KR20230005936A - 치료 단백질에 대한 중화 항체 검정 - Google Patents

치료 단백질에 대한 중화 항체 검정 Download PDF

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수잔 어빈
마노즈 라자드약샤
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Abstract

본 발명은 일반적으로 치료 단백질에 대항하는 중화 항체 (NAb)의 존재에 대한 시험 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 치료 단백질에 대항하는 중화 항체의 검출을 위한 리간드 결합 검정 또는 세포-기반 검정에서 간섭 경쟁 약물에 대항하는 완화제의 사용에 관한 것이다.

Description

치료 단백질에 대한 중화 항체 검정
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2020년 5월 1일 출원된 미국 가특허출원 번호 63/018,821, 2020년 6월 19일 출원된 미국 가특허출원 번호 63/041,768 및 2021년 4월 8일 출원된 미국 가특허출원 번호 63/172,488의 우선권 및 이익을 주장하며, 이들 가특허출원은 각각 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 출원은 치료 단백질에 대항하는 중화 항체의 검출을 위한 진단 검정을 수행하기 위한 검정 방법, 모듈, 및 키트에 관한 것이다.
환자에 대한 생물학적 치료제의 투여는 환자에서 바람직하지 않은 면역원성 반응을 유도할 수 있고, 이는 항-약물 항체 (ADA)의 발달로 이어질 수 있다 (Mire-Sluis, A.R., 등, J Immunol Methods, 289(1):1-16 (2004)). 중화 항체 (NAb)는, 약물을 생물학적으로 불활성으로 만드는, 약물의 그의 표적에 대한 결합을 억제하는 ADA의 서브세트이다. 정의상, NAb는 약물의 효과를 중화시키고, 이는 잠재적으로 임상 활성을 감소시킨다. 추가로, 약물이 내인성 단백질의 생물학적 모방체인 경우, NAb는 약물의 내인성 유사체와 교차-반응할 수 있고, 이는 약물 안정성에 대한 중대한 결과를 가질 수 있다 (Finco, D., 등, J Pharm Biomed Anal,54(2):351-358 (2011); Hu, J., 등, J Immunol Methods, 419:1-8 (2015)).
면역원성 반응의 검출은, 전형적으로 브릿징 면역검정을 사용하여, ADA의 존재에 대해 샘플을 먼저 시험하는 단계적 접근을 수반한다 (Mire-Sluis, A.R., 등, J Immunol Methods, 289(1):1-16 (2004)). ADA 반응의 추가의 특성화는 ADA의 상대적 양을 결정하기 위한 역가 검정, 및 항체 반응이 중화되고 있는지의 여부를 결정하기 위한 검정을 포함할 수 있다 (Wu, B., 등, AAPS Journal, 18(6):1335-1350 (2016); Shankar, G, 등, J Pharm Biomed Anal 48(5):1267-1281 (2008); Gupta, S., 등, J Pharm Biomed Anal, 55(5):878-888 (2011)).
NAb 검정은 치료 단백질에 대항하는 중화의 정확한 정량을 막는 간섭을 받을 수 있다. 예를 들어, 내인성 약물 표적이 가용성인 경우, 이는 대상체 샘플 중에 존재하고 치료제와 경쟁적으로 결합하여, 위양성 NAb 신호를 생성할 수 있다. 또한 치료제의 이전 투여로부터 대상체 샘플 중에 잔류 약물이 존재할 수 있고, 이는 NAb에 경쟁적으로 결합하고 위음성 NAb 신호를 생성할 수 있다. 이들 간섭 원천을 처리하여 NAb의 정확한 정량을 얻기 위해 다양한 기술이 개발되었다 (Xu, W., 등, J Immunol Methods, 462:34-41 (2018); Xu, W., 등, J Immunol Methods, 416:94-104 (2015); Xiang, Y., 등, AAPS Journal, 21(1):4 (2019); Sloan, J.H., 등, Bioanalysis, 8(20):2157-2168 (2016)).
아직 특성화되지 않은 잠재적 간섭의 추가 원천은, 위양성 NAb 신호를 생성할, 치료제와 동일한 약물 표적에 경쟁적으로 결합하는, 시험되는 치료 단백질과 상이한 잔류 약물에 의한 간섭이다. 따라서, 이러한 유형의 간섭을 완화하는 전략도 현재까지 개발되지 않았다.
따라서, 치료 단백질에 대항하는 중화 항체의 검출을 위한 리간드 결합 검정 또는 세포-기반 검정에서 경쟁 약물로부터의 간섭을 식별하고 완화하는 방법에 대한 필요성이 존재함을 인지할 것이다.
요약
본 개시내용은 샘플에서 치료 단백질에 대한 중화제를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 예시적 구현예에서, 방법은 (a) 상기 중화제 및 경쟁 약물을 갖는 상기 샘플을 (i) 상기 치료 단백질, (ii) 상기 치료 단백질의 표적, 및 (iii) 완화제에 접촉시키는 단계; (b) 상기 표적에 대한 상기 치료 단백질의 결합을 측정하는 단계; 및 (c) (b)의 결과를 대조군 측정과 비교하여 상기 중화제를 검출하는 단계를 포함한다.
하나의 측면에서, 상기 대조군 측정은 중화제의 부재 하에 상기 표적에 대한 상기 치료 단백질의 결합을 측정함으로써 얻어진다. 또 다른 측면에서, 상기 중화제는 중화 항체이다.
하나의 측면에서, 상기 치료 단백질은 항체, 가용성 수용체, 항체-약물 컨쥬게이트, 또는 효소이다. 구체적 측면에서, 상기 치료 단백질은 모노클로날 항체이다. 또한 또 다른 구체적 측면에서, 상기 모노클로날 항체는 항-PD-1 항체, 항-TNF 항체, 항-PD-L1 항체, 항-EGFR 항체, 항-CD20 항체, 항-CD38 항체, 또는 항-LAG3 항체이다.
하나의 측면에서, 상기 치료 단백질은 이중특이적 항체이다. 구체적 측면에서, 상기 이중특이적 항체는 CD20xCD3 항체, BCMAxCD3 항체, EGFRxCD28 항체, 또는 CD38xCD28 항체이다.
하나의 측면에서, 상기 치료 단백질은 고체 지지체에 고정화된다. 또 다른 측면에서, 상기 치료 단백질은 검출을 위해 라벨링된다. 구체적 측면에서, 상기 라벨은 형광, 화학발광, 전기화학발광, 방사능, 또는 친화성 정제에 의해 검출가능하다. 또한 또 다른 구체적 측면에서, 상기 라벨은 루테늄을 포함한다.
하나의 측면에서, 상기 표적은 항원, 수용체, 리간드, 또는 효소 기질이다. 또 다른 측면에서, 상기 표적은 세포 표면 단백질이다. 또한 또 다른 측면에서, 상기 표적은 재조합 단백질이다. 또한 또 다른 측면에서, 상기 표적은 세포에 의해 발현된다. 구체적 측면에서, 상기 세포는 HEK293 세포, MOLP-8 세포, 주르캇(Jurkat) 세포, 또는 이들의 변형된 버전이다.
하나의 측면에서, 상기 표적은 고체 지지체에 고정화된다. 또 다른 측면에서, 상기 표적은 검출을 위해 라벨링된다. 구체적 측면에서, 상기 라벨은 형광, 화학발광, 전기화학발광, 방사능, 또는 친화성 정제에 의해 검출가능하다. 또 다른 측면에서, 상기 표적은 효소 기질이다. 또한 또 다른 측면에서, 상기 표적은 CD20, CD3, BCMA, PD-1, EGFR, CD28, CD38, TNF, PD-L1, 또는 LAG3이다. 또한 또 다른 측면에서, 상기 방법은 제2 표적을 추가로 포함한다.
하나의 측면에서, 상기 경쟁 약물은 모노클로날 항체이다. 구체적 측면에서, 상기 경쟁 약물은 리툭시맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 오크렐리주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토시투모맙, 우블리툭시맙, 세툭시맙, 다라투무맙, 또는 아달리무맙이다. 또 다른 측면에서, 상기 경쟁 약물은 이중특이적 항체이다.
하나의 측면에서, 상기 완화제는 모노클로날 항체이다. 또 다른 측면에서, 상기 방법은 2, 3, 4개 이상의 완화제의 사용을 포함한다.
하나의 측면에서, 상기 표적에 대한 상기 치료 단백질의 결합은, 수용체 인산화, 신호 전달 경로에서 하류 단백질의 인산화, 시토카인 방출, 세포 증식, 세포 사멸, 또는 2차 단백질 생성 측정에 의해 측정된다. 또 다른 측면에서, 상기 표적에 대한 상기 치료 단백질의 결합은 리포터 유전자의 발현에 의해 측정된다. 구체적 측면에서, 상기 리포터 유전자는 루시퍼라제이다.
하나의 측면에서, 상기 방법은 상기 치료 단백질 또는 상기 표적에 대한 상기 샘플의 접촉 전에 상기 완화제에 상기 샘플을 접촉시키는 전처리 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용은 또한, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 일부 예시적 구현예에서, 키트는 치료 단백질, 상기 치료 단백질의 표적, 상기 치료 단백질에 대항하는 중화제, 경쟁 약물, 및 완화제를 포함한다.
하나의 측면에서, 상기 키트는 상기 표적을 발현하는 세포를 추가로 포함한다. 구체적 측면에서, 상기 키트는 상기 표적에 대한 상기 치료 단백질의 결합에 반응하여 측정가능한 활성 또는 신호를 생성하는 세포를 추가로 포함한다. 또 다른 구체적 측면에서, 상기 활성은 루시퍼라제의 발현이다.
