분석을 위한 요구가 전세계적으로 증가하였다.
비타민 D는 그것의 고도의 친유성 및 비타민 D 결합 단백질 DBP에 대한 고-친화도 결합으로 인해 정확히 측정하기에는 도전적인 분석물이다. 현재의 측정은 대체로 시간-소모적인 방법, 예컨대 액체 크로마토그래피-병행 질량 분광분석 (LC-MS/MS) 검정, 방사성 면역검정 (RIA), 효소-결합 경합 면역흡착 검정 (ELISA), 및 경합 단백질-결합 검정 (CPBA)을 사용하여 전문 실험실에서 수행된다.
비타민 D 대사산물을 검출하고 정량하기 위한 개선된 방법에 대한 요구가 존재한다. 본원에서는 간단하고, 신속하며 정확한 검정에 의해 비타민 D 대사산물을 검출하고 정량하기 위한 방법, 조성물, 및 장치가 제공된다.
하나 이상의 비타민 D 분자를 검출하고 측정하기 위한 대체 장치, 방법 및 키트에 대한 요구가 상당히 존재한다. 본 발명은 이런 요구를 고민하고 추가적인 장점들을 제공한다. 한 측면으로, 본 발명은 하나 이상의 비타민 D 분자를 검출하기 위한 테스트 장치를 제공하며, 테스트 장치는 (a) 하우징을 포함하고, 하우징에는 (i) 생물학적 샘플을 흡수하고 생물학적 샘플을 컨쥬게이트 패드에 수송하도록 구성된 샘플 적용 패드; (ii) 하나 이상의 비타민 D 분자에 특이적으로 결합하는 비타민 D 결합제를 포함하는 컨쥬게이트 패드; 및 (iii) 비타민 D 결합제가 하나 이상의 비타민 D 분자와 복합체를 형성함으로써 생성된 에피토프에 특이적으로 결합하는 검출 항체가 고정되어 있는 제 1 영역을 포함하는 검출 구역이 포함된다.
본원에 제공된 일부 구체예에서, 하나 이상의 비타민 D 분자는 25-하이드록시비타민 D2, 25-하이드록시비타민 D3, 25-하이드록시비타민 D4, 25-하이드록시비타민 D5, 및 1,25-하이드록시비타민 D3으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 하나 이상의 비타민 D 분자는 25-하이드록시비타민 D2 및 25-하이드록시비타민 D3으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 하나 이상의 비타민 D 분자는 25-하이드록시비타민 D2 및 25-하이드록시비타민 D3이다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 하나 이상의 비타민 D 분자는 25-하이드록시비타민 D2로 구성된다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 하나 이상의 비타민 D 분자는 25-하이드록시비타민 D3으로 구성된다.
본원에 제공된 일부 구체예에서, 검출 구역은 제 2 영역을 추가로 포함하고, 비타민 D 결합제가 하나 이상의 비타민 D 분자에 결합되거나 결합되지 않거나 간에 비타민 D 결합제에 결합할 수 있는 제 3 항체가 제 2 영역 안에 고정된다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 비타민 D 결합제는 검출 시약에 컨쥬게이션된다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 검출 시약은 금 입자, 라텍스 입자, 탄소 나노입자, 셀레늄 나노입자, 은 나노입자, 양자점 (quantum dot), 형광 화합물, 염료, 효소 및 리포솜으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 검출 시약은 금 입자이다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 검출 시약은 라텍스 입자이다.
본원에 제공된 일부 구체예에서, 샘플 적용 패드, 컨쥬게이트 패드, 및 검출 구역은 유체 경로를 따라 상류로부터 하류로 배치되고, 생물학적 샘플이 유체 경로를 통해 이동한다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 테스트 장치는 생물학적 샘플의 수성 부분으로부터 생물학적 샘플의 미립자 부분을 분리시키기 위해 샘플 적용 패드와 컨쥬게이트 패드 사이에 구성된 여과 구성요소를 추가로 포함한다.
한 측면으로, 본 발명은 본원에 개시된 테스트 장치들 중 임의의 한 장치의 샘플 적용 패드에 생물학적 샘플을 적용하는 단계; 샘플 적용 패드에 추적 완충액 (chase buffer)을 적용하는 단계; 및 하나 이상의 비타민 D 분자를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 방법은 샘플 중의 하나 이상의 비타민 D 분자를 정량하는 단계를 더 포함한다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 정량 단계는 혈액 샘플을 충분한, 불충분한, 또는 결핍된 수준의 하나 이상의 비타민 D 분자를 가지는 것으로서 분류한다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 충분한 수준은 적어도 30 ng/mL이다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 불충분한 수준은 적어도 10 ng/mL 및 30 ng/mL 미만이다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 결핍 수준은 10 ng/mL 미만이다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 정량 단계는 검출 멤브레인의 영상을 제공하기 위한 영상 장치 및 검출 멤브레인의 영상을 기반으로 샘플 중의 하나 이상의 비타민 D 분자를 정량하도록 구성된 프로그래밍된 컴퓨터 상의 소프트웨어를 사용하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 영상 장치 및 프로그래밍된 컴퓨터는 단일 장치이다.
본원에 제공된 일부 구체예에서, 추적 완충액은 하나 이상의 비타민 D 분자를 비타민 D 결합 단백질로부터 해리시키기 위한 시약을 포함한다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 전혈 (whole blood), 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 눈 분비물, 척수액, 및 땀으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 검출 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 경쇄는 SEQ ID NO 1 내지 5 및 16 내지 20으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하며; 중쇄는 SEQ ID NO 6 내지 15로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 항체는 면역복합체에 대해 비타민 D 결합제보다 더 높은 결합 친화도를 나타낸다. 일부 구체예에서, 검출 항체는 scFv, VH, Fab, 또는 (Fab)2 결합 유닛을 포함한다.
일부 구체예에서, 검출 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 경쇄는 SEQ ID NO 1 내지 5 및 16 내지 20으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%의 서열 상동성을 공유하는 서열을 포함하며, 중쇄는 SEQ ID NO 6 내지 15로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 최소한 80%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함한다.
또 다른 측면으로, 본 개시는 결합 검정을 수행하도록 구성된 테스트 장치로 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 비타민 D 수준을 검출하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 생물학적 샘플을 테스트 장치에 접촉시키는 단계; (b) 생물학적 샘플에 대해 (1) 비타민 D 결합제 및 (2) 하나 이상의 비타민 D 분자에 의해 형성된 복합체를 포함하는 반응 혼합물을 사용하는 결합 검정을 수행하는 단계; (c) 비타민 D 결합제와 하나 이상의 비타민 D 결합 분자의 복합체를 형성함으로써 형성된 에피토프에 결합하는 검출제에 그 복합체를 추가로 노출시키는 단계를 포함하고, 결합 검정은 액체 크로마토그래피-병행 질량 분광분석의 검출 민감도에 비슷한 생물학적 샘플 중의 검출 민감도를 가진다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 눈 분비물, 척수액, 및 땀으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서 검출제는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 경쇄는 SEQ ID NO 1 내지 5 및 16 내지 20으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하며, 중쇄는 SEQ ID NO 6 내지 15로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 검출제는 복합체에 대해 비타민 D 결합제보다 더 높은 결합 친화도를 나타낸다. 일부 구체예에서, 검출제는 scFv, VH, Fab, 또는 (Fab)2 결합 유닛을 포함한다.
일부 구체예에서, 검출제는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 경쇄는 SEQ ID NO 1 내지 5 및 16 내지 20으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%의 서열 상동성을 공유하는 서열을 포함하며, 중쇄는 SEQ ID NO 6 내지 15로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 눈 분비물, 척수액, 및 땀으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
한 측면으로, 본 발명은 본원에 개시된 테스트 장치 중 임의의 테스트 장치; 및 키트의 사용을 위한 서면 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 키트는 멸균제; 피부를 천공하기 위한 장치; 거즈; 추적 완충액; 및 마이크로피펫으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 구성요소를 추가로 포함한다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 멸균제는 알코올 물수건이다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 피부를 천공하기 위한 장치는 란셋, 바늘, 및 주사기로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본원에 제공된 일부 구체예에서, 추적 완충액은 하나 이상의 비타민 D 분자를 혈액 샘플 중의 비타민 D 결합 단백질로부터 해리하도록 구성된다. 본원에 제공된 일부 구체예에서, 키트는 샘플 중의 하나 이상의 비타민 D 분자의 양에 신호 강도를 관련시키는 색상표 (color chart)를 추가로 포함한다.
참조에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 별개의 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
발명의 신규한 특징들은 첨부된 청구범위에서 특히 제시된다. 본 발명의 특징 및 장점의 더 나은 이해는 발명의 원리가 이용되는 예시적인 구체예들을 제시한 다음의 상세한 설명 및 첨부되는 도면을 참조로 얻어질 것이다.
도 1A 내지 B는 비타민 D 대사산물 수준을 검출하기 위한 예시적인 측면 유동 장치를 도시한다. 도 1A는 대상체에서 비타민 D 대사산물의 수준과 관련된 밴드 밀도를 나타낸다. 도 1B는 혈액 샘플 중의 비타민 대사산물 농도의 양의 범위에 밴드 밀도를 결부시키는 색상표를 나타낸다. 도 1C는 비타민 D를 검출하기 위한 예시적인 측면 유동 장치의 개략도를 도시한다.
도 2는 25-(OH)D3:AF10 항체 면역복합체에 대한 마우스 항체 클론들의 결합을 테스트하기 위한 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)의 결과를 도시한다.
도 3은 25-(OH)D3:AF10 항체의 면역복합체에 대한 합성 항체 클론들의 결합을 테스트하는 ELISA의 결과를 도시한다.
도 4는 25-(OH)D:AF10 항체의 면역복합체에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 혈청 비타민 D 수준과 샌드위치 ELISA의 신호 사이의 선형 관계를 도시한다.
도 5는 10 ng/ml 내지 80 ng/ml 범위의 신호 강도와 25-(OH)D 수준 사이의 선형 관계를 보여주는, 대상체 혈액 및 혈청에서 25-(OH)D 수준을 테스트하기 위한 예시적인 측면 유동 장치의 사용 결과를 도시한다.
도 6은 (i) 스마트폰-기반 판독자에 의해 측정되는 바 모세관 혈액의 비타민 D 수준을 측정하기 위한 예시적인 측면 유동 장치 및 (ii) ELISA-기반 혈청 및 또는 혈액 테스트를 사용하여 측정되는 바 비타민 D 수준들 사이의 비교 결과를 도시한다.
도 7은 본원에 개시된 테스트 장치의 검출 구역의 영상의 분석을 위해 사용될 수 있는 예시적인 컴퓨터 시스템을 도시한다.
도 8은 휴대용 측면 유동 검정 판독기를 사용하는 비타민 D 측정 과정을 도시한다.
도 9는 측면 유동 검정 및 액체 크로마토그래피-병행 질량 분광분석 검정으로부터 생성된 테스트 결과들 사이의 상관관계를 도시한다.
본원에서 기술되는 본 개시의 시스템 및 방법은, 다르게 표시되지 않는 한, 업계에서 실시할 수 있는 사람들의 숙련도 내에서 분자 생물학 (재조합 기법을 포함함), 세포 생물학, 생화학, 마이크로배열 및 서열분석 기술의 종래의 기법 및 설명을 사용할 수 있다. 그러한 종래 기법들은 폴리머 배열 합성, 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 및 결찰, 올리고뉴클레오타이드의 서열분석, 및 표지를 사용한 혼성화의 검출을 포함한다. 적합한 기법의 구체적 예시는 본원의 실시예를 참조로 이루어질 수 있다. 그러나, 당연히 동등한 종래 과정들이 또한 사용될 수 있다. 그러한 종래 기법들 및 성멸들은 예컨대 다음의 표준 실험실 매뉴얼에서 찾아볼 수 있고: Green, et al., Eds., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV) (1999); Weiner, et al., Eds., Genetic Variation: A Laboratory Manual (2007); Dieffenbach, Dveksler, Eds., PCR Primer: A Laboratory Manual (2003); Bowtell and Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003); Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004); Sambrook and Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006); and Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L., Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, N.Y. (1995); Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" IRL Press, London (1984); Nelson and Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry, 3rd Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2000); 및 Berg et al., Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2002), 그것들은 모두 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시는 기술된 특이적 시스템 및 방법, 조성물, 표적 및 사용이 당연히 다를 수 있기 때문에, 그것들에 제한되지 않는 것이 인지되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 측면을 기술할 목적을 위한 것이고 본 개시의 범주를 제한하려는 의도가 아니며, 본 개시의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이라는 것이 인지되어야 한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업계의 숙련된 사람에 의해 측정되는, 부분적으로는 값이 측정되는 또는 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 좌우될, 특정 값에 대해 허용되는 오차 범위 내에 있는 것을 의미한다. 예를 들어, "약"은 업계에서 실시마다, 1 이내의 또는 1을 초과하는 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5% 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 용어는 크기의 한 자릿수 내에, 바람직하게는 값의 5-배 이내에, 더 바람직하게는 2-배 이내에 있는 것을 의미할 수 있다. 특정한 값이 출원 및 청구범위에서 기술되는 경우에, 다르게 표시되지 않는 한 용어 "약"은 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 내에 있는 것을 의미하는 것으로 가정되어야 한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 것과 같이, 그것들은 일반적으로 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중 어느 하나, 또는 그것들의 유사체의 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머 형태를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지된 또는 미지의 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적 예시는 유전자 또는 유전자 단편의 암호화 또는 비-암호화 영역, 유전자 사이 DNA (intergenic DNA), 계통 분석으로부터 규정된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은-헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 짧은 핵 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브, 어댑터, 및 프라이머들이다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리머의 조립 전 또는 후에 이루어질 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소들에 의해 방해될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 중합반응 후에, 예컨대 표지화 구성요소와의 컨쥬게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비 아미노산에 의해 방해될 수 있다. 용어는 또한 변형된 아미노산 폴리머; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작, 예컨대 표지화 구성요소와의 컨쥬게이션을 포함한다. 본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘 다를 포함하여, 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 펩타이드 모방물을 포함한다.
"대조군"은 비교 목적으로 실험에서 사용된 대체 대상체 또는 샘플이다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 본원에서 척추동물, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 인간을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 포유류는, 한정하는 것은 아니지만, 쥐과, 유인원, 인간, 가축, 스포츠용 동물, 및 애완동물을 포함한다. 생체내에서 얻어진 또는 시험관내에서 배양된 생물학적 정체의 조직, 세포, 및 그것들의 자손이 또한 포함된다.
