CN108700573A

CN108700573A - 检测去势抵抗性前列腺癌的方法和检测试剂

Info

Publication number: CN108700573A
Application number: CN201780014137.4A
Authority: CN
Inventors: 荒川宪昭; 平野久; 上村博司; 伊藤悠亮; 明庭昇平; 大竹则久
Original assignee: PUBLIC UNIVERSITY CORP YOKOHAM; Tosoh Corp
Current assignee: PUBLIC UNIVERSITY CORP YOKOHAM; Tosoh Corp; Yokohama City University
Priority date: 2016-02-29
Filing date: 2017-02-23
Publication date: 2018-10-23
Anticipated expiration: 2037-02-23
Also published as: JP6829444B2; EP3425392A4; JPWO2017150314A1; US11604194B2; US20210190786A1; WO2017150314A1; EP3425392A1; CN108700573B

Abstract

本发明的目的在于提供以简便且高精度检测去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的方法和能用于前述方法的试剂。通过将存在于被检体中的GDF15前肽作为CRPC的新型检测标记物并对其量进行测定，从而对内分泌治疗期间或治疗后的前列腺患者检测出去势抵抗性的获得。另外，特异性识别GDF15前肽的抗体包含在CRPC的检测试剂中。

Description

检测去势抵抗性前列腺癌的方法和检测试剂

技术领域

本发明涉及血液中的生长分化因子15(Growth and Differentiation Factor15、以下也记为“GDF15”)蛋白质的前肽及其降解物、以及以它们作为测定对象的去势抵抗性前列腺癌的检测方法和检测试剂。

背景技术

生长分化因子15(GDF15)是与巨噬细胞抑制细胞因子1(Macrophage InhibitoryCytokine 1：MIC-1)、非甾体类抗炎药活化基因1(Nonsteroidal anti-inflammatorydrug-Activated Gene 1：NAG-1)相同的蛋白质，属于TGF-β家族。GDF15表达为包含分泌信号和前肽的原GDF15，然后分泌信号被切断而作为前原GDF15(prepro-GDF15)被分泌至细胞外。原GDF15通过前肽存储在细胞外基质中，通过弗林样蛋白酶在由前肽形成二聚体的状态下切断GDF15并释放至血液中(非专利文献1)。报道了：原GDF15以全长计被分级为分子量40000附近，GDF15成熟体被分级为分子量15000附近(非专利文献2)。

关于GDF15有如下见解：例如在前列腺癌(Prostate cancer：PCa)、卵巢癌、再者心脏疾病等各种疾病中血液中的成熟体量增加(专利文献1～6、非专利文献3～7)，此外在食欲调节、妊娠期间对胎儿检查时的应用(专利文献7～8)。特别是，在与前列腺疾病的相关性方面，已知：前列腺癌与前列腺肥大(Benign prostatic hypertrophy：BPH)相比血液中GDF15成熟体量增加；通过与PSA测定值组合而使诊断性能提高；骨转移与血液中GDF15成熟体量存在相关性而对预后判定是有用的(专利文献9～10、非专利文献8～10)。

然而，这些见解均与GDF15成熟体有关，可认为GDF15前肽局部存在于细胞外基质中(非专利文献2)。综合性蛋白初解物解析大数据(PeptideAtras、Protein Name：ENSP00000252809、Build：Human Plasma Non-Glyco 2015-09)中启示了血液中GDF15前肽的存在，但至今尚不知晓GDF15前肽降解物的存在。另外，将该蛋白质作为测定对象来检测疾病时，其效果也是不清楚的。

目前，在日本每年发病的前列腺癌人数约为60000人，每年死亡人数约为11000人，该数值正在急剧增加。前列腺癌为早期癌、局部晚期癌时，使用外科疗法或辐射线疗法，预后是良好的。另一方面，为晚期转移癌时，使用基于抗雄激素剂的激素疗法，据说有约80％的效果。然而，一部分前列腺癌尽管将雄激素抑制在去势水平，但还会成为病情再次恶化的去势抵抗性前列腺癌(Castration-Resistant Prostate Cancer：CRPC)。

一直以来对CRPC患者实施了抗癌剂治疗，近些年在日本以CRPC作为对象的3种新型治疗药(激素治疗药2种、抗癌剂1种)也可适用保险，治疗药的使用顺序、判别转为抗癌剂治疗的时机受到重视。

作为从全血、血细胞、血清、血浆等的血液成分中检测前列腺癌的方法，通常已知以前列腺特异抗原(Prostate Specific Antigen、PSA)作为检测对象的方法。PSA是1979年王等人从人精清中纯化而得到的丝氨酸蛋白酶，若在血液成分中检测出20ng/ml以上的PSA，则以高的阳性率表现出前列腺癌。因此，作为对前列腺癌的筛选、前列腺癌的治疗效果的评价、治疗后的医学随访等有效的检查被广泛使用。

然而，血液中PSA浓度与CRPC的病情并非一定一致，仅通过测定PSA来判别去势抵抗性的获得是困难的。因此，现状是进行包括其它检查方法在内的全面的医学随访。另外，Grisons得分高的患者、晚期患者被认为获得去势抵抗性的时间相对较快，但无法通过PSA进行确切的诊断，因人而异去势抵抗性获得期间的范围为几个月～10年之宽广，判明骨转移等病情恶化的情况较多，因此迫切期望基于血液诊断进行的简便且更准确的去势抵抗性获得的判别方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利公开2011-102461

专利文献2：日本专利公开2009-545735

专利文献3：日本专利公开2010-528275

专利文献4：日本专利公开2011-523051

专利文献5：日本专利公开2012-515335

专利文献6：日本专利公开2015-108077

专利文献7：日本专利公开2011-190262

专利文献8：日本专利公开2003-532079

专利文献9：日本专利公开2013-174614

专利文献10：日本专利公开2011-509403

非专利文献

非专利文献1：Prostate Cancer Prostatic Dis.2012；15(4)：320-328

非专利文献2：Cancer Res.2005；65(6)：2330-2336

非专利文献3：Biochemical Pharmacology.2013；85：597-606

非专利文献4：Clin Cancer Res.2009；15(21)：6658-6664

非专利文献5：Clin Cancer Res.2011；17：4825-4833

非专利文献6：Clin Cancer Res.2003；9：2642-2650

非专利文献7：Clin Cancer Res.2006；12：442-446

非专利文献8：Clin Cancer Res.2006；12(1)：89-96

非专利文献9：Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.2007；16：532-537

非专利文献10：Aging Cell.2010；9：1057-1064

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供以简便且高精度检测去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的方法和能用于前述方法的试剂。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：在癌细胞株的培养上清液中分泌有GDF15前肽及其降解物，进而确认了在癌患者的血液中也存在GDF15前肽及其降解物。特别是，对前列腺癌(PCa)和去势抵抗性前列腺(CRPC)细胞株培养上清液进行蛋白初解物解析时，发现在培养上清液中不仅存在GDF15成熟体而且存在GDF15前肽及其降解物。

进而，进行了深入研究，结果得到如下见解：在前列腺肿瘤和前列腺肥大中，通过使用了识别GDF15前肽的抗体的免疫分析，在去势抵抗性获得后的前列腺癌被检体中，血液中的GDF15前肽显示出明显的增加，且发现GDF15前肽可成为去势抵抗性前列腺癌的检测标记物，从而完成了本发明。

