KR102320436B1 - 교모종줄기세포 엑소좀 유래 펩타이드를 포함하는 교모세포종의 진단용 바이오마커 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 교모종줄기세포 엑소좀 유래 펩타이드를 포함하는 교모세포종 진단용 바이오마커들에 관한 것으로, 본 발명의 교모종줄기세포 엑소좀 유래의 교모세포종 특이적 마커인 펩타이드는 교모세포종의 암줄기세포능에 특이적으로 그 발현이 감소하므로 이들을 교모세포종의 암줄기세포 특이적인 바이오마커로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

교모종줄기세포 엑소좀 유래 펩타이드를 포함하는 교모세포종의 진단용 바이오마커 조성물{Biomarker composition for diagnosis of glioblastoma comprising glioblastoma stem cell exosome-derived peptide}

본 발명은 교모종줄기세포를 모사한 GBM(glioblastoma) 엑소좀 유래의 펩타이드를 포함하는 교모세포종 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.

신경교종 (glioma)은 원발성 뇌종양 (primary brain tumor)의 60%를 차지하는 종양으로 현재까지도 방사선 치료외엔 특별한 치료법이 없는 악성 종양이다. 특히 가장 악성으로 분류되는 교모세포종 (glioblastoma)은 다른 암과 비교하여 방사선 및 항암제 치료에 대한 저항성이 매우 높아 일단 진단되면 기대 생존기간이 1년에 불과하다. 악성 교모세포종은 전체 뇌종양의 12~15%를 차지하고, 뇌 교종의 50~60%를 차지하는 뇌에 발생하는 단일 종양 중 가장 많이 발생하는 종양이다. 또한, 뇌혈관 장벽이 있어 약물의 전달이 쉽지 않고, 상대적으로 뇌신경 생물학에 대한 이해의 부족 때문에 치료제 개발에서 소외된 분야이기도 하다.

교모세포종 (Glioblastoma multiforme, GBM)에서 중간엽 서브타입 (Mesenchymal subtype)으로의 분화는 종양형 성능을 촉진시켜 다른 서브타입에 비해 확연한 환자 예후 불량을 보인다 (Phillips, H.S., et al., Cancer cell 9:157-173, 2006; Verhaak, R.G., et al., Cancer cell 17:98-110, 2010). 중간엽 (MES) 표현형으로의 이동으로 인해 종양의 공격성이 강해져 재발시 예후가 좋지 않으며, 이러한 중간엽 교모세포종 (Mesenchymal GBM)으로의 분화 과정에서 종양 관련 대식세포 (Tumor-Associated Macrophage; TAM)의 침습이 증가되어 있다.

한편, 엑소좀은 대부분의 세포에서 분비되는 작은 형태의 소포체(membrane vesicle)이다. 엑소좀 안에는 그 세포에서 유래된 다양한 종류의 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA), 지질 등이 포함되어 있는 것으로 보고되었다. 또한, 조직 유래 엑소좀은 엑소좀을 분비한 조직의 상태를 반영하기 때문에, 질병의 진단에 이용될 수 있음이 보고된 바 있다.

이에 본 발명자는 교모세포종 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법을 개발하기 위한 연구를 지속한 결과, 교모종줄기세포 모사 GBM(glioblastoma) 엑소좀 유래 펩타이드를 이용할 경우, 교모세포종을 진단 및 예측할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 교모종줄기세포 모사 GBM(glioblastoma) 엑소좀에서 유래한 펩타이드를 포함하는 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 교모종줄기세포 모사 GBM(glioblastoma) 엑소좀에서 유래한 펩타이드의 발현을 측정하는 제제;를 포함하는 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 교모종줄기세포 모사 GBM(glioblastoma) 엑소좀에서 유래한 펩타이드의 발현량을 측정하는 것인, 교모세포종 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 교모종줄기세포 모사 GBM(glioblastoma) 엑소좀에서 유래한 펩타이드의 발현수준을 측정하는 제제;를 포함하는 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 교모종줄기세포 모사 GBM(glioblastoma) 엑소좀에서 유래한 펩타이드의 발현량을 측정하여 항교모세포종 후보 물질을 효과적인 항교모세포종 물질로 판단하는 항교모세포종 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 교모종줄기세포 모사 GBM(glioblastoma) 엑소좀에서 유래한 펩타이드를 포함하는 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 교모종줄기세포 모사 GBM(glioblastoma) 엑소좀에서 유래한 펩타이드의 발현을 측정하는 제제;를 포함하는 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 교모종줄기세포 모사 GBM(glioblastoma) 엑소좀에서 유래한 펩타이드의 발현량을 측정하는 것인, 교모세포종 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 교모종줄기세포 모사 GBM(glioblastoma) 엑소좀에서 유래한 펩타이드의 발현수준을 측정하는 제제;를 포함하는 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 교모종줄기세포 모사 GBM(glioblastoma) 엑소좀에서 유래한 펩타이드의 발현량을 측정하여 항교모세포종 후보 물질을 효과적인 항교모세포종 물질로 판단하는 항교모세포종 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 교모종줄기세포 모사 GBM(glioblastoma) 엑소좀에서 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein의 발현이 감소된 것을 확인한 바, 상기 펩타이드를 이용하여 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

도 1a은 부착/엑소좀 제거 혈청 배지 조건 및 비부착/무혈청 배지 조건에서 48시간 배양한 세포의 모양을 확인한 도이다.
도 1b는 부착/엑소좀 제거 혈청배지 조건 및 비부착/무혈청 배지 조건에서 48시간 배양한 세포에서 줄기세포 마커인 SOX2의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 부착/엑소좀 제거 혈청 배지 조건 및 비부착/무혈청 배지 조건에서 배양한 세포 배양액에서 분리한 엑소좀을 나노사이트(nanosight)로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 부착/엑소좀 제거 혈청 배지 조건 및 비부착/무혈청 배지 조건에서 배양한 세포 배양액에서 분리한 엑소좀의 사이즈 및 농도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 부착/엑소좀 제거 혈청 배지 조건 및 비부착/무혈청 배지 조건에서 배양한 세포 배양액에서 분리한 엑소좀의 MASS 분석 후 펩타이드를 프로파일한 결과를 나타낸 도이다.
도 3b는 부착/엑소좀 제거 혈청 배지 조건 및 비부착/무혈청 배지 조건에서 배양한 세포 배양액에서 분리한 엑소좀의 MASS 분석 후 펩타이드를 프로파일한 결과를 나타낸 도이다.
도 3c는 부착/엑소좀 제거 혈청 배지 조건 및 비부착/무혈청 배지 조건에서 배양한 세포 배양액에서 분리한 엑소좀의 MASS 분석 후 펩타이드를 프로파일한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 발명에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는 달리 정의되지 않는 이상 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명은 교모종줄기세포 모사 GBM(glioblastoma) 엑소좀에서 유래한 펩타이드로서 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 포함하는, 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "엑소좀"은 세포에서 분비되는 작은 형태의 소포체를 의미하는 것으로, 바람직하게는 전혈, 혈청 및 혈장 등 혈액 내에 존재하는 Circulating 엑소좀이다.

