WO2023085424A1 - 前立腺がんの新規マーカー - Google Patents

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WO2023085424A1
WO2023085424A1 PCT/JP2022/042221 JP2022042221W WO2023085424A1 WO 2023085424 A1 WO2023085424 A1 WO 2023085424A1 JP 2022042221 W JP2022042221 W JP 2022042221W WO 2023085424 A1 WO2023085424 A1 WO 2023085424A1
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WO
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psa
subject
derived
isoelectric point
prostate cancer
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PCT/JP2022/042221
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令江 荒木
明 笹尾
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国立大学法人熊本大学
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    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to novel markers for prostate cancer.
  • the present invention also relates to a method for detecting prostate cancer using said marker.
  • Prostate cancer in Japan accounts for 5% of all cancer deaths in men, while the number of cases accounts for about 10% of all cancers in men, and the rate of increase in mortality in recent years is the highest among all cancers.
  • the prostate-specific antigen (PSA) test is widely used for early diagnosis and treatment prognosis of prostate cancer, but the assay is highly sensitive but has low specificity and is difficult to distinguish between biologic malignancies. Therefore, false positives are likely to occur, and detailed examinations such as ultrasonography and rectal examination are required.
  • definite diagnosis of prostate cancer mainly requires invasive examination such as biopsy, which imposes a heavy burden on the patient. Frequent false positive results in unnecessary medical practice and burden on patients, resulting in great stress and economic loss for patients.
  • treatment after a definitive diagnosis is mainly surgical resection, radiotherapy, hormone therapy, etc., but there are no prognostic or sensitive diagnostic markers for these other than PSA. Therefore, it is essential to construct a diagnostic system with a low degree of invasiveness and high specificity for early diagnosis and determination of therapeutic effects. .
  • Non-Patent Document 1 ISRN Oncol 2012, 768190
  • Non-Patent Document 2 ClinChem 2004, 50:2292-2301
  • the possibility of malignancy discrimination is suggested by the fractionation pattern of PSA in two-dimensional electrophoresis.
  • Non-Patent Document 3 Glycobiology 2006, 16:132-145
  • PSA exhibits various patterns when subjected to two-dimensional electrophoresis.
  • previous papers have tried to distinguish between prostatic hyperplasia or prostatitis and prostate cancer, but there have been no reports of distinguishing between castration resistance. Also, with these methods, it is difficult to ascertain that patients with benign prostatic hyperplasia or prostatitis are virtually free of prostate cancer.
  • PSA is a glycoprotein with a molecular weight of about 30,000, and has asparagine-linked (N-type) sugar chains, and is known to be sialylated at the ends of the sugar chains.
  • PSA derived from prostate cancer patients is reported to have a LacdiNAc structure, which is a disaccharide in which N-acetylgalactosamine and N-acetylglucosamine are bound.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting prostate cancer using a novel marker for prostate cancer.
  • a method for determining that a subject has or is suspected of having prostate cancer by detecting prostate-specific antigen (PSA) present in a sample from the subject comprising: When the isoelectric point of the derived PSA is on the basic side compared to the PSA derived from a healthy subject, it is determined that the subject suffers from or is suspected to have prostate cancer. Method.
  • the fraction having a more basic isoelectric point of the subject-derived PSA When the isoelectric point of PSA derived from a healthy subject is larger than that of a fraction that is basic, the distribution of the isoelectric points of the PSA derived from the subject is on the basic side compared to the distribution of the isoelectric points of the PSA derived from the healthy subject. or when PSA with an isoelectric point of 6.0 or higher is detected, the isoelectric point of the subject-derived PSA is determined to be on the basic side compared to the healthy subject-derived PSA , the determination method described in the above [1].
  • a method for determining that a subject has or is suspected to have prostate cancer by detecting prostate-specific antigen (PSA) present in a sample from the subject comprising determines that a subject has or is suspected of having prostate cancer if it is desialylated compared to PSA from a healthy subject.
  • PSA prostate-specific antigen
  • the subject-derived sample is subject-derived serum.
  • the subject-derived sample is ethanolamine-treated subject-derived serum.
  • a method for obtaining information used for diagnosing that a subject patient suffers from or is suspected of having prostate cancer wherein A method for detecting prostate-specific antigen (PSA) and determining whether the isoelectric point of the detected PSA derived from a subject patient is on the basic side compared to PSA derived from a healthy subject.
  • PSA prostate-specific antigen
  • the fraction of the subject-derived PSA whose isoelectric point is more basic When the isoelectric point of PSA derived from a healthy subject is larger than that of a fraction that is basic, the distribution of the isoelectric points of the PSA derived from the subject is on the basic side compared to the distribution of the isoelectric points of the PSA derived from the healthy subject. or when PSA with an isoelectric point of 6.0 or higher is detected, the isoelectric point of the subject-derived PSA is determined to be on the basic side compared to the healthy subject-derived PSA , the method described in [12] above.
  • a method of detecting prostate-specific antigen (PSA) present in a sample from a subject comprising the steps of: (a) releasing PSA from PSA-ACT complexes present in a sample from the subject; (b) performing two-dimensional electrophoresis on the free PSA obtained in step (a) to separate PSA having different isoelectric points and detecting each PSA spot; and (c) control PSA ( confirming the presence of (one or more) spots of PSA detected on the basic side compared to the one or more spots; method including.
  • PSA prostate-specific antigen
  • [24] A method of diagnosing a subject as having prostate cancer or castration-resistant prostate cancer based on the determination by the method according to any one of [1] to [16] above.
  • [25] Diagnosing whether the prostate cancer that the subject is suffering from is castration-resistant prostate cancer based on the determination by the method according to any one of [1] to [16] above; How to decide treatment course.
  • a method of detecting prostate-specific antigen (PSA) present in serum derived from prostate cancer patients receiving medication and evaluating the effect of medication by comparing the detected PSA before and after medication A method of evaluation comprising determining the amount of (a) basic isoelectric point PSA or (b) desialylated PSA before and after dosing.
  • PSA prostate-specific antigen
  • a method of evaluation comprising determining the amount of (a) basic isoelectric point PSA or (b) desialylated PSA before and after dosing.
  • the method of [27] or [28] above, wherein whether or not administration is effective is determined based on a comparison of PSA before and after administration.
  • the present invention provides a new marker for prostate cancer and a method for detecting prostate cancer using the marker.
  • FIG. 1 shows the results of two-dimensional electrophoresis of seminal plasma derived from healthy subjects. The results of protein staining are shown. Circled spots represent 9 representative spots (0-8) that were positive for anti-PSA antibody.
  • FIG. 2 shows the results of two-dimensional electrophoresis of a cell lysate of prostate cancer cell LNCaP. The upper left figure is the result of protein staining. The lower left figure is the result of staining with an anti-PSA antibody. An enlarged view of the area surrounded by a square in the lower left figure is shown in the lower right figure. Spots that tested positive with anti-PSA antibody are circled. Also, the upper right panel is a three-dimensional image of the eight PSA-positive spots circled in the lower right panel.
  • FIG. 3 shows the results of two-dimensional electrophoresis of various samples (seminal plasma derived from healthy subjects, cell lysate of LNCaP cells, cell lysate of C4-2 cells, and cell lysate of PC-3 cells).
  • the left figure is the result of staining with an anti-PSA antibody. Shows a magnified view of where PSA-positive spots were detected.
  • the right figure is a three-dimensional image of each PSA-positive spot.
  • FIG. 4 shows the results of two-dimensional electrophoresis of serum derived from prostate cancer patients. Serum derived from hormone-sensitive prostate cancer patients (serum A) and sera derived from castration-resistant prostate cancer patients (serums B and C) were used.
  • FIG. 5 is a three-dimensional image (left) of PSA-positive spots resulting from the prostate cancer patient serum in FIG. 4 and a comparison of the detected spot intensities (right).
  • FIG. 6 shows the results of confirming the isoelectric point shift of PSA when the serum of castration-resistant prostate cancer patients was treated with sialidase.
  • the left figure is the result of staining with an anti-PSA antibody, and shows an enlarged view of the locations where PSA-positive spots were detected.
  • the middle panel shows a three-dimensional image of a PSA-positive spot (left), and the right panel shows a comparison of the detected spot intensities.
  • FIG. 7 shows the results of comparing the intensity of PSA-positive spots using sera derived from hormone-sensitive prostate cancer patients and sera derived from castration-resistant prostate cancer patients.
  • the present inventors have successfully developed a fully automatic two-dimensional electrophoresis device (Auto 2D) as a highly sensitive and rapid quantitative pathological protein analyzer.
  • Pathological marker detection by 2D-WB two-dimensional electrophoresis-Western blot
  • 2D-WB two-dimensional electrophoresis-Western blot
  • pathological marker detection by 2D-WB can be performed at a level of 1/100 or less with high sensitivity, high precision, and fully automatic within 1 to 2 hours.
  • the present inventors have attempted to develop a system that can precisely and rapidly analyze the distribution and amount of prostate cancer marker proteins, including post-translational modifications.
  • One aspect of the present invention is whether a subject has or is suspected of having prostate cancer by detecting prostate specific antigen (PSA) present in a sample from the subject to be determined (hereinafter , except when it is clear that only one is indicated from the context before and after, collectively referred to as "suffering from prostate cancer”)), wherein the detected PSA is derived from a healthy subject
  • PSA prostate specific antigen
  • a subject is determined to have prostate cancer when the isoelectric point is basic compared to PSA present in prostatic fluid (hereinafter sometimes referred to as "normal PSA").
