BR112017008985B1 - Método in vitro para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina d, uso de um método in vitro, uso de um primeiro agente de ligação e kit - Google Patents

Abstract

MÉTODO IN VITRO PARA A DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE 25- HIDROXIVITAMINA D, UTILIZAÇÃO DE UM MÉTODO IN VITRO, UTILIZAÇÃO DE UM PRIMEIRO AGENTE DE LIGAÇÃO E CONJUNTO. A presente invenção se refere a um método in vitro para a medição de 25-hidroxivitamina D, em que o composto potencialmente interferente de 24,25- diidroxivitamina D3 é bloqueado por um agente de ligação que especificamente se liga à 24,25- diidroxivitamina D3 e não se liga à 25-hidroxivitamina D.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]A presente invenção se refere a um método in vitro para a medição de 25-hidroxivitamina D, em que o composto potencialmente interferente de 24,25-diidroxivitamina D3 é bloqueado por um agente de ligação que especificamente se liga à 24,25-diidroxivitamina D3 e não se liga à 25- hidroxivitamina D.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Um suprimento adequado de vitamina D é vital como o termo “vitamina” já sugere. A deficiência de vitamina D ocasiona doenças graves: tais como o raquitismo ou osteoporose. Embora a vitamina D ainda fosse considerada como uma substância única no início do século passado, o sistema de vitamina D alterou ao longo das últimas décadas para uma rede complexa e multiforme de metabolitos de vitamina D. Nos dias atuais, mais de 40 produtos diferentes metabólicas de vitamina D são conhecidos (Zerwekh, JE, Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281).

[003] Os seres humanos somente podem produzir as vitaminas D3 ou calciferóis através da ação dos raios ultravioletas da luz solar sobre a pele. A vitamina D3 no sangue está ligada à denominada proteína de ligação da vitamina D e é transportada para o fígado em que é convertida na 25- hidroxivitamina D3 através da 25-hidroxilação. Sabe-se nos dias atuais, que uma diversidade de outros tecidos está envolvida no metabolismo da vitamina D, além de pele e fígado, os dois órgãos que foram mencionados anteriormente (Schmidt-GayK, H. et al., (Eds.), “Calcium regulating hormones, vitamin D metabolites and cyclic AMP”, Springer Verlag, Heidelberg (1990) páginas 2447). A 25-hidroxivitamina D e mais especificamente a 25-hidroxivitamina D2 e 25-hidroxivitamina D3 são as formas principais de armazenamento da vitamina D no organismo humano em relação às suas quantidades. Quando necessário, estes precursores podem ser convertidos nos rins para a formação da 1α,25- diidroxivitamina D biologicamente ativa, a denominada hormona D. A vitamina D biologicamente ativa regula, entre outras, a absorção do cálcio a partir do intestino, a mineralização óssea e influencia um número amplo de outras vias metabólicas: tal como, por exemplo, o sistema de insulina.

[004]A medição em si do nível de vitamina D é de pouco benefício para determinar o status da vitamina D de um indivíduo ou paciente, uma vez que as concentrações de vitamina D (vitamina D2 e vitamina D3) oscilam muito, dependendo da absorção de alimentos ou exposição à luz solar. Além disso, a vitamina D possui uma meia-vida biológica relativamente curta na circulação (24 horas) e, por conseguinte, também não é um parâmetro adequado para determinar o status da vitamina D de um paciente. O mesmo também se aplica às formas fisiologicamente ativas da vitamina D (1,25-hidroxivitamina D). Estas formas biologicamente ativas também ocorrem nas concentrações relativamente pequenas e altamente flutuantes em comparação com a 25- hidroxivitamina D. Por todas estas razões, a quantificação da 25- hidroxivitamina D em especial, é um meio adequado para globalmente analisar o status geral da vitamina D de um indivíduo ou paciente.

[005] Os metabolitos da vitamina D, tal como a 25-hidroxivitamina D estão ligados com afinidade elevada através da proteína de ligação da vitamina D e a uma extensão limitada também à albumina e algumas lipoproteínas. Os métodos adequados para a liberação de um metabolito da vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D em circunstâncias normais também será mais do que adequado para a liberação de um metabolito da vitamina D também a partir de qualquer outra proteína.

[006]A ligação da 25-hidroxivitamina D ou de outros compostos de vitamina D com a proteína de ligação da vitamina D amplamente dificulta a determinação dos compostos de vitamina D. Todos os métodos conhecidos necessitam que o composto de vitamina D a ser analisado seja liberado ou separado do complexo que forma com a proteína de ligação da vitamina D. Na sequência, este é dito como a liberação de um composto de vitamina D a partir de proteína de ligação da vitamina D, por uma questão de simplificação, embora, naturalmente, ele somente possa ser liberado a partir de um complexo do composto de vitamina D e da proteína de ligação da vitamina D, e não a partir da proteína de ligação da vitamina D isoladamente.

[007]A proteína de ligação da vitamina D é desdobrada em pH ácido, mas apresenta uma tendência elevada para corretamente redobrar e religar o analito, quando o pH é deslocado de volta para as condições neutras. Por conseguinte, muitas vezes é necessário liberar os compostos de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D em primeiro lugar e, em seguida, separar a proteína de ligação da vitamina D a partir dos compostos de vitamina D a serem analisados.

[008] Devido à importância clínica elevada da 25-hidroxivitamina D, é conhecido um número amplo de métodos a partir da literatura, o que possibilita que a 25-hidroxivitamina D seja determinada de maneira relativamente confiável.

[009] Haddad, J. G. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995, e Eisman, JA et al., Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305, por exemplo, descrevem a determinação das concentrações da 25-hidroxivitamina D nas amostras de sangue, utilizando a cromatografia líquida de desempenho elevado (HPLC).

[010] Outras abordagens para a determinação da 25- hidroxivitamina D são com base, entre outras, na utilização das proteínas de ligação da vitamina D tais como aquelas que estão presentes no leite. Por conseguinte, Holick, M. F. e Ray, R. (patente US 5.981.779) e DeLuca et al., (patente EP 0.583.945) descrevem as análises da vitamina D para a hidroxivitamina D e diidroxivitamina D que são com base na ligação destas substâncias na proteína de ligação da vitamina D, em que as concentrações destas substâncias são determinadas por meio de um procedimento de teste competitivo. No entanto, um pré-requisito deste método é que os metabolitos da vitamina D a serem determinados, em primeiro lugar devem ser isolados a partir das amostras de sangue ou de soro original e devem ser purificados, por exemplo, através da cromatografia.

[011]Armbruster, F.P. et al., (WO 99/67211) ensinam que uma amostra de soro ou plasma deve ser preparada para a determinação da vitamina D através da precipitação do etanol. Neste método, o precipitado de proteína é removido através da centrifugação e o sobrenadante de etanol contém os metabolitos solúveis da vitamina D. Estes podem ser medidos em uma análise de ligação competitiva.

[012] De maneira alternativa, a patente EP 0.753.743 ensina que as proteínas podem ser separadas a partir das amostras de sangue ou de soro utilizando um sal de periodato. Neste caso, os compostos de vitamina D são determinados no sobrenadante livre de proteínas a partir das amostras tratadas com o periodato. Em alguns testes comerciais, a acetonitrila é recomendada para a extração da amostra de soro ou de plasma (por exemplo, a radioimunoanálise da DiaSorin ou no teste da vitamina D da “Immundiagnostik” Company).

[013] Nos últimos anos, uma série de diferentes reagentes de liberação foi proposta que, em princípio, deve ser adequada para a liberação dos compostos de vitamina D a partir de qualquer proteína de ligação presente na amostra. No entanto, esta liberação ou desprendimento deve ser realizado em condições relativamente amenas, por conseguinte, possibilitando uma utilização direta da amostra tratada com o reagente de liberação em um teste de ligação (vide, por exemplo, a publicação WO 2002/57797 e patente US 2004/0.132.104). Apesar dos imensos esforços nos últimos anos, todos os métodos disponíveis para a determinação de vitamina D apresentam desvantagens: tais como a preparação trabalhosa da amostra, padronização ruim, acordo ruim entre os procedimentos de teste ou má recuperação da vitamina D cravada (vide, para isso em especial, Zerwekh, JE, supra).

[014] Na patente US 7.087.395, os hidróxidos de metais, bem como a ciclodextrina e seus derivados, e os salicilatos de metais são utilizados para a liberação dos compostos de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, que resulta em uma desnaturação irreversível da proteína de ligação da vitamina D ou de outras proteínas de soro. Os tensoativos, tais como o Triton X100 ou Tween-20, foram utilizados para impedir que o composto de vitamina D seja não especificamente ligado aos lipídeos e proteínas na amostra após a desnaturação.

[015] É particularmente difícil automatizar um teste para um composto de vitamina D. A automação necessita da solução de um problema muito difícil, isto é, sobreviver a uma caminhada na corda bamba: Por um lado, é necessário liberar os compostos de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D com o auxílio de um reagente de liberação adequado, por outro lado, as condições devem ser selecionadas de tal maneira que a amostra ainda possa ser diretamente analisada. Um pré-requisito desta análise adicional direta é que, por um lado, a proteína endógena de ligação da vitamina D não se ligue ou não mais se ligue de forma significativa aos compostos de vitamina D, durante esta análise e, por conseguinte, não interfira com esta análise e, por outro lado, que a liberação do reagente utilizado não interfira com a ligação dos reagentes de detecção, tais como os anticorpos, ou uma proteína de ligação da vitamina D. Além disso, é conhecido que diferentes alelos da proteína de ligação da vitamina D estão presentes na população humana que bioquimicamente se comportam de maneira diferente. A liberação e a medição dos compostos de vitamina D devem ser comparáveis para os diversos alelos / fenótipos.

[016] Recentemente (publicação WO 2011/144661), uma análise de vitamina D que utiliza um tratamento de amostra adequado, pode ser realizada online e sem precipitação / separação de qualquer proteína de ligação à vitamina D que possa estar presente na amostra. Este método é com base na utilização de reagente de liberação de vitamina D contendo um sal de carbonato de hidrogênio e/ou uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise em uma concentração total de 0,1 M a 2,0 M, um agente de redução e um agente de alcalinização. Utilizando este reagente de liberação, qualquer composto de vitamina D é liberado da proteína de ligação à vitamina D, enquanto ao mesmo tempo a proteína de ligação à vitamina D incluída na amostra é inativada e não mais se liga à vitamina D. O composto de vitamina D liberado pode ser medido por meios adequados.

[017] Em amostras biológicas, estão presentes muitos compostos relacionados com a vitamina D que estão estruturalmente estreitamente relacionados entre si. A 24,25-diidroxivitamina D3 está presente em quantidades bastante significativas em quase todas as amostras biológicas e realmente interfere com a medição da hidrovitamina D. A sua concentração depende da quantidade total de 25-hidroxivitamina D em uma amostra bem como no contexto clínico de um indivíduo levando a variações entre os coortes de pacientes com diferentes antecedentes medicinais. Poderia ser mostrado que é possível evitar a interferência causada por 24,25-diidroxivitamina D3 incubando uma amostra com um agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3 e não se liga à 25-hidroxivitamina D.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[018] Em uma realização, a presente invenção se refere a um método in vitro para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, o método compreende as etapas: (a) do fornecimento de uma amostra obtida de um indivíduo; (b) da mistura da amostra; (ba) com um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3, por conseguinte, formando um complexo entre o primeiro agente de ligação e a 24,25-diidroxivitamina D3; (bb) com um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, por conseguinte, formando um complexo entre o segundo agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D; (c) da medição do complexo formado em (bb), por conseguinte, determinando a concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3.

[019] Em uma outra realização, a presente invenção se refere à utilização do(s) método(s), de acordo com a presente invenção para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3.

[020]A presente invenção ainda se refere, em uma realização, à utilização de um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25-diidroxivitamina D3 e a um segundo agente de ligação que se liga à 25-hidroxivitamina D em um método(s) in vitro, de acordo com a presente invenção, para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25- diidroxivitamina D3 em uma amostra obtida de um indivíduo.

[021] De acordo com uma outra realização, a presente invenção se refere a um conjunto para a realização do(s) método(s), de acordo com a presente invenção, que compreende, pelo menos, (d) um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3, em que o primeiro agente de ligação é um anticorpo monoclonal ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal e (e) um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, em que o segundo agente de ligação é uma proteína de ligação à vitamina D.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[022]A presente invenção se refere a um método para a determinação da quantidade total e/ou da concentração de 25-hidroxivitamina D na presença de um agente de ligação que se liga à 25-hidroxivitamina D bem como aos conjuntos, composições e utilizações relacionadas com este.

[023] Em uma realização, a presente invenção se refere a um método in vitro para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, o método compreende as etapas: (a) do fornecimento de uma amostra obtida de um indivíduo, (b) da mistura da amostra; (c) ) com um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3, por conseguinte, formando um complexo entre o primeiro agente de ligação e a 24,25-diidroxivitamina D3; (d) ) com um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, por conseguinte, formando um complexo entre o segundo agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D; (c) da medição do complexo formado em (bb), por conseguinte, determinando a concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3.

[024] Os artigos “um” e “uma” são utilizados no presente para se referir a um ou a mais do que um (isto é, a, pelo menos, um) do objeto gramatical do artigo.

[025]A expressão “um ou mais” significa de 1 a 50, de preferência, de 1 a 20, também de preferência, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 ou 15.

[026] O termo “detecção” se refere à detecção qualitativa ou quantitativa de um analito em uma amostra para a determinação da quantidade e/ou concentração do analito, no presente, as medições de um analito tal como a 25-hidroxivitamina D. A “detecção” inclui quaisquer meios de detecção, incluindo a detecção direta e indireta.

[027] O termo “determinação” é utilizado no presente para a detecção qualitativa e para a quantitativa de um analito em uma amostra, e pode incluir a determinação da quantidade e/ou concentração do analito. O termo também abrange a identificação e/ou qualquer caracterização de um analito com base em parâmetros físicos.

