KR20210041009A - 항-약물 항체를 검출하는 방법 - Google Patents
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Abstract
특정 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 샘플에서 항-약물 항체 (ADA)를 검출하는 방법으로서, a) 샘플을 고온에서 전처리하여 샘플 중의 ADA:약물 면역 복합체를 해리하는 단계; b) 매트릭스에 의해 샘플로부터 ADA를 단리하는 단계; c) 버퍼를 사용하여 매트릭스로부터 ADA를 회수하는 단계; 및 d) 세포-기반 검정 또는 시험관내 검정에서 ADA를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2018년 8월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 62/714,183에 대한 우선권을 주장하며, 이는 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 배경
생물학적 치료제는 외래 항원이며 잠재적으로 면역 반응을 유도하여 항-약물 항체 (ADA)의 형성을 초래하며, 결국 광범위한 부작용을 초래할 수 있다. 중화 항체 (NAb)는 치료제의 약리학적 활성 영역에 결합하여 그의 임상 효능을 억제하거나 또는 완전히 중화시킬 수 있는 ADA의 서브세트에 속한다. 세포-기반 기능적 NAb 검정은 그의 중화 활성을 특징규명하는데 선호된다. 그러나, 세포-기반 NAb 검정은 종종 약물 간섭 뿐만 아니라 성장 인자 및 질환-관련된 시토카인을 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 혈청 인자의 간섭에 취약하다. 산 해리를 사용한 비드 추출 (BEAD)은 인간 혈청 샘플로부터 순환 약물 및/또는 다른 간섭 인자를 제거하는데 성공적으로 적용되어, 이로써 ADA/NAb를 풍부하게 하였다. 그러나, 추출 절차에 사용되는 가혹한 산은 NAb의 비가역적 변성을 유발하고 과소평가된 NAb 측정을 초래할 수 있다. 따라서, 중화 항-약물 항체를 검출하는 신규한 방법을 개발할 필요가 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 샘플에서 항-약물 항체 (ADA)를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 a) 샘플을 고온에서 전처리하여 샘플 중의 ADA:약물 면역 복합체를 해리하는 단계; b) 매트릭스에 의해 샘플로부터 ADA를 단리하는 단계; c) 버퍼를 사용하여 매트릭스로부터 ADA를 회수하는 단계; 및 d) 세포-기반 검정 또는 시험관내 검정에서 ADA를 검출하는 단계를 포함한다. 임의적으로, 고온은 60℃ 내지 68℃ (예를 들어, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃ 또는 약 68℃)이다. 임의적으로, 샘플은 약 30분 내지 약 2시간 (예를 들어, 약 30-60분), 예컨대 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 또는 120분의 기간 동안 고온에서 전처리된다.
특정의 구체적 실시양태에서, ADA는 산 처리에 민감하다. 특정의 구체적 실시양태에서, 약물은 ADA보다 더 낮은 열 안정성을 갖는다.
임의적으로, 약물은 항체 또는 그의 단편, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 탄수화물, 지질 또는 소분자 화합물로부터 선택된다. 임의적으로, 샘플은 체액, 점액 분비물, 타액, 혈액, 전혈, 혈장, 및 혈청으로부터 선택된 생물학적 샘플이다. 임의적으로, 샘플은 약물로 치료된 대상체로부터의 것이다.
특정의 구체적 실시양태에서, ADA는 비오티닐화된 약물에 이어서 스트렙트아비딘-코팅된 매트릭스와 접촉함으로써 샘플로부터 단리된다. 대안적으로, ADA는 약물과 커플링된 매트릭스에 의해 샘플로부터 단리된다. 예를 들어, 매트릭스는 자기 비드이다.
특정의 구체적 실시양태에서, 회수된 ADA는 세포-기반 검정에서 검출된다. 예를 들어, 이러한 검정은 i) 회수된 ADA를 약물의 존재 하에 세포에 첨가하는 단계; 및 ii) 세포 상에서 약물의 활성의 감소를 측정함으로써 ADA를 검출하는 단계를 포함한다.
특정의 구체적 실시양태에서, 회수된 ADA는 시험관내 검정에서 검출된다. 예를 들어, 이러한 검정은 i) 회수된 ADA를 검출가능한 표지로 표지된 약물과 접촉시키는 단계; 및 ii) 검출가능한 표지를 측정함으로써 ADA를 검출하는 단계를 포함한다. 예시로서, 검출가능한 표지는 방사성 동위원소, 효소, 형광 표지, 화학발광 표지, 및 전기화학발광 표지, 및 효소 검출 반응용 기질로부터 선택된 표지이다.
특정의 구체적 실시양태에서, 약물은 도메인 항체와 같은 항체 단편이다. 특정의 구체적 실시양태에서, 약물은 페길화된다.
특정의 구체적 실시양태에서, 약물은 룰리주맙 (즉, 페길화된 항-CD28 도메인 항체)이다. 예를 들어, 이러한 약물은 약 62℃의 고온에서 전처리된다. 예를 들어, ADA는 혈청 샘플에서 검출된다.
도 1. 룰리주맙은 Jurkat.CA 및 Raji 이중-세포 생물검정에서 T 세포 활성화 및 IL-2-구동된 루시페라제 리포터 생산을 연속-배양물로부터의 세포 또는 새로 해동된 세포와 함께 용량-의존적 방식으로 억제하였다. A). 연속-배양물로부터의 세포. 상이한 색상의 선은 웰당 상이한 세포의 수를 나타낸다 (단위: ×103). B). 해동된 동결 세포 (fz)는 연속-배양물로부터의 새로운 세포 (fs)와 비교하여 더 잘 수행되었다. 곡선은 중복 웰로부터 소프트맥스(Softmax)로 생성되었다.
도 2. A). NAb PC는 룰리주맙에 의해 억제된 IL-2 생산을 구조하였다. 적색: EC50이 2.22인 토끼 폴리클로날 Ab; 청색: EC50이 1.45인 마우스 mAb 클론 13H4. B). 상이한 양의 룰리주맙 존재 하의 NAb PC 곡선 (마우스 mAb 클론 13H4). (청색, 적색 및 녹색 선은 0.2, 0.25 및 0.3 μg/mL의 룰리주맙을 나타내고, EC50은 각각 0.53, 0.96 및 1.09임).
도 3. 10개의 개별 SLE 혈청을 검정 배지에 10배 희석한 다음, 세포 검정물에 첨가하였다. 오차 막대는 중복 웰로부터의 표준 편차를 나타낸다.
도 4. 룰리주맙 및 항-룰리주맙 NAb PC의 열 안정성. A). 상이한 단백질의 용융 온도를 비교하기 위해 UNcle 플랫폼에서 측정된 시차 주사 형광측정 (DSF). 수직 오렌지색 막대는 62℃를 나타낸다. B). 룰리주맙; C). 항-룰리주맙 NAb PC를 상이한 온도에서 30분 동안 가열하고, 냉각시킨 다음, 세포-기반 검정물에 첨가하였다. NAb 활성은 0.25 μg/mL 약물의 존재 하에 시험되었다. 원시 값은 상대적 활성을 제시하기 위해 0 μg/mL 그룹으로 정규화되었다. 여기에는 토끼 pAb만이 제시되며, mAb 클론 13H4는 유사한 결과를 가졌다. D). NAb PC의 pH 안정성. 토끼 pAb 또는 마우스 mAb 클론 13H4 NAb PC를 상이한 pH에서 60분 동안 처리하고, 중화시킨 다음, 세포 검정물에 첨가하였다. 원시 값은 상대적 활성을 제시하기 위해 pH 7.0 그룹으로 정규화되었다.
도 5. 검정 민감도 결정. NAb PC를 풀링된 정상 인간 혈청에 스파이킹하고 BEHD 추출하여 세포-기반 검정에서 실행하였다. 오차 막대는 6개의 데이터 세트로부터의 표준 편차를 나타낸다.