하나의 측면에서, 상기 표적은 고체 지지체에 고정화된다. 또 다른 측면에서, 상기 키트는 상기 치료 단백질에 부착된 라벨을 추가로 포함한다. 구체적 측면에서, 상기 라벨은 루테늄을 포함한다.
본 발명의 이들, 및 다른 측면은 하기 설명 및 첨부 도면과 함께 고려시 더 잘 인지되고 이해될 것이다. 하기 설명은, 다양한 구현예 및 그의 수많은 구체적 상세사항을 나타내지만, 제한적이 아니라 예시적으로 주어지는 것이다. 많은 치환, 변형, 부가, 또는 재배열이 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있다.
도 1a는 예시적 구현예에 따른 세포-기반 중화 항체 (NAb) 검정의 다이어그램을 나타낸다. 도 1b는 이중특이적 CD20xCD3 약물 항체의 농도 증가에 따른 루시퍼라제 활성 증가를 나타내며, 네가티브 대조군 항체는 예시적 구현예에 따라 루시퍼라제 신호를 유도하지 않는다. 도 1c는 예시적 구현예에 따른 2개의 이중특이적 BCMAxCD3 약물 항체의 농도 증가에 따른 루시퍼라제 활성 증가를 나타낸다.
도 2a는 예시적 구현예에 따른 치료 항체의 각각의 아암(arm)에 대항하는 중화 항체의 첨가시 세포-기반 NAb 검정의 다이어그램을 나타낸다. 도 2b는 예시적 구현예에 따른 이중특이적 CD20xCD3 약물 항체의 CD20 아암 또는 CD3 아암에 대항하는 대용(surrogate) 중화 항체의 농도 증가에 따른 루시퍼라제 활성 감소를 나타낸다.
도 2c는 예시적 구현예에 따른 이중특이적 BCMAxCD3 약물 항체의 BCMA 아암에 대항하는 대용 중화 항체의 농도 증가에 따른 루시퍼라제 활성 감소를 나타낸다. 도 2d는 예시적 구현예에 따른 이중특이적 BCMAxCD3 약물 항체의 CD3 아암에 대항하는 대용 중화 항체의 농도 증가에 따른 루시퍼라제 활성 감소를 나타낸다. 도 2e는 예시적 구현예에 따른 이중특이적 BCMAxCD3 약물 항체에 대한 NAb 검정으로의 이소타입 대조군 항체의 첨가시 루시퍼라제 활성의 변화가 없음을 나타낸다.
도 2f는 예시적 구현예에 따른 제2 이중특이적 BCMAxCD3 약물 항체의 BCMA 아암에 대항하는 대용 중화 항체의 농도 증가에 따른 루시퍼라제 활성 감소를 나타낸다. 도 2g는 예시적 구현예에 따른 제2 이중특이적 BCMAxCD3 약물 항체의 CD3 아암에 대항하는 대용 중화 항체의 농도 증가에 따른 루시퍼라제 활성 감소를 나타낸다. 도 2h는 예시적 구현예에 따른 제2 이중특이적 BCMAxCD3 약물 항체에 대한 NAb 검정으로의 이소타입 대조군 항체의 첨가시 루시퍼라제 활성의 변화가 없음을 나타낸다.
도 3a는 예시적 구현예에 따른 약물 표적 CD20에 대항하는 경쟁 항체의 첨가시 이중특이적 CD20xCD3 약물 항체에 대한 NAb 검정에서 루시퍼라제 활성 감소를 나타낸다. 도 3b는 예시적 구현예에 따른 약물 표적 CD3에 대항하는 경쟁 항체의 첨가시 이중특이적 CD20xCD3 약물 항체에 대한 NAb 검정에서 루시퍼라제 활성 감소를 나타낸다. 도 3c 및 도 3d는 예시적 구현예에 따른 약물 표적 BCMA 또는 CD3에 대항하는 경쟁 항체의 첨가시 이중특이적 BCMAxCD3 약물 항체에 대한 NAb 검정에서 루시퍼라제 활성 감소를 나타낸다. 도 3e 및 도 3f는 예시적 구현예에 따른 약물 표적 BCMA 또는 CD3에 대항하는 경쟁 항체의 첨가시 제2 이중특이적 BCMAxCD3 약물 항체에 대한 NAb 검정에서 루시퍼라제 활성 감소를 나타낸다.
도 4a는 예시적 구현예에 따른 치료 항체의 농도 증가에 따른 NAb 검정에서 루시퍼라제 활성 증가를 나타낸다. 나이브(na
Figure pct00001
ve) 인간 혈청의 첨가는 루시퍼라제 활성에 영향을 주지 않았다. 도 4b는 예시적 구현예에 따른 실험 샘플의 존재 하에 루시퍼라제 활성과 약물 대조군의 존재 하에 루시퍼라제 활성을 비교하는 것에 의한 NAb 검정 신호의 정량화를 예증한다.
도 5는 예시적 구현예에 따른 60개의 약물-나이브 임상 샘플로부터의 세포-기반 NAb 검정 결과를 나타낸다.
도 6은 예시적 구현예에 따른 NAb 검정 신호와 임상 샘플에서의 리툭시맙의 농도 사이의 상관관계를 나타낸다.
도 7a는 예시적 구현예에 따른 리툭시맙의 첨가시 세포-기반 NAb 검정의 다이어그램을 나타낸다. 도 7b는 예시적 구현예에 따른 리툭시맙 및 리툭시맙에 대항하는 완화 항체의 첨가시 NAb 검정의 다이어그램을 나타낸다. 도 7c는 예시적 구현예에 따른 리툭시맙에 대항하는 완화 항체의 첨가시 NAb 검정에서의 루시퍼라제 활성의 복원을 나타낸다.
도 8은 예시적 구현예에 따른 리툭시맙에 대항하는 완화 항체의 첨가시 약물-나이브 임상 샘플에서의 위양성 NAb 검정 신호의 감소를 나타낸다.
도 9a는 예시적 구현예에 따른 표적-포획 리간드 결합 NAb 검정의 다이어그램을 나타낸다. 도 9b는 예시적 구현예에 따른 치료 단백질의 아암에 대항하는 NAb의 첨가시 표적-포획 리간드 결합 NAb 검정의 다이어그램을 나타낸다. 도 9c는 예시적 구현예에 따른 약물-포획 리간드 결합 NAb 검정의 다이어그램을 나타낸다.
도 10a는 예시적 구현예에 따른 경쟁 약물의 첨가시 리간드 결합 NAb 검정의 다이어그램을 나타낸다. 도 10b는 예시적 구현예에 따른 경쟁 약물의 농도 증가에 따른 리간드 결합 NAb 검정에서의 위양성 신호 억제의 증가를 나타낸다.
도 11a는 예시적 구현예에 따른 경쟁 약물 및 경쟁 약물에 대항하는 완화 항체의 첨가시 리간드 결합 NAb 검정의 다이어그램을 나타낸다. 도 11b는 예시적 구현예에 따른 경쟁 약물에 대항하는 완화 항체의 첨가시 위양성 NAb 검정 신호의 제거를 나타낸다.
상세한 설명
치료 단백질은 다양한 인간 질환을 치료하기 위해 사용되는 약물의 중요한 부류이다. 그러나, 치료 단백질은 투여된 수용자에서 면역 반응을 유발하여, 항-약물 항체 (ADA)를 생성할 수 있다. 중화 항체 (NAb)는 치료 단백질의 생물학적 활성을 차단함으로써 환자 안전성에 잠재적으로 영향을 미치고 약물 효능의 손실을 매개할 수 있는 ADA의 하위집단이다. 따라서, NAb의 특성화 및 모니터링은 면역원성 평가의 중요한 측면이며, 치료 작용 메커니즘을 반영하는 민감하고 신뢰성 있는 방법을 필요로 한다 (Wu, B., 등, AAPS Journal, 18(6):1335-1350 (2016)).
NAb 검정은 적절한 민감성, 특이성, 선택성, 및 정밀성으로 NAb를 신뢰성 있게 검출하도록 기대된다. 세포-기반 및 비-세포-기반 검정 둘 다 NAb 평가에 대한 옵션이다. 일반적으로, NAb 검정은 치료 단백질에 대한 표적, 및 그의 표적에 대한 치료 단백질 결합에 대한 반응으로서 신호 출력에 대한 메커니즘을 제시하여, 결합의 정량을 가능하게 한다. NAb가 공동-인큐베이션 샘플 중에 존재하는 경우, 이들은 표적에 대한 치료 단백질의 결합을 억제하여, 신호 출력을 감소시키고 샘플에서의 NAb의 정량을 가능하게 할 것이다.
샘플 매트릭스는, 예를 들어 NAb, 치료 단백질 또는 표적과 직접 상호작용함으로써, NAb의 정확한 정량을 막는 간섭제를 포함할 수 있다. NAb와 상호작용하고 이를 점유함으로써 간섭할 수 있는 매트릭스 성분은, 예를 들어, 치료 단백질의 이전 투여로부터의 잔류 약물을 포함한다. 치료 단백질과 상호작용하고 이를 점유함으로써 간섭할 수 있는 또 다른 성분은, 예를 들어, 가용성 약물 표적을 포함한다. 이들 간섭제는 선행 기술에서 특성화되었고, 이들 간섭 원천을 처리하여 NAb의 정확한 정량을 얻기 위해 기술이 개발되었다 (Xu, W., 등, J Immunol Methods, 462:34-41 (2018); Xu, W., 등, J Immunol Methods, 416:94-104 (2015); Xiang, Y., 등, AAPS Journal, 21(1):4 (2019); Sloan, J.H., 등, Bioanalysis, 8(20):2157-2168 (2016)).