即，本发明如下。

[1]一种检测去势抵抗性前列腺癌的方法，其包括：对被检体中完整的GDF15前肽量进行测定。

[2]一种检测去势抵抗性前列腺癌的方法，其包括：对被检体中GDF15前肽片段量进行测定。

[3]一种检测去势抵抗性前列腺癌的方法，其包括：对被检体中完整的GDF15前肽量和GDF15前肽片段量的总量进行测定。

[4]根据[2]或[3]所述的方法，其中，前述GDF15前肽片段包含以下(A)和/或(B)所述的GDF15前肽片段。

(A)GDF15前肽片段，其具有以下(a)和(b)的特征。

(a)包含序列号2所示的GDF15氨基酸序列的从第58残基的赖氨酸至至少第167残基的天冬氨酸为止的氨基酸序列、或与其具有80％以上同源性的序列。

(b)通过还原SDS-PAGE被分级为分子量约17000。

(B)GDF15前肽片段，其具有以下(c)和(d)的特征。

(c)包含序列号2所示的GDF15氨基酸序列的从第74残基的谷氨酸至至少第167残基的天冬氨酸为止的氨基酸序列、或与其具有80％以上同源性的序列。

(d)通过还原SDS-PAGE被分级为分子量约15000。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其利用使用了识别GDF15前肽的抗体的抗原抗体反应来进行前述测定。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其利用质谱分析法来进行前述测定。

[7]一种用于检测去势抵抗性前列腺癌的试剂，其包含识别GDF15前肽的抗体。

[8]一种GDF15前肽片段，其具有以下(a)和(b)的特征。

(b)通过还原SDS-PAGE被分级为分子量约17000。

[9]一种GDF15前肽片段，其具有以下(c)和(d)的特征。

(d)通过还原SDS-PAGE被分级为分子量约15000。

发明的效果

根据本发明，提供可成为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的诊断标记物的新型肽片段。另外。根据本发明，可提供以简便且高精度检测CRPC的方法和能用于前述方法的试剂。

另外，本发明的试剂用于检测GDF15前肽，由于GDF15表达控制位于p53下游，因此可推测出反映出现有前列腺癌治疗药、尤其是紫杉烷系抗癌剂的治疗效果。因此，本发明的试剂还可以作为治疗前列腺癌时的伴随诊断药。

附图说明

图1是示出从癌细胞培养上清液中检测出的GDF15的肽的图。剖面线的部分表示通过蛋白初解物解析检测出的肽。

图2-1是用于表位解析而制作的重组GDPP的示意图。

图2-2是示出基于ELISA法进行的各单克隆抗体的表位解析结果的图。横轴表示吸光度。

图3-1是示出用SDS-PAGE对通过3种单克隆抗体的LnCap上清液的IP产物进行展开的结果的图(Ruby染色图像)(照片)。

图3-2是示出利用质谱分析装置对由SDS-PAGE的各条带切取的样品进行检测得到的GDPP的肽的图。

图4是示出基于免疫印迹法进行重组iGDPP的纯化结果的图(照片)。

图5是示出通过使用了合成肽的MRM进行定量用的GDPP校正曲线的图。

图6是示出利用iGDPP、tGDPP和mGDF15的测定试剂的校正曲线的图。

图7-1是示出各前列腺疾病组的血清和血浆中iGDPP的AIA解析结果和相关性的图。横线表示各疾病组的中央值。

图7-2是示出各前列腺疾病组的血清和血浆中tGDPP的AIA解析结果和相关性的图。横线表示各疾病组的中央值。

图7-3是示出PCa和CRPC组中的iGDPP和tGDPP测定值的血清与血浆之差的图。

图7-4是示出各前列腺疾病组的血清和血浆中mGDF15的AIA解析结果和相关性的图。横线表示各疾病组的中央值。

图8-1是示出iGDPP和tGDPP的PCa和CRPC被检体的ROC曲线的图。实线表示血浆的值、虚线表示血清的值。

图8-2是示出mGDF15的PCa和CRPC被检体的ROC曲线的图。

图9是示出前列腺疾病血浆中的PSA、mGDF15和iGDPP的AIA解析结果的图。

图10是示出PSA、mGDF15和iGDPP的PCa和CRPC被检体的ROC曲线的图。细实线表示PSA、虚线表示mGDF15、粗实线表示iGDPP。

图11是示出是否进行非甾体类抗炎药给药的iGDPP测定值的图。

具体实施方式

<1>本发明的生长分化因子15(GDF15)前肽片段

本发明的第一方式是作为GDF15前肽的降解物的GDF15前肽片段。

根据GDF15的表达/分泌方式，可认为在GDF15成熟体分泌后GDF15前肽也局部存在于细胞外基质中。本发明人等对PCa和CRPC细胞株培养上清液进行了蛋白初解物解析，结果得知在培养上清液中不仅存在GDF15成熟体而且还存在GDF15前肽及其降解物。进而，本发明人等发现：在血液中分泌有GDF15前肽及其降解物。可推测出：随着表达量的增加，GDF15前肽也被分泌至血液中，GDF15前肽在该过程中经过某些特征性的加工而以其降解物的形式存在GDF15前肽片段。需要说明的是，一直以来并不知晓GDF15前肽的降解物(片段)的存在。

GDF15前肽(以下也记为“GDPP”)是位于原GDF15的N末端侧的165残基的多肽。更具体而言，对于本说明书中的GDF15前肽，在基于序列号1所示的人GDF15的cDNA(GenBankAccessesion No.：NM_004864)的氨基酸序列中，继从起始蛋氨酸至第29残基的丙氨酸为止的信号肽之后，至少包含从第30残基的亮氨酸至第194残基的精氨酸为止的序列，或包含与前述序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。

可认为GDF15前肽片段中存在多种形式，包含通过后述实施例被证实的以下2种。

第1种，是GDF15前肽的C末端侧片段(以下也记为“dNT57-GDPP”)，其在GDPP中在序列号2的第58残基的赖氨酸的N末端侧产生加工而至第57残基缺失。更具体而言，包含序列号2的从第58残基的赖氨酸至至少第167残基的天冬氨酸为止的序列，或包含与前述序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。

第2种，是GDF15前肽的C末端侧片段(以下也记为“dNT73-GDPP”)，其在GDPP中序列号2的第74残基的谷氨酸的N末端侧产生加工而至第73残基缺失。更具体而言，包含序列号2的从第74残基的谷氨酸至至少第167残基的天冬氨酸为止的序列，或包含与前述序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。

前述同源性优选为90％以上、更优选为95％以上。另外，本发明的多肽还可以是由前述序列中缺失、置换、插入和/或添加有1或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽。需要说明的是，多个是指优选为2～20个、更优选为2～10个、进一步优选为2～5个。

另外，通过还原SDS-PAGE可在分子量20000附近检测出GDF15前肽，在分子量17000附近检测出dNT57-GDPP，在分子量15000附近检测出dNT73-GDPP。更具体而言，使用例如10～20质量％的线性梯度的聚丙烯酰胺凝胶并依据常规方法在还原条件下实施SDS-PAGE时，优选在与相当于Precision Plus Protein Preste Standard(BIO-RAD公司制)的分子量20000、17000和15000的条带几乎相同的位置检测出分子量标记物。

<2>本发明的去势抵抗性前列腺癌的检测方法

本发明的第二方式是去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的检测方法，包括对被检体中GDF15前肽量进行测定。与去势抵抗性获得前的PCa相比，该方法是基于CRPC的血液等生物试样中特征性存在GDF15前肽的方法。利用该方法，如后述实施例所示，与测定现有已知的肿瘤标记物(PSA)、单独GDF15成熟体的情况下相比，能够以高灵敏度和特异性检测出去势抵抗性前列腺癌。

该方式中作为测定对象的GDF15前肽包含：由序列号2所示的GDF15氨基酸序列的从第30残基的亮氨酸至第194残基的精氨酸为止的氨基酸序列组成的完整的GDF15前肽(以下也记为“iGDPP”)和/或GDF15前肽片段，GDF15前肽片段中包含dNT57-GDPP、dNT73-GDPP、及其它肽片段。需要说明的是，完整的GDF15前肽是指尚未被降解的GDF15前肽。