도 2. A). NAb PC는 룰리주맙에 의해 억제된 IL-2 생산을 구조하였다. 적색: EC50이 2.22인 토끼 폴리클로날 Ab; 청색: EC50이 1.45인 마우스 mAb 클론 13H4. B). 상이한 양의 룰리주맙 존재 하의 NAb PC 곡선 (마우스 mAb 클론 13H4). (청색, 적색 및 녹색 선은 0.2, 0.25 및 0.3 μg/mL의 룰리주맙을 나타내고, EC50은 각각 0.53, 0.96 및 1.09임).
도 3. 10개의 개별 SLE 혈청을 검정 배지에 10배 희석한 다음, 세포 검정물에 첨가하였다. 오차 막대는 중복 웰로부터의 표준 편차를 나타낸다.
도 4. 룰리주맙 및 항-룰리주맙 NAb PC의 열 안정성. A). 상이한 단백질의 용융 온도를 비교하기 위해 UNcle 플랫폼에서 측정된 시차 주사 형광측정 (DSF). 수직 오렌지색 막대는 62℃를 나타낸다. B). 룰리주맙; C). 항-룰리주맙 NAb PC를 상이한 온도에서 30분 동안 가열하고, 냉각시킨 다음, 세포-기반 검정물에 첨가하였다. NAb 활성은 0.25 μg/mL 약물의 존재 하에 시험되었다. 원시 값은 상대적 활성을 제시하기 위해 0 μg/mL 그룹으로 정규화되었다. 여기에는 토끼 pAb만이 제시되며, mAb 클론 13H4는 유사한 결과를 가졌다. D). NAb PC의 pH 안정성. 토끼 pAb 또는 마우스 mAb 클론 13H4 NAb PC를 상이한 pH에서 60분 동안 처리하고, 중화시킨 다음, 세포 검정물에 첨가하였다. 원시 값은 상대적 활성을 제시하기 위해 pH 7.0 그룹으로 정규화되었다.
도 5. 검정 민감도 결정. NAb PC를 풀링된 정상 인간 혈청에 스파이킹하고 BEHD 추출하여 세포-기반 검정에서 실행하였다. 오차 막대는 6개의 데이터 세트로부터의 표준 편차를 나타낸다.
본 발명은 샘플로부터 ADA를 정성적으로 및/또는 정량적으로 검출하는 신규한 접근법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 샘플에서 항-약물 항체 (ADA)를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 a) 샘플을 고온에서 전처리하여 샘플 중의 ADA:약물 면역 복합체를 해리하는 단계; b) 매트릭스에 의해 샘플로부터 ADA를 단리하는 단계; c) 버퍼를 사용하여 매트릭스로부터 ADA를 회수하는 단계; 및 d) 세포-기반 검정 또는 시험관내 검정에서 ADA를 검출하는 단계를 포함한다. 임의적으로, 고온은 60℃ 내지 68℃ (예를 들어, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃ 또는 약 68℃)이다. 임의적으로, 샘플은 약 30분 내지 약 2시간 (예를 들어, 약 30-60분), 예컨대 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 또는 120분의 기간 동안 고온에서 전처리된다.
특정의 구체적 실시양태에서, ADA는 산 처리에 민감하다. 특정의 구체적 실시양태에서, 약물은 ADA보다 더 낮은 열 안정성을 갖는다. 임의적으로, 약물은 항체 또는 그의 단편, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 탄수화물, 지질 또는 소분자 화합물로부터 선택된다. 임의적으로, 샘플은 체액, 점액 분비물, 타액, 혈액, 전혈, 혈장, 및 혈청으로부터 선택된 생물학적 샘플이다. 임의적으로, 샘플은 약물로 치료된 대상체로부터의 것이다.
특정의 구체적 실시양태에서, ADA는 비오티닐화된 약물에 이어서 스트렙트아비딘-코팅된 매트릭스와 접촉함으로써 샘플로부터 단리된다. 대안적으로, ADA는 약물과 커플링된 매트릭스에 의해 샘플로부터 단리된다. 예를 들어, 매트릭스는 자기 비드이다.
특정의 구체적 실시양태에서, 회수된 ADA는 세포-기반 검정에서 검출된다. 예를 들어, 이러한 검정은 i) 회수된 ADA를 약물의 존재 하에 세포에 첨가하는 단계; 및 ii) 세포 상에서 약물의 활성의 감소를 측정함으로써 ADA를 검출하는 단계를 포함한다.
특정의 구체적 실시양태에서, 회수된 ADA는 시험관내 검정에서 검출된다. 예를 들어, 이러한 검정은 i) 회수된 ADA를 검출가능한 표지로 표지된 약물과 접촉시키는 단계; 및 ii) 검출가능한 표지를 측정함으로써 ADA를 검출하는 단계를 포함한다. 예시로서, 검출가능한 표지는 방사성 동위원소, 효소, 형광 표지, 화학발광 표지, 및 전기화학발광 표지, 및 효소 검출 반응용 기질로부터 선택된 표지이다.
특정의 구체적 실시양태에서, 약물은 도메인 항체와 같은 항체 단편이다. 특정의 구체적 실시양태에서, 약물은 페길화된다.
특정의 구체적 실시양태에서, 약물은 룰리주맙 (즉, 페길화된 항-CD28 도메인 항체; BMS-931699로도 지칭됨)이다. 예를 들어, 이러한 약물은 약 62℃의 고온에서 전처리된다. 예를 들어, ADA는 혈청 샘플에서 검출된다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 특정 용어를 먼저 정의한다. 추가의 정의는 상세한 설명을 통해 설명된다.
"항-약물 항체" 또는 "ADA"는 약물의 임의의 영역에 특이적으로 결합하는 항체이다. 예를 들어, 항-약물 항체는 항체 또는 그의 단편일 수 있으며, 이는 약물 항체의 임의의 영역, 예컨대 항체의 가변 도메인, 불변 도메인, 또는 당구조에 대해 지시될 수 있다. 이러한 항-약물 항체는 환자의 면역원성 반응으로 약물 요법 중에 발생할 수 있다. ADA는 임의의 인간 이뮤노글로불린 이소타입 (예를 들어, IgM, IgE, IgA, IgG, IgD) 또는 IgG 서브클래스 (IgG1, 2, 3, 및 4) 중 하나일 수 있다. ADA는, 예를 들어, 인간 또는 비-인간 동물 (예를 들어, 수의학) 공급원을 포함한 임의의 동물 공급원으로부터의 ADA를 포함한다.
본 명세서의 목적상, 용어 "Nab" 또는 "중화 항체"는 치료 약물의 약리학적 활성 영역에 결합하여 그의 임상 효능을 억제하거나 또는 완전히 중화시킬 수 있는 ADA의 서브세트를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "환자"는 질환이 있거나 또는 질환이 있는 것으로 의심되는 임의의 대상체, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 동물 (예를 들어, 인간 또는 비-인간 동물 대상체)을 지칭한다. 일부 예에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 예에서, 본원에 사용된 용어 "대상체"는 인간 (예를 들어, 남성, 여성 또는 소아)을 지칭한다. 일부 예에서, 본원에 사용된 용어 "대상체"는 동물 모델 연구의 실험 동물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플" 또는 "샘플"은 환자로부터 수득되거나 또는 유래된 샘플을 지칭하며, 이는 환자 유래된 이뮤노글로불린을 포함하고 따라서 이뮤노글로불린 샘플로 지칭될 수 있다. 예로서, 생물학적 샘플은 체액, 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 점액 분비물, 타액, 뇌척수액 (CSF), 기관지폐포 세척액 (BALF), 눈의 유체 (예를 들어, 유리체액, 방수), 림프액, 림프절 조직, 비장 조직, 골수, 및 이들 조직 중 하나 이상으로부터 유래된 이뮤노글로불린 농축 분획으로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈청이거나 또는 혈청을 포함하거나 또는 혈청 또는 혈액으로부터 유래된 이뮤노글로불린 농축 분획이다. 샘플은 체액 또는 신체 조직이거나 또는 그로부터 유래될 (수득될) 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 동일한 약물에 반복적으로 노출되는 것과 같이 약물에 노출된 대상체로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, 샘플은 약물에 최근에 노출되지 않은 대상체로부터 수득되거나 또는 약물의 계획된 투여 이전에 대상체로부터 수득된다.