그러나, 아직 특성화되거나 다루어지지 않은 또 다른 가능한 간섭 물질은, 시험되는 치료 단백질과 별개인, 대상체 샘플에서의 잔류 경쟁 약물이며, 이는 치료 단백질의 표적과 상호작용하고 이를 점유하여, NAb의 위양성 정량을 초래할 수 있다.
치료 단백질에 대항하는 중화 항체를 정확하게 측정하는 문제를 해결하기 위해, 중화 항체 검정에서 간섭을 막기 위해 경쟁 약물에 대항하는 완화제를 사용하기 위한 방법 및 키트가 본원에 기재된다. 또한, 치료 단백질의 표적에 경쟁적으로 결합하는 약물로부터의 NAb 검정에서의 간섭의 검출이 본원에 개시된다. 이 간섭은 NAb 검정에서의 치료 단백질 결합 신호 또는 활성의 감소 및 위양성 NAb 검정 신호를 초래할 수 있다. 이 간섭을 극복하기 위해, 표적에 대한 경쟁 약물의 결합을 감소시켜, 치료 단백질이 그의 표적에 결합할 수 있게 하고, 정확한 NAb 검정 신호를 복원시키는 완화제가 사용될 수 있다.
잔류 경쟁 약물로부터의 간섭은, 예를 들어 실시예 5 및 6에서 입증되는 바와 같이, 임상적 사용을 위한 치료 단백질의 시험 동안 NAb를 정확하게 평가하는 데 있어 심각한 문제이다. 환자가 이미 요법의 제1 라인을 투여받은 후에 신규한 치료제가 시험될 수 있으며, 이는 동일한 표적과 경쟁적으로 상호작용할 수 있다. 이들 경우, 경쟁 약물로부터의 간섭은 식별되고 완화되어야 한다. 예를 들어, B-세포 성숙 항원 (BCMA) 또는 CD3의 공유 표적을 갖는 수많은 약물 후보물이 표 1에 열거되어 있다. 많은 경쟁 약물이 존재할 수 있는 다른 치료 표적은, 예를 들어, 하기를 포함한다: 세툭시맙 등의 약물 또는 약물 후보물에 의해 표적화될 수 있는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); CD28; 다라투무맙 등의 약물 또는 약물 후보물에 의해 표적화될 수 있는 CD38; 림프구-활성화 유전자 3 (LAG3); 세미플리맙, 펨브롤리주맙, 또는 니볼루맙 등의 약물 또는 약물 후보물에 의해 표적화될 수 있는 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1); 프로그래밍된 사멸-리간드 1 (PD-L1); 아달리무맙 등의 약물 또는 약물 후보물에 의해 표적화될 수 있는 종양 괴사 인자 (TNF); 또는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토시투모맙, 또는 우블리툭시맙 등의 약물 또는 약물 후보물에 의해 표적화될 수 있는 CD20. 본원의 개시내용은 이들, 및 다른 약물 및 약물 후보물로부터의 NAb 검정 간섭을 완화하기에 적합한 방법을 교시한다.
표 1. 공유 표적을 갖는 약물 후보물의 예
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달리 기재되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 물질을 이제 기재한다.
용어 "a"는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고, 용어 "약" 및 "대략"은 당업계의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 표준 변동을 허용하는 것으로 이해되어야 하며, 범위가 제공되는 경우, 종점이 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다" 및 "포함하는"("include", "includes", 및 "including")은 비-제한적인 것으로 의도되며, 각각 "포함하다" 및 "포함하는"("comprise", "comprises", 및 "comprising")을 의미하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질" 또는 "관심 단백질"은 공유 연결된 아미드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함할 수 있다. 단백질은, 당업계에서 일반적으로 "폴리펩티드"로서 공지된 하나 이상의 아미노산 중합체 사슬을 포함한다. "폴리펩티드"는 아미노산 잔기, 관련 자연 발생 구조 변이체, 및 펩티드 결합을 통해 연결된 그의 합성 비-자연 발생 유사체, 관련 자연 발생 구조 변이체, 및 그의 합성 비-자연 발생 유사체로 구성된 중합체를 지칭한다. "합성 펩티드 또는 폴리펩티드"는 비-자연 발생 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 합성 펩티드 또는 폴리펩티드는, 예를 들어, 자동화된 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 다양한 고체 상 펩티드 합성 방법이 당업계의 기술자에게 공지되어 있다. 단백질은 단일 기능화 생체분자를 형성하도록 하나 이상의 다수의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 단백질은 항체 단편, 나노바디, 재조합 항체 키메라, 시토카인, 케모카인, 펩티드 호르몬 등을 포함할 수 있다. 관심 단백질은 생물-치료 단백질, 연구 또는 치료법에 사용되는 재조합 단백질, 트랩 단백질 및 다른 키메라 수용체 Fc-융합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 및 이중특이적 항체 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 단백질은, 곤충 바큘로바이러스 시스템, 효모 시스템 (예: 피키아종(Pichia sp.), 포유류 시스템 (예: CHO 세포 및 CHO-K1 세포 등의 CHO 유도체) 등의 재조합 세포-기반 생성 시스템을 사용하여 생성될 수 있다. 생물-치료 단백질 및 그의 생성을 논의하는 최근의 검토에 대하여, 하기 문헌을 참조한다: Ghaderi 등, "Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation" (Darius Ghaderi 등, Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation, 28 BIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING REVIEWS 147-176 (2012), 이들의 전체 교시내용은 본원에 포함됨). 단백질은 조성 및 용해도에 기초하여 분류될 수 있고, 그에 따라 단순 단백질, 예컨대 구상 단백질 및 섬유상 단백질; 컨쥬게이션된 단백질, 예컨대 핵단백질, 당단백질, 점액단백질, 색소단백질, 인단백질, 금속단백질, 및 지질단백질; 및 유도 단백질, 예컨대 1차 유도 단백질 및 2차 유도 단백질을 포함할 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 관심 단백질은 재조합 단백질, 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 항체 단편, 모노클로날 항체, 융합 단백질, scFv 및 이들의 조합일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 단백질"은 적합한 숙주 세포 내로 도입된 재조합 발현 벡터 상으로 운반된 유전자의 전사 및 번역의 결과로 생성된 단백질을 지칭한다. 특정 예시적 구현예에서, 재조합 단백질은 항체, 예를 들어, 키메라, 인간화된, 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 재조합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 이소타입의 항체일 수 있다: IgG (예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA1, IgA2, IgD, 또는 IgE. 특정 예시적 구현예에서, 항체 분자는 전장 항체 (예: IgG1 또는 IgG4 면역글로불린)이거나 또는 대안적으로 항체는 단편 (예: Fc 단편 또는 Fab 단편)일 수 있다.
용어 "항체"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 2개의 중 (H)쇄 및 2개의 경 (L)쇄인 4개의 폴리펩티드 사슬, 뿐만 아니라 그의 다량체 (예: IgM)를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 (CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변성의 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 본 발명의 상이한 구현예에서, 항-big-ET-1 항체 (또는 그의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식계열 서열과 동일할 수 있거나 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 2개 이상의 CDR의 사이드-바이-사이드(side-by-side) 분석에 기초하여 정의될 수 있다. 용어 "항체"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 또한 전체 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등의 용어는, 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생의, 효소적으로 수득가능한, 합성, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 항체 가변 및 임의로 불변 도메인을 코딩하는 DNA의 조종 및 발현을 수반하는 재조합 유전 공학 기술 또는 단백질분해 소화 등의 임의의 적합한 표준 기술을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/거나 예를 들어 상업적 공급원, DNA 라이브러리 (예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 쉽게 입수가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는, 예를 들어, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 구성으로 배열하거나, 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노산을 변형, 부가 또는 결실시키는 것 등을 위해, 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용함으로써 시퀀싱되고 조종될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항체 단편"은, 예를 들어, 항체의 항원-결합 또는 가변 영역 등의 온전한 항체의 일부를 포함할 수 있다. 항체 단편의 예는, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디, dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 영역, 뿐만 아니라 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. Fv 단편은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 조합이고, ScFv 단백질은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 사슬 폴리펩티드 분자이다. 일부 예시적 구현예에서, 항체 단편은 모(parent) 항체가 결합하는 것과 동일한 항원에 결합하는 단편인 모 항체의 충분한 아미노산 서열을 포함하고; 일부 예시적 구현예에서, 단편은 모 항체의 것과 유사한 친화도로 항원에 결합하고/거나 항원에 대한 결합에 대하여 모 항체와 경쟁한다. 항체 단편은 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생성될 수 있고/거나 이는 부분적 항체 서열을 코딩하는 유전자로부터 재조합 생성될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항체 단편은 완전히 또는 부분적으로 합성적으로 생성될 수 있다. 항체 단편은 임의로 단일 사슬 항체 단편을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항체 단편은, 예를 들어, 디술피드 연결에 의해, 함께 연결된 다수의 사슬을 포함할 수 있다. 항체 단편은 임의로 다중-분자 복합체를 포함할 수 있다. 기능적 항체 단편은 전형적으로 적어도 약 50개의 아미노산을 포함하고, 보다 전형적으로는 적어도 약 200개의 아미노산을 포함한다.