[028] Se não for indicado de outra maneira, o termo “25- hidroxivitamina D” ou “composto de vitamina D” deve ser entendido como incluindo todos os compostos de ocorrência natural, que contêm a cadeia principal da vitamina D2 ou a cadeia principal da vitamina D3, de acordo co m as seguintes Fórmulas Estruturais I e II. FÓRMULA I FÓRMULA II

[029] Nas Fórmulas Estruturais I e II, as posições da vitamina D são apresentadas de acordo com a nomenclatura dos esteroides. A 25- hidroxivitamina D indica os metabólitos de vitamina D que são hidroxilados na posição 25 das Fórmulas Estruturais I e II, isto é, a 25-hidroxivitamina D2, bem como a 25-hidroxivitamina D3. Os compostos adicionais de hidroxivitamina D conhecidos são, por exemplo, as formas da 1,25-diidroxivitamina D e da 24,25- diidroxivitamina D.

[030]A 1,25-diidroxivitamina D se refere às formas ativas de vitamina D (as denominadas hormonas D) que possuem uma hidroxilação na posição 1, bem como na posição 25 de uma das Fórmulas Estruturais I e II.

[031] Outros compostos de vitamina D bem conhecidos são a 24,25-diidroxivitamina D2, 24,25-diidroxivitamina D3 e 3-epi-25-hidroxivitamina D.

[032] Em uma realização, de acordo com a presente invenção, a 25-hidroxivitamina D é selecionada a partir do grupo que consiste em 25- hidroxivitamina D2, 25-hidroxivitamina D3, 24,25-diidroxivitamina D2, 24,25- diidroxivitamina D3 e 3-epi-25-hidroxivitamina D. Em uma realização de preferência, a 25-hidroxivitamina D é selecionada a partir do grupo que consiste em 25-hidroxivitamina D2 e 25-hidroxivitamina D3.

[033]A 24,25-diidroxivitamina D3 está presente em quantidades bastante significativas em quase todas as amostras biológicas e interfere com a medição da 25-hidrovitamina D. A sua concentração depende da quantidade total de 25-hidroxivitamina D em uma amostra assim como no contexto clínico de um indivíduo levando a variações entre os coortes de pacientes com diferentes antecedentes medicinais. Poderia ser mostrado que é possível evitar a interferência causada por 24,25-diidroxivitamina D3 incubando uma amostra com um agente de ligação que se liga à 24,25-diidroxivitamina D3 e não se liga à 25-hidroxivitamina D.

[034] Se não for indicado o contrário, o termo “24,25- diidroxivitamina D” deve ser entendido como incluindo todos os compostos de ocorrência natural que contêm a estrutura principal da vitamina D3 e um grupo OH nos átomos de carbono 24 e 25, respectivamente, de acordo com a seguinte Fórmula estrutural III. Em uma realização, de acordo com a presente invenção, a 24,25-diidroxivitamina D é a 24,25-diidroxivitamina D3 (24(R),25- (OH)2D3). FÓRMULA III

[035]A amostra que compreende o(s) analito(s) (por exemplo, a 25-hidroxivitamina D, 24,25-diidroxivitamina D3) pode ser uma composição líquida, em gel ou liquefeita, de preferência, um líquido. Esse líquido pode ser uma solução, suspensão ou emulsão. Em especial, a amostra é uma amostra biológica, em especial, uma amostra corporal obtida a partir de um humano ou animal, ou suas misturas. Esta amostra corporal pode ser utilizada diretamente após a recuperação de um indivíduo, ou pode ser armazenada em condições adequadas, por exemplo, através da congelação, de maneira a realizar o método da presente invenção em um ponto de tempo pretendido. Em especial, podem ser medidas as amostras de diversos indivíduos e/ou diferentes pontos de tempo, de maneira a comparar os indivíduos ou monitorar uma terapia. A recuperação de uma amostra corporal pode ser realizada por um técnico no assunto, dependendo da amostra. Em uma realização de preferência, a amostra é o sangue, soro ou plasma. Ainda em uma outra realização, a amostra é o sangue ou soro sanguíneo. Nesse caso, o sangue é retirado de um indivíduo. O soro sanguíneo pode ser obtido a partir de sangue através de métodos conhecidos no estado da técnica. De maneira similar, podem ser obtidas outras amostras corporais, por exemplo, a coleta de urina, ou realizando uma biopsia, e através do tratamento posterior da amostra, caso necessário.

[036] Conforme descrito acima, a amostra compreende o(s) analito(s) 25-hidroxivitamina D e 24,25-diidroxivitamina D3, respectivamente.

[037] O termo “membro de par de ligação” se refere a um membro de um par de ligação (“bp”), o que significa duas moléculas diferentes em que uma das moléculas se liga à segunda molécula através de meios químicos ou físicos. Além dos membros do par de ligação ao antígeno e ao anticorpo, outros pares de ligação incluem, como exemplos sem limitação, a biotina e avidina, carboidratos e lectinas, sequências de nucleotídeos complementares, sequências de peptídeo complementares, moléculas efetoras e receptoras, cofatores enzimáticos e enzimas, inibidores enzimáticos e enzimas, uma sequência de peptídeo ou uma unidade química (tal como a digoxina / antidigoxina) e um anticorpo específico para a sequência, porção química ou a proteína total, ácidos poliméricos e bases, corantes e ligantes proteicos correspondentes, peptídeos e ligantes proteicos específicos (por exemplo, a ribonuclease, peptídeo S e proteína S de ribonuclease), metais e seus quelantes, aptâmeros e similares. Além disso, os pares de ligação podem incluir um membro que é um análogo de um membro de ligação original, por exemplo, um análogo de analito ou, por exemplo, um membro de ligação realizado através de técnicas recombinantes ou engenharia molecular que é análogo ao membro de par de ligação original e possui as mesmas propriedades de ligação.

[038] Um membro de par de ligação é análogo a um membro de par de ligação se ambos forem capazes de se ligar ao membro complementar do par de ligação da mesma maneira. Tal membro de par de ligação, por exemplo, pode ser um ligante ou um receptor que tenha sido modificado pela substituição de, pelo menos, um átomo de hidrogênio por um grupo para fornecer, por exemplo, um ligante marcado ou um receptor marcado. Os membros de par de ligação podem ser análogos ao analito ou ao membro de par de ligação que é complementar ao analito.

[039] Um “agente de ligação” é um membro de um par de ligação (“bp”) que se liga ao outro membro do par de ligação, a molécula alvo correspondente, por exemplo, a 24,25-diidroxivitamina D3. A afinidade (Kd) de um agente de ligação é de 10-7 mol/L para a sua molécula alvo correspondente. Um agente de ligação, de preferência, possui uma afinidade de 10-8 mol/L. Ainda de maior preferência, um agente de ligação possui uma afinidade de 10-9 mol/L para a sua molécula alvo. Ainda de maior preferência um agente de ligação possui uma afinidade de 10-10 mol/L para a sua molécula alvo.

[040] Como o técnico no assunto irá considerar, o termo “primeiro agente de ligação” que se liga à 24,25-diidroxivitamina D3 é utilizado para indicar que outras biomoléculas presentes na amostra significativamente não se ligam ao agente de ligação específico para a 24,25-diidroxivitamina D3. De preferência, o nível de ligação do agente de ligação específico a uma biomolécula diferente da molécula alvo resulta em uma afinidade de ligação que é apenas 10% ou inferior, de preferência, apenas 5% ou inferior, respectivamente, da afinidade com a molécula alvo. Um primeiro agente de ligação de preferência que se liga à 24,25-diidroxivitamina D3 satisfará ambos os critérios mínimos acima para a afinidade bem como para a especificidade.

[041] Um “primeiro agente de ligação”, de acordo com a presente invenção, está em uma realização selecionada a partir do grupo que consiste em anticorpo policlonal, anticorpo monoclonal e anticorpo sintético (anticorpo plástico), de preferência, um anticorpo monoclonal ou anticorpo sintético, de maior preferência, um anticorpo monoclonal ou um anticorpo ativo do anticorpo monoclonal, respectivamente. O primeiro agente de ligação está ligado em uma realização à 24,25-diidroxivitamina D, de maior preferência, o primeiro agente de ligação está ligado à 24,25-diidroxivitamina D3. De preferência, o anticorpo é um anticorpo monoclonal que se liga à 24,25-diidroxivitamina D3. Ainda de maior preferência, o anticorpo é um anticorpo de plástico que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3.

[042] Um “anticorpo de plástico”, de acordo com a presente invenção, é uma nanopartícula de polímero sintético com uma função similar a um anticorpo (Hoshino, Y. et al., J. Mater. Chem., 2011, 21, 3.517-3.521). Um anticorpo de plástico, de acordo com a presente invenção, é capaz de ligar e neutralizar a 24,25-diidroxivitamina D3 específica.

[043] Um “segundo agente de ligação”, de acordo com a presente invenção, em uma realização, é uma proteína de ligação à vitamina D (VitD- BP) ou um anticorpo ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo, ligando a 25-hidroxivitamina D. De maior preferência, o segundo agente de ligação é uma proteína de ligação à vitamina D, de preferência, uma proteína de ligação à vitamina D recombinante. Ainda em uma outra realização, o segundo agente de ligação é uma parte funcionalmente ativa da proteína de ligação à vitamina D, de preferência, o domínio I da proteína de ligação à vitamina D.

[044] Nos Exemplos da presente invenção, o anticorpo mAb <24,25-diidroxivitamina D3 rK-IgG foi utilizado com sucesso como primeiro agente de ligação. Em uma realização de preferência, o primeiro agente de ligação é a mAb <24,25-diidroxivitamina D3>rK-IgG.

[045] Os anticorpos de ocorrência natural são as proteínas plasmáticas globulares (cerca de 150 kDa) que também são conhecidos como imunoglobulinas que compartilham uma estrutura básica. Uma vez que possuem cadeias de açúcar adicionadas aos resíduos de amino ácidos, são glicoproteínas. A unidade funcional básica de cada anticorpo é um monômero de imunoglobulina (Ig) (apenas contendo uma unidade de Ig); os anticorpos secretados também podem ser diméricos com duas unidades de Ig como com o IgA, tetramérico com quatro unidades de Ig como IgM de teleósteos de peixe, ou pentamérico com cinco unidades de Ig, como IgM de mamífero. Na presente invenção, os exemplos de formatos adequados incluem o formato de anticorpos de ocorrência natural incluindo os isótopos de anticorpos conhecidos como IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.

[046] O monômero Ig é uma molécula em formato de “Y” que consiste em quatro cadeias de polipeptídeo; duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas conectadas por ligações de dissulfureto entre os resíduos de cisteína. Cada cadeia pesada possui cerca de 440 amino ácidos de comprimento; cada cadeia leve possui cerca de 220 amino ácidos de comprimento. As cadeias pesadas e leves contêm, cada uma, as ligações de dissulfureto intracadeias que estabilizam a sua dobragem. Cada cadeia é composta os domínios estruturais denominados domínios Ig. Estes domínios contêm cerca de 70 a 110 amino ácidos e são classificados em diferentes categorias (por exemplo, a variável ou V, e constante ou C) de acordo com o seu tamanho e função. Possuem uma dobra de imunoglobulina característica em que duas folhas beta criam um formato do tipo “sanduíche”, mantidas unidas por interações entre as cisteínas conservadas e outros amino ácidos carregados.

[047] Existem cinco tipos de cadeia pesada de Ig de mamífero denotados por α, δ, ε, Y e μ. O tipo de cadeia pesada presente define o isotipo do anticorpo; estas cadeias são encontradas nos anticorpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente.

[048] Diferentes cadeias pesadas diferem em tamanho e composição; α e y contêm cerca de 450 amino ácidos e δ cerca de 500 amino ácidos, enquanto μ e ε possuem cerca de 550 amino ácidos. Cada cadeia pesada possui duas regiões, a região constante (CH) e a região variável (VH). Em uma espécie, a região constante é idêntica em todos os anticorpos do mesmo isotipo, mas difere em anticorpos de diferentes isotipos. As cadeias pesadas y, α e δ possuem uma região constante composta por três domínios Ig em tandem, e uma região de clivagem para a flexibilidade adicionada; as cadeias pesadas μ e ε possuem uma região constante composta por quatro domínios de imunoglobulina. A região variável da cadeia pesada difere em anticorpos produzidos por diferentes células B, mas é a mesma para todos os anticorpos produzidos por uma única célula B ou clone de célula B. A região variável de cada cadeia pesada possui cerca de 110 amino ácidos de comprimento e é composta por um único domínio Ig.

[049] Nos mamíferos existem dois tipos de cadeia leve de imunoglobulina designados por À e M. Uma cadeia leve possui dois domínios sucessivos: um domínio constante (CL) e um domínio variável (VL). O comprimento aproximado de uma cadeia leve é de 211 a 217 amino ácidos. Cada anticorpo contém duas cadeias leves que são sempre idênticas; apenas um tipo de cadeia leve, M ou À, está presente por anticorpo nos mamíferos. Outros tipos de cadeias leves, tal como a cadeia i, são encontrados em vertebrados inferiores como tal Chondrichthyes e Teleostei.

[050]Além dos anticorpos de ocorrência natural, foram desenvolvidos formatos de anticorpos artificiais incluindo os fragmentos de anticorpos. Alguns deles estão descritos a seguir.

[051] Embora a estrutura geral de todos os anticorpos seja muito similar, a propriedade única de um anticorpo determinado é determinada pelas regiões variáveis (V), conforme detalhado acima. Mais especificamente, os laços variáveis, três cada um a luz (VL) e três na cadeia pesada (VH), são responsáveis pela ligação ao antígeno, isto é, pela sua especificidade antigênica. Esses laços são denominados de Regiões Determinadoras de Complementaridade (CDRs). Uma vez que as CDRs dos domínios VH e VL contribuem para o local de ligação ao antígeno, é a combinação das cadeias pesada e leve, e não isoladamente, que determina a especificidade final do antígeno.