용어 "측정하는", "결정하는", "평가하는", "사정하는", "검정하는", "검출하는" 및 "분석하는"은 본원에서 임의의 형태의 측정을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용되고, 요소하 존재하는지의 여부를 측정하는 것 (예를 들어 검출)을 포함한다. 이 용어들은 정량 및/또는 정성 측정 둘 다를 포함할 수 있다. 평가는 상대적이거나 절대적일 수 있다. "~의 존재를 검출하는 것"은 존재하는 무언가의 양을 측정하는 것뿐만 아니라, 그것이 존재하는지의 여부를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
"항체"는 다른 분자와 특이적으로 결합하고, 그로써 다른 분자의 특정 공간적 및 극성 조직화와 상보적인 것으로서 규정되는 구역을 표면에 또는 공동에 가지는 면역글로불린, 또는 그것의 유도체 또는 단편 또는 활성 단편이다. 항체는 단클론성 또는 다클론성일 수 있고 업계에 널리 알려져 있는 기법들, 예컨대, 숙주 세포의 면역화 및 혈청의 수집 또는 하이브리드 세포주 기술에 의해 제조될 수 있다.
테스트 장치
한 측면으로, 본 발명의 개시는 하나 이상의 비타민 D 분자를 검출하기 위한 테스트 장치를 제공하는데, 테스트 장치는 (a) 하우징을 포함하고, 하우징에는 (i) 생물학적 샘플을 흡수하고 생물학적 샘플을 컨쥬게이트 패드에 수송하도록 구성된 샘플 적용 유닛; (ii) 하나 이상의 비타민 D 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체를 포함하는 상기 컨쥬게이트 패드; (iii) 면역복합체에 특이적으로 결합하는 제 2 항체가 고정되어 있는 제 1 영역을 포함하는 검출 구역이 포함되어 있고, 상기 면역복합체는 (a) 상기 제 1 항체 및 (b) 상기 하나 이상의 비타민 D 분자, 또는 상기 제 1 항체와 상기 하나 이상의 비타민 D 분자를 복합체화함으로써 생성된 에피토프를 포함한다.
"하나 이상의 비타민 D 분자"는 칼슘, 철, 마그네슘, 인산염 및 아연의 장 흡수를 향상시키는 것을 책임지는 지용성 세코스테로이드(secosteriod) 그룹의 구성원들을 나타낸다. 이 그룹의 예시적인 구성원은 비타민 D1, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 D4, 및 그것의 하이드록실화된 버전이다. 예시적인 하이드록실화된 비타민 D 분자는 25-하이드록시비타민 D2 (25-OHD2 또는 25-(OH)D2) 및 25-하이드록시비타민 D3 (25-OHD3 또는 25-(OH)D3)이다. 하나 이상의 비타민 D 분자는 1-α 위치에 부착된 추가적인 하이드록시기를 가진 비타민 D 화합물, 예컨대 1,25-하이드록시비타민 D3 (1,25-OHD3 또는 1,25-(OH)D3)을 포함할 수 있다.
테스트 장치는 측면 유동 테스트 장치일 수 있다. 측면 유동 장치는 하우징, 그 안에 동봉된 테스트 스트립을 포함할 수 있다. 테스트 스트립은 샘플 적용 유닛, 컨쥬게이트 패드 및/또는 검출 유닛을 포함할 수 있다. 테스트 스트립은 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 만약 테스트 스트립이 한 가지를 초과하는 물질을 포함한다면, 하나 이상의 물질은 바람직하게는 유체 연통된다. 테스트 스트립의 한 가지 물질은 테스트 스트립의 다른 물질 위에 겹쳐질 수 있는데, 예를 들면, 필터지가 니트로셀룰로오스 위에 겹쳐져 있다. 대안적으로 또는 그에 더불어, 테스트 스트립은 하나 이상의 물질을 포함하는 영역과 이어서 하나 이상의 상이한 물질을 포함하는 영역을 포함할 수 있다. 이런 경우에, 영역들은 유체 연통되고 부분적으로 서로 겹쳐지거나 겹쳐지지 않을 수 있다. 테스트 스트립에 적합한 물질은, 한정하는 것은 아니지만, 셀룰로오스, 예컨대 필터지, 크로마토그래피용 종이, 니트로셀룰로오스, 및 셀룰로오스 아세테이트로부터 유래된 물질, 뿐만 아니라 유리 섬유, 나일론, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리아크릴아미드, 교차결합된 덱스트란, 아가로스, 폴리아크릴레이트, 세라믹 물질, 등으로 만들어진 물질을 포함한다. 테스트 스트립의 물질 또는 물질들은 그것들의 모세관 흐름 특성 또는 적용된 샘플의 특성을 변형시키기 위해 선택적으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 테스트 스트립의 샘플 적용 영역은 적용된 뇨 샘플의 pH 또는 비중을 교정하기 위하여 또는 최적의 테스트 조건을 확보하기 위하여 완충액으로 처리될 수 있다.
테스트 스트립 물질 또는 물질들은 스트립으로 절단된 시트와 같은 단일 구조이거나 또는 예를 들어 박층 크로마토그래피에서 발견되는 것과 같은 지지체 또는 고체 표면에 결합된 여러 스트립 또는 입자 물질일 수 있고 통합된 부분으로서 액체 접촉시 흡수 패드를 가질 수 있다. 물질은 또한 레인 형성을 유도하기 위해 그 위에 반점이 생길 수 있는 레인들을 가지는 시트일 수 있고, 이때 각 레인에서 별도의 검정이 수행될 수 있다. 물질은 직사각형, 원형, 타원형, 삼각형 또는 다른 형상을 가질 수 있으며, 단 테스트 용액을 횡단하여 적어도 한 방향으로 모세관 이동이 있다. 다른 횡단 방향은 테스트 용액과 중심에서 접촉된 타원형 또는 원형 조각에서와 같이 일어날 수 있다. 그러나, 주요 고려사항은 예정된 부위로 흐르는 적어도 하나의 방향이 있다는 것이다. 다음의 논의에서 스트립이 제한이 아닌 예시에 의해 기술될 것이다.
지지체가 바람직하거나 필요한, 테스트 스트립에 대한 지지체는 일반적으로 수불용성, 빈번하게 비-다공성 및 견고하지만 탄성일 수 있는, 보통 소수성이며, 다공성이고 보통은 스트립과 동일한 길이 및 폭의 것이겠지만 스트립보다 크거나 작을 수 있다. 지지체 물질은 투명할 수 있고, 본 발명의 테스트 장치가 조립될 때, 투명한 지지체 물질은 사용자가 볼 수 있는 테스트 스트립 쪽에 있어서, 투명한 지지체 물질이 테스트 스트립 위에 보호층을 형성할 수 있게 되고, 그곳에서 보호층은 테스트 장치의 전면의 구멍에 의해서와 같이, 외부 환경에 노출될 수 있다. 천연 및 합성의, 광범위한 고정성 및 비-고정성 물질, 및 그것들의 조합이 사용될 수 있고, 단 지지체는 물질 또는 물질들의 모세관 작용을 간섭하지 않거나, 또는 비-특이적으로 검정 성분들과 결합하거나, 또는 신호 생성 시스템을 간섭한다. 예시적인 폴리머는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 유리, 세라믹, 금속, 등을 포함한다. 탄성 지지체는 폴리우레탄, 네오프렌, 라텍스, 실리콘 고무 등으로 만들어질 수 있다.
테스트 장치는 샘플 적용 유닛으로 이어지는 샘플 적용 구멍을 포함할 수 있다. 일부 경우에, "샘플 적용 구멍"은 테스트 장치의 오프닝이 테스트 스트립의 샘플 적용 유닛에 대한 접근을 제공하는 경우에 테스트 장치 또는 테스트 스트립의 일부를 나타내는 것일 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 샘플 적용 구멍은 테스트 장치의 근위 단부에서 개방-단부의 채널에 의해 생성된다. 바람직하게, 테스트 스트립은 개방-단부의 채널과 맞물려서 샘플 적용 구멍과 접촉된 샘플이 그로 인해 테스트 스트립에 적용된다. 대체 구체예에서, 샘플 적용 구멍은 테스트 장치의 전면에 오프닝에 의해 형성되어서, 테스트 스트립의 샘플 적용 유닛이 테스트 장치의 외부와 유체 연통된다.
"샘플 적용 유닛"은 샘플이 적용될 수 있는 곳인 테스트 스트립의 일부일 수 있다. 본 발명의 테스트 스트립의 샘플 적용 구역은 바람직하게는 본 발명의 테스트 장치의 샘플 적용 구멍에서 발생하고, 샘플 적용 구멍과 유체 연통된다. 일부 경우에, 샘플 적용 유닛은 생물학적 유체의 입자 부분을 제거하여, 수성 성분만을 남기기 위하여 구성된 여과 구성요소를 포함한다. 혈액 세포를 여과하기 위한 구성요소들은, 예를 들어 WO2003014726 및 WO2009069017에 기술되고, 이것들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
"컨쥬게이트 패드"는 시약 구역으로서 언급될 수 있는, 시약이 제공되는 곳인 테스트 스트립의 영역을 나타낸다. 컨쥬게이트 패드는 테스트 스트립 위에 포함된 해면성 또는 비-해면성 물질의 별도의 시그먼트이거나, 또는 또한 다른 구역, 예컨대 분석물 검출 구역을 포함할 수 있는 테스트 스트립의 해면성 또는 비-해면성 물질의 영역일 수 있다. 시약 구역은 직접 또는 간접 시약일 수 있는 검출 시약을 운반할 수 있다. 바람직하게 검출 시약은 건조한 상태에서는 고정되고 수분이 많은 상태에서는 이동성인 형태로 제공된다. 시약은 테스트 스트립 검정의 기능에 기여하는 특이적 결합 구성원 (예컨대 항체), 분석물 또는 분석물 유사체, 효소, 기질, 지표, 신호 생성 시스템의 구성요소들, 화학물질 또는 완충제, 환원제, 킬레이터, 계면활성제 등과 같은 화합물들일 수 있다.
일부 경우에, 표지는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 특이적 결합 구성원에 부착된 임의의 분자일 수 있다. 본 발명에서, 표지는 비활성이고 검출 구역에서 농축에 의해 신호를 제공할 수 있거나, 또는 단독으로 신호 생성 시스템의 구성원에 대해 결합 부위로서 작용할 수 있거나, 또는 검출 가능한 신호를 자연적으로 생성하거나 신호 생성 시스템과 함께 검출 가능한 신호를 생성할 수 있다. 표지는 금 입자, 라텍스 입자, 탄소 나노입자, 셀레늄 나노입자, 은 나노입자, 양자점, 형광 화합물, 섬유 염료, 효소, 및 리포솜으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 표지는 금 입자일 수 있다. 표지는 라텍스 입자일 수 있다.
"특이적 결합 구성원"은 다른 분자와 특이적으로 결합하고, 그로써 다른 분자의 특정 공간적 및 극성 조직화와 상보적인 것으로서 규정되는 구역을 표면 상에 또는 공동에 가지는 2개의 상이한 분자 중 하나이다. 특이적 결합 구성원은 항원-항체와 같은 면역학적 쌍의 구성원일 수 있지만, 리간드-담체 단백질, 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 핵산 듀플렉스, IgG-단백질 A, DNA-DNA, DNA-RNA, 등과같은 다른 특이적 결합 쌍은 면역학적 쌍은 아니지만 정의에 포함된다. 특이적 결합 구성원은 결합제일 수 있다.
결합제는 하나 이상의 분자에 상보적으로 결합하는 분자일 수 있다. 결합제는 단백질, 핵산, 리간드, 수용체, 등일 수 있다.
결합제인 단백질의 예는 헤마글루티닌, 소분자 결합 단백질, 활성 또는 비활성 효소 또는 단편화된 항체를 포함할 수 있다. 헤마글루티닌은 항체 또는 렉틴을 포함할 수 있다. 항체는 면역글로불린 (Ig)의 하나 이사으이 부류의 것일 수 있다. 예를 들어, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgW, 또는 그것들의 변형된 변이체일 수 있다. 항체는 단클론성 또는 다클론성일 수 있다. 항체는 인간화된 항체, 키메라 항체, 또는 이중특이적 항체일 수 있다. 항체는 다양한 타입의 결합 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 scFv, VH, Fab, 또는 (Fab)2 결합 영역을 가질 수 있다. 항체는 다양한 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 하나 이상의 검출 시약으로 변형될 수 있다. 항체는 다른 결합제, 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질에 컨쥬게이트될 수 있다.
결합제는 단백질 하위유닛의 다양한 조합을 통합하는 융합 단백질일 수 있다. 단백질 하위유닛의 조합은 자연적으로 발생하지 않거나 자연적으로 발생할 수 있다. 비-제한적인 예로서, 융합 단백질은 항체의 측면 (예컨대 Fc 영역)과 하나 이상의 수용체 도메인을 통합시킬 수 있다. 융합 단백질은 둘 이상의 하위유닛을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 다이머, 트라이머, 테트라머, 또는 펜타머일 수 있다.
본 발명의 한 측면으로, 하나 이상의 결합제는 하나 이상의 비타민 D 분자를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 구체예에서, 비타민 D 결합제는 하나 이상의 비타민 D 분자에 특이적으로 결합한다. 비타민 D 결합제는 특이적 결합 구성원일 수 있다. 비타민 D 결합제는 하나 이상의 비타민 D 분자에 결합할 수 있는 특이적 결합 구성원일 수 있다. 비타민 D 결합제는 본원에서 언급되는 것과 같이, 제 1 항체일 수 있다.
검출제가 사용될 수 있고 비타민 D 결합제와 하나 이상의 비타민 D 분자의 복합체에 결합할 수 있다. 검출제는 비타민 D 결합제 또는 제 1 항체와 복합체를 형성한 하나 이상의 비타민 D 분자를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 검출제는 비타민 D 결합제와 비타민 D 분자의 제 1 복합체에 특이적으로 결합하는 검출 항체일 수 있다. 검출제는 본원에서 언급된 것과 같이, 제 2 항체 또는 검출 항체일 수 있다.
비타민 D 결합제가 하나 이상의 비타민 D 분자에 결합하든 아니든 비타민 D 결합제에 결합할 수 있는 제 3 결합제가 사용될 수 있다.
결합제는 표 1에 열거된 아미노산 서열들 (SEQ ID No 1-20) 중 임의의 것, 또는 그것들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트 패드는 검출 시약을 포함하는데, 검출 시약은 하나 이상의 비타민 D 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체이다. 비타민 D 항체는 업계에 알려져 있다. 예시적인 비타민 D 항체인 AF10은 실시예 1에서 기술되는 것과 같이 제조되었다. 하나 이상의 비타민 D 분자에 결합할 수 있는 다른 항체는 업계에 알려져 있는데, 예를 들면 US20130059825 (본원에 전문이 참조로 포함됨)에 기술되어 있는 것들이다.