용어 "이중특이적 항체"는 2개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로, 각각의 중쇄가, 2개의 상이한 분자 (예: 항원) 상의 또는 동일한 분자 상의 (예: 동일한 항원 상의), 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 2개의 상이한 중쇄를 포함한다. 이중특이적 항체가 2개의 상이한 에피토프 (제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도는 일반적으로 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도보다 적어도 1 내지 2 또는 3 또는 4 자릿수 더 낮을 것이고, 그 반대도 마찬가지이다. 이중특이적 항체에 의해 인식되는 에피토프는 동일한 또는 상이한 표적 (예: 동일한 또는 상이한 단백질) 상에 있을 수 있다. 이중특이적 항체는, 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄를 조합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 코딩하는 핵산 서열이 상이한 중쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열이 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다.
전형적인 이중특이적 항체는 각각 3개의 중쇄 CDR, 그 후 CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는 2개의 중쇄, 및 항원-결합 특이성을 부여하지 않지만 각각의 중쇄와 회합될 수 있는, 또는 각각의 중쇄와 회합될 수 있고 중쇄 항원-결합 영역에 의해 결합된 에피토프 중 하나 이상에 결합할 수 있는, 또는 각각의 중쇄와 회합될 수 있고 하나 또는 둘 다의 에피토프에 중쇄 중 하나 또는 둘 다 결합하게 할 수 있는 면역글로불린 경쇄를 갖는다. BsAb는 Fc 영역을 갖는 것들 (IgG-유사) 및 Fc 영역이 없는 것들의 2개의 주요 부류로 나뉠 수 있고, 여기서 후자는 통상적으로 Fc를 포함하는 IgG 및 IgG-유사 이중특이적 분자보다 작다. IgG-유사 bsAb는, 트리오맙, 놉스 인투 홀스(knobs into holes) IgG (kih IgG), crossMab, orth-Fab IgG, 이중-가변 도메인 Ig (DVD-Ig), 투인원(two-in-one) 또는 이중 작용 Fab (DAF), IgG-단일-사슬 Fv (IgG-scFv), 또는 κλ-바디 등의, 그러나 이에 제한되지는 않는 상이한 포맷을 가질 수 있다. 상이한 비-IgG-유사 포맷은 탠덤(tandem) scFv, 디아바디 포맷, 단일-사슬 디아바디, 탠덤 디아바디 (TandAb), 이중-친화도 재표적화 분자 (DART), DART-Fc, 나노바디, 또는 도크-앤-락(dock-and-lock; DNL) 방법에 의해 생성된 항체 (Gaowei Fan, Zujian Wang & Mingju Hao, Bispecific antibodies and their applications, 8 JOURNAL OF HEMATOLOGY & ONCOLOGY 130; Dafne
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& Roland E. Kontermann, Bispecific Antibodies, HANDBOOK OF THERAPEUTIC ANTIBODIES 265-310 (2014), 이것의 전체 교시내용은 본원에 포함됨)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "다중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 이러한 분자는 통상적으로 단지 2개의 항원에 결합할 것이지만 (즉, 이중특이적 항체, BsAb), 삼중특이적 항체 및 KIH 삼중특이적 등의 추가의 특이성을 갖는 항체가 또한 본원에 개시된 시스템 및 방법에 의해 다루어질 수 있다.
용어 "모노클로날 항체"는 본원에서 사용되는 바와 같이 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체로 제한되지 않는다. 모노클로날 항체는, 당업계에서 이용가능한 또는 공지된 임의의 수단에 의해, 임의의 진핵생물, 원핵생물, 또는 파지 클론을 포함한 단일 클론으로부터 유래될 수 있다. 본 개시내용에서 유용한 모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합의 사용을 포함한 당업계에 공지된 폭넓게 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 관심 단백질은 포유류 세포로부터 생성될 수 있다. 포유류 세포는 인간 기원 또는 비-인간 기원의 것일 수 있고, 1차 상피 세포 (예: 각질세포, 자궁경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포), 확립된 세포 라인 및 그의 균주 (예: 293 배아 신장 세포, BHK 세포, HeLa 자궁경부 상피 세포 및 PER-C6 망막 세포, MDBK (NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, CHO 세포, BeWo 세포, 창(Chang) 세포, 디트로이트(Detroit) 562 세포, HeLa 229 세포, HeLa S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LSI80 세포, LS174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK2 세포, 클론(Clone) M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, Y-l 세포, LLC-PKi 세포, PK(15) 세포, GHi 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MHiCi 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포, 및 TH-I, B1 세포, BSC-1 세포, RAf 세포, RK-세포, PK-15 세포 또는 이들의 유도체), 임의의 조직 또는 장기로부터의 섬유아세포 세포 (심장, 간, 신장, 결장, 내장, 식도, 위, 신경 조직 (뇌, 척수), 폐, 혈관 조직 (동맥, 정맥, 모세혈관), 림프 조직 (림프선, 아데노이드, 편도선, 골수, 및 혈액), 비장, 및 섬유아세포 및 섬유아세포-유사 세포 라인 (예: CHO 세포, TRG-2 세포, IMR-33 세포, 돈(Don) 세포, GHK-21 세포, 시트룰린혈증 세포, 뎀프시(Dempsey) 세포, 디트로이트 551 세포, 디트로이트 510 세포, 디트로이트 525 세포, 디트로이트 529 세포, 디트로이트 532 세포, 디트로이트 539 세포, 디트로이트 548 세포, 디트로이트 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, 미디(Midi) 세포, CHO 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, 베로(Vero) 세포, DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C3H/IOTI/2 세포, HSDMiC3 세포, KLN205 세포, McCoy 세포, 마우스(Mouse) L 세포, 균주 2071 (마우스 L) 세포, L-M 균주 (마우스 L) 세포, L-MTK' (마우스 L) 세포, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포, 스위스(Swiss)/3T3 세포, 인도 문착(Indian muntjac) 세포, SIRC 세포, Cn 세포, 및 젠센(Jensen) 세포, Sp2/0, NS0, NS1 세포 또는 이들의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료 단백질"은 질환 또는 장애의 치료를 위해 대상체에게 투여될 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다. 일부 예시적 구현예에서, 치료 단백질은 암의 치료를 향해 지향될 수 있다. 치료 단백질은 약리학적 효과를 갖는 임의의 단백질, 예를 들어, 항체, 가용성 수용체, 항체-약물 컨쥬게이트, 또는 효소일 수 있다. 일부 예시적 구현예에서, 치료 단백질은 이중특이적 CD20xCD3 항체일 수 있다. 일부 예시적 구현예에서, 치료 단백질은 이중특이적 BCMAxCD3 항체일 수 있다. 일부 예시적 구현예에서, 치료 단백질은 세미플리맙 등의 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1)에 대항하는 모노클로날 항체일 수 있다. 다른 구현예에서, 치료 단백질은 이중특이적 EGFRxCD28 항체, 이중특이적 CD38xCD28 항체, 모노클로날 항-TNF 항체, 모노클로날 항-PD-L1 항체, 모노클로날 항-EGFR 항체, 모노클로날 항-CD20 항체, 모노클로날 항-CD38 항체, 또는 모노클로날 항-LAG3 항체일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적"은 약리학적 효과를 달성하기 위해 치료 단백질과 특이적으로 상호작용할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 예를 들어, 항체의 표적은 이것이 그에 대항하여 지향되는 항원일 수 있고; 리간드의 표적은 이것이 우선적으로 결합하는 수용체일 수 있고, 그 반대도 마찬가지이고; 효소의 표적은 이것이 우선적으로 결합하는 기질일 수 있고; 기타 등등이다. 단일 치료 단백질은 하나 초과의 표적을 가질 수 있다. 다양한 표적이, 특정 응용에 따라, 본 발명의 방법에서의 사용에 적합하다. 표적은, 예를 들어, 세포 표면 상에 존재할 수 있거나, 가용성일 수 있거나, 세포액(cytosolic)일 수 있거나, 고체 표면 상에 고정화될 수 있다. 표적은 재조합 단백질일 수 있다. 일부 예시적 구현예에서, 표적은 CD20, CD3, BCMA, PD-1, EGFR, CD28, CD38, TNF, PD-L1, 또는 LAG3일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항-약물 항체" 또는 "ADA"는 치료 단백질 상의 에피토프를 표적화하는 대상체의 면역 시스템에 의해 생성된 항체를 지칭한다. ADA의 서브세트는 치료 단백질의 약리학적 활성을 억제하거나 중화시키는 방식으로 그에 결합할 수 있는 "중화 항체" 또는 "NAb"이다. NAb는 치료 단백질의 임상적 효능에 영향을 줄 수 있고, 따라서 치료 단백질이 대상체에게 투여될 때 모니터링되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중화제"는 치료 단백질의 약리학적 활성을 억제하거나 중화시키는 방식으로 치료 단백질과 상호작용할 수 있는 분자를 지칭한다. 중화제는, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 예컨대 압타머, 또는 단백질, 예컨대 항체일 수 있다. 중화제는 다양한 공급원으로부터, 예를 들어, 화학적 합성에 의해, 재조합 생성에 의해, 또는 대상체의 면역 시스템으로부터 발생할 수 있다. 단순성을 위해, 대상체의 면역 시스템에 의해 생성된 중화 항체 (NAb)가 본원에서 논의되는 1차 중화제이지만, 본 발명의 방법은 임의의 중화제의 검출에 적용될 수 있음을 이해하여야 한다.
NAb는 다양한 검정을 사용하여 모니터링될 수 있다. NAb 검정은 광범위하게 세포-기반 검정 또는 비-세포-기반 검정으로 나뉠 수 있다. 세포-기반 검정 대 비-세포-기반 검정의 선택은 치료 단백질, 표적, 및 해당 응용에 따라 달라지며, 당업계의 기술자는 그의 필요에 따라 검정을 선택할 수 있을 것이다.
