CN104955841B - 用于检测1,25-二羟基维生素d的方法和试剂盒以及相关抗体 - Google Patents
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Abstract
公开了一种用于选择性检测生物流体样品中的1,25‑二羟基‑维生素D的测定方法。根据本发明的方法,测试样品的pH被调节至6‑9并且将包含维生素D受体的配体结合结构域(VDR‑LBD)的受体蛋白添加至测试样品中,由此获得了VDR‑LBD/1,25‑二羟基维生素D复合物的制剂,其中VDR‑LBD部分相对于未结合的VDR‑LBD发生了构象变化。然后,通过能够特异性地结合至已结合至1,25‑二羟基维生素D的VDR‑LBD的捕获部分来检测VDR‑LBD/1,25‑二羟基维生素D复合物。还公开了用于实施本发明的方法的测定试剂盒以及抗体。本发明的测定法优选为夹心免疫测定法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于在生物流体样品如全血、血浆、血清或尿液样品中检测总1,25-二羟基维生素D的方法和试剂盒。
更具体地,本发明涉及一种免疫检测方法和试剂盒以及涉及相关的抗体,其适合于检测可能含有1,25-二羟基维生素D及其他非活性形式的维生素D如25-羟基维生素D的生物流体样品中的总1,25-二羟基维生素D。
背景技术
维生素D是一种类固醇激素,其在骨骼代谢和钙稳态中起着根本性的作用。在人类和动物中,维生素D的主要形式为维生素D3(胆钙化甾醇)和维生素D2(麦角钙化甾醇)。维生素D3主要是在皮肤中由7-脱氢胆甾醇响应于太阳紫外线-B(UVB)的暴露而合成的,但是发生从膳食来源如油性鱼类即三文鱼和鲭鱼的维生素摄入。维生素D2主要是在来源于真菌和植物来源的膳食以及从补充剂(例如DrisdolTM或Sterogyl 15“A”)中获得的。
不论来源,维生素D2和D3向生物活性化合物的转化需要两个独立的羟基化步骤。在肝脏中,酶25-羟化酶将维生素D转化为25-羟基维生素D(下文中指定为“25(OH)D”)。这种中间代谢物是该激素的主要循环形式并且充当用于进一步羟基化至生物活性代谢物1,25-二羟基维生素D(下文中指定为“1,25(OH)2D”)的蓄池。
后一步骤主要发生在肾小管细胞中并且通过酶1-α-羟化酶催化。1,25(OH)2D的血浆浓度由包括血清甲状旁腺激素(PTH)的多种因素高度调控,并且它们通常比前体化合物25(OH)D低约1000倍。
由于它们的亲油性质,大多数的维生素D及其代谢物在结合至维生素D结合蛋白质(DBP)(也已知为Gc-球蛋白和白蛋白(10-20%))的血流中循环(80-90%)。DBP对于维生素D代谢物具有高亲和力(对25(OH)D和24,25(OH)2D为Ka=5x108M-1,对1,25(OH)2D和维生素D为Ka=4x107M-1),由此在正常情况下,仅约0.03%的25(OH)D和24,25(OH)2D以及约0.4%的1,25(OH)2D为游离形式。
1,25(OH)2D的生物效应主要通过这种生物活性激素与特异性细胞内维生素D受体(VDR)的结合来介导的,其主要通过调节启动子含有称为维生素D响应元件(VDRE)的特异性DNA序列的基因的表达来发挥作用。
维生素D受体(VDR)是一种属于核受体(NR)的超家族的配体依赖性转录调节子。如同这种受体家族的其他成员,VDR具有包含氨基末端A/B结构域、高度保守的DNA结合结构域(DBD)、柔性接头区域和更具可变性的C-末端配体结合结构域(LBD)的模块化结构(Mangelsdorf DJ et al.,1995,Cell 83(6):835-9)。C-末端LBD为球状多功能结构域,其负责激素结合、与视黄醇X受体(RXR)的二聚化以及与共抑制因子和共激活因子的相互作用,它们一起对于转录活性的调控是至关重要的(Haussler MR,et al.1998,J Bone MinerRes.13(3):325-49)。
已经结晶了VDR的配体结合结构域(LBD)并且解析了其结构(Rochel N,Wurtz JM,Mitschler A,Klaholz B,Moras D The crystal structure of the nuclear receptorfor vitamin D bound to its natural ligand.Mol Cell 2000;5:173-179)。
配体与VDR的结合引起在受体的配体结合结构域处的构象变化,其反过来提高了VDR与靶基因的启动子区域中的维生素D-响应元件(VDRE)上的辅因子视黄醇X受体(RXR)的异源二聚化。这反过来引起了启动子向转录机制的开放(Glenville J.et al.,1998Physiological Reviews 78(4):1193-1231)。
已知核受体配体结合结构域(LBD)具有高含量的α螺旋,其响应于配体结合可发生大的构象变化,形成疏水口袋。最近,通过NMR谱解答了褐家鼠(Rattus norvegicus)配体结合结构域(r-VDR-LBD)在结合至不同的配体时的构象的差异(Kiran K.Singarapu etal.2011Biochemistry 50(51):11015-24)。
维生素D目前被公认为激素原,其在维持人类的最佳健康中具有多重作用。很早就已经确定,明显的维生素D缺乏造成组织学上明显的骨疾病,如成人骨软化症和儿童佝偻病,而维生素D不足可以导致甲状旁腺激素浓度的改变,如果持续一段时间,这可能促进骨损失和断裂。但是,虽然初步确定为钙稳态的经典调节,目前已经维生素D具有更为广谱的作用,其通过维生素D受体(VDR)在人类组合中的广泛表达和分布来驱动。
