KR20100122393A - 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 농도 분석을 이용한 폐암 진단용 조성물 및 키트 - Google Patents

야생형 과립구 콜로니 자극인자의 농도 분석을 이용한 폐암 진단용 조성물 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자 (wild type G-CSF)의 단백질 수준을 측정하여, 폐암 또는 폐암의 병기를 진단하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 단백질 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 폐암 또는 폐암의 병기를 진단하기 위한 조성물 및 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따라 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 농도를 정량 분석함으로써 폐암의 발병 유무, 폐암의 병기 및 폐암의 전이 유무를 쉽고 간편하게 진단할 수 있다.
폐암 진단법, 폐암 진단 키트, 폐암 마커, G-CSF

Description

야생형 과립구 콜로니 자극인자의 농도 분석을 이용한 폐암 진단용 조성물 및 키트 {Compositions and kits for diagnosis of lung cancer using the analysis of G-CSF concentration}
본 발명은 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자 (wild type G-CSF)의 단백질 수준을 측정하여, 폐암 또는 폐암의 병기를 진단하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 단백질 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 폐암 또는 폐암의 병기를 진단하기 위한 조성물 및 키트에 관한 것이다.
암을 진단하는데 사용되는 현재의 기술은 조직검사 (cytology evaluation), 조영법 (mammography) 및 종양 마커 면역검정법 (tumor marker immunoassay)으로 대별된다. 특히, 폐암 유무의 진단법은 객담 세포진 검사, 기관지 내시경 조직검사 등의 조직 검사법이 있고, 폐암으로 확진되거나 의심되는 사람에 대하여는 흉부 CT 활영, MRI 촬영, PET 또는 PET-CT촬영 등을 통하여 폐암 확진 및 병기 판정, 뼈 등으로 전이 등을 단계별로 진단하고 있다. 종양 마커 면역검정법으로 폐암을 진단하는 암 마커는 신경원 특이성 에놀라제, 암태아성 항원 (Carcinoembryonic antigen; CEA), 편평세포암 항원 (Squamous cell carcinoma antigen; SCC Ag), 수용성 사이토 각질 19절편 등이 있다. 이들 중 신경원 특이성 에놀라제는 소세포암 진단에 사용되고 있고 수용성 사이토 각질 19 절편은 비소세포암 중 특히 편평상피암 진단에 사용되고 있다. 본 발명과 관련된 야생형 과립구 콜로니 자극인자는 진단에는 사용된 바 없다.
폐암은 크게 소세포암과 비소세포암으로 분류되는데, 폐암의 치료적 접근방법을 결정하는 주된 요인은 종양이 조직학적으로 어느 종류의 암에 포함되는가를 정확하게 진단하는 것이 중요하다. 본 발명은 폐암 진단 마커로 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 생물학적 유체 중의 농도 분석으로 단시간에 간단하게 폐암의 유무, 병기 및 전이 유무를 간단하게 진단할 수 있는 폐암 진단 방법 및 이를 위한 진단 조성물 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 종래 폐암 진단에는 폐암 발병 유무, 병기, 전이 유무 등에 대하여 단계별 관련 진단법들 외에 폐암의 유무를 판정하는 종양 마커 면역검정법 (tumor marker immunoassay)의 낮은 진단률 (예민도; sensitivity)과 특이도 (specificity)를 개선 시킬 수 있는 폐암 스크리닝 및 진단 방법을 개발하고자 수년간에 걸쳐 많은 연구를 수행해 왔으며, 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자를 종양 마커로 하여 이의 농도를 분석함으로써 고도의 특이성과 예민도로 폐암의 유무를 스크리닝하고, 폐암의 병기 및 전이 유무를 판정할 수 있음을 밝혀내었다.