本发明的检测方法中，对GDF15前肽量进行测定的方法没有特别限制。例如可以示例出：利用使用了识别GDF15前肽的抗体的抗原抗体反应的方法；利用质谱分析法的方法。

作为利用使用了识别GDF15前肽的抗体的抗原抗体反应的测定方法的具体例，可列举出以下方法。

(a)使用经标识的测定对象和识别测定对象的抗体，利用经标识的测定对象和被检体中包含的测定对象与前述抗体竞争性结合的竞争法。

(b)使被检体与固定有识别测定对象的抗体的芯片接触，对依赖于该抗体与测定对象结合的信号进行检测的表面等离子共振的方法。

(c)使用识别经荧光标识的测定对象的抗体，利用了通过该抗体与测定对象结合而使荧光偏光度上升的荧光偏光免疫测定法。

(d)使用表位不同的2种识别测定对象的抗体(其中一个是经标识的抗体)，形成该2种抗体与测定对象这3者的复合体的夹心法。

(e)作为前处理通过识别测定对象的抗体使被检体中的测定对象浓缩后，利用质谱分析装置等对该结合蛋白的多肽进行检测的方法。

(d)、(e)的方法简便且通用性高，但在处理多种被检体方面，(d)的方法由于有关试剂和装置的技术已充分确立技术，故而更优选。

作为识别GDF15前肽的抗体，识别GDF15前肽的N末端区域的、例如与序列号2的从第30残基的亮氨酸至第57残基的精氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体可以优选地用于测定iGDPP量。另外，GDF前肽的C末端区域识别的、例如与序列号2的第74残基的谷氨酸至第194残基的精氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体可以优选地用于测定iGDPP量和GDPP片段量的总量(总GDPP、以下也记为“tGDPP”)。

识别GDF15前肽的抗体可以通过将如下物质作为免疫原并对动物进行免疫而得到，所述物质是以GDF15前肽本身、由GDF15前肽的部分区域构成的寡肽、编码原GDF15蛋白质的完整区域或部分区域的多聚核苷酸等。

用于免疫的动物只要具有抗体产生能力就没有特别限定，可以是小鼠、大鼠、猴等通常用于免疫的哺乳动物，还可以使用鸡等鸟类。

需要说明的是，作为免疫原，使用GDF15前肽本身、或由GDF15前肽的部分区域构成的寡肽时，在制备前述蛋白质或前述寡肽的过程中其结构可能会发生变化。因此，得到的抗体有可能对于期望的抗原不具有高特异性、结合力，作为结果有无法准确地定量被检体中包含的GDF15前肽量的可能性。另一方面，使用包含编码原GDF15蛋白质的完整区域或部分区域的多聚核苷酸的表达载体作为免疫原时，在被免疫的动物体内不发生结构变化而导入的GDF15前肽蛋白质的完整区域或部分区域表达，因此可以得到对于被检体中的GDF15前肽具有高特异性和结合力(即高亲和性)的抗体，故而优选。

识别GDF15前肽的抗体可以是单克隆抗体，还可以是多克隆抗体，优选为单克隆抗体。

产生识别GDF15前肽抗体的杂交瘤细胞的建立从已确立技术的方法中适宜选择来进行即可。作为一个例子，有：从利用前述方法进行了免疫的动物中采集B细胞，使前述B细胞与骨髓瘤细胞电融合或在聚乙二醇的存在下融合，利用HAT培养基进行产生期望抗体的杂交瘤细胞的选择，利用极限稀释法对所选择的杂交瘤细胞进行单克隆，由此建立产生识别GDF15前肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

本发明的检测去势抵抗性前列腺癌的方法中使用的、识别GDF15前肽的抗体、例如识别GDF15前肽的单克隆抗体的选定基于与源自宿主表达体系的、糖基磷脂酰肌醇(GPI：glycosyl phosphatidyl inositol)锚固型GDF15前肽或分泌型GDF15前肽的亲和性进行即可。

需要说明的是，作为前述宿主没有特别限定，本领域技术人员从通常用于表达蛋白质的大肠菌、酵母等微生物细胞、昆虫细胞、动物细胞中适宜选择即可，但优选使用通过二硫化物键或糖链添加之类的翻译后修饰而能够表达具有与天然型的GDF15前肽结构近似的蛋白质的哺乳细胞作为宿主细胞。作为哺乳细胞的一个例子，可列举出一直以来使用的、从源自人胎儿肾脏的细胞(HEK)293T细胞株、猴肾脏细胞COS7株、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人分离得到的癌细胞等。

本发明的去势抵抗性前列腺癌检测方法中使用的抗体的纯化从已确立技术的方法中适宜选择来进行即可。作为一个例子，可以通过如下方式进行：对利用前述方法建立的产生抗体的杂交瘤细胞进行培养后，回收其培养上清液，根据需要通过硫酸铵沉淀进行抗体浓缩后，通过使用了固定化有蛋白A、蛋白G、或蛋白L等的载体的亲和色谱和/或离子交换色谱进行抗体的纯化。

需要说明的是，对于利用前述夹心法进行抗原抗体反应时使用的经标识的抗体，用过氧化酶、碱性磷酸酶等酶等对利用前述方法纯化的抗体进行标识即可，该标识也使用已充分确立技术的方法来进行即可。

以下对本发明的检测方法中的、利用质谱分析法对GDF15前肽和GDF15成熟体进行检测的方法进行具体地说明。

被检体为血液时，优选的是，作为前处理工序利用Agilent Human 14等去除血液中富含的白蛋白、免疫球蛋白、运铁蛋白等蛋白质后，利用离子交换、凝胶过滤或反相HPLC等进一步进行分级。

测定可以通过如下方式进行：串联质谱分析(MS/MS)、液相色谱-串联质谱分析(LC/MS/MS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间型质谱分析(matrix assisted laserdesorption ionizat-ion time-of-flight mass spectrometry、MALDI-TOF/MS)、表面增强激光解吸电离质谱分析(surface enhanced laser desorption ionization massspectrometry、SELDI-MS)等。

本发明的检测方法中，优选的是，通过测定而得到的GDF15前肽量超过由对照计算出的基准值(Cutoff值)时，判定为检测出去势抵抗性前列腺癌。

用于判定的GDF15前肽量可以是测定值或换算浓度值中的任一种。需要说明的是，换算浓度值是指基于以GDF15前肽作为标准试样制作的校正曲线并由测定值换算得到的值。标准试样的浓度确定是基于使用了质谱分析的标准肽的校正曲线并由测定值换算得到的值。

基准值(Cutoff值)可以适宜设定为如下值：分别测定去势抵抗性获得前的前列腺癌、其它泌尿器癌、前列腺肥大、或健康人等不是去势抵抗性前列腺癌的被检体、及去势抵抗性前列腺癌被检体，根据受试者工作特征曲线(ROC)解析适宜设定为显示出最适灵敏度和特异性的测定值。例如，具体而言，将血浆用作被检体时的GDF15前肽量的基准值(Cutoff值)可以设定为浓度1.337ng/mL。

<3>本发明的用于检测去势抵抗性前列腺癌的试剂

本发明的第三方式是包含识别GDF15前肽的抗体的、用于检测去势抵抗性前列腺癌的试剂。该方式还可以换言成：识别GDF15前肽的抗体或包含其的试剂在去势抵抗性前列腺癌的检测中的应用。

前述抗体通常是与序列号2所示的原GDF15的从第30残基的亮氨酸至第194残基的精氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体。

该方式中作为检测对象的GDF15前肽中包含完整的GDF15前肽和/或GDF15前肽片段，GDF15前肽片段中包含dNT57-GDPP、dNT73-GDPP、及其它肽片段。