在过去的几十年里,临床和流行病学数据已提供了一些证据,表明减弱的25(OH)D的水平与各种慢性疾病的风险增加相关联,这些疾病包括心血管疾病、高血压、心肌梗死、糖尿病、癌症、减少的神经肌肉功能、感染和自身免疫疾病。甚至妊娠并发症如先兆子痫、妊娠糖尿病、剖宫产、和早产等都可能是妊娠期维生素D缺乏的悲剧的后遗症(Holick MF;2007 N Engl J Med.357(3):266-81,Holick MF和Chen TC.2008Am J Clin Nutr.;87(4):1080S-6S)。
但是,鲜有进行将慢性病风险关联至1,25(OH)2D水平的研究,原因在于当前可采用的测试方法复杂且缺乏可靠性。
因此,在许多不同的临床应用中,作为诊断标志物和/或作为治疗监测指标,作为维生素D的活性形式的循环1,25(OH)2D的测定正变得越来越重要。例如,血清1,25(OH)2D和甲状旁腺激素(PTH)水平以及它们可能的相关性的测定可能代表了一种用于辅助甲状旁腺疾病的诊断以及用于在肾功能衰竭期间或维生素-D抗性佝偻病(VDRR)的发展中检测继发性甲状旁腺功能亢进的发病的重要措施。
目前,无论是在常规临床应用还是在研究应用中,存在广泛的可用于测量总25(OH)D(即25(OH)D3+25(OH)D2)的循环水平的方法。由Abbott Diagnostics(Abbott Park,IL,USA,ARCHITECT 25-OH维生素D测定)、DiaSorin Inc.(Stillwater,MN,USA,25OH维生素D全测定)、Immunodiagnostic Systems(Boldon,England,IDS-iSYS 25-羟基维生素D(25OHD))、Roche Diagnostics(Mannheim,Germany,ModularAnalytics E170维生素D全测定)和Siemens Healthcare Diagnostics(Tarrytown,NY,USA,ADVIA维生素D全测定)提供商用的、快速的、自动化的基于化学发光免疫分析的方法。除了这些测定平台之外,基于色谱分离并随后进行非免疫学直接检测的物理方法(半自动化的液相色谱-串联质谱,LC–MS/MS)的使用最近存在稳定的增长,其主要已在美国的专门实验室(例如位于Calabasas Hills,CA的Esoterix Inc.,位于Rochester,MN的Mayo Clinic,位于Salt Lake City,UT的ARUP Laboratories和位于Lyndhurst,NJ的Quest Diagnostics)、欧洲的专门实验室(例如位于Ghent,Belgium的Ghent University和位于Liége,Belgium的CHU de Liége)和澳大利亚的专门实验室(例如位于Herston Queensland的Pathology Queensland和位于Macquarie Park NSW的Douglass Hanly Moir Pathology)开发。
尽管存在用于测量25(OH)D的测定平台的广泛选择,但是当前不存在可用于定量测定临床样品中活性形式的维生素D的自动测定方法。1,25(OH)2D的全身循环水平极低,处于pg/ml的范围内,因此代表了对于临床监测的显著生物分析挑战。血浆中1,25(OH)2D的定量历来是通过放射免疫测定法(RIA)来进行的。为了避免与放射性处理和放射性标记的有限储存寿命相关的问题,最近出现了新的维生素D的测试方法,其主要依靠LC–MS/MS方法的采用。但是,为了实现必要的灵敏度和选择性,所报道的用于1,25(OH)2D的LC-MS/MS生物分析测定存在需要进行大量的样品制备过程或衍生方案的问题。目前,可用于检测1,25(OH)2D的主要方法需要进行大量的样品预处理或预分析步骤,它们通常是手动进行的,因此可以非常耗时、劳动密集且昂贵。
EP 0 583 945 A公开了一种针对1,25(OH)2D的测定法,其包括作为免疫沉淀竞争性结合测定法的一部分的、使用有机溶剂如乙酸乙酯萃取血清,使用硅胶柱分离出潜在干扰的其他维生素D代谢物,然后添加猪受体蛋白、放射性标记的1,25(OH)2D、能够结合至所述受体的生物素化抗体、和促进蛋白质如BSA。
WO/8901631公开了一种用于1,25(OH)2D(3)的竞争性结合测定法,其包括向未处理的血浆中添加猪受体蛋白质、放射性标记的1,25(OH)2D和能够结合到该受体的生物素化抗体。该竞争性结合测定法需要使用维生素D转运蛋白质,其充当用于使来自相关代谢物的干扰最小化的筛网。
S.SWAMI et al.,Bone,卷28,第3期,2001年3月:319-326公开了一种抗体,其结合至维生素D受体(VDR)的铰链部分并且其被用在测量VDR的方法中。但是,此种抗体不能区分配体占用的和未占用的VDR,因此不能用于检测1,25(OH)2D。
DiaSorin RIA(部件号65100E/100管;1,25-二羟基维生素D)涉及使用有机溶剂、萃取仪器和C18-OH柱以分离出潜在干燥维生素D代谢物如24,25(OH)2D、25,26(OH)2D和25(OH)D以便在代谢物测量之前从测试样品中分离出1,25(OH)2D。