  • the isoelectric point is basic compared to normal PSA, for example, (1) the isoelectric point of at least a part of PSA derived from a subject is PSA derived from a healthy subject (preferably, the most basic (2) If the isoelectric point of PSA derived from a subject is basic, the isoelectric point of PSA derived from a healthy subject is basic (3) If the distribution of the isoelectric points of PSA derived from the subject is on the basic side compared to the distribution of the isoelectric points of PSA derived from healthy subjects, (4) 6 For example, when a PSA with an isoelectric point of 0.0 or more is detected.
  • step (b) Perform two-dimensional electrophoresis on free PSA present in the sample (free PSA originally present in free form and free PSA obtained in step (a)), and determine each PSA based on the isoelectric point and molecular weight
  • step (c) detecting the presence of (one or more) spots of PSA detected on the basic side compared to the (one or more) spots of control PSA.
  • a method of detecting prostate-specific antigen (PSA) present in a sample from a subject comprising the step of confirming.
  • the control PSA is preferably PSA present in prostatic fluid derived from a healthy subject.
  • Another aspect of the present invention further comprises step (d): determining that the subject is suffering from prostate cancer when a PSA spot is detected on the basic side in step (c);
  • a method for determining that a subject has prostate cancer comprising:
  • Another aspect of the present invention determines that the subject is suffering from castration-resistant prostate cancer according to the degree of basicity of the PSA spots detected on the basic side in step (d). It is a method that includes
  • Subject-derived samples used in the methods of the present invention are body fluids derived from mammals, preferably humans.
  • the body fluid is not particularly limited as long as PSA can be detected therein, but urine or blood is preferred, and blood is particularly preferred.
  • blood include, but are not limited to, peripheral blood.
  • blood is preferably serum.
  • step (a) About 80% of PSA, for example, exists in blood as a complex with ⁇ -antichymotrypsin (ACT). Therefore, in order to detect the target PSA with high sensitivity, in step (a), PSA is released from the ACT-PSA complex present in the sample to generate free PSA (fPSA).
  • the means for releasing PSA is not particularly limited as long as it can release PSA from the ACT-PSA complex, but it is preferable to release by adding a reagent for ease of operation.
  • the reagent to be used is not particularly limited as long as it can achieve the release of PSA and does not hinder the subsequent detection of PSA, but ethanolamine is preferably used.
  • Conditions for ethanolamine treatment are not particularly limited as long as they cleave the ACT-PSA complex and generate a sufficient amount of free PSA for detection. , 15 hours or more, preferably about 24 hours. By treatment at about 37° C. for about 24 hours, most of ACT-PSA can be cleaved and free PSA can be produced.
  • pretreatments include, but are not limited to, affinity columns, PSA immunoprecipitation, and various albumin/IgG removal procedures.
  • albumin/IgG account for 60% or more of proteins in human serum, removal of these proteins can improve the separation accuracy in the two-dimensional electrophoresis in step (b).
  • the serum is desalted by ultrafiltration, and further concentrated by ultrafiltration and freeze-drying. preferably.
  • the subject-derived sample is preferably albumin/IgG-removed and then ethanolamine-treated human serum, more preferably further desalted by ultrafiltration and concentrated by ultrafiltration and lyophilization. human-derived serum.
  • step (b) Two-dimensional electrophoresis on free PSA (fPSA) obtained in step (a) (including free PSA originally present in the sample and free PSA released from the complex by step (a)) to detect PSA in the sample by separating the PSA.
  • fPSA free PSA
  • two-dimensional electrophoresis for example, separation is performed according to the isoelectric point in the first dimension and the molecular weight in the second dimension. This allows the PSA in the sample to be separated based on isoelectric point and molecular weight. Since a sample usually contains a plurality of types of PSA with different isoelectric points and molecular weights, the fPSA obtained in step (a) can be detected as a plurality of spots in step (b).
  • PSA spots 5 or more types can be detected, and 8 or more types of PSA spots can be detected depending on the detection sensitivity.
  • Two-dimensional electrophoresis can be performed using a commercially available electrophoresis apparatus and reagents, but is preferably performed using Auto 2D developed by the inventors of the present invention to obtain high reproducibility.
  • Each separated PSA can be detected by appropriately using a known method. Although not limited to this, it can be detected using, for example, Western blotting. Western blotting and detection conditions can be performed by appropriately referring to known techniques. It is convenient and preferable to use an antibody against PSA for detection.
  • Step (c) is a step of confirming the presence of the PSA spot(s) detected on the basic side compared to the control PSA spot(s).
  • the spots detected in step (b) are compared with the spots of control (one or more) PSA and the internal standard (fluorescence) labeled protein added during electrophoresis, and the spots detected is on the more basic side than the control, it is determined that there is a spot more basic than the control.
  • the case where the detected spot is basic with respect to the control includes, but is not limited to, various isoelectric points at which a PSA with a basic isoelectric point that is not detected in the control PSA is detected.
  • the isoelectric point of PSA which has the highest abundance among PSA, is basic compared to normal PSA, the fraction with a basic isoelectric point is more than normal PSA, distribution of multiple spots , the distribution of spots is found to be on the basic side (shifted to the basic side) compared to the control.
  • the fraction having a basic isoelectric point is more than the control PSA, for example, specific isoelectric points (but not limited to, for example, isoelectric points 5.8, 5.9, 6.0 , 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, or 6.5, but preferably about 6.) (hereinafter referred to as "reference isoelectric point”) , the amount of PSA with an isoelectric point equal to or higher than the reference isoelectric point is greater than the control PSA, the amount of PSA with an isoelectric point equal to or higher than the reference isoelectric point (hereinafter referred to as "basic side PSA") By comparing the amount of PSA having an isoelectric point (hereinafter referred to as "acidic PSA”), it is confirmed that the ratio of basic PSA to acidic PSA is greater than that of control PSA.
  • specific isoelectric points but not limited to, for example, isoelectric points 5.8, 5.9, 6.0 , 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, or 6.5, but
  • An arbitrary determination method can be appropriately selected according to the actual conditions of the measurement, such as the measurement accuracy and the purpose of the measurement. For example, by confirming any of the above phenomena, if the spot detected from the sample is on the basic side compared to the control PSA, the presence of the PSA spot on the basic side (or the presence is confirmed to judge or determine.
  • a control can be PSA derived from prostatic fluid of a healthy subject, preferably pretreated to free PSA, which usually produces multiple spots. Mixtures of proteins with various isoelectric points and molecular weights prepared to produce spots similar to spots of PSA derived from prostatic fluid of healthy subjects (sometimes referred to as "control spots") can also be used as controls. . Also, if the electrophoresis conditions are constant, a control spot may be determined in advance and the measurement target may be compared with it.
  • step (d) In step (d), when a sample-derived PSA spot is detected on the more basic side than the control spot in step (c), it is determined that the subject from which the sample is derived has or is suspected of having prostate cancer. Furthermore, in step (d), depending on the degree of PSA detected on the more basic side, prostate cancer can be determined to be castration-resistant (hormone treatment-resistant) prostate cancer or suspected thereof. can.
  • Detected on the more basic side means, for example, PSA with a basic isoelectric point that is not detected in PSA derived from hormone-sensitive prostate cancer patients (e.g., isoelectric points of 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 or 7.0 or more PSA) is detected, there are many fractions with more basic isoelectric points, the distribution of the isoelectric points of PSA is more basic It is in, etc. can be given. More fractions whose isoelectric points are basic means, for example, when a reference isoelectric point is set and the amount of PSA having an isoelectric point equal to or higher than the reference isoelectric point is half or more of the total PSA, etc. can be given. Examples of the reference isoelectric point referred to here include 6.5, 6.6 and 6.7.
  • the present invention using highly sensitive and highly specific markers makes it possible to detect whether or not a subject has prostate cancer using the serum of a subject. can be used to identify castration-resistant patients.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The method of the present invention provides a highly specific and highly sensitive detection method for prostate cancer by a simple procedure based on a sample pretreatment method, a separation method, and a detection method.
  • the method of the present invention also includes a pretreatment method based on a specific separation/concentration method of the PSA complex in serum, and a method of isoelectric point and molecular weight separation (two-dimensional electrophoresis, etc.). It is also a quantitative and high-precision analytical method for post-translational modification molecules.
  • One of the most preferred embodiments of the present invention comprises the following steps: step (i): subjecting a human-derived serum sample to albumin/IgG removal treatment; Step (iii): The obtained free PSA is subjected to two-dimensional electrophoresis using Auto 2D (first dimension: isoelectric point, Second dimension: molecular weight) to separate PSA and detect spots of PSA, step (iv): confirming the presence of PSA detected on the basic side compared to control PSA, and Step (v): detection of prostate cancer, including the step of determining that the subject (human) from whom the serum is derived is afflicted with prostate cancer when PSA is detected on the basic side in step (iv) The method.
  • step (i) subjecting a human-derived serum sample to albumin/IgG removal treatment
  • Step (iii): The obtained free PSA is subjected to two-dimensional electrophoresis using Auto 2D (first dimension: isoelectric point, Second dimension: molecular weight) to separate PSA
  • One of the most preferred embodiments of the present invention includes determining that a subject has castration-resistant prostate cancer by confirming the presence of PSA detected on the more basic side using the above method. , a method for the detection of castration-resistant prostate cancer.
  • a method for the detection of castration-resistant prostate cancer For example, according to the method of the present invention, six or more PSA spots of 35 KD separated by isoelectric points are detected. It can be determined that there is Therefore, these PSA spot groups are quantified, and their distribution and profile serve as markers for castration resistance of prostate cancer.
  • Another aspect of the present invention is the determination of prostate cancer by detecting PSA having a basic isoelectric point compared to PSA present in prostatic fluid derived from a healthy subject (normal PSA).
  • PSA present in a sample derived from a subject is detected, and when the detected PSA has an isoelectric point on the basic side compared to normal PSA, the subject is diagnosed with prostate cancer. is determined to be Also, when the isoelectric point of the detected PSA is on the more basic side, it can be determined that the animal is castrate-resistant.