본원에 사용된 바와 같이, 룰리주맙은 자가면역 및 염증성 질환 (예를 들어, 전신 홍반성 루푸스)의 피하 (SC) 치료를 위해 개발된, 40 kDa의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 포맷된 항-인간 CD28 수용체 길항제 Vk 도메인 항체 (dAb)이다. 예를 들어, 룰리주맙은 미국 특허 번호 8,168,759, 8,454,959, 및 9,085,629에서 참조된 바 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "CD28 활성"은 CD80, CD86 및/또는 또 다른 리간드의 CD28에 대한 결합을 수반하거나 또는 그로부터 생성되는 활성이며, CD28-매개된 세포 신호전달의 활성화를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. CD28 활성은 또한 T 세포 증식의 유도 및 T 세포에 의한 시토카인, 예를 들어, 인터류킨 2 (IL-2) 분비의 유도를 포함한다.
"도메인 항체"는 항체의 중쇄 (VH) 또는 경쇄 (VL)의 이뮤노글로불린 가변 도메인의 특징적인 서열을 포함하고 항원에 특이적으로 결합하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 따라서, "도메인 항체"는 완전한 항체 가변 도메인 뿐만 아니라, 예를 들어 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인, 또는 말단절단된 또는 N- 또는 C-말단 연장을 포함하는 항체 가변 도메인에 특유하지 않은 서열 뿐만 아니라 가변 도메인의 폴딩된 단편에 의해 대체되고 전장 도메인의 표적 항원 특이성을 갖는 변형된 가변 도메인을 포함한다. "dAb"는 본원에서 "도메인 항체"와 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "표지된"에 의해 변형된 실체 (예를 들어, 항체, 항-약물 항체, 약물, 단백질, 효소, 항체, 항체 단편, 다중 도메인 생물치료제 (예를 들어, 항체 약물 접합체) 또는 관련 종)"는 경험적으로 검출가능한 또 다른 분자 또는 화학적 실체 (예를 들어, "검출가능한 표지")와 접합된 임의의 실체를 포함한다. 표지된-실체에 대한 표지로서 적합한 화학 종은 효소, 형광 염료; 양자점; 광학 염료; 발광 염료; 및 방사성핵종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참조문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 명백히 본원에 참조로 포함된다.
실시예 1
1. 도입
생물학적 치료제 또는 생물치료제는 많은 질환 상태의 치료를 위해 승인되어 있다. 생물치료제는 종래의 소분자에 비해 많은 이점이 있음에도 불구하고 전형적으로 면역원성으로 지칭되는 자체에 대한 면역 반응을 유발하는 잠재력을 갖는다 (1). 면역원성은 인체의 자연적인 방어 메카니즘이며 일반적으로 보호적이다. 적응 면역 반응의 일환으로, 숙주가 외인성 단백질 또는 변형된 자가-항원, 예컨대 감염성 병원체, 종양 항원 또는 백신을 만나는 경우, 신체는 이들 외래/변형된 자가-단백질에 대한 항체를 발달시킬 수 있다. 그러나, 생물치료제의 경우, 일반적으로 항-약물 항체 (ADA)라고 불리는 이러한 약물-특이적 항체는 국소 주입 반응으로부터 생명을 위협하는 과민반응 및 순수 적혈구 무형성증, PRCA과 같은 보다 심각한 부작용에 이르기까지 광범위한 안전 관련 사건을 유발할 수 있다 (2, 3). 또한, ADA는 약물 효능의 감소를 유발할 수 있다 (4-6).
ADA에 의해 유발된 약물 효능 감소는 가속화된 약물 제거 또는 ADA의 특수한 서브-집단인 중화 ADA 또는 NAb에 기인하는 것으로, 이는 약물이 그의 표적에 결합하는 것을 방지하거나 또는 입체 장애로 인해 결합 시 다운스트림 신호전달을 억제함으로써 치료 효능을 감소시킨다. 현재 보건 당국은 ADA의 중화 잠재력을 특징규명하기 위해 가능하면 언제든지 기능적 세포-기반 NAb 검정을 시행하는 것을 권장한다 (7). 기존의 세포-기반 기능적 NAb 검정에서는, 시스템 약물로 지정된 약물의 고정된 양이 대조군으로 세포에 첨가되며; NAb의 존재로 인한 통계적으로 유의한 신호 변화는 샘플에서의 중화 활성의 존재를 의미한다. 치료로부터의 순환 약물의 존재 하에 및 샘플에서 약물에 대한 NAb의 몰비에 따라, NAb는 약물과 복합체로 존재하고 생물검정에서 시스템 약물에 대한 결합에 더 이상 이용가능하지 않을 수 있으며; 이는 감소된 또는 가성-음성 NAb 검출로 이어진다. 환자 샘플에서 높은 수준의 mAb 치료제는 기능적 세포-기반 NAb 생물검정에서 특히 문제가 된다 (8).
또한, 임상 혈청 샘플은 종종 NAb 존재 여부와 관계 없이 세포에 직접적으로 영향을 미치고 기능적 검정 판독에 영향을 미칠 수 있는 매트릭스 성분 (성장 인자, 시토카인 등)을 함유할 수 있다. 기능적 생물검정 판독에서 간섭 인자로 인한 작은 교란은 허용될 수 있지만, 대상체-대-대상체 및 시간적 변동성은 NAb의 존재에 대해 샘플을 정확하게 특징규명하는 것을 불가능하게 할 수 있다.
산 해리를 사용한 비드 추출 (BEAD) 샘플 전처리 절차는 약물/ADA 면역 복합체를 해리하기 위해 산을 사용하고, 이어서 ADA 결합에 대해 경쟁하도록 과량의 비오티닐화된 약물을 첨가함으로써 약물 및 매트릭스 간섭 둘 다를 처리하도록 변형 및 최적화되었다. 이어서, 비오티닐화된 약물/ADA 복합체는 스트렙트아비딘-코팅된 자기 비드에 의해 포획되는 반면, 혈청 인자 및 약물은 세척에 의해 제거된다 (9). 이는 다수의 프로젝트에 성공적으로 적용되어 왔지만 (10), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 접합된 생물치료제는 룰리주맙의 경우와 같이 이러한 산 해리-기반 추출과 상용성이지 않을 수 있다. 룰리주맙은 40-킬로 달톤 (kDa)의 분지형 PEG로 포맷된 분화 28 (CD28) 수용체 길항제 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 (Vκ) 도메인 항체 (dAb)의 항-인간 클러스터이다. 대안적으로, 본 발명자들은 샘플을 62℃에서 가열하여 약물/ADA 면역 복합체를 파괴할 뿐만 아니라 도메인 Ab 약물을 선택적으로 변성시킴으로써 도메인 Ab의 보다 낮은 열 안정성을 활용하였다. 약물/ADA 복합체의 파괴를 위한 제1 단계로 산이 BEAD 방법에 사용되며; 중화 시, 과량의 순환 약물은 ADA 결합에 대해 비오틴-약물과 경쟁하며, 이는 약물을 능가하기 위해 훨씬 더 많은 양의 비오틴-약물을 필요로 한다. 따라서, 62℃에서의 도메인 Ab 약물의 비가역적 변성은 훨씬 적은 비오틴-약물이 필요하므로 산-기반 BEAD 방법보다 우월하다. 또한, 산 처리의 제1 단계를 제거하기 위해 가혹한 산 대신 열을 사용하면 산-민감성 NAb 종을 보존할 수 있다.
