KR20170093820A - 비타민 d 의 측정을 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 25-히드록시비타민 D 의 측정을 위한 시험관내 방법에 관한 것이며, 여기에서 잠재적으로 간섭하는 화합물 24,25-디히드록시비타민 D3 은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 특이적으로 결합하고 25-히드록시비타민 D 에 결합하지 않는 결합제에 의해 차단된다.

Description

비타민 D 의 측정을 위한 방법 {METHOD FOR MEASUREMENT OF VITAMIN D}
본 발명은 25-히드록시비타민 D 의 측정을 위한 시험관내 (in vitro) 방법에 관한 것이며, 여기에서 잠재적으로 간섭하는 화합물 24,25-디히드록시비타민 D3 이 24,25-디히드록시비타민 D3 에 특이적으로 결합하고 25-히드록시비타민 D 에 결합하지 않는 결합제에 의해 차단된다.
비타민 D 의 적절한 공급은 용어 "비타민" 이 이미 시사하는 바와 같이 필수적이다. 비타민 D 결핍은 구루병 또는 골다공증과 같은 심각한 질병을 초래한다. 비타민 D 는 지난 세기 초반에는 단일 물질로서 여전히 고려되었으나, 비타민 D 시스템은 지난 10 년 동안 비타민 D 대사산물의 복잡하고 다양한 네트워크로 변화하였다. 요즘, 40 개 초과의 상이한 비타민 D 대사 생성물이 공지되어 있다 (Zerwekh, J.E., Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281).
인간은 오직 햇빛의 자외선이 피부에 작용해야지만 D3 비타민 또는 칼시페롤을 생성시킬 수 있다. 혈액에서, 비타민 D3 은 소위 비타민 D-결합 단백질에 결합하고, 25-히드록실화에 의해 25-히드록시비타민 D3 으로 전환되는 곳인 간으로 이동한다. 요즘, 이미 언급된 2 개의 기관인 피부 및 간 외에도 다수의 다른 조직이 비타민 D 대사에 연계된 것으로 공지되어 있다 (Schmidt-Gayk, H. et al. (eds.), "Calcium regulating hormones, vitamin D metabolites and cyclic AMP", Springer Verlag, Heidelberg (1990) pp. 24-47). 25-히드록시비타민 D, 보다 구체적으로는 25-히드록시비타민 D2 및 25-히드록시비타민 D3 은 이들의 양에 관해서 인간 유기체에서 비타민 D 의 중심 저장 형태이다. 필요한 경우, 이들 전구체가 신장에서 전환되어 생물학적으로 활성인 1α,25-디히드록시비타민 D (소위 D 호르몬) 을 형성할 수 있다. 생물학적으로 활성인 비타민 D 는 기타 칼슘 흡수 중에서 장으로부터의 칼슘 흡수를 조절하고, 골 무기화를 조절하고, 예를 들어 인슐린 시스템과 같은 다수의 다른 대사 경로에 영향을 미친다.
비타민 D 수준 그 자체를 측정하는 것은, 대상 또는 환자의 비타민 D 상태를 측정할 때 식품 흡수 또는 햇빛에 대한 노출에 따라 비타민 D (비타민 D2 및 비타민 D3) 의 농도가 수시로 변하기 때문에 이점이 거의 없다. 또한 비타민 D 는 순환기 (24 시간) 에서 상대적으로 짧은 생물학적 반감기를 가지며, 따라서 이러한 이유로 환자의 비타민 D 상태를 측정하기 위한 적합한 매개변수가 아니다. 이는 또한 비타민 D 의 생리학적 활성 형태 (1,25-디히드록시비타민 D) 에도 동일하게 적용된다. 이들 생물학적 활성 형태는 또한 상대적으로 적게 발생하고 25-히드록시비타민 D 와 비교하여 농도가 매우 수시로 변한다. 이러한 모든 이유로, 특히 25-히드록시비타민 D 의 정량화는 대상 또는 환자의 총 비타민 D 상태를 전반적으로 분석하는데 적합한 수단이다.
25-히드록시비타민 D 와 같은 비타민 D 대사산물은 비타민 D-결합 단백질에 의해 매우 높은 친화도로, 그리고 제한된 정도로 또한 알부민 및 일부 리포단백질에 결합한다. 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 대사산물을 방출시키기 위한 적절한 방법은 또한 정상 환경 하에서 임의의 기타 단백질로부터 비타민 D 대사산물을 방출시키는 것보다 더 적절할 것이다.
비타민 D-결합 단백질에 대한 25-히드록시비타민 D 또는 기타 비타민 D 화합물의 결합은 비타민 D 화합물의 측정을 심하게 복잡하게 한다. 모든 공지된 방법에는, 분석할 비타민 D 화합물이 비타민 D-결합 단백질과 형성하는 착물로부터 방출되거나 탈착되는 것이 요구된다. 하기에서, 이는 단순화의 이유로 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키는 것으로 지칭되나, 물론 이는 비타민 D-결합 단백질 단독으로부터가 아닌 비타민 D 화합물 및 비타민 D-결합 단백질의 착물로부터만 방출될 수 있다.
비타민 D-결합 단백질은 산성 pH 에서 펴지지만, 올바르게 다시 접히는 경향이 강하고 pH 가 다시 중성 조건이 될 때 분석물과 재결합한다. 따라서, 첫째로 비타민 D 화합물을 비타민 D-결합 닺백질로부터 방출시키고 이어서 분석할 비타민 D 화합물로부터 비타민 D-결합 단백질을 분리하는 것이 필요하다.
25-히드록시비타민 D 의 높은 임상적 중요성으로 인해 수많은 방법이 문헌을 통해 공지되어 있으며, 이들은 25-히드록시비타민 D 가 대략적인 신뢰도로 측정되게 한다.
Haddad, J.G. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995, 및 Eisman, J.A. et al., Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305 는 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 를 사용하는 혈액 샘플 중의 25-히드록시비타민 D 농도 측정을 기재하고 있다.
25-히드록시비타민 D 를 측정하기 위한 기타 접근법은 그 중에서도 우유에 존재하는 비타민 D-결합 단백질류의 사용을 기반으로 한다. 따라서 Holick, M.F. and Ray, R. (US 5,981,779) 및 DeLuca et al. (EP 0 583 945) 는 이들 물질의 농도가 경쟁적 테스트 절차에 의해 측정되는, 이들 물질의 비타민 D-결합 단백질에 대한 결합을 기반으로 하는 히드록시비타민 D 및 디히드록시비타민 D 에 대한 비타민 D 어세이를 기재하고 있다. 그러나, 이러한 방법의 필수전제조건은 우선 측정되는 비타민 D 대사산물이 본래의 혈액 또는 혈청 샘플로부터 단리되어야만 하고 예를 들어 크로마토그래피에 의해 정제되어야만 한다는 것이다.
Armbruster, F.P. et al. (WO 99/67211) 은 혈청 또는 혈장 샘플이 에탄올 침전에 의해 비타민 D 측정용으로 준비되어야 한다는 것을 교시하고 있다. 이러한 방법에서, 단백질 침전물은 원심분리에 의해 제거되며 에탄올 상청액은 가용성 비타민 D 대사산물을 함유한다. 이들은 경쟁적 결합 어세이에서 측정될 수 있다.
대안적으로는 EP 0 753 743 은, 퍼이오데이트 (periodate) 염을 사용하여 혈액 또는 혈청 샘플로부터 분리될 수 있음을 교시하고 있다. 이 경우, 비타민 D 화합물은 퍼이오데이트로 처리된 샘플로부터 단백질-미함유 상청액에서 측정된다. 일부 상업적 테스트에서, 아세토니트릴이 혈청 또는 혈장 샘플의 추출을 위해 권장된다 (예를 들어, 방사면역측정법 (DiaSorin) 또는 "Immundiagnostik" Company 로부터의 비타민 D 테스트에서).
최근, 다수의 상이한 방출 시약이 제안되었는데, 이는 원칙적으로 샘플에 존재하는 임의의 결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키는데 적합해야 한다. 그러나, 이러한 방출 또는 탈착은 상대적으로 온화한 조건 하에서 수행되어, 그에 따라 결합 테스트에서 방출 시약으로 처리된 샘플의 직접적인 사용을 가능하게 해야 한다 (예를 들어 WO 02/57797 및 US 2004/0132104 참조). 최근의 이러한 수많은 노력에도 불구하고, 모든 이용가능한 비타민 D 측정 방법은, 어려운 샘플 준비, 불량한 표준화, 테스트 절차 사이의 불량한 조화 또는 스파이킹된 비타민 D 의 불량한 회수와 같은 단점을 갖는다 (특히 이에 대해 상기 Zerwekh, J.E. 참조).
US 7,087,395 에서는, 금속 히드록시드 뿐만 아니라 시클로덱스트린 및 이의 유도체, 및 금속 살리실레이트가 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위해 사용되었고, 이것이 비타민 D-결합 단백질 또는 다른 혈청 단백질의 비가역성 변성을 야기한다. Triton X100 또는 Tween-20 과 같은 계면활성제가, 비타민 D 화합물이 변성 후 샘플에서 지질 및 단백질에 비특이적으로 부착되는 것을 방지하기 위해 사용되었다.
비타민 D 화합물에 대한 테스트를 자동화하는 것은 특히 어렵다. 자동화를 위해서는 매우 어려운 문제가 해결되어야 하는데, 즉 줄타기에서 살아남아야 한다는 점이다: 한편으로는 적합한 방출 시약을 보조로 사용하여 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키는 것이 필요하며, 다른 한편으로는 샘플이 추가로 직접 분석될 수 있도록 하는 조건이 선택되어야 한다. 이러한 직접적인 추가 분석의 필수전제조건은, 한편으로는 내인성 비타민 D-결합 단백질이 이러한 분석 동안 비타민 D 화합물에 결합하지 않거나 더 이상 유의한 정도로 결합하지 않고, 따라서 이러한 분석을 간섭하지 않으며, 다른 한편으로는 사용한 방출 시약이 항체와 같은 검출 시약 또는 비타민 D-결합 단백질의 결합을 간섭하지 않는다는 것이다. 또한, 생화학적으로 상이하게 거동하는 비타민 D-결합 단백질의 상이한 대립형질이 인간 개체군에 존재하는 것으로 공지되어 있다. 비타민 D 화합물의 방출 및 측정은 다양한 대립형질/표현형에 대해 비교가능해야만 한다.
최근에 (WO2011/144661) 적절한 샘플 처리를 사용하는 비타민 D 어세이는 온라인으로 그리고 샘플에 존재할 수 있는 임의의 비타민 D-결합 단백질의 침전/분리 없이 수행될 수 있다. 이러한 방법은 수소 카르보네이트 염 및/또는 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질을 0.1 M 내지 2.0 M 의 총 농도로, 그리고 환원제, 및 알칼리화제를 함유하는 비타민 D 방출 시약의 사용에 기반한다. 이러한 방출 시약을 사용함으로써 임의의 비타민 D 화합물은 비타민 D-결합 단백질로부터 방출되며, 한편 동시에 샘플에 포함된 비타민 D-결합 단백질은 불활성화되고 더이상 비타민 D 에 결합하지 않는다. 방출된 비타민 D 화합물은 적당한 수단에 의해 측정될 수 있다.
생물학적 샘플에서는 서로 구조적으로 가깝게 관련된 많은 비타민 D 관련 화합물이 존재한다. 24,25-디히드록시비타민 D3 은 거의 모든 생물학적 샘플에서 꽤 상당한 양으로 존재하고, 25-히드록시비타민 D 의 측정을 간섭하지 않는다. 그것의 농도는 샘플 중 25-히드록시비타민 D 의 총 양 뿐만 아니라 상이한 의약 배경을 갖는 환자 코호트 사이의 변이를 초래하는 개체의 임상적 배경에 따라 좌우된다. 샘플을 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하고 25-히드록시비타민 D 에 결합하지 않는 결합제와 함께 인큐베이션함으로써 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의해 야기되는 간섭을 회피하는 것이 가능하다는 것이 보여질 수 있었다.
본 발명의 요약
하나의 구현예에서 본 발명은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 대상으로부터 얻어진 샘플을 제공하는 단계,
b) 샘플을
(ba) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 1 결합제와 24,25-디히드록시비타민 D3 사이의 복합체를 형성하며;
(bb) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 2 결합제와 25-히드록시비타민 D 사이의 복합체를 형성하는 단계;
c) (bb) 에서 형성된 복합체를 측정하여, 그에 의해 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하는 단계.
추가의 구현예에서 본 발명은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 본 발명에 따른 방법(들)의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나의 구현예에서 대상으로부터 얻어진 샘플 중 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 본 발명에 따른 시험관내 방법(들)에 있어서의, 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제 및 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제의 용도에 관한 것이다.
추가의 구현예에 따르면 본 발명은 적어도 하기를 포함하는, 본 발명에 따른 방법(들)을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다:
a) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제, 여기에서 제 1 결합제는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분이고,
b) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제, 여기에서 제 2 결합제는 비타민 D-결합 단백질임.
상세한 설명
본 발명은 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 결합제의 존재 하에 25-히드록시비타민 D 의 총 양 및/또는 농도를 확인하기 위한 방법 뿐만 아니라 키트, 조성물 및 그와 관련된 용도에 관한 것이다.
하나의 구현예에서 본 발명은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 대상으로부터 얻어진 샘플을 제공하는 단계,
b) 샘플을
(ba) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 1 결합제와 24,25-디히드록시비타민 D3 사이의 복합체를 형성하며;
(bb) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 2 결합제와 25-히드록시비타민 D 사이의 복합체를 형성하는 단계;
c) (bb) 에서 형성된 복합체를 측정하여, 그에 의해 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하는 단계.
단수형 표현은 관사의 하나 또는 하나 초과 (즉, 하나 이상) 의 문법적 대상을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다.
표현 "하나 이상" 은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20, 또한 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 또는 15 를 나타낸다.
용어 "탐지" 는 샘플 중 분석물의 정성적 또는 정량적 탐지로 분석물의 양 및/또는 농도를 확인하는 것, 본원에서 분석물 예컨대 25-히드록시비타민 D 의 측정을 언급한다. "탐지" 는 직접 및 간접 탐지를 포함하여, 임의의 탐지 수단을 포함한다.