본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 교모세포종을 진단하는 것이다. 보다 구체적으로는 교모세포종에서 엑소좀 내 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein의 펩타이드가 감소하므로 상기 엑소좀 내 펩타이드의 양을 확인함으로써 해당 개체의 교모세포종에 대해 진단이 가능하다.

본 발명에서 용어 "예후(prognosis)"는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말한다. 예후의 예측은 향후 항암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다.

본 발명에서 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 암으로 진단받은 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 위암의 재발, 종양 성장, 약 저항성)를 미리 짐작하는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 "마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 교모세포종의 진단용 바이오마커는 교모세포종 발병시 발현이 감소하는 펩타이드를 지칭한다.

본 발명은 또한 교모종줄기세포 모사 GBM(glioblastoma) 엑소좀에서 유래한 펩타이드로서 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드의 발현을 측정하는 제제;를 포함하는 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서 용어, "펩타이드 발현수준 측정"이란 생물학적 시료에서 목적하는 유전자로부터 발현된 펩타이드의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 목적하는 유전자의 펩타이드에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 펩타이드의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏팅(Western Blotting), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 방사선면역분석(RIA: Rodioimmunoassay), 방사 면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterolony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FASC), 단백질 칩(Protein Chip) 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.

본 발명은 또한

1)분리된 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계;

2)상기 분리된 엑소좀으로부터 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드의 발현을 측정하는 것인, 교모세포종 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 1) 단계의 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 세포 배양액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으며 이에 제한되지 않으며 바람직하게는 교모종줄기세포를 배양한 배양액이다.

본 발명은 또한 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드의 발현수준을 측정하는 제제;를 포함하는 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 엑소좀 내 펩타이드의 양을 확인함으로써 교모세포종을 진단하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 키트는 엑소좀에서 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드의 발현 수준을 확인함으로써 교모세포종을 진단하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 키트에는 교모세포종 진단을 위한 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.

또한, 본 발명에서 펩타이드 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(O-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 항체 또는 압타머 일 수 있으며 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 용어 "항체"는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명에서 용어 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합 할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다

또한, 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한 본 발명은 (a) 교모종줄기세포 엑소좀의 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein의 펩타이드 양을 측정하는 단계;

(b) 상기 교모종줄기세포에 항암줄기세포 후보 물질을 투여하고 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein의 펩타이드 양을 측정하는 단계; 및

(c) (a)단계에서의 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein의 펩타이드 양보다 (b)단계에서의 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein의 펩타이드 양이 증가한 경우, 상기 항교모세포종 후보 물질을 효과적인 항교모세포종 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는, 항교모세포종 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

<실시예 1>

교모세포종 세포주의 암줄기세포능 특이적 배양

모든 인간 교모세포종(glioblastoma) A172 세포주를 한국세포주은행으로부터 구입하여, 열-불활화 우태아혈청(FBS) 10%, 페니실린 100 units/ml 및 스트렙토마이신 100 mg/ml이 함유된 DMEM(Hyclone, Logan, UT, USA) 배지를 이용하여, 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하여 유지하였으며, Nm (유혈청/부착) 조건 배양을 위해 세포를 PBS로 2번 씻어 엑소좀이 제거된 혈청 (EXO-FBS, System Bioscience사)이 포함된 조건에서 배양하였다 (도 1a). 암 줄기세포능을 촉진하는 배양 조건인 구체 형성(sphere forming, GBM) 배양을 위해서는 세포를 트립신처리(trypsinization) 하여 단일 세포를 분리하고, 이를 B27-첨가된 배지 DMEM/F12 (Cellgro, Manassas, VA, USA)에서 혈청 없이 epidermal growth factor 및 basic fibroblast growth factor (10 ng/mL each: R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 첨가하여 초저-부착 플레이트(attachment plates) (Corning, Tewksbury, MA)에서 각각 1 × 10⁵cells/mL 밀도로 구체 형성 배양을 수행하였다 (무혈청/비부착 배양, GBM) (도 1a). 구체 형성 조건으로 배양된 교모세포종 세포주에서 줄기세포능 마커인 SOX2의 mRNA 수준을 확인하기 위하여, 각각의 조건으로 배양한 세포들로부터 RNA를 추출한 뒤, 이를 cDNA로 역전사 한 후, 하기의 프라이머들과 SYBR Green Core Reagents (SYBR Premix Ex Taq II, Takara, Japan)를 이용하여 qPCR을 수행하였다. qPCR 조건은 95℃에서 3분간 변성 (1 사이클), 변성을 위해 95℃에서 10 초 동안 및 어닐링을 위해 60℃에서 30초 동안 증폭, 95℃에서 10초 동안 및 65℃에서 30초 동안 최종 용융 곡선 (1 사이클)이다. 데이터는 ViiA7 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)의 2-ΔΔCT 방법으로 분석하였다.

유전자	서열
SOX2	Forward: 5'-TACCTCTTCCTCCCACTCCA-3'
	Reverse: 5'-ACTCTCCTCTTTTGCACCCC-3'

그 결과, 교모세포종을 무혈청/비부착 배양한 경우 SOX2의 mRNA 수준이 혈청/부착 배양한 경우에 비해 현저하게 증가함을 확인하였다 (도 1b).