세포-기반 검정은 적어도 하나의 유형의 세포를 포함한다. 치료 단백질은 세포 이벤트가 영향받도록 표적에 결합할 수 있고, 이는 이어서 치료 단백질 결합의 출력으로서 측정될 수 있다. 측정가능한 신호 또는 활성을 제공하는 유용한 세포 이벤트는, 예를 들어, 수용체 인산화, 신호 전달 경로에서 하류 단백질의 인산화, 시토카인 방출, 세포 증식, 세포 사멸, 2차 단백질의 생성, 또는 임의의 다른 세포 활성을 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 표적에 대한 치료 단백질 결합에 의해 야기되는 세포 이벤트에 반응하여 발현되는 리포터 유전자가 사용될 수 있으며; 예를 들어, 형광 단백질, 예컨대 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 또는 임의의 이들의 변이체이다.
표적에 대한 치료 단백질 결합에 의해 생성되는 신호의 측정, 및 NAb에 의한 그 신호의 억제의 측정은, "직접적" 세포-기반 검정이라 불릴 수 있다. 역으로, "간접적" 세포-기반 검정에서, 표적에 대한 치료 단백질의 결합은 측정가능한 신호를 억제하고, 그 신호의 복원이 NAb의 검출에 사용된다. 단순성을 위해, 논의는 직접적 세포-기반 검정으로 제한될 것이지만, 본원에 기재된 방법은 간접적 세포-기반 검정에 동등하게 적용될 수 있다.
치료 이중특이적 항체에 의해 브릿징될 때 측정가능한 세포 이벤트를 생성하는 2개의 유형의 세포를 포함하는 세포-기반 NAb 검정이 본원에 개시된다. 세포의 각각의 유형은 이중특이적 항체의 하나의 아암에 의해 인식되는 항원인 표적을 그의 세포 표면 상에 제시할 수 있다. 두 표적 모두의 동시 결합은 두 세포를 브릿징하고 치료 단백질 결합의 표시로서 측정될 수 있는 하류 세포 이벤트를 생성한다. 세포-기반 NAb 검정에 사용되는 세포의 예는 인간 CD20을 발현하는 HEK293/hCD20 세포, BCMA를 내인적으로 발현하는 MOLP-8 세포, 및 주르캇/NFAT-Luc 세포를 포함한다. 주르캇/NFAT-Luc 세포는 그의 세포 표면 상에서 CD3 및 T-세포 수용체 (TCR)를 발현한다. 이중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 CD20xCD3 항체 또는 이중특이적 BCMAxCD3 항체가 이 세포와 제2 세포를 브릿징하면, TCR은 신호 전달 경로를 개시하여 루시퍼라제 리포터의 발현을 초래하여, 측정가능한 신호를 생성한다. 이 신호는, 실시예에서 추가로 기재되는 바와 같이, 검정에서 NAb의 존재에 의해 또는 경쟁 약물에 의해 감소될 수 있다.
세포가 표적을 발현하거나 발현하도록 변형될 수 있고/거나, 측정가능한 신호 또는 활성을 생성함으로써 치료 단백질 및 표적의 결합에 반응할 수 있는 한, 시험되는 치료 단백질 및 표적에 따라 많은 유형의 세포가 본 발명의 세포-기반 검정에서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 세포의 비-제한적 예는 HEK293 세포, HEK293/hCD20 세포, HEK293/MfBCMA 세포, HEK293/hBCMA 세포, NCI-H929 세포, MOLP-8 세포, 주르캇 세포, 주르캇/NFAT-Luc 세포, 주르캇/NFAT-Luc/MfCD3 세포, 및 이들의 변형된 버전을 포함한다.
비-세포-기반 검정은 세포의 부재 하에 NAb의 존재를 검출할 수 있다. 비-세포-기반 검정의 하나의 유형은 경쟁적 리간드 결합 (CLB) 검정이라 불린다. CLB 검정, 또는, 본원에서 언급되는 바와 같이, 리간드 결합 검정은, 표적에 대한 치료 단백질의 결합을 측정하며, 이는 예를 들어 정제된 재조합 단백질, 또는 제조된 세포 막과 회합되는 네이티브 표적일 수 있다. 표적은 마이크로플레이트 또는 비드 등의 고체 지지체 상에 고정화되어, 라벨링된 치료 단백질의 포획을 가능하게 할 수 있고, 그 라벨의 검출이 결합 측정에 사용될 수 있다. 샘플에서의 NAb는 표적에 대한 치료 단백질의 결합을 차단하여, 신호를 감소시킬 것이다. 대안적으로, 치료 단백질은 고체 표면에 고정화될 수 있으며, 가용성 표적은 라벨링되고, 다른 경우에도 동일한 원리가 적용된다. 라벨은 검출가능하고/거나, 예를 들어, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 방사능, 또는 친화성 정제에 의해 신호 또는 활성을 생성할 수 있다.
표적에 결합하는 치료 단백질에 의해 생성되는 신호의 측정, 및 NAb에 의한 그 신호의 억제의 측정은, 직접적-결합 검정이라 불릴 수 있다. 역으로, 간접적-결합 검정에서는, 표적에 대한 치료 단백질의 결합이 측정가능한 신호를 억제하고, 그 신호의 복원이 NAb의 검출에 사용된다. 단순성을 위해, 논의는 직접-결합 검정으로 제한될 것이지만, 본원에 기재된 방법은 간접-결합 검정에 동등하게 적용될 수 있다.
아비딘-코팅된 마이크로플레이트 상에 고정화된, 또한 루테닐화된 치료 단백질, 예를 들어 세미플리맙과 공동-인큐베이션된 비오틴화된 표적, 예를 들어 PD-1을 포함하는 리간드 결합 NAb 검정이 본원에 개시된다. 고정화된 PD-1에 대한 라벨링된 세미플리맙의 결합은 이 결합 측정에 사용될 수 있는 신호의 검출을 가능하게 한다. 실시예에서 추가로 논의되는 바와 같이, 검정에서 NAb 또는 경쟁 약물의 존재는 이 신호를 감소시킬 수 있다.
비-세포-기반 검정의 제2 유형은 효소 활성-기반 검정이라 불린다. 효소 활성-기반 검정은, 적합한 기질을 생성물로 전환함으로써, 그의 작용 메커니즘과 생물학적으로 관련된 반응을 촉매하는 효소 약물 생성물의 능력을 측정한다. 효소 활성은 효소의 그의 기질에 대한 결합을 직접 측정함으로써, 또는 생성된 생성물의 양을 측정함으로써 측정될 수 있다. 검정에서 NAb 또는 경쟁 약물의 존재는 생성물의 감소된 생성 또는 감소된 결합에 의해 나타날 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 또한 효소 활성-기반 검정에서의 NAb의 정확한 정량에 적용가능하다.
샘플에서의 NAb의 존재를 검출하기 위해, NAb 검정은 실험 조건 및 대조군 조건을 포함하여야 한다. 실험 조건은 NAb의 존재에 대하여 시험되는 샘플을 포함한다. 대조군 조건은, 예를 들어, NAb를 포함하지 않는 것으로 알려진, 네가티브 대조군 조건일 수 있다. 신호 또는 활성은 표적에 대한 치료 단백질 결합의 척도로서 NAb 검정에서 생성되고, 대조군 조건과 비교하여 실험 조건에서 상기 신호의 감소는 치료 단백질의 중화, 또한 그에 따라 실험 조건에서 NAb의 존재의 척도이고, 이는 예를 들어 도 4b에서 예증된 바와 같다.
역으로, 포지티브 대조군 조건은 NAb 또는 또 다른 중화제를 포함하는 것으로 알려져 있을 수 있고, 예를 들어, NAb 검정을 검증하거나 그의 신호를 보정하는 데 사용될 수 있다.
실험 조건과 대조군 조건 사이의 신호 변화는 또한 간섭제로부터의 간섭에 의해 야기될 수 있다. 샘플에서의 NAb의 존재가 정확히 검출될 수 있도록 상기 간섭을 감소시키는 방법이 본원에 개시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "간섭제"는 NAb의 정확한 측정에 간섭할 수 있는 NAb 검정 또는 샘플 매트릭스 중에 존재하는 임의의 분자를 지칭한다. 간섭은 NAb, 치료 단백질, 치료 단백질 표적, 또는 NAb 검정의 임의의 성분과의 회합에 의해 야기될 수 있다. 간섭제의 예는 치료 단백질의 가용성 표적, 치료 단백질과 유사한 서열을 갖고 그에 따라 동일한 NAb에 의해 표적화되는 단백질, 또는 치료 단백질의 이전 투여로부터의 잔류 약물을 포함할 수 있다.
간섭제의 특정 부류는, 치료 단백질이 아닌, 그러나 NAb 검정의 성분에, 예컨대 치료 단백질 표적에 경쟁적으로 결합할 수 있는, 샘플 매트릭스 중에 존재하는 "경쟁 약물"일 수 있다. 경쟁 약물은 대상체에게 이전에 투여된 잔류 약물일 수 있다. 일부 예시적 구현예에서, 경쟁 약물은, 예를 들어, CD20, CD3, BCMA, PD-1, EGFR, CD28, CD38, TNF, PD-L1, 또는 LAG3을 포함한 치료 표적에 경쟁적으로 결합할 수 있다. 일부 예시적 구현예에서, 경쟁 약물은 표 1에 열거된 약물 또는 약물 후보물 중 임의의 것일 수 있다. 일부 예시적 구현예에서, 경쟁 약물은 리툭시맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 오크렐리주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토시투모맙, 우블리툭시맙, 세툭시맙, 다라투무맙, 또는 아달리무맙일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "완화제"는 NAb 검정에서 간섭을 감소시키거나 막고 샘플에서의 NAb의 정확한 검출을 가능하게 하도록 간섭제에 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 간섭제와 특이적으로 상호작용하고 NAb, 치료 단백질, 표적, 또는 NAb 검정의 다른 성분과의 그의 간섭을 막을 수 있는 임의의 분자가 적합한 완화제일 수 있다. 완화제는, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 예컨대 압타머, 또는 단백질, 예컨대 항체일 수 있다. 일부 예시적 구현예에서, 완화제는 경쟁 약물에 대항하는 차단 항체, 예컨대 항-리툭시맙 차단 항체, 항-펨브롤리주맙 차단 항체, 또는 항-니볼루맙 차단 항체일 수 있다.