将本发明的试剂用于前述夹心法时，作为前述抗体需要包含表位不同的2种抗体。

本发明的检测试剂还可以进一步含有：包含识别前列腺癌的肿瘤标记物的抗体的、前列腺癌的肿瘤标记物的检测试剂。作为前列腺癌的肿瘤标记物，例如可列举出PSA等。

本发明的试剂中包含的抗体可以是抗体本身，还可以经标识，还可以被固定化在固相中。

以下对本发明的试剂中用于作为前述夹心法的一个方式的2步夹心法的情况进行具体地说明。但本发明不限定于这些。

首先，本发明的试剂可以利用以下(I)至(III)所示的方法来制作。

(I)首先，使夹心法中使用的、识别GDF15前肽的、表位不同的2种抗体(以下为“抗体1”和“抗体2”)中的抗体1与如免疫板、磁性颗粒等能进行B/F(结合/游离)分离的载体结合。结合方法可以是利用了疏水键的物理结合，还可以是使用了能使2种物质之间产生交联的连接试剂等的化学结合。

(II)使前述抗体1结合于载体后，为了避免非特异性结合，利用牛血清白蛋白、脱脂乳、市售的免疫分析用封闭剂等对载体表面进行封闭处理来制成第一试剂。

(III)标识其它抗体2，准备包含得到的标识抗体的溶液作为第二试剂。作为对抗体2进行标识的物质，优选：如过氧化酶、碱性磷酸酶之类的酶、荧光物质、化学发光物质、放射性同位素等能利用检测装置检测出的物质、或存在有如抗生物素等对生物素特异性结合的对象的物质等。另外，作为第二试剂的溶液，优选：可良好地进行抗原抗体反应的缓冲液、例如磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。

由此制作的本发明的试剂根据需要还可以进行冷冻干燥。

需要说明的是，1步夹心法的情况，与前述(I)～(II)同样地使抗体1与载体结合来制作进行了封闭处理的物质，对前述抗体固定化载体进一步添加包含经标识的抗体2的缓冲液来制作试剂即可。

接着，使用利用前述方法得到的试剂，为了利用2步夹心法对GDF15前肽进行检测、测定，利用以下(IV)至(VI)所示的方法进行即可。

(IV)使(II)中制作的第一试剂与被检体在一定温度下接触一定时间。反应条件在温度4℃至40℃的范围内、反应5分钟至180分钟即可。

(V)通过B/F分离去除未反应物质，接着与(III)中制作的第二试剂在一定温度下接触一定时间，形成夹心复合物。反应条件在温度4℃至40℃的范围内、反应5分钟至180分钟即可。

(VI)通过B/F分离去除未反应物质，对标识抗体的标识物质进行定量，通过以已知浓度的GDF15前肽溶液作为标准而制作的校正曲线，对被检体中的人GDF15前肽浓度进行定量。

需要说明的是，对于GDF15成熟体还可以利用上述方法制作检测试剂。关于GDF15成熟体的检测试剂，还可以用作前列腺癌的肿瘤标记物的检测试剂。前列腺癌的肿瘤标记物的检测试剂可以是与上述本发明的试剂同样地制作而成的物质，还可以是现有市售的物质。

检测试剂中包含的抗体等的试剂成分的量根据被检体量、被检体的种类、试剂的种类、检测的方法等各种条件来进行适宜设定即可。具体而言，例如，如后所述使用2.5倍稀释后的血清、血浆50μL作为被检体，利用夹心法进行GDF15前肽量的测定时，对于使该被检体50μL与抗体反应的反应体系，与载体结合的抗体量可以是100ng至1000μg，标识抗体量可以是2ng至20μg。

本发明的去势抵抗性前列腺癌检测试剂还可以用于利用人工方法的检测，还可以用于使用了自动免疫诊断装置的检测。特别是使用了自动免疫诊断装置的检测能够在不受被检体中包含的内源性测定干扰因素、竞争酶的影响的前提下进行检测，且能够在短时间内对被检体中的GDF15前肽以及去势抵抗性前列腺癌的肿瘤标记物的浓度进行定量，故而优选。

本发明的去势抵抗性前列腺癌的检测方法和成为本发明的检测试剂的对象的被检体(被检试样)可列举出：全血、血细胞、血清、血浆等血液成分、细胞或组织的提取液、尿、脑脊液等。将血液成分、尿等体液用作被检体时，能够简便且非侵入式地检测去势抵抗性前列腺癌，故而优选，考虑到采集被检体的容易性、与其它检查项目的通用性，特别优选将血液成分用作被检体。被检体的稀释倍率根据所使用的被检体的种类、状态从无稀释至100倍稀释中进行适宜选择即可，例如血清、血浆的情况，使用稀释了2.5倍的被检体50μL即可。

需要说明的是，利用测定GDPP量的方法对去势抵抗性前列腺癌进行临床评价时，如后述实施例所示，更优选测定血浆中的iGDPP的方法。

另外本发明的检测去势抵抗性前列腺癌的方法和本发明的检测试剂对于去势抵抗性获得后的CRPC患者的医学随访也是有用的。特别是与作为现有的前列腺癌标记物的PSA相比假阳性少等，可期待准确地反映病情。

实施例

以下为了具体地说明本发明而示出实施例，但这些实施例是示出本发明的一个例子，本发明不限定于实施例。

<实施例1>泌尿器癌细胞株的分泌蛋白质的蛋白初解物解析

为了研发去势抵抗性前列腺癌特征性产生的蛋白质，首先对培养泌尿器癌细胞株的分泌蛋白质进行了综合的解析。在φ150mm培养皿中、以包含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中分别培养CRPC细胞株22Rv、PC3和LnCap-AI、作为比较对照的前列腺癌细胞株LnCap、VCap和DU145、膀胱癌细胞株5637、T24、TCC和UMUC3、肾癌细胞株CAKI、ACHN、786-O和U3，24小时后将培养基更换成包含4.0nM的表皮生长因子(Sigma公司制)的RPMI1640培养基(无血清培养基)20mL。进而培养2天后，通过0.22μm过滤器对培养基进行过滤并进行冷冻干燥。用包含7M尿素、2M硫脲、4％CHAPS的30mM TRIS盐酸缓冲液(pH8.5)溶解得到的培养上清液的粉末，通过丙酮沉淀将培养上清液脱盐浓缩，通过包含表面活性剂RapiGest1％的10mM碳酸氢铵溶液进行再次溶解。对于得到的蛋白质试样依据常规方法进行了还原烷基化、胰岛素消化。利用纳米LC-LTQ轨道阱型质谱分析装置(Thermo Fisher Scientific公司制)来测定得到的肽片段。使用Protein Discoverer 1.3软件(Thermo Fisher Scientific公司制)对得到的数据进行解析，通过在Swiss-Prot数据库上检索氨基酸序列来鉴定蛋白质。

在由源自前列腺癌的细胞株鉴定的蛋白质中包含作为现有的前列腺肿瘤标记物的PSA、PAP，关于GDF15，在DU145除外的任意的前列腺癌细胞株中，均可在培养上清液中特征性地检测出前肽部(图1)。

<实施例2>单克隆抗体制作

利用已知的方法(DNA免疫：日本特开2013-061321号公报)，分别制作了识别GDF15前肽的单克隆抗体和识别GDF15成熟体的单克隆抗体各10种。

<实施例3>各种单克隆抗体的表位解析

通过完整的GDF15前肽(iGDPP)和N末端缺失型GDF15前肽片段(dNT-GDPP)的变体表达细胞培养上清液来鉴定实施例2中制作的各抗体的抗原识别位点。

为了进行各种重组GDPP的表达评价和纯化工序，制备了在5’末端进一步插入了FLAG标签和StrepII-tag且在3’末端进一步插入了编码由BNP(脑利钠肽)的C末端侧7个氨基酸组成的BNC肽(日本特开2009-240300号公报)的寡核苷酸的、能表达分泌型iGDPP和4种dNT-GDPP的质粒。图2-1示出制作的各种重组GDPP的结构。以下示出具体的制备方法。