<실시예 2>

세포 배양액에서 엑소좀 분리

먼저 교모세포를 Nm(부착, 혈청을 포함한 배지 배양 조건)과 GBM(비부착, 무혈청 배지 배양조건) 조건에서 배양 후 파이펫으로 배양액을 각각 수득하여 튜브에 담고, 이를 3000x g로 15분간 원심분리하여 세포와 cell debris를 제거하고 상층액을 0.8 마이크로미터 크키의 주사기 필터 (MilliporeSigma사, MILLEX AA filter, 0.8 μm)로 통과시켰다. 상기 주사기 필터에서 걸러진 배양액 5mL 당 ExoQuick-TC (System Bioscience사) 1mL을 첨가하고, 튜브 뚜껑을 잠근 후, 위 아래로 뒤집어 배양액과 ExoQuick-TC액을 혼합하였다. 이를 12시간 내지 16시간 동안 4℃ 조건에서 방치하였다. 이후 튜브를 1500x g에서 30분간 원심분리하여 튜브 바닥 면에 침전된 흰색의 펠렛을 얻기 위해 상층액은 원심분리로 버리고 Phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 2번 처리하고 원심분리하여 수득하였다.

<실시예 3>

엑소좀 내 펩타이드 발현 변화 측정

상기 <실시예 2>와 같이 분리하여 준비한 Nm과 GBM 조건의 엑소좀 사이즈와 그 수를 NanoSight (Malvern Panalytical, 영국) 기기를 이용하여 Nanoparticle Tracking Analysis (NTA. Version 2.3 Build 2.3.5.0033.7-Beta7)으로 FTLA (Finite Track Length Analysis) 법을 사용하여 확인하였으며, 그 결과를 도 2a 및 도 2b와 같이 도식화 하여 나타내었다.

그 후 질량분석법(mass spectrometry)로 이를 분석하기 위하여 먼저 샘플버퍼(2% SDS, 150mM NaCl. 50mM Tris pH8)에 sonic probe (Q Sonica)과 샘플을 녹여 100°C에서 10분간 열처리 하였다. 단백질 추출물의 단백질 농도는 Qubit 형광 측정법에 의해 측정하였다. 그 후 각 샘플 10μg을 MES 버퍼 시스템에서 10 % Bis Tris NuPage mini-gel (Invitrogen)을 사용하여 SDS-PAGE를 실시하였다. 밴드를 오려내어 trypsin을 사용하여 in-gel digestion 한 후 MS 분석을 시행하였으며 보다 상세하게는 먼저 25mM 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)로 세척 후 아세토니트릴(acetonitrile)로 세척 하였다. 그 후 60℃에서 10mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)로 환원시킨 후, 실온에서 50mM 요오도아세트아미드(iodoacetamide로 알킬화시켰다. 이후 37 ℃에서 4 시간동안 트립신 (Promega)을 처리하였다. 마지막으로 포름산에 담가 상층액을 분석에 이용하였다.

상기 시료를 ThermoFisher Q Exactive 질량 분석기에 연결된 Waters NanoAcquity HPLC 시스템을 사용하여 nano LC-MS / MS로 분석하였으며 구체적으로는 하기와 같다.

먼저 펩타이드를 트래핑 컬럼에 로딩하고 350nL/분 조건에서 75μm 분석 컬럼으로 용리시켰으며 두 컬럼 모두에 Luna C18 수지 (Phenomenex)를 사용하였고 이를 2시간동안 구배하였다.

질량 분석계는 MS 및 MS/MS에 대해 각각 Orbitrap이 70,000 FWHM 및 17,500 FWHM에서 작동하는 데이터 의존 모드로 작동하였으며, 15 개의 가장 풍부한 이온을 택하여 MS/MS를 진행하였다. 펩타이드의 분석 데이터베이스는 MASCOT(Matrix Science, London, UK)을 이용하였다(Enzyme: Trypsin/P Databases: SwissProt Human (concatenated forward and reverse plus common contaminants) Fixed modifications: Carbamidomethyl (C) Variable modifications: Acetyl (N-term), Deamidation (N,Q), Oxidation (M), Pyro-Glu (N-term Q) Mass values: Monoisotopic Peptide Mass Tolerance: 10 ppm Fragment Mass Tolerance: 0.02 Da Max Missed Cleavages: 2). Masco DAT 파일은 검증, 필터링 및 샘플 당 비 중복 목록을 생성하기 위해 Scaffold (Proteome Software)로 파싱하였다. 이후 1 % 단백, 펩타이드 FDR 및 단백질 당 2 개 이상의 독특한 펩타이드를 필요로 하는 데이터를 여과 하였다.

상기와 같은 방법으로 질량 분석법(Mass spectrometry)을 실시하여 펩타이드를 분석한 결과 도 3a에 나타낸 바와 같이 면역 관련 단백질 발현 양상을 보임을 확인하였으며, 도 3b에 나타낸 바와 같이 NM과 GBM 배양 조건에서 단백질 발현 양상이 다르게 나타남을 확인하였다.

또한 도 3c에 나타낸 바와 같이 GBM 조건에서 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein의 펩타이드 양이 감소함을 확인하여, 이를 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물로 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.