본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트가 또한 본원에 개시된다. 본 발명의 키트는 경쟁 약물로부터의 간섭을 완화함으로써 사용자가 샘플에서의 NAb의 존재를 정확히 검출할 수 있게 한다. 본 발명의 키트는, 예를 들어, 치료 단백질, 상기 치료 단백질의 표적, 완화제, 상기 치료 단백질과 상기 표적 사이의 결합의 척도로서의 신호 또는 활성을 생성하는 수단, 및 키트의 사용에 대한 지시를 포함할 수 있다. 이들은 또한 포지티브 대조군으로서 사용될 수 있는 중화제를 포함할 수 있다. 이들은 추가로 포지티브 대조군으로서 사용될 수 있는 경쟁 약물을 포함할 수 있다.
키트는 세포-기반 또는 비-세포-기반 NAb 검정, 또는 이들 둘 다로 지향될 수 있다. 세포-기반 NAb 검정을 향해 지향되는 키트는 표적의 발현 및 상기 표적에 대한 치료 단백질 결합의 척도로서의 신호 또는 활성의 생성에 적합한 세포, 예를 들어, HEK293/hCD20 세포, 주르캇/NFAT-Luc 세포, MOLP-8 세포, 또는 표적을 발현할 수 있는 및/또는 측정가능한 신호 또는 활성을 생성함으로써 표적에 대한 치료 단백질의 결합에 반응할 수 있는 임의의 다른 세포를 포함할 수 있다. 세포-기반 NAb 검정을 향해 지향되는 키트에서 적합한 표적은, 예를 들어, CD20, CD3, BCMA, EGFR, CD28, CD38, 또는 이들의 조합일 수 있다. 적합한 치료 단백질, 예를 들어, 이중특이적 CD20xCD3 항체, 이중특이적 BCMAxCD3 항체, 이중특이적 EGFRxCD28 항체, 또는 이중특이적 CD38xCD28 항체가 사용될 수 있다.
비-세포-기반 NAb 검정을 향해 지향되는 키트는, 예를 들어, 아비딘으로 코팅됨으로써, 표적 및/또는 치료 단백질에 결합할 수 있는 고체 지지체, 예를 들어 마이크로플레이트 또는 비드를 포함할 수 있다. 이들은 추가로, 예를 들어 비오틴에 컨쥬게이션됨으로써, 상기 고체 지지체에 결합할 수 있는 표적 및/또는 치료 단백질을 포함할 수 있다. 이들은 라벨링된 표적 및/또는 치료 단백질, 예를 들어 루테늄으로 라벨링된 표적 및/또는 치료 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 비-세포-기반 NAb 검정을 향해 지향되는 키트에서 적합한 표적은, 예를 들어, PD-1, TNF, PD-L1, EGFR, CD20, CD38, 또는 LAG3일 수 있다. 적합한 치료 단백질은, 예를 들어, 세미플리맙, 또는 상기 언급된 표적 중 임의의 것에 대항하여 지향되는 모노클로날 항체일 수 있다.
본 발명은 상기 언급된 치료 단백질(들), 표적(들), 중화제(들), 세포-기반 검정(들), 세포 유형(들), 비-세포-기반 검정(들), 리포터(들), 라벨(들), 간섭제(들), 경쟁 약물(들), 또는 완화제(들) 중 임의의 것으로 제한되지 않으며, 임의의 치료 단백질(들), 표적(들), 중화제(들), 세포-기반 검정(들), 세포 유형(들), 비-세포-기반 검정(들), 리포터(들), 라벨(들), 간섭제(들), 경쟁 약물(들), 또는 완화제(들)이 임의의 적합한 수단에 의해 선택될 수 있음을 이해한다.
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 보다 완전히 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어선 안된다.
실시예
물질 및 방법. 본 발명은, 당업계의 기술자에 의해 실행시, 제약 화학, 면역학, 분자 생물학, 세포 생물학, 재조합 DNA 기술 분야의 종래 기술, 및 예를 들어 하기 문헌에 기재된 바와 같은 검정 기술을 사용할 수 있다: Sambrook 등 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd　ed. 2001; Ausubel 등 "Short Protocols in Molecular Biology", 5th　ed. 1995; "Methods in Enzymology", Academic Press, Inc.; MacPherson, Hames and Taylor (eds.). "PCR 2: A practical approach", 1995; "Harlow and Lane (eds.) "Antibodies, a Laboratory Manual" 1988; Freshney (ed.) "Culture of Animal Cells", 4th　ed. 2000; "Methods in Molecular Biology" vol. 149 ("The ELISA Guidebook" by John Crowther) Humana Press 2001, and later editions of these treatises (e.g., "Molecular Cloning" by Michael Green (4th Ed. 2012) and "Culture of Animal Cells" by Freshney (7th Ed., 2015), 뿐만 아니라 현재의 전자 버전.
본 발명의 방법, 및 본 발명의 키트의 측면을 수행하기 위한 시약은 비오틴화된 PD-1 (표적); 항-리툭시맙 항체 α-Ritux Ab1, α-Ritux Ab2, 및 α-Ritux Ab3, 항-펨브롤리주맙 항체, 및 항-니볼루맙 항체 (완화제); 항-CD3 항체, 항-CD20 항체, 항-BCMA 항체, 항-PD-1 항체, 리툭시맙, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙 (경쟁 약물); 및 이중특이적 항체 CD20xCD3, 이중특이적 항체 BCMAxCD3, 및 세미플리맙 (치료 단백질)을 포함하며; 예를 들어, 미국 특허 번호 9,657,102 및 10,550,193을 참조하며, 이들의 전체 교시내용은 본원에 참조로 포함된다. 네가티브 대조군 항체, 예를 들어, hIgG1, hIgG4는 여러 상업적 공급원으로부터 입수가능하다.
본 발명의 방법, 및 본 발명의 키트의 측면을 수행하기 위해 적합한 세포는, HEK293/hCD20, MOLP-8, 주르캇/NFAT-Luc 및 주르캇/NFAT-Luc/MfCD3 세포를 포함하며, 이들 모두 여러 상업적 공급원으로부터 입수가능하다.
루시퍼라제 검정은 제조업자로부터의 가이드라인에 따라 수행되며; 예를 들어, Promega 및 ThermoFisher를 참조한다.
실시예 1. 치료 단백질에 대항하는 중화 항체 (NAb)의 검출을 위한 세포-기반 검정 디자인
이 실시예는 치료 단백질 후보물을 평가하기 위한 본 발명의 세포-기반 중화 항체 (NAb) 검정의 실험 디자인을 나타낸다. 요약하면, 세포 표면 인간 항원 CD20을 발현하도록 조작된 인간 불멸화 B 세포를 제조하였다 (HEK293/hCD20으로 명명됨). 이들 세포는 CD20을 발현하는 인간 암 세포를 모방하는 검정의 "표적 세포"를 나타낸다. 추가로, T-세포 수용체 (TCR) 및 세포 표면 항원 CD3을 발현하는 인간 불멸화 T-세포를 제조하고, TCR/CD3 유도성 프로모터 (활성화된 T-세포의 핵 인자 (NFAT))의 제어 하에 리포터 유전자 (루시퍼라제)를 발현하도록 조작하였다. 이들 주르캇/NFAT-Luc 세포는, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 CD20xCD3 항체와 같은 약물 항체와 브릿징될 때 세포-매개 세포독성 반응을 통해 CD20 발현 암 세포에 관여하고 잠재적으로 이를 제거할 수 있는 환자의 면역 세포를 모방하는 검정의 "리포터 세포"를 나타낸다.
리포터 세포 상의 T-세포 수용체 (TCR)의 클러스터링을 매개하는, CD20 및 CD3에 결합하는 항체 (이중특이적 CD20xCD3 약물 항체)의 첨가는, 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 초래하고, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 강건한 용량-의존적 루시퍼라제 신호를 제공한다. hIgG4 이소타입 대조군 항체의 첨가는, 도 1b에서 열린 정사각형에 의해 나타낸 바와 같이, 루시퍼라제 활성을 생성하지 않았다.
표적 세포로서의 MOLP-8 세포와 조합하여, 상기에 기재된 바와 같은 리포터 세포로서 주르캇/NFAT-Luc 세포를 사용하여 또 다른 세포-기반 NAb 검정을 디자인하였다. MOLP-8은 세포 표면 단백질 B 세포 성숙 항원 (BCMA)을 내인적으로 발현하는 다발성 골수종 세포 라인이다. 이중특이적 BCMAxCD3 항체는 리포터 및 표적 세포를 브릿징하여, 리포터 세포 상의 TCR의 클러스터링을 매개하여, 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현 및 도 1c에 나타낸 바와 같은 용량-의존적 루시퍼라제 신호를 초래한다. 2개의 BCMAxCD3 항체를 시험하였고, 여기서 점선은 후속 검정에서 사용된 농도를 나타낸다.