용어 "확인" 은 본원에서 샘플 중 분석물의 정성적 또는 정량적 탐지 둘다에 사용되고, 분석물의 양 및/또는 농도의 확인을 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 물리적 파라미터에 기초하는 분석물의 식별 및/또는 임의의 특성분석을 포괄한다.
다르게 언급되지 않으면 용어 "25-히드록시비타민 D" 또는 "비타민 D 화합물" 은 하기 구조식 I 및 II 에 따른 비타민 D2 의 골격 또는 비타민 D3 의 골격을 함유하는 모든 자연 발생적 화합물을 포함하는 것으로 이해된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
상기 구조식 I 및 II 에서 비타민 D 의 위치는 스테로이드 명명법에 따라 언급된다. 25-히드록시비타민 D 는 구조식 I 및 II 의 위치 25 에서 히드록실화되는 비타민 D 대사산물, 즉 25-히드록시비타민 D2 뿐만 아니라 25-히드록시비타민 D3 을 나타낸다. 추가로 공지된 히드록시비타민 D 화합물은 예를 들어, 1,25-디히드록시비타민 D 및 24,25-디히드록시비타민 D 형태이다.
1,25-디히드록시비타민 D 는 구조식 I 및 II 의 위치 1 뿐만 아니라 위치 25 에서 히드록실화된 비타민 D 의 활성 형태 (소위 D 호르몬) 를 지칭한다.
기타 널리 공지된 비타민 D 화합물은 24,25-디히드록시비타민 D2, 24,25-디히드록시비타민 D3 및 C3-에피 25-히드록시비타민 D 이다.
본 발명에 따른 하나의 구현예에서 25-히드록시비타민 D 는 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3, 24,25-디히드록시비타민 D2, 24,25-디히드록시비타민 D3 및 3-에피-25-히드록시비타민 D 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 25-히드록시비타민 D 는 25-히드록시비타민 D2 및 25-히드록시비타민 D3 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
24,25-디히드록시비타민 D3 은 거의 모든 생물학적 샘플에서 꽤 상당한 양으로 존재하고, 25-히드록시비타민 D 의 측정을 간섭하지 않는다. 그것의 농도는 샘플 중 25-히드록시비타민 D 의 총 양 뿐만 아니라 상이한 의약 배경을 갖는 환자 코호트 사이의 변이를 초래하는 개체의 임상적 배경에 따라 좌우된다. 샘플을 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하고 25-히드록시비타민 D 에 결합하지 않는 결합제와 함께 인큐베이션함으로써 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의해 야기되는 간섭을 회피하는 것이 가능하다는 것이 보여질 수 있었다.
다르게 언급되지 않으면 용어 "24,25-디히드록시비타민 D" 는 하기 구조식 III 에 따른 비타민 D3 의 골격 및, 각각, 탄소 원자 24 및 25 에 OH 기를 함유하는 모든 자연 발생적 화합물을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 하나의 구현예에서 24,25-디히드록시비타민 D 는 24,25-디히드록시비타민 D3 (24(R),25-(OH)2D3) 이다.
Figure pct00003
분석물(들) (예를 들어 25-히드록시비타민 D, 24,25-디히드록시비타민 D3) 을 포함할 수 있는 샘플은 액체, 겔 또는 액화가능 조성물, 바람직하게는 액체일 수 있다. 그러한 액체는 용액, 현탁액 또는 에멀전일 수 있다. 특히, 샘플은 생물학적 샘플, 특히 인간 또는 동물로부터 얻어지는 신체 샘플, 또는 그의 혼합물이다. 그러한 신체 샘플은 대상으로부터 회수 직후에 사용될 수 있거나, 또는 본 발명의 방법을 의도되는 시점에 수행하기 위해서 적당한 조건 하에, 예를 들어 동결에 의해 저장될 수 있다. 특히, 대상을 비교하거나 또는 요법을 모니터링하기 위해서 다양한 대상 및/또는 상이한 시점으로부터의 샘플이 측정될 수 있다. 신체 샘플의 회수는 당업자에 의해 샘플에 따라 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 샘플은 혈액, 혈청 또는 혈장이다. 추가의 구현예에서, 샘플은 혈액 또는 혈액 혈청이다. 그러한 경우에, 혈액은 대상으로부터 취해진다. 혈청은 혈액으로부터 당업계에 알려진 방법에 의해 얻어질 수 있다. 유사하게, 기타 신체 샘플은 예를 들어 소변 수집에 의해, 또는 생체조직검사에 의해, 및 필요한 경우에 샘플의 추가 처리에 의해 얻어질 수 있다.
위에 기재된 바와 같이, 샘플은 분석물(들) 25-히드록시비타민 D 및 24,25-디히드록시비타민 D3 를 각각 포함한다.
"결합 쌍 일원" 은 결합 쌍 ("bp") 의 일원을 언급하며, 결합 쌍은 하나의 분자가 두번째 분자와 화학적 또는 물리적 수단을 통해 결합하는 2 개의 상이한 분자를 의미한다. 항원 및 항체 결합 쌍 일원에 더하여, 기타 결합 쌍은, 제한 없는 예로서, 비오틴 및 아비딘, 탄수화물 및 레시틴, 상보적 뉴클레오티드 서열, 상보적 펩티드 서열, 효과기 및 수용체 분자, 효소 보조인자 및 효소, 효소 저해인자 및 효소, 펩티드 서열 또는 화학적 모이어티 (예컨대 디곡신/항-디곡신) 및 서열, 화학적 모이어티 또는 전체 단백질에 특이적인 항체, 중합체성 산 및 염기, 염료 및 상응하는 단백질 결합제, 펩티드 및 특이적 단백질 결합제 (예를 들어, 리보뉴클레아제, S-펩티드 및 리보뉴클레아제 S-단백질), 금속 및 그의 킬레이터, 앱타머 등을 포함한다. 게다가, 결합 쌍은 원래의 결합 일원의 유사체인 일원, 예를 들어 분석물-유사체 또는 예를 들어 원래의 결합 쌍 일원에 유사하고 동일한 결합 특성을 갖는 재조합 기술 또는 분자 공학에 의해 만들어진 결합 일원을 포함할 수 있다.
결합 쌍 일원은 결합 쌍 일원에 유사한 경우는 그들이 둘다 결합 쌍의 상보적 일원에 동일한 방식으로 결합할 수 있는 경우이다. 그러한 결합 쌍 일원은, 예를 들어, 리간드 또는 수용체일 수 있으며, 이는 적어도 하나의 수소 원자를 기로 대체하여 수식되어, 예를 들어, 라벨링된 리간드 또는 라벨링된 수용체를 제공할 수 있다. 결합 쌍 일원은 분석물에 또는 분석물에 상보적인 결합 쌍 일원에 유사할 수 있다.
"결합제" 는 결합 쌍의 다른 일원, 상응하는 표적 분자, 예를 들어 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 결합 쌍 ("bp") 의 일원이다. 결합제는 그것의 상응하는 표적 분자에 관해 10-7　mol/L 의 친화도 (Kd) 를 갖는다. 결합제는 바람직하게는 10-8 mol/L 의 친화도를 갖는다. 추가로 바람직하게는 결합제는 그것의 표적 분자에 관해 10-9 mol/L 의 친화도를 갖는다. 더더욱 바람직하게는 결합제는 그것의 표적 분자에 관해 10-10 mol/L 의 친화도를 갖는다.
당업자는 이해할 바와 같이 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 "제 1 결합제" 라는 용어는 샘플에 존재하는 기타 생체분자가 24,25-디히드록시비타민 D3 에 특이적인 결합제에 유의하게 결합하지 않는다는 것을 나타내는데 사용된다. 바람직하게는, 표적 분자 이외의 생체분자에 대한 특이적 결합제의 결합의 수준은, 각각, 표적 분자에 대한 친화도의 오직 10% 이하, 바람직하게는 오직 5% 이하인 결합 친화도를 초래한다. 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 바람직한 제 1 결합제는 친화도에 관한 뿐만 아니라 특이성에 관한 상기 최소 기준을 둘다 충족시킬 것이다.
본 발명에 따른 "제 1 결합제" 는 하나의 구현예에서 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 합성 항체 (플라스틱 항체), 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 합성 항체, 추가로 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분, 각각, 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 제 1 결합제는 하나의 구현예에서 24,25-디히드록시비타민 D 에 결합하고, 추가로 바람직하게는 제 1 결합제는 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합한다. 바람직하게는 항체는 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 모노클로날 항체이다. 추가로 바람직하게는 항체는 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 플라스틱 항체이다.
본 발명에 따른 "플라스틱 항체" 는 항체 같은 기능을 하는 합성 중합체 나노입자이다 (Hoshino, Y. et al., J. Mater. Chem., 2011,21, 3517-3521). 본 발명에 따른 플라스틱 항체는 특정 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하여 이를 중화시키는 능력이 있다.
본 발명에 따른 "제 2 결합제" 는 하나의 구현예에서 비타민 D-결합 단백질 (VitD-BP) 또는 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 항체 또는 항체의 기능적 활성 부분이다. 추가로 바람직하게는 제 2 결합제는 비타민 D-결합 단백질, 바람직하게는 재조합 비타민 D-결합 단백질이다. 추가의 구현예에서 제 2 결합제는 비타민 D-결합 단백질의 기능적 활성 부분, 바람직하게는 비타민 D-결합 단백질의 도메인 I 이다.
본 발명의 실시예에서, 항체 mAb<24,25-디히드록시비타민 D3 >rK-IgG 가 제 1 결합제로서 성공적으로 사용된다. 바람직한 구현예에서 제 1 결합제는 mAb<24,25-디히드록시비타민 D3>rK-IgG 이다.
자연적으로 발생하는 항체는 기본 구조를 공유하는 면역글로불린으로서도 알려져 있는 구상형의 혈장 단백질 (~150 kDa (http://en.wikipedia.org/wiki/Dalton_unit)) 이다. 이들은 아미노산 잔기에 첨가된 당 사슬을 가지므로, 이들은 당단백질이다. 각각의 항체의 기본적인 기능적 단위는 면역글로불린 (Ig) 단량체 (하나의 Ig 단위만을 함유) 이며; 분비된 항체는 또한 IgA 와 같이 2 개의 Ig 단위를 갖는 이합체, 경골 어류 IgM 과 같이 4 개의 Ig 단위를 갖는 사량체, 또는 포유류 IgM 과 같이 5 개의 Ig 단위를 갖는 오량체일 수 있다. 본 발명에서, 적합한 포맷의 예는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 으로 공지된 항체 이소형을 포함하는 자연적으로 발생하는 항체의 포맷을 포함한다.
Ig 단량체는 4 개의 폴리펩티드 사슬: 시스테인 잔기들 사이에 다이설파이드 결합으로 연결된 2 개의 동일한 중쇄 및 2 개의 동일한 경쇄로 이루어진 "Y"-모양 분자이다. 각각의 중쇄는 약 440개 아미노산 길이이고; 각각의 경쇄는 약 220개 아미노산 길이이다. 중쇄 및 경쇄 각각은 이들의 폴딩 (folding) 을 안정화시키는 사슬간 다이설파이드 결합을 함유한다. 각각의 사슬은 Ig 도메인으로 불리우는 구조적 도메인으로 구성된다. 이들 도메인은 약 70 내지 110개 아미노산을 함유하며 이들의 크기 및 기능에 따라 상이한 카테고리 (예를 들면, 가변 또는 V, 및 불변 또는 C) 로 분류된다. 이들은, 2 개의 베타 시트 (sheet) 가 "샌드위치" 형태를 생성하고, 보존된 시스테인과 다른 하전된 아미노산 사이의 상호작용에 의해 함께 유지된 특징적인 면역글로불린 폴드 (fold) 를 가진다.
α, δ, ε, γ, 및 μ 로 표시되는 5 가지 유형의 포유류 Ig 중쇄가 존재한다. 존재하는 중쇄의 유형은 항체의 이소형을 정의하며; 이들 사슬은 각각 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 항체에서 발견된다.
별도의 중쇄는 크기 및 조성에 있어서 상이하며; α 및 γ 는 대략 450 개의 아미노산을 함유하고 δ 는 대략 500 개의 아미노산을 함유하고, 한편, μ 및 ε 는 대략 550 개의 아미노산을 갖는다. 각각의 중쇄는 2 개의 영역, 불변 영역 (CH) 및 가변 영역 (VH) 을 갖는다. 하나의 종에서, 불변 영역은 동일한 이소형의 모든 항체에서 동일하지만, 상이한 이소형의 항체에서 상이하다. 중쇄 γ, α 및 δ 는 3 개의 탠덤 (tandem) Ig 도메인으로 구성된 불변 영역, 및 가해진 유연성에 대한 힌지 영역을 가지며; 중쇄 μ 및 ε 는 4 개의 면역글로불린 도메인으로 구성된 불변 영역을 갖는다. 중쇄의 가변 영역은 상이한 B 세포에 의해 생산된 항체내에서 상이하지만, 단일 B 세포 또는 B 세포 클론에 의해 생산된 모든 항체의 경우 동일하다. 각각의 중쇄의 가변 영역은, 대략 110 개 아미노산 길이이며 단일 Ig 도메인으로 구성된다.
포유류에서, λ 및 κ 로 표시되는 2 개의 유형의 면역글로불린 경쇄가 존재한다. 경쇄는 2 개의 연속적인 도메인: 1 개의 불변 도메인 (CL) 및 1 개의 가변 도메인 (VL) 을 갖는다. 경쇄의 대략적인 길이는 211 내지 217개 아미노산이다. 각각의 항체는 항상 동일한 2 개의 경쇄를 함유하며; 경쇄 중 단지 하나의 유형, κ 또는 λ 가 포유류에서 항체당 존재한다. 경쇄의 다른 유형, 예를 들어, ι 사슬은 연골어류 및 경골어류와 같은 하등 척추동물에서 발견된다.
자연적으로 발생하는 항체 이외에, 항체 단편을 포함하는 인공 항체 포맷이 개발되어 왔다. 이들 중 일부는 이하에 기술되어 있다.