<110> Metacura Inc. <120> Biomarker composition for diagnosis of glioblastoma comprising glioblastoma stem cell exosome-derived peptide <130> PN1912-689 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin heavy constant mu <400> 1 Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn 1 5 10 15 Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp 20 25 30 Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser 35 40 45 Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln 65 70 75 80 Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn 85 90 95 Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys 100 105 110 Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg 115 120 125 Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile 130 135 140 Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln 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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala 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Ser Ala Arg Asn Val Lys Glu Phe Ala 145 150 155 160 Val Val Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ser Val Ser Val Thr Leu Lys Gly 165 170 175 Ser Val Thr Phe Asn Gly Lys Phe Tyr Pro Ala Gly Asp Val Leu Arg 180 185 190 Val Thr Leu Gln Pro Tyr Asn Val Ala Gln Leu Gln Ser Ser Val Asp 195 200 205 Leu Ser Gly Ser Lys Val Thr Ala Ser Ser Pro Val Ala Val Leu Ser 210 215 220 Gly His Ser Cys Ala Gln Lys His Thr Thr Cys Asn His Val Val Glu 225 230 235 240 Gln Leu Leu Pro Thr Ser Ala Trp Gly Thr His Tyr Val Val Pro Thr 245 250 255 Leu Ala Ser Gln Ser Arg Tyr Asp Leu Ala Phe Val Val Ala Ser Gln 260 265 270 Ala Thr Lys Leu Thr Tyr Asn His Gly Gly Ile Thr Gly Ser Arg Gly 275 280 285 Leu Gln Ala Gly Asp Val Val Glu Phe Glu Val Arg Pro Ser Trp Pro 290 295 300 Leu Tyr Leu Ser Ala Asn Val Gly Ile Gln Val Leu Leu Phe Gly Thr 305 310 315 320 Gly Ala Ile Arg Asn Glu Val Thr Tyr Asp Pro Tyr Leu Val Leu Ile 325 330 335 Pro Asp Val Ala Ala Tyr Cys Pro Ala Tyr Val Val Lys Ser Val Pro 340 345 350 Gly Cys Glu Gly Val Ala Leu 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Ser Leu Ala Phe Asp Gly Asp 2180 2185 2190 Ser Phe Val Arg Leu Arg Val Pro Ala Ala Tyr Ala Gly Ser Leu Cys 2195 2200 2205 Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn Gln Asp Pro Ala Asp Asp Leu Lys Ala 2210 2215 2220 Val Gly Gly Lys Pro Ala Gly Trp Gln Val Gly Gly Ala Gln Gly Cys 2225 2230 2235 2240 Gly Glu Cys Val Ser Lys Pro Cys Pro Ser Pro Cys Thr Pro Glu Gln 2245 2250 2255 Gln Glu Ser Phe Gly Gly Pro Asp Ala Cys Gly Val Ile Ser Ala Thr 2260 2265 2270 Asp Gly Pro Leu Ala Pro Cys His Gly Leu Val Pro Pro Ala Gln Tyr 2275 2280 2285 Phe Gln Gly Cys Leu Leu Asp Ala Cys Gln Val Gln Gly His Pro Gly 2290 2295 2300 Gly Leu Cys Pro Ala Val Ala Thr Tyr Val Ala Ala Cys Gln Ala Ala 2305 2310 2315 2320 Gly Ala Gln Leu Arg Glu Trp Arg Arg Pro Asp Phe Cys Pro Phe Gln 2325 2330 2335 Cys Pro Ala His Ser His Tyr Glu Leu Cys Gly Asp Ser Cys Pro Gly 2340 2345 2350 Ser Cys Pro Ser Leu Ser Ala Pro Glu Gly Cys Glu Ser Ala Cys Arg 2355 2360 2365 Glu Gly Cys Val Cys Asp Ala Gly Phe Val Leu Ser Gly Asp Thr Cys 2370 2375 2380 Val Pro Val Gly Gln Cys Gly Cys Leu His Asp Asp Arg Tyr Tyr Pro 2385 2390 2395 2400 Leu Gly Gln Thr Phe Tyr Pro Gly Pro Gly Cys Asp Ser Leu Cys Arg 2405 2410 2415 Cys Arg Glu Gly Gly Glu Val Ser Cys Glu Pro Ser Ser Cys Gly Pro 2420 2425 2430 His Glu Thr Cys Arg Pro Ser Gly Gly Ser Leu Gly Cys Val Ala Val 2435 2440 2445 Gly Ser Thr Thr Cys Gln Ala Ser Gly Asp Pro His Tyr Thr Thr Phe 2450 2455 2460 Asp Gly Arg Arg Phe Asp Phe Met Gly Thr Cys Val Tyr Val Leu Ala 2465 2470 2475 2480 Gln Thr Cys Gly Thr Arg Pro Gly Leu His Arg Phe Ala Val Leu Gln 2485 2490 2495 Glu Asn Val Ala Trp Gly Asn Gly Arg Val Ser Val Thr Arg Val Ile 2500 2505 2510 Thr Val Gln Val Ala Asn Phe Thr Leu Arg Leu Glu Gln Arg Gln Trp 2515 2520 2525 Lys Val Thr Val Asn Gly Val Asp Met Lys Leu Pro Val Val Leu Ala 2530 2535 2540 Asn Gly Gln Ile Arg Ala Ser Gln His Gly Ser Asp Val Val Ile Glu 2545 2550 2555 2560 Thr Asp Phe Gly Leu Arg Val Ala Tyr Asp Leu Val Tyr Tyr Val Arg 2565 2570 2575 Val Thr Val Pro Gly Asn Tyr Tyr Gln Leu Met Cys Gly Leu Cys Gly 2580 2585 2590 Asn Tyr Asn Gly Asp Pro Lys Asp Asp Phe Gln Lys Pro Asn Gly Ser 2595 2600 2605 Gln Ala Gly Asn Ala Asn Glu Phe Gly Asn Ser Trp Glu Glu Val Val 2610 2615 2620 Pro Asp Ser Pro Cys Leu Pro Pro Pro Thr Cys Pro Pro Gly Ser Glu 2625 2630 2635 2640 Gly Cys Ile Pro Ser Glu Glu Cys Pro Pro Glu Leu Glu Lys Lys Tyr 2645 2650 2655 Gln Lys Glu Glu Phe Cys Gly Leu Leu Ser Ser Pro Thr Gly Pro Leu 2660 2665 2670 Ser Ser Cys His Lys Leu Val Asp Pro Gln Gly Pro Leu Lys