  • PSA with an isoelectric point on the basic side of that of normal PSA is quantified, and its distribution and profile serve as a marker for prostate cancer and a marker for castration resistance of prostate cancer. Therefore, the present invention is also a marker for prostate cancer and castration resistance of prostate cancer.
  • the method for measuring the isoelectric point of PSA in the sample is not limited to this, for example, it can be measured using the two-dimensional electrophoresis described above.
  • the PSA in the sample can be crudely purified using a conventional method, and then measured using a separation/analysis technique based on the isoelectric point such as isoelectric focusing.
  • Another embodiment of the present invention detects PSA present in a sample derived from a subject and confirms the isoelectric point of PSA, and when PSA having an isoelectric point of a specific isoelectric point or higher is detected is a method of determining that a subject is suffering from prostate cancer.
  • Subject-derived samples are the same as described above.
  • Specific isoelectric points used for prostate cancer determination include, for example, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, or 6.5, preferably 6.0, 6.1 or 6.2 can be mentioned, more preferably 6.0 can be mentioned.
  • PSA having an isoelectric point equal to or higher than a specific isoelectric point is detected, preferably when the detected value is high, it can be determined as prostate cancer.
  • PSA having a specific isoelectric point or higher for example, 6.5 or higher, is detected, preferably when the detected value is high, it can be determined that the subject has castration-resistant prostate cancer.
  • PSA having an isoelectric point equal to or higher than the isoelectric point in the sample can be confirmed using, for example, two-dimensional electrophoresis as described above, although the method is not limited to this.
  • the PSA in the sample is separated using a conventional method, for example, by an antibody affinity column, and then using a separation/analysis method based on the isoelectric point such as isoelectric focusing. The presence of PSA can be confirmed.
  • Another aspect of the present invention is the detection of PSA present in a sample from a subject and the degree of desialylation of PSA, wherein if desialylated PSA is detected, the subject has prostate cancer. It is a method for determining that a person has cancer. Also, if the degree of desialylated PSA is high, the subject can be determined to have castration-resistant prostate cancer. Subject-derived samples are the same as described above.
  • PSA in the sample is desialylated can be confirmed using, for example, two-dimensional electrophoresis as described above, but not limited to this. Since the isoelectric point of PSA is shifted by desialylation, the presence of desialylated PSA can be confirmed by confirming this shift.
  • desialylated PSA when desialylated PSA is detected, it is not limited to this, but for example, PSA with an isoelectric point shifted by desialylation (PSA with an isoelectric point not detected in normal PSA) is detected. PSA having an isoelectric point expected to be detected in normal PSA is not detected or is detected in a reduced amount.
  • PSA having an isoelectric point expected to be detected in normal PSA is not detected or is detected in a reduced amount.
  • the degree of desialylated PSA is high, for example, a large amount of PSA with a specific shifted isoelectric point is confirmed, or the amount of total PSA protein and sialic acid is quantified and When the amount of sialylation is determined and compared, there may be a case where the numerical value is below a certain numerical value.
  • Another aspect of the present invention is a method for determining a subsequent treatment policy based on prostate cancer or castration-resistant prostate cancer determined by any of the above methods. . That is, the present invention is also a method for determining prostate cancer for determining treatment strategies.
  • the treatment strategy is not limited to this, for example, if prostate cancer is determined to be not castration-resistant, that is, if it is determined to be hormone-sensitive, hormone therapy is performed, while castration-resistant prostate is treated. chemotherapy is selected.
  • Another aspect of the present invention is to detect prostate-specific antigen (PSA) present in serum from a prostate cancer patient receiving medication by any of the methods described above, and detect the detected PSA. is a method of evaluating the effect of medication by comparing the .
  • PSA prostate-specific antigen
  • Another aspect of the present invention is to evaluate the efficacy of a candidate therapeutic agent for prostate cancer by any of the methods described above. It is a method of evaluating or screening a novel therapeutic agent.
  • PSA prostate-specific antigen
  • Example 1 Detection of PSA by two-dimensional electrophoresis using seminal plasma derived from healthy subjects
  • Seminal plasma derived from healthy subjects (protein amount 10 ⁇ g) was subjected to a fully automatic two-dimensional electrophoresis apparatus (Auto 2D, Sharp Manufacturing System (manufactured by Co., Ltd.), two-dimensional electrophoresis and western blotting were performed according to the manufacturer's instructions.
  • Electrophoresis conditions are as follows. 1st dimension: pH 3-10, IPG gel, isoelectric focusing (IEF): 90 min; 2nd dimension: 10% polyacrylamide gel, SDS-PAGE: ⁇ 40 min.
  • PSA spots were detected (primary antibody: polyclonal rabbit anti-human PSA antibody (Dako) or monoclonal mouse anti-human PSA antibody (R & D), secondary antibody: Cy5-goat-anti-Rabbit IgG, or Cy5-goat-anti-mouse IgG).
  • primary antibody polyclonal rabbit anti-human PSA antibody (Dako) or monoclonal mouse anti-human PSA antibody (R & D)
  • secondary antibody Cy5-goat-anti-Rabbit IgG, or Cy5-goat-anti-mouse IgG.
  • Cy2 labeled trypsin inhibitor complex PI: 4.5, MW: 83 KDa
  • carbonic anhydrase PI: 4.5, MW: 83 KDa
  • Example 2 Detection of PSA from LNCap cells by two-dimensional electrophoresis
  • PSA was detected using prostate cancer cells (LNCaP).
  • LNCaP prostate cancer cells
  • a cell lysate was prepared from LNCaP cells, which are hormone therapy-sensitive prostate cancer cells, and two-dimensional electrophoresis was performed in the same manner as in Example 1 using 10 ⁇ g of the cell lysate in terms of protein amount.
  • a polyclonal anti-PSA antibody was used as the primary antibody. The results are shown in FIG. Eight or more spots that reacted with the anti-PSA antibody were confirmed.
  • Example 3 Detection of PSA by two-dimensional electrophoresis using various samples
  • seminal plasma derived from healthy subjects cell lysate of LNCaP cells, cell lysate of C4-2 cells, and PC
  • Each of the -3 cell lysates was subjected to two-dimensional electrophoresis and Western blotting followed by detection of PSA spots using an anti-PSA antibody.
  • the results are shown in FIG.
  • PSA spots (distribution) derived from seminal plasma of healthy subjects and PSA spots derived from prostate cancer cells were compared, PSA spots (distribution) derived from prostate cancer cells (LNCaP cells and C4-2 cells) were found. was confirmed to be shifted to the basic side.
  • the shift to the basic side was more pronounced in C4-2, which is a hormone therapy-resistant prostate cancer cell.
  • Example 4 Measurement of molecular weight of PSA present in patient serum
  • Patient serum was separated into fractions with molecular weights of 300 kDa or more, 100-300 kDa, 50-100 kDa, and 50 kDa or less by a filter method.
  • Each fraction was treated in the same manner as in Example 1, except that a desalting step by ultrafiltration before electrophoresis and a concentration step by freeze-drying were added to the method, followed by two-dimensional electrophoresis to detect PSA. rice field.
  • Desalination by ultrafiltration was carried out by washing with pure water, freeze-drying, re-dissolving in a minute amount of pure water of about 20 microliters, and concentrating.
  • Example 5 Detection of PSA by two-dimensional electrophoresis using patient samples (1) Using serum derived from prostate cancer patients, PSA contained in the serum was detected. As a control, seminal plasma derived from a healthy subject was used. Since the PSA concentration in blood is only on the order of ng per mL, albumin and IgG were removed as a pretreatment of serum. Depletion was performed using GE's albumin/IgG depletion kit according to the manufacturer's protocol. Then, ethanolamine treatment (0.1 M, 40° C., 24 hours) was performed, followed by neutralization with hydrochloric acid, desalting by ultrafiltration, concentration by freeze-drying, and two-dimensional electrophoresis in the same manner as in Example 1.
  • the evaluation method is not limited to this, but when the ratio of the sum of intensities of 1-3 spots (A) and the sum of intensities of 4-5 (B) is calculated, serum from hormone therapy-sensitive patients , A>B, whereas sera from castration-resistant patients had A ⁇ B or A ⁇ B.
  • the intensity of spots on the acidic side (1 to 3) was even higher. This indicates that the proportion of PSA on the basic side increases as castration resistance increases.
  • Example 6 Isoelectric point change of PSA by sialidase treatment
  • PSA is known to undergo post-translational sugar chain modification and contain sialic acid, which is an acidic sugar. Therefore, the effect of sialidase was confirmed by two-dimensional electrophoresis using seminal plasma from a healthy subject and serum from a hormone therapy-sensitive high-PSA prostate cancer patient. After sialidase treatment of seminal plasma from a healthy subject and albumin/IgG-removed serum from a prostate cancer patient, desalting by ultrafiltration and concentration by freeze-drying, two-dimensional analysis was performed in the same manner as in Example 1. Electrophoresis was performed to detect PSA. The results are shown in FIG.
  • Example 7 Detection of PSA by two-dimensional electrophoresis using patient samples (2) Two-dimensional electrophoresis was performed in the same manner as in Example 5 using 4 samples each of serum derived from hormone therapy-sensitive prostate cancer patients and serum derived from castration-resistant prostate cancer patients to detect PSA. gone. A comparison of the detected spot intensities was then made. Specifically, the ratio of the sum of detected intensities of spots 1 to 3 (A) and the sum of detected intensities of 4 to 5 spots (B) was determined. The results are shown in FIG. In sera from hormone therapy-sensitive patients, A>B, with an average ratio of A to B of about 1.7, whereas in sera from castration-resistant patients, A ⁇ B, with A and B The average B ratio was about 0.7. It was confirmed that clearly basic PSA spots increased in castration-resistant patients.