비록 모든 항체의 일반적인 구조가 매우 유사하다고 해도, 제공된 항체의 고유의 특성은 상기에서 상세히 설명한 바와 같은 가변 (V) 영역에 의해 측정된다. 보다 구체적으로, 가변 루프 (loop), 즉 경 (VL) 쇄 각각에서 3개 및 중 (VH) 사슬에서 3개는 항원에 대한 결합, 즉, 이의 항원 특이성에 관여한다. 이들 루프는 상보성 결정 영역 (CDR) 으로 언급된다. VH 및 VL 도메인 둘 다로부터의 CDR은 항원-결합 부위에 기여하므로, 이는 최종 항원 특이성을 결정하는 단독이 아닌, 중쇄와 경쇄의 조합이다.
따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체" 는 자연적으로 발생하는 항체에 대해 구조적 유사성을 갖고 당해 표적에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드를 의미하고, 여기서 결합 특이성은 CDR 에 의해 결정된다. 따라서, "항체" 는 전장 또는 전체 항체, 항원 결합 단편 (물리적으로 또는 개념상으로, 항체 구조로부터 유도된 단편), 상기 중 어느 하나의 유도체, 키메라 분자, 상기 중 어느 하나와 다른 폴리펩티드의 융합체, 또는 당해 표적에 선택적으로 결합하는 임의의 다른 구조/조성물을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 당해 표적에 대해 결합하는 면역글로불린-유도된 구조에 관한 것이다. 항체 또는 이의 기능적 활성 부분은 적어도 하나의 항원 결합 단편을 포함하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 항원 결합 단편은, 도메인 둘 다가 함께 특이적인 항원에 결합할 수 있는 방식으로 정렬된, 적어도 중쇄의 가변 도메인 및 경쇄의 가변 도메인으로 이루어진다. "당해 표적" 은 포획 분자, 결합 분자 및 탐지 분자의 경우의 분석물이고, 바람직한 트래핑 (trappping) 분자로서 항-개별특이형 항체의 경우에 결합 분자이다.
"전장" 또는 "완전한" 항체는 다이설파이드 결합에 의해 상호연결된 2 개의 중 (H) 및 2 개의 경 (L) 사슬을 포함하는 단백질을 말하며, 이는 (1) 중쇄의 관점에서, 가변 영역 및 3 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 중쇄 불변 영역; 및 (2) 경쇄의 관점에서, 경쇄 가변 영역 및 하나의 도메인 CL을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 용어 "완전한 항체" 와 관련하여, 임의의 항체가 각각의 도메인이, 전체 도메인 구조를 변화시키지 않는 돌연변이, 결실 또는 삽입과 같은 추가의 수식을 포함할 수 있다고 해도, 임의의 항체는 자연적으로 발생하는 항체 (즉, 3개 또는 4 개의 불변 도메인의 중쇄 및 하나의 불변 도메인의 경쇄 및 또한 각각의 가변 도메인을 포함) 의 대표적인 전체 도메인 구조를 가짐을 의미한다.
"항체의 기능적 활성 부분 (functionally active parts of antibodies)" 또는 "항체 단편" 은 또한 상기에서 정의한 바와 같은 적어도 하나의 항원 결합 단편을 함유하며, 기능적 활성 부분 (또는 단편) 이 유도되는 완전한 항체와 본질적으로 동일한 기능 및 결합 특이성을 나타낸다. 파파인을 사용한 제한된 단백질분해적 분해는 Ig 원형 (prototype) 을 3 개의 단편으로 절단한다. 각각 1 개의 전체 L 사슬 및 약 1/2 개의 H 사슬을 함유하는, 2 개의 동일한 아미노 말단 단편은 항원 결합 단편 (Fab) 이다. 크기가 유사하지만 이들의 사슬간 다이설파이드 결합을 가진 중쇄 둘 다의 카복실 말단의 1/2을 함유하는 제 3 단편은 결정화가능한 단편 (Fc) 이다. Fc는 탄수화물, 상보체-결합 및 FcR-결합 부위를 함유한다. 제한된 펩신 분해는 Fab 조각 및 H-H 사슬간 다이설파이드 결합을 포함하는 힌지 영역 둘 다를 함유하는 단일의 F(ab')2 단편을 수득한다. F(ab')2 는 항원 결합에 대해 2가이다. F(ab')2 의 다이설파이드 결합은 Fab'를 수득하기 위해 절단될 수 있다. 또한, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 함께 융합되어 단일쇄 가변 단편 (scFv) 을 형성할 수 있다.
완전한 크기의 항체의 제 1 세대는 일부 문제점을 나타내었으므로, 많은 제2 세대 항체들은 항체의 단편만을 포함한다. 가변 도메인 (Fv) 은 하나의 VL 및 하나의 VH 로 이루어진 온전한 항원-결합 도메인을 지닌 가장 작은 단편이다. 결합 도메인만을 지닌 이러한 단편은 예를 들면, 세균 및 진핵 세포내에서 관련 유전자 단편의 효소적 접근 또는 발현에 의해 생성시킬 수 있다. 상이한 접근, 예를 들면, Fv 및 제 1 의 불변 도메인을 포함하는 "Y" 의 상부 암 중 하나를 포함하는 'Fab'-단편 또는 Fv 단편 단독을 사용할 수 있다. 이들 단편은 일반적으로 단일쇄 Fv (scFv) 의 생산을 초래하는 2 개의 사슬 사이에 폴리펩티드 연결을 도입시킴으로써 안정화된다. 대안으로, 다이설파이드-연결된 Fv (dsFv) 단편을 사용할 수 있다. 단편의 결합 도메인은 임의의 불변 도메인과 합하여 전장의 항체를 생산하거나 다른 단백질 및 폴리펩티드와 융합시킬 수 있다.
재조합 항체 단편은 단일쇄 Fv (scFv) 단편이며, 이는 본 발명에 따른 항체의 바람직한 기능적 활성 부분이다. 일반적으로, 이는 이의 항원에 대해 고 친화성을 가지며 다양한 숙주내에서 발현될 수 있다. 이들 및 다른 특성은 scFv 단편을 의약에서 적용가능하게 할 뿐만 아니라 생명공학적 적용을 위한 가능성이 있도록 한다. 상기에서 상세히 설명한 바와 같이, scFv 단편에서 VH 및 VL 도메인은 친수성 및 유연성 펩티드 링커와 결합되며, 이는 발현 및 폴딩 효능을 개선시킨다. 일반적으로 약 15 개 아미노산의 링커가 사용되며, 이들 중 (Gly4Ser)3 링커가 가장 흔히 사용되어 왔다. scFv 분자는 사용된 링커에 따라 단백질분해적으로 용이하게 분해될 수 있다. 유전 공학 기술의 발달과 더불어, 이들 제한은 기능 및 안정성의 개선에 촛점맞춘 연구에 의해 실질적으로 극복될 수 있다. 예는 다이설파이드-안정화된 (또는 다이설파이드-연결된) Fv 단편의 발생이며, 여기서 VH-VL 이합체는 사슬간 다이설파이드 결합에 의해 안정화된다. 시스테인은 VL 도메인과 VH 도메인 사이의 계면에 도입되어, 2 개의 도메인을 함께 유지시키는 다이설파이드 브릿지를 형성한다.
scFv 의 해리는 단량체 scFv 를 생성하며, 이는 이합체 (디아바디), 삼량체 (트리아바디) 또는 보다 큰 응집체 예컨대 TandAb 및 플렉시바디 (Flexibody) 로 복합체화될 수 있으며, 이들은 또한 발명에 따른 항체의 기능적 활성 부분을 나타낸다.
2 개의 결합 도메인을 가진 항체는 2 개의 scFv와 단순한 폴리펩티드 연결 (scFv)2 을 통해 또는 2 개의 단량체의 이합체화 (디아바디) 를 통해 생성될 수 있다. 가장 간단한 설계는 별도의 항원 (이중특이적인 디아바디) 에 대해 동일하거나, 유사할 수 있거나 (2가의 디아바디) 별도의 항원에 대해 특이성을 갖는 (이중특이적 디아바디) 2 개의 기능적 항원-결합 도메인을 갖는 디아바디이다. 이들 이중특이적 항체는 예를 들면, 표적 세포에 대한 신규 효과기 기능 (예: 세포독성 T 세포) 의 동원을 허용하며, 이러한 기능은 이들 항체가 의약에서의 적용에 매우 유용하도록 한다.
또한, 중쇄의 4 개의 가변 도메인 및 경쇄의 4 개의 가변 도메인을 포함하는 항체 포맷이 개발되었다. 이들의 예는 4가 이중특이적 항체 (TandAb 및 플렉시바디, 제조원: Affimed Therapeutics AG, 독일 하이델베르크 소재) 를 포함한다. 이중특이적 디아바디와는 대조적으로, 이중특이적 TandAb 는 단지 하나의 폴리펩티드로 이루어진 단독이합체다. 2 가지 상이한 사슬 때문에, 다이아바디는 3 가지 상이한 이합체를 구축할 수 있으며 이 중 오직 하나만이 기능적이다. 그러므로, 이러한 균일한 생성물을 생산하고 정제하는 것이 더 단순하고 더. 더욱이, TandAb 는 통상적으로 생체내에서 더 나은 결합 특이성 (2 배의 수의 결합 자리를 보유함) 및 증가된 안정성을 보인다. 플렉시바디는 세포 표면에서 서로 상당히 명확하게 구별되는 2 개의 분자를 결합시키기 위한 고도의 유연성을 갖는 다가 분자를 생성하는 디아바디 다량체 모티프를 지닌 scFv 의 조합물이다. 2개 이상의 기능적 항원-결합 도메인이 존재하고 이들이 별도의 항원에 대해 특이성을 갖는 경우, 항체는 다중특이적이다.
Fv, scFv, 디아바디 분자 또는 도메인 항체 (Domantis) 를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 특정의 항체 분자 또는 이의 기능적 활성 부분은 VH 및 VL 도메인에 다이설파이드 브릿지를 도입시킴으로써 안정화시킬 수 있다. 이중특이적 항체는 종래 기술, 화학적 생산, 또는 하이브리드 (하이브리도마) 로부터의 생산을 포함하는 특정 방법, 및 BiTE™기술 (펩티드 링커와 상이한 특이성의 항원 결합 영역을 지닌 분자) 및 놉스-인투-홀스 조작 (knobs-into-holes engineering) 을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 다른 기술을 사용하여 생산할 수 있다.
따라서, 항체 분자 또는 이의 기능적 활성 부분은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 다이설파이드-연결된 Fv, scFv, (scFv)2, 2가 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 미니바디일 수 있다.
또다른 바람직한 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체이다. 모노클로날 항체는, 이들이 단일의 모 세포의 모든 클론인 면역 세포의 한가지 유형에 의해 생산되므로 동일한 단일특이적인 항체이다. 키메라 항체는, 1개 종의 면역글로불린의 적어도 하나의 영역이 다른 종의 면역글로불린의 다른 영역에 유전자 조작에 의해 융합되어 이의 면역원성을 감소시킨 항체이다. 예를 들어, 뮤린 VL 및 VH 영역을 인간 면역글로불린의 나머지 부분에 융합시킬 수 있다. 키메라 항체의 특정 유형은 인간화된 항체이다. 인간화된 항체는, 비-인간 항체의 CDR 을 암호화하는 DNA 를 인간 항체-생산 DNA 와 병합시켜 생산할 수 있다. 단순히 CDR 은 비-인간이므로, 수득되는 DNA 작제물은 이후에 일반적으로 비-인간 모 항체 또는 키메라 항체와 같은 면역원성이 아닌 항체를 발현시키고 생산하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 항체 분자 또는 그의 기능적 활성 부분은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다: 인간 IgM 불변 도메인, 인간 IgGl 불변 도메인, 인간 IgG2 불변 도메인, 인간 IgG3 불변 도메인, 인간 IgG4 불변 도메인, 인간 IgE 불변 도메인, 및 인간 IgA 불변 도메인.
위에서 본 발명의 항체의 문맥에서 상술한 바와 같이, 자연 발생적 항체의 각각의 중쇄는 2 개의 영역, 불변 영역 및 가변 영역을 갖는다. 5 가지 유형의 포유류 면역글로불린 중쇄가 존재한다: γ, δ, α, μ 및 ε, 이는 각각 면역글로불린 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE 의 클래스를 정의한다.
인간에서 4 가지 IgG 서브클래스 (IgG1, 2, 3 및 4) 가 존재하며, 이들은 혈청에서의 그들의 풍부도의 순서대로 명명된다 (IgG1 이 가장 풍부하다). IgG 서브클래스의 Fc 영역 사이에 약 95 % 유사성이 존재함에도 불구하고, 힌지 영역의 구조는 상대적으로 상이하다. 이러한 영역은, Fab 암 (arm) (분절 항원 결합) 및 양쪽 중쇄의 2 개의 카르복시-말단 도메인 CH2 및 CH3 사이에서, 분자의 유연성을 결정한다. 상부 힌지 (아미노-말단을 향하여) 분절은 Fab 암 사이의 각도의 가변성 (Fab-Fab 유연성) 뿐만 아니라 각각의 개별 Fab 의 회전 유연성을 허용한다. 하부 힌지 영역 (카르복시-말단을 향하여) 의 유연성은 Fc 영역에 상대적인 Fab-암의 위치 (Fab-Fc 유연성) 를 직접 결정한다. 힌지-의존적 Fab-Fab 및 Fab-Fc 유연성은 추가의 효과기 기능 예컨대 보체 활성화 및 Fc 수용체 결합을 유발함에 있어서 중요할 수 있다. 따라서, 힌지 영역의 구조는 각각의 4 가지 IgG 클래스에게 그들의 독특한 생물학적 프로파일을 제공한다.
힌지 영역의 길이 및 유연성은 IgG 서브클래스 사이에서 다양하다. IgG1 의 힌지 영역은 아미노산 216-231 을 아우르고 그것이 자유롭게 유연하기 때문에, Fab 분절은 그의 대칭축 주위를 회전할 수 있고, 2 개의 중쇄 사이 다이설파이드 가교의 첫번째에 중심이 있는 구체 내에서 움직일 수 있다. IgG2 는 IgG1 보다 더 짧은 힌지를 가지며, 12 개의 아미노산 잔기 및 4 개의 다이설파이드 가교를 갖는다. IgG2 의 힌지 영역은 글라이신 잔기를 결여하며, 그것은 비교적 짧고 추가의 중쇄 사이 다이설파이드 가교에 의해 안정화된, 잘 구부러지지 않는 폴리-프롤린 이중 나선을 함유한다. 이들 특성은 IgG2 분자의 유연성을 제한한다. IgG3 은 기타 서브클래스와 그것의 독특한 확장된 힌지 영역 (IgG1 힌지보다 대략 4 배 더 길다) 에서 상이하며, 62 개의 아미노산 (21 개의 프롤린 및 11 개의 시스테인을 포함한다) 을 함유하며, 유연하지 않은 폴리-프롤린 이중 나선을 형성한다. IgG3 에서 Fab 분절은 Fc 분절로부터 비교적 멀리 떨어져 있으며, 분자에게 더 큰 유연성을 제공한다. IgG3 에서 긴 힌지는 또한 기타 서브클래스에 비해 더 높은 그것의 분자량의 원인이다. IgG4 의 힌지 영역은 IgG1 의 힌지 영역보다 더 짧고, 그것의 유연성은 IgG1 과 IgG2 의 유연성 사이의 중간에 있다.