[052] Consequentemente, o termo “anticorpo”, conforme utilizado no presente, significa qualquer polipeptídeo que possua similaridade estrutural com um anticorpo de ocorrência natural e é capaz de ligação específica ao respectivo alvo, em que a especificidade de ligação é determinada pelas CDRs. Por conseguinte, o termo “anticorpo” pretende se referir a uma estrutura derivada de imunoglobulina com a ligação ao alvo respectivo incluindo, mas não limitado a um anticorpo de comprimento completo ou inteiro, um fragmento de ligação ao antígeno (um fragmento derivado fisicamente ou conceitualmente a partir de uma estrutura de anticorpo), um derivado de qualquer um dos anteriores, uma molécula quimérica, uma fusão de qualquer dos anteriores com outro polipeptídeo, ou qualquer estrutura / composição alternativa que seletivamente se liga ao respectivo alvo. O anticorpo ou suas partes funcionalmente ativas podem ser qualquer polipeptídeo que compreenda, pelo menos, um fragmento de ligação ao antígeno. Os fragmentos de ligação ao antígeno consistem, pelo menos, no domínio variável da cadeia pesada e no domínio variável da cadeia leve, dispostos de uma maneira que ambos os domínios em conjunto são capazes de se ligar ao antígeno específico. O “alvo respectivo” é o analito no caso da molécula de captura, molécula de ligação e molécula de detecção e é a molécula de ligação no caso do anticorpo anti- idiotipo como molécula de captura de preferência.

[053] Os anticorpos “completos” ou “totais” se referem às proteínas que compreendem duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações de dissulfureto que compreendem: (1) em termos das cadeias pesadas, uma região variável e uma região constante da cadeia pesada que compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3; e (2) em termos das cadeias leves, uma região variável de cadeia leve e uma região constante de cadeia leve que compreende um domínio, CL. No que se refere ao termo “anticorpo completo” se entende qualquer anticorpo que possui uma estrutura de domínio geral típica de um anticorpo de ocorrência natural (isto é, que compreende uma cadeia pesada de três ou quatro domínios constantes e uma cadeia leve de um domínio constante, bem como os respectivos domínios variáveis), embora cada domínio possa compreender outras modificações, tais como mutações, deleções ou inserções, que não alterem a estrutura de domínio global.

[054]As “partes funcionalmente ativas de anticorpos” ou “fragmentos de anticorpos” também contêm, pelo menos, um fragmento de ligação ao antígeno, conforme definido acima, e essencialmente exibem a mesma função e especificidade de ligação que o anticorpo completo do qual a parte (ou fragmento) funcionalmente ativa é derivada. A digestão proteolítica limitada com a papaína cliva o protótipo Ig em três fragmentos. Dois fragmentos terminais amino idênticos, cada um contendo uma cadeia L completa e cerca de metade de uma cadeia H, são os fragmentos de ligação ao antígeno (Fab). O terceiro fragmento, de tamanho similar, mas contendo a metade do terminal carboxila de ambas as cadeias pesadas com a sua ligação de dissulfureto entre cadeias, é o fragmento cristalizável (Fc). O Fc contém os carboidratos, ligação ao complemento e locais de ligação ao FcR. A digestão limitada por pepsina produz um único fragmento F (ab')2 contendo ambas as peças Fab e a região de clivagem, incluindo a ligação de dissulfureto de intercadeia H-H. F(ab')2 é divalente para a ligação do antígeno. A ligação dissulfureto de F(ab')2 pode ser clivada para se obter o Fab'. Além disso, as regiões variáveis das cadeias pesada e leve podem ser fundidas em conjunto para formar um fragmento variável de cadeia simples (scFv).

[055] Uma vez que a primeira geração de anticorpos de tamanho completo apresentou alguns problemas, muitos dos anticorpos de segunda geração apenas compreendem os fragmentos do anticorpo. Os domínios variáveis (Fvs) são os fragmentos menores com um domínio de ligação ao antígeno intacto constituído por um VL e um VH. Tais fragmentos, com apenas os domínios de ligação, podem ser gerados por abordagens enzimáticas ou expressão dos fragmentos de genes relevantes, por exemplo, em células bacterianas e eucarióticas. Podem ser utilizadas abordagens diferentes, por exemplo, o fragmento Fv isoladamente ou os fragmentos Fab' que compreendem um dos braços superiores do “Y” que inclui o Fv mais os primeiros domínios constantes. Estes fragmentos normalmente são estabilizados pela introdução de uma ligação polipeptídica entre as duas cadeias que resulta na produção de uma única cadeia Fv (scFv). De maneira alternativa, podem ser utilizados os fragmentos Fv (dsFv) ligados por dissulfureto. Os domínios de ligação de fragmentos podem ser combinados com qualquer domínio constante para produzir os anticorpos de comprimento total ou podem ser fundidos com outras proteínas e polipeptídeos.

[056] Um fragmento de anticorpo recombinante é o fragmento Fv (scFv) de cadeia simples, que é uma parte funcionalmente ativa de preferência de um anticorpo, de acordo com a presente invenção. Em geral, possui uma afinidade elevada para o seu antígeno e pode ser expressa em uma variedade de hospedeiros. Estas e outras propriedades tornam os fragmentos de scFv não apenas aplicáveis em medicina, mas também de potencial para as aplicações biotecnológicas. Conforme detalhado acima, no fragmento scFv, os domínios VH e VL estão unidos a um ligante peptídico hidrofílico e flexível, o que aprimora a expressão e a eficiência de dobragem. Normalmente são utilizados ligantes de cerca de 15 amino ácidos, dos quais o ligante (Gly4Ser)3 foi utilizado com maior frequência. As moléculas de scFv podem ser facilmente degradadas proteolicamente, dependendo do ligante utilizado. Com o desenvolvimento de técnicas de engenharia genética, essas limitações poderiam ser praticamente superadas por pesquisas focadas no aprimoramento da função e da estabilidade. Um exemplo é a geração de fragmentos Fv estabilizados por dissulfureto (ou ligados por dissulfureto) em que o dímero VH-VL é estabilizado por uma ligação de dissulfureto intercadeia. As cisteínas são introduzidas na interface entre os domínios VL e VH, formando uma ponte de dissulfureto, que mantém os dois domínios em conjunto.

[057]A dissociação de scFvs resulta em scFv monoméricos, os quais podem ser complexados em dímeros (diacorpos), trímeros (triacorpos) ou agregados maiores tais como o TandAbs e Flexibodies, que também representam partes funcionalmente ativas de um anticorpo, de acordo com a presente invenção.

[058] Os anticorpos com dois domínios de ligação podem ser criados através da ligação de dois scFv com uma ligação polipéptida simples (scFv) 2 ou através da dimerização de dois monômeros (diacorpos). Os projetos mais simples são os diacorpos que possuem dois domínios de ligação ao antígeno funcionais que podem ser iguais, similares (diacorpos bivalentes) ou possuem especificidade para os antígenos distintos (diacorpos biespecíficos). Estes anticorpos biespecíficos, por exemplo, possibilitam o recrutamento de funções efetoras inovadoras (tais como as células T citotóxicas) para as células alvo, o que as torna muito úteis para aplicações em medicina.

[059]Também foram desenvolvidos formatos de anticorpos que compreende quatro domínios variáveis de cadeias pesadas e quatro domínios variáveis de cadeias leves. Os seus exemplos incluem os anticorpos biespecíficos tetravalentes (TandAbs e Flexibodies, Affimed Therapeutics AG, Heidelberg, Alemanha). Em contraste com um diacorpo biespecífico, um TandAb biespecífico é um homodímero que apenas consiste em um polipeptídeo. Devido às duas cadeias diferentes, um diacorpo pode construir três dímeros diferentes, apenas um dos quais é funcional. Por conseguinte, é mais simples e menos dispendioso produzir e purificar este produto homogênio. Além disso, o TandAb normalmente apresenta melhores propriedades de ligação (que possuem o dobro do número de locais de ligação) e estabilidade aumentada in vivo. Os Flexibodies são uma combinação de scFv com um motivo multimérico de diacorpo resultando em uma molécula multivalente com um grau elevado de flexibilidade para juntar duas moléculas que estão bastante distantes entre si na superfície celular. Se mais de dois domínios de ligação ao antígeno funcionais estiverem presentes e se possuírem especificidade para antígenos distintos, o anticorpo é multiespecífico.

[060] Em resumo, os tipos de imunoglobulina específicos que representam os anticorpos ou as suas partes funcionalmente ativas incluem mas não estão limitados ao seguinte anticorpo: um Fab (fragmento monovalente com luz variável (VL), pesado variável (VH), luz constante (CL) e peso constante 1 (CHI)), um F(ab')2 (fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfureto ou uma alternativa na região de clivagem), um Fv (domínios VL e VH), um scFv (uma cadeia única Fv em que VL e VH estão ligados por um ligante, por exemplo, um ligante de peptídeo), uma molécula de anticorpo biespecífico (uma molécula de anticorpo com especificidade conforme descrita no presente ligada a uma segunda fração funcional que possui uma especificidade de ligação diferente do anticorpo, incluindo, sem limitação, outro peptídeo ou proteína tal como um anticorpo ou ligante do receptor), um dímero Fv de cadeia simples biespecífico, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um minicorpo (um scFv ligado a um CH3).

[061]Algumas moléculas de anticorpo ou suas partes funcionalmente ativas incluindo, mas não limitadas ao Fv, scFv, moléculas de diacorpo ou anticorpos de domínio (Domantis) podem ser estabilizadas por incorporação de pontes de dissulfureto para ligar os domínios VH e VL. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos utilizando as tecnologias convencionais, métodos específicos dos quais incluem a produção quimicamente, ou a partir de hibridomas híbridos) e outras tecnologias incluindo, mas não limitado à tecnologia BiTETM (moléculas que possuem regiões de ligação ao antígeno de especificidade diferente com um ligante peptídico) e engenharia de botões em cavidades.

[062] Consequentemente, uma molécula de anticorpo ou uma sua parte funcionalmente ativa pode ser um Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fv, um Fv ligado a um dissulfureto, um scFv, um (scFv)2, um anticorpo bivalente, um anticorpo biespecífico, um anticorpo multiespecífico, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo ou um minicorpo.

[063] Em outra realização de preferência, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. Os anticorpos monoclonais são anticorpos monoespecíficos que são idênticos uma vez que são produzidos por um tipo de célula imunitária que são todos clones de uma célula monocamada. Um anticorpo quimérico é um anticorpo em que, pelo menos, uma região de uma imunoglobulina de uma espécie é fundida a outra região de uma imunoglobulina de outra espécie por engenharia genética de maneira a reduzir a sua imunogenicidade. Por exemplo, as regiões VL e VH de murídeo podem ser fundidas com a parte restante de uma imunoglobulina humana. Um tipo especial de anticorpos quiméricos são os anticorpos humanizados. Os anticorpos humanizados são produzidos por fusão do DNA que codifica as CDR de um anticorpo não humano com o DNA produtor de anticorpo humano. A construção DNA resultante, por conseguinte, pode ser utilizada para expressar e produzir aos anticorpos que, em geral, não são tão imunogênicos como o anticorpo parentérico não humano ou como um anticorpo quimérico, uma vez que apenas as CDR são não humanas.

[064] Em uma realização de preferência da presente invenção, uma molécula de anticorpo ou uma sua parte funcionalmente ativa utilizada em um método da presente invenção compreende um domínio constante de imunoglobulina de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste em: um domínio constante IgM humano, um domínio constante IgGl humano, um domínio constante IgG2 humano, um domínio constante IgG3 humano, um domínio constante IgG4 humano, um domínio constante IgE humano e um domínio constante IgA humano.

[065] Conforme detalhado acima no contexto com o anticorpo da presente invenção, cada cadeia pesada de um anticorpo de ocorrência natural possui duas regiões, a região constante e a região variável. Existem cinco tipos de cadeia pesada de imunoglobulina de mamífero: Y, δ, α, μ e ε, que definem as classes de imunoglobulinas IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente.

[066] No presente, existem quatro subclasses IgG (IgG1, 2, 3 e 4) em seres humanos, denominadas em ordem de sua abundância em soro (a IgG1 sendo a mais abundante). Embora exista uma similaridade de cerca de 95% entre as suas regiões Fc das subclasses IgG, a estrutura das regiões de clivagem é relativamente diferente. Esta região, entre os braços Fab (ligação ao antígeno de fragmento) e os dois domínios terminais carboxila CH2 e CH3 de ambas as cadeias pesadas, determina a flexibilidade da molécula. O segmento de clivagem superior (em direção ao terminal amino) possibilita a variabilidade do ângulo entre os braços Fab (flexibilidade Fab-Fab) assim como a flexibilidade rotacional de cada Fab individual. A flexibilidade da região de clivagem inferior (em direção ao terminal carboxila) diretamente determina a posição dos braços Fab em relação à região Fc (flexibilidade Fab-Fc). A Fab- Fab dependente de clivagem e a flexibilidade Fab-Fc podem ser importantes no desencadeamento de outras funções efetoras tais como a ativação do complemento e a ligação ao receptor Fc. Consequentemente, a estrutura das regiões de clivagem fornece a cada uma das quatro classes de IgG um perfil biológico único.

[067] O comprimento e flexibilidade da região de clivagem varia entre as subclasses de IgG. A região de clivagem de IgG1 engloba os amino ácidos de 216 a 231 e uma vez que é livremente flexível, os fragmentos Fab podem rodar em torno dos seus eixos de simetria e se mover dentro de uma esfera centrada na primeira de duas pontes de dissulfureto de cadeia interpesada. A IgG2 possui uma clivagem mais curta do que a IgG1, com 12 resíduos de amino ácidos e quatro pontes de dissulfureto. A região de clivagem de IgG2 não possui de um resíduo de glicina, é relativamente curta e contém uma hélice dupla de poliprolina rígida, estabilizada por pontes de dissulfureto de cadeia interpesada extra. Estas propriedades restringem a flexibilidade da molécula de IgG2. A IgG3 difere das outras subclasses pela sua única região de clivagem prolongada (cerca de quatro vezes mais longa do que a clivagem IgG1), contendo 62 amino ácidos (incluindo 21 prolinas e 11 cisteínas), formando uma hélice dupla de poliprolina inflexível. Em IgG3, os fragmentos Fab estão relativamente longe do fragmento Fc, fornecendo à molécula uma maior flexibilidade. A clivagem alongada em IgG3 também é responsável pelo seu peso molecular mais elevado em comparação com as outras subclasses. A região de clivagem de IgG4 é mais curta do que aquela de IgG1 e a sua flexibilidade é intermédia entre aquela de IgG1 e IgG2.

[068] No caso de se utilizar uma proteína de ligação à vitamina D como um segundo agente de ligação, o pH durante esta etapa de incubação está em uma realização de preferência selecionado entre pH 6,0 e pH 9,0.