2. 재료 및 방법
2.1. 시약
RPMI-1640, 열-불활성화된 소 태아 혈청 (FBS), G418, HEPES 및 나트륨 피루베이트는 깁코/라이프 테크놀로지(Gibco/Life Technology, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)에서 구입하였다. 네오라이트 루시페라제 리포터 진 어세이 시스템(NeoLite Luciferase Reporter Gene Assay System)은 퍼킨엘머(PerkinElmer, 매사추세츠주 월섬)에서 구입하였으며, 하이-서 맥 스트렙트아비딘 비드(Hi-Sur Mag Streptavidin Bead)는 오션나노텍(OceanNanotech, 캘리포니아주 샌 디에고)에서 구입하였다. 풀링된 인간 혈청, 개별 정상 인간 혈청 및 개별 질환 루푸스 인간 혈청은 바이오리클라메이션(Bioreclamation, 뉴욕주 힉스빌)에서 구입하였다. Jurkat T 세포주 및 Raji B 세포주는 원래 ATCC에서 수득되었으며, Jurkat T 세포는 IL-2-구동된 루시페라제를 안정적으로 발현하는 Jurkat.CA 세포를 생성하도록 추가로 변형되었다. 중화 양성 대조군은 약물 산물에 대한 독점적인 모노클로날 마우스 친화성-정제된 항체이다.
2.2. 세포 배양
IL-2-구동된 루시페라제를 발현하는 안정적으로 형질감염된 Jurkat 세포 (Jurkat.CA) 및 Raji 세포를 통기식 캡 세포 배양 플라스크 (BD 팔콘(BD Falcon), 뉴저지주 플랭클린 레이크스)에서 37℃, 5% CO2 및 95% 상대 습도 (RH)에서 확장하였다. 성장 배지는 상기 세포 둘 다에 대해 10% 열-불활성화된 FBS를 갖는 RPMI 1640이었다. Jurkat.CA 세포주 성장 배지는 또한 400 μg/mL G418, HEPES 및 나트륨 피루베이트를 함유하였다. 상기 세포주 둘 다에 대한 동결배지는 10% DMSO가 보충된 순수한 FBS였다. 해동 후, 세포를 1회 세척하고, 생물검정 배지 (10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지)에 재현탁하고, 생물검정에 직접적으로 사용하였다.
2.3. 비드 추출 및 산 해리 (BEAD) 절차를 위한 시험 대조군의 제조
상이한 농도의 NAb PC를 5 μg/mL 약물 산물과 함께 또는 없이 풀링된 또는 개별의 건강한 인간 혈청에 스파이킹하고, 면역 복합체의 형성이 가능하도록 실온에서 4시간 동안 회전하면서 인큐베이션하였다. 상이한 농도의 약물 산물을 또한 인간 혈청에 스파이킹하고 동일한 방식으로 제조하였다. 이어서, 샘플을 분취하고, 사용할 때까지 -70℃에서 동결시켰다.
2.4. 비드 추출 및 산 해리 (BEAD) 및 비드 추출 및 가열 해리 (BEHD) 절차
본 발명자들은 약간의 변형과 함께 이전에 발표된 산 해리를 사용한 고체상 또는 비드 추출 (BEAD) 절차를 조정하여 ADA를 추출하였다 (9). 간단히, 100 μL의 인간 혈청 샘플 및 상기에서 제조된 대조군 샘플을 먼저 동일한 부피의 400 mM 글리신-HCl, pH 2.0과 혼합하고, 1200 rpm의 진탕기 (라브네트 오비트 P4(Labnet Orbit P4), 뉴저지주 우드브리지)에서 60분 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션하였다. 이어서, 각각의 샘플을 50 μg/mL 비오티닐화된-약물을 함유하는 28 μL 1.8 M 트리즈마 베이스(Trizma Base) (pH 8.8)로 중화시키고, 1200 rpm의 진탕기에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 대안적으로, 100 μL 대조군 및 샘플을 킹피셔 딥 웰(KingFisher Deep well) 96 웰 폴리프로필렌 플레이트에 첨가하고, 플레이트 실러로 덮고, 62℃로 설정되고 400 rpm으로 진탕하는 에펜도르프 써모믹서 R(Eppendorf Thermomixer R)에서 40-60분 동안 인큐베이션하였다. 딥 웰 플레이트를 ~ 15분 동안 냉각시킨 후, 28 μL의 비오티닐화된 약물 (50 μg/mL, DPBS 중의 1% BSA에 희석됨)을 첨가하고, 샘플 플레이트를 1000 rpm으로 진탕하면서 2-8℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 산 또는 가열 처리로 인해 약물 산물로부터 해리되고 비오틴-약물에 결합된 ADA를 250μg의 스트렙트아비딘-코팅된 자기 비드 (25 μL, 10 mg/mL로 첨가되고 1000 - 1200 rpm으로 진탕하면서 RT에서 60분 동안 인큐베이션됨)에 고정시켰다. 이어서, 비드-복합체를 자기 플레이트로 포획하고, 600 μL의 PBST로 2회 세척하고, 킹피셔 플렉스 마그네틱 파티클 프로세서(KingFisher Flex Magnetic Particle Processor) (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 60 μL 2x RPMI-1640, pH 2.3으로 용출하였다. 50 μL의 최종 용출 용액을 22 μL의 100 mM HEPES, pH 8.2를 함유하는 새로운 96 웰 폴리프로필렌 플레이트로 옮겼다.
2.5. 중화 활성을 검출하기 위한 생물검정
IL-2-루시페라제 생물검정을 사용하여 샘플 중 항-치료 단백질 중화 항체의 부재, 존재 또는 상대적 수준을 평가하였다. 간단히, 섹션 2.4.로부터의 30 μL의 중화된 BEAD 용출액을 RT에서 20-40분 동안 96 웰 절반 면적 백색 플레이트에서 15 μL의 250 ng/mL의 시스템 약물과 함께 인큐베이션하였다. Jurkat.CA 세포를 해동하고, 세척하고, 생물검정 배지 (RPMI 1640 중의 10% FBS)에 3.0 x 106개 세포/mL의 최종 농도로 재현탁하고, 15 μL를 플레이트에 첨가하고, RT에서 추가 20분 동안 인큐베이션하였다. 마지막 단계에서, Raji 세포를 해동하고, 세척하고, 2.5 μg/mL 항-인간 CD3 Ab를 함유하는 생물검정 배지에 1.5 x 106개 세포/mL의 최종 농도로 재현탁하고, 그의 15 μL를 플레이트에 첨가하고, 혼합한 다음, 4시간 동안 37℃, 5% CO2 및 95% 습도로 설정된 인큐베이터로 옮겼다. 인큐베이션 후, 75 μL의 네올라이트 루시페라제 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 혼합하고, 500 rpm으로 진탕하면서 어두운 RT 인큐베이터에 배치하고, 원심분리한 다음, 디폴트 96-웰 발광 프로토콜을 갖는 엔스파이어(EnSpire) (퍼킨엘머, 매사추세츠주 월섬) 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다.
2.6. 단백질 열 안정성을 위한 DSF
동시 정적 광 산란을 갖는 시차 주사 형광측정을 UNcle 플랫폼 (언체인드 랩스 인크. (Unchained Labs Inc.))에서 수행하였다. 간단히, 정제된 단백질 샘플을 DPBS 버퍼, pH 7.2 (써모피셔(Thermofisher))에 1 mg/mL로 희석하고, 각각의 9 μL를 마이크로큐벳 어레이에 3중으로 로딩하였다. 샘플 응집 정도는 실행 시작 전에 온라인 동적 광 산란에 의해 결정되었다. 온도-유도된 단백질 언폴딩은 각각의 단계에서 30초 온도 안정화와 함께 1℃ 단계 구배를 사용하여 20℃로부터 85℃까지 가열함으로써 고유 형광 변화를 측정하여 결정되었다. Tm (용융 온도에 상응하는 언폴딩 곡선의 중간점)은 섭씨 온도의 함수로 나노미터 단위의 무게중심 형광을 사용하여 UNcle 소프트웨어에서 계산되었다. 266 nm 및 473 nm에서 동시 정적 광 산란을 기록하여 실험 과정 동안 응집체 형성을 검출하고 제어하였다.