  • the present invention is useful as a method for detecting prostate cancer based on novel markers.
  • the present invention can also be used as a method for determining the sensitivity of conventional prostate cancer treatment (hormone therapy) and determining the direction of patient treatment at an early stage, and as a method for determining the effect of novel therapeutic agents for prostate cancer. Useful.

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Abstract

本発明は、前立腺がんの新たなマーカー及び、該マーカーを用いた前立腺がんの検出方法を提供することを目的とする。本発明により以下の工程からなる前立腺がんの判定方法が提供される：（ａ）対象由来のサンプル中に存在するＰＳＡ－ＡＣＴ複合体からＰＳＡを遊離させる工程、（ｂ）工程（ａ）で得た遊離ＰＳＡに対し２次元電気泳動を実施してＰＳＡを分離しＰＳＡのスポットを検出する工程、及び（ｃ）コントロールＰＳＡのスポットに比べて塩基性側に検出されるＰＳＡのスポットの存在を確認する工程。

Description

前立腺がんの新規マーカー
　本発明は、前立腺がんの新規マーカーに関する。本発明はまた、該マーカーを用いた、前立腺がんの検出方法に関する。
　わが国の前立腺がんは、死亡数は男性がん死亡の５％、一方罹患数は男性がんの約１割を占め、近年の死亡数の増加率はすべてのがんの中で最も高い。前立腺がんの早期診断と治療予後予測では前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）検査が広く使用されているが、測定法は高感度ながら特異度が低く、生物学的悪性度の区別も困難である。それ故、偽陽性が出やすく、超音波検査や直腸診などの精密検査が必要となる。また、前立腺がんの確定診断には主に生検などの侵襲的な検査が必要とされ、患者への負担が大きい。頻繁に生じる偽陽性は、無駄な医療行為や患者への負担を生じ、患者の大きなストレスと経済的なロスを生じる。さらに、確定診断後の治療は主に外科的摘出術、放射線治療、ホルモン療法等によるが、これらの予後や感受性の診断マーカーもＰＳＡ以外には存在しない。従って、早期診断や治療効果判定のための侵襲度が低くかつ特異性の高い診断システムの構築は必要不可欠であり、患者の苦痛と経済的効率の局面からも早急な改善策が求められている。
　２０１０年における英国のメタアナリシス調査にて検診群でのＰＳＡ検査介入による死亡率低下が示されたことから、日本泌尿器科学会もこれを推奨している。Takakuraらは、液体クロマトグラフィー質量分析計を用いた検討で新たな腫瘍マーカーの候補を報告している(非特許文献１：ISRN Oncol 2012, 768190）。また、Jungらの報告（非特許文献２：ClinChem 2004, 50:2292-2301)によると、２次元電気泳動におけるＰＳＡの分画パターンにより悪性度鑑別の可能性が示唆されている。しかし、悪性の中でもホルモン療法感受性のものと去勢抵抗性の鑑別に関しては報告されていない。また、Gloriaらの報告（非特許文献３：Glycobiology 2006, 16:132-145）によると、ＰＳＡは２次元電気泳動を行うことで様々なパターンを呈する事が示されている。さらに、このパターンの違いにより良性病変と悪性病変を区別することが可能かもしれないとの報告もなされている。しかしながら、それらを明確に区別できたとの報告はない。このように、先行論文では、前立腺肥大や前立腺炎と前立腺がんの区別を試みたものはあるが、去勢抵抗性を区別した報告はない。また、これらの方法では、実質的に前立腺肥大や前立腺炎の患者に前立腺がんが生じていないと確定することは困難である。
　ＰＳＡは分子量約３万の糖タンパク質であり、アスパラギン結合型（Ｎ型）糖鎖を有し、糖鎖の末端がシアル酸化されていることが知られている。また、前立腺がん患者由来のＰＳＡでは、Ｎ－アセチルガラクトサミンとＮ－アセチルグルコサミンが結合した２糖であるＬａｃｄｉＮＡｃ構造を有すると報告されている。
Takakuraら、ISRN Oncol 2012, 768190 Jungら、Clin Chem 2004, 50:2292-2301 Gloriaら、Glycobiology 2006, 16:132-145
　本発明の目的は、前立腺がんの新規マーカーを用いた前立腺がんの検出方法を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、特定の性質を有するＰＳＡが前立腺がん患者の血液中に存在することを見いだし、本発明を完成した。
　本発明は以下を含むものである。
［１］対象由来のサンプル中に存在する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を検出することによって対象が前立腺がんに罹患している又はその疑いがあると判定するための方法であって、前記対象由来のＰＳＡの等電点が、健常者由来のＰＳＡと比較して塩基性側である場合に、対象が前立腺がんに罹患している又はその疑いがあると判定することを特徴とする判定方法。
［２］対象由来のＰＳＡの少なくとも一部の等電点が健常者由来のいずれのＰＳＡの等電点より塩基性である場合、対象由来のＰＳＡの等電点の塩基性である分画が健常者由来のＰＳＡの等電点が塩基性である分画に比べて多い場合、対象由来のＰＳＡの等電点の分布が前記健常者由来のＰＳＡの等電点の分布に比べ塩基性側にある場合、又は６．０以上の等電点をもつＰＳＡが検出された場合に、前記対象由来のＰＳＡの等電点が健常者由来のＰＳＡと比較して塩基性側であると判断する、上記［１］に記載の判定方法。
［３］対象由来のＰＳＡの等電点の塩基性である分画が健常者由来のＰＳＡの等電点が塩基性である分画に比べて多い場合、又は対象由来のＰＳＡの等電点の分布が前記健常者由来のＰＳＡの等電点の分布に比べ塩基性側にある場合に、前記対象由来のＰＳＡの等電点が健常者由来のＰＳＡと比較して塩基性側であると判断する、上記［１］に記載の判定方法。
［４］前記サンプルは対象由来の血清である上記［１］～［３］のいずれか一つに記載の方法。
［５］前記サンプルはエタノールアミンによって処理された対象由来の血清である上記［１］～［４］のいずれか一つに記載の方法。
［６］前記対象由来のＰＳＡの等電点の塩基性の程度に基づいて、前記対象がさらに去勢抵抗性前立腺がんであると判定する上記［１］～［５］のいずれか一つに記載の方法。
［７］６．５以上の等電点をもつＰＳＡが検出された場合に、前記対象がさらに去勢抵抗性前立腺がんであると判定する上記「１」～［５］にいずれか一つに記載の方法。
［８］対象由来のサンプル中に存在する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を検出することによって対象が前立腺がんに罹患している又はその疑いがあると判定する方法であって、対象由来のＰＳＡは、健常者由来のＰＳＡと比較して脱シアル酸化されている場合に対象が前立腺がんに罹患している又はその疑いがあると判定することを特徴とする方法。
［９］前記対象由来のサンプルは、対象由来の血清である、上記［８］に記載の方法。
［１０］前記対象由来のサンプルは、エタノールアミンによって処理された対象由来の血清である、上記［８］に記載の方法。
［１１］前記対象由来のＰＳＡの脱シアル酸化の程度に基づいて、前記対象がさらに去勢抵抗性前立腺がんであると判定する上記［８］～［１０］のいずれか一つに記載の方法。
［１２］対象患者が前立腺がんに罹患している又はその疑いがあると診断するために利用する情報を取得する方法であって、前立腺がんの疑いがある患者由来の血清中に存在する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を検出し、検出した対象患者由来のＰＳＡの等電点が、健常者由来のＰＳＡと比較して塩基性側であるか否かを決定する方法。
［１３］対象由来のＰＳＡの少なくとも一部の等電点が健常者由来のいずれのＰＳＡの等電点より塩基性である場合、対象由来のＰＳＡの等電点の塩基性である分画が健常者由来のＰＳＡの等電点が塩基性である分画に比べて多い場合、対象由来のＰＳＡの等電点の分布が前記健常者由来のＰＳＡの等電点の分布に比べ塩基性側にある場合、又は６．０以上の等電点をもつＰＳＡが検出された場合に、前記対象由来のＰＳＡの等電点が健常者由来のＰＳＡと比較して塩基性側であると判断する、上記［１２］に記載の方法。
［１４］前記患者由来の血清がエタノールアミンによって処理された患者由来の血清である上記［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］対象患者が前立腺がんに罹患している又はその疑いがあると診断するために利用する情報を取得する方法であって、前立腺がんの疑いがある患者由来の血清中に存在する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を検出し、検出したＰＳＡが健常者由来のＰＳＡと比較して脱シアル酸化されているか否かを決定する方法。
［１６］前記患者由来の血清がエタノールアミンによって処理された患者由来の血清である上記［１５］に記載の方法。