[069] No caso de se utilizar um anticorpo que liga a 25- hidroxivitamina D em uma realização como um segundo agente de ligação, o pH durante esta etapa de incubação estará entre pH 5 e pH 8, de preferência, o pH durante esta etapa de incubação estará entre pH 5,5 e pH 7,5.

[070] De acordo com uma realização específica, o primeiro agente de ligação é um anticorpo monoclonal ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal, e o segundo agente de ligação é uma proteína de ligação à vitamina D ou uma parte funcionalmente ativa da proteína de ligação à vitamina D.

[071] Em uma outra realização, o primeiro agente de ligação é um anticorpo monoclonal ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal e o segundo agente de ligação é um anticorpo monoclonal ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal.

[072]Ainda em uma outra realização, o primeiro agente de ligação é a mAb <24,25-diidroxivitamina D3> ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal e o segundo agente de ligação é o mAb<25- hidroxivitamina D> ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal.

[073] Em uma realização, de acordo com a presente invenção, um agente de ligação transporta os meios para imobilização e pode ser utilizado para a imobilização. Os meios de imobilização podem possibilitar a ligação a um suporte, de preferência, o suporte sólido, covalente ou não covalente.

[074] O termo “suporte sólido” ou “fase sólida” se refere a um material na fase sólida que interage com os reagentes na fase líquida por reações heterogenias. A utilização de suportes sólidos é bem conhecida nos campos da química, bioquímica, farmácia e biologia molecular. Muitos tipos de suportes sólidos foram desenvolvidos dependendo do problema técnico a ser resolvido. Qualquer um destes pode ser utilizado no contexto da presente invenção. Por exemplo, o suporte sólido utilizado nos métodos da presente invenção pode incluir os componentes de sílica, acetato de celulose, nitrocelulose, nylon, poliéster, polieterssulfona, poliolefina ou fluoreto de polivinilideno, ou suas combinações. Outros suportes sólidos adequados incluem, mas não estão limitados ao vidro de poro controlado, uma placa de vidro ou lâmina, poliestireno e dextrano ativado. Em outros aspectos, os polímeros orgânicos sintéticos tais como a poliacrilamida, polimetacrilato e poliestireno também são superfícies de suporte ilustrativas. Além disso, os polissacarídeos tais como a celulose e dextrano, são outros exemplos ilustrativos de superfícies de suporte. Outras superfícies de suporte tais como as fibras também são operáveis.

[075] Os suportes de resina comuns utilizados, por exemplo, na química combinatória ou de proteínas incluem a resina de poliestireno, por exemplo, reticulada com o divinilbenzeno; hidroximetilpoliestireno; aminometilpoliestireno; resina de TentaGel (TG) e ArgoGel (AG): copolímeros de enxerto de poliestireno / DVB-poli (etileno glicol) (PS-PEG)- Bayer; Coroas / Pinhos (CP) (suporte de polietileno / polipropileno enxertado por radiação); resinas à base de Kieselguhr / poliacrilamida (KPA); vidro de poro controlado; PEGA - copolímero de poli (etileno glicol) / dimetilacrilamida.

[076]A imobilização para um suporte sólido pode ser realizada utilizando os suportes sólidos que foram modificados ou ativados para incluir os grupos funcionais que possibilitam o acoplamento covalente da entidade ou suporte ao agente de ligação, por exemplo, uma proteína ou um anticorpo. Normalmente, são utilizados os braços ligantes alifáticos. O agente de ligação, especialmente as proteínas ou anticorpos, também pode ser ligado de maneira não covalente a uma superfície, através, por exemplo, de mecanismos iônicos ou hidrofóbicos, e são destacados pelo liberador inibindo estes mecanismos localmente. De maneira adicional, a ligação covalente de um agente de ligação, por exemplo, uma proteína ou anticorpo, a uma superfície, por exemplo, uma superfície de vidro ou de óxido de metal, pode ser realizada pela primeira vez ativando a superfície com um amino silano. Os agentes de ligação derivados com os grupos funcionais reativos com a amina, por conseguinte, podem se ligar à superfície. Os suportes, em especial, os suportes sólidos, podem ser derivatizados com as proteínas tais como as enzimas, peptídeos, oligonucleotídeos e polinucleotídeos por ligação covalente ou não covalente através de um ou mais locais de ligação, por conseguinte, ligando o mesmo ácido ao suporte sólido.

[077] O suporte (sólido) pode estar contido em um recipiente, em que o recipiente é um tubo, tal como um tubo de centrifugação ou tubo giratório, seringas, cartucho, câmara, placa de múltiplas cavidades ou tubo de teste, ou suas combinações. O suporte (sólido) pode ser pré-tratado ou funcionalizado de maneira a possibilitar a ligação mediada pelo ligante do agente de ligação. Em uma realização, o suporte sólido pode ser fibroso ou particulado, normalmente possibilitando o contato adequado. A dimensão do suporte (sólido) adequado para a utilização no método da presente invenção pode variar de acordo com o método selecionado. O primeiro agente de ligação ou o segundo agente de ligação, respectivamente, podem ser ligados a um suporte (sólido) apenas (por exemplo, um recipiente ou placa de múltiplas cavidades) ou podem estar ligados a uma multiplicidade de suportes (sólido) (por exemplo, as esferas). O formato do suporte (sólido) adequado para a utilização nos métodos da presente invenção, por exemplo, pode ser uma folha, um disco pré-cortado, cilindro, fibra simples ou um suporte sólido composto por partículas. Em uma realização, o suporte (sólido) pode ser fibroso ou particulado para possibilitar um contato ideal. O tamanho do suporte (sólido) pode variar e pode ser selecionado dependendo do método a ser realizado.

[078] Em algumas realizações, o suporte sólido é uma tira de teste, um chip, em especial, um chip de microarranjo ou nanoarranjo, uma placa de microtitulação ou uma micropartícula (esfera).

[079] Muitos sistemas de teste comerciais são com base na utilização de suporte sólido revestido com a avidina ou estreptavidina (SA), por exemplo, as placas de microtitulação revestidas com a SA, grelhas revestidas com a SA ou micropartículas revestidas com a SA (esferas).

[080] Um derivado de analito biotinilado, por exemplo, está ligado a este suporte sólido de SA antes ou durante o procedimento de teste. Quando se detecta o composto de vitamina D, este composto derivado de analito biotinilado, por exemplo, pode ser uma 25-hidroxivitamina D2 biotinilada e/ou uma 25-hidroxivitamina D3 biotinilada.

[081] Em uma realização da presente invenção, o método de detecção in vitro é realizado como uma análise competitiva. Em um tal teste competitivo, um derivado de composto de vitamina D adicionado em uma quantidade definida ao teste compete com o composto de vitamina D correspondente a partir da amostra para os locais de ligação do agente de ligação específico. Quanto mais composto de vitamina D estiver presente na amostra, menor será o sinal de detecção.

[082] Em uma realização, o derivado de um composto de vitamina D é um composto de vitamina D biotinilada. Em uma outra realização, o composto de vitamina D biotinilada é uma 25-hidroxivitamina D2 biotinilada e/ou uma 25-hidroxivitamina D3 biotinilada. Em uma outra realização, o composto de vitamina D biotinilada é uma 25-hidroxivitamina D2 biotinilada.

[083] Em uma realização, o derivado de um composto de vitamina D é um composto de vitamina D rutenilada. Em uma outra realização, o composto de vitamina D rutenilada é uma 25-hidroxivitamina D2 rutenilada e/ou uma 25-hidroxivitamina D3 rutenilada. Em uma outra realização, o composto de vitamina D rutenilada é uma 25-hidroxivitamina D2 rutenizada.

[084] Conforme mencionado acima, os segundos agentes de ligação de preferência para a utilização em um método de detecção, conforme descrito na presente descrição, são os anticorpos e proteína de ligação à vitamina D. A proteína de ligação à vitamina D, se utilizada em um formato de análise competitiva, irá conduzir a uma medição integrada de todos os compostos de vitamina D que competem com a sua ligação a um ou mais derivados de compostos de vitamina D (biotinilada). Em uma realização, a proteína de ligação à vitamina D será marcada de maneira detectável, por exemplo, rutenilada.

[085] Em uma realização, o método de acordo com a presente invenção, é realizado em um formato de análise competitiva, em que (i) o suporte sólido é uma micropartícula revestida com a SA (esfera), o competidor é um derivado de um composto de vitamina D biotinilada e o segundo agente de ligação é um conjugado de proteína de ligação à vitamina D rutenilada, ou (ii) o suporte sólido é uma micropartícula revestida com a SA (esfera), o competidor é um conjugado de vitamina D rutenilada e o segundo agente de ligação é um conjugado de proteína de ligação à vitamina D biotinilada.

[086] De acordo com uma realização de preferência, o primeiro agente de ligação impede a ligação da 24,25-diidroxivitamina D3 ao segundo agente de ligação. Em uma realização ainda de maior preferência, a 24,25- diidroxivitamina D3 ligada ao primeiro agente de ligação não pode ser ligada pelo segundo agente de ligação. Ainda em uma outra realização, o segundo agente de ligação não é capaz de liberar a 24,25-diidroxivitamina D3 ligada ao primeiro agente de ligação.

[087] Um técnico no assunto está ciente de que um composto de vitamina D presente em uma amostra obtida de um indivíduo está ligado à proteína de ligação à vitamina D. Por conseguinte, nos métodos, de acordo com a presente invenção, o composto de vitamina D presente na amostra ligado à proteína de ligação à vitamina D é liberado da proteína de ligação à vitamina D antes da etapa (b) com um reagente de liberação em uma realização específica.

[088]A amostra fornecida obtida de um indivíduo, de acordo com os métodos, compreende um composto de vitamina D ligado à proteína de ligação à vitamina D em uma realização.

[089] Um reagente de liberação desnatura a proteína de ligação à vitamina D, de preferência, o reagente de liberação irreversível desnatura a proteína de ligação à vitamina D.

[090] Em uma realização específica, o composto de vitamina D é liberado da proteína de ligação à vitamina D antes da etapa (b) através de um método selecionado a partir do grupo que consiste em uma degradação proteolítica, uma liberação ácida, uma liberação alcalina, uma liberação de metanol, uma precipitação de etanol (publicação WO 1999/67211), uma liberação de sal de periodato (patente EP 0.753.743), uma extração com a acetonitrila, uma liberação de hidróxido de metal (patente US 7.087.395), uma liberação por ciclodextrina e/ou seus derivados (patente US 7.087.395) ou uma liberação de salicilato de metal (patente US 7.087.395), respectivamente. O técnico no assunto está ciente dos métodos adequados para liberar um composto de vitamina D ligado à proteína de ligação à vitamina D antes da determinação / medição do composto de vitamina D. Nos últimos anos, foram propostos diversos reagentes de liberação diferentes que, em princípio, deveriam ser adequados para liberar os compostos de vitamina D a partir de qualquer proteína de ligação presente na amostra.

[091] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um método in vitro para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, o método compreende as etapas: (a) do fornecimento de uma amostra obtida de um indivíduo e - da liberação do composto de vitamina D presente na amostra ligado à proteína de ligação à vitamina D com um reagente de liberação, (b) da mistura da amostra; (ba) com um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3, por conseguinte, formando um complexo entre o primeiro agente de ligação e a 24,25-diidroxivitamina D3; (bb) com um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, por conseguinte, formando um complexo entre o segundo agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D; (c) da medição do complexo formado em (bb), por conseguinte, determinando a concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3.

[092] De acordo com uma realização específica, o composto de vitamina D é liberado da proteína de ligação à vitamina D antes da etapa (b) por uma liberação alcalina. As condições alcalinas resultam na desnaturação da proteína de ligação da vitamina D e liberação de composto de vitamina D presente na amostra a ser investigada. A concentração do agente de alcalinização precisa ser suficiente para aumentar o pH da “mistura de reagentes” (= uma amostra a ser investigada + agente de alcalinização + reagentes adicionais) até, pelo menos, pH 10,0, de preferência, pelo menos, pH 10,5, de maior preferência, pelo menos, 11,0 na reação de pré-tratamento antes da etapa (b). O técnico no assunto está ciente de que o pH da mistura de reagentes precisa ser medido no momento da mistura da amostra a ser investigada + agente de alcalinização + reagentes adicionais. Devido à hidrólise do sal carbonato de hidrogênio e/ou da substância capaz de liberar os íons carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, o pH será reduzido na mistura do reagente.

[093] O reagente de liberação compreende, em uma realização específica, um sal de carbonato de hidrogênio e/ou uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise em uma concentração de 0,1 M a 2,0 M, um agente de redução e um agente de alcalinização. Em uma outra realização específica, o reagente de liberação compreende um sal de carbonato de hidrogênio em uma concentração de 0,1 M a 2,0 M, um agente de redução e um agente de alcalinização. Em uma realização específica adicional, o reagente de liberação compreende uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise em uma concentração de 0,1 M a 2,0 M, um agente de redução e um agente de alcalinização. Tais reagentes de liberação e métodos de liberação estão descritos em detalhes nas publicações WO 2011/144661 e WO 2013/072342.

[094] Um “íon de carbonato de hidrogênio “ (íon de bicarbonato) é um ânion de Fórmula empírica HCO3- e uma massa molecular de 61,01 daltons.

[095] Um “sal de carbonato de hidrogênio “ é um composto selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de hidrogênio de sódio (NaHCO3), carbonato de hidrogênio de potássio (KHCO3), carbonato de hidrogênio de amônio (NH4HCO3), carbonato de hidrogeno de cálcio (Ca(HCO3)2) e carbonato de hidrogênio de magnésio (Mg(HCO3)2.

[096] Uma “substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise”, de acordo com uma realização da presente invenção, é um éster de carbonato. Um “éster de carbonato”, de acordo com a presente invenção, é um grupo carbonila flanqueado por dois grupos alcóxi. A estrutura geral destes carbonatos é R1O(C=O)OR2. Existem ésteres carbonato cíclicos (por exemplo, o carbonato de etileno) ou ésteres de carbonato não cíclicos (por exemplo, o carbonato de dimetila), bem como os seus derivados disponíveis hidroxilados ou halogenizados.