"검출 구역"은 상기 기술된 것과 같은 염료가 위치가 이동되거나, 나타나거나, 변색되거나, 또는 선택적으로 소멸되는 것으로 관찰될 수 있는 테스트 스트립의 영역이다. 검출 구역의 검출 또는 관찰은 검출 가능한 표지의 선택에 따라, 임의의 편리한 수단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 검출 또는 관찰은 시각적으로, 형광에 의해, 반사율에 의해, 방사선 사진에 의해, 또는 당업자에게 알려져 있는 임의의 다른 수단에 의해 수행될 수 있다.
검출 구역은 제 1 영역을 포함할 수 있고, 제 1 영역 안에는 (a) 하나 이상의 비타민 D 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체 (예컨대 AF10) 및 (b) 하나 이상의 비타민 D 분자를 포함하는 면역복합체에 특이적으로 결합하는 검출 제제 또는 제 2 항체가 고정되어 있다. 일부 경우에, 검출제 또는 제 2 항체는 비타민 D 결합제 또는 제 1 항체와 하나 이상의 비타민 D 분자의 복합체가 형성될 때 생성된 에티포트에 결합한다. 예를 들어, 제 2 항체는 하나 이상의 비타민 D 분자와 제 1 항체 사이의 연합에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 비타민 D 결합제 또는 제 1 항체의 하나 이상의 비타민 D 분자에의 결합은 검출제 또는 제 2 항체에 의해 인식되는 비타민 D 결합제 또는 제 1 항체 상의 에피토프의 형성을 유발할 수 있다. 일부 경우에 하나 이상의 비타민 D 분자의 결합시에 형성된 에피토프는 하나 이상의 비타민 D 분자의 결합 부위가 아니라, 제 1 항체의 또 다른 부위에 있는 에피토프이다. 일부 경우에, 제 2 항체는 제 1 항체에 결합될 때 하나 이상의 비타민 D 분자를 인식할 수 있다. 검출 구역의 제 1 영역은 분석물의 존재를 나타내는 검출 가능한 신호를 제공할 수 있다. 검출 구역의 제 1 영역은 분석물에 특이적인 고정된 결합 시약 ("특이적 결합 구성원"), 및/또는 그 분석물과 반응하는 효소를 포함할 수 있다. 분석물의 검출을 허용 또는 향상시킬 수 있는 다른 물질, 예컨대 기질, 완충제, 염이 또한 검출 구역에 제공될 수 있다. 신호 생성 시스템의 하나 이상의 구성원은 검출 구역에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 검출 구역은 테스트가 적절하게 수행되었다는 표시를 제공하는 하나 이상의 대조군 구역을 포함하는 제 2 영역을 선택적으로 포함할 수 있다.
일부 경우에, 검출 구역은 추가로 제 2 영역을 포함할 수 있다. 이 영역은 대조군 영역일 수 있고, 그 영역에는 하나 이상의 비타민 D 분자에 결합하든 결합하지 않든 제 1 항체에 결합하는 특이적 결합 구성원이 고정된다. 예를 들어, 특이적 결합 구성원은 제 1 항체의 불변 영역에 결합할 수 있는 제 3 항체일 수 있다. 제 3 항체는 하나 이상의 비타민 D 분자가 결합되든 결합되지 않든 변하지 않는 제 1 항체 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 제 2 영역은 대조군 영역일 수 있고, 그 안에 고정된 특이적 결합 구성원은 단백질 A일 수 있다. 일부 경우에, 컨쥬게이트 패드는 제 1 항체와 상이한 종으로부터 유래된 추가의 항체를 포함하고, 여기서 추가의 항체는 제 1 항체, 비타민 D, 또는 비타민 D 결합 단백질에 결합하지 않는다. 일부 경우에, 제 2 영역은 대조군 영역이고, 제 3 항체는 추가의 항체를 인식하지만, 제 1 항체 또는 제 2 항체는 인식하지 못한다. 예를 들어, 제 1 및 제 2 항체가 각각 마우스 및 래트로부터 유래되면, 추가의 항체는 닭으로부터 유래될 수 있고, 제 3 항체는 염소 항-닭, 래트 항-닭 등일 수 있다.
제 2 영역에 나타나는 신호는 제 1 항체가 검출될 수 있고 테스트 스트립이 적절하게 기능하는 것을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 제 2 영역은 검출 가능한 표지가, 위치가 이동되거나, 나타나거나, 변색되거나, 또는 선택적으로 소멸되는 것으로 관찰될 수 있는 테스트 스트립의 영역일 수 있다. 제 2 영역의 검출 또는 관찰은 염료의 특정 선택에 따라 임의의 편리한 수단에 의해, 특히 예를 들면 그것에 한정되는 것은 아니지만, 시각적으로, 형광에 의해, 반사율에 의해, 방사선 사진에 의해, 측면 유동 판독기 등에 의해 수행될 수 있다.
생물학적 샘플은 분석물의 존재 또는 양에 대해 테스트될 임의의 물질이다. 바람직하게, 생물학적 샘플은 유체 샘플, 바람직하게는 액체 샘플이다. 본 발명의 테스트 장치를 사용하여 테스트될 수 있는 액체 샘플의 예는 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 눈 분비물, 정액, 땀 및 척수액을 포함하여 체액을 포함한다. 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장일 수 있다. 점성 액체, 반고체, 또는 고체 시편(specimen)이 샘플일 수 있는 액체 용액, 용출액, 현탁액, 또는 추출액을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 목 또는 생식기를 문지를 면봉이 샘플을 만들기 위해 액체 용액에 현탁될 수 있다.
예시적인 측면 유동 검정은 도 1C에 제공된다. 예시적인 측면 유동 검정은 샘플 적용 패드, 컨쥬게이트 패드, 및 상기 생물학적 샘플이 그것을 따라 이동하는 유체 경로를 따라 상류로부터 하류로 배치된 상기 검출 구역을 포함한다. 샘플은 샘플 적용 패드 또는 샘플 패드에 적용될 수 있다. 샘플의 적용 후에 추적 완충액이 이어질 수 있다. 혈액 샘플로부터, 비타민 D (예컨대, 25-(OH)D)는 면역복합체를 생성하기 위하여 하나 이상의 비타민 D 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체 (Mab-1)를 포함하는 컨쥬게이트 패드로 흐를 수 있다. 제 1 항체는 검출 시약, 예컨대 콜로이드상 금과 컨쥬게이트될 수 있다. 면역복합체를 형성한 및 형성하지 않은 항체는 검출 구역으로 흐를 수 있다. 검출 구역은 대조군 라인 및 테스트 라인을 포함할 수 있다. 테스트 라인은 Mab-1을 하나 이상의 25-(OH)D 분자와 복합체를 형성시킴으로써 생성된 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 (Mab-2)를 포함할 수 있다. 면역복합체를 형성한 및 형성하지 않은 Mab-1은 Mab-1이 하나 이상의 비타민 D 분자 (항-IgG 항체)에 결합되든 결합되지 않든 Mab-1에 결합할 수 있는 제 3 항체를 포함하는 대조군 라인으로 측면으로 흐를 수 있다. 복합체를 형성하지 않은 및/또는 면역복합체를 형성한 Mab-1 항체는 대조군 라인에서 검출될 수 있다. Mab-2 결합된 면역복합체를 형성한 Mab-1 항체는 테스트 라인에서 검출될 수 있다. 테스트 라인에서의 검출 수준은 비타민 D의 수준을 나타낼 수 있다.
방법
한 측면으로, 본 개시는 본원에 개시된 테스트 장치를 사용하여 하나 이상의 비타민 D 분자의 수준을 검출할 수 있는 방법들을 제공한다. 방법은 본원에 개시된 테스트 장치의 샘플 적용 유닛에 생물학적 샘플을 적용하는 단계; 샘플 적용 유닛에 추적 완충액을 적용하는 단계; 및 하나 이상의 비타민 D 분자의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 그러한 검출은 테스트 장치의 제 2 영역에 나타나는 신호를 시각화함으로써, 예컨대 특이적 결합제에 의해 검출 구역에서 표지된 제 1 항체의 농도에 의해 발생할 수 있다.
일부 경우에, 방법은 추가로 샘플 중의 하나 이상의 비타민 D 분자를 정량하는 단계를 포함한다. 정량은 검출 구역의 제 1 영역의 신호 강도와 생물학적 샘플에 존재하는 분석물의 양 사이의 관계를 측정함으로써 수행될 수 있다. 신호 강도와 생물학적 샘플에 존재하는 분석물의 양 사이의 관계는 각각의 배치에 대해 또는 각각의 테스트 스트립에 대해 공지량의 하나 이상의 비타민 D 분자를 함유하는 표준의 적용에 의해 측정될 수 있는 것이 인지될 것이다.
일부 경우에, 정량은 예컨대 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 비타민 D 분자의 충분한 수준, 불충분한 수준, 또는 결핍된 수준을 가지는 것으로서 대상체를 분류함으로써 반-정량적일 것이다. 충분한 수준의 비타민 D는 적어도 10 ng/mL, 적어도 15 ng/mL, 적어도 20 ng/mL, 적어도 25 ng/mL, 적어도 30 ng/mL, 적어도 35 ng/mL, 적어도 40 ng/mL, 또는 적어도 50 ng/mL일 수 있다. 불충분한 수준의 비타민 D는 적어도 5 ng/mL 및 최대 45 ng/mL, 적어도 5 ng/mL 및 최대 40 ng/mL, 적어도 5 ng/mL 및 최대 35 ng/mL, 적어도 5 ng/mL 및 최대 30 ng/mL, 적어도 5 ng/mL 및 최대 25 ng/mL, 적어도 5 ng/mL 및 최대 20 ng/mL, 적어도 5 ng/mL 및 최대 15 ng/mL, 적어도 5 ng/mL 및 최대 10 ng/mL, 적어도 10 ng/mL 및 최대 45 ng/mL, 적어도 10 ng/mL 및 최대 40 ng/mL, 적어도 10 ng/mL 및 최대 35 ng/mL, 적어도 10 ng/mL 및 최대 30 ng/mL, 적어도 10 ng/mL 및 최대 25 ng/mL, 적어도 10 ng/mL 및 최대 20 ng/mL, 적어도 10 ng/mL 및 최대 15 ng/mL, 적어도 15 ng/mL 및 최대 45 ng/mL, 적어도 15 ng/mL 및 최대 40 ng/mL, 적어도 15 ng/mL 및 최대 35 ng/mL, 적어도 15 ng/mL 및 최대 30 ng/mL, 적어도 15 ng/mL 및 최대 25 ng/mL, 적어도 15 ng/mL 및 최대 20 ng/mL, 적어도 20 ng/mL 및 최대 45 ng/mL, 적어도 20 ng/mL 및 최대 40 ng/mL, 적어도 20 ng/mL 및 최대 35 ng/mL, 적어도 20 ng/mL 및 최대 30 ng/mL, 적어도 20 ng/mL 및 최대 25 ng/mL, 적어도 25 ng/mL 및 최대 45 ng/mL, 적어도 25 ng/mL 및 최대 40 ng/mL, 적어도 25 ng/mL 및 최대 35 ng/mL, 적어도 25 ng/mL 및 최대 30 ng/mL, 적어도 30 ng/mL 및 최대 45 ng/mL, 적어도 30 ng/mL 및 최대 40 ng/mL, 적어도 30 ng/mL 및 최대 35 ng/mL, 적어도 35 ng/mL 및 최대 45 ng/mL, 적어도 35 ng/mL 및 최대 40 ng/mL, 적어도 40 ng/mL 및 최대 45 ng/mL일 수 있다. 결핍된 수준의 비타민 D는 최대 10 ng/mL, 최대 15 ng/mL, 최대 20 ng/mL, 최대 25 ng/mL, 최대 30 ng/mL, 최대 35 ng/mL, 최대 40 ng/mL, 또는 최대 50 ng/mL일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 30 ng/mL보다 많은 하나 이상의 비타민 D 분자를 가질 수 있고 충분한 수준의 하나 이상의 비타민 D 분자를 가지는 것으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 10 내지 30 ng/mL의 하나 이상의 비타민 D 분자를 가질 수 있고 불충분한 수준의 하나 이상의 비타민 D 분자를 가지는 것으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 10 ng/mL 미만의 하나 이상의 비타민 D 분자를 가질 수 있고 결핍 수준의 하나 이상의 비타민 D 분자를 가지는 것으로 분류될 수 있다.
일부 경우에, 정량은 추가로 검출 구역의 영상을 생성하기 위한 영상 장치 및 검출 구역의 영상을 기반으로 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 비타민 D 분자를 정량하도록 구성된 프로그래밍된 컴퓨터상의 소프트웨어를 사용하는 것을 포함하였다. 영상은 신호 강도에 대해 분석될 수 있다. 일부 경우에, 신호 강도는 빛의 세기, 빛의 질, 및 영상 장치간 변동과 같은 변수들에 대해 영상을 표준화하기 위해 대조 영역의 신호 강도에 대해 비교된다.
도 7은 프로그래밍된 또는 그렇지 않으면 본 개시의 방법을 실행하도록 구성된 컴퓨터 시스템(701)을 도시한다. 컴퓨터 시스템(701)은 본원에 제공된 방법을 실행하도록 내장될 수 있고, 그렇지 않으면 컴퓨터 시스템(701)의 부재시 수행이 매우 어려울 것이다. 컴퓨터 시스템(701)은 본 개시의 방법, 예를 들어, 검출 구역의 영상을 기반으로 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 비타민 D 분자를 정량하는 방법의 다양한 측면을 조절할 수 있다. 컴퓨터 시스템(701)은 사용자의 전자 장치 또는 전자 장치와 관련하여 원격으로 위치된 컴퓨터 시스템일 수 있다. 전자 장치는 이동식 전자 장치일 수 있다. 대안으로서, 컴퓨터 시스템(701)은 컴퓨터 서버일 수 있다.