［１７］対象由来のサンプル中に存在する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）対象由来のサンプル中に存在するＰＳＡ－ＡＣＴ複合体からＰＳＡを遊離させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得た遊離ＰＳＡに対し２次元電気泳動を実施して異なる等電点を持つＰＳＡを分離し各々のＰＳＡのスポットを検出する工程、及び
（ｃ）コントロールＰＳＡの（１又は複数の）スポットに比べて塩基性側に検出されるＰＳＡの（１又は複数の）スポットの存在を確認する工程、
を含む方法。
［１８］前記対象由来のサンプルは、ヒト由来の血清である、上記［１７］に記載の方法。
［１９］工程（ａ）の前に、血清に対してアルブミン／ＩｇＧ除去処理を行うことを含む上記［１７］又は［１８］に記載の方法。
［２０］前記コントロールＰＳＡは、ヒト健常者由来のＰＳＡである、上記［１７］～［１９］のいずれか一つに記載の方法。
［２１］工程（ａ）がエタノールアミンを用いて行われる上記［１７］～［２０］のいずれか一つに記載の方法。
［２２］上記［１７］～［２１］のいずれか一つに記載の方法において、前記工程（ｃ）において塩基性側にＰＳＡスポットが検出された場合、対象が前立腺がんに罹患していると判定する方法。
［２３］前記工程（ｃ）において、コントロールＰＳＡのスポットに比べて塩基性側に検出されるＰＳＡのスポットの程度に応じて、対象がさらに去勢抵抗性の前立腺がんに罹患しているか否かを決定する上記［２２］に記載の方法。
［２４］上記［１］～［１６］のいずれか一つに記載の方法による判定に基づいて、対象が前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんに罹患していると診断する方法。
［２５］上記［１］～［１６］のいずれか一つに記載の方法による判定に基づいて、対象が罹患している前立腺がんが去勢抵抗性前立腺がんであるか否かを診断し、治療方針を決定する方法。
［２６］前記治療方針が、ホルモン治療を行うか化学療法を行うかの決定である、上記［２５］に記載の方法。
［２７］投薬を受けている前立腺がん患者由来の血清中に存在する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を検出し、検出したＰＳＡを投薬の前後において比較することにより投薬の効果を評価する方法であって、投薬の前後において、（ａ）等電点が塩基性であるＰＳＡの量の減少、又は（ｂ）脱シアル酸化されたＰＳＡの量の減少を確認することを含む評価方法。
［２８］投薬前後の前記ＰＳＡの比較は２次元電気泳動を用いて行なわれる上記［２７］に記載の方法。
［２９］投薬前後のＰＳＡの比較に基づいて、投薬が有効であるか否かを判定する上記［２７］又は［２８］に記載の方法。
　本発明により、前立腺がんの新たなマーカー及び、該マーカーを用いた前立腺がんの検出方法が提供される。
図１は、健常者由来の精漿を２次元電気泳動した結果である。タンパク染色した結果を示している。円で囲んだスポットは、抗ＰＳＡ抗体で陽性となった代表的なスポット９個（０－８）を示している。 図２は、前立腺がん細胞ＬＮＣａＰの細胞溶解物について２次元電気泳動を行った結果である。左上図は、タンパク染色した結果である。左下図は、抗ＰＳＡ抗体で染色した結果である。左下図の四角で囲んだ部分の拡大図を右下図に示した。抗ＰＳＡ抗体で陽性を示したスポットは円で囲んである。また、右上図は、右下図の丸で囲んだ８個のＰＳＡ陽性スポットの３次元イメージである。 図３は、各種サンプル（健常者由来精漿、ＬＮＣａＰ細胞の細胞溶解物、Ｃ４－２細胞の細胞溶解物、及びＰＣ－３細胞溶解物）について２次元電気泳動を行った結果である。左図は、抗ＰＳＡ抗体で染色した結果である。ＰＳＡ陽性スポットが検出された場所の拡大図を示している。右図は、それぞれのＰＳＡ陽性スポットの３次元イメージである。 図４は、前立腺がん患者由来の血清について２次元電気泳動を行った結果である。ホルモン感受性前立腺がん患者由来の血清（血清Ａ）、去勢抵抗性前立腺がん患者由来の血清（血清Ｂ及びＣ）を用いた。対照として、健常者由来精漿（Seminal Plasma）を用いた。図は、抗ＰＳＡ抗体で染色した結果であり、ＰＳＡ陽性スポットが検出された場所の拡大図を示している。 図５は、図４の前立腺がん患者血清の結果のＰＳＡ陽性スポットの３次元イメージ（左）及びその検出されたスポット強度の比較（右図）である。 図６は、去勢抵抗性前立腺がん患者の血清をシアリダーゼ処理した場合のＰＳＡの等電点シフトを確認した結果である。左図は、抗ＰＳＡ抗体で染色した結果であり、ＰＳＡ陽性スポットが検出された場所の拡大図を示している。中図は、ＰＳＡ陽性スポットの３次元イメージ（左）、及び右図はその検出されたスポット強度の比較を示している。 図７は、ホルモン感受性前立腺がん患者由来の血清と去勢抵抗性前立腺がん患者由来の血清用いて、ＰＳＡ陽性スポットの強度の比較した結果である。
　以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法及び材料とともに説明する。なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料及び方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物及び特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
　本明細書中で、「Ｘ～Ｙ」という表現を用いた場合は、下限としてＸを上限としてＹを含む意味で、或いは上限としてＸを下限としてＹを含む意味で用いられる。
　本発明者らは、高感度かつ迅速な定量的病態蛋白質解析装置として全自動２次元電気泳動装置 (Ａｕｔｏ ２Ｄ）の開発に成功した。２Ｄ－ＷＢ（２次元電気泳動－ウェスタンブロット）による病態マーカー検出は、今まで莫大な時間と費用と技術を要し、検診や通常診療には導入困難であった。Ａｕｔｏ ２Ｄを用いると、２Ｄ－ＷＢによる病態マーカー検出が１００分の１以下の量で高感度高精度かつ全自動で１－２時間以内に行うことが可能となった。
　本発明者らは、前立腺がんマーカー蛋白質の翻訳後修飾を含む分布・量を精密かつ迅速に解析できるシステム開発を試み、血清、前立腺液、前立腺がん細胞より、前立腺がん特異的ＰＳＡの翻訳後修飾（糖鎖、リン酸化、酸化、会合体、蛋自分解物等）スポットが２Ｄチップ上に再現性よく３２種類以上検出（全て質量分析による同定済み）されることを見いだした。そして、それらのスポットは、正常とがん、さらにはＡＲ阻害剤やタキソール等の抗がん剤やホルモン療法の感受性有無等を区別できる特異的なプロファイリングを示すことを見出した。
　本発明の一つの態様は、判定すべき対象由来のサンプル中に存在する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を検出することによって、対象が前立腺がんに罹患している又はその疑いがあるか（以下、前後の文脈から一方のみを指していることが明らかな場合を除き、まとめて「前立腺がんに罹患している」という）を判定する方法であって、検出したＰＳＡが、健常者由来の前立腺液中に存在するＰＳＡ（以下、「正常ＰＳＡ」という場合がある）と比較して等電点が塩基性である場合に対象が前立腺がんに罹患していると判定する。ここで、正常ＰＳＡと比較して等電点が塩基性であるとは、例えば、（１）対象由来のＰＳＡの少なくとも一部の等電点が、健常者由来のＰＳＡ（好ましくは、最も塩基性である健常者由来のＰＳＡ）と比較して塩基性である場合、（２）対象由来のＰＳＡの等電点が塩基性である分画が健常者由来のＰＳＡの等電点が塩基性である分画に比べて多い場合、（３）対象由来のＰＳＡの等電点の分布は、健常者由来のＰＳＡの等電点の分布に比べ、塩基性側にある場合、（４）６．０以上の等電点をもつＰＳＡが検出された場合、を例示できる。
　本発明の他の一つの態様は、以下の工程：工程（ａ）：対象由来のサンプル中に存在するＰＳＡ－ＡＣＴ（ＰＳＡ－α１アンチキモトリプシン）複合体からＰＳＡを遊離させる工程、工程（ｂ）：サンプル中に存在する遊離ＰＳＡ（もともと遊離型で存在していた遊離ＰＳＡ及び工程（ａ）で得た遊離ＰＳＡ）に対し２次元電気泳動を実施し、等電点及び分子量に基づいて各ＰＳＡを分離してＰＳＡのスポットを検出する工程、及び工程（ｃ）：コントロールＰＳＡの（１又は複数の）スポットに比べて塩基性側に検出されるＰＳＡの（１又は複数の）スポットの存在を確認する工程、を含む対象由来のサンプル中に存在する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を検出する方法である。ここでコントロールＰＳＡとは、好ましくは、健常者由来の前立腺液中に存在するＰＳＡである。
　本発明の他の一つの態様は、さらに、工程（ｄ）：工程（ｃ）において塩基性側にＰＳＡのスポットが検出された場合、対象が前立腺がんに罹患していると判定する工程、を含む対象が前立腺がんに罹患していると判定する方法である。
　本発明の別の一つの態様は、工程（ｄ）において塩基性側に検出されるＰＳＡのスポットの塩基性の程度に応じて、対象が去勢抵抗性前立腺がんに罹患していると判定することを含む方法である。
　以下、それぞれについて説明する。
　本発明の方法で用いる対象由来のサンプルは、哺乳動物、好ましくはヒト由来の体液である。体液としては、その中にＰＳＡが検出できる体液であれば特に制限がないが、好ましくは尿又は血液、特に好ましくは血液である。血液としてはこれに限定されないが例えば末梢血をあげあることができる。本発明の方法において用いる場合は、血液は、血清であることが好ましい。