[097] Um técnico no assunto está ciente de como selecionar um agente de redução adequado, por exemplo, selecionado a partir do grupo que consiste em 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEP, cisteína-HCl e ditiotreitol (DTT).

[098]T Um técnico no assunto também está ciente de como selecionar os agentes de alcalinização adequados, por exemplo, selecionados a partir do grupo que consiste em NaOH, KOH, Ca(OH)2 e LiOH, ou uma sua mistura.

[099] É vantajoso que a liberação essencialmente completa do analito (composto de Vitamina D) a partir da molécula de ligação (proteína de ligação à Vitamina D) seja realizada antes da etapa (b) dos métodos, de acordo com a presente invenção.

[0100] Na etapa (b) dos métodos, de acordo com a presente invenção, o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação estão simultaneamente em contato com a amostra em uma realização específica. Em outras palavras, em uma realização específica, as etapas (ba) e (bb) são realizadas simultaneamente de acordo com o(s) método(s) da presente invenção.

[0101] Na etapa (b) dos métodos, de acordo com a presente invenção, o primeiro agente de ligação é colocado em contato com a amostra antes ou após o contato do segundo agente de ligação com a amostra em uma realização específica. Em outras palavras, em uma realização específica, a etapa (ba) é realizada antes da etapa (bb), de acordo com o(s) método(s) da presente invenção. Em uma realização adicional, a etapa (ba) é realizada após a etapa (bb), de acordo com o(s) método(s) da presente invenção.

[0102] Em uma realização, de acordo com o método da presente invenção, a concentração de 25-hidroxivitamina D é determinada / medida / detectada em um procedimento de imunoanálise.

[0103]As imunoanálises são bem conhecidos dos técnicos no assunto. Os métodos para a realização de tais análises, bem como as aplicações práticas e procedimentos estão resumidos em livros relacionados. Os exemplos de livros de texto relacionados são Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, em: Practice and theory of enzyme immunoassays, páginas 221-278, Burdon, R.H. e V. Knippenberg, P.H. (Eds.), Elsevier, Amsterdam (1990) e diversos volumes de Methods in Enzymology, Colowick, S.P. e Caplan, N.O. (Eds.), Academic Press), tratando de métodos de detecção imunológica, especialmente os volumes 70, 73, 74, 84, 92 e 121.

[0104] Em uma realização, o método para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D é selecionado a partir do grupo que consiste em uma imunoanálise ligada à enzima (ELISA), imunoanálise por eletroquimioluminescência (ECLIA), radioimunoanálise (RIA) e imunoanálise quimioluminescente (CLIA). Em uma realização de preferência, a 25- hidroxivitamina D é detectada em uma imunoanálise ligada à enzima (ELISA). A 25-hidroxivitamina D é detectada em uma outra realização de preferência em uma imunoanálise (eletro-) quimioluminescência (ECLIA). A 25-hidroxivitamina D é detectada em uma realização adicional em uma radioimunoanálise (RIA). As análises adicionais de preferência são a imunoanálise de fluorescência em sanduíche (FIA), imunoanálise de enzima de captura de micropartículas (MEIA), imunoanálises de fluorescência em fase sólida (SPFIA), imunoanálise de fluorescência de concentração de partículas (PCFIA), análise nefelométrica e turbidimétrica com e sem aumento de partículas de látex (LPIA). Além disso, a análise pode estar na forma de tiras de teste em uma realização.

[0105] Neste momento, existem diversos instrumentos comercialmente disponíveis que utilizam a eletroquimioluminescência (ECL) para medições analíticas. Para revisão, vide Richter, M.M., Chem. Rev. 104 (2004) 3.003-3.036. As espécies que podem ser induzidas a emitir ECL (espécies ativas de ECL) foram utilizadas como marcadores de ECL. Os exemplos de marcadores de ECL incluem os compostos organometálicos tais como a porção de tris-bipiridil-rutênio [Ru(bpy)3]2+ em que o metal, por exemplo, é a partir dos metais dos grupos VII e VIII, incluindo o Re, Ru, Ir e Os. As espécies que reagem com o marcador de ECL no processo ECL são referidas no presente como correagentes de ECL. Os correagentes normalmente utilizados para a ECL incluem as aminas terciárias (por exemplo, a tripropilamina (TPA)), oxalato e persulfato. A luz é gerada por uma reação concertada de marcadores de ECL e correagentes; a participação do reagente de ligação em uma interação de ligação pode ser monitorada medindo a ECL emitida a partir do marcador de ECL. De maneira alternativa, o sinal de ECL a partir de um composto ativo de ECL pode ser indicativo do ambiente químico (vide, por exemplo, patente U.S. 5.641.623 e 5.643.713, que descreve as análises de ECL que monitoram a presença ou destruição de correagentes ECL especiais). Para mais antecedentes sobre ECL, marcadores de ECL, análises de ECL e instrumentação para a realização de análises de ECL, vide patentes EP 0.441.875, EP 0.500.305, EP 0.973.035, EP 1.892.524 e PCT publicadas WO 1887/06706; WO 1989/10551; WO 1990/05301; WO 1993/01308; WO 1998/12539; WO 1999/32662; WO 1999/58962; WO 1998/57154 e WO 2001/013095.

[0106] Os instrumentos de ECL comercialmente disponíveis demonstraram um desempenho excepcional. Eles se tornaram amplamente utilizados por razões, incluindo sua excelente sensibilidade, alcance dinâmico, precisão e tolerância de matrizes de amostras complexas. A instrumentação comercialmente disponível utiliza os projetos com base em células de fluxo com células de fluxo reutilizáveis permanentes.

[0107] Os volumes de amostra disponíveis para a determinação de analitos são frequentemente limitados e analitos cada vez mais diferentes precisam ser determinados a partir de uma amostra. Também é necessário o desenvolvimento de equipamento laboratorial mais rápido para a automação de análises e métodos mais sensíveis para a detecção de analitos. Isto conduz à necessidade de análises eletroquimioluminescentes altamente sensíveis e específicas e métodos para a sua realização. Além disso, devem ser considerados os aprimoramentos associados aos riscos de segurança ou às preocupações ambientais.

[0108] Em uma outra realização, a 25-hidroxivitamina D é determinada em uma análise tipo sanduíche.

[0109] Em uma outra realização de preferência, uma imunoanálise tipo sanduíche é utilizada para a determinação da 25-hidroxivitamina D em uma amostra. Tal imunoanálise tipo sanduíche especificamente detecta a 25- hidroxivitamina D em uma amostra sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3.

[0110] Em uma análise tipo sanduíche, o segundo agente de ligação é utilizado, de acordo com a presente invenção, em uma realização para capturar a 25-hidroxivitamina D e um terceiro agente de ligação é utilizado, que está marcado como sendo diretamente ou indiretamente detectável, para capturar o complexo formado pelo segundo agente de ligação e 25-hidroxivitamina D.

[0111] O segundo agente de ligação e o terceiro agente de ligação utilizados em um formato de análise tipo sanduíche, em uma realização, são os anticorpos, respectivamente ou em uma outra realização, uma combinação de uma proteína de ligação à vitamina D como o segundo agente de ligação e um anticorpo como o terceiro agente de ligação. No caso de se utilizar um anticorpo em uma análise tipo sanduíche, também pode ser utilizada uma parte funcionalmente ativa de um anticorpo em uma realização.

[0112] Em uma realização, os conjuntos da presente invenção são utilizados para uma imunoanálise de quantidade qualitativa (25-hidroxivitamina D presente ou ausente) ou quantitativa (a quantidade de 25-hidroxivitamina D é determinada) ou semiquantitativa (quantidades relativas, em especial acima ou abaixo de um valor de corte são fornecidas).

[0113] Em uma realização de preferência, a 25-hidroxivitamina D é detectada em uma imunoanálise eletroquímica ou eletroquimioluminescente (= ECLIA). Em uma análise eletroquímica ou eletroquimioluminescente uma molécula de analito ligada é detectada por um marcador ligado a um agente de detecção (molécula alvo). Um eletrodo eletroquimicamente inicia a luminescência de um marcador químico ligado a um agente de detecção. A luz emitida pelo marcador é medida por um fotodetector e indica a presença ou quantidade de complexos ligados de molécula de analito / molécula alvo. Os métodos de ECLA estão descritos, por exemplo, nas patentes US 5.543.112; 5.935.779; e 6.316.607. A modulação do sinal pode ser maximizada para diferentes concentrações de moléculas de analito para medições precisas e sensíveis.

[0114] O termo”marcador” ou “marcador detectável”, conforme utilizado no presente, se refere a qualquer substância que seja capaz de produzir um sinal através de detecção direta ou indireta. O marcador detectável, por conseguinte, pode ser detectado diretamente ou indiretamente. O marcador de detecção direta adequado para a utilização na presente invenção pode ser selecionado a partir de quaisquer grupos marcadores detectáveis conhecidos, tais como os cromogênios, grupos fluorescentes, grupos quimioluminescentes (por exemplo, os ésteres de acridinio ou dioxetanos), compostos eletroquimioluminescentes, catalisadores, enzimas, substratos enzimáticos, corantes fluorescentes, corantes (por exemplo, a fluoresceína, cumarina, rodamina, oxazina, resorufina, cianina e seus derivados), partículas coloidais metálicas e não metálicas e partículas de látex polimérico orgânico. Outros exemplos de marcadores detectáveis são os complexos de metal luminescentes, tais como complexos de rutênio ou europío, por exemplo, conforme utilizado para ECLIA, enzimas, por exemplo, conforme utilizado para ELISA, e radioisótopos; por exemplo, conforme utilizado para RIA.

[0115] Os sistemas de detecção indireta, por exemplo, compreendem que o reagente de detecção, por exemplo, o anticorpo de detecção, é marcado com um primeiro parceiro de um par de ligação de bioafina. Os exemplos de pares de ligação adequados são o hapteno ou antígeno / anticorpo, biotina ou análogos de biotina tais como a aminobiotina, iminobiotina ou destiobiotina / avidina ou estreptavidina, açúcar / lectina, ácido nucleico ou ácido nucleico / ácido nucleico complementar, e receptor / ligante, por exemplo, o hormônio esteroide receptor / hormônio esteroide. Os primeiros membros de par de ligação de preferência compreendem o hapteno, antígeno e hormona. São especialmente de preferência os haptenos tais como a digoxina e biotina e seus análogos. O segundo parceiro de tal par de ligação, por exemplo, um anticorpo, estreptavidina, e similares, normalmente é marcado para possibilitar a detecção direta, por exemplo, pelos marcadores detectáveis conforme mencionado acima.

[0116] O técnico no assunto está ciente de que o primeiro e/ou o segundo agente de ligação podem ser marcados com um marcador detectável, respectivamente. O técnico no assunto está ciente de que o marcador selecionado para o primeiro agente de ligação precisa ser diferente do marcador selecionado para o segundo agente de ligação.

[0117] De acordo com uma realização específica, o primeiro agente de ligação é a mAb <24,25-diidroxivitamina D3> e o segundo agente de ligação é uma proteína de ligação à vitamina D, de preferência, uma proteína de ligação à vitamina D marcada, de maior preferência, uma vitamina D- biotinilada ou rutenilada, respectivamente.

[0118] Para a detecção direta, o grupo de rotulagem ou marcador adequado para a utilização na presente invenção pode ser selecionado a partir de quaisquer grupos marcadores detectáveis conhecidos, mas não estão limitados aos cromogênios, grupos fluorescentes, quimioluminescentes (por exemplo, os ésteres de acridinio ou dioxetanos), compostos eletroquimioluminescentes, enzimas, substratos enzimáticos, corantes, corantes fluorescentes (por exemplo, a fluoresceína, cumarina, rodamina, oxazina, resorufina, cianina e seus derivados), partículas coloidais metálicas e não metálicas e partículas de látex polimérico orgânico. Outros exemplos de grupos marcadores são complexos de metais luminescentes, tais como os complexos de rutênio ou európio, enzimas, por exemplo, conforme utilizado para ELISA, e radioisótopos.

[0119] Os sistemas de detecção indireta, por exemplo, compreendem que o reagente de detecção, por exemplo, o anticorpo de detecção, é marcado com um primeiro parceiro de um par de ligação de bioafina. Os exemplos de pares de ligação adequados são o hapteno ou antígeno / anticorpo, biotina ou análogos de biotina tais como a aminobiotina, iminobiotina ou destiobiotina / avidina ou estreptavidina, açúcar / lectina, ácido nucleico ou ácido nucleico / ácido nucleico complementar, e receptor / ligante, por exemplo, o hormônio esteroide receptor / hormônio esteroide. Os primeiros membros de par de ligação de preferência compreendem o hapteno, antígeno e hormona. São especialmente de preferência os haptenos tais como a digoxina e biotina e seus análogos. O segundo parceiro de tal par de ligação, por exemplo, um anticorpo, estreptavidina, e similares, normalmente é marcado para possibilitar a detecção direta, por exemplo, pelos marcadores conforme mencionado acima.

[0120] Em uma realização específica, a concentração de 25- hidroxivitamina D na amostra é de, pelo menos, 1 nmol/L (0,4 ng/mL), de maior preferência de, no máximo 500 nmol/L (200 ng/mL), de maior preferência, está no intervalo a partir de 10 nmol/L (4 ng/mL) a 500 nmol/L (200 ng/mL), de maior preferência, no intervalo a partir de 10 nmol/L (4 ng/mL) a 250 nmol/L (100 ng/mL).

[0121] De acordo com a presente invenção, “reação cruzada” ou “reatividade cruzada” significa que a força de ligação a um composto de vitamina D a ser determinado (por exemplo, a 25-hidroxivitamina D) é distinta a partir do composto interferente (por exemplo, a 24,25-diidroxivitamina D3) contra a qual um primeiro agente de ligação, em especial, um anticorpo, se refere, possui 10% ou inferior, de preferência, 5% ou inferior da força de ligação medida com o analito. A resistência à ligação, em especial, pode ser determinada pela aplicação de um teste de afinidade utilizando um BiaCoreTM. Como o técnico no assunto sabe, a afinidade de ligação (afinidade ou forças de ligação), se fornecida como Kd é a melhor / maior, menor Kd.