컴퓨터 시스템(701)은 중앙 처리 장치 (CPU, 또한 본원에서 "프로세서" 및 "컴퓨터 프로세서")(705)를 포함하는데, 그것은 단일 코어 또는 다중 코어 프로세서, 또는 병렬 처리를 위한 복수의 프로세서일 수 있다. 컴퓨터 시스템(701)은 또한 메모리 또는 메모리 위치(710) (예컨대 랜덤 액세스 메모리, 판독-전용 메모리, 플래시 메모리), 전자 기억 장치(715) (예컨대 하드 디스크), 하나 이상의 다른 시스템과의 통신을 위한 통신 인터페이스(720) (예컨대 네트워크 어댑터), 및 캐시(cache), 다른 메모리, 데이터 기억 및/또는 전자 디스플레이 어댑터와 같은 주변 장치들(725)을 포함한다. 메모리(710), 기억 장치(715), 인터페이스(720) 및 주변 장치들(725)은 통신 버스 (실선)를 통해 CPU(705), 예컨대 마더보드와 통신된다. 기억 장치(715)는 데이터를 저장하기 위한 데이터 저장 장치 (또는 데이터 저장소)일 수 있다. 컴퓨터 시스템(701)은 통신 인터페이스(720)의 도움으로 컴퓨터 네트워크 ("네트워크")(730)와 작동 가능하게 결합될 수 있다. 네트워크(730)는 인터넷, 인터넷 및/또는 엑스트라넷, 또는 인터넷과 통신되는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷일 수 있다. 네트워크(730)는 일부 경우에는 전기 통신 및/또는 데이터 네트워크이다. 네트워크(730)는 하나 이상의 컴퓨터 서버를 포함할 수 있고, 그것은 분산 컴퓨팅, 예컨대 클라우드 컴퓨팅을 가능하게 할 수 있다. 네트워크(730)는, 일부 경우에 컴퓨터 시스템(701)의 도움으로, 피어투피어식 네트워크를 실행할 수 있는데, 그것은 컴퓨터 시스템(701)에 결합된 장치들이 클라이언트 또는 서버처럼 거동하는 것을 가능하게 할 수 있다.
CPU(705)는 프로그램 또는 소프트웨어에 내장될 수 있는, 기계-판독가능한 지시들의 시퀀스를 실행할 수 있다. 지시는 메모리 위치, 예컨대 메모리(710)에 저장될 수 있다. 지시는 CPU(705)로 전달될 수 있고, 계속해서 프로그램되거나 또는 그렇지 않으면 본 개시의 방법을 실행하도록 CPU(705)에 환경을 설정할 수 있다. CPU(705)에 의해 수행된 작동들의 예는 불러오기, 암호 해독, 실행 및 응답하기를 포함할 수 있다.
CPU(705)는 회로, 예컨대 집적 회로의 일부일 수 있고, 시스템(701)의 하나 이상의 다른 구성요소는 회로에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 회로는 용도 특이적 집적 회로(ASIC)이다.
기억 장치(715)는 파일, 예컨대 드라이버, 라이브러리 및 저장된 프로그램들을 저장할 수 있다. 기억 장치(715)는 사용자 데이터, 예컨대 사용자 선호도 및 사용자 프로그램을 저장할 수 있다. 컴퓨터 시스템(701)은 일부 경우에 컴퓨터 시스템(701) 외부에 있는, 예컨대 인트라넷을 통해 컴퓨터 시스템(701)과 또는 인터넷과 통신되는 원격 서버상에 위치한 하나 이상의 추가적인 데이터 기억 장치를 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템(701)은 네트워크(730)를 통해 하나 이상의 원격 컴퓨터 시스템과 통신될 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템(701)은 사용자 (예컨대 환자, 의료인, 또는 서비스 제공자)의 원격 컴퓨터 시스템과 통신될 수 있다. 원격 컴퓨터 시스템의 예로는 퍼스털 컴퓨터 (예컨대 휴대용 PC), 슬레이트 또는 테블릿 PC (예컨대, Apple® 아이패드, Samsung® 갤럭시 탭), 전화기, 스마트폰 (예컨대, Apple® 아이폰, 안드로이드-이용 가능한 장치, Blackberry®), 또는 개인용 정보 단말기를 포함한다. 사용자는 네트워크(730)를 통해 컴퓨터 시스템(701)에 접근할 수 있다.
본원에 기술된 방법들은 컴퓨터 시스템(701)의 전자 기억 위치에, 예컨대 메모리(710) 또는 전자 기억 장치(715)에 저장된 기계 (예컨대, 컴퓨터 프로세서) 실행 가능한 암호에 의해 실행될 수 있다. 메모리(710)는 데이터베이스의 일부일 수 있다. 기계 실행 가능한 또는 기계 판독 가능한 암호는 소프트웨어의 형태로 제공될 수 있다. 사용 중에, 암호는 프로세서(705)에 의해 실행될 수 있다. 일부 경우에, 암호는 기억 장치(715)로부터 검색되고 프로세서(705)에 의한 접근을 준비하기 위해 메모리(710)에 저장될 수 있다. 일부 상황에서는, 전자 기억 장치(715)는 배제될 수 있고, 기계-실행 가능한 지시들은 메모리(710)에 저장될 수 있다.
암호는 암호를 실행하도록 적응된 프로세서를 가지는 기계와 함께 사용하기 위해 사전-컴파일링되고 구성되거나, 또는 실행 시간 중에 컴파일링될 수 있다. 암호는 사전-컴파일링된 또는 컴파일링-도중(as-compiled) 방식으로 암호가 실행되는 것을 가능하게 하기 위해 선택될 수 있는 프로그래밍 언어로 공급될 수 있다.
본원에 제공된 시스템 및 방법, 예컨대 컴퓨터 시스템(701)의 측면들은 프로그래밍에 내장될 수 있다. 기술의 다양한 측면들은 전형적으로 기계 판독 가능한 매질의 타입에 전달되거나 내장된 기계 (또는 프로세서) 실행 가능한 암호 및/또는 결합된 데이터의 형태의 "제품" 또는 "제조 물품"으로서 여겨질 수 있다. 기계-실행 가능한 암호는 전자 기억 장치, 예컨대 메모리 (예컨대 판독-전용 메모리, 랜덤-액세스 메모리, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크에 저장될 수 있다. "저장"형 매질은 소프트웨어 프로그래밍에 대해 언제든 비-일과성 저장을 제공할 수 있는, 컴퓨터, 프로세서 등의 유형의(tangible) 메모리, 또는 그것의 결합된 모듈, 예컨대 다양한 반도체 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등 중 임의의 것 또는 전부를 포함할 수 있다. 소프트웨어의 전부 또는 일부는 때로 인터넷 또는 다양한 다른 전기 통신 네트워크를 통해 통신될 수 있다. 예를 들어, 그러한 통신은 하나의 컴퓨터 또는 프로세서로부터 다른 컴퓨터 또는 프로세서로, 예를 들어 관리 서버 또는 호스트 컴퓨터로부터 적용 서버의 컴퓨터 플랫폼으로의 소프트웨어의 로딩을 가능하게 할 수 있다. 그러므로, 소프트웨어 요소들을 가질 수 있는 다른 타입의 매질은, 예컨대 컴퓨터 시스템에의 연결 또는 광학 랜드라인 네트워크를 통해 및 다양한 에어-링크(air-link) 위로, 국소 장치 사이의 물리적 인터페이스를 가로질러 사용된, 광파(optical wave), 전파(electrical wave) 및 전자기파를 포함한다. 그런 파를 전달할 수 있는 물리적 요소들, 예컨대 유선 또는 무선 연결, 광학적 링크 등은 또한 소프트웨어를 가지는 매질로서 고려될 수 있다. 본원에서 사용되는 것과 같이, 비-일과성, 유형의 "저장" 매질에 한정되지 않는 한, 컴퓨터 또는 기계 "판독 가능한 매질"과 같은 용어는 실행을 위해 프로세서에 지시들을 제공하는데 참여하는 임의의 매질을 나타낸다.
그러므로, 기계 판독 가능한 매질, 예컨대 컴퓨터-실행 가능한 암호는, 한정하는 것은 아니지만, 유형의 저장 매질, 반송파(carrier wave) 매질 또는 물리적 전송 매질을 포함하여, 많은 형태를 가질 수 있다. 비-소멸성 저장 매질은, 예를 들면 광학 또는 자기(magnetic) 디스크, 예컨대 데이터베이스 등을 실행하기 위해 사용될 수 있는, 예컨대 도면에 도시된 임의의 컴퓨터(들)의 저장 장치들의 임의의 것을 포함한다. 소멸성 저장 매질은 동적 메모리, 예컨대 그런 컴퓨터 플랫폼의 주 메모리를 포함한다. 유형의 전송 매질은 동축 케이블; 컴퓨터 시스템 내에 버스를 포함하는 와이어들을 포함하여, 구리 와이어 및 광섬유를 포함한다. 반송파 전송 매질은 무선 주파수 (RF) 및 적외선 (IR) 데이터 통신 중에 생성된 것들과 같은 전기 또는 전자기 신호, 음파 또는 광파의 형태를 취할 수 있다. 그러므로 컴퓨터-판독 가능한 매질의 통상적인 형태는 예를 들어 플로피 디스크, 가요성 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 임의의 다른 자기 매질, CD-ROM, DVD 또는 DVD-ROM, 임의의 다른 광학 매질, 펀치 카드 페이퍼 테이프, 구멍의 패턴을 가진 임의의 다른 물리적 저장 매질, RAM, ROM, PROM 및 EPROM, FLASH-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 반송파 전송 데이터 또는 지시, 그런 반송파를 수송하는 케이블 또는 링크, 또는 그것으로부터 컴퓨터가 프로그래밍 암호 및/또는 데이터를 판독할 수 있는 임의의 다른 매질을 포함한다.
컴퓨터 시스템(701)은 예를 들어, 유전자 정보, 예컨대 단일 개체 또는 개체 그룹의 질환-유발 대립유전자의 확인을 제공하기 위한 사용자 인터페이스 (UI)(740)를 포함하는 전자 디스플레이(735)를 포함하거나 그것과 통신될 수 있다. UI의 예로는, 제한 없이, 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 및 웹-기반 사용자 인터페이스 (또는 웹 인터페이스)를 포함한다.
추적 완충액은 하나 이상의 비타민 D 분자를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 추적 완충액은 비타민 D 결합 단백질 및/또는 알부민으로부터 하나 이상의 비타민 D 분자를 해리하기 위한 시약들을 포함하는 것으로 구성될 수 있다. 하나 이상의 비타민 D 분자를 해리하기 위한 시약의 비-제한적 예는 산성 용액, 알칼리성 용액, 8-아닐리노-1-나프탈렌설폰산, 3-(아세토닐벤질)-4-하이드록시쿠마린, 알킬 아미노 플루오로 계면활성제, 퍼플루오로헥산산, 퍼플루오로옥탄산, 프로테이나제 K, 우레아, 및 구아니딘 염산염이다. 예를 들어, 추적 완충액은 WO2004063704 (본원에 그 전문이 참조로 포함됨)에 기술된 것과 같이, 산성 용액 또는 알칼리성 용액일 수 있다. 다르게는, 추적 완충액은 미국 특허 번호 7,482,162 (본원에 그 전문이 참조로 포함됨)에 기술된 것과 같이, 8-아닐리노-1-나프탈렌설폰산 및/또는 3-(아세토닐벤질)-4-하이드록시쿠마린을 사용하여 내인성 결합 단백질로부터 비타민 D의 경합성 대체에 의존할 수 있다.
추적 완충액은, 예컨대 WO2007039194 (본원에 그 전문이 참조로 포함됨)에 기술된 것과 같이, 예를 들어 3.8 내지 4.8의 pH 및 5 내지 30%의 DMSO, 액체 유기 아미드 및 선택적으로 0.5 내지 5%의 단쇄 알코올을 가진 시약일 수 있다. 추적 완충액은 WO2008039266 (본원에 그 전문이 참조로 포함됨)에 기술된 것과 같은 알킬 아미노 플루오로 계면활성제를 포함하여, 안정화제 및 포획 리간드를 포함할 수 있다.
키트
한 측면으로, 본 개시는 본원에 개시된 테스트 장치 및 키트의 사용자에 대한 서면 설명서를 포함하는 하나 이상의 비타민 D 분자의 수준을 검출할 수 있는 키트를 제공한다. 일부 경우에, 키트는 멸균화제, 피부를 천공하기 위한 장치, 거즈, 추적 완충액 및 마이크로피펫으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 구성요소를 추가로 포함할 수 있다.
멸균화제는, 예를 들어, 인간 피부를 소독할 수 있는 알코올 물수건일 수 있다.
피부를 천공하기 위한 장치는 적은 부피의 혈액을 생산하기 위해 대상체의 피부를 침투할 수 있는 작고 날카로운 물체일 수 있다. 피부를 천공하기 위한 장치는 란셋, 바늘 및 주사기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 란셋은, 예를 들어 스프링-작동될 수 있다.
추적 완충액은 앞서 기술된 것과 같이, 비타민 D 결합 단백질로부터 하나 이상의 비타민 D 분자를 분리하기 위한 시약들을 포하말 수 있다.
마이크로피펫은 장치에 공지 부피의 생물학적 샘플을 제공할 수 있다.
키트는 추가로 샘플 중의 상기 하나 이상의 비타민 D 분자의 양에 신호 강도를 관련시키는 색상표를 포함할 수 있다. 잠재적인 배치-대-배치 가변성으로 인해, 색상표는 공지량의 하나 이상의 비타민 D 분자를 함유하는 표준을 작동시키고 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 비타민 D 분자의 양의 상이한 범위에 상응하는 색상을 측정함으로써 테스트 장치의 각 배치에 대해 실험적으로 생성될 수 있다.
실시예
실시예 1: 25-(OH)D에 대한 단클론성 항체의 생성.
25-(OH)D에 대한 단클론성 항체를 Kohler 및 Milstein (G. Kohler and C. Milstein Nature, 1975, 256, 495)의 방법의 변형에 의해 제조하였다. 마우스들을 담체 단백질 KHL에 대한 3-위치에서 컨쥬게이트된 25-(OH)D의 피하 주사에 의해 면역화하였다. 완전 프로인트 보조제를 항원과 함께 주사하였다. 불완전 프로인트 보조제를 항원 부스트에 사용하였다. 면역 반응을 25-(OH)D3에 대한 ELISA에 의해 모니터링하였다. 4 내지 5회의 항원 부스트 후에, 비장 세포를 수득하고 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 존재하에 골수종 세포와 융합시켰다. 융합된 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고 선택적 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT) 배지의 존재하에 성장시켰다. 융합된 세포로부터의 상층액을 25-(OH)D3 및 25-(OH)D2에 대한 결합 활성에 대해 ELISA에 의해 테스트하였다. 25-(OH)D3 및 25-(OH)D2 둘 다에 대해 높은 친화도를 가진 클론 AF10을 대규모 항체 제조 및 정재를 위해 선택하였다.
실시예 2: 면역화된 마우스로부터 25-(OH)D 및 mAb의 면역복합체에 대한 단클론성 항체의 생성.