이와 관련하여 한가지 관점으로서, 본 발명의 목적은 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 단백질 수준을 측정하여, 폐암 또는 폐암의 병기를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 다른 관점에서, 본 발명의 목적은 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 단백질 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 폐암 또는 폐암의 병기를 진단하는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명의 목적은 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 단백질 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 폐암 또는 폐암의 병기와 전이 유무를 진단하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명에 따라, 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 농도를 분석함으로써 폐암 진단률 (예민도) 및 진단 특이도를 각각 94% 및 98% 이상으로 향상시킬 수 있는 간단하고 향상된 폐암 스크리닝 및 진단 방법을 제공할 뿐만 아니라 폐암의 병리조직학적 병기 진행 정도, 전이 유무 및 전이 장기를 판단할 수 있는 진단 방법을 제공한다.
폐암은 크게 소세포암과 비소세포암으로 분류되며, 비소세포암은 샘종, 평편세포암, 대세포암으로 소구분되며, 폐암의 치료적 접근방법을 결정하는 주된 요인은 종양이 조직학적으로 어느 종류의 암에 포함되는가를 정확하게 진단하는 것이 중요하다. 본원에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 폐암의 발병 여부, 소세포암과 비소세포암의 구분, 각각의 세포암의 병리학적 단계의 구분, 전이의 유무, 뼈로의 전이 여부, 뼈를 포함한 다른 장기로의 전이 여부를 확인하는 것을 포함한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자 (야생형 G-CSF)의 단백질 수준을 측정하여, 폐암을 스크리닝 또는 진단하는 방법에 관한 것이다.
과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF)는 조혈 전구세포의 분화 및 증식, 성숙한 호중구의 활성화 등을 조절하는 콜로니 자극 인자의 군에 속하는 사이토킨으로 알려져 있으며, 분자량 약 20,000의 당단백질이다. 본원에서 사용된 용어 "야생형 과립구 콜로니 자극인자 (야생형 G-CSF)"는 유전자 조작되지 않은 천연에서 분리 또는 단리되는 단백질을 언급한다.
본 발명자는 정상인과 폐암 환자의 혈장으로부터 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 정량 분석하였으며, 정상인 157명 혈청에 존재하는 농도는 최대 20.84 pg/ml으로 20 pg/ml 이상인 혈청은 2명이었고, 평균 농도는 11.11 pg/ml이었다. 혈장 중 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도를 최대 20 pg/ml으로 정하고 폐암 스크리닝 및 진단에 야생형 과립구 콜로니 자극인자 폐암 진단용 마커로서 사용하는 경우, 폐암 진단 특이도는 98%인 것으로 나타났다.
폐암으로 확진된 100명의 환자의 혈장 중 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도는 최고 314.1 pg/ml, 최저 5.7 pg/ml인 것으로 분석되었다. 20 pg/ml 이하인 시료는 6명 (6%)으로 20 pg/ml 이상인 시료는 94명으로 전체 인원의 94%인 것으로 나타났다. 혈장 중 야생형 과립구 콜로니 자극인자를 폐암 스크리닝 및 진단 마커로서 사용하여 폐암 진단 유효성을 분석하는 경우, 폐암 스크리닝 및 진단률 (예민도)은 94%로 나타났다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자 (야생형 G-CSF)의 단백질 수준을 측정하여, 폐암의 병기를 진단하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "폐암의 병기의 진단"은 소세포암과 비소세포암의 구분, 각각의 세포암의 병리학적 단계의 구분, 전이의 유무, 뼈로의 전이 여부, 뼈를 포함한 다른 장기로의 전이 여부를 확인하는 것을 포함하는 것으로서, 본 발명에 따라 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 농도를 측정하여 이 의 농도를 분석함으로써 폐암의 병기를 구분할 수 있다.