[0122]Além disso, poderia ser mostrado nos Exemplos, que o primeiro agente de ligação da presente invenção não apresenta nenhuma reatividade cruzada com a 25-hidroxivitamina D; isto é, foi descoberto que a reatividade cruzada com a 25-hidroxivitamina D é 10% ou inferior, em especial, 5% ou inferior, em especial, 1% ou inferior de reatividade cruzada. Em uma realização, o primeiro agente de ligação não possui reatividade cruzada significativa com a 25-hidroxivitamina D, de preferência, o primeiro agente de ligação possui 10% ou inferior de reatividade cruzada com a 25-hidroxivitamina D, de maior preferência, o primeiro agente de ligação possui 5% ou inferior de reatividade cruzada com a 25-hidroxivitamina D, de maior preferência ainda, o primeiro agente de ligação possui 1% ou inferior de reatividade cruzada com a 25-hidroxivitamina D, respectivamente. Por conseguinte, também pequenas quantidades de 25-hidroxivitamina D podem ser detectadas de maneira especificamente e confiável, até mesmo na presença de 24,25-diidroxivitamina D3.

[0123] De acordo com a presente invenção, Kd (primeiro agente de ligação) é a afinidade do primeiro agente de ligação para a 24,25- diidroxivitamina D3 e Kd (segundo agente de ligação) é a afinidade do segundo agente de ligação para a 25-hidroxivitamina D.

[0124]A “afinidade” define a força de interação entre as duas espécies e, de preferência, é determinada por meio de ressonância de plasmon de superfície, em especial, utilizando o sistema BiaCore®. No caso de anticorpos ou fragmentos de anticorpos, a afinidade é determinada como valor de Kd de preferência determinado através de ressonância de plasmon de superfície, em especial, utilizando o sistema BiaCore®. A determinação da afinidade pode ser realizada conforme descrito em “Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics”, Current Opinion in Immunology, Volume 5, edição 2, 1993, páginas 282-286.

[0125]Além disso, de acordo com a presente invenção, Conc (primeiro agente de ligação) e Conc (segundo agente de ligação) são as concentrações molares do primeiro agente de ligação e do segundo agente de ligação, respectivamente, na etapa (b) do método da presente invenção acima.

[0126]Além disso, de acordo com a presente invenção, a MR (primeiro agente de ligação) é a valência de ligação do primeiro agente de ligação para a ligação à 24,25-diidroxivitamina D3 e MR (segundo agente de ligação) é a valência de ligação do segundo agente de ligação para a 25- hidroxivitamina D.

[0127]A “valência de ligação”, de acordo com a presente invenção, é entendida como o número determinado experimentalmente de locais de ligação para um determinado par de parceiros de ligação. No caso de anticorpos ou suas partes funcionalmente ativas, a valência de ligação teórica normalmente é 1 ou 2, mas as valências de ligação determinadas experimentalmente podem ser valores não inteiros (por exemplo, 1,4) devido aos efeitos estéricos. No caso de anticorpos como o primeiro agente de ligação de preferência, a valência de ligação teórica normalmente é 1. Novamente, a valência de ligação determinada experimentalmente pode ser um valor não inteiro (por exemplo, 0,9) devido aos efeitos estéricos. A determinação da valência de ligação pode ser realizada conforme descrito em Schraeml M. et al., (2012) Methods in Molecular Biology Vol. 901, 171-181.

[0128] Para alcançar uma medição essencialmente completa da 25-hidroxivitamina D, é vantajoso que o Kd do primeiro agente de ligação para a 24,25-diidroxivitamina D3 seja no máximo 10 vezes mais elevado, de preferência, o mesmo, de maior preferência, inferior que a afinidade do segundo agente de ligação para a 25-hidroxivitamina D. Por conseguinte, em uma outra realização de preferência, Kd (primeiro agente de ligação) / Kd (segundo agente de ligação) é 10 ou inferior, de preferência, 1 ou inferior, de maior preferência, 0,1 ou inferior.

[0129] Para alcançar uma medição essencialmente completa da 25-hidroxivitamina D, é ainda mais vantajoso em uma realização se a concentração do primeiro agente de ligação for a mesma, de preferência, pelo menos, 10 vezes superior, de maior preferência, 50 vezes superior, de maior preferência, 100 vezes superior que a concentração do segundo agente de ligação. Por conseguinte, em uma realização ainda de maior preferência, Conc (primeiro agente de ligação) / Conc (segundo agente de ligação) é no máximo 200, de preferência, no máximo 100, de maior preferência, no máximo 50, de maior preferência ainda, no máximo 10, ainda de maior preferência, no máximo 1, em que Conc (primeiro agente de ligação) está no intervalo a partir de 1 * (de 1 a 10) nmol/L a 200 * (de 1 a 10) nmol/L e/ou Conc (segundo agente de ligação) está no intervalo a partir de 1 a 10 nmol/L.

[0130] De acordo com uma realização específica, o primeiro agente de ligação de preferência é, pelo menos, o mesmo, de maior preferência, pelo menos, 10 vezes superior, pelo menos, 100 vezes superior à afinidade de ligação à 24,25-diidroxivitamina D3, respectivamente, como o segundo agente de ligação.

[0131] Outro aspecto importante são as valências de ligação do primeiro agente de ligação e do segundo agente de ligação utilizadas no método da presente invenção, em especial, no caso do primeiro agente de ligação e/ou do segundo agente de ligação serem anticorpos ou suas partes funcionalmente ativas. Quando se ligam aos pequenos analitos, por exemplo, um composto de vitamina D, uma molécula de ligação que é um anticorpo normalmente mostra uma valência de ligação de MR = 2, enquanto que por razões estéricas, o primeiro agente de ligação que é um anticorpo normalmente mostra uma valência de ligação de MR = 1 e inferior. Neste caso, o quociente de molaridade funcional, de preferência, é a ser considerado.

[0132] É ainda vantajoso determinar a quantidade total de analito (por exemplo, um composto de vitamina D, de preferência, a 25-hidroxivitamina D) se o segundo agente de ligação, que se pretende ligar ao analito, exiba uma afinidade suficientemente elevada para este analito. Além disso, é vantajoso que o primeiro agente de ligação, que se pretende ligar à 24,25-diidroxivitamina D3, exiba uma afinidade suficientemente elevada para esta 24,25- diidroxivitamina D3.

[0133] É ainda vantajoso determinar a quantidade total de 25- hidroxivitamina D se a afinidade do primeiro agente de ligação para ligação à 24,25-diidroxivitamina D3 for suficientemente elevada para alcançar a ligação essencialmente completa de 24,25-diidroxivitamina D3 ao primeiro agente de ligação. Por conseguinte, em uma realização adicional, o Kd do primeiro agente de ligação para ligação à 24,25-diidroxivitamina D3 é 10-8 mol/L ou inferior, de preferência, 10-9 mol/L ou inferior, de maior preferência, 10-10 mol/L ou inferior.

[0134]Ainda em uma outra realização, o Kd do segundo agente de ligação para a ligação à 25-hidroxivitamina D é 10-8 mol/L ou inferior, de preferência, 10-9 mol/L ou inferior, de maior preferência, 10-10 mol/L ou inferior.

[0135] É ainda vantajoso que o primeiro agente de ligação exiba especificidade para a 24,25-diidroxivitamina D3 de maneira a minimizar a detecção de falsos positivos da 25-hidroxivitamina D. Além disso, é vantajoso que o primeiro agente de ligação exiba especificidade para a 24,25- diidroxivitamina D3, em especial, para minimizar a perda do primeiro agente de ligação e para maximizar a ligação à 24,25-diidroxivitamina D3. Por conseguinte, em uma realização de preferência, o primeiro agente de ligação liga a 24,25-diidroxivitamina D3 especificamente, em especial, a ligação do primeiro agente de ligação a um alvo diferente de 24,25-diidroxivitamina D3 é no máximo 5% da ligação do primeiro agente de ligação à 24,25- diidroxivitamina D3.

[0136] Em uma realização ainda mais específica, a concentração do primeiro agente de ligação está no intervalo a partir de 1 * (de 1 a 10) nmol/L a 200 * (de 1 a 10) nmol/L, tal como 1 * (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nmol/L a 200 * (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) nmol/L, especialmente, de 1 a 1.000 nmol/L, 30 a 800 nmol/L, 50 a 700 nmol/L, 100 a 600 nmol/L.

[0137] Um técnico no assunto está ciente de que tais métodos necessitam ser padronizados para uma medição quantitativa de um composto de vitamina D. Ainda em uma realização adicional, os métodos, de acordo com a presente invenção, são normalizados por um calibrador de vitamina D.

[0138] Um técnico no assunto também está ciente de que os métodos para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, de acordo com a presente invenção também podem ser executados com um procedimento modificado.

[0139] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um método in vitro para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, o método compreende as etapas: (a) do fornecimento de uma amostra obtida de um indivíduo, (b) da mistura da amostra com um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25-diidroxivitamina D3 e um segundo agente de ligação que se liga à 25-hidroxivitamina D, por conseguinte, formando um primeiro complexo entre o primeiro agente de ligação e a 24,25-diidroxivitamina D3 e um segundo complexo entre o segundo agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D, respectivamente, e (c) da medição do segundo complexo formado em (b), por conseguinte, determinando a concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3.

[0140] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um método in vitro para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, o método compreende as etapas: (a) do fornecimento de uma amostra obtida de um indivíduo, (b) da mistura da amostra, (ba) com um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3, por conseguinte, formando um primeiro complexo entre o primeiro agente de ligação e a 24,25-diidroxivitamina D3, (bb) com um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, por conseguinte, formando um segundo complexo entre o agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D, (c) da separação do segundo complexo que compreende o segundo agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D do segundo agente de ligação que não compreende a 25-hidroxivitamina D e (d) da medição do segundo complexo formado em (bb), por conseguinte, medindo a 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25- diidroxivitamina D3.

[0141] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um método in vitro para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, o método compreende as etapas: (e) do fornecimento de uma amostra obtida de um indivíduo, (f) da mistura da amostra, (ba) com um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3, por conseguinte, formando um complexo entre o primeiro agente de ligação e a 24,25-diidroxivitamina D3, (bb) com um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, (g) da mistura da amostra com uma 25-hidroxivitamina D marcada, uma 25-hidroxivitamina D da amostra e uma 25-hidroxivitamina D marcada competindo pela ligação ao segundo agente de ligação que se liga à 25-hidroxivitamina D, por conseguinte, obtendo um segundo complexo entre o segundo agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D marcada, (h) da separação da 25-hidroxivitamina D marcada compreendida no segundo complexo obtido na etapa (c) da 25-hidroxivitamina D marcada não compreendida no segundo complexo, e (i) da medição da 25-hidroxivitamina D marcada compreendida no segundo complexo, por conseguinte, medindo a 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3.

[0142] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um método in vitro para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, o método compreende as etapas: (a) do fornecimento de uma amostra obtida de um indivíduo e - da liberação do composto de vitamina D presente na amostra ligado à proteína de ligação à vitamina D com um reagente de liberação, (b) da mistura da amostra, (ba) com um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3, por conseguinte, formando um complexo entre o primeiro agente de ligação e a 24,25-diidroxivitamina D3, (bb) com um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, (c) da mistura da amostra com uma 25-hidroxivitamina D marcada, uma 25-hidroxivitamina D da amostra e uma 25-hidroxivitamina D marcada competindo pela ligação ao segundo agente de ligação que se liga à 25-hidroxivitamina D, por conseguinte, obtendo um segundo complexo entre o segundo agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D marcada, (d) da separação da 25-hidroxivitamina D marcada compreendida no segundo complexo obtido na etapa (c) da 25-hidroxivitamina D marcada não compreendida no segundo complexo, e (e) da medição da 25-hidroxivitamina D marcada compreendida no segundo complexo, por conseguinte, medindo a 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3.

UTILIZAÇÃO

[0143] Utilizando os métodos da presente invenção, a quantidade total e/ou a concentração de 25-hidroxivitamina D podem ser detectadas.

[0144] Em uma realização, a presente invenção se refere à utilização de um método in vitro, de acordo com o(s) método(s) da presente invenção, para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3.

[0145] Em uma outra realização, a presente invenção se refere à utilização de um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25-diidroxivitamina D3 e a um segundo agente de ligação que se liga à 25-hidroxivitamina D em um método(s) in vitro, de acordo com a presente invenção, para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25- diidroxivitamina D3 em uma amostra obtida de um indivíduo.

[0146] De preferência como um primeiro agente de ligação mAb <24,25-diidroxivitamina D3> e como um segundo agente de ligação, é utilizada uma proteína de ligação à vitamina D, de acordo com uma realização da presente invenção.

[0147]Além disso, a presente invenção se refere a uma realização da utilização de um conjunto descrito no presente para a determinação de 25- hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3.

CONJUNTO

[0148] Em uma realização, a presente invenção se refere a um conjunto para a realização do(s) método(s), de acordo com a presente invenção, que compreende, pelo menos: (f) um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3, em que o primeiro agente de ligação é um anticorpo monoclonal ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal, e (g) um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, em que o segundo agente de ligação é uma proteína de ligação à vitamina D.

[0149] De preferência, como um primeiro agente de ligação mAb <24,25-diidroxivitamina D3> e como um segundo agente de ligação, é fornecida uma proteína de ligação à vitamina D em um conjunto, de acordo com uma realização da presente invenção.

[0150] O técnico no assunto está ciente de que os reagentes descritos no presente são adequados para a fabricação de um conjunto para a prática dos métodos, de acordo com a presente invenção.

[0151] Em uma realização específica, o conjunto também compreende a composição de reagente que possui 0,1 M a 2,0 M de um sal de carbonato de hidrogênio ou de uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, um agente de redução e um agente de alcalinização, de preferência, o conjunto compreende uma composição de reagente que possui de 0,1 M a 2,0 M de um sal de carbonato de hidrogênio ou de uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, 2 mM a 30 mM de um agente de redução, uma solução de 1 M A 1,5 M de um agente de alcalinização, além de um primeiro agente de ligação e um segundo agente de ligação, de acordo com a presente invenção.

[0152] Em uma realização específica adicional, o conjunto compreende um agente de redução selecionado a partir do grupo que consiste em 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEP, cisteína-HCl e ditiotreitol (DTT) e uma solução de 1 M a 1,5 M de um agente de alcalinização selecionado a partir do grupo que consiste em NaOH, KOH, Ca(OH)2.