비타민 D-결합 단백질이 제 2 결합제로서 사용되는 경우에, 이러한 인큐베이션 단계 동안 pH 는 하나의 구현예에서 바람직하게는 pH 6.0 내지 pH 9.0 로부터 선택된다.
25-히드록시비타민 D 에 결합하는 항체가 하나의 구현예에서 제 2 결합제로서 사용되는 경우에, 이러한 인큐베이션 단계 동안 pH 는 pH 5 내지 pH 8 일 것이고, 바람직하게는 이러한 인큐베이션 단계 동안 pH 는 pH 5.5 내지 pH 7.5 일 것이다.
구체적 구현예에 따르면 제 1 결합제는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분이고, 제 2 결합제는 비타민 D-결합 단백질 또는 비타민 D-결합 단백질의 기능적 활성 부분이다.
추가의 구현예에서 제 1 결합제는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분이고, 제 2 결합제는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분이다.
또한 추가의 구현예에서 제 1 결합제는 mAb<24,25-디히드록시비타민 D3> 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분이고, 제 2 결합제는 mAb<25-히드록시비타민 D> 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분이다.
본 발명에 따른 하나의 구현예에서, 결합제는 부동화를 위한 수단을 보유하고 부동화에 사용될 수 있다. 부동화를 위한 수단은 지지체, 바람직하게는 고체 지지체에 대한 결합을, 공유적으로 또는 비-공유적으로 허용할 수 있다.
용어 "고체 지지체" 또는 "고체 상" 은 불균일 반응에 의해 액체 상의 시약과 상호작용하는 고체-상의 재료를 언급한다. 고체 지지체의 사용은 화학, 생화학, 약학 및 분자 생물학 분야에서 잘 알려져 있다. 많은 유형의 고체 지지체가 해결될 기술적 문제에 따라 개발되어 왔다. 이들 중 임의의 것이 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 사용되는 고체 지지체는 실리카, 셀룰로스 아세테이트, 니트로셀룰로스, 나일론, 폴리에스테르, 폴리에테르술폰, 폴리올레핀, 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드, 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 추가의 적합한 고체 지지체는 조절된 공극 유리 (controlled-pore glass), 유리 플레이트 또는 슬라이드, 폴리스티렌, 및 활성화된 덱스트란을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 다른 양상에서, 합성 유기 중합체 예컨대 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 및 폴리스티렌이 또한 예시적 지지체 표면이다. 또한, 다당류 예컨대 셀룰로스 및 덱스트란이 지지체 표면의 추가의 예시적 예이다. 기타 지지체 표면 예컨대 섬유가 또한 사용가능하다.
예를 들어 결합 또는 단백질 화학에서 사용되는 통상의 수지 지지체는 폴리스티렌 수지, 예를 들어 디비닐벤젠로 가교된 것; 히드록시메틸폴리스티렌; 아미노메틸폴리스티렌; TentaGel 수지 (TG) 및 ArgoGel (AG): 폴리스티렌/DVB-폴리(에틸렌 글리콜) 그라프트 공중합체 (PS-PEG) - Bayer; 크라운/핀 (Crowns/Pins) (CP) (방사선-그라프팅된 폴리에틸렌 / 폴리프로필렌 지지체); 규조토/폴리아크릴아미드-기반 수지 (KPA); 조절된-공극 유리; PEGA - 폴리(에틸렌 글리콜)/디메틸아크릴아미드 공중합체를 포함한다.
고체 지지체에 대한 부동화는 결합제, 예를 들어 단백질 또는 항체에 대한 실체 (entity) 또는 지지체의 공유적 커플링을 허용하는 관능기를 포함하도록 수식 또는 활성화된 고체 지지체를 사용하여 달성될 수 있다. 전형적으로는, 지방족 링커 암이 이용된다. 결합제, 특히 단백질 또는 항체는 또한, 예를 들어, 이온성 또는 소수성 메카니즘을 통해, 표면에 비공유적으로 부착될 수 있고, 이들 메카니즘을 국소적으로 저해하는 방출인자에 의해 탈착된다. 부가적으로, 표면, 예를 들어 유리 또는 금속 옥사이드 표면에 대한 결합제, 예를 들어 단백질 또는 항체의 공유적 부착은 첫째로 표면을 아미노 실란으로 활성화하여 달성될 수 있다. 아민-반응성 관능기로 유도체화된 결합제는 그 후 표면에 부착할 수 있다. 지지체, 특히 고체 지지체는 하나 이상의 부착 자리를 통한 공유적 또는 비-공유적 결합에 의해 단백질 예컨대 효소, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드로 유도체화될 수 있으며, 그에 의해 동일한 산을 고체 지지체에 결합시킨다.
(고체) 지지체는 용기에 함유될 수 있으며, 여기에서 용기는 튜브, 예컨대 원심분리 튜브 또는 스핀 튜브, 주사기, 카트리지, 체임버, 다중-웰 플레이트, 또는 테스트 튜브, 또는 그들의 조합이다. 결합제의 링커-매개되는 결합을 허용하기 위해서 (고체) 지지체는 전처리 또는 관능화될 수 있다. 하나의 구현예에서, 고체 지지체는 통상적으로 적당한 접촉을 허용하는 섬유 또는 미립자일 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 (고체) 지지체의 크기는 선택된 방법에 따라 다를 수 있다. 제 1 결합제 또는 제 2 결합제는, 각각, 오직 하나의 (고체) 지지체 (예를 들어 하나의 용기 또는 다중-웰 플레이트) 에 결합될 수 있거나 또는 다수의 (고체) 지지체 (예를 들어 비드) 에 결합될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 (고체) 지지체의 모양은, 예를 들어, 시트, 미리 자른 원반형, 원통형, 단일 섬유, 또는 미립자로 구성된 고체 지지체일 수 있다. 하나의 구현예에서, (고체) 지지체는 최적의 접촉을 허용하는 섬유 또는 미립자일 수 있다. (고체) 지지체의 크기는 다를 수 있고 수행될 방법에 따라 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 고체 지지체는 테스트 스트립, 칩, 특히 마이크로어레이 또는 나노어레이 칩, 미세역가-플레이트 또는 마이크로입자 (비드) 이다.
많은 상업적 테스트 시스템은 아비딘 또는 스트렙타비딘 (SA) 으로 코팅된 고체 지지체, 예를 들어 SA-코팅된 미세역가 플레이트, SA-코팅된 격자, 또는 SA-코팅된 마이크로입자 (비드) 에 기반한다.
비오틴일화된 분석물 유도체는 예를 들어 테스트 절차 전에 또는 동안 이러한 SA 고체 지지체에 결합된다. 비타민 D 화합물을 탐지할 때 이러한 비오틴일화된 분석물 유도체 화합물은 예를 들어 비오틴일화된 25-히드록시비타민 D2 및/또는 비오틴일화된 25-히드록시비타민 D3 일 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서 탐지의 시험관내 방법이 경쟁적 어세이로서 수행된다. 그러한 경쟁적 테스트에서 테스트에 정의된 양으로 첨가된 비타민 D 화합물의 유도체는 특이적 결합제의 결합 자리에 관해 샘플로부터의 상응하는 비타민 D 화합물과 경쟁한다. 샘플에 존재하는 비타민 D 화합물이 더 많을수록, 탐지 신호는 더 작아진다.
하나의 구현예에서 비타민 D 화합물의 유도체는 비오틴일화된 비타민 D 화합물이다. 추가의 구현예에서 비오틴일화된 비타민 D 화합물은 비오틴일화된 25-히드록시비타민 D2 및/또는 비오틴일화된 25-히드록시비타민 D3 이다. 추가의 구현예에서 비오틴일화된 비타민 D 화합물은 비오틴일화된 25-히드록시비타민 D2 이다.
하나의 구현예에서 비타민 D 화합물의 유도체는 루테닐화된 비타민 D 화합물이다. 추가의 구현예에서 루테닐화된 비타민 D 화합물은 루테닐화된 25-히드록시비타민 D2 및/또는 루테닐화된 25-히드록시비타민 D3 이다. 추가의 구현예에서 루테닐화된 비타민 D 화합물은 루테닐화된 25-히드록시비타민 D2 이다.
위에서 언급된 바와 같은 본 명세서에 공개된 탐지 방법에서 사용하기에 바람직한 제 2 결합제는 항체 및 비타민 D-결합 단백질이다. 비타민 D-결합 단백질은, 경쟁적 어세이 포맷으로 사용되는 경우에, 그것의 결합에서 하나 이상의 (비오틴일화된) 비타민 D 화합물 유도체와 경쟁하는 모든 비타민 D 화합물의 통합된 측정을 초래할 것이다. 하나의 구현예에서 비타민 D-결합 단백질은 탐지가능하게 라벨링, 예를 들어 루테닐화될 것이다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 방법은 경쟁적 어세이 포맷으로 수행되며, 여기에서
i) 고체 지지체는 SA-코팅된 마이크로입자 (비드) 이고, 경쟁자는 비오틴일화된 비타민 D 화합물의 유도체이고, 제 2 결합제는 루테닐화된 비타민 D-결합 단백질 접합체이거나, 또는
ii) 고체 지지체는 SA-코팅된 마이크로입자 (비드) 이고, 경쟁자는 루테닐화된 비타민 D 접합체이고, 제 2 결합제는 비오틴일화된 비타민 D-결합 단백질 접합체이다.
바람직한 구현예에 따르면, 제 1 결합제는 제 2 결합제에 대한 24,25-디히드록시비타민 D3 의 결합을 방지한다. 추가의 바람직한 구현예에서제 1 결합제에 결합된 24,25-디히드록시비타민 D3 은 제 2 결합제에 의해 결합될 수 없다. 또한 추가의 구현예에서 제 2 결합제는 제 1 결합제에 결합된 24,25-디히드록시비타민 D3 를 방출할 수 없다.
당업자는 대상으로부터 얻어진 샘플에 존재하는 비타민 D 화합물이 비타민 D-결합 단백질에 결합되는 것을 안다. 그러므로 본 발명에 따른 방법에서 구체적 구현예에서 비타민 D-결합 단백질에 결합된 샘플에 존재하는 비타민 D 화합물은 단계 (b) 에 앞서 방출 시약으로 비타민 D-결합 단백질로부터 방출된다.
하나의 구현예에서 본 발명의 방법에 따라 대상으로부터 얻어진 제공된 샘플은 비타민 D-결합 단백질에 결합된 비타민 D 화합물을 포함한다.
방출 시약이 비타민 D-결합 단백질을 변성시키며, 바람직하게는 방출 시약이 비타민 D-결합 단백질을 불가역적으로 변성시킨다.
구체적 구현예에서 비타민 D 화합물은 단계 (b) 에 앞서 각각 단백질분해 붕괴, 산성 방출, 알칼리성 방출, 메탄올 방출, 에탄올 침전 (WO 99/67211), 페리오데이트 염 방출 (EP 0 753 743), 아세토니트릴 추출, 금속 히드록시드 방출 (US 7,087,395), 시클로덱스트린 및/또는 그의 유도체에 의한 방출 (US 7,087,395) 또는 금속 살리실레이트 방출 (US 7,087,395) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 비타민 D-결합 단백질로부터 방출된다. 당업자는 비타민 D 화합물의 확인/측정에 앞서 비타민 D-결합 단백질에 결합된 비타민 D 화합물을 방출시키기에 적합한 방법을 안다. 최근에 비타민 D 화합물을 샘플에 존재하는 임의의 결합 단백질로부터 방출시키기에 적합한 다수의 상이한 방출 시약이 제안되었다.
추가의 구현예에서 본 발명은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 대상으로부터 얻어진 샘플을 제공하고,
비타민 D-결합 단백질에 결합된 샘플에 존재하는 비타민 D 화합물을 방출 시약으로 방출하는 단계,
b) 샘플을
(ba) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 1 결합제와 24,25-디히드록시비타민 D3 사이의 복합체를 형성하며;
(bb) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 2 결합제와 25-히드록시비타민 D 사이의 복합체를 형성하는 단계;
c) (bb) 에서 형성된 복합체를 측정하여, 그에 의해 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하는 단계.
구체적 구현예에 따르면 비타민 D 화합물은 단계 (b) 에 앞서 알칼리성 방출에 의해 비타민 D-결합 단백질로부터 방출된다. 알칼리성 조건은 비타민 D-결합 단백질의 변성 및 조사될 샘플에 존재하는 비타민 D 화합물의 방출을 초래한다. 알칼리화제의 농도는 반응 단계 (b) 에 앞서 전처리에서 "시약 혼합물" (= 조사될 샘플 + 알칼리화제 + 부가적 시약) 의 pH 를 적어도 pH 10.0, 바람직하게는 적어도 pH 10.5, 더욱 바람직하게는 적어도 11.0 으로 증가시키기에 충분해야 한다. 당업자는 조사될 샘플 + 알칼리화제 + 부가적 시약의 혼합물의 시점에 시약 혼합물의 pH 가 측정되어야 한다는 것을 안다. 수소 카르보네이트 염 및/또는 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질의 가수분해로 인해, pH 는 시약 혼합물에서 감소될 것이다.
방출 시약은 구체적 구현예에서 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도의 수소 카르보네이트 염 및/또는 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질, 환원제 및 알칼리화제를 포함한다. 추가의 구체적 구현예에서 방출 시약은 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도의 수소 카르보네이트 염, 환원제 및 알칼리화제를 포함한다. 추가의 구체적 구현예에서 방출 시약은 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도의 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질, 환원제 및 알칼리화제를 포함한다. 그러한 방출 시약 및 방출 방법은 WO 2011/144661 및 WO 2013/072342 에 상세히 기재되어 있다.