마우스들을 담체 단백질 키호울 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 대해 26-위치에서 컨쥬게이트된 25-(OH)D의 피하 주사에 의해 면역화하였다. 완전 프로인트 보조제를 항원과 함께 주사하였다. KLH 컨쥬게이트 및 불완전 프로인트 보조제를 제 1 및 제 3 부스트에 사용하였고, 25-(OH)D:항체 AF10의 면역복합체를 제 2 및 제 4 부스트에 사용하였다. 면역 반응을 25-(OH)D:항체 AF10의 면역복합체에 대한 ELISA 검정에 의해 모니터링하였다. 4회의 부스트 후에, 비장 세포를 수득하였다. 다음에 비장 세포로부터의 RNA를 분리하고 가변 유전자 증폭을 수행하였다.
mRNA를 Dynabeads® mRNA 제조 키트 (ThermoFisher)를 제조자의 프로토콜을 따라 사용함으로써 분리하였다. 계속해서, 제 1 가닥 cDNA를 Superscript II 역전사효소 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 생성하였다. cDNA로부터, 중쇄 및 경쇄 가변 유전자를 별도로 PCR에 의해 마우스 VH, VK 및 V에 대한 프라이머 세트를 사용하여 Phage Display: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 따라 기술된 것과 같이 증폭시켰다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자들을 추가로 PCR에 의해 (GS3)4 링커의 부분 서열을 3' VH 및 5' VL에 첨가하여 증폭시켰다. 제 3 PCR 반응에서, 제 2 라운드 증폭된 VH 및 VL DNA의 동일한 양을 단일-사슬 가변 단편 (scFv) 조립을 위해 혼합하였다. 최종 scFv DNA 단편을 Qiagen PCR 정제 칼럼 (QIAGEN Inc., Germany)으로 정제하였다. 정제된 scFv DNA 및 PCANTAB5 벡터 DNA를 제한 효소 NcoI 및 NotI (New England Lab)으로 소화시킨 후 1% 아가로오스 겔에 의해 크기를 선택하였다. 잘라낸 밴드를 QIAquick Gel 추출 키트로 정제하였다. 소화된 scFv, 벡터 DNA 및 T4 리가아제 (New England Lab)를 16℃에서의 밤새 결찰을 위해 혼합하였다. 20 μg의 결찰된 DNA를 정제하였고 대장균 TG1 경합 세포에 전기천공법에 의해 형질전환하였다. 형질전환 후에, TG1 세포를 SOC 배지에 현탁시키고 1시간 동안 37℃에서 250 rpm 흔들림으로 인큐베이션하였다. TG1 세포를 100 μg/ml의 카르베니실린 및 2% 글루코오스를 함유하는 2YT-아가 플레이트에 플레이팅하였다. 밤새 30℃에서 인큐베이션한 후에, TG1 형질전환체들을 15% 글리세롤, 100 μg/ml의 카르베니실린 및 2% 글루코오스를 함유하는 2YT에 수득하고, 라이브러리 부분표본을 보관을 위해 -80℃에서 유지시켰다. 이 과정으로 1.2x109개 콜로니의 라이브러리 크기가 초래되었다.
파지 디스플레이된 라이브러리를 다음과 같이 제조하였다. 200 mL의 2YT 배지 (100 μg/ml의 카르베니실린 및 2% 글루코오스를 포함함)를 라이브러리 TG1으로 OD 0.1에서 시작하여 접종하였다. 37℃에서 250 rpm 흔들림으로 3-4시간 동안 인큐베이션한 후에, K07 헬퍼 파지를 1:10의 세포 대 파지 비율로 첨가하고, 배양을 37℃에서 1시간 동안 흔들림 없이 인큐베이션하였다. TG1 세포를 원심분리하고 세포 펠릿을 100 μg/ml 카르베니실린 및 35 μg/ml 카나마이신을 포함한 2 L의 2YT에 재현탁한 후, 30℃에서 250 rpm 흔들림으로 밤새 인큐베이션하였다. TG1 세포를 30분 동안 6000 x g에서 4℃에서 원심분리하였다. 라이브러리 파지 입자를 배양 상층액으로부터 PEG-침전에 의해 정제하고, 인산염-완충 식염수 (PBS)에 재현탁한 후 OD268 측정에 의해 적정하였다. 파지 디스플레이 항체 라이브러리를 20% 글리세롤을 포함한 PBS 중에서 -80℃에서 보관하였다.
면역복합체-특이적 항체를 다음의 선택 과정에 의해 상기 마우스 scFv 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택하였다. 미세적정 웰을 1 μg의 mAb AF10으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 1x chemiblocker (EMD Millipore)로 2시간 동안 차단한후에, 1 μg의 25-(OH)D3을 각 웰에 첨가하고 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 웰을 PBS로 3회 세척하고 1x chemiblocker로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 25-(OH)D:항체 AF10의 면역복합체에 대한 친화도 선택을 수행하기 전에, 400 μl의 파지 라이브러리 용액 (총 1,012 파지 입자)을 비타민 D 없이 항체 AF10을 함유한 웰에서 2시간 동안 실온에서 사전-인큐베이션하고, 그런 다음 미결합 파지를 25-(OH)D:항체 AF10의 면역복합체를 포함한 4개의 웰에 옮겨서 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 미결합 파지를 제거하고 웰을 PBS-Tween으로 10회 세척하였다. 결합된 파지를 100 μl의 100 mM HCl로 10분 동안 용출하고, 용출된 파지를 수득하고 10% 1 M Tris-HCl로 중화하였다. 그런 다음 용출된 파지를 10 mL의 새로운 TG1 세포 (OD600
Figure pct00001
0.8)에 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 감염된 TG1 세포를 카르베니실린 및 글루코오스를 포함한 2개의 2YT 플레이트에 플레이팅하고 밤새 성장시키고, 밤샌 세포를 상기 기술한 것과 같이 제 1 라운드 파지 제조를 위해 수득하였다. 친화도 선택 과정을 바로 앞서 기술한 것과 같이 제 2 라운드 파지에 대해 수행하였다. 총 3 라운드의 친화도 선택을 수행하였다.
제 3 라운드의 친화도 선택으로부터 감염된 TG1 콜로니를 scFv-p3 융합의 발현 및 결합 활성의 확인을 위해 선택하였다. 간단히 설명하면, 분리된 TG 콜로니들을 100 μl의 2YT/카르베니실린 및 글루코오스를 가진 96 웰 플레이트 (5개 플레이트 및 총 480 콜로니)에 넣고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 제 2일에, 웰당 10 μl의 배양을 웰당 카르베니실린 및 0.1% 글루코오스를 함유한 500 μl의 2YT 배지를 포함한 96-웰 딥 플레이트의 상응하는 웰에 옮겼다. 딥-웰 플레이트를 250 rpm으로 흔들리는 37℃ 쉐이커 인큐베이터에서 배양이 0.8 내지 1의 OD600에 도달할 때까지 인큐베이션하였다. 그런 다음 6 mM IPTG를 함유한 100 μl의 2YT를 각 웰에 첨가하고 발현 플레이트를 30℃에서 250 rpm으로 흔들면서 밤새 인큐베이션하였다. 2.5 mg/mL 라이소자임 및 5 mM EDTA를 함유한 160 μL의 용해 완충액을 발현 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 배양을 1시간 동안 실온에서 흔들어 주었다. 배양 상층액을 웰당 140 μl의 2x ChemiBlocker와 혼합하고 추가로 30분 동안 250 rpm에서 흔들면서 인큐베이션하였다. 배양 상층액을 원심분리하고 아래와 같이 결합 검정에 대해 준비하였다.
25-(OH)D:항체 AF10의 면역복합체에 결합할 수 있는 클론들에 대해 스크리닝하기 위하여, 2개의 96-웰 검정 플레이트를 각 발현 플레이트에 대해 준비하는데, 한 플레이트는 AF10 항체만으로 코팅되었고, 다른 하나는 25-(OH)D:항체 AF10의 면역복합체로 코팅되었다. 검정 플레이트를 1x ChemiBlocker로 2시간 동안 실온에서 차단하였다. 발현 플레이트로부터의 배양 상층액을 검정 플레이트의 상응하는 웰로 옮겼다. 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 PBS-Tween으로 3회 세척하고, 100 μL의 마우스 항-M13 p3 항체 (New England Lab)를 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 샘플을 PBS-Tween으로 3회 세척하고, 100 μL의 양고추냉이 과산화효소 (HRP)-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG를 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 PBS-Tween으로 3회 세척하고, 100 μL의 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)을 각 웰에 첨가하였다. 10 내지 30분 동안 전개시킨 후 OD630을 측정하였다. AF10 항체 단독이 아닌, 25-(OH)D:항체 AF10의 면역복합체에 결합된 클론들을 확인을 위해 선택하였다. 포지티브 배양 상층액을 연속적으로 1:3 비율로 희석하고 상기 과정을 따라 다시 검정하였다. 도 2는 25-(OH)D3:항체 AF10의 면역복합체에 대한 결합 활성을 가진 6개의 클론을 보여준다. 중쇄 가변 영역 (SEQ ID NO 6 내지 15) 및 경쇄 가변 영역 (SEQ ID NO 1 내지 5 및 16 내지 20)의 독특한 서열을 표 1에 열거한다.
경쇄는 EQ ID NO 1 내지 5 및 16 내지 20으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 중쇄는 SEQ ID NO 6 내지 15로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 경쇄는 EQ ID NO 1 내지 5 및 16 내지 20으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80% 서열 상동성을 공유하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 중쇄는 EQ ID NO 6 내지 15로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 최소한 80% 서열 상동성을 가진 서열을 포함할 수 있다.
항체는 다음의 아미노산 서열 중 임의의 것을 가지는 경쇄 CDR 및 상기 중쇄 CDR을 포함할 수 있다: SEQ ID NO 6의 중쇄 및 SEQ ID NO 1의 경쇄, SEQ ID NO 6의 중쇄 및 SEQ ID NO 2의 경쇄, SEQ ID NO 6의 중쇄 및 SEQ ID NO 3의 경쇄, SEQ ID NO 6의 중쇄 및 SEQ ID NO 4의 경쇄, SEQ ID NO 6의 중쇄 및 SEQ ID NO 5의 경쇄, SEQ ID NO 6의 중쇄 및 SEQ ID NO 16의 경쇄, SEQ ID NO 6의 중쇄 및 SEQ ID NO 17의 경쇄, SEQ ID NO 6의 중쇄 및 SEQ ID NO 18의 경쇄, SEQ ID NO 6의 중쇄 및 SEQ ID NO 19의 경쇄, SEQ ID NO 6의 중쇄 및 SEQ ID NO 20의 경쇄.
항체는 다음의 아미노산 서열 중 임의의 것을 가지는 경쇄 CDR 및 상기 중쇄 CDR을 포함할 수 있다: SEQ ID NO 7의 중쇄 및 SEQ ID NO 1의 경쇄, SEQ ID NO 7의 중쇄 및 SEQ ID NO 2의 경쇄, SEQ ID NO 7의 중쇄 및 SEQ ID NO 3의 경쇄, SEQ ID NO 7의 중쇄 및 SEQ ID NO 4의 경쇄, SEQ ID NO 7의 중쇄 및 SEQ ID NO 5의 경쇄, SEQ ID NO 7의 중쇄 및 SEQ ID NO 16의 경쇄, SEQ ID NO 7의 중쇄 및 SEQ ID NO 17의 경쇄, SEQ ID NO 7의 중쇄 및 SEQ ID NO 18의 경쇄, SEQ ID NO 7의 중쇄 및 SEQ ID NO 19의 경쇄, SEQ ID NO 7의 중쇄 및 SEQ ID NO 20의 경쇄.
항체는 다음의 아미노산 서열 중 임의의 것을 가지는 경쇄 CDR 및 상기 중쇄 CDR을 포함할 수 있다: SEQ ID NO 8의 중쇄 및 SEQ ID NO 1의 경쇄, SEQ ID NO 8의 중쇄 및 SEQ ID NO 2의 경쇄, SEQ ID NO 8의 중쇄 및 SEQ ID NO 3의 경쇄, SEQ ID NO 8의 중쇄 및 SEQ ID NO 4의 경쇄, SEQ ID NO 8의 중쇄 및 SEQ ID NO 5의 경쇄, SEQ ID NO 8의 중쇄 및 SEQ ID NO 16의 경쇄, SEQ ID NO 8의 중쇄 및 SEQ ID NO 17의 경쇄, SEQ ID NO 8의 중쇄 및 SEQ ID NO 18의 경쇄, SEQ ID NO 8의 중쇄 및 SEQ ID NO 19의 경쇄, SEQ ID NO 8의 중쇄 및 SEQ ID NO 20의 경쇄.
항체는 다음의 아미노산 서열 중 임의의 것을 가지는 경쇄 CDR 및 상기 중쇄 CDR을 포함할 수 있다: SEQ ID NO 9의 중쇄 및 SEQ ID NO 1의 경쇄, SEQ ID NO 9의 중쇄 및 SEQ ID NO 2의 경쇄, SEQ ID NO 9의 중쇄 및 SEQ ID NO 3의 경쇄, SEQ ID NO 9의 중쇄 및 SEQ ID NO 4의 경쇄, SEQ ID NO 9의 중쇄 및 SEQ ID NO 5의 경쇄, SEQ ID NO 9의 중쇄 및 SEQ ID NO 16의 경쇄, SEQ ID NO 9의 중쇄 및 SEQ ID NO 17의 경쇄, SEQ ID NO 9의 중쇄 및 SEQ ID NO 18의 경쇄, SEQ ID NO 9의 중쇄 및 SEQ ID NO 19의 경쇄, SEQ ID NO 9의 중쇄 및 SEQ ID NO 20의 경쇄.
항체는 다음의 아미노산 서열 중 임의의 것을 가지는 경쇄 CDR 및 상기 중쇄 CDR을 포함할 수 있다: SEQ ID NO 10의 중쇄 및 SEQ ID NO 1의 경쇄, SEQ ID NO 10의 중쇄 및 SEQ ID NO 2의 경쇄, SEQ ID NO 10의 중쇄 및 SEQ ID NO 3의 경쇄, SEQ ID NO 10의 중쇄 및 SEQ ID NO 4의 경쇄, SEQ ID NO 10의 중쇄 및 SEQ ID NO 5의 경쇄, SEQ ID NO 10의 중쇄 및 SEQ ID NO 16의 경쇄, SEQ ID NO 10의 중쇄 및 SEQ ID NO 17의 경쇄, SEQ ID NO 10의 중쇄 및 SEQ ID NO 18의 경쇄, SEQ ID NO 10의 중쇄 및 SEQ ID NO 19의 경쇄, SEQ ID NO 10의 중쇄 및 SEQ ID NO 20의 경쇄.