甚至最近由Immunodiagnostics提供的用于测定1,25(OH)2D的商业化自动测定法(部件号IS-2400;IDS-iSYS 1,25-二羟基维生素D)也需要耗时且劳动密集型样品预处理步骤,该预处理步骤使用IDS专有的免疫胶囊(Immunocapsules)。
另外,因为与在预分析或样品预处理步骤过程中未完全从测试样品中去除的其他维生素D代谢物的交叉反应性事件会导致错误的较高浓度的1,25(OH)2D的测量,现有技术方法在测定特异性方面存在局限。例如,大多数免疫抗体显著地与血液中可能以比1,25(OH)2D大1000倍水平存在的25(OH)D、24,25(OH)2D和25,26(OH)2D交叉反应。
因此,强烈需要开发一种用于检测总1,25(OH)2D(1,25(OH)2D2+1,25(OH)2D3)的测定方法,其不会存在现有技术的缺点和局限性。
特别地,需要一种测定方法,其能够精确、灵敏并准确检测总1,25(OH)2D(1,25(OH)2D2+1,25(OH)2D3)而不需要耗时且劳动密集型的样品预处理步骤,并且其可以以自动化格式提供。
还需要一种1,25(OH)2D测定方法,其基本上不会与测试样品中可能存在的其他维生素D代谢物交叉反应。
这些及其他需求通过构成本说明书不可分割部分的所附权利要求中定义的方法及相关的试剂盒和抗体而得到了满足。
发明内容
如下列实施例中所进一步说明的,本发明基于以下发现:在其中进行测定的介质的pH显著地影响维生素D结合蛋白质(DBP)和维生素D受体的配体结合结构域(VDR-LBD)与1,25(OH)2D的结合亲和力。
更具体地,由本发明人进行的实验的结果清楚地显示,测试样品的pH值高于6的移动,优选高于7,令人惊讶地引起VDR-LBD对1,25(OH)2D的亲和力比对25(OH)D的亲和力约200倍的提高,而在相同的pH值下,DBP表现出对25(OH)D比对1,25(OH)2D大约1000倍的亲和力。因此,pH对结合于DBP的1,25(OH)2D和结合于VDR-LBD的1,25(OH)2D之间的平衡的此种有利影响的开发,在用于在存在摩尔过量的VDR-LBD的条件下从天然DBP中选择性地捕获循环1,25(OH)2D并且同时留下大多数以被掩蔽的(sequestered)形式结合至DBP的25(OH)D的容易度和有效性方面代表了一种独特的工具。此种方法相对于现有技术方法是特别有利的,现有技术方法需要耗时且劳动密集型的样品预处理步骤以允许在临床样品中测量1,25(OH)2D。
由于已知1,25(OH)2D与VDR-LBD的结合诱导VDR-LBD分子的构象变化,本发明人已进行了广泛的实验以开发能够特异性地识别并且结合至已结合于1,25(OH)2D的VDR-LBD而不会与未复合的VDR-LBD交叉反应的捕获部分,如抗体,以便在各种生物基质中选择性的鉴别VDR-LBD/1,25(OH)2D复合物与未结合的VDR-LBD。此种构象特异性捕获部分特别有用,因为其代表了用于快速并可靠检测循环活性形式的维生素D的非常宝贵的工具。
因此,本发明的一个方面是一种用于检测生物液体样品中的1,25(OH)2D或其类似物的方法,如所附权利要求9中所限定的。
还处于本发明的范围内的是一种用于检测生物流体样品中的1,25(OH)2D或其类似物的试剂盒,如所附权利要求18中所限定的。
本文中使用的术语“维生素D”同时指代维生素D3(胆钙化甾醇(cholecalciferol))和维生素D2(麦角钙化甾醇(ergocalciferol)),并且术语“1,25(OH)2D”同时指代1,25(OH)D3和1,25(OH)D2。1,25(OH)2D的类似物包括其修饰版本和结构类似物,如例如19-去甲-1α-25-二羟基维生素D2(19-nor-1α-25-dihydroxyvitamin D2)(例如来自Abbott的胜普乐(Zemplar)或帕立骨化醇(paricalcitol))、1α-羟基维生素D2或1α-羟基麦角钙化甾醇(例如来自Genzyme的Hectorol或度骨化醇(doxercalciferol))和2-亚甲基-19-去甲-(20S)-1α,25-(OH)2D3(例如来自Deltanoid Pharmaceuticals的2MD)。
如上所述,本发明的检测方法的特征性特征在于,实验下的生物流体样品的pH被调节至高于6的值,即,包含在6和9之间。优选的pH值包含在7和8.6之间,如7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5或8.6。适合用于调节生物液体样品的pH至上所述数值的缓冲剂和缓冲溶液为本领域技术人员众所周知。
在本发明的上下文中,生物流体样品优选地选自由全血、血清、血浆和尿组成的组。生物液体样品可以可选地包括进一步的组分,如例如;稀释剂、防腐剂、稳定剂和/或缓冲剂。如果需要,使用本领域中众所周知的任何适合的稀释缓冲剂来制备生物液体样品的稀释液。
本发明的检测方法的进一步特征在于,采用包含维生素D受体的配体结合结构域(VDR-LBD)的受体蛋白以便结合1,25(OH)2D或其类似物。
如在本说明书中所使用的术语“包含维生素D受体的配体结合结构域(VDR-LBD)的受体蛋白”既包括完整的维生素D受体蛋白(VDR)(其包括C-末端配体结合结构域),也包括分离或工程形式的维生素D受体的配体结合结构域(LBD)。例如,完整的维生素D受体蛋白或其配体结合结构域为通过DNA技术产生的重组蛋白。可以使用来自各种动物物种的编码维生素D受体的核苷酸序列并且进行了表征。因此,在本发明中用作受体蛋白的完整的维生素D受体蛋白或其配体结合结构域是例如但不限于哺乳动物起源的(例如,人类、小鼠或大鼠蛋白),或鸟类起源的,或两栖动物起源的;可替代地,其为任何此类蛋白的突变变体。