(1)按表1所示的组合使用基于人GDF15的cDNA(GenBank Accessesion No.：NM_004864)设计的引物，依据常规方法并利用RT-PCR法对相当于iGDPP、dNT37-GDPP、dNT59-GDPP、dNT-77GDPP和dNT94-GDPP的各多聚核苷酸进行了扩增。

[表1]

(2)胎盘碱性磷酸酶(Placental Alkaline phosphatase)在包含GPI锚固区的质粒pFLAG1(SIGMA公司制)的HindIII-EcoRI位点，使用In-fusion(Clonetech公司制)，按照规程(protocol)插入(1)的RT-PCR扩增产物，构建了各种分泌型GDPP表达质粒。

(3)在由插入至质粒pFLAG1中的多聚核苷酸表达的各种分泌型GDPP中，为了确认在N末端侧添加有FLAG标签、在C末端侧添加有BNC标签，而使用作为瞬时表达(transientexpression)细胞的293T细胞株，利用下述方法进行了验证。

(3-1)依据常规方法，将(2)中构建的各种分泌型GDPP表达质粒导入293T细胞株中并暂时地表达各种分泌型GDPP，将培养72小时后的培养液离心分离，回收上清液作为各种分泌型GDPP溶液。

(3-2)使用各种分泌型GDPP溶液作为试样，进行了(A)酶免疫测定法(ELISA法)和(B)免疫印迹(WB)法。

(A)ELISA法

(A-1)以100ng/孔的方式用碳酸盐缓冲液(pH9.8)稀释猴抗FLAG多克隆抗体(ROCKLAND公司制)，在MaxiSorp96孔板(NUNC公司制)中进行了固相化。

(A-2)在4℃下反应一夜后，用TBS(Tris-Buffered Saline)清洗3次，以250μL/孔的方式在各孔中添加包含3％牛血清白蛋白(BSA；Bovine Serum Albumin)的TBS溶液，在室温下放置2小时。

(A-3)用TBS进行3次清洗，以50μL/孔的方式添加各种分泌型GDPP溶液和作为阴性对照未导入表达质粒的293T细胞株的培养上清液，在室温下放置1小时。

(A-4)利用包含0.5％Tween 20的TBS(TBS-T)进行3次清洗后，以50μL/孔的方式添加用包含1％BSA的TBS-T(1％BSA/TBS-T)稀释至1μg/mL的小鼠抗BNC单克隆抗体溶液，在室温下放置1小时。

(A-5)用TBS-T进行3次清洗后，以50μL/孔的方式添加用1％BSA/TBS-T稀释10000倍后的辣根过氧化物酶(HRP)标识抗小鼠免疫球蛋白G-Fc抗体(SIGMA公司制)溶液，在室温下放置1小时。

(A-6)用TBS-T进行4次清洗，添加TMB Microwell Peroxidase Substrate(KPL公司制)后，用1mol/L磷酸溶液使反应停止，通过吸光测定酶标仪测定了450nm的吸光值。

(B)免疫印迹法

(B-1)依据常规方法用SDS-PAGE展开(3-1)中得到的各种分泌型GDPP溶液和作为阴性对照的未导入表达质粒的293T细胞株的培养上清液，转移至PVDF膜(Bio-RadLaboratories,Inc.制)上。

(B-2)通过封闭溶液(Blocking One)(Nacalai Tesque,Inc.制)进行封闭后，在该封闭溶液中以1μg/片的方式添加碱性磷酸酶标识抗BNC抗体，在4℃下反应一夜。

(B-3)用TBS-T清洗后，使用ECL Select试剂(GE HEALTHCARE公司制)，利用LAS4000图像解析装置(GE HEALTHCARE公司制)来检测得到的化学发光。

各种分泌型GDPP溶液(分泌型GDPP培养上清液)中，与阴性对照(293T培养上清液)相比，可观察到明显的依赖于添加量的信号，并确认了在培养上清液中产生了各种分泌型GDPP。

各种分泌型GDPP溶液(分泌型GDPP培养上清液)中，在分子量约27000附近、约20000附近和约18000附近检测到明显的条带，确认在培养上清液中产生了在N末端具有FLAG标签且在C末端具有BNC标签的分泌型GDPP。

利用上述ELISA法，评价了上述5种重组GDPP培养上清液与各单克隆抗体的反应。表2中示出基于图2-2所示的ELISA解析的结果判定的各抗体的抗原识别位点。

[表2]

<实施例4>基于各种单克隆抗体固定化磁珠进行的免疫沉淀性能评价

制备实施例2中制作的10种GDF15前肽单克隆抗体和猴抗FLAG多克隆抗体(ROCKLAND公司制)的抗体固定化磁性微粒，利用以下方法鉴定了与各抗体特异性结合的分泌型GDF15前肽的培养上清液和前列腺癌细胞培养上清液中的蛋白质。需要说明的是，作为前列腺癌细胞，使用了LnCap、PC3和DU145这3种。

(1)依据常规方法将实施例2中制作的纯化单克隆抗体的一部分固定化在Dynabeads M-280 Tosylactivated磁性微粒(Invitrogen公司制)后，用包含0.5％BSA的PBS进行封闭，制备了抗体固定化磁性微粒。

(2)免疫沉淀-免疫印迹法(IP-WB法)

(2-1)用包含10％胎牛血清的RPMI1640培养基(和光纯药公司制)将前述3种癌细胞在100％汇合状态下培养3天。

(2-2)将培养上清液离心分离后，对于上清液0.1mL，分别添加制备的10种抗体固定化磁性微粒，在室温下搅拌1小时进行反应。

(2-3)用PBST-NP40(0.1％Tween 20、1％NP40)清洗2次后，用不包含表面活性剂的PBS清洗3次。

(2-4)利用实施例3(B)中记载的免疫印迹法对结合在各抗体固定化磁性微粒上的蛋白质进行解析。需要说明的是，分子量标记物使用Full-Range Rainbow MolecularWeight Markers(GE公司制)，SDS-PAGE用凝胶使用10～20％梯度凝胶(Marisol,Inc.制)。免疫印迹的检测用抗体使用通过碱性磷酸酶标识试剂盒(同仁化学公司制)标识了抗BNC抗体的物质。

<实施例5>基于质谱分析法进行的单克隆抗体结合蛋白质的鉴定

使用如下3种抗体固定化磁性微粒进行了IP的再验证，所述抗体是：实施例4中确认了与GDF15前肽亲和性高的TS-GDPP02抗体、TS-GDPP04抗体和TS-GDPP08抗体。另外，利用质谱分析法对与TS-GDPP02抗体和TS-GDPP04抗体结合的GDF15前肽的多肽进行了解析。作为前列腺癌培养上清液，使用实施例1中使用的LnCap，按以下方式制备了用于质谱分析的样品。

(1)利用实施例4中记载的方法，用上述3种抗体固定化磁性微粒对LnCap样品溶液进行IP后，依据常规方法用SDS Loading Buffer洗脱。用SDS-PAGE对IP前的LnCap上清液、IP后的LnCap上清液和IP产物进行展开，利用SYPRO-Ruby染色(Invitrogen公司制)对分离的蛋白质进行染色。

(2)切出观察到染色的分子量约20000附近、约17000附近和约15000附近的条带(属于图3-1中记载的SYPRO-Ruby染色图像中的1、2和3的位置)共计3种片段，使用二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行还原烷基化后，利用胰岛素实施了凝胶内消化。

(3)对于通过胰岛素消化而生成的肽片段，利用使用了C18反相柱的纳米LC-LTQ轨道阱型质谱分析装置(Thermo Fisher Scientific公司制)进行了MS/MS测定。使用ProteinDiscoverer 1.3软件(Thermo Fisher Scientific公司制)对得到的数据进行解析，通过在Swiss-Prot数据库上检索氨基酸序列来鉴定蛋白质。