Asp Cys 2675 2680 2685 Ile Phe Asp Leu Cys Leu Gly Gly Gly Asn Leu Ser Ile Leu Cys Ser 2690 2695 2700 Asn Ile His Ala Tyr Val Ser Ala Cys Gln Ala Ala Gly Gly Gln Val 2705 2710 2715 2720 Glu Pro Trp Arg Asn Glu Thr Phe Cys Pro Met Glu Cys Pro Gln Asn 2725 2730 2735 Ser His Tyr Glu Leu Cys Ala Asp Thr Cys Ser Leu Gly Cys Ser Ala 2740 2745 2750 Leu Ser Ala Pro Leu Gln Cys Pro Asp Gly Cys Ala Glu Gly Cys Gln 2755 2760 2765 Cys Asp Ser Gly Phe Leu Tyr Asn Gly Gln Ala Cys Val Pro Ile Gln 2770 2775 2780 Gln Cys Gly Cys Tyr His Asn Gly Ala Tyr Tyr Glu Pro Glu Gln Thr 2785 2790 2795 2800 Val Leu Ile Asp Asn Cys Arg Gln Gln Cys Thr Cys His Val Gly Lys 2805 2810 2815 Val Val Val Cys Gln Glu His Ser Cys Lys Pro Gly Gln Val Cys Gln 2820 2825 2830 Pro Ser Gly Gly Ile Leu Ser Cys Val Asn Lys Asp Pro Cys His Gly 2835 2840 2845 Val Thr Cys Arg Pro Gln Glu Thr Cys Lys Glu Gln Gly Gly Gln Gly 2850 2855 2860 Val Cys Leu Pro Asn Tyr Glu Ala Thr Cys Trp Leu Trp Gly Asp Pro 2865 2870 2875 2880 His Tyr His Ser Phe Asp Gly Arg Lys Phe Asp Phe Gln Gly Thr Cys 2885 2890 2895 Asn Tyr Val Leu Ala Thr Thr Gly Cys Pro Gly Val Ser Thr Gln Gly 2900 2905 2910 Leu Thr Pro Phe Thr Val Thr Thr Lys Asn Gln Asn Arg Gly Asn Pro 2915 2920 2925 Ala Val Ser Tyr Val Arg Val Val Thr Val Ala Ala Leu Gly Thr Asn 2930 2935 2940 Ile Ser Ile His Lys Asp Glu Ile Gly Lys Val Arg Val Asn Gly Val 2945 2950 2955 2960 Leu Thr Ala Leu Pro Val Ser Val Ala Asp Gly Arg Ile Ser Val Thr 2965 2970 2975 Gln Gly Ala Ser Lys Ala Leu Leu Val Ala Asp Phe Gly Leu Gln Val 2980 2985 2990 Ser Tyr Asp Trp Asn Trp Arg Val Asp Val Thr Leu Pro Ser Ser Tyr 2995 3000 3005 His Gly Ala Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Met Asp Arg Asn Pro Asn 3010 3015 3020 Asn Asp Gln Val Phe Pro Asn Gly Thr Leu Ala Pro Ser Ile Pro Ile 3025 3030 3035 3040 Trp Gly Gly Ser Trp Arg Ala Pro Gly Trp Asp Pro Leu Cys Trp Asp 3045 3050 3055 Glu Cys Arg Gly Ser Cys Pro Thr Cys Pro Glu Asp Arg Leu Glu Gln 3060 3065 3070 Tyr Glu Gly Pro Gly Phe Cys Gly Pro Leu Ala Pro Gly Thr Gly Gly 3075 3080 3085 Pro Phe Thr Thr Cys His Ala His Val Pro Pro Glu Ser Phe Phe Lys 3090 3095 3100 Gly Cys Val Leu Asp Val Cys Met Gly Gly Gly Asp Arg Asp Ile Leu 3105 3110 3115 3120 Cys Lys Ala Leu Ala Ser Tyr Val Ala Ala Cys Gln Ala Ala Gly Val 3125 3130 3135 Val Ile Glu Asp Trp Arg Ala Gln Val Gly Cys Glu Ile Thr Cys Pro 3140 3145 3150 Glu Asn Ser His Tyr Glu Val Cys Gly Pro Pro Cys Pro Ala Ser Cys 3155 3160 3165 Pro Ser Pro Ala Pro Leu Thr Thr Pro Ala Val Cys Glu Gly Pro Cys 3170 3175 3180 Val Glu Gly Cys Gln Cys Asp Ala Gly Phe Val Leu Ser Ala Asp Arg 3185 3190 3195 3200 Cys Val Pro Leu Asn Asn Gly Cys Gly Cys Trp Ala Asn Gly Thr Tyr 3205 3210 3215 His Glu Ala Gly Ser Glu Phe Trp Ala Asp Gly Thr Cys Ser Gln Trp 3220 3225 3230 Cys Arg Cys Gly Pro Gly Gly Gly Ser Leu Val Cys Thr Pro Ala Ser 3235 3240 3245 Cys Gly Leu Gly Glu Val Cys Gly Leu Leu Pro Ser Gly Gln His Gly 3250 3255 3260 Cys Gln Pro Val Ser Thr Ala Glu Cys Gln Ala Trp Gly Asp Pro His 3265 3270 3275 3280 Tyr Val Thr Leu Asp Gly His Arg Phe Asp Phe Gln Gly Thr Cys Glu 3285 3290 3295 Tyr Leu Leu Ser Ala Pro Cys His Gly Pro Pro Leu Gly Ala Glu Asn 3300 3305 3310 Phe Thr Val Thr Val Ala Asn Glu His Arg Gly Ser Gln Ala Val Ser 3315 3320 3325 Tyr Thr Arg Ser Val Thr Leu Gln Ile Tyr Asn His Ser Leu Thr Leu 3330 3335 3340 Ser Ala Arg Trp Pro Arg Lys Leu Gln Val Asp Gly Val Phe Val Thr 3345 3350 3355 3360 Leu Pro Phe Gln Leu Asp Ser Leu Leu His Ala His Leu Ser Gly Ala 3365 3370 3375 Asp Val Val Val Thr Thr Thr Ser Gly Leu Ser Leu Ala Phe Asp Gly 3380 3385 3390 Asp Ser Phe Val Arg Leu Arg Val Pro Ala Ala Tyr Ala Gly Ser Leu 3395 3400 3405 Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn Gln Asp Pro Ala Asp Asp Leu Lys 3410 3415 3420 Ala Val Gly Gly Lys Pro Ala Gly Trp Gln Val Gly Gly Ala Gln Gly 3425 3430 3435 3440 Cys Gly Glu Cys Val Ser Lys Pro Cys Pro Ser Pro Cys Thr Pro Glu 3445 3450 3455 Gln Gln Glu Ser Phe Gly Gly Pro Asp Ala Cys Gly Val Ile Ser Ala 3460 3465 3470 Thr Asp Gly Pro Leu Ala Pro Cys His Gly Leu Val Pro Pro Ala Gln 3475 3480 3485 Tyr Phe Gln Gly Cys Leu Leu Asp Ala Cys Gln Val Gln Gly His Pro 3490 3495 3500 Gly Gly Leu Cys Pro Ala Val Ala Thr Tyr Val Ala Ala Cys Gln Ala 3505 3510 3515 3520 Ala Gly Ala Gln Leu Arg Glu Trp Arg Arg Pro Asp Phe Cys Pro Phe 3525 3530 3535 Gln Cys Pro Ala His Ser His Tyr Glu Leu Cys Gly Asp Ser Cys Pro 3540 3545 3550 Gly Ser Cys Pro Ser Leu Ser Ala Pro Glu Gly Cys Glu Ser Ala Cys 3555 3560 3565 Arg Glu Gly Cys Val Cys Asp Ala Gly Phe Val Leu Ser Gly Asp Thr 3570 3575 3580 Cys Val Pro Val Gly Gln Cys Gly Cys Leu His