工程（ａ）
　ＰＳＡは、例えば血液中においては、その８割程度がαアンチキモトリプシン（ＡＣＴ）との複合体として存在する。そこで、感度良く目的のＰＳＡの検出を行うために、工程（ａ）において、サンプル中に存在するＡＣＴ－ＰＳＡ複合体からＰＳＡを遊離させて遊離ＰＳＡ（ｆＰＳＡ）を生じさせる。ＰＳＡを遊離させるための手段は、ＡＣＴ－ＰＳＡ複合体からＰＳＡを遊離できる限り特に制限がないが、操作の簡便さより試薬を添加して遊離させるのが好ましい。用いる試薬は、ＰＳＡの遊離を達成できその後のＰＳＡの検出の障害にならない限り特に制限がないが、好ましくはエタノールアミンが用いられる。エタノールアミン処理の条件は、ＡＣＴ－ＰＳＡ複合体を切断し、検出に十分な量の遊離ＰＳＡを生じさせる条件であれば特に制限がないが、例えば、３７～４２℃、好ましくは約４０℃で、１５時間以上好ましくは約２４時間処理する方法をあげることができる。約３７℃で約２４時間処理することにより、大部分のＡＣＴ－ＰＳＡを切断でき、遊離ＰＳＡを産生することができる。
　サンプルとして血液（例えば血清）を用いる場合は、工程（ａ）の前にサンプルの前処理を行うことが好ましい。前処理としては、これに限定されないが、例えば、アフィニティカラム、ＰＳＡの免疫沈降、種々のアルブミン／ＩｇＧ除去手段をあげることができる。アルブミン／ＩｇＧ除去手段としては、各種の方法が報告されているとともに種々の装置やキットが販売されており、これらを適宜使用することができる。アルブミン及びＩｇＧは、ヒト血清中のたんぱく質の６０％以上を占めるので、これらを除去することにより、工程（ｂ）の２次元電気泳動での分離精度をあげることができる。
　また、本発明の方法においては、工程（ａ）においてＰＳＡ－ＡＣＴをエタノールアミンで処理して遊離のＰＳＡとした後に、血清を限外ろ過による脱塩、さらに、限外ろ過及び凍結乾燥により濃縮することが好ましい。
　対象由来のサンプルは、好ましくは、アルブミン／ＩｇＧ除去処理され、次いでエタノールアミン処理したヒト由来の血清であり、より好ましくはさらに、限外ろ過による脱塩、及び、限外ろ過及び凍結乾燥により濃縮したヒト由来の血清である。
工程（ｂ）
　工程（ａ）で得た遊離のＰＳＡ（ｆＰＳＡ）（もともとサンプル中に存在していた遊離のＰＳＡ、及び工程（ａ）により複合体から遊離させた遊離のＰＳＡを含む）に対し２次元電気泳動を実施し、ＰＳＡを分離することにより、サンプル中のＰＳＡを検出する。２次元電気泳動は、例えば、１次元目に等電点により、２次元目に分子量により分離を行う。これにより、サンプル中のＰＳＡを、等電点及び分子量に基づいて分離できる。通常、サンプル中には、等電点や分子量の異なる複数の種類のＰＳＡが存在しているので、工程（ａ）により得られたｆＰＳＡは、工程（ｂ）により複数のスポットとして検出できる。これに限定されないが、例えば、５種類以上、検出感度によっては８種類以上のＰＳＡのスポットが検出できる。２次元電気泳動は、市販の泳動装置及び試薬を用いて行うことができるが、好ましくは本発明者等により開発されたＡｕｔｏ ２Ｄを用いて行うことで高い再現性を得ることができる。分離された各ＰＳＡは、公知の方法を適宜用いて検出できる。これに限定されないが、例えば、ウエスタンブロティングを用い検出することができる。ウェスタンブロッティング及び検出の条件は、公知の技術を適宜参照して行うことができる。検出はＰＳＡに対する抗体を用いるのが簡便で好ましい。
　工程（ｃ）
　工程（ｃ）は、コントロールＰＳＡの（１又は複数の）スポットに比べて塩基性側に検出されるＰＳＡの（１又は複数の）スポットの存在を確認する工程である。工程（ｂ）で検出したＰＳＡの（１又は複数の）スポットをコントロールの（１又は複数の）ＰＳＡ及び電気泳動時に添加した内部標準の(蛍光)標識タンパク質のスポットと比較して、検出したスポットがコントロールより塩基性側である場合に、コントロールに対して塩基性のスポットが存在すると判定する。検出されたスポットがコントロールに対して塩基性である場合とは、これに限定されないが、例えば、コントロールＰＳＡでは検出されない塩基性の等電点をもつＰＳＡが検出される、種々の等電点をもつＰＳＡのなかで最も存在割合が多いＰＳＡの等電点が正常ＰＳＡに比較して塩基性である、等電点が塩基性である分画が正常ＰＳＡに比べて多い、複数のスポットの分布を比べた場合にスポットの分布がコントロールに比べて塩基性側にある（塩基性側にシフトしている）、などが確認された場合をあげることができる。等電点が塩基性である分画がコントロールＰＳＡに比べて多いとは、例えば、特定の等電点（これに限定されないが、例えば、等電点５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、又は６．５をあげることができるが、好ましくは約６である。）を基準とし（以下、「基準等電点」という）、基準等電点以上の等電点をもつＰＳＡの量がコントロールＰＳＡと比べて多い、基準等電点以上のＰＳＡ（以下、「塩基性側ＰＳＡ」という）の量と基準等電点未満の等電点をもつＰＳＡ（以下、「酸性側ＰＳＡ」という）の量を比較して酸性側ＰＳＡに対する塩基性側ＰＳＡの比がコントロールＰＳＡと比べて大きい、などが確認されることをあげることができる。測定精度や測定目的など、実際に行う測定の実情に合わせて任意の判断手法を適宜選択することができる。例えば、上記の何れかの現象を確認することにより、サンプルから検出されたスポットがコントロールＰＳＡに比べて塩基性側である場合は、塩基性側にＰＳＡスポットが存在すると（又は、存在が確認されたと）判断又は決定する。
　コントロールは、健常者の前立腺液から由来するＰＳＡ、好ましくは前処理により遊離のＰＳＡとしたものであり得、それは通常複数のスポットを生じる。健常者の前立腺液から由来するＰＳＡのスポット（「コントロールスポット」という場合がある）と同様のスポットを生じるように調製した、種々の等電点と分子量のタンパク質の混合物をコントロールとして用いることもできる。また、電気泳動条件が一定であれば、予めコントロールスポットを定めておき、測定対象をそれと比較してもよい。
工程（ｄ）
　工程（ｄ）は、工程（ｃ）において、コントロールスポットより塩基性側にサンプル由来のＰＳＡスポットが検出された場合に、サンプルが由来する対象が前立腺がんまたはその疑いがあると判定する。さらに、工程（ｄ）においては、より塩基性側に検出されるＰＳＡの程度に応じ、前立腺がんが、去勢抵抗性（ホルモン治療抵抗性）前立腺がんまたはその疑いがあると判定することができる。より塩基性側に検出されるとは、例えば、ホルモン感受性の前立腺がん患者由来のＰＳＡでは検出されない塩基性の等電点をもつＰＳＡ（例えば、等電点が６．５、６．６、６．７、６．８、６．９又は７．０以上のＰＳＡ）が検出される、等電点がより塩基性である分画が多い、ＰＳＡの等電点の分布がより塩基性側にある、等をあげることができる。等電点が塩基性である分画がより多いとは、例えば、基準等電点を設定し、基準等電点以上の等電点をもつＰＳＡの量が全ＰＳＡの半分以上である場合、などをあげることができる。ここで言う基準等電点としては、例えば、6．5、６．６又は６．７をあげることができる。
　このように、高感度、高特異度のマーカーを利用した本発明により、被験対象者の血清を用いて対象者が前立腺がんであるか否かを検出でき、さらには、前立腺がん患者血清を用いて去勢抵抗性の患者を見分けることができる。本発明の方法により、サンプルの前処理法と分離法、及び検出法を軸とした簡便な手法により、特異性が高く高感度な前立腺がんの検出方法が提供される。本発明の方法はまた、血清中のＰＳＡ複合体の特異的分離・濃縮法を軸とする前処理法と、等電点及び分子量を分離する方法（２次元電気泳動等）を主としたＰＳＡの翻訳後修飾分子群の定量的高精度分析法でもある。
　本発明の最も好ましい態様の一つは、以下の工程；工程（ｉ）：ヒト由来の血清サンプルに対しアルブミン／ＩｇＧ除去処理を行う工程、工程（ｉｉ）：アルブミン／ＩｇＧが除去された血清に対しエタノールアミン処理を行い、ＰＳＡ－ＡＣＴ複合体からＰＳＡを遊離させる工程、工程（ｉｉｉ）：得られた遊離ＰＳＡに対し、Ａｕｔｏ ２Ｄを用いて２次元電気泳動（１次元目：等電点、２次元目：分子量）を実施してＰＳＡを分離し、ＰＳＡのスポットを検出する工程、工程（ｉｖ）：コントロールＰＳＡと比較して塩基性側に検出されるＰＳＡの存在を確認する工程、及び工程（ｖ）：工程（ｉｖ）において塩基性側にＰＳＡが検出された場合、血清が由来する対象（ヒト）が前立腺がんに罹患していると判定する工程、を含む前立腺がんの検出方法である。
　本発明の最も好ましい態様の一つは、上記の方法を用いて、より塩基性側に検出されるＰＳＡの存在を確認することにより、対象が去勢抵抗性前立腺がんであると判定することを含む、去勢抵抗性前立腺がんの検出方法である。例えば、本発明の方法により、等電点によって分離される３５KDの６つ以上のＰＳＡスポットが検出されるが、最も塩基性側へ分離されるスポットの定量値が高いものは、去勢抵抗性であると判断できる。よって、これらのＰＳＡスポット群の定量を行い、その分布とプロファイルが、前立腺がんの去勢抵抗性のマーカーとなる。
　本発明の別の一つの態様は、健常者由来の前立腺液中に存在するＰＳＡ（正常ＰＳＡ）に比べて等電点が塩基性であるＰＳＡを検出することを特徴とする前立腺がんの判定方法である。本発明の判定方法において、対象由来のサンプル中に存在するＰＳＡの検出が行われ、検出したＰＳＡが正常ＰＳＡに比べて等電点が塩基性側である場合、対象が前立腺がんに罹患していると判定される。また、検出されたＰＳＡの等電点がより塩基性側である場合は、去勢抵抗性であると判定できる。