2.7 통계적 방법
2.7.1 대조군 정밀도 평가
분산 분석 (ANOVA) 모델의 맥락에서 분산 성분 방법을 사용하여 대조군 샘플의 정밀도 추정치를 계산하였다 (11). ANOVA 모델은 분석자, 검정일 및 검정일 내의 검정 플레이트에 대한 요인을 포함하였다. 분석자간, 일간, 플레이트간 및 플레이트내 분산의 추정치는 ANOVA 모델에서 계산되었으며, 각각은 표준 편차 (SD)로, 이어서 변동 계수 (CV [%] = 100*SD/평균)로 표현되었다. 총 표준 편차 (총 SD)는 이러한 분산 추정치 합계의 제곱근으로 계산되었다. 총 CV (%) (100*총 SD/평균)를 사용하여 플레이트 허용치를 설정하였다.
2.7.2 컷 포인트 평가
각각의 루푸스 환자 샘플을 3명의 분석자에 의해 2회씩, 6개의 상이한 경우에 대해 검정하였다. NAb 검정 컷 포인트는 공개된 방법을 사용하여 계산되었다 (12). 수일에 걸친 플레이트간 RLU 변동을 교정하기 위해, 환자 샘플 RLU 대 플레이트 음성 대조군 (NegC) RLU의 비율 (각각에 대한 평균 중복)을 계산하였다. 컷 포인트 평가에 비율이 사용되었으므로, 동일한 플레이트로부터 환자 샘플 RLU와 NegC RLU 간의 상관관계를 계산하고 데이터를 플롯팅하였다. 양의 상관관계는 비율 계산 방법의 사용을 지지할 것이다.
NAb 검정 컷 포인트를 계산하기 위해, 샘플 비율 분포의 정규성을 평가하였다. 이상치는 각각의 환자 샘플에 대한 개별 비율을 기반으로 평가되었다. 값이 분포의 제25 백분위수에서 사분위간 범위의 3배를 뺀 값보다 작거나 또는 분포의 제75 백분위수에 사분위간 범위의 3배를 더한 값을 초과하는 경우에 이상치로 간주되었다.
이상치 제외 및 정규성에 대한 로그 변환 후, NAb 검정 컷 포인트는 비율에 대한 단측 모수 99% 구간에서 하한으로 계산되었다. 사용된 수학식의 형식은 하기와 같다:
NAb 검정 컷 포인트 = EXP (평균비율 -z*총SD비율).
상기 수학식에서, '평균비율'은 이상치 제외 후 로그 비율의 평균이고; 'z'는 정규 곡선 아래의 하위 1% 꼬리 면적에 상응하는 정규 분포로부터의 'z-점수'에 대한 값이고 (2.33); '총SD비율'은 이상치 제외 후 비율의 로그에 대한 총 표준 편차의 추정치이다. 'EXP'는 표현의 안티로그이다.
3. 결과
3.1. 세포 검정에서 IL-2 생산의 치료-유도된 억제
룰리주맙은 40-kDa의 분지형 PEG로 포맷된 항-인간 CD28 길항작용 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 (Vκ) dAb이다. 이는 T-세포 활성화의 강력한 억제제이며, 시험관내 효능제, 공동자극 및 가교 실험에 의해 결정된 순수한 길항제이다 (13-15). 도 1A에 제시된 바와 같이, 연속 배양으로부터의 Jurkat.CA 세포는 효능작용 항-CD3 Ab 및 Raji B 세포에 의해 활성화될 때 높은 수준의 IL-2 프로모터-구동된 루시페라제 리포터를 생성하였다 (이는 CD80/CD86을 제공하여 Jurkat.CA 세포에 CD28을 결속시킴). 룰리주맙은 용량 의존적 방식으로 T 세포 활성화 및 루시페라제 리포터 생산을 억제하였다 (도 1A).
다운스트림 샘플 시험을 더 쉽게 하기 위해, 동결된 세포를 해동하고, 동결된 세포가 회수되고 연속 세포 배양 유지를 시작하는데 걸리는 약 3-7일의 대기 시간이 필요하지 않는 즉시 플레이트 시약으로 사용될 수 있는지의 여부를 확인하기 위해 즉시 검정에 사용하였다. 연속 배양 세포와 비교할 때 새로 해동된 세포에서 훨씬 더 높은 원시 신호가 발견되었다 (도 1B). Jurkat.CA 및 Raji 세포의 상이한 수 및 비율은 각각의 곡선의 EC50으로 표시된 것과 같이 상이한 원시 신호, 응답 윈도우 및 민감도를 나타내었다. 웰당 45000개의 Jurkat.CA 세포 및 22500개의 Raji 세포가 추가 검정 개발 및 필요한 원시 신호와 총 세포 수의 균형을 위한 최적화를 위해 선택되었다 (도 1B 및 표 1).
표 1. Jurkat 및 Raji 세포의 수 및 비율이 상이한 IL-2 루시페라제 생산의 원시 신호
3.2. 룰리주맙에 대한 중화 Ab는 IL-2 생산을 구조하였다.
잠재적인 NAb 양성 대조군 (PC) 패널을 세포 검정에서 스크리닝하고, 가장 강력한 클론을 선택하였다. 도 2A에 제시된 바와 같이, 토끼 폴리클로날 Ab (pAb) 및 마우스 모노클로날 Ab (mAb) PC 둘 다는 0.4 μg/mL 룰리주맙 (즉, 시스템 약물, 세포 검정에서 약물의 최종 농도)의 존재 하에 용량-의존적 방식으로 루시페라제 리포터 발현을 구조하였다. 가장 민감한 NAb 검정을 실시하기 위해, 시스템 약물 수준은 가능한 한 낮아야 하지만 여전히 우수한 신호 대 잡음 비율 (S/N) 및 낮은 변동 계수 (CV)를 가져야 한다. 예상된 바와 같이, 약물 농도가 높을수록 NAb PC의 부재 하에서 루시페라제 리포터의 신호가 더 낮았다 (도 2B & 표 9). 0.3 μg/mL의 시스템 약물이 전체 NAb 곡선에 대해 가장 높은 S/N을 가졌지만, NAb 검정의 민감도가 좌우되는 NAb 곡선의 하단부에 주의를 기울여야 한다. 따라서, 추가의 검정 최적화를 위해 0.25 μg/mL 시스템 약물을 선택하였으며; 이러한 시스템 약물 수준에서, 0.125, 0.25 및 0.5 μg/mL의 NAb는 다른 두 약물 농도보다 지속적으로 높은 S/N을 가졌다 (표 2).
표 2. 약물 농도가 상이한 NAb 곡선. 유사한 결과를 갖는 3개의 반복 실험 중 하나만을 여기에 제시하였다.