이들 결과는, 본 발명의 세포-기반 검정이 강건한 용량 반응 곡선을 제공하고 포지티브 및 네가티브 대조군에 대하여 예측가능하게 반응함을 보여준다.
실시예 2. 세포-기반 NAb 검정을 사용한 치료 단백질에 대항하는 NAb의 검출
이 실시예는 본 발명의 NAb 검정의 실험 디자인의 개념의 추가적 증거를 나타낸다. 세포-기반 NAb 검정에서, 치료 단백질에 대항하는 NAb는 그의 표적 및/또는 리포터 세포에 대한 치료 단백질의 결합을 억제하고, 이로써 리포터 신호를 제거한다. NAb 검정에서 리포터 신호 또는 활성의 감소는 샘플에서의 NAb의 존재의 척도이다.
예를 들어, 도 2a는 이중특이적 CD20xCD3 약물 항체에 대항하는 NAb의 작용을 예증하며, 여기서 이중특이적 항체의 항-CD20 아암 또는 항-CD3 아암에 대항하는 NAb의 결합은 각각 CD20 또는 CD3에 대한 결합을 방해하여, 루시퍼라제 활성을 감소시킨다. 이 세포-기반 NAb 검정을 추가로 검증하기 위해, 대용 NAb를 NAb 검정에 첨가하여, 이중특이적 CD20xCD3 약물 항체의 항-CD20 아암 또는 항-CD3 아암을 표적화하였다. NAb의 첨가는, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 용량-의존적 방식으로 루시퍼라제 활성의 감소를 야기하였다.
2개의 이중특이적 BCMAxCD3 약물 항체와의 사용에 대하여 이 세포-기반 NAb 검정의 유효성을 추가로 검증하였다. 대용 NAb를 NAb 검정에 첨가하여, 2개의 이중특이적 BCMAxCD3 약물 항체의 항-BCMA 아암 또는 항-CD3 아암을 표적화하였다. NAb의 첨가는, 도 2c, 2d, 2f 및 2g에 나타낸 바와 같이, 용량-의존적 방식으로 루시퍼라제 활성의 감소를 야기하였다. 이소타입 대조군의 첨가는, 도 2e 및 2h에 나타낸 바와 같이, 루시퍼라제 활성에 영향을 주지 않았다.
이들 결과는, 본 발명의 검정이 용량-의존적 방식으로 치료 단백질에 대항하는 중화 항체의 존재를 신뢰가능하게 측정함을 보여준다.
실시예 3. 경쟁 약물에 의한 세포-기반 NAb 검정 간섭
NAb 검정은 매트릭스 성분으로부터의 간섭으로 인한 위양성 또는 위음성 결과에 취약할 수 있다. 간섭의 하나의 잠재적 원천은 시험되는 치료 단백질의 표적에 경쟁적으로 결합하는 제2 약물이다. 이러한 유형의 간섭의 개념의 증거로서, 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, CD20 또는 CD3에 대항하는 경쟁 항체의 첨가와 함께 이중특이적 CD20xCD3 약물 항체에 대한 NAb 검정을 수행하였다. 경쟁 약물의 첨가는 루시퍼라제 활성의 용량-의존적 감소를 야기하여, 대용 NAb에 의한 루시퍼라제 활성 감소를 모방하고 따라서 위양성 결과를 생성하였다.
경쟁 약물로부터의 간섭은 또한 2개의 이중특이적 BCMAxCD3 약물 항체에 대한 NAb 검정에서도 나타났다. BCMA 또는 CD3에 대항하는 2가 모 항체의 첨가는, 도 3c 및 3e에 나타낸 바와 같이, 두 검정 모두에서 루시퍼라제 신호 감소를 야기하였다. BCMA에 대항하는 다양한 임상적 후보물 항체의 첨가는, 도 3d 및 3f에 나타낸 바와 같이, 또한 두 검정 모두에서 루시퍼라제 신호 감소를 야기하였다.
이들 결과는, 경쟁 제2 약물의 존재가 세포-기반 NAb 검정에서 위양성 결과를 생성할 수 있다는 개념의 증거를 입증한다.
실시예 4. 세포-기반 NAb 검정에 대한 인간 혈청의 첨가
상기에서 논의된 바와 같이, NAb 검정은 매트릭스 성분으로부터의 간섭에 취약할 수 있다. 잠재적 간섭에 대한 본 발명의 NAb 검정의 회복성을 시험하기 위해, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 약물-나이브 인간 혈청의 첨가와 함께 이중특이적 CD20xCD3 약물 항체에 대한 NAb 검정을 수행하였다. 루시퍼라제 활성은 인간 혈청의 첨가에 의해 영향받지 않았고, 이는 인간 혈청 성분으로부터의 간섭에 대한 본 발명의 NAb 검정의 회복성 및 그에 따라 임상적 응용에 대한 적합성을 입증한다.
도 4b는 "NAb 검정 신호"의 단순 표시를 나타낸다. 샘플에서의 NAb의 상대적 존재는 실험 샘플에서 유도된 루시퍼라제 활성에 대하여 약물 대조군으로 유도된 루시퍼라제 활성을 나눔으로써 정량된다. 루시퍼라제 활성은 NAb의 존재 하에 용량-의존적 방식으로 감소되어, 보다 높은 NAb 검정 신호를 초래한다.
실시예 5. 임상 샘플에서의 세포-기반 NAb 검정 간섭
본 발명의 NAb 검정을 사용하여, 도 5에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 CD20xCD3 약물 항체에 대항하는 NAb의 존재에 대하여 임상 실험으로부터의 60개 약물-나이브 인간 샘플을 시험하였다. 시험된 환자는 약물 항체에 노출되지 않았지만, 많은 샘플은 NAb에 대한 위양성 결과를 나타내었다.
실시예 3에서 논의된 바와 같이, NAb 검정에서 위양성 신호의 하나의 가능한 원천은 경쟁 제2 약물이다. 이 임상 실험에서 많은 환자는 이전 항-CD20 요법의 이력을 가졌다. 경쟁 항-CD20 약물이 NAb 검정의 위양성 결과의 원인일 수 있는지의 여부를 평가하기 위해, 상업적으로 이용가능한 ELISA를 사용하여, 17개 인간 샘플의 서브세트를 리툭시맙, 항-CD20 항체의 존재에 대하여 시험하였다. 리툭시맙의 존재는, 도 6에 나타낸 바와 같이, 위양성 NAb 검정 신호와 상관되었다.
이들 결과는, 잔류 경쟁 약물로부터의 간섭이 임상적 응용에서 NAb 검정에서의 위양성 결과를 초래할 수 있으며, 치료 단백질에 대항하는 NAb를 정확히 검출하기 위해 이것이 다루어져야 함을 입증한다.
실시예 6. 경쟁 약물에 의한 세포-기반 NAb 검정 간섭의 완화
상기에 기재된 바와 같이, 경쟁 약물의 존재는 NAb 검정에서 치료 단백질의 그의 표적에 대한 결합에 간섭하여, 리포터 활성의 감소 및 위양성 NAb 검정 신호를 초래할 수 있다. 이는, 치료 단백질로서 이중특이적 CD20xCD3 약물 항체 및 경쟁 약물로서 리툭시맙, 항-CD20 항체의 예를 사용하는 도 7a에서 예증된다. 경쟁 약물의 존재 하에 치료 단백질에 대항하는 NAb를 정확히 검출하기 위해, 상호 표적에 대한 경쟁 약물의 결합이 완화되어야 한다. 이는, 완화제로서 항-리툭시맙 항체의 예를 사용하여 경쟁 약물로부터의 간섭을 막고 치료 단백질에 대항하는 NAb의 정확한 검출을 가능하게 하는 도 7b에서 예증된다.
리툭시맙에 대항하는 차단 항체를 본 발명의 NAb 검정에서 간섭을 완화하는 그의 능력에 대하여 시험하였다. 항-리툭시맙 항체를 리툭시맙으로 스파이킹된 혈청에서 공동-인큐베이션하고, 도 7c에 나타낸 바와 같이, NAb 검정에 첨가하였다. 항-리툭시맙 항체의 첨가는 루시퍼라제 활성을 복원시켜, 리툭시맙에 의해 야기된 위양성 NAb 검정 신호를 제거하였다.
이들 결과는, 경쟁 약물에 대항하는 완화제의 사용이 위양성 NAb 검정 신호를 제거하고 치료 단백질에 대항하는 NAb의 정확한 검출을 가능하게 할 수 있음을 입증한다.
실시예 7. 임상 샘플에서 경쟁 약물에 의한 세포-기반 NAb 검정 간섭의 완화
실시예 5에 나타낸 바와 같이, 임상 실험으로부터의 많은 약물-나이브 인간 샘플은, 가능하게는 경쟁 약물, 항-CD20 항체 리툭시맙의 존재로 인해, 이중특이적 CD20xCD3 약물 항체에 대항하는 NAb에 대하여 시험시 위양성 NAb 검정 신호를 얻었다. 리툭시맙으로부터의 간섭을 완화하기 위해, 도 8에 나타낸 바와 같이, 항-리툭시맙 차단 항체의 첨가와 함께 임상 샘플을 사용하여 NAb 검정을 수행하였다. 샘플 #1은 낮은 NAb 검정 신호를 갖는 대조군 샘플이다. 샘플 #2 및 #3은 높은 위양성 NAb 검정 신호를 나타내었다. 항-리툭시맙 항체의 첨가는 위양성 NAb 검정 신호를 제거하였다.