본 발명자는 폐암 환자들에 대한 임상 결과들을 병리조직학 관점에서 분류하여 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 혈장 농도를 분석한 결과, 소세포암 (SCLC; Small Cell Lung Carcinoma) 환자는 15명으로 혈장 중에 야생형 과립구 콜로니 자극인자 평균 농도는 34.88 pg/ml, 비소세포암 (NSCLC; Non-Small Cell Lung Carcinoma) 환자는 85명으로 혈장 중에 야생형 과립구 콜로니 자극인자 평균 농도는 47.95 pm/ml로 소세포암 환자군에서보다 통계학적으로 유의하게 높게 나타났다. 비소세포암 환자군 85명에서 샘종 (adenocarcinoma) 환자는 33명, 편평세포종 (squamous cell carcinoma) 환자는 39명, 대세포종 (large cell carcinoma) 환자는 5명으로 각각의 환자군에서 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 평균 농도는 40.08 pg/ml, 51.77 pg/ml, 56.56 pg/ml로 대세포암 환자들에서 가장 높게 나타났다.
또한, 폐암 환자들에 대한 임상 결과들을 폐암 병기 관점에서 분류하여 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 혈장 농도를 분석한 결과, 비소세포암 (NSCLC; Non-Small Cell Lung Carcinoma) 환자 85명 중에 폐암 1기 4명, 2기 2명, 3기 38명, 4기 41명으로 분류되었으며, 병기에 따른 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 농도는 23.95 pg/ml, 33.10 pg/ml, 40.10 pg/ml, 58.30 pg/ml로 폐암 병기 진행 정도에 따라 혈장 중에 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도가 통게학적으로 유의하게 증가하였다. 또한 소세포암 환자 15명 중에 제한기 (limited)는 5명, 확장기 (extensive)는 10명으로 이때 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 혈장농도는 23.79 pg/ml과 40.31 pg/ml로 확장기 환자에서 높게 나타났다.
또한, 폐암 환자들에 대한 임상 결과들을 폐암의 전이 유무와 전이 조직 관점에서 분류하여 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 혈장 농도를 분석한 결과, 전이가 일어나지 않은 환자군 49명, 뼈 외 조직으로 전이가 있는 환자군 25명, 뼈를 포함한 다른 조직으로 전이가 일어난 환자군 26명에 대한 혈장 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자 평균농도는 36.83 pg/ml, 48.54 pg/ml, 60.77 pg/ml로 다른 조직으로 전이가 없을 때 보다 전이가 일어난 환자군에서 통계적으로 유의하게 높았으며, 전이가 일어난 환자군을 비교 분석시 뼈로의 전이가 일어난 환자군에서 통계적으로 유의하게 높은 결과를 나타내었다.
특정 양태에서, 본 발명의 폐암 병기 진단 방법은 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 혈장 농도가 35 pg/ml 이상인 경우 비소세포성폐암 병기 3기 또는 소세포성폐암 확장기로 진단한다.
특정 양태에서, 본 발명의 폐암 병기 진단 방법은 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 혈장 농도가 50 pg/ml 이상인 경우, 비소세포성폐암 병기 4기로 진단한다.
특정 양태에서, 본 발명의 폐암 병기 진단 방법은 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 혈장 농도가 20 내지 40 pg/ml인 경우 폐암 전이가 없는 것으로 진단하고, 40 pg/ml 이상인 경우 폐암 전이가 있는 것으로 진단한다.
특정 양태에서, 본 발명의 폐암 병기 진단 방법은 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 혈장 농도가 50 pg/ml 이상인 경우 폐암이 뼈를 포함한 다른 장기로 전이된 것으로 진단한다.
본원에서 사용된 용어 “생물학적 유체”는 폐암의 발병에 의하여 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 단백질 수준의 차이를 검출할 수 있는 체액으로서, 혈액, 혈청, 혈장, 뇨 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 혈액, 혈청 및 혈장을 포함하고, 보다 바람직하게는 혈청 및 혈장을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 “단백질 수준의 측정”은 폐암을 진단하기 위하여 생물학적 유체에서의 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다.
본원에서 사용된 용어 “항체”는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 종양 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 재조합 항체 등을 포함한다.