3.3. BEAD 처리를 사용한 룰리주맙의 존재 하에서 NAb의 낮은 회수율
룰리주맙은 자가면역 및 염증성 질환의 치료를 위해 개발되고 있으며, 환자는 종종 순환 중에 다량의 염증성 시토카인을 발현한다 (14). 도 3에 제시된 바와 같이, 10개의 개별 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 혈청을 검정 배지에 10배 희석하고, 세포-기반 검정물에 첨가하였을 때, 루시페라제 원시 신호가 배지 단독 대조군 샘플과 비교하여 1개의 샘플 (S8)은 50% 초과의 증가를 갖고 4개의 샘플 (S2, S3, S5 & S9)은 50% 초과의 억제를 가졌다. 이는 10배 희석으로는 SLE 혈청의 모든 간섭 인자를 희석하기에 충분하지 않음을 시사한다. 그러나, 더 많이 희석하면 샘플 중의 NAb도 희석될 것이므로 NAb 검정의 민감도가 감소한다. 예를 들어, 검정에 20배 희석이 필요하고 검정이 희석 후 0.5 μg/mL NAb만 검출할 수 있는 경우, NAb 검정의 민감도는 순수 시험 혈청에서 잠재적으로 10 μg/mL까지 높을 수 있다. 임상 샘플에서 예상되는 룰리주맙 수준은 최대 5 μg/mL이며, 이는 샘플을 어떠한 추출도 없이 희석하여 검정물에 첨가할 경우에 15 μg/mL 미만의 NAb가 검출되지 않을 수 있음을 의미한다 (룰리주맙의 분자량은 약 50-KDa이며, 15 μg/mL의 NAb는 모두 1:1 몰비로 5 μg/mL의 룰리주맙과 면역 복합체를 형성하며 검정에서 시스템 약물에 결합할 수 없을 것임). 산 해리를 사용한 비드 추출 (BEAD)은 먼저 NAb PC가 산 처리로 샘플에서 약물로부터 해리되고, 이어서 비오티닐화된-약물/비드 복합체에 결합하고, 스트렙트아비딘-코팅된 자기 비드로부터 용출될 수 있는지의 여부를 확인하기 위해 시험되었다. 이러한 추출은 샘플에서 과도한 양의 약물 뿐만 아니라 검정을 방해할 수 있는 매트릭스 인자도 제거할 것이다. BEAD가 다수의 세포-기반 기능적 NAb 검정에 성공적으로 적용되었지만, BEAD 처리 후 NAb 활성은 룰리주맙 NAb 검정에 대해 불량하였다. 본 발명자들이 상대적 NAb 활성에서 임의 컷 포인트를 1.3으로 설정하는 경우에, 5 μg/mL의 약물 존재 하에서 NAb 검출 민감도는 약 8 μg/mL일 것이다 (표 2 및 데이터는 제시되지 않음). 클론 13H4가 산-안정적이며 비오틴-약물의 증가된 양, 스트렙트아비딘-자기 비드의 증가된 양 뿐만 아니라 다양한 pH에서 여러 가지 길이의 산 처리와 같은 추출의 모든 중요한 단계를 최적화했음을 확증한 후에도 어떠한 개선도 달성되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 룰리주맙은 작은 12-kDa 단백질 백본을 가지고 있지만, 40-kDa의 분지형 PEG 모이어티를 가지고 있으며, 이는 500-kDa 단백질과 동일한 큰 공간을 차지한다. 낮은 pH 하에서 분지형 PEG 모이어티는 NAb와 비오티닐화된 룰리주맙 단백질의 상호작용을 (예를 들어, 입체 장애를 통해) 방지하여 궁극적으로 NAb의 낮은 회수율을 초래할 수 있다는 가설을 세웠다.
3.4. 룰리주맙 및 양성 대조군의 열 안정성
PEG화되지 않은 룰리주맙은 150-kDa NAb PC와 비교할 때 단지 12-kDa로 매우 작다. 이는 룰리주맙이 가열 시 선택적이고 비가역적으로 변성되어 비오티닐화되고 PEG화되지 않은 약물에 의해 추출될 무손상 NAb를 남길 수 있는지의 여부를 조사하도록 자극하였다. 먼저, 본 발명자들은 UNcle 플랫폼에서 시차 주사 형광측정 (DSF)을 사용하여 PEG화된 또는 PEG화되지 않은 룰리주맙 뿐만 아니라 PBS 중에 제조된 항-룰리주맙 NAb PC의 패널의 열 안정성을 비교하였다. 도 4A & 표 3에 제시된 바와 같이, PEG 모이어티가 있는 또는 없는 룰리주맙은 용융 온도가 훨씬 더 낮아서 대부분이 이미 62℃에서 변성된 반면, pAb 및 mAb 둘 다를 포함한 모든 NAb PC는 이 온도에서 막 변성되기 시작하였다.
표 3. DSF에 의해 측정된 룰리주맙 및 상이한 NAb PC의 평균 용융 온도
룰리주맙 및 NAb PC의 상이한 열 안정성을 추가로 확증하기 위해, 토끼 pAb #1 및 클론 13H4를 상이한 온도에서 50-60분 동안 가열한 다음, 세포-기반 검정물에 첨가하여 나머지 활성을 시험하였다. 특히 약물 농도가 낮을 때 (약 0.5 μg/mL 이하), 62℃ 미만으로 가열된 약물의 경우에 상당한 활성이 손실되었지만, 시험된 모든 NAb PC는 시험된 모든 온도에서 활성으로 보존하였다 (도 4B & 4C). 이러한 결과는 62℃ 미만에서 대부분의 약물은 비가역적으로 변성된 반면, 시험된 모든 NAb PC는 활성 상태를 유지하였음을 시사하였다. 흥미롭게도, NAb PC에 대한 pH 안정성 시험 시, 마우스 mAb 클론 13H4는 BEAD에서 제1 산 처리에 사용된 것과 동일한 pH인 pH 2.1에 대해 내성을 나타낸 반면, 토끼 pAb는 pH 2.1 처리 후 거의 60%의 활성을 상실하였다 (도 4D). 다른 프로젝트에서 폴리클로날 NAb PC에 대해서도 유사한 불량한 pH 안정성이 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음). 62℃에서 가열 시 동일한 토끼 pAb가 거의 모든 활성을 보존하였다는 사실은 가열이 pH 민감성 ADA/NAb 해리의 잠재적인 대안이 될 수 있음을 시사하였다.
3.5. 산-처리 대신 가열하면 항-룰리주맙 NAb 회수율이 증가하였다.
약물과 NAb PC 사이의 중요한 차이를 제시하는 유망한 열 안정성 데이터와 함께 62℃에서의 가열은 BEAD 추출에서 산 해리의 효과적이지 않은 제1 단계를 대체하는 것으로 평가되었다. 혈청에서 상이한 농도의 토끼 pAb 또는 마우스 mAb 클론 13H4를 5 μg/mL 룰리주맙과 함께 또는 없이 RT에서 적어도 4시간 동안 인큐베이션하여 면역 복합체의 형성을 보장하였다. 이어서, 샘플을 예열된 62℃ 열-블록에서 인큐베이션하고, 30분 동안 커버링하거나; 400mM 글리신, pH 2.0으로 60분 동안 처리하였다. 이어서, 1% BSA 또는 1.8 M 트리스, pH 8.8을 갖는 PBS 중에 제조된 28 μL의 룰리주맙 (50 μg/mL)의 비오티닐화된-단백질 백본을 각각 냉각된 플레이트 또는 산 처리된 플레이트에 첨가하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 스트렙트아비딘-코팅된 자기 비드를 첨가하여 비오틴-약물/NAb 복합체를 풀 다운하였다. 비드 세척 후, NAb를 비드로부터 산-용출하고, 중화시키고, 최종적으로 세포-기반 검정물에 첨가하였다. 표 4에 제시된 바와 같이, 약물/NAb 면역 복합체를 해리하기 위한 가열은 산 해리보다 훨씬 더 나은 NAb 회수율을 나타내었으며, 본 발명자들은 이러한 새로운 절차를 비드 추출 및 가열 해리 (BEHD: Bead Extraction and Heating Dissociation)라고 부른다. 토끼 pAb PC의 경우, 가열은 약물 그룹의 존재 또는 부재 둘 다 하에 4 μg/mL NAb에서 >1.5의 상대적 NAb 활성을 달성한 반면; 산 처리 그룹에서는 16 μg/mL의 NAb만이 >1.5의 상대적 NAb 활성을 달성하였다. 유사하게는, 4 μg/mL의 클론 13H4는 가열 처리 시 >1.6의 상대적 NAb 활성을 달성한 반면, 산 처리된 그룹에서는 동일한 수준의 >1.6의 상대적 NAb 활성이 8-16 μg/mL에서만 발생하였다.