[0153]Além disso, em uma realização, o conjunto compreende um calibrador de vitamina D.

[0154] O conjunto, de acordo com a presente invenção, demonstrou ser adequado para a utilização em um teste automatizado para os compostos de vitamina D. A presente invenção, de preferência, se refere à utilização de um conjunto, de acordo com a presente invenção, para a determinação de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25- diidroxivitamina D3.

[0155] O teste para a 25-hidroxivitamina D, de preferência, é completamente automatizado. O termo “completamente automatizado” neste caso significa que o experimentador apenas precisa colocar uma amostra a ser investigada e uma embalagem de reagente contendo todos os componentes para a medição de um composto de vitamina D em um analisador automatizado e todas as outras etapas são realizadas automaticamente pelo analisador. O teste completamente automatizado é realizado de uma maneira especialmente de preferência em um analisador Elecsys® da Roche Diagnostics.

[0156]A composição de reagente, primeiro agente de ligação e segundo agente de ligação, respectivamente, de acordo com a presente invenção, em uma realização adicional são utilizados em um método in vitro para a detecção de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25- diidroxivitamina D3, em que a 25-hidroxivitamina D é selecionada a partir do grupo que compreende a 25-hidroxivitamina D2, 25-hidroxivitamina D3 e 3-epi- 25-hidroxivitamina D, de preferência, a 25-hidroxivitamina D2, 25- hidroxivitamina D3.

[0157] Conforme mencionado anteriormente acima, a 25- hidroxivitamina D2 e a 25-hidroxivitamina D3 são formas especialmente relevantes de vitamina D para o diagnóstico. No(s) método(s) in vitro, de acordo com a presente invenção, a detecção específica de 25-hidroxivitamina D2 ou 25-hidroxivitamina D3 ou ambas por meio de um anticorpo específico para a 25-hidroxivitamina D2 ou 25-hidroxivitamina D3 sem interferência com 24,25-diidroxivitamina D3 também representa uma realização de preferência.

[0158] Salvo definição em contrário, os termos técnicos e científicos utilizados no presente possuem o mesmo significado normalmente entendido por um técnico regular do assunto a que a presente invenção pertence. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons (Nova Iorque, NY, 1994), e March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4a ed., John Wiley & Sons (Nova Iorque, NY 1992); Lewin, B., Genes V, publicado por Oxford University Press (1994), ISBN 0-19-854287-9; Kendrew, J. et al., (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd. (1994), ISBN 0-63202182-9; e Meyers, R.A. (Ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc. (1995), ISBN 1-56081-569-8 fornecem um técnico regular do assunto com um guia geral para muitos dos termos utilizados no presente pedido.

[0159]A prática da presente invenção irá empregar, salvo indicação em contrário, as técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo as técnicas de recombinação), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro das habilidades do estado da técnica. Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura, tais como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture (1987); Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Ausubel, F.M. et al., (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, (1987) e atualizações periódicas; Mullis et al., (Eds.), PCR: The Polymerase Chain Reaction (1994).

[0160] Outras características e realizações opcionais da presente invenção serão descritas com maiores detalhes na descrição posterior de realizações de preferência, de preferência em conjunto com as reivindicações dependentes. Neste caso, as respectivas características opcionais podem ser realizadas de uma maneira isolada, bem como em qualquer combinação viável arbitrária, como o técnico no assunto irá perceber. O âmbito da presente invenção não é restringido pelas realizações de preferência.

[0161] Resumindo as descobertas da presente invenção, as seguintes realizações são de preferência: (1) Método in vitro para a determinação da concentração de 25- hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, o método compreende as etapas: (a) do fornecimento de uma amostra obtida de um indivíduo que compreende um composto de vitamina D ligado à proteína de ligação à vitamina D, (b) da mistura da amostra, (ba) com um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3, por conseguinte, formando um complexo entre o primeiro agente de ligação e a 24,25-diidroxivitamina D3; (bb) com um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, por conseguinte, formando um complexo entre o segundo agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D; (c) da medição do complexo formado em (bb), por conseguinte, determinando a concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, (2) O método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é o sangue, soro ou plasma; (3) O método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o composto de vitamina D presente na amostra ligado à proteína de ligação à vitamina D é liberado da proteína de ligação à vitamina D antes da etapa (b) com um reagente de liberação; (4) O método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o reagente de liberação desnaturaliza a proteína de ligação à vitamina D, de preferência, o reagente de liberação irreversível desnatura a proteína de ligação à vitamina D; (5) O método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o composto de vitamina D é liberado da proteína de ligação à vitamina D antes da etapa (b) através de um método selecionado a partir do grupo que consiste em uma degradação proteolítica, uma liberação ácida, uma liberação alcalina, uma liberação de metanol, uma precipitação de etanol, uma liberação de sal de periodato, uma extração com a acetonitrila, uma liberação de hidróxido de metal, uma liberação por ciclodextrina e/ou seus derivados ou uma liberação de salicilato de metal, respectivamente; (6) O método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o reagente de liberação compreende um sal de carbonato de hidrogênio em uma concentração de 0,1 M a 2,0 M e/ou uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise em uma concentração de 0,1 M a 2,0 M, um agente de redução e um agente de alcalinização; (7) O método, de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que: - Kd (primeiro agente de ligação) / Kd (segundo agente de ligação) é 10 ou inferior, de preferência, 1 ou inferior, de maior preferência, 0,1 ou inferior; e/ou - Conc (primeiro agente de ligação) / Conc (segundo agente de ligação) é no máximo 200, de preferência, no máximo 100, de maior preferência, no máximo 50, de maior preferência ainda, no máximo 10, - em que Kd (primeiro agente de ligação) é a afinidade do primeiro agente de ligação para a 24,25-diidroxivitamina D3 e Kd (segundo agente de ligação) é a afinidade do segundo agente de ligação para a 25-hidroxivitamina D, e - em que Conc (primeiro agente de ligação) e Conc (segundo agente de ligação) são as concentrações molares do primeiro agente de ligação e do segundo agente de ligação, respectivamente, na etapa (b), especialmente em que Conc (primeiro agente de ligação) está no intervalo a partir de 1 * (de 1 a 10) nmol/L a 200 * (de 1 a 10) nmol/L e/ou Conc (segundo agente de ligação) está no intervalo a partir de 1 a 10 nmol/L; (8) O método, de acordo com as reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que: - o Kd do primeiro agente de ligação para ligação à 24,25- diidroxivitamina D3 é 10-8 mol/L ou inferior, de preferência, 10-9 mol/L ou inferior, de maior preferência, 10-10 mol/L ou inferior; e/ou - o Kd do segundo agente de ligação para ligação à 25- hidroxivitamina D é 10-8 mol/L ou inferior, de preferência, 10-9 mol/L ou inferior, de maior preferência, 10-10 mol/L ou inferior; (9) O método, de acordo com as reivindicações de 1 a 8, (a) em que o indivíduo é um humano; e/ou (b) em que o método é selecionado a partir do grupo que consiste em uma imunoanálise ligada à enzima (ELISA), imunoanálise por eletroquimioluminescência (ECLIA), radioimunoanálise (RIA) e imunoanálise quimioluminescente (CLIA); e/ou (c) em que a 25-hidroxivitamina D é selecionada a partir do grupo que consiste em 25-hidroxivitamina D2, 25-hidroxivitamina D3 e 3-epi-25- hidroxivitamina D; e/ou (d) em que a 25-hidroxivitamina D é selecionada a partir do grupo que consiste em 25-hidroxivitamina D2 e 25-hidroxivitamina D3; e/ou (e) em que o primeiro agente de ligação é selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpo policlonal, anticorpo monoclonal e anticorpo sintético (anticorpo plástico), de preferência, um anticorpo monoclonal ou anticorpo sintético, de maior preferência, um anticorpo monoclonal ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal, respectivamente; e/ou (f) em que o segundo agente de ligação é uma proteína de ligação à vitamina D, de preferência, uma proteína recombinante de ligação à vitamina D; e/ou (g) em que o primeiro agente de ligação é um anticorpo monoclonal ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal, e o segundo agente de ligação é uma proteína de ligação à vitamina D ou uma parte funcionalmente ativa da proteína de ligação à vitamina D; e/ou (h) em que o primeiro agente de ligação é a mAb <24,25- diidroxivitamina D3> e o segundo agente de ligação é uma proteína de ligação à vitamina D, de preferência, uma proteína de ligação à vitamina D marcada, de maior preferência, uma proteína de ligação à vitamina D rutenilada; e/ou (i) em que o primeiro agente de ligação é um anticorpo monoclonal ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal e o segundo agente de ligação é um anticorpo monoclonal ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal; e/ou (j) em que o primeiro agente de ligação é a mAb <24,25- diidroxivitamina D3> ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal, e o segundo agente de ligação é mAb <25-hidroxivitamina D> ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal, que é capaz de imobilizar sobre um suporte sólido; e/ou (k) em que o primeiro agente de ligação evita a ligação de 24,25- diidroxivitamina D3 ao segundo agente de ligação; e/ou (l) em que a 24,25-diidroxivitamina D3 ligada ao primeiro agente de ligação não pode ser ligada pelo segundo agente de ligação; e/ou (m) em que o segundo agente de ligação não é capaz de liberar a 24,25-diidroxivitamina D3 ligada ao primeiro agente de ligação; e/ou (h) em que o primeiro agente de ligação, pelo menos, possui a mesma afinidade de ligação, de preferência, pelo menos, 10 vezes superior, de maior preferência, pelo menos, 100 vezes superior à 24,25-diidroxivitamina D3, respectivamente, como o segundo agente de ligação; e/ou (o) em que o primeiro agente de ligação não possui reatividade cruzada significativa com a 25-hidroxivitamina D, de preferência, o primeiro agente de ligação possui 10% ou inferior de reatividade cruzada com a 25- hidroxivitamina D, de maior preferência, o primeiro agente de ligação possui 5% ou inferior de reatividade cruzada com a 25-hidroxivitamina D, de maior preferência ainda, o primeiro agente de ligação possui 1% ou inferior de reatividade cruzada com a 25-hidroxivitamina D, respectivamente; e/ou (p) em que o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação de acordo com a etapa (b) da reivindicação 1 são colocados em contato simultaneamente com a amostra; e/ou (q) em que o primeiro agente de ligação é colocado em contato com a amostra de acordo com a etapa (b) da reivindicação 1 antes ou após o contato do segundo agente de ligação com a amostra; e/ou (r) em que a concentração de 25-hidroxivitamina D na amostra é de, pelo menos, pelo menos 1 nmol/L (0,4 ng/mL), de maior preferência de, no máximo 500 nmol/L (200 ng/mL), de maior preferência ainda, de 10 nmol/L (4 ng/mL) a 500 nmol/L (200 ng/mL), ainda de maior preferência, no intervalo a partir de 10 nmol/L (4 ng/mL) a 250 nmol/L (100 ng/mL); e/ou (s) em que o método é padronizado por um calibrador de vitamina D; (10) A utilização de um método in vitro, de acordo com as reivindicações de 1 a 9, para a determinação da concentração de 25- hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3; (11) A utilização de um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25-diidroxivitamina D3 e um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D em um método in vitro para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3 em uma amostra obtida de um indivíduo; (12) Conjunto para executar o método, de acordo com as reivindicações de 1 a 9, que compreende, pelo menos; (a) um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3, em que o primeiro agente de ligação é um anticorpo monoclonal ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal; e (b) um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, em que o segundo agente de ligação é uma proteína de ligação à vitamina D; (13) Método in vitro para a determinação da concentração de 25- hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, o método compreende as etapas: (a) do fornecimento de uma amostra obtida de um indivíduo, (b) da mistura da amostra com um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25-diidroxivitamina D3 e um segundo agente de ligação que se liga à 25-hidroxivitamina D, por conseguinte, formando um primeiro complexo entre o primeiro agente de ligação e a 24,25-diidroxivitamina D3 e um segundo complexo entre o segundo agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D, respectivamente, e (c) da medição do segundo complexo formado em (b), por conseguinte, determinando a concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3; (14) Um método in vitro para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, o método compreende as etapas: (a) do fornecimento de uma amostra obtida de um indivíduo, (b) da mistura da amostra, (ba) com um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3, por conseguinte, formando um primeiro complexo entre o primeiro agente de ligação e a 24,25-diidroxivitamina D3, (bb) com um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, por conseguinte, formando um segundo complexo entre o agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D, (c) da separação do segundo complexo que compreende o segundo agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D do segundo agente de ligação que não compreende a 25-hidroxivitamina D; e (d) da medição do segundo complexo formado em (bb), por conseguinte, medindo a 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25- diidroxivitamina D3; (15) Método in vitro para a determinação da concentração de 25- hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, o método compreende as etapas: (a) do fornecimento de uma amostra obtida de um indivíduo, (b) da mistura da amostra, (ba) com um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3, por conseguinte, formando um complexo entre o primeiro agente de ligação e a 24,25-diidroxivitamina D3, (bb) com um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, (c) da mistura da amostra com uma 25-hidroxivitamina D marcada, uma 25-hidroxivitamina D da amostra e uma 25-hidroxivitamina D marcada competindo pela ligação ao segundo agente de ligação que se liga à 25-hidroxivitamina D, por conseguinte, obtendo um segundo complexo entre o segundo agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D marcada, (d) da separação da 25-hidroxivitamina D marcada compreendida no segundo complexo obtido na etapa (c) da 25-hidroxivitamina D marcada não compreendida no segundo complexo, e (e) da medição da 25-hidroxivitamina D marcada compreendida no segundo complexo, por conseguinte, medindo a 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, 16) Método in vitro para a determinação da concentração de 25- hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3, o método compreende as etapas: (a) do fornecimento de uma amostra obtida de um indivíduo e - da liberação do composto de vitamina D presente na amostra ligado à proteína de ligação à vitamina D com um reagente de liberação, (b) da mistura da amostra, (ba) com um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3, por conseguinte, formando um complexo entre o primeiro agente de ligação e a 24,25-diidroxivitamina D3, (bb) com um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, (c) da mistura da amostra com uma 25-hidroxivitamina D marcada, uma 25-hidroxivitamina D da amostra e uma 25-hidroxivitamina D marcada competindo pela ligação ao segundo agente de ligação que se liga à 25-hidroxivitamina D, por conseguinte, obtendo um segundo complexo entre o segundo agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D marcada, (d) da separação da 25-hidroxivitamina D marcada compreendida no segundo complexo obtido na etapa (c) da 25-hidroxivitamina D marcada não compreendida no segundo complexo, e (e) da medição da 25-hidroxivitamina D marcada compreendida no segundo complexo, por conseguinte, medindo a 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0162]A presente invenção ainda é elucidada pelos seguintes Exemplos e Figuras. O âmbito de proteção real resulta das reivindicações anexas à presente invenção. As realizações estão esquematicamente representadas nas Figuras.