야생형 과립구 콜로니 자극 인자에 대한 항체의 생성은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 폴리클로날 항체는 상기한 야생형 과립구 콜로니 자극 인자 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 폴리클로날 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 모노클로날 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method) (Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
항체를 이용하여 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에서 야생형 과립구 콜로니 자극 인자는 항원-항체 복합체의 형성을 통해 검출되며, 본원 사용된 용어 “항원-항체 복합체”란 야생형 과립구 콜리니 자극 인자와 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 레벨(detection level)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 레벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
특정 양태에서, 본 발명의 진단 방법은 ELISA 또는 RIA 또는 이의 변형된 방 법을 이용하여 야생형 과립구 콜로니 자극 인자의 단백질 수준을 측정한다. 단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지를 하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다.
특정 양태에서, 본 발명의 진단 방법은 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 혈장 농도의 변화를 관측하여 최초 확진시 검사 농도보다 감소되는 환자에 대하여 폐암 치료의 반응성이 좋은 것으로 판정함으로써, 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 농도 변화에 따라 폐암 환자의 치료 과정을 모니터링한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자 (야생형 G-CSF)의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암 또는 폐 암 병기 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물에서 폐암의 진단은 병리 상태의 존재를 확인하는 것을 의미하고, 폐암 병기 진단은 소세포암과 비소세포암의 구분, 각각의 세포암의 병리학적 단계의 구분, 전이의 유무, 뼈로의 전이 여부, 뼈를 포함한 다른 장기로의 전이 여부를 확인하는 것을 포함한다.
상기 야생형 과립구 콜로니 자극인자 (야생형 G-CSF)의 단백질 수준을 측정하는 제제는 야생형 과립구 콜로니 자극인자에 결합하는 항체일 수 있다.
특정 양태에서, 상기 단백질 수준을 ELISA 또는 RIA 방법 또는 이의 변형된 방법으로 측정한다. 보다 바람직한 양태에서, 단백질 수준은 ELISA 방법으로 측정한다.
특정 양태에서, 상기 생물학적 유체는 혈액, 혈청, 혈장 또는 뇨를 포함하며, 보다 바람직하게는 혈액, 혈청 또는 혈장을 포함하며, 가장 바람직하게는 혈청 또는 혈장을 포함한다.
특정 양태에서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 20 pg/ml 이상인 경우 폐암으로 진단된다. 특정 양태에서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 35 pg/ml 이상인 경우 비소세포성폐암 병기 3기 또는 소세포성폐암 확장기로 진단된다. 특정 양태에서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 50 pg/ml 이상인 경우 비소세포성폐암 병기 4기로 진단된다. 특정 양태에서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 20 내지 40 pg/ml인 경우 폐암 전이가 없는 것으로 진단되고, 40 pg/ml 이상인 경우 폐암 전이가 있는 것으로 진단된다. 특정 양태에서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 50 pg/ml인 경우 폐암이 뼈 를 포함한 다른 장기로 전이된 것으로 진단된다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자 (야생형 G-CSF)의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암 또는 폐암 병기 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트에서 폐암의 진단은 병리 상태의 존재를 확인하는 것을 의미하고, 폐암 병기 진단은 소세포암과 비소세포암의 구분, 각각의 세포암의 병리학적 단계의 구분, 전이의 유무, 뼈로의 전이 여부, 뼈를 포함한 다른 장기로의 전이 여부를 확인하는 것을 포함한다.
상기 야생형 과립구 콜로니 자극인자 (야생형 G-CSF)의 단백질 수준을 측정하는 제제는 야생형 과립구 콜로니 자극인자에 결합하는 항체일 수 있다.
특정 양태에서, 상기 단백질 수준을 ELISA 또는 RIA 방법 또는 이의 변형된 방법으로 측정한다. 보다 바람직한 양태에서, 단백질 수준은 ELISA 방법으로 측정한다. ELISA 키트는 이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하며, 야생형 과립구 콜로니 자극인자에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 재조합 항체이다. 또한, ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 이외에도, ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합 할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 상기 생물학적 유체는 혈액, 혈청, 혈장 또는 뇨를 포함하며, 보다 바람직하게는 혈액, 혈청 또는 혈장을 포함하며, 가장 바람직하게는 혈청 또는 혈장을 포함한다.