图3-1中示出Ruby染色图像，图3-2中示出由LnCap的分子量约20000附近、约17000附近和约15000附近的IP产物鉴定的肽(颜色深的部分表示通过质谱分析检测到的区域)。Ruby染色图像中，通过TS-GDPP04抗体和TS-GDPP08抗体这2种在分子量约20000附近、约17000附近和约15000附近观察到推测为GDF15前肽的信号。另一方面，识别N末端区域的TS-GDPP02抗体仅在分子量约20000附近观察到信号。

根据LnCap IP产物的质谱分析数据，Ruby染色图像中位于1、2和3的分子量约20000附近、约17000附近和约15000附近的蛋白质被证实为GDF15前肽。另外，Ruby染色图像中位于2和3的GDF15前肽被证实为分别从N末端至序列号2的第57位的精氨酸为止以及至第73位的亮氨酸为止缺失而片段化的N末端缺失型GDF15前肽片段(dNT57-GDPP和dNT73-GDPP)。关于C末端，在任意的GDPP中均以高灵敏度检测出至序列号2的第167残基的天冬氨酸为止。dNT57-GDPP检测出第170残基的亮氨酸，但测定过程中还有受偏差影响的可能性，可推测出特别是GDPP的C末端区域由于富含精氨酸而难以实现通过质谱分析进行的准确的末端鉴定。由该结果可以认为，在GDPP和dNT-GDPP的C末端序列中包含至少序列号2的第167残基的天冬氨酸为止的序列。

<实施例6>GDF15前肽测定试剂的制备

使用实施例2中制作的抗GDPP单克隆抗体，改变抗体的组合来制作2种GDPP测定试剂。1种是通过识别GDPP的N末端区域的抗体(TS-GDPP02)与识别C末端区域的抗体(TS-GDPP04)的组合，检测出完整的GDPP(iGDPP)。另一种是，通过识别C末端区域的抗体彼此的组合(TS-GDPP04和TS-GDPP08)检测出iGDPP和dNT-GDPP这两者。将通过后者检测出的值称为总GDPP(tGDPP)。以下记载具体的制备方法。

(1)将抗GDF15前肽单克隆抗体(TS-GDPP02和08)以成为100ng/载体的方式在室温下进行一昼夜物理性吸附至水不溶性铁氧体载体，然后用包含1％BSA的100mMTris缓冲液(pH8.0)进行40℃·4小时封闭，由此制备了抗GDF15前肽抗体固定化载体。

(2)对于抗GDF15前肽单克隆抗体(TS-GDPP04)，用碱性磷酸酶标识试剂盒(同仁化学公司制)制备了抗GDF15前肽标识抗体。

(3)在透磁性的容器(容量1.2mL)中加入(1)中制备的12个抗体固定化载体后，添加包含(2)中制备的标识抗体0.5μg/mL的缓冲液(包含3％BSA的Tris缓冲液、pH8.0)50μL，实施冷冻干燥，由此制作了GDF15前肽测定试剂。需要说明的是，制作的GDF15前肽测定试剂在氮气填充下实施密闭密封，直至测定在4℃下保管。

另外，对于GDF15成熟体(mGDF15)也同样地使用实施例2中制备的抗mGDF15单克隆抗体(TS-mGD18抗体和TS-mGD20抗体)制作了测定试剂。

<实施例7>GDF15前肽标准品的制备

GDF15前肽没有市售品，因此使用实施例3中制备的分泌型iGDPP作为标准品。对于GDF15成熟体，使用市售的重组蛋白质(R&D system公司制)。

然而，重组iGDPP中还混有降解物，因此若直接使用则无法进行准确的定量。因此，利用位于重组iGDPP的N末端侧的Strep-II标签(IBA公司制)，用市售的纯化试剂盒(IBA公司制)仅对全长GDF15前肽进行了纯化。利用实施例3中记载的蛋白质印迹法对纯化后的分泌型iGDPP进行了评价。将GDPP纯化品的蛋白质印迹结果示于图4。由于是标签肽而使分子量增大，但即使使用N末端和C末端中任意者的标签抗体，也仅可检测出1条全长GDF15前肽的条带。

<实施例8>GDF15前肽标准品的评价

对于实施例7中制备的全长GDF15前肽，按以下步骤通过质谱分析实施了定量。

使用稳定同位素标识的合成肽(Heavy肽、Sigma-Aldrich公司制)和未标识的合成肽(Light肽、Sigma-Aldrich公司制)，制作了基于浓度和L/H信号比的校正曲线(图5)。

对于实施例7中制备的纯化GDF15前肽标准品，使用实施例4中制备的猴抗FLAG多克隆抗体(ROCKLAND公司制)的磁性微粒，利用实施例4所示的方法实施了免疫沉淀。依据常规方法用甘氨酸-HCl(pH2.5)从抗体磁性微粒中洗脱GDF15前肽。进而，利用实施例5所示的方法对该洗脱样品实施了质谱分析测定前处理。

在前处理后的样品中添加Heavy肽，利用QTRAP5500(AB SCIEX公司制)质谱分析装置实施了LC-MRM(Multiple Reactive Monitoring)测定。使用Skyline Software对得到的数据进行解析。对与Heavy肽的信号比和图5所示的校正曲线进行比较，确定了重组iGDPP的浓度。

<实施例9>GDF15前肽测定试剂的性能评价

分别制备了共计3种拟被检体样品：作为包含GDF15前肽的样品分别将实施例3中制作的重组GDPP上清液和实施例5中制备的LnCap用FBS稀释10倍；作为不包含GDF15前肽的样品仅有FBS，使用实施例6中制作的2种GDF15前肽测定试剂测定5点，由此评价了前述试剂。

评价用装置使用全自动辅酶免疫分析装置AIA-1800(东曹公司制：制造贩卖申报型号13B3X90002000002)。通过全自动辅酶免疫分析装置AIA-1800如下进行测定：

(1)将稀释样品20μL和包含表面活性剂的稀释液80μL自动分注在收容有实施例6中制作的GDF15前肽测定试剂的容器中，

(2)在37℃恒温下进行10分钟抗原抗体反应，

(3)用包含表面活性剂的缓冲液进行8次清洗，

(4)添加4-甲基伞形酮磷酸盐，

由此得到基于将每单位时间的由碱性磷酸酶对4-甲基伞形酮的生成浓度，将其作为测定值(nmol/(L·s))。

AIA测定的结果是，FBS除外的任意拟被检体样品也显示出5点测定的变异系数为3％以下，证实了用实施例6中制作的GDF15前肽测定试剂得到的结果是值得信赖的结果。

另外，用FBS分别稀释实施例8中被确定浓度的纯化iGDPP和市售的mGDF15，将用于AIA测定而制作的校正曲线示于图6。以下基于该校正曲线计算出临床评价等GDPP定量值。

<实施例10>前列腺癌被检体的GDF15前肽和GDF15成熟体的测定

将本实施例中使用的被检体组(血清56例、血浆85例)示于表3。该被检体是横浜市立大泌尿器科根据同一规程收集的血清和血浆被检体，获得了知情同意的许可和横浜市立大学伦理委员会的许可。

[表3]

将全自动辅酶免疫分析装置AIA-1800(东曹公司制)作为评价用装置，使用实施例6中制作的iGDPP、tGDPP和mGDF15测定试剂进行了测定。作为比较数据，从横浜市立大学泌尿器科的病历中摘录了各被检体的PSA测定值(接近采血液日的值)。

表4-1和表4-2中示出有关血清和血浆齐备的被检体的、iGDPP和tGDPP测定结果。如图7-1和图7-2的相关图所示，与血浆相比，iGDPP在血清中减少，tGDPP几乎未发生变化。将PCa和CRPC组中的iGDPP和tGDPP的血清血浆之差示于图7-3。PCa组中，iGDPP和tGDPP两者的血清血浆之间几乎没有差异，相反CRPC组中，tGDPP没有发生变化，但与血浆中相比血清中的iGDPP有减少的倾向。由该结果可推测出，血清中发生了iGDPP的降解，以高浓度存在的CRPC组中该影响较大。血浆中的iGDPP与tGDPP的定量值几乎一致，由此显示出血浆中几乎未发生降解。需要说明的是，这次使用的血浆被检体是EDTA血浆，因此可推测出参与GDPP降解的蛋白酶因螯合剂的作用而失活。