　よって、正常ＰＳＡの等電点より塩基性側の等電点をもつＰＳＡの定量を行い、その分布とプロファイルが、前立腺がんのマーカーとなりさらには前立腺がんの去勢抵抗性のマーカーとなる。従って、本願発明は、前立腺がんさらには前立腺がんの去勢抵抗性のマーカーでもある。
　サンプル中のＰＳＡの等電点の測定方法は、これに限定されないが、例えば、上記した２次元電気泳動を用いて測定することができる。あるいは、サンプル中のＰＳＡを、常法を用いて粗精製し、その後、等電点電気泳動等など等電点に基づく分離・解析手法を用いて測定することができる。
　本発明の他の一つの態様は、対象由来のサンプル中に存在するＰＳＡの検出及びＰＳＡの等電点の確認を行い、特定の等電点以上の等電点を有するＰＳＡを検出した場合に、対象が前立腺がんに罹患していると判定する方法である。対象由来のサンプルは前記と同じである。
　前立腺がんの判定に用いる特定の等電点とは、例えば、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、又は６．５をあげることができ、好ましくは、６．０、６．１又は６．２をあげることができ、より好ましくは６．０をあげることができる。特定の等電点以上の等電点を有するＰＳＡを検出した場合、好ましくはその検出値が高い場合は、前立腺がんと判断できる。さらに特定の等電点以上、例えば６．５以上の等電点を有するＰＳＡを検出した場合、好ましくはその検出値が高い場合は、対象は、去勢抵抗性前立腺がんであると判定できる。サンプル中に上記等電点以上のＰＳＡが存在することの確認は、これに限定されないが、例えば、上記した２次元電気泳動を用いて行うことができる。あるいは、サンプル中のＰＳＡを、常法を用いて、例えば抗体のアフィニティカラムにより分離し、その後、等電点電気泳動等など等電点に基づく分離・解析手法を用い、上記等電点以上のＰＳＡの存在を確認することができる。
　本発明の別の他の一つの態様は、対象由来のサンプル中に存在するＰＳＡの検出及びＰＳＡの脱シアル酸化の程度を検出し、脱シアル酸化されたＰＳＡを検出した場合に、対象が前立腺がんに罹患していると判定する方法である。また、脱シアル酸化されたＰＳＡの程度が高い場合は、対象は、去勢抵抗性前立腺がんであると判定できる。対象由来のサンプルは前記と同じである。
　サンプル中のＰＳＡが脱シアル酸化されているか否かの確認は、これに限定されないが、例えば、上記した２次元電気泳動を用いて行うことができる。ＰＳＡは、脱シアル酸化されることにより等電点のシフトが起こるので、これを確認することにより脱シアル酸化されたＰＳＡの存在を確認できる。
　よって、脱シアル酸化されたＰＳＡを検出した場合とは、これに限定されないが、例えば、脱シアル酸化によりシフトした等電点をもつＰＳＡ（正常ＰＳＡでは検出されない等電点をもつＰＳＡ）が検出される、正常ＰＳＡで検出されると予想される等電点をもつＰＳＡが検出されない又は減少して検出される、などが確認された場合をあげることができる。脱シアル酸化されたＰＳＡの程度が高い場合とは、例えば、シフトした特定の等電点をもつＰＳＡの量が多く確認される、あるいは、全ＰＳＡタンパク質及びシアル酸の量を定量しタンパク質あたりのシアル酸化量を決定して比較した場合、その数値がある一定の数値以下になっている場合などをあげることができる。
　本発明の別の他の一つの態様は、上記した何れかの方法により前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんと判断された場合、それに基づいてその後の治療方針を決定するための方法である。すなわち、本発明はまた、治療方針を決定するための前立腺がんの判定方法でもある。治療方針は、これに限定されないが、例えば、前立腺がんと判定されたが去勢抵抗性でない、すなわちホルモン感受性であると判断された場合は、ホルモン治療が行われ、一方、去勢抵抗性前立腺がんと判定された場合は化学療法が選択される。
　本発明の他の別の一つの態様は、上記した何れかの方法により、投薬を受けている前立腺がん患者由来の血清中に存在する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を検出し、検出したＰＳＡを投薬の前後において比較することにより投薬の効果を評価する方法である。
　本発明の別の一つの態様は、上記した何れかの方法により、前立腺がんの治療薬の候補の薬効を評価することによる。新規治療薬の評価方法又はスクリーニング方法である。
　以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
1．材料
　前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を含むサンプルとして以下のものを用いた：（ｉ）健常者由来の精漿、（ｉｉ）ＬＮＣａＰ細胞（前立腺がん細胞、ＰＳＡ陽性、ホルモン治療感受性）、（ｉｉｉ）Ｃ４－２細胞（前立腺がん細胞、ＰＳＡ陽性、ホルモン治療抵抗性）。対照として、ＰＣ－３細胞（前立腺がん細胞、ＰＳＡ陰性）を用いた。また、以下の患者の血清を、熊本大学倫理審査委員会の認証を受け、インフォームドコンセントを確認した上で入手し、試験に用いた：（ａ）ホルモン治療感受性前立腺がん患者血清、（ｂ）去勢抵抗性前立腺がん（castration resistant prostate cancer：ＣＲＰＣ）患者血清。
（実施例１）健常者由来精漿を用いた２次元電気泳動によるＰＳＡの検出
　健常者由来の精漿（タンパク量１０μｇ）を、全自動２次元電気泳動装置（Ａｕｔｏ ２Ｄ、シャープマニファクチャリングシステム（株）製）を用い、製造者の手順書に従って２次元電気泳動及びウエスタンブロティングを行った。泳動条件は次の通りである。１次元目：ｐＨ３－１０、ＩＰＧゲル、等電点電気泳動（ＩＥＦ）：９０分；２次元目動：１０％ポリアクリルアミドゲル、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：～４０分。ウエスタンブロティング後に、ＰＳＡのスポットを検出した（１次抗体：polyclonal rabbit anti-human PSA antibody（Dako）、又は monoclonal mouse anti-human PSA antibody（R&D）、２次抗体：Cy5-goat-anti-Rabbit IgG、又はCy5-goat-anti-mouse IgG）。また、内部２Ｄマーカーとして、Cy2 labeled trypsin inhibitor complex（ＰＩ：４．５，Ｍ．Ｗ．：８３ＫＤａ）及びCarbonic anhydrase（ＰＩ：４．５，Ｍ．Ｗ．：８３ＫＤａ）を用いた。その結果、上記２つの抗体に反応するＰＳＡ陽性のスポットが１７以上検出された。結果を図１に示す。図中、代表的なスポット８個を円で囲んである。各スポットについてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った結果、５つのスポットからＰＳＡが検出できた。図中の２，３，６，７及び８で示されたスポットがＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析からＰＳＡの存在が確認されたスポットである。
（実施例２）ＬＮＣａｐ細胞からの２次元電気泳動によるＰＳＡの検出
　実施例１と同様にして、前立腺がん細胞（ＬＮＣａＰ）を用いてＰＳＡの検出を行った。ホルモン治療感受性の前立腺がん細胞であるＬＮＣａＰ細胞から細胞溶解物を調製し、タンパク量換算で１０μｇの細胞溶解物を用いて実施例１と同様にして２次元電気泳動を行った。ウエスタンブロティング後、１次抗体としてポリクローナル抗ＰＳＡ抗体を用いた。結果を図２に示す。抗ＰＳＡ抗体に反応するスポットが８つ以上確認された。
（実施例３）各種サンプルを用いた２次元電気泳動によるＰＳＡの検出
　実施例１と同様にして、健常者由来精漿、ＬＮＣａＰ細胞の細胞溶解物、Ｃ４－２細胞の細胞溶解物、及びＰＣ－３細胞溶解物のそれぞれについて２次元電気泳動を行い、ウエスタンブロティング後、抗ＰＳＡ抗体を用いてＰＳＡスポットの検出を行った。結果を図３に示す。その結果、健常者精漿由来のＰＳＡスポット（の分布）と、前立腺がん細胞由来のＰＳＡスポットを比べると、前立腺がん細胞（ＬＮＣａＰ細胞及びＣ４－２細胞）由来のＰＳＡスポット（の分布）が塩基性側にシフトしていることが確認された。また、塩基性側へのシフトは、ホルモン治療抵抗性の前立腺がん細胞であるＣ４－２でより顕著であった。
（実施例４）患者血清中に存在するＰＳＡの分子量の測定
　患者血清を、フィルター法で分子量３００ｋＤａ以上、１００－３００ｋＤａ、５０－１００ｋＤａ、及び５０ｋＤａ以下の分画に分けた。
　それぞれの分画を、実施例１と同様にして、ただし、手法に電気泳動前の限外ろ過による脱塩・凍結乾燥による濃縮工程を加えた後、２次元電気泳動を行いＰＳＡの検出を行った。限外ろ過による脱塩は純水による洗いこみで行い、これを凍結乾燥し２０マイクロリットル程度の微量の純水に再溶解し濃縮を行った。その結果、３００ｋＤａ以上、及び１００－３００ｋＤａ、及び５０ｋＤａ以下の分画において、同様の抗ＰＳＡ抗体に反応する複数のスポットが確認された。血清中の存在するＡＣＴ－ＰＳＡ複合体は、通常１００ｋＤａあたりに電気泳動されるが、実際は、２００－３００ｋＤａ以上の大きさであると思われる。一方、フリー体ＰＳＡが５０ｋＤａ以下の分画で確認された。
　また、１００ｋＤａ以上のタンパク質を分画後、エタノールアミン処理を行うと、フリー体ＰＳＡのスポットが３０ｋＤａあたりに出現することが判った。