可选地,在本发明中用作受体蛋白的完整的维生素D受体蛋白或其配体结合结构域进一步包含亲和标签或被偶联至亲和标签,以便充分改善纯化和/或检测步骤。在最常见的亲和标签中,附接在目标蛋白的C-末端或N-末端的聚组氨酸标签(“His-标签”)是在蛋白质科学中常规采用,因此它们在本发明上下文中的使用完全处于本领域技术人员的知识范围内。表达的His-标记的蛋白质可以例如在含有过渡金属离子的基质上容易地被纯化,并且抗His-标签抗体的使用在定位和免疫沉淀研究中代表了一种有用且公知的工具。
因此,在本发明的优选的实施方式中,用作受体蛋白的完整的维生素D受体蛋白或其配体结合结构域是重组His-标记的融合蛋白。但是,可以采用其他亲和标签如例如Arg5、Strep-tag II、FLAG、荧光素(FITC)、Poly(A)、Poly(dT)和生物素。用于产生表位-标记的重组蛋白的技术通常在本领域中是已知的。在另一个优选的实施方式中,用作受体蛋白的完整的维生素D受体蛋白或其配体结合结构域被偶联至(coupled to)伴侣(chaperone)蛋白质或通常偶联至具有伴侣样功能的任何其他蛋白质,以便协助蛋白质折叠和/或改善稳定性。携带了旨在改善稳定性的氨基酸序列突变的受体蛋白(即,可能偶联至亲和标签或伴侣或伴侣样蛋白的完整的维生素D受体蛋白或其配体结合结构域)也可以用在本发明的上下文中。
如上所述,本发明的检测方法涉及捕获部分的使用,该捕获部分通过特异性识别构象改变的已结合至1,25(OH)2D或其类似物的VDR-LBD而能够结合VDR-LBD/1,25(OH)2D复合物而不会与未复合的VDR-LBD交叉反应。
在优选地实施方式中,捕获部分为所附权利要求1中限定的抗体。
由于本发明人首次使得所附权利要求1中限定的具有结合特异性的抗体可以获得,该抗体本身也落入本发明的范围。
因此,本发明的另一方面是一种抗体,其特异性地结合由VDR-LBD与1,25-二羟基维生素D或1,25-二羟基维生素D的类似物形成的复合物的维生素D受体的配体结合结构域而不会与未复合的VDR-LBD交叉反应。
优选地,本发明的抗体是单克隆抗体。如实施例中所描述的,本发明人生产了一些产生单克隆抗体的杂交瘤克隆,该单克隆抗体能够特异性地识别并结合至构象改变的已结合至1,25(OH)2D的VDR-LBD而基本上不与未复合的VDR-LBD交叉反应。指定为11B4H11H10的这些杂交瘤克隆中的一种产生一种单克隆抗体,其通过测序而被完全表征,从而确定其重链和轻链可变结构域的核酸和氨基酸序列。还确定了重链和轻链可变结构域两者的CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。
此种核酸和氨基酸序列示于序列表中,该序列表构成本说明书不可缺少的部分;在该序列表中,11B4H11H10的重链可变结构域的氨基酸和核酸序列分别指定为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8;11B4H11H10的轻链可变序列的氨基酸和核酸序列分别指定为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10;11B4H11H10的重链可变结构序列的CDR指定为SEQ ID NO:1、2和3,且11B4H11H10的轻链可变结构域的CDR指定为SEQ ID NO:4、5和6。
因此,根据优选的实施方式中,本发明的抗体是包含重链可变结构域和轻链可变结构域的单克隆抗体,其中重链可变结构域包含选自由SEQ ID NO:1、2和3组成的组中的至少一个CDR和/或轻链可变结构域包含选自由SEQ ID NO:4、5和6组成的组中的至少一个CDR。
在更优选的实施方式中,重链可变结构域包含CDR SEQ ID NO:1、2和3,和/或轻链可变结构域包含CDR SEQ ID NO:4、5和6。
在特定的实施方式中,重链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或由包含序列SEQ ID NO:8的核酸编码和/或轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:9或由包含序列SEQ ID NO:10的核酸编码。
如在本说明书中使用的术语“抗体”涵盖完整抗体分子(包括具有全长重链和轻链的多克隆、单克隆、嵌合的、人源化的、或人的版本)以及抗原结合抗体片段。“抗体片段”包括与相应的完整抗体具有相同结构特异性的任何免疫球蛋白片段。此种片段是根据标准方法来生产的;参见例如Harlow和Lane,"Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,Cold Spring Harbor,USA,1988。抗体片段的非限制性实例包括F(ab)、Fab’、F(ab’)2、F(v)、单链抗体(scFv)、F(c)、F(d)。
本发明的抗体优选地通过动物免疫来生产。简要地,根据本身已知的方法(Costagliola et al.,J Immunol 1998;160:1458-65),通过使用包含构象改变的结合至1,25-(OH)2维生素D或其类似物的VDR-LBD的免疫原注射动物(例如大鼠、仓鼠、兔或小鼠)来产生单克隆抗体。在初始注射后和/或加强注射后,通过对获自注射的动物的血清样品进行免疫测定法监测特异性抗体产生的存在。从发现产生一种或多种目标特异性抗体的动物中摘取脾细胞,并随后与骨髓瘤细胞融合配对物(partner)进行融合以产生杂交瘤细胞系,然后筛选它们分泌一种或多种目标抗体,即,特异性地结合至由VDR-LBD和1,25(OH)2D或其类似物形成的复合物的VDR-LBD的抗体的能力。