Asp Asp Arg Tyr Tyr 3585 3590 3595 3600 Pro Leu Gly Gln Thr Phe Tyr Pro Gly Pro Gly Cys Asp Ser Leu Cys 3605 3610 3615 Arg Cys Arg Glu Gly Gly Glu Val Ser Cys Glu Pro Ser Ser Cys Gly 3620 3625 3630 Pro His Glu Thr Cys Arg Pro Ser Gly Gly Ser Leu Gly Cys Val Ala 3635 3640 3645 Val Gly Ser Thr Thr Cys Gln Ala Ser Gly Asp Pro His Tyr Thr Thr 3650 3655 3660 Phe Asp Gly His Arg Phe Asp Phe Met Gly Thr Cys Val Tyr Val Leu 3665 3670 3675 3680 Ala Gln Thr Cys Gly Thr Arg Pro Gly Leu His Arg Phe Ala Val Leu 3685 3690 3695 Gln Glu Asn Val Ala Trp Gly Asn Gly Arg Val Ser Val Thr Arg Val 3700 3705 3710 Ile Thr Val Gln Val Ala Asn Phe Thr Leu Arg Leu Glu Gln Arg Gln 3715 3720 3725 Trp Lys Val Thr Val Asn Gly Val Asp Met Lys Leu Pro Val Val Leu 3730 3735 3740 Ala Asn Gly Gln Ile Arg Ala Ser Gln His Gly Ser Asp Val Val Ile 3745 3750 3755 3760 Glu Thr Asp Phe Gly Leu Arg Val Ala Tyr Asp Leu Val Tyr Tyr Val 3765 3770 3775 Arg Val Thr Val Pro Gly Asn Tyr Tyr Gln Leu Met Cys Gly Leu Cys 3780 3785 3790 Gly Asn Tyr Asn Gly Asp Pro Lys Asp Asp Phe Gln Lys Pro Asn Gly 3795 3800 3805 Ser Gln Ala Gly Asn Ala Asn Glu Phe Gly Asn Ser Trp Glu Glu Val 3810 3815 3820 Val Pro Asp Ser Pro Cys Leu Pro Pro Pro Thr Cys Pro Pro Gly Ser 3825 3830 3835 3840 Ala Gly Cys Ile Pro Ser Asp Lys Cys Pro Pro Glu Leu Glu Lys Lys 3845 3850 3855 Tyr Gln Lys Glu Glu Phe Cys Gly Leu Leu Ser Ser Pro Thr Gly Pro 3860 3865 3870 Leu Ser Ser Cys His Lys Leu Val Asp Pro Gln Gly Pro Leu Lys Asp 3875 3880 3885 Cys Ile Phe Asp Leu Cys Leu Gly Gly Gly Asn Leu Ser Ile Leu Cys 3890 3895 3900 Ser Asn Ile His Ala Tyr Val Ser Ala Cys Gln Ala Ala Gly Gly His 3905 3910 3915 3920 Val Glu Pro Trp Arg Asn Glu Thr Phe Cys Pro Met Glu Cys Pro Gln 3925 3930 3935 Asn Ser His Tyr Glu Leu Cys Ala Asp Thr Cys Ser Leu Gly Cys Ser 3940 3945 3950 Ala Leu Ser Ala Pro Leu Gln Cys Pro Asp Gly Cys Ala Glu Gly Cys 3955 3960 3965 Gln Cys Asp Ser Gly Phe Leu Tyr Asn Gly Gln Ala Cys Val Pro Ile 3970 3975 3980 Gln Gln Cys Gly Cys Tyr His Asn Gly Val Tyr Tyr Glu Pro Glu Gln 3985 3990 3995 4000 Thr Val Leu Ile Asp Asn Cys Arg Gln Gln Cys Thr Cys His Val Gly 4005 4010 4015 Lys Val Val Val Cys Gln Glu His Ser Cys Lys Pro Gly Gln Val Cys 4020 4025 4030 Gln Pro Ser Gly Gly Ile Leu Ser Cys Val Thr Lys Asp Pro Cys His 4035 4040 4045 Gly Val Thr Cys Arg Pro Gln Glu Thr Cys Lys Glu Gln Gly Gly Gln 4050 4055 4060 Gly Val Cys Leu Pro Asn Tyr Glu Ala Thr Cys Trp Leu Trp Gly Asp 4065 4070 4075 4080 Pro His Tyr His Ser Phe Asp Gly Arg Lys Phe Asp Phe Gln Gly Thr 4085 4090 4095 Cys Asn Tyr Val Leu Ala Thr Thr Gly Cys Pro Gly Val Ser Thr Gln 4100 4105 4110 Gly Leu Thr Pro Phe Thr Val Thr Thr Lys Asn Gln Asn Arg Gly Asn 4115 4120 4125 Pro Ala Val Ser Tyr Val Arg Val Val Thr Val Ala Ala Leu Gly Thr 4130 4135 4140 Asn Ile Ser Ile His Lys Asp Glu Ile Gly Lys Val Arg Val Asn Gly 4145 4150 4155 4160 Val Leu Thr Ala Leu Pro Val Ser Val Ala Asp Gly Arg Ile Ser Val 4165 4170 4175 Ala Gln Gly Ala Ser Lys Ala Leu Leu Val Ala Asp Phe Gly Leu Gln 4180 4185 4190 Val Ser Tyr Asp Trp Asn Trp Arg Val Asp Val Thr Leu Pro Ser Ser 4195 4200 4205 Tyr His Gly Ala Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Met Asp Arg Asn Pro 4210 4215 4220 Asn Asn Asp Gln Val Phe Pro Asn Gly Thr Leu Ala Pro Ser Ile Pro 4225 4230 4235 4240 Ile Trp Gly Gly Ser Trp Arg Ala Pro Gly Trp Asp Pro Leu Cys Trp 4245 4250 4255 Asp Glu Cys Arg Gly Ser Cys Pro Thr Cys Pro Glu Asp Arg Leu Glu 4260 4265 4270 Gln Tyr Glu Gly Pro Gly Phe Cys Gly Pro Leu Ser Ser Gly Thr Gly 4275 4280 4285 Gly Pro Phe Thr Thr Cys His Ala His Val Pro Pro Glu Ser Phe Phe 4290 4295 4300 Lys Gly Cys Val Leu Asp Val Cys Met Gly Gly Gly Asp Arg Asp Ile 4305 4310 4315 4320 Leu Cys Lys Ala Leu Ala Ser Tyr Val Ala Ala Cys Gln Ala Ala Gly 4325 4330 4335 Val Val Ile Glu Asp Trp Arg Ala Gln Val Gly Cys Glu Ile Thr Cys 4340 4345 4350 Pro Glu Asn Ser His Tyr Glu Val Cys Gly Pro Pro Cys Pro Ala Ser 4355 4360 4365 Cys Pro Ser Pro Ala Pro Leu Thr Thr Pro Ala Val Cys Glu Gly Pro 4370 4375 4380 Cys Val Glu Gly Cys Gln Cys Asp Ala Gly Phe Val Leu Ser Ala Asp 4385 4390 4395 4400 Arg Cys Val Pro Leu Asn Asn Gly Cys Gly Cys Trp Ala Asn Gly Thr 4405 4410 4415 Tyr His Glu Ala Gly Ser Glu Phe Trp Ala Asp Gly Thr Cys Ser Gln 4420 4425 4430 Trp Cys Arg Cys Gly Pro Gly Gly Gly Ser Leu Val Cys Thr Pro Ala 4435 4440 4445 Ser Cys Gly Leu Gly Glu Val Cys Gly Leu Leu Pro Ser Gly Gln His 4450 4455 4460 Gly Cys Gln Pro Val Ser Thr Ala Glu Cys Gln Ala Trp Gly Asp Pro 4465 4470 4475 4480 His Tyr Val Thr Leu Asp Gly His Arg Phe Asp Phe Gln Gly Thr Cys 4485 4490 4495 Glu Tyr Leu Leu Ser Ala Pro Cys His Gly Pro Pro Leu