표 4. 가열 및 산 처리 후의 상대적 NAb 활성. 룰리주맙의 경우에 약물/NAb 복합체를 해리하는데 가열이 산보다 더 우수하다. 원시 값은 상대적 NAb 활성을 계산하기 위해 0 μg/mL NAb 그룹으로 정규화되었다.
3.6. 검정 검증
최적화된 세포 검정 및 BEHD 추출을 통해, 검정은 하기 파라미터: 컷 포인트, 정밀도, 민감도, 약물 간섭, 선택성 및 안정성으로 검증되었다.
3.6.1 컷 포인트
컷 포인트는 50개의 연구 중 치료 경험이 없는 SLE 환자 혈청 샘플을 사용하여 평가되었다. 각각의 샘플은 2일에 걸쳐 3명의 분석자에 의해 2개의 플레이트에서 중복 실행되었다. 각각의 플레이트는 SLE 환자 샘플 이외에 대조군 샘플을 함유하였다. 양성 대조군 클론 13H4 (PC)는 항-룰리주맙 NAb를 건강한 공여자로부터 풀링된 혈청에 스파이킹하여 제조되었다. LPC는 혈청 중 3 μg/mL (LPC-1) 또는 2.5 μg/mL (LPC-2)의 낮은 양성 대조군 중화 항체였다. 이러한 방법은 BEHD 추출의 전처리를 가지므로, LPC-1 및 LPC-2는 또한 LPC-추출 대조군 (LPC-EXC)으로 5 μg/mL 룰리주맙의 존재 하에 제조되어 각각의 실행에서 BEHD 추출을 모니터링하였다. HPC는 10 μg/mL의 높은 양성 대조군 중화 항체였다. NegC는 PC가 없는 건강한 공여자로부터의 동일한 풀링된 혈청이다. PC 및 NegC 샘플은 각각의 플레이트에서 각각 2 및 3 세트의 중복으로 실행되었다. 각각의 플레이트에 대한 허용 기준은 ≤ 30.0%의 각각의 PC의 변동 계수 CV (%)로 설정되었다. 또한, NegC의 평균 원시 상대적 발광 단위 (RLU) 값은 LPC, LPC-EXC 및 HPC의 값보다 작아야 한다. 6개 PC 중 적어도 4개 (HPC, LPC 및 LPC-EXC) 및 각각의 수준에서 적어도 하나는 플레이트 허용치를 충족해야 한다. 3개의 NegC 중복 중 적어도 2개는 %CV 기준을 충족해야 한다.
NegC는 대조군 및 환자 샘플과 동일하게 프로세싱되었다. 플레이트에 걸친 RLU의 가능한 변동을 설명하기 위해, 샘플 RLU 대 플레이트 NegC RLU의 비율 (비율 = RLU/NegC RLU)을 사용하여 SLE 환자 샘플에 대한 컷 포인트를 계산하였다. 플레이트에 걸쳐 SLE 샘플 RLU와 NegC RLU 사이의 강한 상관관계가 관찰되었으며 (피어슨 'r'=0.96), 이는 플레이트간 RLU 변동을 교정하기 위해 NegC RLU를 사용하는 것을 지지한다.
정규성 가정은 샤피로-윌크(Shapiro-Wilk) 검정에 의해 확증되었다. 이상치를 제거한 후, 샘플 RLU/NegC RLU의 비율에 기초한 NAb 검정 컷 포인트는 1.61로 결정되었다 (99% 신뢰 수준, 표 5). ≥ 1.61의 평균 RLU/NegC RLU 값을 산출하는 샘플은 중화인 것으로 간주된다.
표 5. 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 대상체 샘플에 대한 중화 검정 컷 포인트의 결정
3.6.2 정밀도
PC 비율 (PC/NegC RLU 비율)에 대해 12개 실행 모두에서 정밀도 평가 (CV [%])를 수행하였다. 표 6을 참조한다. 분석은 섹션 2.7.1에 기재된 바와 같이 각각의 대조군 샘플 및 공여자 샘플에 대해 개별적으로 수행되었다. 총 정밀도를 포함한 모든 정밀도 추정치는 모든 대조군 샘플에서 18.4% (%CV) 이내였다. HPC/NegC만이 1.61의 컷 포인트보다 높은 단측 99% 예측 구간에서 하한을 가졌으므로, HPC/NegC의 허용 기준은 ≥1.94인 반면, 다른 모든 PC의 컷 포인트는 ≥1.61이다.
표 6. 검정 PC/NegC RLU 비율의 정밀도 평가 및 요약
a 0.0%의 정밀도 추정치는 일 및/또는 분석자 사이보다 플레이트 사이 및/또는 내에서 변동이 더 컸음을 나타내며 추정치는 계산될 수 없었다. 플레이트 중복의 평균이 사용되었다.
b 예측 구간 계산에 사용된 로그-변환된 데이터.
3.6.3 선택성
선택성은 20개의 개별 SLE 인간 혈청 연구 샘플로 평가되었다. 샘플은 스파이킹되지 않은 상태 및 항-룰리주맙의 LPC 수준 (3 μg/mL)으로 스파이킹된 상태로 실행되었다. 스파이킹되지 않은 샘플의 75%는 음성이었고, LPC로 스파이킹된 샘플의 100%는 양성이었다 (표 7).
표 7. SLE 혈청의 선택성 평가
3.6.4 민감도
검정 민감도는 친화성 정제된 마우스 항-룰리주맙 NAb PC가 1.61의 컷 포인트 이상에서 지속적으로 결과를 생성하는 최저 농도로 정의된다. PC 항체를 풀링된 정상 인간 혈청에 40, 20, 10, 4, 2, 1 및 0.5 μg/mL로 스파이킹하였다. 컷 포인트 평가 동안 2일에 걸쳐 3명의 분석자가 총 6개의 곡선을 실행하였다. 이러한 모든 실행에서 확실하게 양성으로 시험된 PC의 최저 농도는 2.0 μg/mL인 것으로 밝혀졌다. 6개의 곡선은 모두 4개의 파라미터 로지스틱 (4PL) 함수로 분석되었으며, 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 1.61로 보간되었다. 미디어 값은 1.31이므로, 검정의 추정 민감도는 1.31 μg/mL로 설정된다 (도 5).
3.6.5 약물 간섭
3 μg/mL의 LPC-1 및 NegC를 10, 5, 2.5 및 1 μg/mL의 룰리주맙으로 스파이킹하여 검정의 약물 내성을 추정하였다. 룰리주맙으로 스파이킹된 LPC는 시험된 최고 농도 (10 μg/mL)에서 양성 반응을 생성할 수 있었고 룰리주맙으로 스파이킹된 모든 NegC 샘플은 음성 (비-중화) 결과를 생성하였으므로, 검정은 LPC-1 수준에서 10 μg/mL 초과의 약물을 견딜 수 있다 (표 8).
표 8. 검정의 약물 간섭. LPC 수준 (3 μg/mL)의 NAb PC는 샘플에서 10 μg/mL 약물의 존재 하에 검출될 수 있다.
3.6.6 NAb PC의 안정성
인간 혈청에서 항-룰리주맙 NAb PC의 실온 및 동결-해동 안정성은 HPC, LPC-1 및 LPC-1-EXC 수준을 사용하여 평가되었다. 각각의 대조군 수준의 3개의 분취 량을 24시간 동안 주위 실온에 두거나 또는 10회의 동결-해동 주기에 적용하였다. 샘플을 검정하고 컷 포인트에 대해 분류하였다. 모든 샘플은 각각의 조건에서 스크리닝 기준을 충족하였으며, 이는 NAb PC가 주변 실온에서 24시간 동안 또는 최대 10회의 동결-해동 주기에 안정적임을 확증한다 (표 9).
표 9. 안정성 시험. PC는 실온에서 24 시간 동안 방치하는 경우 또는 10회의 동결-해동 주기 후에 안정적이었다.
4. 논의
특히 mAb 생물치료제에 대한 세포-기반 기능적 NAb 검정의 주요 과제 중 하나는 환자 시험 샘플에 존재하는 많은 양의 약물이며, 이는 종종 세포-기반 검정에서 NAb의 검출을 방해한다 (16, 17).