在本发明的检测方法中,可以通过许多技术来完成捕获的VDR-LBD/1,25(OH)2D复合物的检测。例如,可以通过采用标记的受体蛋白来直接产生可检测的信号或经由能够结合由捕获部分捕获的VDR-LBD/1,25(OH)2D复合物的标记的检测子(detector)分子来间接产生可检测的信号。典型地,检测子分子是指向VDR-LBD/1,25(OH)2D的表位的另一种抗体(即,抗VDR-LBD检测子抗体),前述表位不同于由本发明的捕获分子识别的表位。
可检测的标记物可以是能够产生通过视觉或仪器装置可检测的信号的任何物质。适合用于本发明的标记物包括例如荧光化合物、化学发光化合物、放射性化合物、酶和酶底物、适合用于比色检测的分子、结合蛋白、表位、酶或底物。在实践中,本领域中已知的任何信号分子或标记物可以并入到本发明的方法和试剂盒的实施方式中。
任何使得能够使生物流体样品与包含维生素D受体的配体结合结构域(VDR-LBD)的受体蛋白之间的接触的测定形式均适合于进行本发明的检测方法。
根据优选的实施方式,本发明的检测方法是在受试者或患者的生物流体样品上进行的体外免疫测定法。免疫测定法包括均相和非均相测定法,以及竞争性和非竞争性夹心测定法。
图1和图2通过实例的方式示出了根据本发明的单位点、非竞争性免疫测定法,其中经由1,25(OH)2D与包含维生素D受体的配体结合结构域(VDR-LBD)的标记的受体蛋白的结合形成的复合物被固定在固体载体上的本发明的构象特异性捕获抗体(其在图1和图2中指定为“单克隆抗结合LBD”)捕获。在图1和图2的实例中,固体载体为顺磁性颗粒(PMP)且标记物为氨基-丁基-乙基-异鲁米诺(ABEI)。
在图1的具体实施方式中,同时进行使用测定缓冲剂调节生物流体样品的pH的步骤和向样品中添加包含VDR-LBD的受体蛋白的步骤。在图2的具体实施方式中,顺序进行这些步骤。
图3通过实例示出了夹心免疫测定法。夹心免疫测定法的一般特征和步骤非常完善且为本领域技术人员众所周知。夹心免疫测定法是本发明的方法的特别优选的实施方式。
图3的夹心免疫测定法包括,使VDR-LBD/1,25(OH)2D复合物结合至固定在固体载体(例如,顺磁性颗粒,PMP)上的构象特异性捕获抗体(指定为“单克隆抗结合LBD”),和使用标记的检测子抗体作为夹心的第二部分。检测子抗体为直接标记的或通过由标记的抗免疫球蛋白抗体组成的偶联物识别(在图3的具体实例中,检测子抗体直接由ABEI标记)。然后,通过适合的方法测量直接或间接结合至VDR-LBD/1,25(OH)2D复合物的标记的抗体的量。
夹心免疫测定法可以涉及使用包含VDR-LBD的标记的受体蛋白与抗标签检测子抗体的组合。在这种实施方式中,被构象-特异性捕获抗体捕获的VDR-LBD/1,25(OH)2D复合物的检测是通过将检测子抗体特异性的结合至存在于复合物上的标签来实现的。优选地,标签为聚组氨酸标签。在更具体的实施方式中,标签为伴侣蛋白。
落入本发明的范围内的免疫测定法可以为任何适合的格式,如例如放射免疫测定法(RIA)、化学发光或荧光免疫测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于Luminex的珠子阵列、蛋白质微阵列测定法、或快速试验格式如例如免疫层析条试验。
取决于免疫测定法的格式,捕获抗体和/或检测子抗体可以被固定在固体载体上。适合的固体载体的非限制性实例为微量滴定板的孔、微粒(如胶乳、聚苯乙烯、硅石、螯合琼脂糖或磁性珠、膜、条带或碎片)的表面。
如上所述,本发明的进一步方面为一种用于检测生物流体样品中的1,25(OH)2D或其类似物的试剂盒,试剂盒包括如以上连同方法定义的受体蛋白和捕获部分、以及具有6~9的pH的结合缓冲剂。优选的pH值处于7和8.6之间,如7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7.、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5或8.6。用于调节测试样品的pH的结合缓冲剂的优选的但非限制性的实例包括50mM Tris缓冲剂(pH 7.4)、Hepes(6.5-7.5)、PBS。
本发明的试剂盒可以进一步包含固体载体,如但不限于珠、微粒、纳米粒子、超顺磁性颗粒、微量滴定板、比色杯、侧向流动装置、流通池、或者蛋白质或肽能够被动或共价结合的任何表面。本发明的试剂盒的受体蛋白或捕获部分可以被固定在固体载体上。
进一步的,本发明的试剂盒可以含有以上连同检测方法所描述的检测方法。
纯粹通过说明的方式提供下列实验部分,并且它们不旨在限制所附权利要求书中定义的本发明的范围。
具体实施方式
实施例1:表达和纯化大鼠VDR-LBD蛋白
为了产生待用作适合用于本发明的方法和试剂盒的重组VDR-LBD蛋白,构建了基于质粒的表达载体。简要地,通过使用Nde I/Bgl II限制性位点组合,将编码缺失47个氨基酸内部环(165-211)的来自褐家鼠(Rattus norvegicus)残基116-423的维生素D受体的配体结合结构域(rVDR-LBD)的DNA克隆到pET-29b质粒(Novagen)中。为了促进重组VDR-LBD蛋白质的检测和纯化,通过在VDR-LBD编码序列的下游克隆His标签编码序列,随后为终止密码子,在目标蛋白的C-末端添加聚组氨酸标签。