Gly Ala Glu 4500 4505 4510 Asn Phe Thr Val Thr Val Ala Asn Glu His Arg Gly Ser Gln Ala Val 4515 4520 4525 Ser Tyr Thr Arg Ser Val Thr Leu Gln Ile Tyr Asn His Ser Leu Thr 4530 4535 4540 Leu Ser Ala Arg Trp Pro Arg Lys Leu Gln Val Asp Gly Val Phe Val 4545 4550 4555 4560 Ala Leu Pro Phe Gln Leu Asp Ser Leu Leu His Ala His Leu Ser Gly 4565 4570 4575 Ala Asp Val Val Val Thr Thr Thr Ser Gly Leu Ser Leu Ala Phe Asp 4580 4585 4590 Gly Asp Ser Phe Val Arg Leu Arg Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Ser 4595 4600 4605 Leu Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn Gln Asp Pro Ala Asp Asp Leu 4610 4615 4620 Lys Ala Val Gly Gly Lys Pro Ala Gly Trp Gln Val Gly Gly Ala Gln 4625 4630 4635 4640 Gly Cys Gly Glu Cys Val Ser Lys Pro Cys Pro Ser Pro Cys Thr Pro 4645 4650 4655 Glu Gln Gln Glu Ser Phe Gly Gly Pro Asp Ala Cys Gly Val Ile Ser 4660 4665 4670 Ala Thr Asp Gly Pro Leu Ala Pro Cys His Gly Leu Val Pro Pro Ala 4675 4680 4685 Gln Tyr Phe Gln Gly Cys Leu Leu Asp Ala Cys Gln Val Gln Gly His 4690 4695 4700 Pro Gly Gly Leu Cys Pro Ala Val Ala Thr Tyr Val Ala Ala Cys Gln 4705 4710 4715 4720 Ala Ala Gly Ala Gln Leu Gly Glu Trp Arg Arg Pro Asp Phe Cys Pro 4725 4730 4735 Leu Gln Cys Pro Ala His Ser His Tyr Glu Leu Cys Gly Asp Ser Cys 4740 4745 4750 Pro Val Ser Cys Pro Ser Leu Ser Ala Pro Glu Gly Cys Glu Ser Ala 4755 4760 4765 Cys Arg Glu Gly Cys Val Cys Asp Ala Gly Phe Val Leu Ser Gly Asp 4770 4775 4780 Thr Cys Val Pro Val Gly Gln Cys Gly Cys Leu His Asp Gly Arg Tyr 4785 4790 4795 4800 Tyr Pro Leu Gly Glu Val Phe Tyr Pro Gly Pro Glu Cys Glu Arg Arg 4805 4810 4815 Cys Glu Cys Gly Pro Gly Gly His Val Thr Cys Gln Glu Gly Ala Ala 4820 4825 4830 Cys Gly Pro His Glu Glu Cys Arg Leu Glu Asp Gly Val Gln Ala Cys 4835 4840 4845 His Ala Thr Gly Cys Gly Arg Cys Leu Ala Asn Gly Gly Ile His Tyr 4850 4855 4860 Ile Thr Leu Asp Gly Arg Val Tyr Asp Leu His Gly Ser Cys Ser Tyr 4865 4870 4875 4880 Val Leu Ala Gln Val Cys His Pro Lys Pro Gly Asp Glu Asp Phe Ser 4885 4890 4895 Ile Val Leu Glu Lys Asn Ala Ala Gly Asp Leu Gln Arg Leu Leu Val 4900 4905 4910 Thr Val Ala Gly Gln Val Val Ser Leu Ala Gln Gly Gln Gln Val Thr 4915 4920 4925 Val Asp Gly Glu Ala Val Ala Leu Pro Val Ala Val Gly Arg Val Arg 4930 4935 4940 Val Thr Ala Glu Gly Arg Asn Met Val Leu Gln Thr Thr Lys Gly Leu 4945 4950 4955 4960 Arg Leu Leu Phe Asp Gly Asp Ala His Leu Leu Met Ser Ile Pro Ser 4965 4970 4975 Pro Phe Arg Gly Arg Leu Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asn Gly Asn 4980 4985 4990 Trp Ser Asp Asp Phe Val Leu Pro Asn Gly Ser Ala Ala Ser Ser Val 4995 5000 5005 Glu Thr Phe Gly Ala Ala Trp Arg Ala Pro Gly Ser Ser Lys Gly Cys 5010 5015 5020 Gly Glu Gly Cys Gly Pro Gln Gly Cys Pro Val Cys Leu Ala Glu Glu 5025 5030 5035 5040 Thr Ala Pro Tyr Glu Ser Asn Glu Ala Cys Gly Gln Leu Arg Asn Pro 5045 5050 5055 Gln Gly Pro Phe Ala Thr Cys Gln Ala Val Leu Ser Pro Ser Glu Tyr 5060 5065 5070 Phe Arg Gln Cys Val Tyr Asp Leu Cys Ala Gln Lys Gly Asp Lys Ala 5075 5080 5085 Phe Leu Cys Arg Ser Leu Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Cys Gln Ala Ala 5090 5095 5100 Gly Val Ala Val Lys Pro Trp Arg Thr Asp Ser Phe Cys Pro Leu His 5105 5110 5115 5120 Cys Pro Ala His Ser His Tyr Ser Ile Cys Thr Arg Thr Cys Gln Gly 5125 5130 5135 Ser Cys Ala Ala Leu Ser Gly Leu Thr Gly Cys Thr Thr Arg Cys Phe 5140 5145 5150 Glu Gly Cys Glu Cys Asp Asp Arg Phe Leu Leu Ser Gln Gly Val Cys 5155 5160 5165 Ile Pro Val Gln Asp Cys Gly Cys Thr His Asn Gly Arg Tyr Leu Pro 5170 5175 5180 Val Asn Ser Ser Leu Leu Thr Ser Asp Cys Ser Glu Arg Cys Ser Cys 5185 5190 5195 5200 Ser Ser Ser Ser Gly Leu Thr Cys Gln Ala Ala Gly Cys Pro Pro Gly 5205 5210 5215 Arg Val Cys Glu Val Lys Ala Glu Ala Arg Asn Cys Trp Ala Thr Arg 5220 5225 5230 Gly Leu Cys Val Leu Ser Val Gly Ala Asn Leu Thr Thr Phe Asp Gly 5235 5240 5245 Ala Arg Gly Ala Thr Thr Ser Pro Gly Val Tyr Glu Leu Ser Ser Arg 5250 5255 5260 Cys Pro Gly Leu Gln Asn Thr Ile Pro Trp Tyr Arg Val Val Ala Glu 5265 5270 5275 5280 Val Gln Ile Cys His Gly Lys Thr Glu Ala Val Gly Gln Val His Ile 5285 5290 5295 Phe Phe Gln Asp Gly Met Val Thr Leu Thr Pro Asn Lys Gly Val Trp 5300 5305 5310 Val Asn Gly Leu Arg Val Asp Leu Pro Ala Glu Lys Leu Ala Ser Val 5315 5320 5325 Ser Val Ser Arg Thr Pro Asp Gly Ser Leu Leu Val Arg Gln Lys Ala 5330 5335 5340 Gly Val Gln Val Trp Leu Gly Ala Asn Gly Lys Val Ala Val Ile Val 5345 5350 5355 5360 Ser Asn Asp His Ala Gly Lys Leu Cys Gly Ala Cys Gly Asn Phe Asp 5365 5370 5375 Gly Asp Gln Thr Asn Asp Trp His Asp Ser Gln Glu Lys Pro Ala Met 5380 5385 5390 Glu Lys Trp Arg Ala Gln Asp Phe Ser Pro Cys Tyr Gly 5395 5400 5405