항체는 다음의 아미노산 서열 중 임의의 것을 가지는 경쇄 CDR 및 상기 중쇄 CDR을 포함할 수 있다: SEQ ID NO 11의 중쇄 및 SEQ ID NO 1의 경쇄, SEQ ID NO 11의 중쇄 및 SEQ ID NO 2의 경쇄, SEQ ID NO 11의 중쇄 및 SEQ ID NO 3의 경쇄, SEQ ID NO 11의 중쇄 및 SEQ ID NO 4의 경쇄, SEQ ID NO 11의 중쇄 및 SEQ ID NO 5의 경쇄, SEQ ID NO 11의 중쇄 및 SEQ ID NO 16의 경쇄, SEQ ID NO 11의 중쇄 및 SEQ ID NO 17의 경쇄, SEQ ID NO 11의 중쇄 및 SEQ ID NO 18의 경쇄, SEQ ID NO 11의 중쇄 및 SEQ ID NO 19의 경쇄, SEQ ID NO 11의 중쇄 및 SEQ ID NO 20의 경쇄.
항체는 다음의 아미노산 서열 중 임의의 것을 가지는 경쇄 CDR 및 상기 중쇄 CDR을 포함할 수 있다: SEQ ID NO 12의 중쇄 및 SEQ ID NO 1의 경쇄, SEQ ID NO 12의 중쇄 및 SEQ ID NO 2의 경쇄, SEQ ID NO 12의 중쇄 및 SEQ ID NO 3의 경쇄, SEQ ID NO 12의 중쇄 및 SEQ ID NO 4의 경쇄, SEQ ID NO 12의 중쇄 및 SEQ ID NO 5의 경쇄, SEQ ID NO 12의 중쇄 및 SEQ ID NO 16의 경쇄, SEQ ID NO 12의 중쇄 및 SEQ ID NO 17의 경쇄, SEQ ID NO 12의 중쇄 및 SEQ ID NO 18의 경쇄, SEQ ID NO 12의 중쇄 및 SEQ ID NO 19의 경쇄, SEQ ID NO 12의 중쇄 및 SEQ ID NO 20의 경쇄.
항체는 다음의 아미노산 서열 중 임의의 것을 가지는 경쇄 CDR 및 상기 중쇄 CDR을 포함할 수 있다: SEQ ID NO 13의 중쇄 및 SEQ ID NO 1의 경쇄, SEQ ID NO 13의 중쇄 및 SEQ ID NO 2의 경쇄, SEQ ID NO 13의 중쇄 및 SEQ ID NO 3의 경쇄, SEQ ID NO 13의 중쇄 및 SEQ ID NO 4의 경쇄, SEQ ID NO 13의 중쇄 및 SEQ ID NO 5의 경쇄, SEQ ID NO 13의 중쇄 및 SEQ ID NO 16의 경쇄, SEQ ID NO 13의 중쇄 및 SEQ ID NO 17의 경쇄, SEQ ID NO 13의 중쇄 및 SEQ ID NO 18의 경쇄, SEQ ID NO 13의 중쇄 및 SEQ ID NO 19의 경쇄, SEQ ID NO 13의 중쇄 및 SEQ ID NO 20의 경쇄.
항체는 다음의 아미노산 서열 중 임의의 것을 가지는 경쇄 CDR 및 상기 중쇄 CDR을 포함할 수 있다: SEQ ID NO 14의 중쇄 및 SEQ ID NO 1의 경쇄, SEQ ID NO 14의 중쇄 및 SEQ ID NO 2의 경쇄, SEQ ID NO 14의 중쇄 및 SEQ ID NO 3의 경쇄, SEQ ID NO 14의 중쇄 및 SEQ ID NO 4의 경쇄, SEQ ID NO 14의 중쇄 및 SEQ ID NO 5의 경쇄, SEQ ID NO 14의 중쇄 및 SEQ ID NO 16의 경쇄, SEQ ID NO 14의 중쇄 및 SEQ ID NO 17의 경쇄, SEQ ID NO 14의 중쇄 및 SEQ ID NO 18의 경쇄, SEQ ID NO 14의 중쇄 및 SEQ ID NO 19의 경쇄, SEQ ID NO 14의 중쇄 및 SEQ ID NO 20의 경쇄.
항체는 다음의 아미노산 서열 중 임의의 것을 가지는 경쇄 CDR 및 상기 중쇄 CDR을 포함할 수 있다: SEQ ID NO 15의 중쇄 및 SEQ ID NO 1의 경쇄, SEQ ID NO 15의 중쇄 및 SEQ ID NO 2의 경쇄, SEQ ID NO 15의 중쇄 및 SEQ ID NO 3의 경쇄, SEQ ID NO 15의 중쇄 및 SEQ ID NO 4의 경쇄, SEQ ID NO 15의 중쇄 및 SEQ ID NO 5의 경쇄, SEQ ID NO 15의 중쇄 및 SEQ ID NO 16의 경쇄, SEQ ID NO 15의 중쇄 및 SEQ ID NO 17의 경쇄, SEQ ID NO 15의 중쇄 및 SEQ ID NO 18의 경쇄, SEQ ID NO 15의 중쇄 및 SEQ ID NO 19의 경쇄, SEQ ID NO 20의 중쇄 및 SEQ ID NO 20의 경쇄.
예시적인 중쇄 및 경쇄 가변 영역
서열 번호 아미노산 서열
1 DIQMTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSYPYTFGGGTKLEIK
2 DIVLTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQHYSTPYTFGGGTKLEIK
3 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLELK
4 DIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCQQHGESPLTFGAGTKLEIK
5 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYASSPYTFGGGTKLEIK
6 EVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYTEYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSVVYYCARQDGYYVGYFDYWGQGTTLTVSS
7 EVELQESGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTNYWMNWVRQRPGQGFEWIGEINPSNGDTFYNQKFKGKATLIVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARIGGYYFDYWGQGTTLTVSS
8 EVNVVESGAELVKPGASVRLSCTTSGFNIEDSYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNIKSDPKFQGKATISADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCLYYYDSSDYWGQGTTLTVSS
9 EVKLVESGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYNMNWVKQSNGKSLEWIGNIDPYYGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCARWSYYGNYVYWYFDVWGAGTTLTVSS
10 EVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARSYYFDYWGQGTTLTVSS
11 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTVNWVRQAPGKGLEWLSVISGDGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKALNAGWGFDYWGQGTLVTVSS
12 QVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGSAMHWVRQAPGKGMEWVSAISGSGGSTYYADSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNGYTDGYGMDYWGQGTLVTVSS
13 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSSVNWVRQAPGKGLEWLAVISGDGGSTYYADSVKGRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAIFPSYMDVWGQGTLVTVSS
14 EVQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTSSAVDWVRQARGQRLEWIGWIVVGSGNTSYAQKFQERVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKSVTYYYMDHWGQGTLVTVSS
15 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNSYAISWVRQAPGQGLEWMGVIIGIFGTATYAQSVQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGRYSRSFDVWGQGTLVTVSS
16 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRANRLVSSSMLAWYQQKPGQAPRLLIGASKRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCAQYDGSSYTFGQGTKLEIKR
17 QSVLTQPPSVSGSPGQRVTISCTGNNLSGYYVSWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAMDEADYYCAAYYSGTYVFGQGTKLTVLGQ
18 SYELTQPLSVSVSLGQTARITCWDNVGGYNVHWYQQKPGQSPVLVIYRDSERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCSSYYQSTVLFGGGTKLTVLGQ
19 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASNVGGNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCSAYHQSTYTFGQGTKVEIKR
20 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKVGSSYVNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCASYYSTSTFGGGTKVEIKR
실시예 3: 합성 라이브러리로부터 25-(OH)D:mAB의 면역복합체에 대한 단클론성 항체의 생성.
합성 항체 라이브러리를 천연 VH/VL 쌍형성 빈도 (Protein Engineering, Design & Selection pp. 1-7, 2012 doi:10.1093/단백질/gzs043에 기술됨)를 기반으로 설계하고, 빈번하게 쌍을 이룬 인간 VH1, VH3, VK1, VK3, V1, V2 및 V3의 프레임워크를 유전자 합성을 위한 마스터 유전자로서 선택하였다. 선택된 마스터 유전자를 중복하는 올리고들의 PCR 조립에 의해 합성하였다. 올리고의 길이는 60 내지 80 염기였고, 모든 CDR에 대한 올리고들은 아미노산 잔기를 랜덤화하기 위해 뉴클레오타이드 NNS 및/또는 MVS를 사용한 변성 올리고들이었다. 제 1 라운드의 PCR 조립 후에, 5개의 경쇄 마스터 유전자를 경쇄 불변 영역과 PCR에 의해 조립하였다. 그 결과의 전-길이 경쇄 유전자를 제한 효소 HindIIII 및 NcoI (New England Lab)으로 소화시키고, 1% 아가로오스 겔에서 크기-선택하였다. 크기-선택된 단편을 정제하고 QIAquick Gel 추출 키트로 추출하였다. 소화된 경쇄 유전자, pAXD20 벡터 DNA, 및 T4 리가아제 (New England Lab)를 혼합하고 16℃에서 밤새 결찰이 진행되도록 하였다. 각각의 경쇄 유전자 구성물에 대해, 20 μg의 결찰된 DNA를 정제하고 대장균 TOP10 경합 세포에 전기천공법에 의해 형질전환하였다. 그런 다음 형질전환체들을 100 μg/ml의 카르베니실린 및 2% 글루코오스를 함유한 100 2YT-아가 플레이트에서 성장시켰다. 밤새 30℃에서 인큐베이션한 후에, 라이브러리 형질전환체들을 수득하고 15% 글리세롤을 포함한 2YT에 현탁시켰다. 스톡의 절반을 라이브러리 부분표본으로서 -80℃에 보관하고, 나머지를 Qiagen Maxiprep 키트에 의해 처리하였다. 결과의 라이브러리 크기를 표 2에 열거한다. 중쇄 클로닝의 다음 단계를 위해 AFK1 및 AFk3의 DNA를 조합하였고, AFL1, AFL2 및 AFL3을 또한 조합하였다.
경쇄 라이브러리의 특성들
라이브러리 라이브러리 크기
AFK1 1.1 x 109
AFK3 1.2 x 109
AFL1 8.5 x 108
AFL2 7.6 x 108
AFL3 8 x 108
PCR 조립된 VH1 및 VH3 마스터 유전자를 추가로 CH1 불변 영역과 PCR에 의해 조립하고, 그 결과의 Fd 유전자를 제한 효소 NcoI 및 SalI (New England BioLab)으로 소화시키고 1% 아가로오스 겔에 의해 크기-선택하였다. 크기-선택된 단편을 정제하고 QIAquick Gel 추출 키트로 추출하였다. 소화된 Fd 유전자, 경쇄 라이브러리 DNA 및 T4 리가아제 (New England Lab)를 혼합하고 16℃에서 밤새 결찰이 진행되도록 하였다. 각각의 Fd 사슬 유전자 라이브러리에 대해, 40 μg의 결찰된 DNA를 정제하고 대장균 TG1 경합 세포에 전기천공법에 의해 형질전환하였다. 그런 다음 형질전환체들을 100 μg/ml의 카르베니실린 및 2% 글루코오스를 함유한 400 2YT-아가 플레이트에서 성장시켰다. 밤새 30℃에서 인큐베이션한 후에, 라이브러리 형질전환체들을 수득하고 15% 글리세롤을 포함한 2YT에 현탁시켰다. 라이브러리 부분표본을 제조하고 -80℃에서 보관하였다. 그 결과의 라이브러리 크기를 표 3에 열거한다.
파지 디스플레이 라이브러리들의 특성
라이브러리 라이브러리 크기
AFH1K 3.6 x 109
AFH3K 3.3 x 109
AFH1L 3.5 x 109
AFH3L 3.2 x 109
총 1.4x 1010
파지 디스플레이 라이브러리를 다음 방식으로 제조하였다. 500 2YT (100 μg/ml의 카르베니실린 및 2% 글루코오스를 포함함) 배양을 라이브러리 TG1 세포로 0.1의 OD에서 시작하여 접종시켰다. 37℃에서 250 rpm으로 흔들면서 3-4시간 인큐베이션한 후에, K07 헬퍼 파지를 1:10 비율로 첨가하였다. 그런 다음 배양을 37℃에서 1시간 동안 흔들림 없이 인큐베이션하였다. TG1 세포를 원심분리하고 세포 펠릿을 100 μg/ml 카르베니실린 및 35 μg/ml 카나마이신을 함유한 2 L의 2YT에 재현탁하고 밤새도록 30℃에서 250 rpm으로 흔들면서 인큐베이션하였다. 그런 다음 TG1 세포를 30분 동안 6000 x g에서 4℃에서 원심분리하였다. 라이브러리 파지 입자를 배양 상층액으로부터의 PEG-침전에 의해 정제하고, PBS에 재현탁하고 OD268 측정에 의해 적정하였다. 파지 디스플레이 항체 라이브러리를 20% 글리세롤을 포함한 PBS에 담아 -80℃에서 보관하였다. 각각의 라이브러리를 별도로 제조하고 별도로 유지하였다.
면역복합체-특이적 항체를 선택하기 위한 과정은 실시예 2에서의 설명과 유사하다. 간단히 설명하면, 2종류의 미세적정 웰을 준비하는데, 하나는 AF10 항체만으로 코팅되었고, 두 번째는 25-(OH)D3:AF10의 면역복합체로 코팅되었다. 친화도 선택 전에, AF10 단독에 결합하는 파지들을 고갈시키기 위해 개별적인 라이브러리를 AF10-단독 웰에서 사전-인큐베이션하였다. 그런 다음 상층액을 25-(OH)D3:AF10의 면역복합체로 코팅된 미세적정 웰로 옮긴다. 제 1 라운드 친화도 선택에서, 총 8개의 웰을 사용하였고, 각각의 라이브러리 파지를 2개의 웰에 첨가하였다. 제 2 라운드 친화도 선택에서는, 제 1 라운드로부터의 파지들을 혼합하고 4개의 웰을 인큐베이션에 사용하였다. 총 3 라운드의 친화도 선택을 수행하였다.