在生长于补充有卡那霉素(40μg/L)和氯霉素(40μg/L)的LB中的BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(Stratagene)细胞中,编码VDR-LBD蛋白的质粒表达为内含体。用单菌落培养起始(发酵剂,starter)培养物(5mL)并且在37℃(250rpm)下于14mL管中生长6小时以达到~1的光密度(OD600)。以2500倍将起始培养物稀释至过夜培养物(35mL)中并且在30℃(250rpm)下于125mL烧瓶中生长15h(典型的OD600~3.7)。在2L的烧瓶中将过夜培养物稀释于0.5L表达培养基中,OD600为~0.09。培养物生长~2.5h(250rpm)至0.6-0.8的OD600,并且通过添加IPTG至0.35mM的最终浓度以诱导VDR-LBD的表达。使培养物在37℃持续生长6小时,然后通过在4℃在5000rpm(GS3转子)下离心15分钟来收获细胞。将新鲜收集的细胞沉淀(典型地5.5g/L培养物)存储在-80℃以用于进一步的蛋白质纯化。
将细胞沉淀(5.5g)重悬浮于含有50mM Tris–HCl(pH 8.0)、2mM EDTA、10mM DTT、0.3mM苯甲基磺酰氟和0.5mg/mL溶菌酶的135mL裂解缓冲液中,随后使用超声细胞破碎仪(Fisher)进行超声。通过在4℃在11000rpm(SS34转子)下离心15分钟获得包括细胞碎片和内含体的沉淀,并且使用200mL洗涤缓冲液(50mM Tris–HCl、2mM EDTA、100mM NaCl,pH8.0)洗涤,随后使用200mL具有0.5%(v/v)Triton X-100的相同的洗涤缓冲液进行洗涤。在每次添加之后,将浆料温和地搅拌5分钟,然后在4℃在12000rpm离心20分钟。将最终的沉淀非常温和地悬浮于200mL含有40mM Tris-乙酸(pH 7.6)、2mM EDTA、6M胍-HCl和100mM DTT的变性缓冲液中,并且在室温下搅拌2小时。通过在4℃在12000rpm下离心20分钟获得清液。在4℃,将上清液相对于20L含有25mM NaH2PO4-Na2HPO4(pH 7.4)、50mM KCl和2mM DTT的透析缓冲液透析过夜。第二天,通过离心去除下白色沉淀物并且回收上清液,并且更换两次含有16mM HEPES(pH 7.4)、25mM NaCl、15mM KCl和2mM DTT的缓冲液再继续透析24小时。在Amicon离心过滤器(10K MWCO)中浓缩蛋白质溶液,并且更换至含有16mM HEPES(pH 7.4)、25mM NaCl、15mM KCl和10mM TCEP的最终缓冲液中。缓冲液更换是通过重复稀释和浓缩以去除与His-标签珠不相容的DTT来进行的。通过12%SDS-PAGE分析蛋白质的纯度。通过Bradford方法使用BSA作为标准(系数0.055μg-1cm-1)来测定蛋白质浓度。VDR-LBD的典型产率为25-30mg/L培养物并且高度依赖于表达水平,其是通过培养物的健全性和透析操作来确定的。
实施例2:产生能够识别VDR-LBD/1,25(OH)2D复合物的构象特异性单克隆抗体
本发明人为了产生构象特异性抗体的所追求的策略,以由结合于1,25(OH)2D的维生素D受体的结合结构域(VDR-LBD)组成的复合物作为免疫原的利用为基础。单独使用配制有适合佐剂的免疫原的等分试样注射到BALB/c小鼠中。在4、6和8周之后,使用聚乙二醇(PEG)作为融合剂,将来自小鼠脾脏的淋巴细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合。以高通量96孔培养板格式将杂交细胞种植于384孔中。
使用目标免疫原(即VDR-LBD/1,25(OH)2D复合物)在主融合板上通过ELISA测定抗原特异性免疫活性,并且使用单独的未结合的维生素D配体结合域作为阴性对照。简要地,96-孔微量滴定板分别涂布有100μl的0.56μg/ml未结合形式或与1,25(OH)2D预结合的His-标记的重组VDR-LBD蛋白质。通过将三摩尔过量的1,25(OH)2D(1mg/ml)的存在下过夜培养VDR-LBD蛋白质以进行预结合反应。通过聚组氨酸标记与存在于孔表面上的镍离子涂层之间的特异性反应来实现蛋白质至微量滴定板上的吸附。在蛋白质吸附之后,使用PBS-T(0.1%溶于PBS的吐温20)洗涤板并且在室温下用100μl的1:16000稀释的待查单克隆抗体培养1小时,同时温和地混合。在培养之后,使用PBT-T洗涤板三次,并且在室温下使用100μl的1:30000稀释于PBS-T中的HRP-结合的山羊抗小鼠IgG(1mg/ml)培养1小时。然后,在室温下用100μl/孔的TMB底物培养经洗涤的板10分钟。通过添加150μl/孔的1%HCl溶液终止反应。使用酶标仪在450nm下测量吸光度。
此种筛选策略使得能够检测和选择分泌抗体的克隆,抗体仅对VDR-LBD/1,25(OH)2D复合物显示出特异性而对未结合的配体结合结构域则不显示出特异性(表1)。然后,通过限制稀释法来克隆经选择的杂交瘤细胞并且根据上述的ELISA方法再筛选。对具有期望滴度和特异性的克隆进行亚克隆以稳定抗体表达。
初步测试所选择的克隆的每一个以确定小鼠免疫球蛋白的同种型,随后扩增至生产规模。在克隆扩增之后,使用AKTAprime plus通过蛋白A亲和纯化来分离小鼠IgG并且经受使用Hitrap脱盐柱的缓冲液交换至1X DPBS缓冲液中。使用0.2μm过滤器杀菌由此获得的抗体样品,评估样品浓度并且将产品无菌包装于聚丙烯管中并且存储在4℃下。