[表4-1]

[表4-2]

需要说明的是，如表5和图7-4所示，对于mGDF15，得到了血清和血浆几乎不发生变化的结果。

[表5]

接着，血清和血浆的情况，对iGDPP和tGDPP的诊断性能进行了比较。如表6-1、表6-2和图8-1所示，iGDPP和tGDPP两者均是在血浆中测定时显示出高的去势抵抗性前列腺癌检测能力。由于血浆中几乎不存在dNT-GDPP，因此两者的诊断性能几乎一致。然而，在高表达的被检体中可观察到一部分降解，即使在血浆中检测出iGDPP者也显示出高的诊断性能力。

关于mGDF15，如图8-2所示，确认了在血清和血浆中几乎不发生变化的诊断性能。由这些结果可预料到对于基于GDPP的CRPC的临床评价而言，测定血浆中的iGDPP的方法更为适宜。

[表6-1]

	iGDPP在血浆中	tGDPP在血浆中	mGDF15在血浆中
				曲线下面积	0.8803	0.8605	0.7974
标准误差	0.0569	0.0598	0.07044
				95％置信区间	0.7687至0.9918	0.7434至0.9777	0.6593至0.9355
P值	<0.0001	0.0001	0.0015

[表6-2]

	iGDPP在血清中	tGDPP在血清中	mGDF15在血清中
				曲线下面积	0.7000	0.6288	0.7579
标准误差	0.0851	0.0931	0.07709
				95％置信区间	0.5332至0.8668	0.4463至0.8112	0.6068至0.9090
P值	0.0305	0.1636	0.0059

以下，对于临床被检体的AIA测定结果仅记载血浆的结果，GDF15前肽仅示出iGDPP的结果。

将iGDPP、mGDF15的测定值和PSA测定值示于图9。mGDF15和PSA在前列腺癌中通常显示出高值倾向，但GDPP在去势抵抗性前列腺癌中特征性地显示出高值。

将该组分为前列腺肥大、去势抵抗性获得前的前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌这3组进行解析的结果示于图9，将GDF15前肽和GDF15成熟体测定值和PSA测定值在各组中的最小值、25百分比、中央值、75百分比、最大值、95％置信区间中的浓度范围示于表7。与前列腺肥大相比mGDF15和PSA在去势抵抗性获得前的前列腺癌中显示出稍高值倾向，在去势抵抗性前列腺癌中显示出显著的高值。然而在去势抵抗性获得前后重叠的浓度范围较广，不能说诊断性能高。另一方面，GDPP在前列腺肥大和去势抵抗性获得前的前列腺癌中几乎没有差异，仅在去势抵抗性前列腺癌中显示出显著的高值。

可认为mGDF15与GDPP之差是由分泌机构不同而引起的。去势抵抗性获得前的前列腺癌中，通过Furin样蛋白酶的作用而仅使mGDF15从储存在细胞外基质中的原GDF15中释放出，相对于此去势抵抗性前列腺癌中表达量增加，可推测出除了mGDF15之外无法储存在细胞外基质中的GDPP也会释放至血液中。

[表7]

将去势抵抗性获得前和获得后的前列腺癌组之间的iGDPP测定体系、mGDF15测定体系和PSA测定数据的受试者工作特征曲线(ROC)解析的结果示于图10，将AUC(Area Underthe Curve、ROC曲线下面积)和显著差异检验中的P值示于表8。去势抵抗性获得前和获得后的前列腺癌组之间的iGDPP测定值的显著差异为p<0.0001，可观察到统计学的显著差异，显示出iGDPP测定试剂对于检测去势抵抗性前列腺癌是有用的。另外，与PSA测定值相比，mGDF15测定体系的P值以及AUC均显示出上升。

[表8]

	PSA	mGDF15	iGDPP
				曲线下面积	0.7732	0.8011	0.8790
标准误差	0.06498	0.05807	0.04877
				95％置信区间	0.6458至0.9006	0.6872至0.9149	0.7834至0.9746
P值	0.0005	<0.0001	<0.0001

接着，表9中示出将iGDPP和mGDF15的各基准值(Cutoff值)作为由上述ROC解析得到的值、以及PSA的基准值作为通常的基准值附近的20ng/mL时的、去势抵抗性获得前和获得后的前列腺癌组之间的灵敏度和特异性。虽然对于PSA而言是不利的条件，但至少在对去势抵抗性前列腺癌进行特异性诊断的目的方面明确了iGDPP的有用性。

[表9]

	PSA	mGDF15	iGDPP
				基准值	20	1861	1337
灵敏度(％)	73.1	74.1	74.1
				特异性(％)	69.0	74.2	93.3

表10中示出将iGDPP和mGDF15作为上述基准值、将PSA设为通常的基准值的20ng/mL时的实施例10中记载的全部临床被检体的阳性率。iGDPP测定试剂在该组中假阳性率低且能以高概率判别去势抵抗性前列腺癌为阳性，显示出具有作为去势抵抗性前列腺癌诊断标记物的性能。

[表10]

通过iGDPP、mGDF15、PSA和iGDPP与PSA的组合对去势抵抗性获得的判别能力进行了比较。如表11所示，单独项目中iGDPP的假阳性率/假阴性率均最低，具有最高的正确诊断率。

另外，通过组合iGDPP和PSA而能够降低假阴性率。通过之后的研究，在iGDPP高值的情况及PSA高值的情况下能够进一步表征为CRPC。

[表11]

	PSA	mGDF15	iGDPP	PSA+iGDPP
					灵敏度(％)	70.4	74.1	74.1	88.9
特异性(％)	84.5	79.3	89.7	79.3
					假阳性率(％)	15.5	20.7	10.3	20.7
假阴性率(％)	29.6	25.9	25.9	11.1
					正确诊断率(％)	67.9	62.5	76.9	66.7

将每疾病组的iGDPP和各种参数的相关系数示于表12。

可启示出：年龄、PSA与iGDPP之间几乎没有相关性，反映出完全不同的现象。另一方面，mGDF15与iGDPP虽然在CRPC上存在相关性，但由于去势抵抗性获得前的PCa而使相关性特征性地降低。可推测出其原因在于，由于分泌机构不同而使CRPC特征性地分泌GDPP。

作为骨转移指标的病变范围(EOD：Extent of Disease)、骨扫描指数(BSI：BoneScan Index)也未观察到高的相关性。虽然有mGDF15作为骨转移的标记物的报道，但未出现骨转移的PCa中也处于高值的倾向，因此得到了未必能说反映了骨转移有无的结果。

[表12]

<实施例11>去势抵抗性获得后的医学随访期间的CRPC患者血浆被检体的评价

表13中示出获得去势抵抗性，将医学随访时的CRPC患者血浆被检体10例的iGDPP的测定结果及PSA值、非甾体类抗炎药(NSAIDS)的给药状況和病情。

CRPC-01和CRPC-05除外的8例显示出PSA和iGDPP中任意者均为低值，未发现癌的进展，诊断为处于良好的管理下。然而，PSA均为高值的CRPC-05(PSA高值/iGDPP高值)与CRPC-01(PSA高值/iGDPP低值)这2例相比，前者可观察到骨转移等的恶性进展，相反后者虽然PSA为高值，但未观察到恶性进展，诊断为处于良好的管理下。由该结果启示出：iGDPP与PSA相比，可成为准确反映CRPC的恶性进展的标记物。