"수소 카르보네이트 이온" (바이카르보네이트 이온) 은 실험식 HCO3 - 을 갖는 음이온이고 61.01 달톤의 분자 질량을 갖는다.
"수소 카르보네이트 염" 은 탄산수소나트륨 (NaHCO3), 탄산수소칼륨 (KHCO3), 탄산수소암모늄 (NH4HCO3), 탄산수소칼슘 (Ca(HCO3)2) 및 탄산수소마그네슘 (Mg(HCO3)2) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물이다.
본 발명의 구현예에 따른 "가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질" 은 카르보네이트 에스테르이다. 본 발명에 따른 "카르보네이트 에스테르" 는 2 개의 알콕시기가 측면에 위치한 카르보닐기이다. 이들 카르보네이트의 일반적 구조는 R1O(C=O)OR2 이다. 시클릭 카르보네이트 에스테르 (예를 들어, 에틸렌 카르보네이트) 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 (예를 들어, 디메틸 카르보네이트) 뿐만 아니라 이의 히드록실화 또는 할로겐화 유도체가 이용가능하다.
당업자는, 예를 들어 2-메르캅토에탄올, 2-메르캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl 및 디티오트레이톨 (DTT) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적합한 환원제를 선택하는 것을 안다.
또한 당업자는, 예를 들어 NaOH, KOH, Ca(OH)2 및 LiOH, 또는 그의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적합한 알칼리화제를 선택하는 것을 안다.
결합 분자 (비타민 D-결합 단백질) 로부터 분석물 (비타민 D 화합물) 의 본질적으로 완전한 방출이 본 발명에 따른 방법의 단계 (b) 에 앞서 수행되는 것이 유리하다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (b) 에서, 구체적 구현예에서 제 1 결합제 및 제 2 결합제는 샘플과 동시에 접촉된다. 다시 말하면, 구체적 구현예에서 단계 (ba) 및 (bb) 는 본 발명의 방법(들)에 따라 동시에 수행된다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (b) 에서 구체적 구현예에서 제 2 결합제를 샘플과 접촉시킨 전에 또는 후에 제 1 결합제가 샘플과 접촉된다. 다시 말하면, 구체적 구현예에서 단계 (ba) 는 본 발명의 방법(들)에 따른 단계 (bb) 전에 수행된다. 추가의 구현예에서 단계 (ba) 는 본 발명의 방법(들)에 따른 단계 (bb) 후에 수행된다.
본 발명의 방법에 따른 하나의 구현예에서 25-히드록시비타민 D 의 농도는 면역어세이 절차에서 확인/측정/탐지된다.
면역어세이는 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러한 어세이의 수행 방법 뿐만 아니라 실질적 응용 및 절차가 관련 교과서에 요약되어 있다. 관련 교과서의 예는 Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, In: Practice and theory of enzyme immunoassays, pp. 221-278, Burdon, R.H. 및 v. Knippenberg, P.H. (eds.), Elsevier, Amsterdam (1990), 및 면역학적 탐지 방법을 다루는 다양한 권의 Methods in Enzymology, Colowick, S.P., and Caplan, N.O. (eds.), Academic Press, 특히 권 70, 73, 74, 84, 92 및 121 이다.
하나의 구현예에서 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 방법은 효소 결합 면역어세이 (ELISA), 전기화학발광 면역어세이 (ECLIA), 방사면역어세이 (RIA) 및 화학발광 면역어세이 (CLIA) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 25-히드록시비타민 D 는 효소 결합 면역어세이 (ELISA) 에서 탐지된다. 25-히드록시비타민 D 는 추가의 바람직한 구현예에서 (전기-) 화학발광 면역어세이 (ECLIA) 에서 탐지된다. 25-히드록시비타민 D 는 추가의 구현예에서 방사면역어세이 (RIA) 에서 탐지된다. 또한 바람직한 구현예는 25-히드록시비타민 D 를 확인하기 위한 화학발광 면역어세이 (CLIA) 이다. 추가로 바람직하게는 어세이는 샌드위치 형광 면역어세이 (FIA), 마이크로입자 포획 효소 면역어세이 (MEIA), 고체-상 형광 면역어세이 (SPFIA), 입자 농도 형광 면역어세이 (PCFIA), 라텍스 입자 증강 (enhancement) (LPIA) 이 있는 및 없는 혼탁분석 및 비탁분석 어세이이다. 또한, 하나의 구현예에서 어세이는 테스트 스트립의 형태일 수 있다.
현재, 측정에 전기화학발광 (ECL) 을 이용하는 다수의 상업적으로 입수가능한 기기가 존재한다. 리뷰에 관해 Richter, M.M., Chem. Rev. 104 (2004) 3003-3036 을 참고한다. ECL 을 방사하도록 유도될 수 있는 종 (ECL-활성 종) 은 ECL 라벨로서 사용되어 왔다. ECL 라벨의 예는 유기금속성 화합물 예컨대 트리스-바이피리딜-루테늄 [Ru(bpy)3]2+ 모이어티를 포함하며, 여기에서 금속은, 예를 들어, Re, Ru, Ir 및 Os 을 포함하는, VII 및 VIII 족 금속으로부터이다. ECL 과정에서 ECL 라벨과 반응하는 종은 본원에서 ECL 공반응자 (coreactant) 로서 언급된다. ECL 에 통상적으로 사용되는 공반응자는 삼차 아민 (예를 들어 트리프로필아민 (TPA)), 옥살레이트, 및 퍼술페이트를 포함한다. 빛은 ECL 라벨 및 공반응자의 협력 (concertated) 반응에 의해 생성된다; 결합 상호작용에서 결합 시약의 참여는 ECL 라벨로부터 방사되는 ECL 을 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 대안적으로는, ECL-활성 화합물로부터의 ECL 신호가 화학적 환경의 지표일 수 있다 (참고: 예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,623 및 5,643,713, 이들은 특수한 ECL 공반응자의 존재 또는 파괴를 모니터링하는 ECL 어세이를 기재한다). ECL, ECL 라벨, ECL 어세이 및 ECL 어세이를 수행하기 위한 기기장비에 대한 더 많은 배경에 관해 EP 0 441 875, EP 0 500 305, EP 0 973 035, EP 1 892 524, 및 공개 PCT 번호 WO87/06706; WO89/10551; WO90/05301; WO93/01308; WO98/12539; WO99/32662; WO99/58962; WO98/57154 및 WO2001/013095 를 참고한다.
상업적으로 입수가능한 ECL 기기는 예외적인 성능을 입증했다. 그들은 그들의 우수한 민감도, 동적 범위, 정밀도, 및 복합체 샘플 매트릭스의 관용을 포함하는 이유로 널리 사용되어 왔다. 상업적으로 입수가능한 기기장비는 영구적인 재사용가능한 플로우 셀 (flow cell) 을 갖는 플로우 셀-기반 디자인을 사용한다.
분석물의 확인을 위한 입수가능한 샘플 부피는 종종 제한되고 하나의 샘플로부터 점점 더 많은 상이한 분석물이 확인되어야 한다. 또한 어세이 자동화를 위한 더 빠른 실험 장비 및 분석물의 탐지를 위한 더욱 민감한 방법의 개발이 요구된다. 이는 고감도 특이적 전기화학발광 어세이 및 이의 수행 방법에 관한 필요를 초래한다. 또한 안전 위험 또는 환경 염려와 연관된 개선이 고려될 것이다.
추가의 구현예에서, 25-히드록시비타민 D 는 샌드위치 어세이에서 확인된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 샘플 중 25-히드록시비타민 D 를 확인하기 위해서 샌드위치 면역어세이가 사용된다. 그러한 샌드위치 면역어세이는 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 샘플 중 25-히드록시비타민 D 를 특이적으로 탐지한다.
샌드위치 어세이에서 본 발명에 따른 제 2 결합제가 하나의 구현예에서 사용되어 25-히드록시비타민 D 를 포획하고, 직접 또는 간접 탐지가능하게 라벨링된 제 3 결합제가 사용되어 제 2 결합제와 25-히드록시비타민 D 로 형성된 복합체를 포획한다.
샌드위치-유형 어세이 포맷에서 사용되는 제 2 결합제 및 제 3 결합제는 하나의 구현예에서 항체, 각각 또는 추가의 구현예에서 제 2 결합제로서의 비타민 D-결합 단백질 및 제 3 결합제로서의 항체의 조합이다. 항체가 샌드위치-유형 어세이에서 사용되는 경우에, 하나의 구현예에서 또한 항체의 기능적 활성 부분이 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 키트는 정성적 (25-히드록시비타민 D 의 존재 또는 부재) 또는 정량적 (25-히드록시비타민 D 의 양이 확인된다) 또는 반-정량적 (상대적 양, 특히 컷-오프 값 초과 또는 미만이 제공된다) 면역어세이에 사용된다.
바람직한 구현예에서 25-히드록시비타민 D 는 전기화학적 또는 전기화학발광 면역어세이 (=ECLIA) 에서 탐지된다. 전기화학적 또는 전기화학발광 어세이에서 결합된 분석물 분자는 탐지제 (표적 분자) 에 연결된 라벨에 의해 탐지된다. 전극은 탐지제에 연결된 화학적 라벨의 발광을 전기화학적으로 개시한다. 라벨에 의해 방사된 빛은 광탐지기로 측정되고 결합된 분석물 분자/표적 분자 복합체의 존재 또는 양을 나타낸다. ECLA 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,543,112; 5,935,779; 및 6,316,607 에 기재되어 있다. 정밀하고 민감한 측정을 위해 상이한 분석물 분자 농도에 관해 신호 조정이 최대화될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "라벨" 또는 "탐지가능 라벨" 은 직접 또는 간접 탐지를 통해 신호를 생성할 수 있는 임의의 물질을 언급한다. 탐지가능 라벨은 따라서 직접 또는 간접 탐지될 수 있다. 직접 탐지를 위해 본 발명에서 사용하기에 적합한 라벨은 임의의 알려진 탐지가능 마커 기, 예컨대 크로모겐, 형광 기, 화학발광 기 (예를 들어 아크리디늄 에스테르 또는 디옥세탄), 전기화학발광 화합물, 촉매, 효소, 효소 기질, 염료, 형광 염료 (예를 들어 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 옥사진, 레소루핀, 시아닌 및 그의 유도체), 콜로이드성 금속성 및 비금속성 입자, 및 유기 중합체 라텍스 입자로부터 선택될 수 있다. 탐지가능 라벨의 기타 예는 발광 금속 복합체, 예컨대 투레늄 또는 유로퓸 복합체, 예를 들어 ECLIA 에 사용되는 것, 효소, 예를 들어 ELISA 에 사용되는 것, 및 방사성동위원소; 예를 들어 RIA 에 사용되는 것이다.
간접 탐지 시스템은, 예를 들어, 탐지 시약, 예를 들어 탐지 항체가 바이오아핀 결합 쌍의 제 1 상대로 라벨링되는 것을 포함한다. 적합한 결합 쌍의 예는 헵텐 또는 항원/항체, 비오틴 또는 비오틴 유사체 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘, 당/렉틴, 핵산 또는 핵산 유사체/상보적 핵산, 및 수용체/리간드, 예를 들어 스테로이드 호르몬 수용체/스테로이드 호르몬이다. 바람직한 제 1 결합 쌍 일원은 헵텐, 항원 및 호르몬을 포함한다. 특히 바람직한 것은 헵텐 예컨대 디곡신 및 비오틴 및 그의 유사체이다. 그러한 결합 쌍의 제 2 상대, 예를 들어 항체, 스트렙타비딘 등은 통상적으로는 직접 탐지를 허용하도록, 예를 들어 상기와 같은 탐지가능 라벨에 의해 라벨링된다.
당업자는 제 1 및/또는 제 2 결합제가 각각 탐지가능 라벨로 라벨링될 수 있다는 것을 안다. 당업자는 제 1 결합제를 위해 선택된 라벨이 제 2 결합제를 위해 선택된 라벨과 상이해야 한다는 것을 안다.
구체적 구현예에 따르면 제 1 결합제는 mAb<24,25-디히드록시비타민 D3> 이고, 제 2 결합제는 비타민 D-결합 단백질, 바람직하게는 라벨링된 비타민 D-결합 단백질, 더욱 바람직하게는 비오틴일화된 또는 루테닐화된 비타민 D-결합 단백질, 각각이다.
직접 탐지를 위해 라벨링 기 또는 본 발명에서 사용하기에 적합한 라벨은 임의의 알려진 탐지가능 마커 기로부터 선택될 수 있으나, 크로모겐, 형광, 화학발광 기 (예를 들어 아크리디늄 에스테르 또는 디옥세탄), 전기화학발광 화합물, 촉매, 효소, 효소 기질, 염료, 형광 염료 (예를 들어 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 옥사진, 레소루핀, 시아닌 및 그의 유도체), 콜로이드성 금속성 및 비금속성 입자, 및 유기 중합체 라텍스 입자에 제한되지 않는다. 라벨링 기의 기타 예는 발광 금속 복합체, 예컨대 투레늄 또는 유로퓸 복합체, 효소, 예를 들어 ELISA 에 사용되는 것, 및 방사성동위원소이다.
간접 탐지 시스템은, 예를 들어, 탐지 시약, 예를 들어 탐지 항체가 바이오아핀 결합 쌍의 제 1 상대로 라벨링되는 것을 포함한다. 적합한 결합 쌍의 예는 헵텐 또는 항원/항체, 비오틴 또는 비오틴 유사체 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘, 당/렉틴, 핵산 또는 핵산 유사체/상보적 핵산, 및 수용체/리간드, 예를 들어 스테로이드 호르몬 수용체/스테로이드 호르몬이다. 바람직한 제 1 결합 쌍 일원은 헵텐, 항원 및 호르몬을 포함한다. 특히 바람직한 것은 헵텐 예컨대 디곡신 및 비오틴 및 그의 유사체이다. 그러한 결합 쌍의 제 2 상대, 예를 들어 항체, 스트렙타비딘 등은, 통상적으로는 직접 탐지를 허용하도록, 예를 들어 상기 라벨에 의해 라벨링된다.