　これらのことより、以下、患者サンプルを用いた２次元電気泳動によるＰＳＡの検出は、等電点電気泳動では還元剤及びタンパク質変性剤（尿素）存在下で、又、２次元目のＳＤＳ電気泳動では還元剤及びＳＤＳ（界面活性剤）の処理を行うこととした。
（実施例５）患者サンプルを用いた２次元電気泳動によるＰＳＡの検出（１）
　前立腺がん患者由来の血清を用いて血清中に含まれるＰＳＡの検出を行った。コントロールとして、健常者由来の精漿を用いた。血液中のＰＳＡ濃度は、１ｍＬあたりｎｇオーダーでしか含まれていないため、血清の前処理として、アルブミン及びＩｇＧの除去を行った。除去は、ＧＥ社のアルブミン／ＩｇＧ除去キットを用い、製造者の手順書に従って行った。
　次いで、エタノールアミン処理（０．１Ｍ、４０℃、２４時間）を行い、塩酸での中和、限外ろ過での脱塩、凍結乾燥による濃縮後、実施例１と同様にして２次元電気泳動を行い、ＰＳＡの検出を行った。結果を図４に示す。また、検出されたスポット強度の比較を図５に示す。その結果、ホルモン治療感受性患者由来の血清に比べ、去勢抵抗性の患者由来の血清では塩基性側のスポットの強度が高くなる傾向が確認できた。例えば、評価方法としては、これに限定しないが、１～３のスポットの強度の和（Ａ）と４～５の強度の和（Ｂ）の比を計算した場合、ホルモン治療感受性患者由来の血清では、Ａ＞Ｂであるのに対し、去勢抵抗性の患者由来の血清では、Ａ≒Ｂ又はＡ＜Ｂであった。一方、健常者精漿では、酸性側（１～３）のスポットの強度がさらに高かった。このことより、去勢抵抗性になるに従って、塩基性側のＰＳＡの割合が増えることを示している。
（実施例６）シアリダーゼ処理によりＰＳＡの等電点変化
　ＰＳＡは翻訳後の糖鎖修飾を受けており、酸性糖であるシアル酸を有することが知られている。そこで、健常者精漿、及びホルモン療法感受性の高ＰＳＡ前立腺がん患者からの血清を用い、シアリダーゼによる影響について２次元電気泳動を用いて確認した。
　健常者精漿、及び、アルブミン/ＩｇＧ除去した前立腺がん患者からの血清を、シアリダーゼ処理をした後、限外ろ過での脱塩、凍結乾燥による濃縮後、実施例１と同様にして２次元電気泳動を行いＰＳＡの検出を行った。
　結果を図６に示す。シアリダーゼ処理により、いずれのサンプルを用いた場合も、ＰＳＡが塩基性側にシフトとすることが確認できた。また、前立腺がん患者由来のＰＳＡでは、一部のＰＳＡにおいて、糖鎖の一部が脱落している、つまり一部が脱シアル酸化されていることが確認できた。さらに、去勢抵抗性の患者由来のＰＳＡについても同様に調べたところ、去勢抵抗性になるにしたがって、糖鎖の脱落したＰＳＡの割合が増えていることが確認できた。これまで、正常の前立腺細胞と比較して前立腺がんではシアリダーゼ活性が上がり、さらに去勢抵抗性になるにしたがってその傾向が強くなるとの報告があるが、今回の結果はこのシアリダーゼ増加によるＰＳＡの脱糖鎖を反映しているものと思われる。
（実施例７）患者サンプルを用いた２次元電気泳動によるＰＳＡの検出（２）
　ホルモン治療感受性の前立腺がん患者由来の血清および去勢抵抗性の前立腺がん患者由来の血清、それぞれ４例を用いて、実施例５と同様にして、２次元電気泳動を行い、ＰＳＡの検出を行った。その後、検出されたスポット強度の比較を行った。具体的には、検出された１～３のスポットの強度の和（Ａ）と４～５のスポットの強度の和（Ｂ）の比を求めた。結果を図７に示す。ホルモン治療感受性患者由来の血清では、Ａ＞ＢでありＡとＢの比の平均は約１．７であるのに対し、去勢抵抗性の患者由来の血清では、Ａ＜Ｂであり、ＡとＢの比の平均は約０．７であった。去勢抵抗性の患者では、明らかに塩基性のＰＳＡスポットが増加することが確認できた。
　上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
　本発明は、新規マーカーに基づく前立腺がんの検出方法として有用である。本発明はまた、通常の前立腺がん治療（ホルモン治療）の感受性を見極め、患者の治療の方向性を早期に決定する方法として、又、前立腺がん新規治療薬の効果を見極めるための方法として有用である。

Claims (20)

  1. 　対象由来のサンプル中に存在する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を検出することによって対象が前立腺がんに罹患している又はその疑いがあると判定する方法であって、前記対象由来のＰＳＡが、健常者由来のＰＳＡと比較して等電点が塩基性側である場合に、対象が前立腺がんに罹患している又はその疑いがあると判定することを特徴とする判定方法。
  2. 　対象由来のＰＳＡの少なくとも一部の等電点が健常者由来のいずれのＰＳＡの等電点より塩基性である場合、対象由来のＰＳＡの等電点が塩基性である分画が健常者由来のＰＳＡの等電点が塩基性である分画に比べて多い場合、対象由来のＰＳＡの等電点の分布が前記健常者由来のＰＳＡの等電点の分布に比べ塩基性側にある場合、又は６．０以上の等電点をもつＰＳＡが検出された場合に、前記対象由来のＰＳＡが健常者由来のＰＳＡと比較して等電点が塩基性側であると判断する、請求項１に記載の判定方法。
  3. 　対象由来のＰＳＡの等電点の塩基性である分画が健常者由来のＰＳＡの等電点が塩基性である分画に比べて多い場合、又は対象由来のＰＳＡの等電点の分布が前記健常者由来のＰＳＡの等電点の分布に比べ塩基性側にある場合に、前記対象由来のＰＳＡの等電点が健常者由来のＰＳＡと比較して塩基性側であると判断する、請求項１に記載の判定方法。
  4. 　前記対象由来のサンプルは対象由来の血清である請求項１～３のいずれか一つに記載の方法。
  5. 　前記対象由来のサンプルはエタノールアミンによって処理された対象由来の血清である請求項１～３のいずれか一つに記載の方法。
  6. 　前記対象由来のＰＳＡの等電点の塩基性の程度に基づいて、前記対象がさらに去勢抵抗性前立腺がんであると判定する請求項１～３のいずれか一つに記載の方法。
  7. 　６．５以上の等電点をもつＰＳＡが検出された場合に、前記対象がさらに去勢抵抗性前立腺がんであると判定する請求項１～３のいずれか一つに記載の方法。
  8. 　対象由来のサンプル中に存在する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を検出することによって対象が前立腺がんに罹患している又はその疑いがあると判定する方法であって、対象由来のＰＳＡは、健常者由来のＰＳＡと比較して脱シアル酸化されている場合に対象が前立腺がんに罹患していると判定することを特徴とする方法。
  9. 　前記対象由来のサンプルは、対象由来の血清である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記対象由来のサンプルは、エタノールアミンによって処理された対象由来の血清である、請求項８に記載の方法。
  11. 　前記対象由来のＰＳＡの脱シアル酸化の程度に基づいて、前記対象がさらに去勢抵抗性前立腺がんであると判定する請求項８～１０のいずれか一つに記載の方法。
  12. 　対象患者が前立腺がんに罹患している又はその疑いがあると診断するために利用する情報を取得する方法であって、前立腺がんの疑いがある患者由来の血清中に存在する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を検出し、検出した対象患者由来のＰＳＡの等電点が、健常者由来のＰＳＡと比較して塩基性側であるか否かを決定する方法。
  13. 　対象由来のＰＳＡの少なくとも一部の等電点が健常者由来のいずれのＰＳＡの等電点より塩基性である場合、対象由来のＰＳＡの等電点の塩基性である分画が健常者由来のＰＳＡの等電点が塩基性である分画に比べて多い場合、対象由来のＰＳＡの等電点の分布が前記健常者由来のＰＳＡの等電点の分布に比べ塩基性側にある場合、又は６．０以上の等電点をもつＰＳＡが検出された場合に、前記対象由来のＰＳＡの等電点が健常者由来のＰＳＡと比較して塩基性側であると判断する請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記患者由来の血清がエタノールアミンによって処理された患者由来の血清である請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 　対象由来のサンプル中に存在する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を検出する方法であって、以下の工程：
    （ａ）対象由来のサンプル中に存在するＰＳＡ－ＡＣＴ複合体からＰＳＡを遊離させる工程、
    （ｂ）工程（ａ）で得た遊離ＰＳＡに対し２次元電気泳動を実施してＰＳＡを分離しＰＳＡのスポットを検出する工程、及び
    （ｃ）コントロールＰＳＡのスポットに比べて塩基性側に検出されるＰＳＡのスポットの存在を確認する工程、
    を含む方法。
  16. 　前記対象由来のサンプルは、ヒト由来の血清である、請求項１５に記載の方法。
  17. 　工程（ａ）の前に、血清に対してアルブミン／ＩｇＧ除去処理を行うことを含む請求項１６に記載の方法。
  18. 　工程（ａ）がエタノールアミンを用いて行われる請求項１５～１７のいずれか一つに記載の方法。
  19. 　請求項１８に記載の方法において、前記工程（ｃ）において塩基性側にＰＳＡスポットが検出された場合、対象が前立腺がんに罹患していると判定する方法。
  20. 　前記工程（ｃ）において、コントロールＰＳＡのスポットに比べて塩基性側に検出されるＰＳＡのスポットの程度に応じて、対象がさらに去勢抵抗性の前立腺がんに罹患しているか否かを決定する請求項１９に記載の方法。
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