Claims (12)

1. 엑소좀 유래의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 mu, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 kappa, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 alpha1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 gamma1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 lambda1 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 IgGFc-binding protein을 포함하는 펩타이드를 포함하는, 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 교모세포종 유래의 엑소좀인 것인, 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 교모세포종에서 펩타이드 발현양이 정상세포와 비교하여 저발현 되는 것인, 교모세포종 진단용 바이오마커 조성물.
5. 엑소좀 유래의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 mu, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 kappa, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 alpha1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 gamma1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 lambda1 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 IgGFc-binding protein을 포함하는 펩타이드의 발현을 측정하는 제제;를 포함하는 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 조성물.
6. 삭제
7. 1)분리된 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계;
   2)상기 분리된 엑소좀으로부터 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 mu, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 kappa, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 alpha1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 gamma1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 lambda1 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 IgGFc-binding protein을 포함하는 펩타이드의 발현을 측정하는 것인, 교모세포종 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 엑소좀은 교모종줄기세포 유래인 것인, 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
9. 제7항에 있어서,
   상기 펩타이드는 교모세포종에서 펩타이드 발현양이 정상세포와 비교하여 저발현 되는 것인, 방법.
10. 엑소좀 유래의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 mu, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 kappa, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 alpha1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 gamma1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 lambda1 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 IgGFc-binding protein을 포함하는 펩타이드의 발현수준을 측정하는 제제;를 포함하는 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 키트.
11. 제10항에 있어서,
    상기 펩타이드의 발현수준을 측정하는 제제는 항체 또는 압타머인, 키트.
12. (a) 교모종줄기세포에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 mu, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 kappa, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 alpha1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 gamma1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 lambda1 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 IgGFc-binding protein을 포함하는 펩타이드의 양을 측정하는 단계;
    (b) 상기 교모종줄기세포에 항교모세포종 후보 물질을 투여하고 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein의 펩타이드 양을 측정하는 단계; 및
    (c) (a)단계에서의 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein의 펩타이드 양보다 (b)단계에서의 면역글로불린 mu, 면역글로불린 kappa, 면역글로불린 alpha1, 면역글로불린 gamma1, 면역글로불린 lambda1 및 IgGFc-binding protein의 펩타이드 양이 증가한 경우, 상기 항교모세포종 후보 물질을 효과적인 항교모세포종 물질로 판단하는 단계;를 포함하는, 항교모세포종 후보 물질의 스크리닝 방법.

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