특정 양태에서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 20 pg/ml 이상인 경우 폐암으로 진단된다. 특정 양태에서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 35 pg/ml 이상인 경우 비소세포성폐암 병기 3기 또는 소세포성폐암 확장기로 진단된다. 특정 양태에서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 50 pg/ml 이상인 경우 비소세포성폐암 병기 4기로 진단된다. 특정 양태에서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 20 내지 40 pg/ml인 경우 폐암 전이가 없는 것으로 진단되고, 40 pg/ml 이상인 경우 폐암 전이가 있는 것으로 진단된다. 특정 양태에서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 50 pg/ml인 경우 폐암이 뼈를 포함한 다른 장기로 전이된 것으로 진단된다.
이하, 본 발명을 하기의 실시 예에 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 하기 실시 예로 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 정상인과 폐암으로 확진된 환자 혈청
본 실험에 사용된 시료는 정상인과 폐암으로 확진된 환자의 혈액으로, 원광 대 의대병원의 임상시험연구 심의위원회의 심의를 통과하여 내원하는 사람을 대상으로 연구목적을 설명하고 자발적 동의 하에 혈액검사에 사용하는 혈액의 일부로부터 혈청 또는 혈장을 분리하였다. 자세하게는 채혈된 혈액 2 ml을 실온에서 1시간 정치한 후, 냉각원심분리기로 1,500 G에서 10분간 원심분리하여 상청액인 혈청 또는 혈장을 1.5 ml 튜브에 분취하여 -70 ℃에 보관하였다. 추후 샌드위치 면역측정법 (sandwich ELISA법)에 의한 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 정량분석 등에 사용하였다.
실시예 2: 정상인 혈청에 존재하는 야생형 과립구 콜로니 자극인자 정량 분석
정상인 157명 혈청에 존재하는 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도는 R&D Systemics사 (USA)의 ELISA 키트를 구입하여 제조회사에서 제공하는 실험방법으로 측정하였다.
정상인 157명 혈청에 존재하는 농도는 최대 20.84 pg/ml으로 20 pg/ml 이상인 혈청은 2명이었고, 평균 농도는 11.11 pg/ml, 표준편차는 2.49 pg/ml 이었다. 대부분 문헌에서 정상인 농도는 20 pg/ml로 보고하였는데, 본 실시예의 결과에서도 2명 (1.6%)을 제외한 155 (98.4%)명이 20 pg/ml 이상이었다.
본 실시예의 결과로부터 정상인 혈청 또는 혈장 중에 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도를 최대 20 pg/ml으로 정하고 폐암 스크리닝 및 진단에 본 종양 마커를 폐암 진단용 마커로서 유효성을 분석하면, 폐암 진단 특이도는 98%인 것으로 나 타났다.
실시예 3: 폐암 확진 환자 혈청에 존재하는 야생형 과립구 콜로니 자극인자 정량 분석
폐암으로 확진된 환자 100명 혈청에 존재하는 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도는 R&D Systemics사 (USA)의 ELISA 키트를 구입하여 제조회사에서 제공하는 실험방법으로 측정하였다.
폐암으로 확진 환자 100명 혈청에 존재하는 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도는 도 1a, 1b 및 1c 과 같다. 도 1a, 1b 및 1c에서 알 수 있듯이 폐암 환자에서 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도는 최고 314.1 pg/ml, 최저 5.7 pg/ml인 것으로 분석되었다. 20 pg/ml 이하인 시료는 6명 (6%)으로 20 pg/ml 이상인 시료는 94명으로 전체 인원의 94%인 것으로 나타났다.
본 실시예의 결과로부터 야생형 과립구 콜로니 자극인자를 폐암 스크리닝 및 진단 마커로 활용하여 폐암 진단 유효성을 분석하면, 폐암 스크리닝 및 진단률 (예민도)는 94%로 상당히 높게 나타났다.