이들 결과는, 임상 샘플에서의 잔류 경쟁 약물, 이 경우에는 리툭시맙이 NAb 검정에 간섭하고 NAb 검정의 결과를 부정확하게 만들 수 있음을 확인시켜준다. 이들은 추가로, 경쟁 약물에 대항하는 완화제가 임상적 응용에서 위양성 NAb 검정 신호를 제거할 수 있음을 입증한다. 경쟁 약물에 대항하는 완화제의 사용은 시험되는 치료 단백질에 대항하는 NAb의 정확한 검출을 가능하게 한다.
실시예 8. 치료 단백질에 대항하는 NAb의 검출을 위한 리간드 결합 검정 디자인
이 실시예는 치료 단백질 후보물을 평가하기 위한 본 발명의 리간드 결합 NAb 검정의 실험 디자인을 나타낸다. 본 발명의 예시적 구현예는 표적-포획 리간드 결합 NAb 검정을 포함한다. 요약하면, 샘플을 비오틴화된 표적과 인큐베이션하고 아비딘-코팅된 마이크로플레이트로 옮긴다. 후속 단계에서 루테닐화된 약물을 마이크로플레이트에 첨가한다. NAb의 부재 하에, 루테늄-라벨링된 약물은, 도 9a에 나타낸 바와 같이, 고정화된 비오틴-표적에 결합하여, 검정에서 신호를 생성한다. NAb의 존재 하에, 루테늄-라벨링된 약물은, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 비오틴-표적에 결합할 수 없어, 검정 신호의 억제를 초래한다.
추가의 리간드 결합 NAb 검정이 치료 단백질에 대항하는 NAb의 평가에 적합할 수 있다. 예를 들어, 표적-포획 디자인 대신에, 리간드 결합 검정은 약물-포획에 대하여 디자인될 수 있고: 치료 관심 단백질이 고정화되고, 표적이 검정 신호의 생성을 위해 라벨링된다. 도 9c는 아비딘-코팅된 마이크로플레이트 상에 고정화된 비오틴화된 약물, 검정 신호를 생성하는 루테닐화된 표적, 및 표적에 대한 결합을 차단하고 이로써 검정 신호를 억제하는 고정화된 약물에 대항하는 NAb로의 리간드 결합 검정 디자인을 예증한다.
실시예 9. 경쟁 약물에 의한 리간드 결합 NAb 검정 간섭
상기에 기재된 세포-기반 NAb 검정과 같이, 리간드 결합 NAb 검정은 매트릭스 성분으로부터의 간섭으로 인한 위양성 또는 위음성 결과에 취약할 수 있다. 간섭의 하나의 잠재적 원천은, 도 10a에 나타낸 바와 같이, 시험되는 치료 단백질의 표적에 경쟁적으로 결합하는 제2 약물이다. 예를 들어, 약물 항체 세미플리맙, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙은 동일한 약물 표적, PD-1을 공유한다. 임상 샘플이 신호를 생성하기 위한 비오틴화된 PD-1에 대한 루테닐화된 세미플리맙의 결합을 사용하여 세미플리맙에 대항하는 NAb에 대해 시험되는 경우, 임상 샘플에서의 임의의 잔류 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 또는 라벨링되지 않은 세미플리맙은 표적에 경쟁적으로 결합하여, 검정 신호를 억제하고 NAb의 존재에 대한 위양성 결과를 야기할 것이다.
개념의 증거로서, 도 10b에 나타낸 바와 같이, 증가하는 농도의 세미플리맙, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙을 세미플리맙에 대항하는 NAb에 대한 표적-포획 NAb 검정에 첨가하였다. 125 ng/mL 초과의 세미플리맙, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙의 농도는 루테닐화된 세미플리맙으로부터의 신호를 억제하여, 위양성 NAb 검정 신호를 생성하였다.
이들 결과는, 경쟁 약물의 존재가 위양성 리간드 결합 NAb 검정 신호를 초래할 수 있으며, 치료 단백질에 대항하는 NAb를 정확히 검출하기 위해 이것이 다루어져야 함을 입증한다.
실시예 10. 경쟁 약물에 의한 리간드 결합 NAb 검정 간섭의 완화
상기에 기재된 바와 같이, 경쟁 약물의 존재는 리간드 결합 NAb 검정에서 치료 단백질의 그의 표적에 대한 결합에 간섭하여, 신호의 감소 및 위양성 NAb 검정 신호를 초래할 수 있다. 경쟁 약물의 존재 하에 치료 단백질에 대항하는 NAb를 정확히 검출하기 위해, 상호 표적에 대한 경쟁 약물의 결합이 완화되어야 한다. 이는, 완화제로서 항-펨브롤리주맙 또는 항-니볼루맙 항체의 예를 사용하여 경쟁 약물로부터의 간섭을 막고 치료 단백질에 대항하는 NAb의 정확한 검출을 가능하게 하는 도 11a에서 예증된다.
펨브롤리주맙 및 니볼루맙에 대항하는 차단 항체를 본 발명의 NAb 검정에서 간섭을 완화하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 항-펨브롤리주맙 또는 항-니볼루맙 항체를 각각 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙으로 스파이킹된 샘플에서 공동-인큐베이션하고, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 리간드 결합 NAb 검정에 첨가하였다. 경쟁 약물에 대항하는 완화제의 첨가는 표적에 대한 경쟁적 결합에 의해 야기되는 위양성 NAb 검정 신호를 제거하였다.
이들 결과는, 경쟁 약물에 대항하는 완화제의 사용이 리간드 결합 검정에서 위양성 NAb 검정 신호를 제거하고, 치료 단백질에 대항하는 NAb의 정확한 검출을 가능하게 할 수 있음을 입증한다.

Claims (39)

  1. 샘플에서 치료 단백질에 대한 중화제를 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 중화제 및 경쟁 약물을 갖는 샘플을 치료 단백질, 치료 단백질의 표적, 및 완화제에 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 표적에 대한 상기 치료 단백질의 결합을 측정하는 단계; 및
    (c) (b)의 결과를 대조군 측정과 비교하여 상기 중화제를 검출하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대조군 측정이 중화제의 부재 하에 상기 표적에 대한 상기 치료 단백질의 결합 측정을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 중화제가 중화 항체인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 치료 단백질이 항체, 가용성 수용체, 항체-약물 컨쥬게이트, 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 치료 단백질이 모노클로날 항체인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 항-PD-1 항체, 항-TNF 항체, 항-PD-L1 항체, 항-EGFR 항체, 항-CD20 항체, 항-CD38 항체, 및 항-LAG3 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 치료 단백질이 이중특이적 항체인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 이중특이적 항체가 CD20xCD3 항체, BCMAxCD3 항체, EGFRxCD28 항체, 및 CD38xCD28 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 치료 단백질이 고체 지지체에 고정화된 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 치료 단백질이 검출을 위해 라벨링된 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 라벨이 형광, 화학발광, 전기화학발광, 방사능, 또는 친화성 정제에 의해 검출가능한 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 라벨이 루테늄을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 표적이 항원, 수용체, 리간드, 또는 효소 기질인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 표적이 세포 표면 단백질인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 표적이 재조합 단백질인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 표적이 세포에 의해 발현되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포가 HEK293 세포, MOLP-8 세포, 주르캇 세포, 또는 이들의 변형된 버전인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 표적이 고체 지지체에 고정화된 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 표적이 검출을 위해 라벨링된 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 라벨이 형광, 화학발광, 전기화학발광, 방사능, 또는 친화성 정제에 의해 검출가능한 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 표적이 효소 기질인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 표적이 CD20, CD3, BCMA, PD-1, EGFR, CD28, CD38, TNF, PD-L1, 또는 LAG3인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 제2 표적을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 경쟁 약물이 모노클로날 항체인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 경쟁 약물이 리툭시맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 오크렐리주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토시투모맙, 우블리툭시맙, 세툭시맙, 다라투무맙, 또는 아달리무맙인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 경쟁 약물이 이중특이적 항체인 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 완화제가 모노클로날 항체인 방법.
  28. 제1항에 있어서, 2, 3, 4개 이상의 완화제의 사용을 포함하는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 표적에 대한 상기 치료 단백질의 결합을 수용체 인산화, 신호 전달 경로에서 하류 단백질의 인산화, 시토카인 방출, 세포 증식, 세포 사멸, 또는 2차 단백질 생성 측정에 의해 측정하는 것인 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 표적에 대한 치료 단백질의 결합을 리포터 유전자의 발현에 의해 측정하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 루시퍼라제인 방법.
  32. 제1항에 있어서, 상기 치료 단백질 또는 상기 표적에 대한 상기 샘플의 접촉 전에 상기 완화제에 상기 샘플을 접촉시키는 전처리 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. (a) 치료 단백질;
    (b) 상기 치료 단백질의 표적;
    (c) 상기 치료 단백질에 대항하는 중화제;
    (d) 경쟁 약물; 및
    (e) 완화제
    를 포함하는 키트.
  34. 제33항에 있어서, 상기 표적을 발현하는 세포를 추가로 포함하는 키트.
  35. 제34항에 있어서, 상기 표적에 대한 상기 치료 단백질의 결합에 반응하여 측정가능한 활성 또는 신호를 생성하는 세포를 추가로 포함하는 키트.
  36. 제35항에 있어서, 상기 활성이 루시퍼라제의 발현인 키트.
  37. 제33항에 있어서, 상기 표적이 고체 지지체에 고정화된 것인 키트.
  38. 제33항에 있어서, 상기 치료 단백질에 부착된 라벨을 추가로 포함하는 키트.
  39. 제38항에 있어서, 상기 라벨이 루테늄을 포함하는 것인 키트.
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