구체적 구현예에서, 샘플 중 25-히드록시비타민 D 의 농도는 적어도 1 nmol/L (0.4 ng/㎖), 추가로 바람직하게는 최대 500 nmol/L (200 ng/㎖), 추가로 바람직하게는 10 nmol/L (4 ng/㎖) 내지 500 nmol/L (200 ng/㎖) 범위, 추가로 바람직하게는 10 nmol/L (4 ng/㎖) 내지 250 nmol/L (100 ng/㎖) 범위이다.
본 발명에 따른 "교차반응" 또는 "교차반응성" 은 제 1 결합제, 특히 항체가 지향되는 간섭 화합물 (예를 들어 24,25-디히드록시비타민 D3) 과 구별되는 확인될 비타민 D 화합물 (예를 들어 25-히드록시비타민 D) 에 대한 결합 강도가 분석물로 측정된 결합 강도의 10 % 이하, 바람직하게는 5% 이하라는 것을 의미한다. 결합 강도는 특히 BiaCore™ 을 사용하는 친화도 테스트를 적용하여 측정될 수 있다. 당업자가 아는 바와 같이, Kd 로서 제공되는 경우에 결합 친화도 (친화도 또는 결합 강도) 가 더 나을수록/더 높은수록, Kd 는 더 낮다.
더욱이, 실시예에서, 본 발명의 제 1 결합제는 25-히드록시비타민 D 에 대한 유의한 교차반응성을 전혀 보이지 않는다는 것을 알 수 있다; 즉 25-히드록시비타민 D 에 대한 교차반응성은 10% 이하, 특히 5% 이하, 특히 1% 이하 교차반응성인 것으로 밝혀졌다. 하나의 구현예에서 제 1 결합제는 25-히드록시비타민 D 에 대한 유의한 교차반응성을 갖지 않고, 바람직하게는 제 1 결합제는 25-히드록시비타민 D 에 대한 10% 이하 교차반응성을 갖고, 추가로 바람직하게는 제 1 결합제는 25-히드록시비타민 D 에 대한 5% 이하 교차반응성을 갖고, 추가로 바람직하게는 제 1 결합제는 25-히드록시비타민 D 에 대한 1% 이하 교차반응성을, 각각, 갖는다. 따라서, 또한 작은 양의 25-히드록시비타민 D 가 특이적으로 및 신뢰가능하게, 심지어는 24,25-디히드록시비타민 D3 의 존재 하에, 탐지될 수 있다.
본 발명에 따르면, Kd(제 1 결합제) 는 24,25-디히드록시비타민 D3 에 관한 제 1 결합제의 친화도이고, Kd(제 2 결합제) 는 25-히드록시비타민 D 에 관한 제 2 결합제의 친화도이다.
"친화도" 는 2 개의 종 사이의 상호작용의 강도를 정의하고, 바람직하게는 표면 플라스몬 공명을 통해, 특히 BiaCore® 시스템을 사용하여 확인된다. 항체 또는 항체 분절의 경우에, 친화도는 Kd 값으로서 바람직하게는 표면 플라스몬 공명을 통해, 특히 BiaCore® 시스템을 사용하여 확인된다. 친화도의 확인은 "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics", Current Opinion in Immunology, Volume 5, Issue 2, 1993, Pages 282-286 에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
더욱이, 본 발명에 따르면, Conc(제 1 결합제) 및 Conc(제 2 결합제) 는 상기 본 발명의 방법의 단계 b) 에서의, 각각, 제 1 결합제 및 제 2 결합제의 몰농도이다.
더욱이, 본 발명에 따르면, MR(제 1 결합제) 은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 대한 결합에 관한 제 1 결합제의 결합가이고, MR(제 2 결합제) 는 25-히드록시비타민 D 에 관한 제 2 결합제의 결합가이다.
본 발명에 따른 "결합가" 는 소정의 결합 상대의 쌍에 관해 실험적으로 확인된 결합 자리의 수로서 이해된다. 항체 또는 그의 기능적 활성 부분의 경우에, 이론적 결합가는 전형적으로는 1 또는 2 이지만, 실험적으로 확인된 결합가는 입체 효과로 인해 비-정수 값 (예를 들어 1.4) 일 수 있다. 제 1 결합제로서 바람직한 항체의 경우에, 이론적 결합가는 전형적으로는 1 이다. 다시, 실험적으로 확인된 결합가는 입체 효과로 인해 비-정수 값 (예를 들어 0.9) 일 수 있다. 결합가의 확인은 Schraeml M. et al. (2012) Methods in Molecular Biology Vol. 901, 171-181 에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
25-히드록시비타민 D 의 본질적으로 완전한 측정을 달성하기 위해서, 24,25-디히드록시비타민 D3 에 관한 제 1 결합제의 Kd 가 25-히드록시비타민 D 에 관한 제 2 결합제의 친화도보다 최대 10 배 더 높은, 바람직하게는 동일한, 더욱 바람직하게는 더 낮은 경우가 유리하다. 그러므로, 추가의 바람직한 구현예에서, Kd(제 1 결합제) / Kd(제 2 결합제) 는 10 이하, 바람직하게는 1 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 이하이다.
25-히드록시비타민 D 의 본질적으로 완전한 측정을 달성하기 위해서, 하나의 구현예에서 제 1 결합제의 농도가 제 2 결합제의 농도보다, 각각, 동일한, 바람직하게는 적어도 10-배 더 높은, 추가로 바람직하게는 50-배 더 높은, 추가로 바람직하게는 100-배 더 높은, 또한 바람직하게는 200-배 더 높은 경우가 또한 유리하다. 그러므로, 추가의 바람직한 구현예에서, Conc(제 1 결합제) / Conc(제 2 결합제) 는, 각각, 최대 200, 바람직하게는 최대 100, 바람직하게는 최대 50, 바람직하게는 최대 10, 바람직하게는 최대 1 이며, 특히 여기에서 Conc(제 1 결합제) 는 1*(1 내지 10) nmol/L 내지 200*(1 내지 10) nmol/L 범위, 및/또는 Conc(제 2 결합제) 는 1 내지 10 nmol/L 범위이다.
구체적 구현예에 따르면 제 1 결합제는 바람직하게는 각각 24,25-디히드록시비타민 D3 에 대해 제 2 결합제와 적어도 동일한, 바람직하게는 적어도 10-배 더 높은, 추가로 바람직하게는 적어도 100-배 더 높은 결합 친화도를 갖는다.
또다른 주요한 양상은, 특히 제 1 결합제 및/또는 제 2 결합제가 항체 또는 그의 기능적 활성 부분인 경우에, 본 발명의 방법에서 이용되는 제 1 결합제 및 제 2 결합제의 결합가이다. 작은 분석물, 예를 들어 비타민 D 화합물에 결합할 때, 항체인 결합 분자는 전형적으로는 MR=2 의 결합가를 보이지만, 입체적 이유로, 항체인 제 1 결합제는 전형적으로는 MR=1 이하의 결합가를 보인다. 이 경우에, 함수적 몰농도 지수 (functional molarity quotient) 가 바람직하게는 고려될 것이다.
분석물 (예를 들어 비타민 D 화합물, 바람직하게는 25-히드록시비타민 D) 의 총 양의 확인에서 분석물에 결합하는 것이 의도되는 제 2 결합제가 이러한 분석물에 대해 충분히 높은 친화도를 나타내는 경우가 추가로 유리하다. 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 것이 의도되는 제 1 결합제가 이러한 24,25-디히드록시비타민 D3 에 대해 충분히 높은 친화도를 나타내는 경우가 추가로 유리하다.
25-히드록시비타민 D 의 총 양의 확인에서 제 1 결합제에 대한 24,25-디히드록시비타민 D3 의 본질적으로 완전한 결합을 달성하기 위해서 24,25-디히드록시비타민 D3 에 대한 제 1 결합제의 결합 친화도가 충분히 높은 경우가 추가로 유리하다. 그러므로 추가의 구현예에서 24,25-디히드록시비타민 D3 에 대한 결합에 관한 제 1 결합제의 Kd 는 10-8　mol/L 이하, 바람직하게는 10-9　mol/L 이하, 더욱 바람직하게는 10-10　mol/L 이하이다.
추가의 구현예에서 25-히드록시비타민 D 에 대한 결합에 관한 제 2 결합제의 Kd 는 10-8　mol/L 이하, 바람직하게는 10-9　mol/L 이하, 더욱 바람직하게는 10-10 mol/L 이하이다.
25-히드록시비타민 D 의 거짓-양성 탐지를 최소화하기 위해서 제 1 결합제가 24,25-디히드록시비타민 D3 에 관해 특이성을 나타내는 경우가 추가로 유리하다. 추가로, 특히 제 1 결합제의 상실을 최소화하고 및 24,25-디히드록시비타민 D3 에 대한 결합을 최대화하기 위해서, 제 1 결합제가 24,25-디히드록시비타민 D3 에 관해 특이성을 나타내는 경우가 유리하다. 그러므로, 바람직한 구현예에서, 제 1 결합제는 24,25-디히드록시비타민 D3 에 특이적으로 결합하고, 특히 24,25-디히드록시비타민 D3 와 상이한 표적에 대한 제 1 결합제의 결합은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 대한 제 1 결합제의 결합의 최대 5% 이다.
추가의 구체적 구현예에서, 제 1 결합제의 농도는 1 * (1 내지 10) nmol/L 내지 200 * (1 내지 10) nmol/L, 예컨대 1 * (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10) nmol/L 내지 200 * (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10) nmol/L, 특히 1 내지 1000 nmol/L, 30 내지 800 nmol/L, 50 내지 700 nmol/L, 100 내지 600 nmol/L 범위이다.
당업자는 그러한 방법이 비타민 D 화합물의 정량적 측정에 관해 표준화될 필요가 있다는 것을 안다. 추가의 구현예에서 본 발명에 따른 방법은 비타민 D 칼리브레이터 (calibrator) 에 의해 표준화된다.
당업자는 또한 본 발명에 따른 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 방법이 또한 변형된 절차로 실행될 수 있다는 것을 안다.
추가의 구현예에서 본 발명은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 대상으로부터 얻어진 샘플을 제공하는 단계,
b) 샘플을 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제 및 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 1 결합제와 24,25-디히드록시비타민 D3 사이의 제 1 복합체 및 제 2 결합제와 25-히드록시비타민 D 사이의 제 2 복합체를 각각 형성하는 단계, 및
c) (b) 에서 형성된 제 2 복합체를 측정하여, 그에 의해 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하는 단계.
추가의 구현예에서 본 발명은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 대상으로부터 얻어진 샘플을 제공하는 단계,
b) 샘플을
ba) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 1 결합제와 24,25-디히드록시비타민 D3 사이의 제 1 복합체를 형성하며,
bb) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 2 결합제와 25-히드록시비타민 D 사이의 제 2 복합체를 형성하는 단계,
c) 제 2 결합제 및 25-히드록시비타민 D 를 포함하는 제 2 복합체를 25-히드록시비타민 D 를 포함하지 않는 제 2 결합제로부터 분리하는 단계, 및
d) (bb) 에서 형성된 제 2 복합체를 측정하여, 그에 의해 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 를 측정하는 단계.
추가의 구현예에서 본 발명은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 대상으로부터 얻어진 샘플을 제공하는 단계,
b) 샘플을
(ba) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 1 결합제와 24,25-디히드록시비타민 D3 사이의 복합체를 형성하며,
(bb) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제와 혼합하는 단계,
c) 샘플을 라벨링된 25-히드록시비타민 D 와 혼합하여, 샘플로부터의 25-히드록시비타민 D 및 라벨링된 25-히드록시비타민 D 가 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제에 대한 결합에 관해 경쟁하여, 그에 의해 제 2 결합제와 라벨링된 25-히드록시비타민 D 사이의 제 2 복합체를 얻는 단계,
d) 단계 (c) 에서 얻어진 제 2 복합체에 포함된 라벨링된 25-히드록시비타민 D 를 제 2 복합체에 포함되지 않은 라벨링된 25-히드록시비타민 D 로부터 분리하는 단계, 및
e) 제 2 복합체에 포함된 라벨링된 25-히드록시비타민 D 를 측정하여, 그에 의해 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 를 측정하는 단계.
추가의 구현예에서 본 발명은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 대상으로부터 얻어진 샘플을 제공하고,
비타민 D-결합 단백질에 결합된 샘플에 존재하는 비타민 D 화합물을 방출 시약으로 방출하는 단계,
b) 샘플을
(ba) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 1 결합제와 24,25-디히드록시비타민 D3 사이의 복합체를 형성하며,
(bb) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제와 혼합하는 단계,
c) 샘플을 라벨링된 25-히드록시비타민 D 와 혼합하여, 샘플로부터의 25-히드록시비타민 D 및 라벨링된 25-히드록시비타민 D 가 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제에 대한 결합에 관해 경쟁하여, 그에 의해 제 2 결합제와 라벨링된 25-히드록시비타민 D 사이의 제 2 복합체를 얻는 단계,
d) 단계 (c) 에서 얻어진 제 2 복합체에 포함된 라벨링된 25-히드록시비타민 D 를 제 2 복합체에 포함되지 않은 라벨링된 25-히드록시비타민 D 로부터 분리하는 단계, 및
e) 제 2 복합체에 포함된 라벨링된 25-히드록시비타민 D 를 측정하여, 그에 의해 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 를 측정하는 단계.
용도:
본 발명의 방법을 사용하여, 25-히드록시비타민 D 의 총 양 및/또는 농도가 탐지될 수 있다.
하나의 구현예에서 본 발명은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한, 본 발명의 방법(들)에 따른 시험관내 방법의 용도에 관한 것이다.
추가의 구현예에서 본 발명은 대상으로부터 얻어진 샘플 중 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 본 발명에 따른 시험관내 방법(들)에 있어서의, 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제 및 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제의 용도에 관한 것이다.
바람직하게는 제 1 결합제로서 mAb<24,25-디히드록시비타민 D3> 및 제 2 결합제로서 비타민 D-결합 단백질이 본 발명의 구현예에 따라 사용된다.
또한 본 발명은 하나의 구현예에서 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 확인을 위한 본원에 공개된 키트의 용도에 관한 것이다.
키트:
하나의 구현예에서 본 발명은 적어도 하기를 포함하는, 본 발명에 따른 방법(들)을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다:
a) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제, 여기에서 제 1 결합제는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분임, 및
b) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제, 여기에서 제 2 결합제는 비타민 D-결합 단백질임.