본 실시예의 결과와 실시예 1의 결과는 정상인과 폐암 환자군에서 간단하게 혈장 또는 혈청 중에 폐암 마커로 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도를 측정함으로 폐암을 선별 하는 진단방법을 제공할 수 있었다.
실시예 4: 폐암의 병리조직학 유형에 따른 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 농도
본 실시예는 폐암 환자들에 대한 임상 결과들을 병리 조직학 관점에서 분류하여 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 혈청 또는 혈장 농도를 분석한 결과로 도 2에 나타내었다.
도 2에서 알 수 있듯이 소세포암 (SCLC; Small Cell Lung Carcinoma) 환자는 15명으로 혈장 중에 야생형 과립구 콜로니 자극인자 평균 농도는 34.88 pg/ml, 표준편차 3.8 pg/ml이었고, 비소세포암 (NSCLC; Non-Small Cell Lung Carcinoma) 환자는 85명으로 혈장 중에 야생형 과립구 콜로니 자극인자 평균 농도는 47.95 pm/ml, 표준편차 4.4 pg/ml로 소세포암 환자군에서 보다 통계학적으로 유의하게 높게 나타났다. 비소세포암 환자군 85명에서 샘종(adenocarcinoma) 환자는 33명, 편평세포암 (squamous cell carcinoma) 환자는 39명, 대세포암 (large cell carcinoma) 환자는 5명으로 각각의 환자군에서 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 평균 농도는 40.08 pg/ml, 51.77 pg/ml, 56.56 pg/ml로 대세포암 환자들에서 가장 높게 나타났다.
본 실시예의 결과는 폐암 환자군에서 간단하게 혈장 또는 혈청 중에 폐암 마커로 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도를 측정함으로 폐암의 병리조직학적 진단을 대체할 수 있는 진단 방법을 제공할 수 있었다.
실시예 5: 폐암의 병기에 따른 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 농도
본 실시예는 폐암 환자들에 대한 임상 결과들을 폐암 병기 관점에서 분류하여 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 혈청 또는 혈장 농도를 분석한 결과로 도 3에 나타내었다.
도 3에서 알 수 있듯이 비소세포암 (NSCLC; Non-Small Cell Lung Carcinoma) 환자 85명 중에 폐암 1기 4명, 2기 2명, 3기 38명, 4기 41명으로 분류되었으며, 이때 병기에 따른 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 농도는 23.95 pg/ml, 33.10 pg/ml, 40.10 pg/ml, 58.30 pg/ml로 각각의 표준편차는 8.3, 2.1, 5.3, 7.3 pg/ml로 폐암 병기 진행 정도에 따라 혈장 중에 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도가 통게학적으로 유의하게 증가하고 있음을 나타낸다. 또한 소세포암 환자 15명 중에 제한기 (limited)는 5명, 확장기 (extensive)는 10명으로 이때 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 혈장농도는 23.79 pg/ml과 40.31 pg/ml로 확장기 환자에서 높게 나타났다.
본 실시예의 결과는 폐암 환자군에서 간단하게 혈장 또는 혈청 중에 폐암 마커로 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도를 측정함으로 폐암의 병기를 추정할 수 있는 간단한 진단 방법을 제공할 수 있었다.
실시예 6: 폐암의 전이에 따른 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 농도
본 실시예는 폐암 환자들에 대한 임상 결과들을 폐암의 전이 유무와 전이 조 직 관점에서 분류하여 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 혈청 또는 혈장 농도를 분석한 결과로 도 4에 나타내었다.
도 4에서 알 수 있듯이 전이가 일어나지 않은 환자군 49명, 뼈 외 조직으로 전이가 있는 환자군 25명, 뼈를 포함한 다른 조직으로 전이가 일어난 환자군 26명에 대한 혈장 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자 평균농도는 36.83 pg/ml, 48.54 pg/ml, 60.77 pg/ml로 다른 조직으로 전이가 없을 때 보다 전이가 일어난 환자군에서 통계적으로 유의하게 높았으며, 전이가 일어난 환자군을 비교 분석시 뼈로의 전이가 일어난 환자군에서 통계적으로 유의하게 높은 결과를 나타내었다.