제 3 라운드 친화도 선택으로부터의 콜로니들을 p3 융합의 발현 및 결합 활성의 확인을 위해 선택하였다. 그 과정은 실시예 2에 기술된 것과 유사하다. 간단히 설명하면, 5개의 96-웰 플레이트 및 총 480개의 콜로니를 선택하여 마스터 플레이트를 만들었다. 제 2일 동안에, 웰당 10 μl의 배양을 96-웰 딥-웰 발현 플레이트의 상응하는 웰에 옮겼다. 딥-웰 플레이트를 37℃ 쉐이커 인큐베이터에서 250 rpm으로 흔들면서 배양이 0.8 내지 1의 OD600nm에 도달할 때까지 인큐베이션하였다. 6 mM IPTG를 함유한 100 μl의 2YT를 각 웰에 첨가하고, 발현 플레이트를 30℃에서 250 rpm으로 흔들면서 밤새 인큐베이션하였다. 2.5 mg/mL 라이소자임 및 5 mM EDTA를 함유한 160 μL의 용해 완충액을 발현 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 흔들면서 인큐베이션하였다. 배양 상층액을 웰당 140 μl의 2x ChemiBlocker와 혼합하고 추가로 30분 동안 250 rpm에서 인큐베이션하였다. 배양 상층액을 원심분리하고 아래와 같이 결합 검정에 대해 준비하였다.
ELISA 스크리닝 과정은 실시예 2에서 기술한 것과 유사하였다. 간단히 설명하면, 각각의 발현 플레이트에 대해, 2개의 96-웰 검정 플레이트를 준비하는데, 한 플레이트는 AF10 항체만으로 코팅되었고, 두 번째는 25-(OH)D3:AF10의 면역복합체로 코팅되었다. 발현 플레이트로부터의 배양 상층액을 검정 플레이트의 상응하는 웰로 옮겼다. 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 PBS-Tween으로 3회 세척하였다. 100 μL의 HRP-컨쥬게이트된 항--Fab 항체 (Jackson ImmunoReaearch Lab, USA)를 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. PBS-Tween으로 3회 세척하고, 100 μL의 기질 TMB를 각 웰에 첨가하여 10 내지 30분 동안 전개시키고, 50 μl의 중단 용액을 첨가하였다. 그런 다음 OD450을 측정하였다. AF10 항체가 아닌, 25-(OH)D3:AF10의 면역복합체에 결합된 클론들을 확인을 위해 선택하였다. 포지티브 배양 상층액의 1:3 연속 희석을 상기 과저을 따라 검정하였다. 도 3은 25-(OH)D3:AF10의 면역복합체에 대한 5개의 클론의 결합 활성을 보여주고, 가변 영역 서열들은 표 1에 열거되었다.
실시예 4: 재조합 항체 발현 및 정제
재조합 Fab 발현을 위해, VH 및 VL 유전자를 대장균 발현 벡터 pEx에 클로닝하였다. 각각의 개별적인 클론에 대해, 20 ml의 밤샌 배양을 2% 글루코오스 및 100 μg/ml 카르베니실린을 포함한 2YT에서 제조하고 37℃ 쉐이커 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 다음날, 0.1% 글루코오스 및 100μg/mL 카르베니실린을 함유한 700 mL의 2YT를 2 L 초수율 플라스크 (Thomson Instrument Company)에, 7 ml의 밤샌 배양을 전달함으로써 접종하였다. 배양을 35℃에서 280 rpm으로 흔들면서 대략 2-3시간 동안, OD600이 ~0.8이 될 때까지 성장시켰다. 그런 다음 350 μl의 1M IPTG를 배양에 첨가하고 밤새 22℃에서 280 rpm으로 흔들면서 인큐베이션하였다. 세포 펠릿을 7500 x g에서 20분 동안의 원심분리에 의해 수집하고, 1 mg/ml 라이소자임 및 5 mM EDTA를 함유한 용해 완충액에 재현탁하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 가용성 Fab를 포함한 상층액을 15,000 x g에서 4℃에서 2회 원심분리함으로써 수집하였다. 그런 다음 상층액을 5 ml의 단백질-G 칼럼 (GE healthcare) 위에 로딩하여 Fab를 결합시키고 50 ml의 FBS로 세척하였다. 그런 다음 Fab 단백질을 0.3M 아세트산, pH3 완충액으로 용출하였다. 용출된 분획을 수집하고, 0.5 부피의 1M Tris-HCl, pH8.5 완퉁액으로 중화하였다. Fab 샘플을 PBS로 완충액-교환하고, 3 내지 5 mg/ml의 농도로 농축하였다. Fab 샘플을 -80℃에서 보관하였다.
IgG 발현을 위해, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 사이토메갈로바이러스 프로모터-기반 포유류 발현 벡터 PMX30 및 pMX31에 각각 클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄 벡터 DNA를 1:3의 비율로 혼합하고 혈청-유리 배지 중의 30 ml 현탁액 HEK293 세포로 일시적으로 트랜스펙션하였다. 20시간 후에, 세포를 생존력 및 생존 세포 수를 측정하기 위해 샘플링하였고, 역가를 측정하였다(Octet QKe, ForteBio). 배양을 제 5일에 수득하였고, 각각에 대한 추가의 샘플을 세포 밀도, 생존력 및 역가를 측정하기 위해 측정하였다. IgG를 함유하는 조건 배지를 수득하고 원심분리 및 여과에 의해 일시적인 트랜스펙션 생성으로부터 정화하였다. 상층액을 단백질 A 칼럼 위에 작동시키고 저pH 완충액 (pH = 3)으로 용출하였다. 0.2 μm 막 필터를 사용한 여과를 수행한 후에 부분표본화하였다. 정제 및 여과 후에, 단백질 농도를 OD280 및 흡광 계수를 기준으로 계산하였다. 일반적으로, 이 과정으로부터 1 내지 5 mg의 IgG를 생성하였다.
실시예 5: 혈청 25-(OH)D 측정을 위한 샌드위치 ELISA 검정
25-(OH)D:AF10의 면역복합체에 대한 단클론성 항체를 샌드위치 기반 ELISA 검정을 제조하기 위해 사용하였다. 유리 25-(OH)D3을 검정에 대해 사용하였다. 간단히 설명하면, 100 μL/웰의 AF10 항체 (PBS 중의 3 μg/ml)를 사용하여 미세역가 플레이트를 밤새도록 4℃에서 코팅하였다.
검정 플레이트를 PBS로 세척하고 1x ChemiBlocker로 2시간 동안 실온에서 차단하였다. 5 μL/웰의 25-(OH)D3을 0.5 내지 50 ng/ml의 농도에서 플레이트에 첨가하였고, 그런 다음 3 μg/ml의 200 μL의 항-면역복합체 항체를 첨가하였다. 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에, 플레이트를 PBS-Tween으로 3회 세척하고, 100 μl의 HRP-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 항체 (Jackson ImmunoReaearch Lab, USA)를 각 웰에 첨가하고 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. PBS-Tween으로 3회 세척한 후에, 100 μl의 기질 TMB를 각 웰에 첨가하고 30분 동안 전개시켰다. 50 μL의 중단 용액을 첨가하고, OD450을 측정하였다. 이 데이터는 용량-의존적 반응을 나타냈고 25-(OH)D 검출에 대한 샌드위치 ELISA에 대한 개념 입증으로서 작용하였다. 임상 샘플 검출에 대한 검정의 유용성을 추가로 확인하기 위하여, 25-(OH)D 값 (ADVIA Centaur VitaminD Total assay, Siemens)을 가진 환자 혈청 샘플을 샌드위치 ELISA 검정을 사용하여 측정하였다. 검정을 유리 25-(OH)D3에 대해서와 같이 수행하되, 각 웰에 25-(OH)D:AF10의 면역복합체에 대한 3 μg/ml의 단클론성 항체를 함유한 200 μL의 CalBiotech 방출 완충액 (Calbiotech, California, USA)을 첨가한 후, 5 μl의 혈청 샘플을 첨가하였다. 혼합 후에, 플레이트를 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 도 4는 비타민 D 농도를 측정하는 2가지 방법 사이의 선형 관계를 증명하는, 혈청 25-(OH)D의 성공적인 샌드위치 ELISA 검출을 보여준다.
실시예 6: 25-(OH)D 측정을 위한 측면 유동 검정
예시적인 측면 유동 장치는 샘플 수송을 위한 샘플 적용 유닛 (예컨대, Ahlstrom 또는 Millipore 제품), 표지된 항체 및 고정된 포획 시약을 포함하는 검출 구역을 포함하는 컨쥬게이트 패드 및 흡수 패드 (예컨대 Ahlstrom 또는 Millipore 제품)를 포함한다.
건조 컨쥬게이트 패드를 다음과 같이 제조하였다. 0.04% 콜로이드상 용액을 염화 금을 시트르산 나트륨으로 비등 온도에서 환원시킴으로써 제조하였다. 25 μg의 항-25-(OH)D 항체를 1 ml의 0.04% 콜로이드상 용액에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 컨쥬게이트를 20분 동안 1000 rpm에서 원심분리하였다. 그런 다음 상층액을 붓고, 펠릿을 1 mL의 15 mM 포스페이트 완충액, pH 7.4에 현탁하였다. 유사한 과정을 수행하여 포지티브 대조군에 대해 사용한 콜로이드상 금-항-닭 IgG 항체의 컨쥬게이트를 제조하였다. 항-25-(OH)D 컨쥬게이트 및 항-닭 IgG 컨쥬게이트를 컨쥬게이트 패드 베이스와 1:10 비율로 혼합하였다. 10 ml의 컨쥬게이트 패드 베이스 혼합물을 8 cm x 8 cm 섬유유리 시트 조각에 적용하고, 실온에서 4시간 동안 진공 건조시켰다. 패드를 건조실에서 건조제와 함께 보관하였다.
검출 막을 제조하기 위하여, 25-(OH)D:AF10의 면역복합체에 대한 단클론성 항체를 테스트 라인 용액으로서 pH 7.4의 15 mM 포스페이트 완충액에서 0.2 내지 1.5 mg/ml의 농도 범위로 제조하였다. 테스트 라인 용액을 니트로셀룰로오스 막 (Millipore 125 또는 GE AE99)에 0.6 내지 1.0 μL/cm의 양으로 분배하였다. 유사하게, 항-닭 IgG를 포함한 대조군 라인 용액을 니트로셀룰로오스 막 위에 대조군 라인 위치에 분배하였다. 그런 다음 막을 30% 미만의 습도를 가진 환경에서 1시간 동안 공기 건조시킨 후, 건조실에서 건조제와 함께 보관하였다.
테스트 장치를 구성하기 위하여, 검출 막, 컨쥬게이트 패드, 및 샘플 심지 물질을 배열하고 조립된 스트립을 플라스틱 하우징에 넣었다.
장치를 공지의 25-(OH)D 농도를 가진 혈청 또는 혈액 샘플을 사용함으로써 평가하였다. 5 μL의 혈청 또는 10 μL의 모세관 혈액을 샘플 패드에 적용하고, 이어서 3 방울 (100 μL)의 샘플 추적 완충액을 적용하였다. 테스트 라인 및 대조군 라인을 15분 후에 판독하였다. 도 5에 도시한 그 결과는, 테스트 라인 상의 신호 밀도가 더 높은 혈청 비타민 D 농도를 가진 샘플에서 증가한 것을 나타낸다. 테스트 장치는 대상체가 충분한, 불충분한, 또는 결핍된 비타민 D를 가진 것을 나타낸다 (도 1A). 나아가, 테스트 장치는 신호 세기와 10 ng/ml 내지 80 ng/ml 범위의 샘플 중의 25-(OH)D 수준 사이의 선형 관계를 증명하였다. 추가의 샘플을 반-정량적 색상표를 사용하여 측정되는 바와 같이 비타민 D 수준에 대해 테스트하였다 (도 1B). 데이터를 ADVIA Centaur VitD 검정에 의해 측정된 비타민 D 수준과 비교하였다. 표 4에서 나타낸 것과 같이, 측면 유동 테스트 장치의 결과는 ADVIA Centaur VitD 검정으로부터의 테스트와 일치하였다. 테스트를 상이한 제조 로트로부터의 장치로 재생하였다.
측면 유동 테스트 장치 및 ADVIA Centaur VitD 검정을 사용한 측정의 비교
ADVIA Centaur VitD 검정 측면 유동 테스트 결과
(반-정량적)
환자 번호 환자 ID 25-(OH)D ng/mL 25-(OH)D ng/mL VitD 충분도
1 03928913 4.2 < 10 결핍된
2 03928920 4.2 < 10 결핍된
3 1023110935 9 < 10 결핍된
4 1023110936 10 10 결핍된
5 1023110968 10 10 결핍된
6 1023110755 10 10 결핍된
7 1023110768 10 <10 결핍된
8 1022110849 11 10 결핍된
9 1023110943 11 10 결핍된
10 1023110949 11 10 결핍된
11 1023110957 19.4 <20 불충분한
12 1023110763 20 20 불충분한
13 1023110788 20 >20 불충분한
14 1023110831 20 20 불충분한
15 1023110866 20 <20 불충분한
16 1023110876 20 20 불충분한
17 1023110958 20 20 불충분한
18 1023110743 21 20 불충분한
19 1022110782 29 30 충분한
20 1022110783 29 30 충분한
21 1022110784 30 >30 충분한
22 1022110863 30 30 충분한
23 1023110910 30 30 충분한
24 1023110813 29.1 30 충분한
25 10411110254 32.7 30 충분한
26 10411110267 33.5 >30 충분한
27 10052015WK 42 >30 충분한
28 10052015JA 41 >30 충분한
29 1120834 67 >>30 충분한
30 1124761 80 >>30 충분한
31 1123647 97 >>30 충분한
나아가, 모세관 혈액 샘플 중의 비타민 D 수준의 정량적 검출을 위해 스마트폰-기반 판독기를 사용하였다. 10 μl의 모세관 혈액을 샘플 패드에 적용하고, 이어서 3 방울 (100 μl)의 샘플 추적 완충액을 적용하였다. 테스트 라인을 15분 후에 판독하였다. 상응하는 개체의 혈청 샘플을 수집하고 ELISA 테스트를 수행하였다. 도 6은 측면 유동 테스트 장치 및 ELISA-기반 혈액 테스트를 사용한 모세관 혈액 테스트를 비교한 것을 도시한다. 데이터는 0.91의 상관 계수, R을 가진 포지티브 선형 상관관계를 보여준다.
실시예 7: 큐브-판독기를 사용한 25-(OH)D 측정을 위한 측면 유동 검정
큐브-판독기 (opTricon GmbH, Germany)를 25-OH 비타민 D의 전체 정량 측정에 사용하였다. 큐브-판독기는 휴대용 측면 유동 검정 판독기로, 대략 41 mm의 가장자리 길이 및 40 g의 무게의 큐브-모양을 가진다. 측정 과정은 도 8에 도시된다.