바람직하게는 제 1 결합제로서 mAb<24,25-디히드록시비타민 D3> 및 제 2 결합제로서 비타민 D-결합 단백질이 본 발명의 구현예에 따른 키트에 제공된다.
당업자는 본원에 공개된 시약이 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 키트의 제조에 적합하다는 것을 안다.
구체적 구현예에서 키트는 또한 0.1 M 내지 2.0 M 의 수소 카르보네이트 염 또는 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질, 환원제, 및 알칼리화제를 갖는 시약 조성물을 포함하며, 바람직하게는 키트는 0.1　M 내지 2.0 M 의 수소 카르보네이트 염 또는 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질, 2 mM 내지 30 mM 의 환원제, 1 M 내지 1.5 M 의 알칼리화제의 용액을 갖는 시약 조성물을, 본 발명에 따른 제 1 결합제 및 제 2 결합제에 더하여, 포함한다.
추가의 구체적 구현예에서 키트는 2-메르캅토에탄올, 2-메르캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl 및 디티오트레이톨 (DTT) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 환원제 및 1 M 내지 1.5 M 의 NaOH, KOH, Ca(OH)2 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알칼리화제의 용액을 포함한다.
추가로 키트는 하나의 구현예에서 비타민 D 칼리브레이터를 포함한다.
본 발명에 따른 키트는 비타민 D 화합물에 관한 자동화된 테스트에서의 사용에 적합한 것을 증명되었다. 본 발명은 바람직하게는 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 확인을 위한 본 발명에 따른 키트의 용도에 관한 것이다.
25-히드록시비타민 D 에 관한 테스트는 바람직하게는 완전히 자동화된다. 완전 자동화는 이 경우에 실험자가 단지 조사될 샘플 및 비타민 D 화합물을 측정하기 위한 모든 성분을 함유하는 시약 팩을 자동화된 분석기에 배치하기만 하면 되고, 모든 추가의 단계가 분석기에 의해 자동으로 수행된다는 것을 의미한다. 완전히 자동화된 테스트는 특히 바람직하게는 Roche Diagnostics 로부터의 Elecsys® 분석기에서 수행된다.
추가의 구현예에서, 본 발명에 따른, 시약 조성물, 제 1 결합제 및 제 2 결합제, 각각은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 탐지를 위한 시험관내 방법에서 사용되며, 여기에서 25-히드록시비타민 D 는 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3 및 3-에피-25-히드록시비타민 D, 바람직하게는 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3 을 포함하는 군으로부터 선택된다.
위에서 이미 언급된 바와 같이 25-히드록시비타민 D2 및 25-히드록시비타민 D3 은 특히 진단에 적절한 형태의 비타민 D 이다. 본 발명에 따른 시험관내 방법(들)에서 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D2 또는 25-히드록시비타민 D3 에 대한 특이적 항체를 통한 특이적 25-히드록시비타민 D2 또는 25-히드록시비타민 D3 또는 둘모두의 탐지가 또한 바람직한 구현예에 해당한다.
다르게 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 4th ed., John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1992); Oxford University Press 에 의해 출판된, Lewin, B., Genes V (1994), ISBN 0-19-854287-9; Blackwell Science Ltd. 에 의해 출판된, Kendrew, J. et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology (1994), ISBN 0-632-02182-9; 및 Meyers, R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: VCH Publishers, Inc. 에 의해 출판된, a Comprehensive Desk Reference (1995), ISBN 1-56081-569-8 은 당업자에게 본 출원에서 사용되는 많은 용어에 대한 일반 안내를 제공한다.
본 발명의 실시는, 다르게 명시되지 않으면, 당해 기술분야 내에 있는, 분자 생물학 (재조합 기술을 포함한다), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 종래의 기술을 이용할 것이다. 그러한 기술은 문헌, 예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (1989); Gait, M.J., Oligonucleotide Synthesis (1984); Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture (1987); Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Ausubel, F.M. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, (1987) 및 주기적인 업데이트; Mullis et al. (eds.), PCR: The Polymerase Chain Reaction (1994) 에서 충분히 설명되어 있다.
본 발명의 추가의 임의적 특색 및 구현예는 바람직한 구현예의 후속 설명에서, 바람직하게는 종속항과 함께, 더욱 상세히 개시될 것이다. 거기에서, 각각의 임의적 특색은 분리된 방식으로 뿐만 아니라 임의의 임의적인 실현가능한 조합으로, 당업자가 실현할 바와 같이, 실현될 수 있다. 본 발명의 범위는 바람직한 구현예에 의해 제한되지 않는다.
본 발명의 발견을 요약하면, 하기 구현예가 바람직하다:
1. 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
a) 비타민 D-결합 단백질에 결합된 비타민 D 화합물을 포함하는 대상으로부터 얻어진 샘플을 제공하는 단계,
b) 샘플을
(ba) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 1 결합제와 24,25-디히드록시비타민 D3 사이의 복합체를 형성하며;
(bb) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 2 결합제와 25-히드록시비타민 D 사이의 복합체를 형성하는 단계;
c) (bb) 에서 형성된 복합체를 측정하여, 그에 의해 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 샘플이 혈액, 혈청 또는 혈장인, 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 비타민 D-결합 단백질에 결합된 샘플에 존재하는 비타민 D 화합물이 단계 (b) 에 앞서 방출 시약으로 비타민 D-결합 단백질로부터 방출되는, 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 방출 시약이 비타민 D-결합 단백질을 변성시키며, 바람직하게는 방출 시약이 비타민 D-결합 단백질을 불가역적으로 변성시키는, 방법.
5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 비타민 D 화합물이 단계 (b) 에 앞서, 각각, 단백질분해 붕괴, 산성 방출, 알칼리성 방출, 메탄올 방출, 에탄올 침전, 페리오데이트 염 방출, 아세토니트릴 추출, 금속 히드록시드 방출, 시클로덱스트린 및/또는 그의 유도체에 의한 방출 또는 금속 살리실레이트 방출로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 비타민 D-결합 단백질로부터 방출되는, 방법.
6. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 방출 시약이 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도의 수소 카르보네이트 염 및/또는 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도의 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질, 환원제 및 알칼리화제를 포함하는, 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 특징으로 하는 방법:
- Kd(제 1 결합제) / Kd(제 2 결합제) 는 10 이하, 바람직하게는 1 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 이하이고/거나;
- Conc(제 1 결합제) / Conc(제 2 결합제) 는 최대 200, 바람직하게는 최대 100, 바람직하게는 최대 50, 더욱 바람직하게는 최대 10 임,
여기에서 Kd(제 1 결합제) 는 24,25-디히드록시비타민 D3 에 관한 제 1 결합제의 친화도이고, Kd(제 2 결합제) 는 25-히드록시비타민 D 에 관한 제 2 결합제의 친화도이고,
여기에서 Conc(제 1 결합제) 및 Conc(제 2 결합제) 는 단계 b) 에서의, 각각, 제 1 결합제 및 제 2 결합제의 몰농도이며, 특히 여기에서 Conc(제 1 결합제) 는 1*(1 내지 10) nmol/L 내지 200*(1 내지 10) nmol/L 범위이고/거나, Conc(제 2 결합제) 는 1 내지 10 nmol/L 범위임.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 특징으로 하는 방법:
- 24,25-디히드록시비타민 D3 에 대한 결합에 관한 제 1 결합제의 Kd 는 10-8　mol/L 이하, 바람직하게는 10-9　mol/L 이하, 더욱 바람직하게는 10-10　mol/L 이하이고/거나;
- 25-히드록시비타민 D 에 대한 결합에 관한 제 2 결합제의 Kd 는 10-8　mol/L 이하, 바람직하게는 10-9　mol/L 이하, 더욱 바람직하게는 10-10 mol/L 이하임.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 특징으로 하는 방법:
a) 대상은 인간이고/거나;
b) 방법은 효소 결합 면역어세이 (ELISA), 전기화학발광 면역어세이 (ECLIA), 방사면역어세이 (RIA) 및 화학발광 면역어세이 (CLIA) 로 이루어지는 군으로부터 선택되고/거나;
c) 25-히드록시비타민 D 는 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3 및 3-에피-25-히드록시비타민 D 로 이루어지는 군으로부터 선택되고/거나;
d) 25-히드록시비타민 D 는 25-히드록시비타민 D2 및 25-히드록시비타민 D3 로 이루어지는 군으로부터 선택되고/거나;
e) 제 1 결합제는, 각각, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 합성 항체 (플라스틱 항체), 바람직하게는 합성 항체 또는 모노클로날 항체, 추가로 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분으로 이루어지는 군으로부터 선택되고/거나;
f) 제 2 결합제는 비타민 D-결합 단백질, 바람직하게는 재조합 비타민 D-결합 단백질이고/거나;
g) 제 1 결합제는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분이고, 제 2 결합제는 비타민 D-결합 단백질 또는 비타민 D-결합 단백질의 기능적 활성 부분이고/거나;
h) 제 1 결합제는 mAb<24,25-디히드록시비타민 D3> 이고, 제 2 결합제는 비타민 D-결합 단백질, 바람직하게는 라벨링된 비타민 D-결합 단백질, 더욱 바람직하게는 루테닐화된 비타민 D-결합 단백질이고/거나;
i) 제 1 결합제는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분이고, 제 2 결합제는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분이고/거나;
j) 제 1 결합제는 mAb<24,25-디히드록시비타민 D3> 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분이고, 제 2 결합제는 mAb<25-히드록시비타민 D> 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분이며, 고체 지지체에 부동화될 수 있고/거나;
k) 제 1 결합제는 제 2 결합제에 대한 24,25-디히드록시비타민 D3 의 결합을 방지하고/거나;
l) 제 1 결합제에 결합된 24,25-디히드록시비타민 D3 는 제 2 결합제에 의 해결합될 수 없고/거나;
m) 제 2 결합제는 제 1 결합제에 결합된 24,25-디히드록시비타민 D3 를 방출할 수 없고/거나;
n) 제 1 결합제는, 각각, 제 2 결합제와 적어도 동일한, 바람직하게는 적어도 10-배 더 높은, 추가로 바람직하게는 적어도 100-배 더 높은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 대한 결합 친화도를 갖고/거나;
o) 제 1 결합제는, 각각, 25-히드록시비타민 D 에 대한 유의한 교차반응성을 갖지 않고, 바람직하게는 제 1 결합제는 25-히드록시비타민 D 에 대한 10% 이하 교차반응성을 갖고, 추가로 바람직하게는 제 1 결합제는 25-히드록시비타민 D 에 대한 5% 이하 교차반응성을 갖고, 추가로 바람직하게는 제 1 결합제는 25-히드록시비타민 D 에 대한 1% 이하 교차반응성을 갖고/거나;
p) 제 1 항의 단계 (b) 에 따른 제 1 결합제 및 제 2 결합제는 샘플과 동시에 접촉되고/거나;
q) 제 2 결합제를 샘플과 접촉시키기 전에 또는 후에 제 1 결합제가 제 1 항의 단계 (b) 에 따른 샘플과 접촉되고/거나;
r) 샘플 중 25-히드록시비타민 D 의 농도는 적어도 1 nmol/L (0.4 ng/㎖), 추가로 바람직하게는 최대 500 nmol/L (200 ng/㎖), 추가로 바람직하게는 10 nmol/L (4 ng/㎖) 내지 500 nmol/L (200 ng/㎖) 범위, 추가로 바람직하게는 10 nmol/L (4 ng/㎖) 내지 250 nmol/L (100 ng/㎖) 범위이고/거나;
s) 방법은 비타민 D 칼리브레이터에 의해 표준화됨.
10. 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 시험관내 방법의 용도.
11. 대상으로부터 얻어진 샘플 중 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 방법에 있어서의, 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제 및 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제의 용도.
12. 적어도 하기를 포함하는, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 키트:
a) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제, 여기에서 제 1 결합제는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분임, 및
b) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제, 여기에서 제 2 결합제는 비타민 D-결합 단백질임.
13. 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
a) 대상으로부터 얻어진 샘플을 제공하는 단계,
b) 샘플을 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제 및 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제와 혼합하여, 그에 의해, 각각, 제 1 결합제와 24,25-디히드록시비타민 D3 사이의 제 1 복합체 및 제 2 결합제와 25-히드록시비타민 D 사이의 제 2 복합체를 형성하는 단계, 및
c) (b) 에서 형성된 제 2 복합체를 측정하여, 그에 의해 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하는 단계.
14. 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
a) 대상으로부터 얻어진 샘플을 제공하는 단계,
b) 샘플을
ba) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 1 결합제와 24,25-디히드록시비타민 D3 사이의 제 1 복합체를 형성하며,
bb) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 2 결합제와 25-히드록시비타민 D 사이의 제 2 복합체를 형성하는 단계,
c) 제 2 결합제 및 25-히드록시비타민 D 를 포함하는 제 2 복합체를 25-히드록시비타민 D 를 포함하지 않는 제 2 결합제로부터 분리하는 단계, 및
d) (bb) 에서 형성된 제 2 복합체를 측정하여, 그에 의해 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 를 측정하는 단계.
15. 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
a) 대상으로부터 얻어진 샘플을 제공하는 단계,
b) 샘플을
(ba) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 1 결합제와 24,25-디히드록시비타민 D3 사이의 복합체를 형성하며,
(bb) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제와 혼합하는 단계,
c) 샘플을 라벨링된 25-히드록시비타민 D 와 혼합하여, 샘플로부터의 25-히드록시비타민 D 및 라벨링된 25-히드록시비타민 D 가 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제에 대한 결합에 관해 경쟁하여, 그에 의해 제 2 결합제와 라벨링된 25-히드록시비타민 D 사이의 제 2 복합체를 얻는 단계,
d) 단계 (c) 에서 얻어진 제 2 복합체에 포함된 라벨링된 25-히드록시비타민 D 를 제 2 복합체에 포함되지 않은 라벨링된 25-히드록시비타민 D 로부터 분리하는 단계, 및
e) 제 2 복합체에 포함된 라벨링된 25-히드록시비타민 D 를 측정하여, 그에 의해 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 를 측정하는 단계.