본 실시예의 결과는 폐암 환자군에서 간단하게 혈장 또는 혈청 중에 폐암 마커로 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도를 측정함으로 폐암의 전이 유무와 뼈로의 전이 유무를 판정할 수 있는 간단한 진단 방법을 제공할 수 있었다.
또한 이러한 진단 방법을 고려하여, 후술하는 특허청구범위에 기재된 폐암 진단 또는 폐암 병기 진단용 조성물 또는 키트를 제공할 수 있다.
도 1a, 1b 및 1c는 폐암으로 확진된 환자 혈장에 존재하는 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도를 나타낸 도면이다.
도 2는 폐암으로 확진된 환자 혈장에 존재하는 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도를 병리조직학적 유형으로 분석한 도면이다.
도 3은 폐암으로 확진된 환자 혈장에 존재하는 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도를 폐암 임상병기에 따라 분석한 도면이다.
도 4는 폐암으로 확진된 환자 혈장에 존재하는 야생형 과립구 콜로니 자극인자 농도를 폐암 전이 유무 및 전이 유형에 따라 분석한 도면이다.

Claims (22)

  1. 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자 (야생형 G-CSF)의 단백질 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 폐암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 수준을 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) 또는 RIA (Radioimmunoassay) 방법 또는 이의 변형된 방법으로 측정하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 유체가 혈액, 혈청 또는 혈장인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 20 pg/ml 이상인 것에 대해 폐암으로 판정하는 조성물.
  5. 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 단백질 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 폐암 병기 진단용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질 수준을 ELISA 또는 RIA 방법 또는 이의 변형된 방법으로 측정하는 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 생물학적 유체가 혈액, 혈청 또는 혈장인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 35 pg/ml 이상인 것에 대해 비소세포성폐암 병기 3기 또는 소세포성폐암 확장기로 판정하는 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 50 pg/ml 이상인 것에 대해 비소세포성폐암 병기 4기로 판정하는 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 20 내지 40 pg/ml인 것에 대해 폐암 전이가 없는 것으로 판정하고, 40 pg/ml 이상인 것에 대해 폐암 전이가 있는 것으로 판정하는 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 50 pg/ml인 것에 대해 폐암이 뼈를 포함한 다른 장기로 전이된 것으로 판정하는 조성물.
  12. 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자 (야생형 G-CSF)의 단백질 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 폐암 진단용 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단백질 수준을 ELISA 또는 RIA 방법 또는 이의 변형된 방법으로 측정하는 키트.
  14. 제12항에 있어서, 상기 생물학적 유체가 혈액, 혈청 또는 혈장인 키트.
  15. 제14항에 있어서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 20 pg/ml 이상인 것에 대해 폐암으로 판정하는 키트.
  16. 생물학적 유체 중의 야생형 과립구 콜로니 자극인자의 단백질 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 폐암 병기 진단용 키트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 단백질 수준을 ELISA 또는 RIA 방법 또는 이의 변형된 방법으로 측정하는 키트.
  18. 제16항에 있어서, 상기 생물학적 유체가 혈액, 혈청 또는 혈장인 키트.
  19. 제18항에 있어서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 35 pg/ml 이상인 것에 대해 비소세포성폐암 병기 3기 또는 소세포성폐암 확장기로 판정하는 키트.
  20. 제18항에 있어서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 50 pg/ml 이상인 것에 대해 비소세포성폐암 병기 4기로 판정하는 키트.
  21. 제18항에 있어서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 20 내지 40 pg/ml인 것에 대해 폐암 전이가 없는 것으로 판정하고, 40 pg/ml 이상인 것에 대해 폐암 전이가 있는 것으로 판정하는 키트.
  22. 제18항에 있어서, 야생형 G-CSF의 혈장 농도가 50 pg/ml인 것에 대해 폐암이 뼈를 포함한 다른 장기로 전이된 것으로 판정하는 키트.
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