作为上述研究的结果,选择了称为11B4H11H10的杂交瘤克隆以用于进一步分析。
表1
(用根据本发明的能够特异性结合抗VDR-LBD/1,25(OH)2D复合物的4个抗体获得的ELISA筛选数据)
上述的选择方法也可以用来识别分泌根据本发明的抗体(即能够特异性结合结合于1,25-二羟基-维生素D或其类似物的维生素D受体的配体结合结构域的mAb或其功能片段)的进一步的杂交瘤克隆。
实施例3:识别由杂交瘤克隆11B4H11H10表达的免疫球蛋白G VH和VL基因的DNA共
有序列
解冻11B4H11H10的主原料瓶并且扩增以产生用于cDNA文库构建的代表性的细胞数。简要地,从75cm2烧瓶中活性对数生长的细胞培养物中分离出1 x 107个杂交瘤细胞,并且在聚丙烯50cm2无菌离心管中在500 x g离心4分钟。使用试剂(Invitrogen)分离出总RNA,并且在NanodropTM上定量。使用寡聚dT引物程序逆转录杂交瘤总RNA(500ng)。通过使用特异性引物由cDNA文库扩增(RT-PCR)小鼠免疫球蛋白可变重链(Vh)和可变轻链(Vl)。通过TA克隆,以随机取向将这些扩增的链独立地插入到TOPO载体(Invitrogen)中。通过电穿孔将连接产物转化至大肠杆菌(E.coli)的电转感受态维持菌株中。
从每个转化板中选择二十个独立的细菌菌落,并且通过接种到处于15ml聚丙烯保护帽管中的10ml LBA肉汤(100μg/ml氨苄西林)中且在37℃下使用250rpm轨道振荡过夜生长来扩增。由此,为Vh和V1产生二十个纯化的质粒DNA。
使用T7测序引物,以单复制正向(5’-3’)反应通过自动DNA测序(FunctionalBiosciences,Madison,Wisconsin)来筛选初始二十个Vh和Vl TOPO质粒的每一个以确定是否存在全长Vh或Vl插入。在序列对齐之后,出现了单个代表性的Vh和Vl,表明在RNA分离时的杂交瘤群体为单克隆。
选择最多达十个代表性的含有相应全长插入的Vh和Vl的质粒用于另外复制的DNA测序。更具体地,每个质粒进行两个另外的T7正向和BGH逆向反应以构建共有序列。
使用CLC Workbench进行DNA对齐以便产生新的小鼠免疫球蛋白可变重和可变轻共有序列。在将识别的DNA共有序列翻译为氨基酸伸展后,采用NCBI BLAST用于Vh和Vl蛋白结构域分析以确认序列为小鼠免疫球蛋白基因并绘制重要结构域、包括互补性决定区(CDR)的图谱(映射,map)。
指定为11B4H11H10的单克隆抗体的DNA共有序列以及其CDR示于序列表中。
实施例4:1,25(OH)2D测定
如下开发本发明的测定法的优选的实施方式之一。使用11B4单克隆抗体按照供应商的说明书涂布顺磁性微粒(PMP)(Dynal,Norway)。如实施例1中的描述制备在测定法中使用的重组VDR-LBD,并且被偶联至亲和标签(在下文中指定为“TAG”)。如实施例2中的描述制备在测定法中使用的11B4H11H10单克隆抗体。在PBS缓冲液pH 7.4中将小鼠单克隆抗TAG抗体与环状氨基丁基乙基异鲁米诺(cABEI)结合。计算的cABEI并入为2~3分子每抗体分子。通过将不同浓度的1,25(OH)2D的乙醇溶液添加到无类固醇的、活性炭处理的(charcoal-stripped)人血清中来制备校准物。测定缓冲液配方由TRIS 50mM pH 7.4、CHAPS 0.02%、EDTA 1mM、8mg/ml的肝素和1%小鼠血清组成以缓解嗜异性人抗小鼠(HAMA)干扰。
不使用任何离线预分析/样品预处理步骤的自动测定法的主要挑战在于,测定法特异性地捕获并且检测生物基质(例如,血清或血浆)中的全部量的1,25(OH)2D或活性形式的维生素D的类似物、而不会受到可能以比1,25(OH)2D高1000倍的水平存在的其他维生素D代谢物如25(OH)D、24,25(OH)2D和25,26(OH)2D的干扰的能力。这种挑战进一步被维生素D结合蛋白(DBP)和白蛋白的存在复杂化,它们在循环中大量存在并且充当25(OH)D、1,25(OH)2D、和维生素D的其他代谢物的主要结合蛋白,由此85%至90%结合至DBP且10至15%结合至白蛋白。另外,高雌激素状态(例如,怀孕)下,DBP水平提高至2-5倍。
因此,为了验证本发明的测定法以VDBP-非依赖性方式特异性地捕获并检测全部量的循环1,25(OH)2D的能力,发明人制备了跨越该测定法的测量范围的一组人类血清样品(N=17;8位明显健康的人和9位孕妇)。使用FDA-批准的来自位于Stillwater,MN USA的DiaSorin Inc.的1,25(OH)2D放射免疫测定法(部件号65100E/100管;1,25-二羟基维生素D)来测量这些17个样品中的预期1,25(OH)2D值(pg/mL),该测定法随后用作参比方法。
示意性描述于图3中的测定法是在DiaSorin分析仪(Saluggia,Italy)上进行的。首先,用100μl的测定缓冲液和50μl的VDR-LBD-TAG培养50μl的人类血清样品30分钟。接下来,加入20μl涂布有11B4H11H10单克隆抗体的PMP,并且将反应混合物培养另外的30分钟。在洗涤反应混合物之后,加入40μl cABEI-结合的抗TAG单克隆抗体,并且将反应混合物培养另外的30分钟。在第二次洗涤之后,加入引发溶液,并且在分析仪读数室中读取反应混合物的相对光单位(RLU).