전형적인 ADA 검정에서, 샘플 중의 ADA에 대해 순환 약물과 경쟁하도록 비오틴-접합된 약물 및 HRP- 또는 루테늄-표지된 약물이 시험 샘플에 첨가되며; 충분한 ADA가 표지된 약물과 복합체를 형성할 수 있는 한, 샘플은 브릿징 검정에서 ADA 양성으로 시험될 것이다. 달리 말해서, 과량의 표지된 약물의 존재 하에서, ADA-순환 약물 복합체보다 ADA-표지된 약물 복합체 형성을 선호하도록 평형을 이동할 수 있다 (18). 그러나, 세포-기반 NAb 검정에서, 세포는 샘플 중의 약물과 비오티닐화된 약물과 같은 첨가된 약물을 구별할 수 없다: 존재하는 모든 약물은 세포에 직접적 또는 간접적 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 약물 수준이 NAb에 대해 1:1 몰 비율을 초과하는 경우, 세포-기반 검정물에 첨가하기 전에 과량의 약물을 제거하지 않는 한 NAb가 검출되지 않을 것이다. 면역원성 시험을 위해 다량의 약물을 제거하는 제1의 성공적인 방법은 산 해리를 사용한 고체상 추출인 SPEAD이다: 약물/ADA 면역 복합체를 함유하는 샘플을 먼저 비오티닐화된 약물과 함께 밤새 인큐베이션하여 비오틴-약물/ADA 복합체를 형성하며; 이어서, 이들 복합체는 높은-결합 스트렙트아비딘-코팅된 플레이트에 의해 포획된다. 세척 후, ADA는 산을 사용하여 비오틴-약물로부터 용출된다 (19). 이러한 원래의 SPEAD 방법에는 2가지의 제한이 있다: 1) 일부 ADA/NAb PC는 매우 낮은 오프율로 높은 친화성을 가지므로 하룻밤 인큐베이션은 비오틴-약물/ADA 복합체에 유리한 새로운 평형을 형성하기에 충분하지 않다. 2) 또한, 높은-결합 플레이트는 결합 능력이 제한되어 추가될 비오티닐화된 약물의 양을 제한하며; 시험 샘플 중 약물이 너무 높으면, 첨가된 비오티닐화된 약물의 제한된 양이 소량 (백분율)의 ADA/NAb만을 회수할 수 있어 낮은 약물 내성 및 낮은 NAb 검출을 초래한다. 이러한 이유로, BEAD가 SPEAD로부터 진화하였다. 산이 없는 하룻밤 인큐베이션을 대체하기 위해 산 해리 단계가 추가되었으며, 훨씬 더 많은 결합 표면을 갖는 스트렙트아비딘-코팅된 자기 비드가 더 많은 비오틴-약물을 첨가할 수 있도록 플레이트를 대체하는데 사용되어, ADA/NAb 결합에 대한 보다 효율적인 경쟁이 가능하다 (10).
BEAD 방법이 다수의 NAb 검정에 성공적으로 적용되었지만, 본 발명자들은 최근에 본 발명자들이 시험한 15개의 NAb PC 패널의 최대 40%가 산에 불안정하고 가혹한 산 처리를 견딜 수 없어 NAb 회수율이 낮다는 것을 발견하였다 (데이터 준비 중). 이는 실제 시험 샘플 중의 NAb 종 중 적어도 일부가 또한 산에 민감할 수 있으며 BEAD 추출 후에 검출되지 않을 수 있음을 의미한다.
본원에서 본 발명자들은 PEG화된 도메인 Ab와 같은 새로운 생물치료제 종류가 BEAD 추출과 상용성이지 않을 수 있음을 입증한다. 본 사례 연구에서, 본 발명자들은 전체 150-kDa의 NAb와 비교할 때 낮은 용융 온도의 룰리주맙을 사용하였다. 62℃ 가열 단계는 NAb/약물 복합체를 해리하여 BEAD의 가혹한 산 처리를 대체할 뿐만 아니라 시험 샘플 중의 대부분의 약물을 비가역적으로 변성시켜 PEG화되지 않은 비오틴-룰리주맙에 의해 추출될 무손상 NAb를 남긴다. 샘플에서 기능적 약물의 양이 감소하면 ADA/비오티닐화된 약물 복합체에 대한 평형이 촉진되어 추출된 ADA의 수율이 증가하므로 약물의 비가역적 변성이 바람직하다. 특히, 불량한 낮은 pH 안정성을 갖는 토끼 pAb NAb PC가 62℃에서의 가열에서 살아남았으며, 이는 pH에 민감한 ADA/NAb 해리의 잠재적인 대안이 될 수 있음을 시사한다.
본 발명자들은 우수한 정확도, 정밀도 및 민감도로 검정을 검증할 수 있었다. 본 발명자들이 BEHD로 명명한 가열 해리를 사용한 동일한 비드 추출 방법은 완전한 인간 Ab보다 충분히 더 낮은 용융 온도를 갖는 임의의 다른 생물치료제에 적용될 수 있었다. 본 발명자들이 아는 한, 이것은 면역원성 시험에서 ADA/NAb 추출을 촉진하기 위해 열을 사용하는 첫 보고서이다.
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등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태의 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되도록 의도된다.
Claims (22)
- 하기 단계를 포함하는, 샘플에서 항-약물 항체 (ADA)를 검출하는 방법:
a) 샘플을 고온에서 전처리하여 샘플 중의 ADA:약물 면역 복합체를 해리하는 단계;
b) 매트릭스에 의해 샘플로부터 ADA를 단리하는 단계;
c) 버퍼를 사용하여 매트릭스로부터 ADA를 회수하는 단계; 및
d) 세포-기반 검정 또는 시험관내 검정에서 ADA를 검출하는 단계. - 제1항에 있어서, 고온이 60℃ 내지 68℃인 방법.
- 제1항에 있어서, 고온이 약 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃ 또는 68℃인 방법.
- 제1항에 있어서, 샘플이 약 30분 내지 2시간의 기간 동안 고온에서 전처리되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, ADA가 산 처리에 민감한 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 약물이 ADA보다 더 낮은 열 안정성을 갖는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 약물이 항체 또는 그의 단편, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 탄수화물, 지질, 또는 소분자 화합물로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 샘플이 체액, 점액 분비물, 타액, 혈액, 전혈, 혈장, 및 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택된 생물학적 샘플인 방법.
- 제1항에 있어서, ADA가 비오티닐화된 약물에 이어서 스트렙트아비딘-코팅된 매트릭스와 접촉함으로써 샘플로부터 단리되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, ADA가 약물과 커플링된 매트릭스에 의해 샘플로부터 단리되는 것인 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 매트릭스가 자기 비드인 방법.
- 제1항에 있어서, 회수된 ADA가 세포-기반 검정에서 검출되는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, i) 회수된 ADA를 약물의 존재 하에 세포에 첨가하는 단계; 및 ii) 세포 상에서 약물의 활성의 감소를 측정함으로써 ADA를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 회수된 ADA가 시험관내 검정에서 검출되는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, i) 회수된 ADA를 검출가능한 표지로 표지된 약물과 접촉시키는 단계; 및 ii) 검출가능한 표지를 측정함으로써 ADA를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 검출가능한 표지가 방사성 동위원소, 효소, 형광 표지, 화학발광 표지, 및 전기화학발광 표지, 및 효소 검출 반응용 기질로부터 선택된 표지인 방법.
- 제1항에 있어서, 약물이 도메인 항체인 방법.
- 제1항에 있어서, 약물이 페길화된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 약물이 룰리주맙인 방법.
- 제1항에 있어서, 고온이 약 62℃인 방법.
- 제1항에 있어서, 샘플이 혈청인 방법.
- 제1항에 있어서, 샘플이 약물로 치료된 대상체로부터의 것인 방법.
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