액체 크로마토그래피 질량 분석 (LC-MS/MS) 검정에 의해 측정된 25-OH 비타민 D 값을 가진 총 20개의 인간 혈청 샘플을 측면 유동 테스트에 적용하였다. 측정 과정은 실시예 6에서 기술한 대로이다. 하기 표 5에 열거한 결과는 측면 유동 테스트로부터의 25-OH 비타민 D 값이 LC-MS/MS 검정 (25-OH 비타민 D 측정에 대한 "금" 표준 방법)으로부터 생성된 진정한 값과 매우 가까운 것을 보인다.
측면 유동 테스트 및 액체 크로마토그래피 질량 분석 테스트로부터의 테스트 결과
샘플 ID 25-OH 비타민 D (ng/ml) 25-OH 비타민 D (ng/ml)
LC-MS/MS 테스트 측면 유동 테스트
S-1 14.3 14.4
S-2 14.0 16.0
S-3 18.9 19.9
S-4 19.8 19.1
S-5 20.0 22.4
S-6 26.4 22.1
S-7 29.3 31.0
S-8 40.1 37.2
S-9 40.3 47.4
S-10 45.9 51.8
S-11 46.4 39.2
S-12 49.0 42.6
S-13 56.3 57.4
S-14 60.3 72.7
S-15 63.1 67.8
S-16 75.5 71.2
S-17 87.4 85.9
S-18 92.3 97.9
S-19 92.4 94.4
S-20 103.9 93.1
평균 49.8 50.2
측면 유동 테스트와 LC-MS/MS 검정 사이의 25-OH 비타민 D 값의 비교는 선형 회귀 Y = 0.98X + 1.49를 산출하였고, 이때 상관 계수는 0.98이었다. 비교 결과를 도 9에 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구체예가 본원에서 제시되고 기술된 한편, 당업자들에게는 그러한 구체예들이 실시예에 의해서만 제공된 것임이 명백할 것이다. 많은 변화, 수정 및 치환들이 이제 발명으로부터 벗어나지 않으면서 당업자들에게 일어날 것이다. 발명의 실시함에 있어서 본원에 기술된 발명의 구체예들에 대한 다양한 대안들이 사용될 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 다음의 청구범위는 발명의 범주를 규정하고 이 청구범위의 범주 내의 방법 및 구조 및 그것들의 동등물이 그로써 커버될 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> AFFIMEDIX, INC. <120> DEVICE FOR DETECTION OF VITAMIN D METABOLITES <130> 49821-701.601 <140> PCT/US2017/014620 <141> 2017-01-23 <150> 62/286,297 <151> 2016-01-22 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu Asn Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln His Gly Glu Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Val Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Asp Gly Tyr Tyr Val Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Glu Val Glu Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Phe Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ile Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Glu Val Asn Val Val Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Ser 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ile Lys Ser Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Leu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 9 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Ser Tyr Tyr Gly Asn Tyr Val Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ser Val Ile Ser Gly Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Leu Asn Ala Gly Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Met Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Met 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Gly Tyr Thr Asp Gly Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Ser Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ile Phe Pro Ser Tyr Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Ala Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Val Val Gly Ser Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Val Thr Tyr Tyr Tyr Met Asp His Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Ile Gly Ile Phe Gly Thr Ala Thr Tyr Ala Gln Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala 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Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asn Asn Leu Ser Gly Tyr Tyr Val 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Tyr Ser Gly Thr Tyr Val 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Trp Asp Asn Val Gly Gly Tyr Asn Val His 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Arg 35 40 45 Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn 50 55 60 Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly Asp 65 70 75 80 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Tyr Gln Ser Thr Val Leu Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 <210> 19 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Asn Val Gly Gly Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Ala Tyr His Gln Ser Thr Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Val Gly Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Tyr Ser Thr Ser Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Gly Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser 1 5 10 15

Claims (39)

  1. 하나 이상의 비타민 D 분자를 검출하기 위한 테스트 장치로서,
    상기 테스트 장치는
    (a) 하우징을 포함하고, 상기 하우징 안에
    (i) 생물학적 샘플을 흡수하고 상기 생물학적 샘플을 컨쥬게이트 패드에 수송하도록 구성된 샘플 적용 패드;
    (ii) 하나 이상의 비타민 D 분자에 특이적으로 결합하는 비타민 D 결합제를 포함하는 상기 컨쥬게이트 패드; 및
    (iii) 상기 비타민 D 결합제가 상기 하나 이상의 비타민 D 분자와 복합체를 형성함으로써 생성된 에피토프에 특이적으로 결합하는 검출 항체가 고정되어 있는 제 1 영역을 포함하는 검출 구역이 포함되어 있는, 테스트 장치.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 비타민 D 분자는 25-하이드록시비타민 D2, 25-하이드록시비타민 D3, 25-하이드록시비타민 D4, 25-하이드록시비타민 D5, 및 1,25-하이드록시비타민 D3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 하나 이상의 비타민 D 분자는 25-하이드록시비타민 D2 및 25-하이드록시비타민 D3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 하나 이상의 비타민 D 분자는 25-하이드록시비타민 D2 및 25-하이드록시비타민 D3인 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 하나 이상의 비타민 D 분자는 25-하이드록시비타민 D2로 구성되는 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 하나 이상의 비타민 D 분자는 25-하이드록시비타민 D3으로 구성되는 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 검출 구역은 제 2 영역을 더 포함하고, 상기 비타민 D 결합제가 상기 하나 이상의 비타민 D 분자에 결합되거나 결합되지 않거나 간에 상기 비타민 D 결합제에 결합할 수 있는 제 3 항체가 상기 제 2 영역 안에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 비타민 D 결합제는 검출 시약에 컨쥬게이트되는 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  9. 제 8 항에 있어서, 검출 시약은 금 입자, 라텍스 입자, 탄소 나노입자, 셀레늄 나노입자, 은 나노입자, 양자점, 형광 화합물, 염료, 효소 및 리포솜으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  10. 제 9 항에 있어서, 검출 시약은 상기 금 입자인 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  11. 제 9 항에 있어서, 검출 시약은 상기 라텍스 입자인 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플 적용 패드, 상기 컨쥬게이트 패드, 및 상기 검출 구역은 유체 경로를 따라 상류로부터 하류로 배치되고, 상기 생물학적 샘플은 상기 유체 경로를 통해 이동하는 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플의 수성 부분으로부터 상기 생물학적 샘플의 미립자 부분을 분리하도록 구성된 상기 샘플 적용 패드와 상기 컨쥬게이트 패드 사이의 여과 구성요소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 상기 경쇄는 SEQ ID NO 1 내지 5 및 16 내지 20으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하며; 상기 중쇄는 SEQ ID NO 6 내지 15로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 항체는 상기 비타민 D 결합제보다 상기 에피토프에 대해 더 높은 결합 친화도를 나타내는 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 항체는 scFv, VH, Fab, 또는 (Fab)2 결합 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 상기 경쇄는 SEQ ID NO 1 내지 5 및 16 내지 20으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%의 서열 상동성을 공유하는 서열을 포함하며, 상기 중쇄는 SEQ ID NO 6 내지 15로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 최소한 80%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 테스트 장치.
  18. (a) 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 상기 테스트 장치의 상기 샘플 적용 패드에 생물학적 샘플을 적용하는 단계;
    (b) 상기 샘플 적용 패드에 추적 완충액을 적용하는 단계; 및
    (c) 상기 하나 이상의 비타민 D 분자를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 샘플 중의 상기 하나 이상의 비타민 D 분자를 정량하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 정량 단계는 상기 혈액 샘플을 충분한 수준, 불충분한 수준, 또는 결핍된 수준의 상기 하나 이상의 비타민 D 분자를 가지는 것으로서 분류하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 충분한 수준은 적어도 30 ng/ml인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 18 항에 있어서, 상기 불충분한 수준은 적어도 10 ng/ml 및 30 ng/ml 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 18 항에 있어서, 상기 결핍된 수준은 10 ng/ml 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 18 항에 있어서, 상기 정량 단계는 상기 검출 멤브레인의 영상을 제공하기 위한 영상 장치 및 상기 검출 멤브레인의 상기 영상을 기반으로 상기 샘플 중의 상기 하나 이상의 비타민 D 분자를 정량하도록 구성된 프로그래밍된 컴퓨터 상의 소프트웨어를 사용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 영상 장치 및 상기 프로그래밍된 컴퓨터는 단일 장치인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 18 항에 있어서, 상기 추적 완충액은 비타민 D 결합 단백질로부터 상기 하나 이상의 비타민 D 분자를 해리하기 위한 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 14 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 눈 분비물, 척수액, 및 땀으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 결합 검정을 수행하도록 구성된 테스트 장치로 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 비타민 D 수준을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 생물학적 샘플을 테스트 장치에 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 생물학적 샘플에 대해 (1) 비타민 D 결합제 및 (2) 하나 이상의 비타민 D 분자에 의해 형성된 복합체를 포함하는 반응 혼합물을 사용하는 상기 결합 검정을 수행하는 단계;
    (c) 상기 비타민 D 결합제와 하나 이상의 비타민 D 결합 분자의 복합체를 형성함으로써 형성된 에피토프에 결합하는 검출제에 상기 복합체를 추가로 노출시키는 단계를 포함하고, 상기 결합 검정은 액체 크로마토그래피-병행 질량 분광분석의 검출 민감도와 비슷한 상기 생물학적 샘플 중의 검출 민감도를 가지는,
    방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 검출제는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 상기 경쇄는 SEQ ID NO 1 내지 5 및 16 내지 20으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하며; 상기 중쇄는 SEQ ID NO 6 내지 15로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 검출제는 상기 비타민 D 결합제보다 상기 복합체에 대해 더 높은 결합 친화도를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 28 항에 있어서, 상기 검출제는 scFv, VH, Fab, 또는 (Fab)2 결합 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 28 항에 있어서, 상기 검출제는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 상기 경쇄는 SEQ ID NO 1 내지 5 및 16 내지 20으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%의 서열 상동성을 공유하는 서열을 포함하며, 상기 중쇄는 SEQ ID NO 6 내지 15로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 최소한 80%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 28 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 눈 분비물, 척수액, 및 땀으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. (a) 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 상기 테스트 장치 및
    (b) 키트의 사용을 위한 서면 설명서
    를 포함하는 키트.
  35. 제 34 항에 있어서, 멸균제; 피부를 천공하기 위한 장치; 거즈; 추적 완충액; 및 마이크로피펫으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 구성요소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  36. 제 34 항에 있어서, 상기 멸균제는 알코올 물수건인 것을 특징으로 하는 키트.
  37. 제 34 항에 있어서, 상기 피부를 천공하기 위한 장치는 란셋, 바늘, 및 주사기로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  38. 제 34 항에 있어서, 상기 추적 완충액은 혈액 샘플 중의 비타민 D 결합 단백질로부터 하나 이상의 비타민 D 분자를 해리하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 키트.
  39. 제 34 항에 있어서, 상기 샘플 중의 하나 이상의 비타민 D 분자의 양에 신호 강도를 관련시키는 색상표를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10254279B2 (en) * 2013-03-29 2019-04-09 Nima Labs, Inc. System and method for detection of target substances
AU2017209523A1 (en) 2016-01-22 2018-08-09 Affimedix, Inc. Device for detection of vitamin D metabolites
ES2942490T3 (es) * 2017-05-11 2023-06-01 Boditechmed Inc Procedimiento para el ensayo de cuantificación rápida de la vitamina D basado en la medición de fluorescencia utilizando un cartucho de flujo lateral
WO2022085719A1 (ja) * 2020-10-21 2022-04-28 東洋紡株式会社 ビタミンａ定量用イムノクロマトストリップおよび測定キット
CN117229411B (zh) * 2023-11-10 2024-02-02 南京欧凯生物科技有限公司 特异性结合25-羟基维生素d的单克隆抗体、其应用及检测试剂盒

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020036170A1 (en) 2000-08-11 2002-03-28 Harvey Michael A. Lateral flower plasma separation device
GB0029729D0 (en) 2000-12-06 2001-01-17 Ids Ltd Method for detection of vitamin D metabolites
WO2003028582A2 (en) * 2001-09-28 2003-04-10 Aspenbio, Inc. Bovine pregnancy test
FI20022048A0 (fi) * 2002-11-18 2002-11-18 Valtion Teknillinen Ei-kompetetiivinen immunomääritys pienille analyyteille
US20040132104A1 (en) 2003-01-07 2004-07-08 Sackrison James L. Vitamin D assay
WO2006098804A2 (en) 2005-03-11 2006-09-21 Chembio Diagnostic Systems, Inc. Dual path immunoassay device
CA2624129C (en) 2005-09-29 2011-03-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Release reagent for vitamin d compounds
WO2008039266A2 (en) 2006-07-28 2008-04-03 Beckman Coulter, Inc. Stabilizing agents and capture ligands for use in assays measuring analyte concentrations
US8535617B2 (en) 2007-11-30 2013-09-17 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Blood cell barrier for a lateral flow device
WO2012129650A1 (en) * 2011-03-25 2012-10-04 Nanospeed Diagnostics Inc. Lateral flow immunoassay for detecting vitamins
US8785603B2 (en) * 2011-05-20 2014-07-22 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Antibodies to 25-hydroxyvitamin D2 and D3 and uses thereof
JP6156144B2 (ja) 2011-09-21 2017-07-05 富士レビオ株式会社 親和性複合体に対する抗体
WO2014070935A1 (en) * 2012-10-31 2014-05-08 Astute Medical, Inc. Quantitative lateral flow assay
US20140162294A1 (en) * 2012-12-06 2014-06-12 General Atomics Methods and compositions for assaying vitamin d
US9445749B2 (en) * 2013-01-21 2016-09-20 Cornell University Smartphone-based apparatus and method for obtaining repeatable, quantitative colorimetric measurement
DK2759550T3 (en) * 2013-01-28 2018-11-26 Diasorin S P A Method and kit for detecting vitamin 1,25-dihydroxy-D and related antibodies
CN105229468A (zh) * 2013-06-04 2016-01-06 普默特株式社 具有可变对照线的用于快速检测的条带以及使用该条带的诊断试剂盒
US20150118689A1 (en) * 2013-10-24 2015-04-30 Quidel Corporation Systems and methods for whole blood assays
CN104062440B (zh) * 2014-06-30 2016-05-11 韩雅君 一种快速检测维生素d的试纸条
WO2016091755A1 (en) * 2014-12-08 2016-06-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for measurement of vitamin d
AU2017209523A1 (en) 2016-01-22 2018-08-09 Affimedix, Inc. Device for detection of vitamin D metabolites

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021033836A1 (ko) * 2019-08-22 2021-02-25 한국표준과학연구원 Ldi-ms를 이용한 혈액 내 비타민 d의 검출 방법 및 이를 위한 장치

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