为了将本发明的1,25(OH)2D测定法与作为参比方法的DiaSorin RIA进行比较,基于RLU相对于由图4示出的标准曲线获得的剂量(pg/mL),将由各个样品获得的RLU转化为pg/mL。图4的标准曲线是按如下获得的。通过将不同浓度的1,25(OH)2D的乙醇溶液加入到无类固醇的、活性炭处理的人血清中来制备标准曲线校准物。使用散点图(Scatter Plot)以三阶多项式拟合将校准物响应(RLU)相对于剂量(pg/mL)绘图。然后,将样品RLU转化为pg/mL(表2),并且通过使用Passing&Bablok拟合、线性回归、和Bland Altman%差分图分析进行测定法与参比方法之间的相关性分析。所获得的结果分别示于图5A、图5B和图5C中。分析表明,使用本发明的测定法确定的剂量与使用DiaSorin RIA参比测定法确定的剂量实质上等同(斜率为0.89,截距为6.6pg/mL,R2为0.96,且平均%差分为-2.8%),由此表明,本发明的测定法能够独立于DBP血清浓度而准确地捕获并检测人类血清中的全部量的循环1,25(OH)2D。
最后,为了证明人类血清中1,25(OH)2D的特异回收,使用FDA 510(k)澄清的25OH Vitamin D TOTAL Assay(部件号310600,DiaSorin Inc.,Stillwater,MN,USA)确定每组样品(N=17)中的总25(OH)D的浓度(ng/mL)。由于在510(k)澄清的DiaSorin RIA 1,25(OH)2D剂量和510(k)澄清的25OH Vitamin D TOTALAssay(OH)D剂量之间不存在相关性(图6),我们得出结论:本发明的1,25(OH)2D测定法不依赖于血清总25(OH)D浓度,特异性地且定量地回收了人类血清中的全部量的1,25(OH)2D。这些结果示于图6中,其显示在1,25(OH)2D剂量和25(OH)D剂量之间不存在显著的相关性(p=0.4546)。
表2
(基于RLU相对于由图4中的LIAISON标准曲线获得的剂量,用各个样品获得的RLU被转化为剂量(pg/mL)。剂量跨越了测定法测量范围23.8pg/mL(最小)至164.0pg/mL(最大),平均为83.54pg/mL且95%CI 65.04至102.03pg/mL)。
。
Claims (14)
1.一种抗体,其特异性地结合至维生素D受体的配体结合结构域(VDR-LBD),其特征在于所述抗体选择性鉴别形成自VDR-LBD和1,25-二羟基维生素D或其类似物的复合物和未复合的VDR-LBD,其中,所述抗体的重链可变结构域的CDR为SEQ ID NO:1、2和3,且所述抗体的轻链可变结构域的CDR为SEQ ID NO:4、5和6,并且其中所述维生素D类似物为19-去甲-1α-25-二羟基维生素D2、1α-羟基维生素D2、1α-羟基麦角钙化甾醇或2-亚甲基-19-去甲-(20S)-1α,25-(OH)2D3。
2.根据权利要求1所述的抗体,其中所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:7或由包含SEQ ID NO:8的核酸序列编码。
3.根据权利要求1所述的抗体,其中所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9或由包含SEQ ID NO:10的核酸序列编码。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体,其选自由以下各项组成的组:完整的免疫球蛋白、单链抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv。
5.一种捕获部分在制造用于检测生物流体样品中的1,25-二羟基维生素D(1,25(OH)2D)或其类似物的试剂盒中的应用,其中所述捕获部分为在权利要求1至4中任一项中所限定的抗体,并且所述检测包括步骤:
(i)将所述生物流体样品的pH调节至包含在6和9之间的值,并且同时地或顺序地向所述生物流体样品中添加包含维生素D受体的配体结合结构域(VDR-LBD)的受体蛋白,由此获得1,25-二羟基维生素D或其类似物与所述受体蛋白的所述VDR-LBD的结合;
(ii)通过捕获部分捕获包含结合至1,25-二羟基维生素D或其类似物的维生素D受体的配体结合结构域(VDR-LBD)的受体蛋白,所述捕获部分特异性地结合维生素D受体的配体结合结构域(VDR-LBD),所述捕获部分能够选择性鉴别形成自VDR-LBD和1,25-二羟基维生素D或其类似物的复合物和未复合的VDR-LBD;和
(iii)检测被捕获的包含已结合至1,25-二羟基维生素D或其类似物的维生素D受体的配体结合结构域(VDR-LBD)的受体蛋白,
其中所述维生素D类似物为19-去甲-1α-25-二羟基维生素D2、1α-羟基维生素D2、1α-羟基麦角钙化甾醇或2-亚甲基-19-去甲-(20S)-1α,25-(OH)2D3。
6.根据权利要求5所述的应用,其中所述受体蛋白为分离的或工程形式的完整的维生素D受体蛋白或者其配体结合结构域(LBD)。
7.根据权利要求5至6中任一项所述的应用,其中所述捕获部分被固定在固体载体上。
8.根据权利要求5至6中任一项所述的应用,其中所述生物流体为全血、血浆、血清或尿。
9.根据权利要求5至6中任一项所述的应用,其中步骤(i)中,所述生物流体样品的pH被调节至包含在7和8.6之间的值。
10.根据权利要求5至6中任一项所述的应用,其使用夹心免疫测定法。
11.根据权利要求10所述的应用,其中通过标记的抗VDR-LBD检测子抗体来进行步骤(iii)的检测被捕获的包含已结合至1,25-二羟基维生素D或其类似物的维生素D受体的配体结合结构域(VDR-LBD)的受体蛋白。
12.一种用于检测生物流体样品中的1,25-二羟基维生素D或其类似物的试剂盒,所述试剂盒包括:
-包含维生素D受体的配体结合结构域(VDR-LBD)的受体蛋白;
-特异性地结合维生素D受体的配体结合结构域(VDR-LBD)的捕获部分,所述捕获部分能够选择性鉴别形成自VDR-LBD和1,25-二羟基维生素D或其类似物的复合物和未复合的VDR-LBD;和
-具有包含在6和9之间的pH的结合缓冲液;
其中所述捕获部分为在权利要求1至4中任一项中所限定的抗体,
并且其中所述维生素D类似物为19-去甲-1α-25-二羟基维生素D2、1α-羟基维生素D2、1α-羟基麦角钙化甾醇或2-亚甲基-19-去甲-(20S)-1α,25-(OH)2D3。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其中所述受体蛋白为分离的或工程形式的完整的维生素D受体蛋白或者其配体结合结构域。
14.根据权利要求12至13中任一项所述的试剂盒,其中所述结合缓冲液具有包含在7和8.6之间的pH。
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