使用观察到恶性进展的CRPC-05除外的9例，将NSAIDS给药组和非给药组中的iGDPP的测定结果示于图11。该研究中，基于通过Mann-Whitney检验组之间未观察到显著差异(p＝0.9643)，启示出NSAIDS给药可能与血液中iGDPP量不相关。

[表13]

产业上的可利用性

根据本发明，可提供作为去势抵抗性前列腺癌的新型的检测标记物的GDF15前肽检测的方法和试剂。由此，能够简便且精度高地检测在仅通过血液诊断等来测定作为现有检测标记物的PSA的情况下难以判别的去势抵抗性的获得。本发明使去势抵抗性前列腺癌的诊断变得简便，能够在早期进行治疗法的研究，因此在产业上是非常有用的。

根据癌症的发展而需要更换治疗药的前列腺癌的情况，若能通过血液检查等简便的手段来鉴定去势抵抗性的获得，则可期待有助于去势抵抗性前列腺癌筛选和对最能期待治疗效果的治疗药更换时期的确定。进而，未来可期待有助于包含新型治疗药的前列腺癌化学疗法的伴随诊断。

序列表

<110> 公立大学法人横滨市立大学（Yokohama City University）

东曹株式会社（TOSOH Corporation）

<120> 检测去势抵抗性前立腺癌的方法和检测试剂

<130> 17075

<150> JP2016-037135

<151> 2016-02-29

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1220

<212> DNA

<213> 智人(Homo Sapiens)

<220>

<221> CDS

<222> (33)..(956)

<400> 1

agtcccagct cagagccgca acctgcacag cc atg ccc ggg caa gaa ctc agg 53

Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg

1 5

acg gtg aat ggc tct cag atg ctc ctg gtg ttg ctg gtg ctc tcg tgg 101

Thr Val Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu Val Leu Leu Val Leu Ser Trp

10 15 20

ctg ccg cat ggg ggc gcc ctg tct ctg gcc gag gcg agc cgc gca agt 149

Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser

25 30 35

ttc ccg gga ccc tca gag ttg cac tcc gaa gac tcc aga ttc cga gag 197

Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu

40 45 50 55

ttg cgg aaa cgc tac gag gac ctg cta acc agg ctg cgg gcc aac cag 245

Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln

60 65 70

agc tgg gaa gat tcg aac acc gac ctc gtc ccg gcc cct gca gtc cgg 293

Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu Val Pro Ala Pro Ala Val Arg

75 80 85

ata ctc acg cca gaa gtg cgg ctg gga tcc ggc ggc cac ctg cac ctg 341

Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly Ser Gly Gly His Leu His Leu

90 95 100

cgt atc tct cgg gcc gcc ctt ccc gag ggg ctc ccc gag gcc tcc cgc 389

Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg

105 110 115

ctt cac cgg gct ctg ttc cgg ctg tcc ccg acg gcg tca agg tcg tgg 437

Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp

120 125 130 135

gac gtg aca cga ccg ctg cgg cgt cag ctc agc ctt gca aga ccc cag 485

Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln

140 145 150

gcg ccc gcg ctg cac ctg cga ctg tcg ccg ccg ccg tcg cag tcg gac 533

Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp

155 160 165

caa ctg ctg gca gaa tct tcg tcc gca cgg ccc cag ctg gag ttg cac 581

Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala Arg Pro Gln Leu Glu Leu His

170 175 180

ttg cgg ccg caa gcc gcc agg ggg cgc cgc aga gcg cgt gcg cgc aac 629

Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn

185 190 195

ggg gac cac tgt ccg ctc ggg ccc ggg cgt tgc tgc cgt ctg cac acg 677

Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr

200 205 210 215

gtc cgc gcg tcg ctg gaa gac ctg ggc tgg gcc gat tgg gtg ctg tcg 725

Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser

220 225 230

cca cgg gag gtg caa gtg acc atg tgc atc ggc gcg tgc ccg agc cag 773

Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln

235 240 245

ttc cgg gcg gca aac atg cac gcg cag atc aag acg agc ctg cac cgc 821

Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg

250 255 260

ctg aag ccc gac acg gtg cca gcg ccc tgc tgc gtg ccc gcc agc tac 869

Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr

265 270 275

aat ccc atg gtg ctc att caa aag acc gac acc ggg gtg tcg ctc cag 917

Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln

280 285 290 295

acc tat gat gac ttg tta gcc aaa gac tgc cac tgc ata tgagcagtcc 966

Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

300 305

tggtccttcc actgtgcacc tgcgcggagg acgcgacctc agttgtcctg ccctgtggaa 1026

tgggctcaag gttcctgaga cacccgattc ctgcccaaac agctgtattt atataagtct 1086

gttatttatt attaatttat tggggtgacc ttcttgggga ctcgggggct ggtctgatgg 1146

aactgtgtat ttatttaaaa ctctggtgat aaaaataaag ctgtctgaac tgttaaaaaa 1206

aaaaaaaaaa aaaa 1220

<210> 2

<211> 308

<212> PRT

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 2

Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Val Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu

1 5 10 15

Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu

20 25 30

Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser

35 40 45

Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu

50 55 60

Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu

65 70 75 80

Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly

85 90 95

Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu

100 105 110

Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser

115 120 125

Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln

130 135 140

Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser

145 150 155 160

Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala

165 170 175

Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg

180 185 190

Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly

195 200 205

Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly

210 215 220

Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys

225 230 235 240

Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln

245 250 255

Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro

260 265 270

Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr

275 280 285

Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp

290 295 300

Cys His Cys Ile

305

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 分泌的iGDPP正向引物

<400> 3

cgatgacgac aagcttctgt ctctggccga g 31

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 分泌的iGDPP反向引物

<400> 4

cagaactttg cagatatcgg cggcttgcgg ccg 33

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 分泌的dNT37-GDPP正向引物

<400> 5

cgatgacgac aagcttgcaa gtttcccggg acc 33

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 分泌的dNT59-GDPP正向引物

<400> 6

cgatgacgac aagcttcgct acgaggacct g 31

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 分泌的dNT77-GDPP正向引物

<400> 7

cgatgacgac aagcttaaca ccgacctcgt cc 32

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 分泌的dNT94-GDPP正向引物

<400> 8

cgatgacgac aagcttctgg gatccggcgg c 31

Claims

1.一种检测去势抵抗性前列腺癌的方法，其包括：对被检体中完整的生长分化因子15(GDF15)前肽量进行测定。

2.一种检测去势抵抗性前列腺癌的方法，其包括：对被检体中GDF15前肽片段量进行测定。

3.一种检测去势抵抗性前列腺癌的方法，其包括：对被检体中完整的GDF15前肽量和GDF15前肽片段量的总量进行测定。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述GDF15前肽片段包含以下(A)和/或(B)所述的GDF15前肽片段，

(A)GDF15前肽片段，其具有以下(a)和(b)的特征，

(a)包含序列号2所示的GDF15氨基酸序列的从第58残基的赖氨酸至至少第167残基的天冬氨酸为止的氨基酸序列、或与其具有80％以上同源性的序列，

(b)通过还原SDS-PAGE被分级为分子量约17000，

(B)GDF15前肽片段，其具有以下(c)和(d)的特征，

(c)包含序列号2所示的GDF15氨基酸序列的从第74残基的谷氨酸至至少第167残基的天冬氨酸为止的氨基酸序列、或与其具有80％以上同源性的序列，

(d)通过还原SDS-PAGE被分级为分子量约15000。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其利用使用了识别GDF15前肽的抗体的抗原抗体反应来进行所述测定。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其利用质谱分析法来进行所述测定。

7.一种用于检测去势抵抗性前列腺癌的试剂，其包含识别GDF15前肽的抗体。

8.一种GDF15前肽片段，其具有以下(a)和(b)的特征，

(b)通过还原SDS-PAGE被分级为分子量约17000。

9.一种GDF15前肽片段，其具有以下(c)和(d)的特征，

(d)通过还原SDS-PAGE被分级为分子量约15000。