16. 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
a) 대상으로부터 얻어진 샘플을 제공하고,
비타민 D-결합 단백질에 결합된 샘플에 존재하는 비타민 D 화합물을 방출 시약으로 방출하는 단계,
b) 샘플을
(ba) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 1 결합제와 24,25-디히드록시비타민 D3 사이의 복합체를 형성하며,
(bb) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제와 혼합하는 단계,
c) 샘플을 라벨링된 25-히드록시비타민 D 와 혼합하여, 샘플로부터의 25-히드록시비타민 D 및 라벨링된 25-히드록시 비타민 D 가 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제에 대한 결합에 관해 경쟁하여, 그에 의해 제 2 결합제와 라벨링된 25-히드록시비타민 D 사이의 제 2 복합체를 얻는 단계,
d) 단계 (c) 에서 얻어진 제 2 복합체에 포함된 라벨링된 25-히드록시비타민 D 를 제 2 복합체에 포함되지 않은 라벨링된 25-히드록시비타민 D 로부터 분리하는 단계, 및
e) 제 2 복합체에 포함된 라벨링된 25-히드록시비타민 D 를 측정하여, 그에 의해 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 를 측정하는 단계.
본 발명은 이어지는 실시예 및 도면에 의해 추가로 설명된다. 실제 보호 범위는 본 발명에 첨부된 청구항으로부터 온다. 구현예는 도면에서 도식적으로 묘사된다.
도 1: 도 1 은 7-{2-[2-(2-{(S)-3-[2-[(1R,7aR)-1-((R)-4,5-디히드록시-1,5-디메틸-헥실)-7a-메틸-옥타히드로-인덴-(4E)-일리덴]-에트-(Z)-일리덴]-4-메틸렌-시클로헥실옥시카르보닐아미노}-에톡시)-에톡시]-에틸카르바모일}-헵탄산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (산의 NHS 에스테르) 의 화학적 구조를 보여준다.
도 2: 도 2 는 시약 R1 중, 각각, 차단제 (제 1 결합제) 의 부재 또는 존재 하에서의 Elecsys® 비타민 D 총 면역어세이를 보여준다. 25-히드록시비타민 D3 (○, 25(OH)D3); 24,25-디히드록시비타민 D3 (●, 24,25(OH)2D3).
도 2a 는 차단 시약 (제 1 결합제) mAb<24,25-디히드록시비타민 D3>rK-IgG 의 부재 하에서의 결과를 보여준다.
도 2b 는 간섭 제거를 위한 차단 시약 (제 1 결합제) mAb<24,25-디히드록시비타민 D3>rK-IgG (mAb<24,25(OH)2D3>) 의 존재 하에서의 결과를 보여준다.
도 3: Elecsys® 비타민 D 총 면역어세이 및 LC-MS 비타민 D 측정 사이의 상관관계가 도 3a 및 3b 에서 2 개의 상이한 샘플 세트에 관해 보여진다. 차단 시약의 부재 (○, 제 1 결합제의 부재) 및 차단제의 존재 (●, 제 1 결합제의 존재).
실시예 1
24,25-디히드록시비타민 D 3 에 관한 차단 시약의 합성 절차
1.1 항원 및 항원 접합체의 합성
7-{2-[2-(2-{(S)-3-[2-[(1R,7aR)-1-((R)-4,5-디히드록시-1,5-디메틸-헥실)-7a-메틸-옥타히드로-인덴-(4E)-일리덴]-에트-(Z)-일리덴]-4-메틸렌-시클로헥실옥시카르보닐아미노}-에톡시)-에톡시]-에틸카르바모일}-헵탄산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (도 1 에서 산의 NHS 에스테르) 의 합성
출발 물질 24,25-O-이소프로필리덴- 24R, 25-디히드록시비타민 D3 의 합성이 Sestelo, Jose Perez; Cornella, Ivan; De Una, Olga; Mourino, Antonio; Sarandeses, Luis A., Chemistry - A European Journal　(2002),　8(12),　2747-2752 에 의해 기재된다. 구조는 도 1 에 제시되어 있다.
100 ㎎ 의 출발 물질 및 26.8 ㎎ 의 DMAP 를 플라스크에서 건조시키고, 20 ㎖ 의 디클로로메탄을 첨가했다. 121 ㎕ 트리에틸아민의 첨가 후에 86.7 ㎎ 포스겐을 톨루엔 20% 용액으로서 첨가했다. 용액을 45 분 동안 불활성 분위기 하에 교반하고, 실온 (RT; RT 는 당업자에게 20℃ 내지 25℃ (68℉ 내지 77℉) 로서 알려져 있다) 에서 빛으로부터 보호하고, 10 ㎖ 디클로로메탄에 용해된 324.6 ㎎ 의 디아미노-디옥사-옥탄을 첨가했다. 혼합물을 추가로 밤새 동일한 조건 하에 교반했다. 생성물을 분취용 HPLC 에 의해 정제했다. 수율 = 72 ㎎.
55 ㎎ 의 아민 유도체를 밤새 실온 (RT) 에서 168 ㎎ 옥탄이산 비스 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 아세토니트릴 중 68 ㎕ 트리에틸아민과 반응시킴으로써 NHS 에스테르로 전환시켰다. 약 1g Dowex 50WXH 의 첨가에 의해 보호기를 절단하고 반응이 완료될 때까지 지속적으로 교반했다. 생성물을 분취용 HPLC 에 의해 정제했다. 수율 16 ㎎. HPLC-ESI-MS: M+ = 844.7 Da
항원 접합체의 합성:
5.63 ㎎ 의 상기 NHS 에스테르를 500 ㎕ DMSO 에 용해시키고, 50 ㎎ KLH (키홀 림펫 헤모시아닌, Sigma H 8283) 의 용액에 첨가했다. pH 를 pH= 8.3 로 조정하고, 용액을 밤새 교반했다. 혼합물을 Amicon 교반 셀 (stirred cell) 에서 정제했다.
아미노 기의 분석: 항원-KLH 비 대략 500:1
1.2 24,25-디히드록시비타민 D3 에 대한 항체의 생성
토끼 B-세포 PCR 에 의한 항체 발달:
24,25-디히드록시비타민 D3 에 대한 항체의 생성을 위해 16-주령 ZiKa 토끼를 KLH 에 커플링된 24,25-디히드록시비타민 D3 로 면역화시켰다. 모든 토끼를 반복되는 면역화에 적용했다. 첫번째 달에 동물을 1 주일에 1 회 면역화시켰다. 두번째 달 이후로부터 동물을 1 달에 1 회 면역화시켰다. 각각의 면역화를 위해 500 ㎍ KLH-커플링된 24,25-디히드록시비타민 D3 을 1 ㎖ 140 mM NaCl 에 용해시키고, 1 ㎖ CFA 중에 에멀전화했다. 면역화의 시작 후 days 45 및 105 에 역가의 발달을 평가했다. 면역원에 대한 역가가 ELISA 에 의해 탐지가능할 때, 항체를 Seeber et al. 2014 에 기재된 바와 같이 B-세포 클로닝에 의해 발달시켰다. 재조합 전장 토끼 IgG 를 HEK293 세포의 일시적 트랜스펙션에 의해 생산했다.
역가 분석:
24,25-디히드록시비타민 D3 에 대한 혈청 역가의 확인을 위해 24,25-디히드록시비타민 D3 의 비오틴일화된 변이체를 스트렙타비딘 코팅된 96-웰 플레이트에 커플링시켰다. 면역화 캠패인의 시작 후 day 45 및 day 105 에 각각의 토끼로부터 소량의 혈청을 수집했다. 비오틴일화된 24,25-디히드록시비타민 D3 을 플레이트 표면에 15 ng/㎖ 의 농도로 부동화시켰다. 각각의 토끼로부터의 혈청을 1% BSA 함유 PBS 중에 희석하고, 희석물을 플레이트에 첨가했다. 혈청을 희석률 1:300, 1:900, 1:2700, 1:8100, 1:24300, 1:72900, 1:218700 및 1:656100 에서 시험했다. 결합된 항체를 HRP-라벨링된 F(ab')2 염소 항-토끼 Fcγ (Dianova) 및 기질로서의 ABTS (Roche) 로 탐지했다.
실시예 2
결합 어세이에 24,25-디히드록시비타민 D 3 에 관한 차단 시약의 적용
어세이 절차에 따라, 24,25-디히드록시비타민 D3 에 특이적으로 결합하는 차단 시약 (예를 들어 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분, 또는 합성 항체 (플라스틱 항체)) 을 전처리 또는 방출 시약, 어세이 희석물 또는 어세이 완충액에 첨가하여 어세이의 각각의 라벨링된 결합 성분 (접합체) 전에 또는 그와 함께 샘플 중 비타민 D 화합물과 접촉되게 할 수 있다.
예로서 Elecsys® 비타민 D 총 면역어세이에서 24,25-디히드록시비타민 D3 의 차단이 기재된다:
ㆍ 0.075 ㎎/㎖ 의 mAb<24,25-디히드록시비타민 D3>rK-IgG 를 루테닐화된 비타민 D-결합 단백질 접합체를 함유하는 Elecsys® 비타민 D 총 면역어세이의 시약 R1 에 첨가했다.
ㆍ 비타민 D 총 어세이 적용을 비타민 D 대사산물이 없는 매트릭스 (범용 희석제) 중 25-히드록시비타민 D3 (○, 25(OH)D3) 또는 24,25-디히드록시비타민 D3 (●, 24,25(OH)2D3) 의 희석 시리즈로 실행했다.
ㆍ 레퍼런스 (차단 시약이 부재함) 는 25-히드록시비타민 D3 및 24,25-디히드록시비타민 D3 에 대한 교차반응성을 보였다 (표 1 및 도 2a)
ㆍ 차단 시약의 존재 하에서의 면역어세이 적용은 24,25-디히드록시비타민 D3 에 대한 감소된 교차반응성을 보였으며, 한편 25-히드록시비타민 D3 에 관한 특이성은 영향을 받지 않았다 (표 1 및 도 2b)
표 1: 25-히드록시비타민 D3 (25(OH)D3) 및 24,25-디히드록시비타민 D3 (24,25(OH)2D3) 에 관한 신호 동역학 (signal dynamics) 에 대한 mAb<24,25-디히드록시비타민 D3>rK-IgG 의 효과 (B/B0 로서 제시됨).
Figure pct00004
mAb<24,25-디히드록시비타민 D3>rK-IgG 의 양성 효과는 또한 25-히드록시비타민 D2 및 25-히드록시비타민 D3 에 관해서만 특이적인 LC-MS/MS 에 대한 개선된 상관관계에서 2 개의 상이한 샘플 세트에 관해 독립적으로 볼 수 있었다 (도 3a 및 3b). 차단제의 부재 (○) 하에서 상관관계는 0.92 (왼쪽) 또는 0.79 (오른쪽) 이다. mAb<24,25-디히드록시비타민 D3>rK-IgG 의 첨가 (●, mAb<24,25(OH)2D3>) 후에 상관관계는 각각 0.94 (왼쪽) 또는 0.90 (오른쪽) 으로 개선되었다.

Claims (15)

  1. 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 (in vitro) 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    a) 비타민 D-결합 단백질에 결합된 비타민 D 화합물을 포함하는 대상으로부터 얻어진 샘플을 제공하는 단계,
    b) 샘플을
    (ba) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 1 결합제와 24,25-디히드록시비타민 D3 사이의 복합체를 형성하며;
    (bb) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제와 혼합하여, 그에 의해 제 2 결합제와 25-히드록시비타민 D 사이의 복합체를 형성하는 단계;
    c) (bb) 에서 형성된 복합체를 측정하여, 그에 의해 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 샘플이 혈액, 혈청 또는 혈장인, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 비타민 D-결합 단백질에 결합된 샘플에 존재하는 비타민 D 화합물이 단계 (b) 에 앞서 방출 시약으로 비타민 D-결합 단백질로부터 방출되는, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - Kd(제 1 결합제) / Kd(제 2 결합제) 는 10 이하이고/거나;
    - Conc(제 1 결합제) / Conc(제 2 결합제) 는 최대 200 인 방법;
    여기에서 Kd(제 1 결합제) 는 24,25-디히드록시비타민 D3 에 관한 제 1 결합제의 친화도이고, Kd(제 2 결합제) 는 25-히드록시비타민 D 에 관한 제 2 결합제의 친화도이고,
    여기에서 Conc(제 1 결합제) 및 Conc(제 2 결합제) 는 단계 b) 에서의, 각각, 제 1 결합제 및 제 2 결합제의 몰농도이며, 특히 여기에서 Conc(제 1 결합제) 는 1*(1 내지 10) nmol/L 내지 200*(1 내지 10) nmol/L 범위이고/거나, Conc(제 2 결합제) 는 1 내지 10 nmol/L 범위임.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 24,25-디히드록시비타민 D3 에 대한 결합에 관한 제 1 결합제의 Kd 는 10-8　mol/L 이하이고/거나;
    - 25-히드록시비타민 D 에 대한 결합에 관한 제 2 결합제의 Kd 는 10-8　mol/L 이하인, 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 효소 결합 면역어세이 (ELISA), 전기화학발광 면역어세이 (ECLIA), 방사면역어세이 (RIA) 및 화학발광 면역어세이 (CLIA) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 25-히드록시비타민 D 는 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3 및 3-에피-25-히드록시비타민 D 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 결합제는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분이고, 제 2 결합제는 비타민 D-결합 단백질 또는 비타민 D-결합 단백질의 기능적 활성 부분인, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 결합제가 제 2 결합제와 적어도 동일한 24,25-디히드록시비타민 D3 에 대한 결합 친화도를 갖는, 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 결합제가 제 1 결합제에 결합된 24,25-디히드록시비타민 D3 를 방출할 수 없는, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 결합제가 25-히드록시비타민 D 에 대한 유의한 교차반응성을 갖지 않는, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 탐지의 시험관내 방법이 경쟁적 어세이로서 수행되는, 방법.
  13. 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 시험관내 방법의 용도.
  14. 대상으로부터 얻어진 샘플 중 24,25-디히드록시비타민 D3 에 의한 간섭 없이 25-히드록시비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 시험관내 방법에 있어서의, 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제 및 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제의 용도.
  15. 적어도 하기를 포함하는, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 키트:
    a) 24,25-디히드록시비타민 D3 에 결합하는 제 1 결합제, 여기에서 제 1 결합제는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 기능적 활성 부분임, 및
    b) 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 제 2 결합제, 여기에서 제 2 결합제는 비타민 D-결합 단백질임.
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