[0163] Figura 1: A Figura 1 mostra a estrutura química de éster de N-hidroxissuccinimida do ácido 7-{2-[2-(2-{(S)-3-[2-[(1R,7aR)-1-((R)-4,5- diidroxi-1,5-dimetil-hexil)-7a-metil-octaidro-inden-(4E)-ilideno]-et-(Z)-ilideno]-4- metileno-ciclo-hexiloxicarbonilamino}-etoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}heptanóico (éster de ácido NHS).

[0164] Figura 2: A Figura 2 mostra a imunoanálise total de Elecsys® Vitamina D sem ou com o agente de bloqueio (primeiro agente de ligação), respectivamente, no reagente R1. 25-hidroxivitamina D3 (O,25(OH)D3); 24,25-diidroxivitamina D3 (•, 24,25 (OH)2Ds).

[0165]A Figura 2a mostra os resultados sem bloquear o reagente (primeiro agente de ligação) mAb <24,25-diidroxivitamina D3> rK-IgG.

[0166]A Figura 2b mostra os resultados com o reagente de bloqueio (primeiro agente de ligação) para a eliminação de interferência de mAb<24,25-diidroxivitamina D3> rK-IgG (mAb<24,25 (OH)2D3>).

[0167] Figura 3: A correlação entre as medições de imunoanálise total Elecsys® Vitamin D e LC-MS vitamina D é mostrada nas Figuras 3a e 3b para dois conjuntos de amostras diferentes. Sem o reagente de bloqueio (O, sem primeiro agente de ligação) e com agente de bloqueio (•, com o primeiro agente de ligação).

EXEMPLO 1 PROCEDIMENTOS PARA A SÍNTESE DE UM REAGENTE DE BLOQUEIO PARA A 24,25- DIIDROXIVITAMINA D3 1.1 SÍNTESE DO ANTÍGENO E CONJUGADO DE ANTÍGENO

[0168] Síntese de ácido de éster do ácido M-hidroxiloxisuccinimida 7-{2-[2-(2-{(S)-3-[2-[(1R,7aR)-1-((R)-4,5-dihidroxi-1,5-dimetil-hexil)-7a-metil- octaidro-inden-(4E)-ilideno]-te-(Z)-ilideno]-4-metileno-ciclo- hexiloxicarbonilamino}-etoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-heptanóico (NHS éster de ácido na Figura 1)

[0169]A síntese do material de partida 24,25-O-isopropilideno- 24R, 25-diidroxivitamina D3 está descrita por Sestelo, Jose Perez; Cornella, Ivan; De Una, Olga; Mourino, Antonio; Sarandeses, Luis A., Chemistry - A European Journal (2002), 8 (12), 2747-2752. A estrutura é mostrada na Figura 1.

[0170] 100 mg do material de partida e 26,8 mg de DMAP foram secados em um balão e foram adicionados 20 mL de diclorometano. Após a adição de 121 μl de trietilamina foram adicionados 86,7 mg de fosgênio como solução de tolueno a 20%. A solução foi agitada durante 45 minutos sob atmosfera inerte e protegida da luz à temperatura ambiente (RT: a RT é conhecida do técnico no assunto como 20° C a 25° C e 324,6 mg de diamino- dioxa-octano dissolvido em 10 mL de diclorometano. A mistura ainda foi agitada durante a noite sob as mesmas condições O produto foi purificado por HPLC preparativa. Rendimento = 72 mg.

[0171] 55 mg do derivado amina foram convertidos no éster NHS por reação com 168 mg de éster de bis-N-hidroxisuccinimida do ácido octanodióico, 68 μl de trietilamina em acetonitrila durante a noite à temperatura ambiente (RT). O grupo de proteção foi clivado através da adição de cerca de 1 g de Dowex 50WXH e agitação contínua até a reação estar completa. O produto foi purificado por HPLC preparativa. Rendimento 16 mg. HPLC-ESI- MS:M+ = 844,7 Da

SÍNTESE DO CONJUGADO DE ANTÍGENO

[0172] 5,63 mg do éster de NHS descrito acima foram dissolvidos em 500 μl de DMSO e foram adicionados a uma solução de 50 mg de KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin, Sigma H 8283). O pH foi ajustado para pH = 8,3 e a solução foi agitada durante a noite. A mistura foi purificada em uma célula agitada com Amicon.

[0173]Analítica de grupos amino: proporção Antigen-KLH de cerca de 500:1.

1.2 GERAÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA 24,25-DIIDROXIVITAMINA D3 DESENVOLVIMENTO DE ANTICORPOS COM PCR DE CÉLULAS B DE COELHOS

[0174] Para a geração de anticorpos contra a 24,25- diidroxivitamina D3, os coelhos ZiKa de 16 semanas de idade foram imunizados com a 24,25-diidroxivitamina D3 acoplada à KLH. Todos os coelhos foram submetidos a imunizações repetidas. Nos primeiros meses, os animais foram imunizados semanalmente. A partir do segundo mês, os animais foram imunizados uma vez por mês. Para cada imunização foram dissolvidos 500 μg de 24,25-diidroxivitamina D3 acoplada à KLH em 1 mL de NaCl 140 mM e foram emulsionados em 1 mL de CFA. O desenvolvimento dos títulos é avaliado nos dias 45 e 105 após o início da imunização. Quando os títulos contra o imunogênio são detectáveis por ELISA, os anticorpos são desenvolvidos por clonagem de células B conforme descrito em Seeber et al., 2014. A IgG recombinante de coelho de comprimento completo é produzida por transfecção transitória de células HEK293.

ANÁLISE DE TÍTULOS

[0175] Para a determinação dos títulos de soro contra a 24,25- diidroxivitamina D3 foi acoplada uma variante biotinilada de 24,25- diidroxivitamina D3 às placas de 96 cavidades revestidas com a estreptavidina. Uma pequena quantidade de soro de cada coelho é coletada no dia 45 e dia 105 após o início da campanha de imunização. A 24,25-diidroxivitamina D3 biotinilada foi imobilizada na superfície da placa a uma concentração de 15 ng/mL. Os soros de cada coelho foram diluídos em o PBS com 1% de BSA e as diluições foram adicionadas às placas. Os soros foram testados nas diluições 1:300, 1:900, 1:2.700, 1:8.100, 1:24.300, 1:72.900, 1:218.700 e 1:656.100. O anticorpo ligado foi detectado com Fc (Dianova) de cabra anticoelho marcado com a HRP (AB) e ABTS (Roche) como substrato.

EXEMPLO 2 APLICAÇÃO DE UM REAGENTE DE BLOQUEIO PARA A 24,25-DIIDROXIVITAMINA D3 A UMA ANÁLISE DE LIGAÇÃO

[0176] Dependendo do procedimento de análise, um reagente de bloqueio (por exemplo, um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, uma parte funcionalmente ativa de um anticorpo monoclonal ou um anticorpo sintético (anticorpo plástico)) que especificamente se liga à 24,25- diidroxivitamina D3 pode ser adicionado ao pré-tratamento ou liberar os reagentes, diluentes de análise ou tampões de análise colocando-os em contato com os compostos de vitamina D em uma amostra antes ou em conjunto com o respectivo componente de ligação marcado (conjugado) da análise.

[0177] Como um exemplo, está descrito o bloqueio de 24,25- diidroxivitamina D3 na análise imunoenzimático total Elecsys® Vitamin D: - 0,075 mg/mL de mAb <24,25-diidroxivitamina D3> rK-IgG foram adicionados ao reagente R1 da imunoanálise total Elecsys® Vitamina D contendo o conjugado rutenilado da proteína de ligação à Vitamina D; - a aplicação de análise total de Vitamina D foi realizada com uma série de diluição de 25-hidroxivitamina D3 (O, 25(OH)D3) ou 24,25- diidroxivitamina D3 (•, 24,25 (OH)2D3) em uma matriz livre de metabolitos da vitamina D (Diluent Universal); - a referência (sem reagente de bloqueio) mostrou reatividade cruzada com a 25-hidroxivitamina D3 e 24,25-diidroxivitamina D3 (Tabela 1 e Figura 2a); - a aplicação de imunoanálise com o reagente de bloqueio mostrou reatividade cruzada reduzida com a 24,25-diidroxivitamina D3 enquanto a especificidade para a 25-hidroxivitamina D3 não é afetada (Tabela 1 e Figura 2b). TABELA 1 EFEITO DA MAB <24,25-DIIDROXIVITAMINA D3> RK-IGG NA DINÂMICA DO SINAL (MOSTRADO COMO B / B0) PARA A 25-HIDROXIVITAMINA D3 (25(OH)D3) E 24,25- DIIDROXIVITAMINA D3 (24,25(OH)2Ü3)

[0178] O efeito positivo da mAb <24,25-diidroxivitamina D3>rK-IgG também pode ser independentemente observado para dois conjuntos de amostras diferentes na correlação aprimorada com LC-MS/MS que é específica para a 25-hidroxivitamina D2 e 25-hidroxivitamina D3 apenas (Figuras 3a e 3b). Sem agente de bloqueio (O), a correlação é 0,92 (esquerda) ou 0,79 (direita). Após a adição da mAb <24,25-diidroxivitamina D3> rK-IgG (•, mAb <24,25 (OH)2D3>) a correlação aprimorou para 0,94 (esquerda) ou 0,90 (direita), respectivamente.

Claims (15)

1. MÉTODO IN VITRO PARA A DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE 25-HIDROXIVITAMINA D, sem interferência por 24,25- diidroxivitamina D3, caracterizado por compreender as etapas de: (a) fornecimento de uma amostra obtida de um indivíduo que compreende um composto de vitamina D ligado à proteína de ligação à vitamina D, (b) mistura da amostra (ba) com um primeiro agente de ligação que especificamente se liga à 24,25-diidroxivitamina D3 e não se liga à 25- hidroxivitamina D, por conseguinte, formando um complexo entre o primeiro agente de ligação e a 24,25-diidroxivitamina D3; (bb) com um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, por conseguinte, formando um complexo entre o segundo agente de ligação e a 25-hidroxivitamina D; (c) da medição do complexo formado em (bb), por conseguinte, determinando a concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela amostra ser o sangue, soro ou plasma.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo composto de vitamina D presente na amostra ligado à proteína de ligação à vitamina D ser liberado da proteína de ligação à vitamina D antes da etapa (b) com um reagente de liberação.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por - Kd (primeiro agente de ligação) / Kd (segundo agente de ligação) ser 10 ou inferior; e/ou - Conc (primeiro agente de ligação) / Conc (segundo agente de ligação) ser no máximo 200; - em que Kd (primeiro agente de ligação) é a afinidade do primeiro agente de ligação para a 24,25-diidroxivitamina D3 e Kd (segundo agente de ligação) é a afinidade do segundo agente de ligação para a 25-hidroxivitamina D e - em que Conc (primeiro agente de ligação) e Conc (segundo agente de ligação) são as concentrações molares do primeiro agente de ligação e do segundo agente de ligação, respectivamente, na etapa (b), especialmente em que Conc (primeiro agente de ligação) está no intervalo a partir de 1 *(1 a 10) nmol/L a 200 *(1 a 10) nmol/L e/ou Conc (segundo agente de ligação) está no intervalo a partir de 1 a 10 nmol/L.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo - Kd do primeiro agente de ligação para ligação à 24,25- diidroxivitamina D3 ser 10-8 mol/L ou inferior; e/ou - Kd do segundo agente de ligação para a ligação à 25- hidroxivitamina D ser 10-8 mol/L ou inferior.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo método ser selecionado a partir do grupo que consiste em imunoanálise ligada à enzima (ELISA), imunoanálise por eletroquimioluminescência (ECLIA), radioimunoanálise (RIA) e imunoanálise quimioluminescente (CLIA).

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela 25-hidroxivitamina D ser selecionada a partir do grupo que consiste em 25-hidroxivitamina D2, 25-hidroxivitamina D3 e 3-epi-25- hidroxivitamina D.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo primeiro agente de ligação ser um anticorpo monoclonal ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal e o segundo agente de ligação ser uma proteína de ligação à vitamina D ou uma parte funcionalmente ativa da proteína de ligação à vitamina D.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo primeiro agente de ligação, pelo menos, possuir a mesma afinidade de ligação à 24,25-diidroxivitamina D3 como o segundo agente de ligação.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo segundo agente de ligação não ser capaz de liberar a 24,25-diidroxivitamina D3 ligada ao primeiro agente de ligação.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo primeiro agente de ligação não possuir uma reatividade cruzada significativa com a 25-hidroxivitamina D.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo método de detecção in vitro ser realizado como uma análise competitiva.

13. USO DE UM MÉTODO IN VITRO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por ser para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3.

14. USO DE UM PRIMEIRO AGENTE DE LIGAÇÃO, caracterizado por se ligar especificamente à 24,25-diidroxivitamina D3 e não se ligar à 25-hidroxivitamina D, e um segundo agente de ligação se ligar à 25- hidroxivitamina D em um método in vitro para a determinação da concentração de 25-hidroxivitamina D sem interferência por 24,25-diidroxivitamina D3 em uma amostra obtida de um indivíduo.

15. KIT, para executar o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender, pelo menos, (a) um primeiro agente de ligação que se liga à 24,25- diidroxivitamina D3, e se liga à 25-hidroxivitamina D em que o primeiro agente de ligação é um anticorpo monoclonal ou uma parte funcionalmente ativa do anticorpo monoclonal e (b) um segundo agente de ligação que se liga à 25- hidroxivitamina D, em que o segundo agente de ligação é uma proteína de ligação à vitamina D.